Ruiz López, S. Fecundación IN VITRO en la especie porcina: Situación actual y perspectivas Dr. SALVADOR RUIZ LÓPEZ Dpto. Fisiología (Fisiología Veterinaria) Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia E-mail: [email protected]. http://www.um.es/grupo-fisiovet Tan sólo diez años después de que en 1978 naciera Louise Brown, la primera niña probeta, ya se habían producido cerca de 2.500 nacimientos mediante fecundación in vitro (FIV) en el mundo y en la actualidad, la técnica de FIV en la especie humana se ha convertido en un tratamiento rutinario en mucho tipos de infertilidad. Sin embargo, el desarrollo de los sistemas de FIV en los animales domésticos, y en concreto en la especie porcina, aunque inicialmente fue escaso, debido sobre todo a la incertidumbre sobre las posibles aplicaciones prácticas de esta técnica, ha ido adquiriendo cada vez una mayor importancia al vislumbrarse un abanico cada vez más amplio de posibilidades en un futuro no demasiado lejano. La FIV es una técnica empleada hoy en día en la mayoría de las especies animales de interés zootécnico y en la especie humana, aunque con fines diferentes. Así, mientras que en la vaca su aplicación comercial y productiva es muy elevada, como lo demuestran los datos relativos al número de embriones producidos in vitro y transferidos anualmente en Sudamérica (196.791, un 67% del total mundial), Asia (82.307, un 28%), Europa (6.845, un 2’4%) o Norteamérica (4.309, un 1’5%; Thibier, 2007), en la cerda es una técnica todavía lejos de utilizarse a este nivel. La FIV ha sido definida como la penetración de espermatozoides capacitados en ovocitos maduros fuera del tracto genital femenino. Sin embargo, esta definición clásica ha sido hoy en día modificada con el desarrollo de la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), que se considera una variante de la FIV tradicional. En cualquier sistema de FIV, los espermatozoides ya sean eyaculados o epididimales, deben ser sometidos a un proceso de capacitación espermática mediante procedimientos in vitro con medios de cultivo adecuados y lavados. Por otro lado, los ovocitos utilizados en los programas de FIV pueden ser ovocitos madurados in vivo o madurados in vitro. Tras el cocultivo de ambos tipos de gametos se procede a la valoración de los resultados de penetración espermática o bien al cultivo adicional de los cigotos resultantes durante un tiempo variable y la posterior transferencia a hembras receptoras en sincronía fisiológica. 66 Figura 1. Lechón transgénico obtenido mediante sistemas de FIV/ICSI (García Vázquez et al., 2008). Sin embargo, no es menos importante el uso de la FIV en la especie porcina en el ámbito de la investigación tanto básica (estudio de moléculas implicadas en la interacción espermatozoide-ovocito, por ejemplo, Coy et al., 2008) como aplicada (producción de animales transgénicos para xenotrasplantes, para obtención de células madre, investigación sobre terapias génicas, transferencias nucleares o biomedicina experimental, etc; García Vázquez et al., 2008, 2010) (Fig.1). En otras especies, como la yegua, la FIV clásica presenta muchas dificultades y se prefiere la fecundación mediante ICSI para la obtención de embriones in vitro (Dell’Aquila et al., 1997), mientras que en la perra, la FIV y el cultivo de embriones se han realizado tanto con la finalidad de generar conocimiento sobre la biología reproductiva en esta especie como con el objetivo de desarrollar métodos de conservación de razas o especies de carnívoros en peligro de extinción (Luvoni et al., 2006). En relación a este último aspecto, cada año se producen nuevos nacimientos de animales de especies muy diferentes en zoológicos o centros de recuperación en los que el uso de esta técnica es una herramienta básica para el éxito del proceso (así, en Enero de 2007 nació el primer bebé rinoceronte por FIV en el Zoológico de Budapest). Finalmente, los datos de la International Embryo Transfer Society (IETS) relativos al incremento progresivo del número de transferencias de embriones en ovejas, cabras y cérvidos (sobre todo en Australia, China y Nueva Zelanda) demuestran que si estos embriones pudieran obtenerse eficazmente in vitro su uso en el sector productivo sería inmediato (Thibier, 2007). En todos los casos, el rendimiento de la FIV está muy alejado del 100% y muy por debajo del porcentaje de éxito que se obtiene en condiciones de fecundación natural. Precisamente por este motivo, la técnica no deja de estar en continua evolución y ser objeto de investigación para mejorarla a todos los niveles, con especial incidencia en la especie humana, donde el número de parejas sometidas a ciclos de FIV aumenta en todo el mundo cada año (Adamson et al., 2006). Uno de los principales problemas que presenta la FIV porcina en la actualidad Fecundación IN VITRO en la especie porcina: Situación actual y perspectivas es la elevada tasa de polispermia, posiblemente debido a que el número de espermatozoides utilizado es demasiado alto en comparación con la fecundación in vivo (Hunter, 1999). Se ha especulado que parte del problema de la polispermia sea debido a una inadecuada maduración ovocitaria; sin embargo, cuando se utilizan ovocitos recién ovulados y fecundados in vitro se obtienen también fecundaciones polispérmicas (Coy et al., 1993a,b,c; Martínez et al., 1993). Además, se han obtenido lechones mediante la transferencia de ovocitos MIV a una hembra receptora y posteriormente inseminada (Coy et al., 1999), lo cual también indica que el problema de la polispermia podría ser inherente a la FIV y no a la MIV. En este sentido, resulta de gran interés la revisión realizada por el Dr. Funahashi (2003) sobre la problemática de la polispermia en los sistemas MIV-FIV en porcino. Otras variables estudiadas en relación a la FIV en esta especie en el intento de conseguir una reducción de la polispermia son: la concentración espermática (Coy et al., 1993b; Xu et al., 1996; Martínez et al., 2002), la procedencia de los espermatozoides (Rath & Niemann, 1997), el volumen del medio de cocultivo (Coy et al., 1993a), los tratamientos de lavado espermático, centrifugación o selección previos a la FIV (Matás et al., 2003; Park et al., 2009), el tiempo de coincubación espermatozoideovocito (Coy et al., 1993c; Martínez et al, 2002; Alminana et al., 2008a) e incluso modificaciones en el propio sistema de cocultivo (microgota vs. pajuela) (Alminana et al., 2008b). En la actualidad, la generación de nuevos conocimientos relacionados con el proceso fisiológico de la fecundación puede tener una aplicación directa en la mejora de los sistemas de fecundación in vitro en las diferentes especies de mamíferos de interés. Así, estudios recientes en este sentido, han conseguido demostrar el efecto beneficioso de una glicoproteína específica del oviducto (oviductina) sobre la monospermia en la vaca y en la cerda (Coy et al., 2008) (Fig. 2). Esta proteína, además, afecta a la viabilidad espermática y mejora la calidad de los embriones producidos. Llegados a este punto, sería de gran interés el intentar producir la proteína recombinante de la “oviductina” para valorar la posibilidad de introducirla en los medios de cultivo que se emplean en FIV. Además, se debe valorar el papel de otras moléculas, como glicosidasas, activador de plasminógeno (Grullón et al., 2008) y de ciertas proteasas en los resultados de FIV, para considerar su posible uso en los medios de cultivo, con el objetivo de conseguir una mejora en el rendimiento de la técnica en cuanto a la calidad y cantidad de embriones producidos in vitro. k MIV-FIV y Cultivo de embriones A continuación, vamos a detallar el proceso en la técnica de FIV a partir de ovocitos que previamente van a ser madurados in vitro. Este método es el que llevamos a cabo en los laboratorios de Fisiología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia. 1. Preparación de medios de manipulación, MIV y FIV de ovocitos porcinos Los medios de manipulación y cultivo de gametos y embriones se caracterizan por ser muy específicos para cada una de las funciones a que están destinados. Por este motivo, distinguiremos los medios de manipulación de los medios de cultivo propiamente dicho. Como su nombre indica, los primeros se emplean para la recogida, transporte y lavado de los gametos, generalmente antes de introducirlos en un cultivo. En estos medios los ovocitos permanecen un tiempo muy limitado, y como se utilizan en el ambiente exterior, es decir nº 30 “fuera” del incubador, necesitan tampones en su composición que mantenga el pH estable si llevan bicarbonato. Los medios de cultivo, por el contrario, se emplean generalmente dentro de un incubador, en una atmósfera CO2 controlada, en ellos los gametos o embriones permanecen durante varias horas o días, y el pH se suele mantener alrededor de un valor de 7’4 mediante el equilibrio que se establece entre el ión bicarbonato que se incluye en su composición, y el CO2 del aire del incubador, que se emplea al 5% Como norma general, los medios de manipulación se preparan con agua bidestilada, o si es posible ultrapura, mientras que los medios de cultivo siempre deben prepararse con agua ultrapura, libre de pirógenos. Una vez preparados, los medios de cultivo se esterilizan por filtración, haciéndolos pasar a través de una membrana con un diámetro de poro de 0.22 μm. Se envasan en recipientes estériles y se guardan en frigorífico (2-8ºC) durante un tiempo variable. En el día de su uso, si se van a suplementar, se hará dentro de una cabina de flujo laminar, para guardar la esterilidad. 1.1. Medios de Manipulación: - Solución de transporte: 0’9% p/v de NaCl con 100 mg/l kanamicina sulfato. - Medio de lavado de ovarios porcinos: Solución de cetrimida (Bromuro de hexadecil-trimetilamonio: Cetab) al 0’04% (w/v). - Medio de recogida y selección de ovocitos: Tampón Fosfato Salino de Dulbecco modificado (PBSDm), suplementado con 1 mg/ml de alcohol de polivinilo (PVA) y 0’005 mg/l de rojo fenol, como indicador de pH. Este medio se conserva a 4ºC hasta su utilización, momento en el cual se atempera en estufa a 39ºC. 1.2. Medios de cultivo: - Medio de maduración de ovocitos porcinos (NCSU-37). Se prepara una solución stock de NCSU-37 de acuerdo con lo descrito por Petters y Wells (1993) con agua ultrapura. A continuación, se esteriliza por filtración haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana (0’22 μm) y se conserva en condiciones estériles a 4°C un máximo de dos semanas. Figura 2. Estudio de moléculas implicadas en la interacción espermatozoide-ovocito “oviductina” (Coy et al., 2008). En el día del uso, se añaden diferentes suplementos que deben prepararse con agua purificada: Solución de eCG/hCG, conteniendo 1000 UI/ml de cada hormona, se añaden 10 μl de la solución a cada poci- 67 Ruiz López, S. llo con 500 μl de NSCU-37. Dibutiril AMP cíclico (dbAMPc, 1 mM), se añaden 10 μl a cada pocillo. `-mercaptoetanol (50 μM). Cisteína (0’57 mM). Insulina (5 mg/l) y fluido folicular porcino (PFF, 10% v/v) (Funahashi et al., 1997). El PFF se obtiene por aspiración de folículos antrales (3-6 mm Ø) de ovarios procedentes del sacrifico en matadero de hembras prepúberes; el contenido folicular aspirado se centrifuga a 1500 g, 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante se dispensa, previa filtración a través de una serie de filtros con un poro de membrana de 0’8, 0’45 y 0’22 +m, este último de baja adsorción proteica, en alícuotas de 1 ml, para proceder a su almacenamiento a -20ºC hasta su uso. - Medio 199 modificado para fecundación in vitro de ovocitos porcinos. Medio 199 con sales de Earle y L-glutamina, sin bicarbonato sódico. El TCM-199 se elabora en laboratorio con agua ultrapura, se esteriliza mediante filtración y se conserva bajo condiciones estériles a 4°C un máximo de cuatro semanas. - Medio TALP para fecundación in vitro de ovocitos porcinos (Medio Fert-TALP). La solución stock de TALP se elabora en laboratorio con agua ultrapura. A continuación, se esteriliza mediante filtración y se conserva bajo condiciones estériles a 4°C un máximo de dos semanas. El medio TALP stock se suplementa con 3 mg/ml de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA-FAF) y 0’12 mg/ ml de piruvato sódico, tal y como describen Rath et al. (1999). El pH se ajusta hasta 7’4 en incubador al 5% de CO2, 38’5°C y atmósfera saturada de humedad durante 3 h antes de su uso - Medio de cultivo de embriones porcinos (NCSU-23). Se prepara según lo descrito por Petters y Wells (1993) con agua ultrapura. A continuación, se esteriliza por filtración haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana con diámetro de 0’22 μm. 2. Obtención de ovocitos Los ovarios procedentes de hembras prepúberes (90-100 Kg/pv) se obtienen en la cadena de matadero y son transportados, en un tiempo no superior a 60 minutos desde el sacrificio, al laboratorio en un recipiente isotermo con solución salina a 38ºC. En el laboratorio, se retiran los restos de oviducto y se lavan en Cetab y solución salina. Se seleccionan los ovarios con buen desarrollo folicular, desechando los que presentan cuerpos lúteos, formaciones quísticas o morfología anormal (Fig. 3) Los ovarios seleccionados se mantienen en solución salina en baño María a 38ºC hasta su procesamiento. atrésicos y con diámetro aproximado entre 3-6 mm. El contenido folicular se recoge en placas de Petri de 35 mm de diámetro sobre placa calefactora, conteniendo medio PBSDm atemperado y suplementado con 1 mg de PVA. Mediante pipetas Pasteur estériles, todo el contenido formado por fluido folicular, complejos cúmuloovocito y PBSDm se lleva a tubos estériles de 10 ml, donde se dejan sedimentar (en placa calefactora) durante aproximadamente 10 minutos. Posteriormente, se elimina el sobrenadante mediante decantación y el sedimento se vierte en placas de Petri con medio PBSDm fresco atemperado. Los COCs se seleccionan mediante estereomicroscopio a 20x y se aspiran mediante pipetas Pasteur de vidrio (estiradas por calor para reducir su grosor y con el extremo romo). La pipeta se conecta a un tubo flexible de silicona, en el que se intercala un filtro para impedir posibles contaminaciones. Solamente se deben seleccionar para la posterior maduración, los COCs obtenidos antes de que transcurran 2 h desde el sacrificio de los animales (Matás et al., 1996), y con un citoplasma granulado y homogéneo, de aspecto compacto y rodeado de al menos 3 a 4 capas de células del cúmulo. 3. Maduración (MIV) Los ovocitos seleccionados para MIV se lavan una vez en PBS atemperado y dos veces en medio NCSU-37, equilibrado previamente a 38’5ºC en incubador con 5% de CO2 y atmósfera saturada de humedad durante aproximadamente 3 h. Los ovocitos en grupos de 50 se cultivan en 500 μl de medio de maduración NCSU-37 suplementado, durante un período de 20-22 h en incubador a 38’5ºC en atmósfera saturada de humedad y 5% CO2. Pasadas 20-22 h de cultivo, los COCs se transfieren a placas “multidish” de 4 pocillos con medio NCSU-37 sin hormonas ni dbAMPc donde se lavan dos veces y se cultivan durante otras 20-22 h (Funahashi y Day, 1993). 4. Fecundación (FIV) de ovocitos porcinos Los ovocitos, cultivados 40-42 h en el medio de maduración NCSU-37, se denudan de las células del cúmulo mecánicamente mediante ligeras aspiraciones con pipeta automática. Posteriormente, se lavan 3 veces en medio TALP y se depositan en grupos de 30-35 ovocitos en microgotas con 50 μl de medio de FIV, equilibrado previamente a 38’5ºC y con 5% CO2 en incubador y atmósfera saturada de humedad, cubiertas con aceite mineral en placas de 4 pocillos. Para la preparación de los espermatozoides, unos 100 μl de semen criopreservado/descongelado se lavan tres veces en 10 ml de PBSDm por centrifugación a 1900g x 3 min. Al finalizar los lavados, se resuspende el sedimento resultante en medio de fecundación suplementado de forma que 50 μl de la resuspensión con la concentración de espermatozoides deseada se adicionen a las microgotas de medio con los ovocitos. Se utilizan de 1000 a 2000 espermatozoides por ovocito y un cocultivo de 2-4 horas (Fig. 4). 5. Cultivo de embriones porcinos Figura 3. Ovario de cerda con folículos adecuados para la obtención de ovocitos. Los complejos cúmulo-ovocito (COCs) se obtienen mediante sección del ovario, con hoja de bisturí estéril, de folículos no 68 Finalizado el tiempo de coincubación, los ovocitos se lavan tres veces en medio de cultivo de embriones (NSCU-23 suplementado con 0’4% de BSA en gotas de 200 μl de medio cubiertas de aceite mineral y se colocan en una placa “multidish” de 4 pocillos para su desarrollo embrionario. En cada pocillo se incuban grupos de 30-50 ovocitos en 500 μl de medio de cultivo de embriones Fecundación IN VITRO en la especie porcina: Situación actual y perspectivas cubierto por aceite mineral y equilibrado previamente 3 horas en incubador a 38’5ºC, 5% CO2, 5% O2 y atmósfera saturada de humedad. 18 horas después de la FIV, algunos ovocitos se fijan y tiñen para valorar los parámetros de fecundación y el resto se dejan en cultivo hasta un máximo de 9 días para analizar y valorar el desarrollo embrionario. 6. Evaluación de resultados 6.1. Valoración de los parámetros de fecundación: Parte de los ovocitos fecundados y cultivados in vitro se fijan a las 16-18 horas post-fecundación y se tiñen para valorar los parámetros de fecundación. Para ello, los ovocitos se lavan en PBSDm, eliminándose mecánicamente el exceso de espermatozoides adheridos, y se colocan en microgotas del mismo medio (1 ovocito/microgota) en un portaobjetos, sobre el cual se colocan previamente dos líneas paralelas de vaselina, depositando un total de 10 ovocitos por portaobjeto. Inmediatamente, se coloca un cubreobjetos sobre el porta, presionando suavemente hasta que el cubre contacta con las microgotas. Los ovocitos son fijados en etanol-acético (1:3, v/v) durante al menos 24 horas y teñidos con colorante lacmoid u orceína (1%) para examen microscópico con contraste de fases (objetivos de 40 y 20 x). nº 30 nº 13 - Rendimiento o eficiencia de la fecundación: porcentaje de ovocitos monospérmicos sobre el total de ovocitos analizados. - Espermatozoides / ovocito: número medio de espermatozoides, en cualquier estadio de descondensación, por ovocito penetrado. 6.2. Valoración del desarrollo embrionario: El resto de ovocitos fecundados y cultivados in vitro se dejan en medio de cultivo de embriones para valorar su desarrollo embrionario in vitro. En el día 5 de cultivo se suplementan los pocillos de medio de cultivo con los embriones con un 10% de suero fetal bovino. Figura 5. Evaluación de FIV mediante fluorescencia (Hoestch). Ovocito monospérmico con dos pronúcleos (izquierda) y ovocito polispérmico con 3 pronúcleos (derecha) (20 x). Los embriones se evalúan a los 2, 7 y 9 días del cultivo, mediante la visualización bajo estereomicroscopio (Fig. 6). Los parámetros a evaluar son los siguientes: - División (“cleavage”): porcentaje de ovocitos que a las 48 h. de la fecundación están divididos en 2-4 células y que además presentan apariencia normal y uniforme en cuanto a tamaño, forma y coloración oscura de cada una de las células. Figura 4. FIV: adición de los espermatozoides a la microgota que contiene los ovocitos. Alternativamente a esta técnica de tinción, puede realizarse la fijación y tinción empleando un fluorocromo (Hoestch). Se debe trabajar con microscopio de fluorescencia excitando con una longitud de onda de 495 nm. Esta técnica tiene como inconveniente el que la membrana nuclear no es visible y que no se pueden distinguir claramente si los espermatozoides compactos están en el interior o fuera del ovocito. Como ventajas podemos destacar, que es una técnica más rápida y limpia que la anterior y la visualización de los pronúcleos resulta muy evidente (Fig. 5). - Blastocistos: porcentaje de ovocitos en alcanzan el estadio de blastocisto a las 144-168 h, considerando sólo aquellos embriones en estadio de blastocisto temprano, expandido o eclosionado, que presentan un forma y coloración oscura adecuada y además con masa celular interna visible. - Eclosionados: porcentaje de blastocistos eclosionados el día 9 de cultivo con respecto al total de blastocistos evaluados el día 7 de cultivo. Los parámetros de fecundación a evaluar son los siguientes: - Ovocitos penetrados: porcentaje de ovocitos madurados nuclearmente (en metafase II) que son penetrados por 1 ó mas espermatozoides. Un ovocito se considera penetrado cuando se observan en su interior los dos corpúsculos polares, el pronúcleo femenino, cabezas espermáticas descondensadas con sus correspondientes flagelos espermáticos y/o pronúcleos masculinos. - Ovocitos monospérmicos: porcentaje de los ovocitos que presentan un pronúcleo femenino, una cabeza espermática descondensada con su flagelo o un pronúcleo masculino y los dos corpúsculos polares sobre el total de ovocitos penetrados. Figura 6. Embriones porcinos in vitro en diferentes fases de desarrollo. 69 Ruiz López, S. 6.3. Resultados esperados: - Ovocitos penetrados: 60-80% - Ovocitos monospérmicos: 50-60% - Eficiencia de la fecundación: 35-40% - Espermatozoides/ovocito: 1’2-1’6 - Divididos: 40% - Blastocistos: 20-25% - Eclosionados: 2-5% COY P, MARTÍNEZ E, RUIZ S, VÁZQUEZ JM, ROCA J, GARCÍA-VÁZQUEZ FA, RUIZ S, GRULLÓN LA, DE ONDIZ MATÁS C. SPERM CONCENTRATION INFLUENCES A, GUTIERREZ-ADÁN A, GADEA J. 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