UNIVERSIDAD VERACRUZANA
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESTANDARIZACIÓN DE LA PRUEBA DE RT-PCR PARA DIAGNÓSTICO DE RABIA EN SALIVA. TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE: TESIS COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: ALMA DALILA HUESCA SÁNCHEZ ASESORES DRA. ELIZABETH LOZA-RUBIO M en C MARÍA LUISA MÉNDEZ OJEDA VERACRUZ, VER. ENERO 2013 ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE CUADROS iii ÍNDICE DE FIGURAS AGRADECIMIENTO iii iv DEDICATORIA v RESUMEN vi ABSTRACT INTRODUCCIÓN vii 1 1. ANTECEDENTES 1.1 HISTORIA 1.2 AGENTE ETIOLÓGICO 1.2.1 Clasificación del virus 1.2.2 Estructura del virus 1.3 DIAGNÓSTICO 1.3.1 Histopatología 1.3.2 Técnicas de Sellers 1.3.3 Prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) 1.3.4 Inmunofluorescencia directa (IFD) 1.3.5 Prueba biológica 1.3.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 2. JUSTIFICACIÓN 3. HIPÓTESIS 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 5. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1 UBICACIÓN 5.2 MEDIDAS DE SEGURIDAD 5.3 MATERIAL BIOLÓGICO 5.4 METODOLOGÍA 5.4.1 Replicación del virus de la rabia de origen vampiro 5.4.2 Titulación del virus de la Rabia 5.4.3 Estandarización de la prueba de RT-PCR en saliva 5.4.4 Estandarización de la prueba de PCR-anidada en saliva 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7. CONCLUSIÓN 8. LITERATURA CITADA ANEXO 1 Técnica de suspensión de cerebro al 20% para replicar el virus ANEXO 2 Extracción de ARN con Trizol LS Reagent 3 3 5 5 6 10 10 10 10 11 11 12 15 15 16 16 16 17 17 17 17 18 18 18 19 22 23 28 29 34 35 ii ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Clasificación, distribución geográfica y especies 6 Comparación de resultados entre la RT-PCR y la PCR- 26 afectadas por el género Lyssavirus. Cuadro 2 anidada. ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Estructura del virus de la rabia. 7 Figura 2. Genoma del virus de la rabia. 8 Figura 3. Descripción de un proceso de PCR en los primeros 14 ciclos de reacción. Figura 4. Esquema para realizar las diluciones de virus de rabia 19 en saliva de humano, utilizadas para posteriormente estandarizar la RT-PCR y la PCR anidada. Figura 5. Síntesis de cDNA empleada para la estandarización de 21 la PCR y la PCR anidada. Figura 6. Figura 7. RT-PCR en saliva de humano inoculada con virus de rabia. Carril 1: Marcador de pesos moleculares (Promega, MD, USA); carril 2: cerebro de ratón inoculado con virus (control positivo); carril 3: cerebro de ratón sin inocular (control negativo); carril 4: dilución 10-1 de virus en saliva; carril 5: dilución 10-2; carril 6: dilución 10-3; carril 7: dilución 10-4; carril 8: dilución 10-5; carril 9: dilución 10-6. Los productos de 761 pb se observaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. PCR anidada en muestras de saliva inoculadas con virus de rabia. Carril 1: Marcador 100 pb (Promega, MD, USA); carril 2: marcador Low Mass Leader (Invitrogen, CA, USA); carril 3: cerebro de ratón inoculado con virus (control positivo); carril 4: cerebro de ratón sin inocular (control negativo); carril 5: dilución 10-1 de virus en saliva; carril 6: dilución 10-2; carril 7: dilución 10-3; carril 8: dilución 10-4; carril 9: dilución 10-5; carril 10: dilución 10-6. Los iniciadores For II y Rev II amplificaron un segmento de 160 pb, observado en un gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio. 24 25 iii AGRADECIMIENTOS Agradezco primeramente a Dios por darme la fortaleza de no dejarme rendir a pesar de todas las adversidades que se me presentaron en el camino. Por darme el más grande de todos los pilares: mi FAMILIA. A la FMVZ-UV por formarme como profesionista y permitirme ser parte de ella. A todos los profesores que compartieron sus conocimientos y formaron parte de este desarrollo, por el apoyo y amistad sincera brindada por algunos de ellos. A los trabajadores de la Facultad, doña Toñis, don Chucho, don Conta, Ing. Rufino, las secretarias, etc. por los momentos de alegrías y de corajes que me provocaron. Al laboratorio de Biotecnología del CENID Microbiología INIFAP Palo Alto. Por haberme permitido realizar mi servicio social y mi trabajo de tesis en sus instalaciones A la Dra. Elizabeth Loza-Rubio por darme la oportunidad de estar en su laboratorio y ser una de mis asesoras. A mis compañeros de laboratorio: Edith, Caty, Luis, René, Efraín y Silvia, por sus palabras de aliento cuando todo me salía mal, por sus conocimientos y apoyo incondicional. A Marilú, por todo lo que hizo por mí, por asesorarme en el trabajo de tesis, por permitirme ser parte de esta etapa de su vida y por los días que me tuvo que aguantar; por los momentos inolvidables tanto de alegrías como de tristezas que pasamos juntas, pero sobre todo por su amistad. A Fer, por su apoyo y amistad sincera, por la confianza que me brindó, por recordarme que la humildad y sencillez nos conducen por buen camino y que ayudan a abrir muchas puertas. A mi tutora la Dra. Nelly Cisneros por el apoyo incondicional que me ofreció durante mi carrera, por los consejos y la confianza que me expresó. A mis amigos: Lore, Charito, Gabo, Jhonny, Justino, Guevara, Andrés, Marcos, Pimentel, Oli, Ismael, Rafita, Jorge, Mary y Paty, y aquéllos que me acompañaron en algún momento importante de mi vida, ya que todos y cada uno de ustedes me han enseñado cosas distintas, porque me han ayudado a levantarme de mis tropiezos y caídas, por ser mis cómplices y regalarme momentos inolvidables. Y a todos los que quizás no menciono o se han ido de mi vida, pero que han dejado alguna huella marcada con cosas buenas o malas…GRACIAS! iv DEDICATORIA A Domingo Huesca Mendoza y Yolanda Sánchez Quirino por ser los mejores padres que me pudo haber tocado en esta vida, por todos los sacrificios que tuvieron que hacer para darme la oportunidad de seguir estudiando y por estar siempre pendiente de mí a pesar de los kilómetros de distancia. Por apoyarme en los momentos más difíciles que pasé durante la carrera. Los amo y son mi impulso para seguir superándome y continuar luchando. A mis hermanos (Cira, Alberto, Antonio, Guadalupe, Carlos, Asmed e Isabel) porque a pesar de la convivencia mucha o poca que he tenido con cada uno de ustedes, son parte de mi vida…los quiero mucho. A Asael, mi gordito hermoso, por alegrarme con su presencia, ocurrencias y travesuras. A mi Angelito porque al saber de su existencia le dió un rayo de luz a mi vida cuando más oscuridad había. A tía Eva, por cuidar de mí por más de cinco años y por darme su apoyo, cariño y dedicación incondicionalmente. A todos mis primos, tíos y abuelitos, por el amor que me han demostrado, la confianza y desconfianza también que algunos han tenido en mí, porque con ello me impulsan a ser mejor. v RESUMEN Huesca Sánchez Alma Dalila: Estandarización de la prueba de RT-PCR para diagnóstico de rabia en saliva. Tesis de Licenciatura, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Dra. Elizabeth Loza-Rubio, M. en C. María Luisa Méndez Ojeda. La rabia es una zoonosis que afecta a animales de sangre caliente incluido al hombre. Se manifiesta de forma furiosa o paralítica, la primera se presenta principalmente en perros y gatos y la segunda en bovinos y roedores; es una enfermedad mortal. Para el diagnóstico de la rabia, la prueba estándar es la Inmunofluorescencia Directa (IFD), que identifica al virus de la rabia activo y se realiza de manera postmortem. Por lo que es conveniente estandarizar técnicas que detecten al genoma del virus “in vivo”, para de esta manera contar con más y mejores herramientas diagnósticas. El objetivo de este estudio fue estandarizar las pruebas de RT-PCR y PCR-anidada, para detectar el genoma del virus de la rabia en saliva de humano. Ambas técnicas podrían ser utilizadas en laboratorios de diagnóstico clínico como pruebas ante-mortem. Para ello, se realizaron diluciones décuples (10-1 a 10-6) en saliva de humano sano, agregando virus de rabia proveniente de murciélago-hematófago (vampiro). A cada dilución se le extrajo el ARN, se sintetizó el DNA complementario (cDNA) usando el kit M-MVL (Invitrogen, California USA) y se procedió a estandarizar ambas pruebas. Al analizar el virus concentrado (control positivo) y cada una de las diluciones, se obtuvo la amplificación de un fragmento de 761 pb en la RT-PCR en el control positivo, así como en la dilución 10-1; mientras que para la PCR-anidada, la amplificación se detectó además del virus concentrado, en las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Se concluye que las condiciones para la estandarización de ambas pruebas fue adecuada; no obstante, la PCR-anidada resultó más sensible, lo que podría ser útil para realizar la detección del genoma del virus de la rabia en saliva. Palabras Clave: Rabia, Diagnóstico molecular, RT-PCR; PCR-Anidada, saliva. vi ABSTRACT Huesca Sánchez Alma Dalila: Standardization of RT-PCR test for diagnostic of rabies in saliva. Tesis de Licenciatura, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Dra. Elizabeth Loza-Rubio, M. en C. María Luisa Méndez Ojeda. Rabies is a zoonosis that affects warm-blooded animals including man. It is manifested as furious or paralytic, the first occurring mainly in dogs and cats and the second one in cattle and rodents. For rabies diagnosis the standard test is direct immunofluorescence (DIF), this is done in died individuals. So, it is necessary to develop techniques to detect the genome virus "in vivo”. Therefore, the objective of this study was to standardize a polymerase Chain Reaction (RTPCR) and nested PCR, which could be used in clinical diagnostic laboratories as an ante-mortem test. For this purpose, tenfold dilutions (10-1 to 10-6) in human saliva were done adding rabies virus. A non-diluted rabies virus was also used. Firstly, RNA was extracted from samples with Trizol LS (Ambion), according to manufacturer protocol; later the complementary DNA (cDNA) was obtained using the M-MVL kit (Invitrogen, California USA) and proceeded to standardize both tests. A fragment of 761 bp was obtained by PCR in non-diluted virus and in 10 1 dilution. While by nested PCR a fragment of 160 bp was obtained in non-diluted virus and in dilutions 10-1, 10-2 and 10-3. It is concluded that the standardization of both RT-PCR and PCR-nested could be useful for the detection of rabies virus in saliva. Keywords: Rabies, Molecular diagnosis, RT-PCR, Nested-PCR, saliva. vii INTRODUCCIÓN La rabia es una enfermedad viral aguda y letal que afecta el sistema nervioso central provocando encefalomielitis en los mamíferos, incluido al humano; por lo que se encuentra entre las diez zoonosis que producen mayor número de muertes a nivel mundial (Jackson, 1997; CDC, 2011). Es causada por un virus cuyo ácido nucleíco es ARN monocatenario de polaridad negativa (Quarleri, 2008). En América Latina los perros y los murciélagos hematófagos (Desmodus rotundus), son considerados como los principales transmisores de la enfermedad. Esto varía de acuerdo a la región geográfica, por ejemplo en América del Norte son los mapaches (Procyon lotor) y los zorros (Spilogale gracillis y Mephitis mephitis); en Europa es el zorro rojo (Vulpes vulpes), y en África del sur son los chacales (Canis adustus y Canis mesomelas) y las mangostas (Suricata suricata) (Woldehiwet, 2005; Jackson, 2008). El virus de la rabia es transmitido a través del contacto con la saliva del animal enfermo, es decir, para que sea inoculado el virus no necesariamente tiene que existir una mordedura, sino que basta con que exista una solución de continuidad en la piel que entre en contacto con la saliva del animal rabioso. Aunque experimentalmente, se ha demostrado que la rabia puede ocurrir mediante la infección por aerosoles, a través de la vía respiratoria e incluso por vía oral; en los humanos, además ha ocurrido en trasplantes de órganos, principalmente de córnea (CDC, 1999; Woldehiwet, 2005). También hay peligro de contagio para quienes manipulan vísceras de animales que murieron de rabia, con las manos desnudas. Clásicamente la signología comprende tres fases: la prodrómica, la de excitación (furiosa) y la paralítica. La fase más significativa en perros es la de excitación; mientras que la paralítica es característica de roedores, murciélagos y del ganado (Woldehiwet, 2005). 1 Para confirmar la presencia del virus, se han desarrollado diferentes técnicas de diagnóstico como la histopatología, la tinción de Sellers y la Inmunofluorescencia Directa (IFD), esta última se utiliza como prueba estándar En el caso de diagnóstico negativo, se recomienda usar la prueba biológica en ratones como procedimiento confirmatorio (Woldehiwet, 2005). El diagnóstico a tiempo es de suma importancia; por la naturaleza de la enfermedad, se requiere que las pruebas de laboratorio sean rápidas, sensibles, específicas y sobre todo confiables. En dependencia de la técnica empleada, un laboratorio de diagnóstico puede determinar si una muestra es positiva o no a rabia en algunas horas. Por tal motivo, con la implementación de la biología molecular como metodología diagnóstica, la PCR se considera como una alternativa para detectar al genoma viral, aún cuando existan muestras que contengan cantidades pequeñas del mismo. 2 1. ANTECEDENTES 1.1 HISTORIA La rabia es una enfermedad conocida desde hace aproximadamente tres mil años antes de Cristo (a.C.); en lengua sánscrita, “rabhas” significa agredir (Romero et al., 2006; Navarro et al., 2007). En el siglo Xl a.C, Avicena, un médico árabe, habló de la rabia y dijo que la herida de una mordedura permanece abierta durante cuarenta días, que las personas llegan a sufrir de hidrofobia y la enfermedad termina en apoplejía. Demócrito hizo la primera descripción de la rabia canina 500 años a.C. En el siglo IV a.C, Aristóteles escribió en la Historia Natural de los animales que: “los perros sufren de un mal violento que los hace irritables y todos los animales que estos mordían se enfermaban” (Steele y Fernández, 1991). Gruner en 1881 recomendó la inoculación de saliva de perros enfermos a animales sanos, como medio de diagnóstico de la enfermedad. Louis Pasteur estableció a través de sus investigaciones, el principio de la vacunación preventiva, inoculando microbios de virulencia atenuada y culminó con el uso de la vacuna antirrábica en 1885, esto debido a que en ese mismo año se le presentó el caso de un niño de nueve años llamado Joseph Meister, quien había sido mordido por un perro en manos, piernas y muslos. Así, Pasteur tuvo que agilizar su experimentación de la vacunación en humanos (Laval y Lepe, 2008). En 1887 el Dr. Eduardo Liceaga, presidente del Consejo Superior de Salubridad en México, aprendió de Pasteur la forma de preparar la vacuna antirrábica la cual empezó a usarse un año después, cuando ya se reconocía a la rabia como problema de salud pública (SSA, 2001; Romero et al., 2006; Llamas y Orozco, 2009). En 1889, el M.V.Z José de la Luz Gómez replicó al virus en ratones para preparar la vacuna. Además realizó la inmunización a partir de virus atenuados procedentes 3 del laboratorio Pasteur, lo cual fue un gran ejemplo de colaboración entre los ministerios de Salud y de Agricultura (Uribe et al., 2011). Al mismo tiempo que los casos de rabia transmitida por perros en América se redujeron en 90% de 1983 al 2005, los casos debido a animales silvestres aumentaron considerablemente. En vista de ello, algunos países consideraron oportuno promover una revisión de las actividades panamericanas para prevenir los casos de rabia, fijar como propósito completar el proceso de eliminar la rabia transmitida por perros y disminuir la provocada por otras especies, como los murciélagos hematófagos (Velasco et al., 2005). La rabia en México transmitida por los murciélagos hematófagos se encuentra limitada en regiones de 25 estados del país. Los casos de Rabia en bovinos y en otras especies ganaderas se han mantenido desde el sur del estado de Sonora, toda la costa del Océano Pacifico hasta el estado de Chiapas y el sur del estado de Tamaulipas; así mismo por toda la costa del Golfo de México hasta la Península de Yucatán (SENASICA, 2012). En este contexto cobran importancia las estrategias de acción conjunta entre la Secretaría de Salud (SSA), Secretaría de Agricultura, ganadería, desarrollo rural, pesca y alimentación (SAGARPA) y la Secretaría de Medio ambiente y recursos naturales (SEMARNAT). A nivel de cooperación internacional, son fundamentales las acciones de vigilancia y control epidemiológico, particularmente en el área binacional de la frontera entre México y los Estados Unidos (OMS, 2008). De acuerdo a los registros epidemiológicos de la Dirección de Campañas Zoosanitarias, del año 2001 al mes de octubre de 2010 en México la prevalencia de la Rabia Paralítica Bovina se ha incrementado de 3.8 % a 5.6 % lo cual representa pérdidas económicas para el sector pecuario ante la muerte de los animales afectados (NOM-067-ZOO-2007). Durante el periodo de enero a junio de 2012 se presentaron 192 casos de rabia bovina en distintos estados de la República (SENASICA, 2012). 4 1.2 AGENTE ETIOLÓGICO 1.2.1 Clasificación del virus El agente etiológico del virus de la rabia se encuentra clasificado en el orden de los Mononegavirales, familia Rhabdoviridae, género Lyssavirus. Tiene forma de bala y mide de 130 a 240 nanómetros (nm) por 65 a 80 nm (Jackson, 2010; LozaRubio et al., 2012). Este género contiene hasta ahora 14 virus: virus de la rabia (RABV), virus del murciélago Lagos (LBV), virus Mokola (MOKV), virus Duvenhage (DUVV), Lyssavirus del murciélago europeo 1 y 2 (EBLV 1y 2), Lyssavirus del murciélago australiano, virus de Aravan, virus de Khujand, virus Irkut, virus caucásico del oeste (WCV) y virus del murciélago de Shimoni (SHIBV) (Loza-Rubio et al., 1996; Smith, 1996; Nadin-Davis et al., 2002; Kuzmin et al., 2010; Dietzgen et al., 2011). Recientemente han sido identificados dos nuevos Lyssavirus, uno aislado en un murciélago insectívoro (Myotis nattererii) en Alemania, identificado como Bokeloh (Freuling et al., 2011); el otro, aislado de una civeta africana e identificado como Ikoma (IKOV) (Marston et al., 2012). La clasificación del género se presenta en el cuadro 1. 5 Cuadro 1. Clasificación, distribución geográfica y especies afectadas por el género Lyssavirus. VIRUS SIGLAS ESPECIES AFECTADAS Virus de la rabia VRAB Carnívoros (por todo el mundo) y murciélagos (América) DISTRIBUCION GEOGRAFICA Mundial (salvo varias Islas) Virus del murciélago Lagos LBV Murciélagos frugívoros África Virus Mokola MOKV Hombres, musarañas, gatos, perros, roedores África Virus Duvenhage DUVV Murciélagos insectívoros África del Sur Lyssavirus del murciélago europeo 1 EBLV-1 Murciélago insectívoro (Eptesicus pipistrellus) Europa Lyssavirus del murciélago europeo 2 EBLV-2 Lyssavirus del murciélago australiano ABLV Virus de Aravan ARAV Virus de Khujand KHUV Virus Irkut IRKV Virus caucásico del oeste WCBV Virus del murciélago de Shimoni BBLV Murciélagos insectívoros (Myotis spp.) Murciélagos insectívoros y frugívoros (suborden:Megachiroptera) Murciélago insectívoro (Myotis blythi) Murciélago insectívoro (Myotis mystacinus) Murciélago insectívoro (Murina leucogaster) Murciélago insectívoro (Miniopterus schrreibersi) Murciélago insectívoro (Hipposideros commersoni) Europa Australia Asia central Asia central Este de Siberia Región del Cáucaso, Asia central África Bokeloh Murciélago insectívoro (Myotis nattererii) Europa Virus Ikoma Civeta África 1.2.2 Estructura del virus Su genoma está constituido por un Ácido Ribonucleico (ARN) que tiene una sola hebra de polaridad negativa. Esto significa que el ARN no puede codificar directamente la síntesis proteica y debe ser copiado a una cadena de ARNm de polaridad positiva, para dar origen a ARN mensajeros. Como resultado, el virus debe de portar su propia ARN polimerasa dependiente de ARN. 6 La longitud media de las partículas infecciosas o maduras del virus es de 180 nanómetros (nm) y su diámetro medio es de 75nm. La superficie de la partícula viral está cubierta por 400 proyecciones de glicoproteínas. Las partículas del virus tienen uno de sus extremos aplanados y un lado que termina en una forma redondeada y por ello se dice que tiene forma de bala (Figura 1) (Shors, 2009). Figura 1. Estructura del virus de la rabia. FUENTE: http://viralzone.expasy.org/all by species/2.html Su envoltura está constituida por una capa de lípidos cuya superficie contiene cinco proteínas: la G (glicoproteína) que alterna con la proteína M (proteína de matriz). La nucleocápside, está constituida por las proteínas N (Nucleoproteína), la P (fosfoproteína) y la L (larga o transcriptasa) (Figura 2). 7 Figura 2. Genoma del virus de la rabia. FUENTE: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/virologia/rabia.html Glicoproteína (G). Es una proteína de 505 aminoácidos con peso molecular de 65 a 67 Kilodaltons (Kda) (Ross et al., 2008). Es utilizada por el virus para unirse a las células hospederas e inicia las relaciones entre ambos al unirse a los receptores celulares. Se cree que es la determinante del tropismo y de la patogenicidad viral y que, junto con la proteína M, está implicada en la formación de la envoltura vírica y en la producción de viriones. La proteína G es también una diana de los linfocitos T, e induce la formación de anticuerpos neutralizantes contra el virus (Loza-Rubio et al., 1998; Morales et al., 2006). Proteína de matriz (M). Esta es una proteína periférica de membrana de 200 aminoácidos, cuyo peso molecular es de 22 a 25 Kda. Participa en el ensamblaje del virus y en su salida de la célula, así como la regulación a la baja de la transcripción (OPS, 2000; Woldehiwet, 2002). 8 Nucleoproteína (N). Constituida por 450 aminoácidos y con un peso molecular de 58 a 62 Kda, interviene en la inmunidad humoral y celular, es la de mayor importancia diagnóstica en su papel de antígeno (Morales et al., 2006), ya que es la proteína más conservada. Equivale al 90% del total de la nucleocápside; encapsula y protege de la degradación al genoma. Tiene dominios funcionales que se unen al ARN, a la proteína P y, posiblemente a la proteína M (OPS, 2000). Proteína (L). Tiene un peso molecular de 190 Kda. Asociada con la fosfoproteína dirigen la transcripción y replicación del ARN vírico (Jackson, 1997; Morales et al., 2006). Proteína (P). La proteína P con 35 a 40 Kda de peso molecular interactúa con la proteína L, estabilizándola y participa en la encapsulación del ARN (OPS, 2000). Interactúa con la proteína N, evitando su autoagregación y con el complejo proteína N-ARN, facilitan el inicio de la transcripción del ARN y la elongación de la cadena por la ARN-polimerasa (proteína L) (Romero et al., 2006; Jackson y Wunner, 2007). 9 1.3 DIAGNÓSTICO El diagnóstico es esencial para la administración oportuna de profilaxis de postexposición, tanto para la elección de estrategias e intervenciones en Salud Pública, así como también para decidir el tratamiento del paciente y el conocimiento de riesgo de circulación viral en el área de procedencia del animal (OPS, 2007). El diagnóstico confirmatorio de rabia se establece a base de diversas técnicas aplicadas a muestras obtenidas a partir del estudio post-mortem. Las técnicas de laboratorio que se emplean comúnmente son: Inmunofluorescencia Directa, Prueba biológica, Técnica de Sellers, Histopatología, ELISA y Métodos Moleculares de amplificación (Zubair et al., 2012). 1.3.1. Histopatología Consiste en la observación de los cuerpos de inclusión en cortes de tejido cerebral (cerebelo e hipocampo). No es específico para el diagnóstico de la rabia debido a que las lesiones encontradas son similares a otras encefalopatías (Torres et al., 1995). 1.3.2. Técnica de Sellers Tiene por objeto la identificación de los Cuerpos de Negri. Se considera que es una técnica inespecífica, dando lugar a interpretaciones falsas positivas. Ya no se recomienda su empleo en la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (Del Castillo et al., 2003; Secretaría de Salud, 2010). 1.3.3 Prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) Es el método que detecta antígenos, se utiliza una capa de anticuerpo de captura sobre una fase sólida para fijar el antígeno. Se detecta luego el antígeno mediante un anticuerpo específico marcado con enzima o se utiliza aquel para absorber el anticuerpo específico, que a su vez es detectado mediante una globulina antiespecie marcada con enzima. Después que el anticuerpo marcado y no 10 combinado es eliminado por medio de lavado, se agrega el sustrato apropiado para la reacción enzimática. Se obtienen productos del desdoblamiento enzimático y aparece el color que puede evaluarse a simple vista o cuantific arse con el espectrofotómetro (Woldehiwet, 2005; Nagarajan et al., 2006). 1.3.4 Inmunofluorescencia Directa (IFD) Es la prueba primaria para el diagnóstico de la rabia, muy sensible, que consiste en el examen microscópico bajo luz ultravioleta de impresiones de tejido o de células, a las cuales se les han adicionado anticuerpos contra el virus; anticuerpos que han sido conjugados con un fluorocromo, que es el isotiocianato de fluoresceína, y se observa cuando el anticuerpo se incuba con el tejido infectado y se une al antígeno (NOM-056-ZOO-1995; Del Castillo et al., 2003; Woldehiwet, 2005). La positividad del resultado se basa en la presencia de inclusiones intracitoplasmáticas, que son de aspecto fluorescente y de color verde-amarillo (Woldehiwet, 2005). Existen muestras que dan negativa a la prueba de IFD por lo tanto, se deben confirmar con la prueba biológica o incluso por PCR (Ribas et al., 2005). 1.3.5. Prueba Biológica Es una prueba secundaria o de reserva, se efectúa con la inoculación intracerebral de las muestras sospechosas en ratones lactantes. Las muestras que se emplean con más frecuencia para esta prueba son los encéfalos; sin embargo y de acuerdo a las necesidades de diagnóstico, también se utiliza saliva, tejido de glándulas salivales y células del sedimento de líquido cefalorraquídeo. Una vez que son inoculados, deben ser observados durante 21 días y de cada ratón muerto, su cerebro debe ser examinado para la detección de virus rábico con la prueba de IFD (SSA, 2010). Todas las cepas de ratones parecen ser susceptibles a rabia. La inoculación intracerebral de ratones albinos suizos con virus rábico produce infección típica. Los ratones inoculados con las cepas de animales silvestres usualmente enferman entre los 7 y 15 días, y una vez que muestran signos de enfermedad, puede detectarse el antígeno rábico. A pesar que los ratones 11 lactantes (3 días o menos) son los más sensibles, se observan muertes inespecíficas causadas por trauma de inoculación, toxicidad del inóculo y canibalismo, en cuyo caso deberá repetirse la prueba (Del Castillo et al., 2003; Woldehiwet, 2005). 1.3.6. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La reacción en cadena de polimerasa (PCR) llamada también PCR en punto final, es una prueba diagnóstica sensible y específica capaz de detectar el genoma de patógenos presentes en tejidos, inclusive hasta en tejido descompuesto. Se emplea como apoyo en aquellos casos donde el resultado del diagnóstico ha sido dudoso por otras técnicas. Se usa para ampliar una secuencia de DNA, con esta se consigue copiar millones de veces en un par de horas una secuencia predeterminada dentro de una mezcla de DNA (Rojas et al., 2006). Los componentes de la PCR son: DNA molde (muestra), Enzima Taq polimerasa que proviene de la bacteria (Thermus aquaticus), cationes divalentes (MgCl), cebadores o “primers”, nucleótidos libres (dNTPs) y una solución buffer (Vinueza, 2009). La PCR se desarrolla básicamente en tres etapas tal como se muestra en la figura tres (Crespo, 2000). 1. Desnaturalización del DNA: ocurre a una temperatura promedio de 95ºC en 45 segundos, en esta fase las dobles cadenas del DNA se abren o desnaturalizan quedando en forma de cadenas sencillas. 2. Alineamiento: tiene lugar a 50 °C en 30 segundos, a esta temperatura se forman y se rompen los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el DNA, y aquellas uniones más estables durarán un mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos alineados, formando una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño segmento de DNA de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno 12 que se forman entre las bases estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. 3. Extensión: sucede a 72ºC durante 2 minutos, la Taq polimerasa sintetiza nuevas cadenas de DNA a partir de los cebadores incorporando los nucleótidos. Esta técnica también puede ser usada en apoyo a la epidemiología o epizootiología de la enfermedad si el producto de cDNA obtenido se secuencia (Loza-Rubio et al., 1999; Loza-Rubio et al., 2005). Debido a que la RT-PCR utiliza como molde inicial el ARN, se requiere desarrollar un paso extra para poder realizar las tres etapas descritas anteriormente. Dicho paso es convertir el ARN a un tipo de DNA llamado cDNA (DNA complementario) utilizando la enzima transcriptasa inversa. Otra variante de la PCR es la PCR-anidada; ésta, ha sido diseñada para aumentar la sensibilidad y la detección de ciertas cepas virales, usando una segunda PCR para amplificar el producto que viene de una RT-PCR. El producto de la amplificación de la RT-PCR actúa como plantilla para la PCR-anidada, que mejora perceptiblemente la sensibilidad sin deteriorar la especificidad. 13 Figura 3. Descripción de un proceso de PCR en los primeros ciclos de reacción. FUENTE: http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml 14 2. JUSTIFICACIÓN El diagnóstico confirmatorio de rabia se establece a base de diversas técnicas aplicadas a muestras obtenidas a partir del estudio post-mortem principalmente en cerebro. La NOM-056-ZOO-1995 indica que la Inmunofluorescencia Directa (IFD) es el principal método de diagnóstico de Rabia en laboratorios aprobados, pero tiene el inconveniente de ser post-mortem y además puede dar como resultados falsos negativos si la muestra se encuentra ya en descomposición, aparte requiere ser confirmada por la prueba biológica. En investigaciones recientes (Quarleri, 2008), ha comprobado que el uso de técnicas de biología molecular como lo es la PCR, son de utilidad para detectar al genoma del virus de la rabia en saliva, lo que es importante para establecer un diagnóstico de rabia ante-mortem utilizando muestras con cantidades mínimas de ARN, lo cual permitiría tomar medidas de control anticipadas en caso de brotes, o bien, para emplearla en otras investigaciones, por lo que en el presente trabajo se desea ajustar una reacción menor (25 l) a la establecida por algunos laboratorios que utilizan una reacción de volumen final de 50 l. 3. HIPÓTESIS La RT-PCR y la PCR-anidada son técnicas moleculares que podrán estandarizarse para detectar la presencia del genoma del virus de la rabia en saliva. 15 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Estandarizar la prueba de RT-PCR y PCR-anidada para detectar el genoma del virus de la rabia en saliva. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Replicar virus de la rabia de origen vampiro en ratones. - Realizar diluciones décuples del virus de la rabia en saliva. - Estandarizar una RT-PCR para detectar al genoma del virus de la rabia en saliva. - Estandarizar una PCR-anidada para incrementar la detección del genoma. 16 5. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1. UBICACIÓN El presente proyecto se realizó en el Laboratorio de Biotecnología en el Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Microbiología Animal, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (CENID- Microbiología, INIFAP), ubicado en el kilómetro 15.5 de la carretera MéxicoToluca, Colonia Palo Alto, México D.F. 5.2. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD El personal que trabajó el material infectado con rabia fue previamente vacunado con la aplicación de tres dosis de vacuna en los días 0, 7 y 21 por vía intramuscular. El laboratorio cumplió con la normativa nacional de biocontención y de bioseguridad, para proteger al personal del contacto con los patógenos, también debe cumplir las directrices señaladas en el Capítulo 1.1.2. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de Microbiología (Manual OIE, 2008). Todo el material contaminado se desinfectó antes de salir del laboratorio, sea a través del autoclave o bien por vía química. 5.3. MATERIAL BIOLÓGICO Se utilizaron ratones blancos albinos cepa CD21, de 21 días de nacidos con un peso promedio de 22 gramos, a los cuales cada tercer día se les realizaba limpieza de jaulas y bebederos así como la renovación de cama con el fin de evitar la producción de olores desagradables y mantenerlos limpios y secos (INS, 2008). El espacio vital proporcionado por animal era de 52 cm2 con una temperatura de encierro primario entre 20-24 ºC, con humedad relativa aproximada de 50-70%. Además se les proporcionó agua limpia, fresca y alimento en pellet ad libitum para cubrir sus necesidades fisiológicas (Rodent Laboratory Chow) (NOM-062-ZOO1999). 17 5.4 METODOLOGÍA 5.4.1 Replicación del virus de rabia de origen vampiro Un total de 132 ratones cepa CD21, de 21 días de nacidos, fueron organizados en grupos de ocho para ser inoculados por vía intracerebral con 30 µl (50–100 LD50) de virus rábico de origen vampiro cepa del Laboratorio de Biotecnología del INIFAP. Después de ser inoculados, los animales se mantuvieron en observación durante ocho días, y el 80% de ellos presentaron los signos característicos de rabia a los cinco días post-inoculación: pelo hirsuto, incoordinación de miembros posteriores, parálisis parcial y terminando con parálisis generalizada. Una vez que presentaron parálisis generalizada, se les sacrificó humanitariamente (NOM-062-ZOO-1999). Con todas las medidas de seguridad, se procedió a extraer el cerebro, el cual se colocó en tubos eppendorf previamente identificados y almacenados a -70ºC para posteriormente realizar la suspensión de cerebro al 20% para la replicación viral (Anexo 1). 5.4.2 Titulación del virus de la rabia La infectividad es la habilidad de un virus para invadir una célula y replicarse en ella. Para determinar la concentración de viriones infectantes, se realizan generalmente diluciones décuples seriadas y se inocula cada dilución a un determinado número de hospedadores susceptibles, para observar la interacción virus-célula que indique la replicación del virus. La relación entre el volumen inoculado y el número de respuestas positivas producidas en el hospedador empleado se evalúan para determinar el título del virus (Del Castillo et al., 2003). Para conocer el título viral, se utilizó el método de Reed y Muench (Del Castillo et al., 2003) que emplea las siguientes fórmulas: DP= distancia proporcional 18 Punto Final 50% (PF 50%) PF 50%= Log de la dilución del %>50% + (DP x Log del factor de dilución) Título viral Título= inverso del PF 50% 5.4.3 Estandarización de la prueba de RT-PCR en saliva Se tomó muestra de saliva de humano, la cual fue colocada en seis viales, cada uno con 900 l. de saliva. Para proceder a hacer diluciones se agregó al primer vial 100 l del virus de origen vampiro (tomado de la suspensión viral realizada al 20%). De éste se tomaron 100 l y se transfirieron al segundo vial, y así sucesivamente, como se muestra en la figura 4. Figura 4. Esquema para realizar las diluciones de virus de rabia en saliva de humano, utilizadas para posteriormente estandarizar la RT-PCR y la PCR anidada. De cada una de las diluciones se tomaron 250l y se les adicionó 20l de proteinasa K (Amresco, Biotechnology grade. 2g/l), la cual degrada proteínas que pueden destruir al DNA. Se incubaron durante dos hrs. a 37ºC, posteriormente se realizó la extracción del ARN, tanto del virus sin diluir, como de cada una de las diluciones, usando Trizol LS Reagent (Ambion), según las especificaciones del fabricante (Anexo 2). El ARN obtenido se cuantificó en µg/µl usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Las muestras fueron almacenadas a -70°C hasta su uso. 19 Para realizar la síntesis de DNA complementario (cDNA) como se muestra en la figura 5, se utilizó el kit M-MVL Transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Molony (Invitrogen, California USA), utilizando el siguiente protocolo: Mezcla 1 Reactivo H2O Oligo (Sueli1) 100 pmol dNTP´s1 ARN Volumen 18 µl 0.5 µl 1 µl 0.5 µl 1 dNTP’s = di nucleótidos Esta mezcla se incubó durante 5 minutos a una temperatura de 65°C, terminado el tiempo se transportó en hielo, y se le adicionó la mezcla 2. Mezcla 2 Reactivo First-Strand Buffer 5X DTT1 M-MLV RTs Volumen 4 µl 2 µl 1 µl 1 DTT = Ditiotraitol La mezcla final se incubó durante 50 minutos a una temperatura de 37°C, y se inactivó 15 minutos a una temperatura de -20°C. Este cDNA se empleó para realizar la PCR y la PCR anidada. 20 Figura 5. Síntesis de cDNA empleada para la estandarización de la PCR y la PCR anidada. Para llevar a cabo la PCR se utilizó el kit de Invitrogen California, USA (cuya reacción es de 50 µl), ajustadas para una reacción en volumen final de 25 µl. Reactivo H2O Buffer 10x PCR –MgCl MgCl2 50mM dNTP Mix 10mM SuEli 1 - 10 pmol SuEli 2 - 10 pmol Taq Polymerase cDNA (muestra) Volumen 15.1 µl 2.5 µl 0.75 µl 0.312 µl 0.625 µl 0.625 µl 0.125 µl ~1g La secuencia de los iniciadores reportados por Loza-Rubio et al. (2005) es: SuEli 1 :(+): 5´ CGTRGAYCAATATGAGTACA 3´ SuEli 2 :(-): 5´ CAGGCTCRAACATTCTTCTTA 3´ La amplificación se llevó a cabo en un termociclador iCycler de Biorad, con un protocolo de temperaturas, 30 ciclos de 95°C 45 seg, 50°C 30 seg, 70°C 30 seg y un ciclo de 72°C 2 minutos y 4°C por tiempo indefinido. 21 Para observar el producto de 761 pb, se empleó gel de agarosa al 1%, preparado con TAE1x. Se utilizó un marcador de peso molecular de 2000 pb Low DNA Mass Ladder (Invitrogen, CA, USA). Además de las muestras problema, se agregaron un control positivo (cerebro de ratón inoculado con virus de rabia) y un control negativo (cerebro de ratón no infectado). Las muestras se corrieron 50 minutos a 110 volts. Posteriormente, el gel se tiñó durante 5 minutos en bromuro de etidio al 10 %. El gel se observó en un fotodocumentador Molecular Imager de Biorad (Gel Doc TM XR+ Imaging System). 4.4 Estandarización de la PCR-Anidada en saliva. Para la realización de la PCR-anidada, se utilizó 5 l del producto de amplificación de la primera PCR, de las mismas muestras de saliva con sus respectivas diluciones de 10 -1 a 10-6. Se utilizó el mismo kit de la primera PCR para una reacción en volumen final también de 25 µl, sustituyendo únicamente los cebadores. La secuencia de los iniciadores utilizados en esta PCR es: For 2: (+): 5´GCCGCRATGCAGTTGTTTGA 3´ Rev 2: (-): 5´ACAGTRGGGTCCCTTGTCA 3´ Al ser un segmento más pequeño, las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 2%, con un tiempo de corrida de 45 minutos con 90 volts. El gel se tiñó con bromuro de etidio al 10%, se observó en el fotodocumentador Molecular Imager de Biorad (Gel Doc TM XR+ Imaging System). Para la PCR-anidada, el segmento fue de 160 pb. El marcador de peso molecular fue el 100 pb DNA Ladder (Promega, MD, USA). Además de las muestras y de los marcadores, se agregaron controles positivo y negativo. 22 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Replicación del virus de rabia de origen vampiro De la suspensión viral obtenida al 20% se obtuvieron 181.40 ml. Con este virus se hicieron las diluciones de las muestras de saliva, para la estandarización de las pruebas de RT-PCR y PCR anidada, y se como control negativo. Estandarización de la prueba de RT-PCR en saliva. La rabia continua siendo una de las 10 principales zoonosis en el mundo. En ganadería produce severas pérdidas económicas y un diagnóstico certero y oportuno es siempre deseable. Sacramento et al. (1991) notifican por primera vez el uso de la reacción en cadena de la polimerasa como método de diagnóstico de rabia en muestras de cerebros. Sin embargo, es hasta 1998 que Crepin y su grupo de colaboradores publican el diagnóstico por PCR de saliva. Por otro lado, aunque en la literatura existen algunas publicaciones sobre detección del genoma del virus de la rabia en saliva, en México no existe nada al respecto, tal vez por la dificultad que implica su estandarización, debido a que la saliva posee ciertas enzimas y un amplio espectro de bacterias de la flora normal que impiden que la saliva se procese con facilidad (Kasempimolporn et al., 2011), por lo que en este estudio se planteó el objetivo de estandarizar tanto la RT-PCR, como una PCR anidada, por ser una prueba más sensible. Asimismo, ambas podrían ser utilizadas para diagnóstico molecular in vivo. Como se observa en la figura 6, una vez realizadas las diluciones del virus de la rabia en saliva de humano, el resultado fue positivo para el virus sin diluir (control positivo) y para la dilución 10-1. Biswal et al. (2012) notifican que detectaron sólo el 10% de varias muestras analizadas positivas, cuando analizaron salivas de casos clínicos usando la prueba de PCR. A diferencia de esta tesis ellos no reportan el uso de proteinasa K antes de proceder a la extracción del ARN; sin embargo, en este estudio se siguió el protocolo de Crepin et al. (1998) en cuanto a su utilización para degradar algunos de estos componentes. 23 Por lo que concierne a los iniciadores usados en esta investigación, Loza-Rubio et al., (2005) los diseñaron usando varias secuencias de aislamientos mexicanos de diferentes especies y origen geográfico, y han demostrado una apropiada sensibilidad y especificidad cuando se han probado en muestras de cerebros de diversos orígenes (bovinos, ovinos, cerdos, etc); de acuerdo a este estudio también son útiles al usar saliva. Figura 6. RT-PCR en saliva de humano inoculada con virus de rabia. Carril 1: Marcador de pesos moleculares (Promega, MD, USA); carril 2: cerebro de ratón inoculado con virus (control positivo); carril 3: cerebro de ratón sin inocular (control negativo); carril 4: dilución 10-1 de virus en saliva; carril 5: dilución 10-2; carril 6: dilución 10-3; carril 7: dilución 10-4; carril 8: dilución 10-5; carril 9: dilución 10-6. Los productos de 761 pb se observaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. Con estos resultados se reitera que la RT-PCR es una prueba que puede detectar el genoma del virus de la rabia en saliva, como lo sustentan varias publicaciones (Crepin et al., 1998; Aguilar et al,. 2005; Nagaraj et al., 2006). 24 Estandarización de la prueba de PCR anidada en saliva Una vez realizada la RT-PCR, el producto de amplificación se utilizó para estandarizar la PCR anidada, ya que la literatura menciona que es una técnica más sensible que la RT-PCR cuando el diagnóstico se realiza en tejido encefálico (Biswal et al., 2007; Kasempimolporn et al., 2011); sin embargo, no se encontraron reportes usando saliva, excepto con la técnica de PCR en tiempo real, la cual incluso es capaz de cuantificar a las partículas virales (Nagaraj et al., 2006). Con respecto a este estudio la PCR-anidada mostró un mejor nivel de detección del genoma de rabia, ya que la amplificación ocurrió hasta 10 -3, lo que equivale a 1000 partículas virales, como se observa en la figura 7, donde se muestra una amplificación de un fragmento de 160 pb correspondiente al gene N, que es el más usado para establecer un diagnóstico, por ser el gen más conservado (Morales et al., 2006). El control positivo muestra también la misma talla del producto de amplificación (carril 3). Figura 7. PCR anidada en muestras de saliva inoculadas con virus de rabia. Carril 1: Marcador 100 pb (Promega, MD, USA); carril 2: marcador Low Mass Leader (Invitrogen, CA, USA); carril 3: cerebro de ratón inoculado con virus (control positivo); carril 4: cerebro de ratón sin inocular (control negativo); carril 5: dilución 10 -1 de virus en saliva; carril 6: dilución 10-2; carril 7: dilución 10-3; carril 8: dilución 10-4; carril 9: dilución 10-5; carril 10: dilución 10-6. Los iniciadores For II y Rev II amplificaron un segmento de 160 pb, observado en un gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio. 25 En el cuadro dos, se hace una comparación de resultados promedio obtenidos durante la estandarización de la RT-PCR y PCR-anidada. Como ya se mencionó, mientras en la RT-PCR se detecta al genoma del virus de la rabia en la dilución 10-1, en la PCR anidada existió amplificación en las diluciones 10 -1, 10-2 y 10-3, aunque ésta fue débil, según podemos ver en la figura 7. Esto es lógico, ya que para realizar la PCR anidada se usa el amplicón obtenido en la RT-PCR. Cuadro 2. Comparación de resultados entre la RT-PCR y la PCR-anidada. Dilución RT-PCR PCR-A C+ + + C- - - 10 -1 + + -2 - + 10 -3 - + 10 -4 - - 10 -5 - - 10 -6 - - 10 Elmgren et al. (2002) reportaron el caso de un niño de nueve años sospechoso a rabia, al cual se le tomaron muestras de saliva, secreciones de ojos, improntas de córneas, fluido cerebroespinal y biopsias de piel. Algunas de estas muestras fueron analizadas con IFD y los resultados fueron confirmados con RT-PCR. Con la RT-PCR se detectó la presencia del virus en las muestras de saliva, y usando una PCR-anidada obtuvo que el virus también estaba presente en las secreciones de ojos y en la biopsia de piel. Los resultados obtenidos por Elmgren et al. son similares a los obtenidos en este trabajo debido a que la PCR -anidada sigue 26 demostrando tener una mayor sensibilidad al detectar resultados positivos que no habían sido reconocidos por la RT-PCR. Aunque las bondades de la PCR anidada está documentada ampliamente, la mayoría de los estudios se refiere al procesamiento de tejido encefálico fresco o en descomposición (Heaton et al., 1997; Rojas et al., 2006; Biswal et al., 2007; Araujo et al., 2008; Coertse et al., 2010). Actualmente, hay reportes donde se postula los beneficios que tendría un diagnóstico ante-mortem, pero usando PCR en tiempo real, la cual es una técnica más sensible que la PCR anidada, que incluso puede cuantificar el número de partículas virales. 27 7. CONCLUSIÓN En este estudio se estandarizaron las condiciones adecuadas para llevar a cabo la RT-PCR y la PCR anidada en saliva, las cuales podrían ser utilizadas en laboratorios de diagnóstico ó en investigaciones, para realizar la detección del genoma del virus de la rabia in vivo, y que al usar un volumen de 25 l se utiliza una cantidad menor de reactivos lo cual no va en detrimento de la sensibilidad, ya que la PCR anidada detectó al genoma de rabia hasta la dilución 10 -3. 28 8. LITERATURA CITADA Aguilar SA, Loza-Rubio E, Rojas SM, Brisseau N, Cliquet F, Pastoret PP, Rojas DS, Tesoro E, Kretschmer R, 2005. Salivary excretion of rabies virus by healthy vampire bats. Epidemiol Infect 133, pp. 517-522. 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Se colecta el cerebro con un palillo de madera para pesarlo y se vacía en el mortero estéril, mantenido en frío. 3-. Se flamea la boquilla, donde se encuentra el medio albúmina, que se utiliza para diluir. 4-. De lo que pese el encefalo, se agrega 20% del medio para diluir (Albúmina sérica bovina al 2%) -de gramos a mililitros- (ejemplo 1.5 gr cerebro agregar 6 ml de solución). 5-. Se macera el cerebro, adicionándole el medio. 6-. Ya que está bien macerado, se vacía en tubos eppendorf con la micropipeta, (en caso de que sean varios cerebros, se coloca en tubos falcón de 10 ml). 7-. Se desecha el material que estuvo en contacto con el cerebro. 8-. Se centrifugan las muestras: 1500RPM/20min/4-8°C. 9-. Se vacía todo el sobrenadante en tubos falcón de 10 ó 50ml. 10-. Agregar antibiótico en proporción 1 en 100, sobre la cantidad de sobrenadante obtenido (ejemplo 6 ml de sobrenadante 0.06 ml = 60µl de antibiótico). 11-. Alicuotar en tubos eppendorf, debidamente marcados. 12-. Si el mismo día se realizara la inoculación, dejar reposar 30 minutos. 13-. En caso de que se aplace la inoculación, congelar a -70°C. NOTA: Todos los materiales deberán estar en hielo, muestras, morteros y tubos falcón. SOLUCIONES. Albúmina sérica bovina al 2% en PBS células para macerado de cerebros 1. Preparación de PBS células para un litro: Agua bidestilada 1.0 L. Cloruro de potasio (KCl) 0.2 g. Cloruro de sodio (NaCl) 8.0 g. Fosfato de potasio (KH2PO4) 0.2 g. Fosfato de sodio (NaHPO412H2O) 2.9 g. Ajustar pH 7.2 a 7.4, una vez que está bien diluido. 34 2.- Para 200 ml. se añaden 4 g. de albúmina. Agitar perfectamente. Esterilizar con micro filtro. Antibiótico-Antimicótico: Penicilina 10 000 u/ml –Estreptomicina 10 000 g/ml -AmfotericinaB 25 µg/ml Cálculo para agregar solución diluyente: 1.5 gr. x 4 = 6 ml ANEXO 2 Extracción de ARN con Trizol LS Reagent OBJETIVO: Extraer el ARN total de tejidos líquidos utilizando el reactivo Trizol LS Reagent (Invitrogen), para ser usado en la técnica de RT-PCR. MATERIALES Micropipeta de capacidades de 1-1000 l y puntas con filtro. Centrífuga refrigerada de 12 000 rpm. Tu ml estériles. Cloroformo (Amresco). Isopropanol. Etanol absoluto (Amresco). Etanol 75% (Mezclar 75 mL de alcohol absoluto con 25 mL de agua DEPC). PROCEDIMIENTO 1-. Homogenizar 250 l de la muestra líquida y agregarle 750 l del Trizol LS. 2-. Incubar el homogenizado por 5min en hielo. 3-. Adicionar 200 l de cloroformo y mezclar vigorosamente los tubos con la mano por 15 s e incubar en frío por 10 min. y centrifugar a 12 000 rpm por 15 minutos a 4ºC. 4-. Transferir la fase acuosa a un tubo limpio. 5-. Agregar 500 l de alcohol isopropílico incubar 10min. en hielo y centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos a 4ºC. 6-. Remover el sobrenadante y lavar con 1 mL de etanol al 75% el botón de ARN, mezclar la muestra en vortex y centrifugar a 7 500 rpm por 5 minutos a 4ºC. 7-. El botón obtenido se seca a temperatura ambiente, colocando el tubo de centrífuga sobre papel absorbente. 8-. Resuspender el botón por pipeteo en 50L de H2O – DEPC, y alicuotar. Almacenar las alícuotas a -70ºC. 9-.Cuantificar 35
