universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
INSTITUTO DE PATOLOGÍA ANIMAL
EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA DE DOS FORMULACIONES DE VACUNAS
EXPERIMENTALES PARA EL CONTROL DE SEPTICEMIA RICKETTSIAL DEL
SALMÓN (SRS) EN TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss)
Memoria de Título presentada como parte
de los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO
MARÍA IVONNE RODRÍGUEZ SALAMANCA
VALDIVIA – CHILE
2009
PROFESOR PATROCINANTE:
______________________________________
Dr. Ricardo Enríquez S.
Firma
COLABORADOR:
______________________________________
TM Mónica Monrás M.
Firma
PROFESORES CALIFICADORES:
_______________________________________
Dr. Gabriel Morán R.
Firma
________________________________________
Dr. Jorge Toro Y.
Firma
FECHA DE APROBACIÓN:
9 de septiembre de 2009
A mis padres y familia por su
apoyo incondicional, y en
recuerdo de mi bella tía.
ÍNDICE
Capítulo
Página
1. RESUMEN ………………………………………………………………………...1
2. SUMMARY………………………………………………………………………..2
3. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………3
4. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………..9
5. RESULTADOS…………………………………………………………………...16
6. DISCUSIÓN……………………………………………………………………...24
7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………30
8. ANEXOS…………………………………………………………………………35
9. AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………..41
1
1. RESUMEN
La salmonicultura nacional desde sus inicios ha presentado un crecimiento sostenible,
pero junto con ello la sanidad de la industria, que en un comienzo fue un factor a favor, ha ido
cambiando frente al aumento de patógenos causales de masivas mortalidades, entre los cuales
destaca Piscirickettsia salmonis agente de la Septicemia Rickettsial del Salmón (SRS),
afectando principalmente a salmonídeos en la fase marina de cultivo.
Con el fin de contribuir a su prevención, se evaluaron dos nuevas vacunas
experimentales contra P. salmonis en truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de 18 a 30 g.
Los peces después del periodo de aclimatación y chequeo sanitario, se distribuyeron en grupos
denominados formulación 1 (F1), formulación 2 (F2) y control con 72, 72 y 36 especímenes,
respectivamente. Posteriormente, se realizó la vacunación vía intraperitoneal con las
formulaciones experimentales en dosis de 0,1 ml/pez, además de solución fisiológica estéril
(NaCl 0,85%) de igual forma para el grupo control. Después de transcurridos un mínimo de
500 UTA (Unidades Térmicas Acumuladas), se efectuó el desafío de los peces con la
inoculación de P. salmonis cepa R-28 vía intramuscular en dosis de 1x105,82TCID50/0,1ml/pez,
en duplicado (dos estanques por grupo) con agua salada (15-17‰). Durante los 36 días que
duró el desafío, se registró diariamente la mortalidad de los peces y se tomaron muestras para
las pruebas de tinción Gram, Giemsa y PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) usados para
el diagnóstico de SRS.
La eficacia de las vacunas se evaluó mediante el cálculo del porcentaje relativo de
sobrevivencia (RPS). Los valores obtenidos en RPS para las formulaciones experimentales F1
y F2 fueron 54,5% y 40,9 %, respectivamente. Determinando que ambas formulaciones son
deficientes en la protección de trucha arco iris (O. mykiss) para SRS por ser RPS < 70%.
Palabras claves: vacunas, SRS, trucha arco iris.
2
2. SUMMARY
EFFECTIVENESS EVALUATION OF TWO EXPERIMENTAL VACCINES FOR THE
CONTROL OF SALMON RICKETTSIAL SEPTICEMIA (SRS) IN RAINBOW TROUT
(Oncorhynchus mykiss).
Since the beginning, the national salmonculture has presented an exponential growth,
consequently the health status of the fish in intensive production has been affected by
pathogens that produce massive mortality, in wich Piscirickettsia salmonis causes the Salmon
Rickettsial Septicemia (SRS), mainly present in salmonids in seawater phase of production.
In order to contribute to its prevention, two new experimental vaccines against P.
salmonis were assessed in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from 18 to 30 g of body
weight. After a period of acclimatization and to make sure the normal health status, the fishes
were divided into groups called formulation 1 (F1), formulation 2 (F2) and control with 72, 72
and 36 specimens each respectively. Subsequently, vaccination was performed
intraperitoneally with experimental formulations in doses of 0.1ml/fish, in addition with sterile
saline solution (NaCl 0.85%) similarly to the control group. After a minimum of 500 UTA
(Accumulated Thermal Units), the fishes were challenge with the inoculation of P. salmonis
strain R-28 intramuscularly at a dose of 1x105.82 TCID50/0.1ml/fish in duplicate (two pools per
group) in seawater (15-17 ‰). During the 36 days of challenge, daily mortality was recorded
and fish samples were taken for tests staining Gram, Giemsa and PCR (Polymerase Chain
Reaction) were used for the diagnosis of SRS.
In conclusion, the results obtained in RPS (Relative Percentage of Survival) for the
experimental F1 and F2 were 54.5% and 40.9%, respectively. Finally both formulations were
deficient in the protection of rainbow trout (O. mykiss) against SRS, because they showed RPS
< 70%.
Key words: vaccines, SRS, rainbow trout.
3
3. INTRODUCCIÓN
En Chile, las condiciones de la zona austral con una enorme línea costera, aguas con
temperaturas adecuadas, numerosas islas, fiordos y bahías protegidas, han permitido que la
salmonicultura sea una de las actividades más relevantes del país, logrando convertirse en uno
de los principales productores mundiales (Våge 2005).
La salmonicultura nacional en sus inicios estaba en un estado sanitario privilegiado,
pero por la creciente intensificación de su producción, con aumentos en la densidad por jaula,
incremento en la manipulación de los peces y el consecuente estrés en estos, llevó a la
aparición de enfermedades infectocontagiosas causantes de masivas mortalidades, entre los
cuales tomó gran importancia el patógeno Piscirickettsia salmonis (Schäfer y col 1990),
causante de la Septicemia Rickettsial del Salmón (SRS). Esta patología sigue siendo un
problema para la industria, ya que se le atribuye cerca del 80% de la mortalidad de los
salmónidos en la fase de agua de mar con pérdidas económicas estimadas en más de 100
millones de dólares anuales (Bravo y Midtlyng 2007).
Entre las especies susceptibles a SRS se encuentra la trucha arco iris (Oncorhynchus
mykiss), que representa una parte importante de la producción de la industria salmonicultora.
En Chile, durante el período del 2008, la trucha arco iris constituyó el 24% de las
exportaciones de salmónidos, con una producción de 124.827 toneladas netas, representando
el segundo lugar después del salmón del Atlántico (Salmo salar)1.
3.1 SEPTICEMIA RICKETTSIAL DEL SALMON (SRS)
El primer comunicado del patógeno P. salmonis, agente causal de la Septicemia
Rickettsial del salmón, fue documentado por Bravo y Campos (1989a), los que en un principio
reportaron la enfermedad bajo el nombre de Síndrome del salmón coho, ya que al comienzo
parecía limitarse al salmón coho (Oncorhynchus kisutch), presentándose después de cinco a
diez semanas de introducir los peces en el agua de mar. Sin embargo, a principios de 1990 el
síndrome también se encontró en salmón del Atlántico (S. salar), trucha arco iris (O. mykiss) y
salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha) (Garcés y col 1991). Debido al desconocimiento
inicial del agente etiológico, se le denominó U.A., (Unknown Agent: Agente desconocido)
(Fryer y col 1990).
1
http://www.directorioaqua.com/contenido/pdf/Acuicola/Exportaciondesalmonidos/Enero_diciembre_2007_2008
.pdf Consultado el 28 mayo 2009.
4
Fryer y col (1990) y Cvitanich y col (1991) reportaron el aislamiento y características
in vitro del agente. Describieron a la bacteria como gram negativa, inmóvil, acapsulada,
pleomórfica, generalmente cocoide, con un tamaño que puede variar de 0,5 a 1,5 μm de
diámetro; puede estar en pares o en forma de anillo. El microorganismo se describió como
intracelular obligado, se multiplica por división binaria dentro de vacuolas en el citoplasma de
la célula, produciendo efecto citopático (CPE) en cultivos celulares de peces. El CPE se
caracteriza por producir, en un comienzo, la formación de células vacuolizadas que aumentan
en tamaño y número, afectando la monocapa del cultivo celular, provocando la lisis y
desprendimiento de ésta (Lannan y Fryer 1993).
La temperatura óptima para su crecimiento in vitro es de 15 a 18°C, disminuyendo su
replicación bajo los 10°C o sobre los 21°C, y cesando por sobre los 25°C (Fryer y col 1990).
La multiplicación es inhibida por la presencia de antibióticos como estreptomicina,
gentamicina y tetraciclina, pero no así por penicilina (Fryer y col 1990, Cvitanich y col 1991).
Smith y col (1996), evidenciaron un aumento de la resistencia a antimicrobianos como a ácido
oxolínico, flumequina, cloranfenicol, oxitetraciclina, y gentamicina, atribuible al excesivo uso
de estas drogas por años.
Recientemente, Mikalsen y col (2008) lograron el cultivo del patógeno en un medio
bacteriológico en agar y caldo corazón con cisteína y con adición de 5 % de sangre de ovino.
Los ensayos, que utilizaron bacterias aisladas de salmones Atlánticos enfermos de SRS,
mostraron un mejor crecimiento del agente a 22 °C, identificando al patógeno como P.
salmonis confirmado por la secuenciación de su ADN y por caracterización serológica a través
de inmunofluorescencia indirecta (IFAT). Tras lo cual se desafío con el aislado a salmones
Atlánticos reproduciendo la enfermedad.
Por medio de microscopía electrónica, se ha observado a este patógeno rodeado por
dos membranas en su superficie, una membrana externa ondulada y una interna, esas
membranas externas son descritas para algunos tipos de rickettsias. Basados en la morfología
y la característica de intracelular de esta bacteria, fue clasificada en la familia Rickettsiaceae y
tribu Ehrlichieae (Fryer y col 1990). Posteriormente, en base a los estudios de la subunidad
16S del ARN ribosomal, se incluyó al agente dentro de un nuevo género y especie,
clasificándolo como Piscirickettsia salmonis, denominando Piscirickettsiosis a la enfermedad
(Fryer y col 1992). Más tarde, mediante métodos de filogenética molecular, P. salmonis fue
reclasificada dentro de la clase Gammaproteobacteria, generándose una nueva familia
denominada Piscirickettsiaceae (Fryer 2002, Fryer y Hedrick 2003).
Lannan y Fryer (1994), estudiaron la sobrevivencia extracelular de P. salmonis,
indicando que en agua dulce el patógeno se inactiva rápidamente, a diferencia en agua salada,
en donde el agente puede sobrevivir por períodos más prolongados (hasta 14 días),
considerándolo como un factor epidemiológico importante para una posible transmisión
directa de la enfermedad en ambiente marino.
Si bien, el agente se ha reportado en todos las especies de salmónidos cultivados en el
mar, en 1993 se detectó un brote de SRS en un lote de trucha arco iris (de ovas provenientes
5
de Estados Unidos) criadas en jaulas en el lago Llanquihue (Bravo 1994). También, Gaggero y
col (1995), aislaron el agente desde tejido renal de diversos salmónidos enfermos mantenidos
en la fase de agua dulce del ciclo productivo.
En relación al mecanismo de transmisión de la enfermedad, Cvitanich y col (1991),
describieron la transmisión horizontal en salmón coho, entre peces experimentalmente
infectados y peces susceptibles, tanto en agua dulce como en agua salada. Almendras y col
(1997), en estudios con salmón del Atlántico en agua dulce, demostraron la transmisión
horizontal de la enfermedad, que se incrementaba conforme aumentaba el contacto entre peces
y la densidad poblacional. Smith y col (1999) en ensayos con trucha arco iris, evaluaron como
vías de infección la inyección intraperitoneal y subcutánea, papel filtro con el agente en piel y
branquias, intubación intestinal y gástrica, describiendo una mortalidad acumulada de 98 %,
100 %, 54 %, 24 %, 24 % y 2%, respectivamente. Concluyendo que la vía oral no debiera ser
el método normal o principal de inicio de la infección del agente en salmónidos, al comparar
los resultados que evidenciaban mayor mortalidad acumulada para piel y branquias. Además,
Ojeda (2000), logró reproducir el SRS mediante la inmersión de peces en una suspensión del
agente, sugiriendo la posibilidad de transmisión horizontal en ausencia de vectores de P.
salmonis.
Existen ensayos que sustentan también la transmisión vertical. Cvitanich y col (1991),
encontraron la presencia del agente en frotis de diversos órganos, incluidos ovarios, fluido
ovárico y testicular, además de alteraciones patológicas en ovarios de peces infectados natural
y experimentalmente. Estudios realizados por Larenas y col (1996), en el cual hicieron
diversas mezclas de cruza con machos y hembras de trucha arco iris infectadas y no infectadas
con la bacteria, detectaron al agente en las ovas fertilizadas a los 18 días de inoculación,
sugiriendo que la transmisión vertical es posible. Posteriormente, Larenas y col (2005),
utilizaron alevines (5g) provenientes de la cruza de machos y hembras de salmón coho
positivos a P. salmonis. A pesar que estos alevines no mostraron signos clínicos o lesiones de
la enfermedad, de las muestras de riñón y heces analizadas, el 21% de los peces se mostraron
positivos a la infección, presumiendo que los peces se infectaron probablemente vía vertical, y
que además las muestras de heces positivas indicarían la eliminación del agente, favoreciendo
la diseminación del patógeno. Otro estudio describió que la bacteria produce un elemento de
unión a las ovas, mediante la adhesión a ella por prolongaciones similares a pseudópodos,
probablemente originados de la membrana externa de P. salmonis, denominándolo “Complejo
de Adhesión Piscirickettsial” (CAP), lo que permitiría la infección de la ova, favoreciendo así
la transmisión vertical (Larenas y col 2003).
En los peces infectados por P. salmonis se presenta una variedad de signos clínicos
generales, propios de enfermedades septicémicas. Los peces afectados se ubican en los
extremos de las balsas-jaulas, en sentido contrario a la corriente, se muestran letárgicos, suben
a la superficie y no reaccionan a estímulos, también se muestran inapetentes y con respiración
dificultosa (Alvarado y col 1990). Macroscópicamente los peces presentan oscurecimiento de
la piel (en especial dorso y flancos), fragilidad de las escamas, abdomen abultado, hemorragia
perianal y en algunos casos ocular (bilateral), petequias en la zona del vientre, úlceras en la
piel de aproximadamente 2 cm de diámetro y palidez branquial. A nivel cutáneo, uno de los
6
primeros signos es la aparición de induraciones epidérmicas en la zona de los flancos y el
abdomen (Bravo y Campos 1989a y 1989b, Alvarado y col 1990, Branson y Nieto 1991,
Cvitanich y col 1991).
En el examen anatomopatológico, se aprecia ascitis serosanguinolenta, el estómago se
observa sin alimento y dilatado, la vesícula biliar se puede encontrar pletórica (indicando que
los peces no han comido por un largo tiempo), hemorragias petequiales y equimóticas en la
mayoría de los órganos internos, renomegalia, hepatomegalia y esplenomegalia. El hígado se
muestra pálido y se pueden apreciar nódulos blanquecinos tanto superficiales como en el
parénquima. El bazo y corazón también pueden presentar estos nódulos (Alvarado y col 1990,
Cubillos y col 1990, Cvitanich y col 1991).
Histopatológicamente, se describen lesiones severas en diversos órganos y tejidos
como riñón, hígado, bazo, cerebro, corazón, intestino, ovario y branquias. Se pueden observar
también lesiones vasculares con infiltrado de células inflamatorias en la periferia de los vasos,
degradación vacuolar y necrosis celular. En general P. salmonis se puede encontrar en
cualquier órgano y tejido del organismo del pez, donde se puede apreciar macrófagos
conteniendo microorganismos tipo rickettsiales dentro de su citoplasma (Cubillos y col 1990,
Cvitanich y col 1991, Larenas y col 1995).
Para el diagnóstico de la enfermedad en Chile, los métodos para la detección de P.
salmonis que se utilizan principalmente son cultivo celular, Reacción en Cadena de
Polimerasa (PCR) y técnicas inmunológicas como inmunofluorescencia (IFAT) e
inmunoensayo (ELISA), según Espinoza (2004).
3.2 VACUNACIÓN
Las vacunas en medicina veterinaria son una parte integral en las estrategias sanitarias
aplicadas en sistemas de producción intensiva. De esta forma, la inmunoprofilaxis ha tomado
un rol importante en la industria acuícola a nivel mundial (Thorarinsson y Powell. 2006). Las
vacunas en salmones tienen una base similar al resto de los animales, con antígenos que
generan la producción de anticuerpos que protegen al individuo inoculado frente al agente
causal de una determinada enfermedad (Karunasagar y Karunasagar 1999).
Inicialmente estas vacunas se desarrollaron a base de bacterinas y virinas, o sea, el
patógeno inactivado. Posteriormente, con el uso de una mayor biotecnología se sumaron las
vacunas recombinantes y las de ADN, en la cuales se trabaja mediante los genes que producen
los antígenos. Respecto a las vacunas de ADN, aún existe temor a su uso por el cuestionado
manejo genético y la limitada comprensión respecto de la liberación de estas en el medio
ambiente (Gillund y col 2008).
La estrategia de vacunación, o sea, la ruta de inmunización con el antígeno tiene un
directo impacto con el nivel y tipo de inmunidad protectiva que desarrolla el pez
7
(Karunasagar y Karunasagar 1999). Según Horne (1997), se cuenta con tres métodos básicos
de vacunación en peces, la inmersión, administración oral y la inyección.
El uso de vacunas en Chile se inicio a comienzos de los 80’s, cuando los primeros
stock de salmón coho fueron vacunados contra vibriosis antes de ser transferidos a mar. Sin
embargo, después de unos años se discontinuo esta práctica al no haber evidencia de la
enfermedad en Chile. Posteriormente, vacunas contra yersiniosis comenzaron a utilizarse en
1995, tras presentarse el primer brote de la Enfermedad de la Boca Roja (ERM) en salmón
atlántico en 1992. Desde entonces la vacunación se ha ido convirtiendo poco a poco en una
práctica común en la industria nacional (Bravo y Midtlyng 2007).
Se ha demostrado que la vacunación es una estrategia eficaz para el control de
enfermedades en pisciculturas, como se ha observado para diversas patologías causadas por
agentes tales como Yersinia ruckeri, Aeromona salmonicida subsp. salmonicida y virus de la
necrosis pancreática infecciosa (IPNv), entre otros. Sin embargo, aún existen patologías que
no cuentan con una solución eficiente mediante la vacunación para su adecuado control, como
sucede para los patógenos P. salmonis o el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAv)
(Uribe 2009).
Actualmente en Chile existen productos biológicos inmunológicos para uso en
salmónidos contra P. salmonis, los que habitualmente suelen ser vacunas mixtas, los que se
encuentran registrados en el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), dentro de los cuales se
puede mencionar a los producidos por el laboratorio Novartis Chile S.A. con sus vacunas
inactivadas en emulsión inyectable Birnagen Forte 2 y Birnagen Forte 4, ambas contra IPN y
SRS, además de Vibrio ordalii y Aeromonas salmonicida para esta última, así también, otra
opción de vacuna de similares características es Alpha Ject Micro 2 contra SRS e IPN, del
laboratorio Pharmaq AS Chile Ltda2.
En general, se buscan programas de desarrollo de vacunas mixtas, que permitan un
gran avance en la prevención de las pérdidas asociadas a múltiples patógenos (Bravo y
Midtlyng 2007). Además, también se busca complementar la estrategia de vacunación con la
implementación de rigurosas medidas de bioseguridad y el uso de inmunoestimulantes como
nucleótidos, glucanos y probióticos en la producción acuícola, disminuyendo la utilización de
tratamientos terapéuticos (antibióticos) y mejorando los efectos de los productos de
vacunación, convirtiéndose en un medio para alcanzar mejores indicadores productivos (Uribe
2009).
Dentro de los métodos utilizados para evaluar la eficacia y potencia de una vacuna se
utilizan el porcentaje relativo de sobrevivencia (RPS), el aumento de la dosis letal 50 (DL50) y
el aumento en el título de anticuerpos específicos neutralizantes. Nordmo (1997), señala el
2
http://www.sag.gob.cl/OpenDocs/asp/pagVerRegistro.asp?argRegistroId=3294&argInstanciaId=56&argCarpetaI
d=1564&argTreeNodosAbiertos=(1564)(-56)&argTreeNodoActual=1564&argTreeNodoSel=-56 Consultado 28
mayo 2009
8
RPS como un método adecuado para evaluar en forma objetiva los resultados de una vacuna,
mediante el desafío de grupos de peces vacunados y no vacunados con al agente patógeno en
estudio, utilizando las mortalidades obtenidas durante el ensayo en la fórmula matemática del
RPS que proporciona la sobrevivencia atribuible a la vacunación.
3.3 HIPÓTESIS
Las truchas arco iris vacunadas con las formulaciones experimentales 1 y 2 presentan
menor mortalidad que las no vacunadas al desafío con P. salmonis.
3.4 OBJETIVO GENERAL
El objetivo general es determinar la eficacia de dos formulaciones de vacuna contra P.
salmonis en trucha arco iris.
3.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Inocular P. salmonis en truchas arco iris vacunadas con dos formulaciones experimentales
de vacunas anti P. salmonis y en controles inoculadas con solución fisiológica estéril.
•
Registrar las mortalidades diarias y realizar el diagnóstico presuntivo y cuantificación de la
presencia de P. salmonis en órganos, además de aplicar PCR- P. salmonis a muestras de
cada grupo como prueba confirmatoria.
•
Calcular el Porcentaje de Mortalidad Acumulada (PMA) y el Porcentaje Relativo de
Sobrevivencia (RPS) de las truchas arco iris vacunadas y no vacunadas.
9
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1. MATERIALES
4.1.1. Peces
Se utilizó un total de 195 truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss), con un peso entre
18 a 30 g, promediando 22,5 g. Originarios de una piscicultura sin historial de SRS, fueron
trasladados en bidones hasta las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología y Patología
Acuática de la Universidad Austral de Chile.
4.1.2. Patógeno para el desafío
Se trabajó con un aislado nacional mantenido en nitrógeno líquido de Piscirickettsia
salmonis cepa R-28 perteneciente al cepario del laboratorio. Para el cultivo de P. salmonis se
utilizó la línea celular CHSE-214 (embrión de salmón chinook) en medio de cultivo MEM
(Medio Mínimo Esencial) y suero fetal bovino.
4.1.3. Materiales de experimentación y equipos
Para la recepción y mantención de los peces en la Sala de Estanques del laboratorio, se
utilizaron 3 estanques de plástico de 200 l, con agua dulce proveniente de una vertiente y
renovada constantemente, cada uno con una bomba de aireación y filtro de carbón activado,
más un termómetro (°C).
Para la mantención de los peces en la Sala de Inoculación Experimental, se
dispusieron de 6 estanques de fibra de vidrio de 100 l de capacidad, cada cual con su filtro de
carbón activado, calefactor, termómetro y dos bombas de aireación una constante y una de
emergencia. Llenados con agua salada (15-17‰) proveniente del Laboratorio Costero de
Recursos Acuáticos Calfuco perteneciente a la Universidad Austral de Chile.
Los materiales utilizados en ambas instalaciones, propios de cada una de las salas
mencionadas, fueron entre otros, quechas, baldes, mangueras, pediluvio, etc. Tanto para estos
instrumentos como para las aguas utilizadas se uso cloro 5% como desinfectante.
Para la vacunación e inoculación del patógeno en los peces se utilizaron jeringas de
tuberculina, guantes de látex, benzocaína al 20% y baldes. Para el caso particular de la
vacunación se utilizaron 2 formulaciones experimentales, entregadas por el fabricante y
almacenadas en el laboratorio, además solución fisiológica estéril (NaCl 0,85%) para el grupo
no vacunado o control.
10
4.2. MÉTODO
El diagrama a continuación resume el diseño experimental.
Transferencia desde
Piscicultura a Sala
Estanques
Término de la
evaluación 36 días
post inoculación
Aclimatación y
Chequeo Sanitario
Vacunación con las
formulaciones y
Sol. Fisiológica
Preparación de
P. salmonis
Mantención en Sala
de Estanques
mínimo 500 UTA
Registro diario
mortalidades,
pruebas y exámenes
Desafío de los peces
4.2.1. Cultivo celular y aislamiento de P. salmonis
Para el cultivo de P. salmonis se usó la línea celular CHSE-214. La temperatura de
multiplicación y mantención de las células fue de 20°C. La inoculación se realizó en una
monocapa celular de 24 h con medio de cultivo MEM, adicionado con 10% suero fetal bovino
para mantención celular y un 2% del mismo para inoculación, sin antibióticos. La incubación
se realizó a 15°C por 15 días o hasta que el efecto citopático alcanzara el 90%.
4.2.2. Conformación de grupos a vacunar
Las trucha arco iris (O. mykiss) de 22,5 g promedio, se les realizó un chequeo sanitario
a una muestra de estos considerando un chequeo bacteriológico y virológico, según protocolo
estándar del laboratorio.
11
Luego los peces se distribuyeron en tres grupos de 36, 72 y 72 especímenes para el
grupo control, F1 y F2, respectivamente. Estos fueron dispuestos en estanques de 200 l con
agua dulce y renovación constante, a temperatura ambiente, aireación por medios de bombas
de aire, además del uso de filtros de carbón activado para la limpieza del agua. Se mantuvieron
por un periodo de aclimatación (10 días) y fueron alimentados con una dieta comercial
pelletizada en cantidad de 2% del peso vivo distribuido mañana y tarde, como dieta de
mantención.
Para mantener limitado el ingreso de microorganismos patógenos se mantuvo cuidado
en el ingreso a la sala de estanques, exigiendo uso de botas desinfectadas en pediluvio con
cloro 5% y limpieza de manos con alcohol 75%.
4.2.3. Vacunación
Posterior a la formación de los grupos y establecido el correcto estado sanitario y su
aclimatación, se procedió a la vacunación. Los peces se prepararon con un ayuno previo de 24
h y al momento de ser vacunados, fueron anestesiados con benzocaína en dosis de 20 mg/l,
tras lo cual los especímenes fueron inoculados vía intraperitoneal (i.p.) con las formulaciones
de vacuna experimental 1 y 2 (Proyecto Fondef DO3i1137 de la Pontificia Universidad
Católica de Valparaíso) en dosis de 0,1 ml/pez para el grupo F1 y F2 (según recomendaciones
del fabricante), y solución fisiológica estéril (NaCl 0,85%) en igual dosis para el grupo control
(Tabla N° 1 y Anexo 1).
Tabla N° 1: Distribución de la vacunación i.p. para la prueba de potencia de 2 formulaciones
experimentales rotuladas F1 y F2 para P. salmonis en trucha arco iris (O. mykiss) de 18-30 g,
en agua dulce.
Grupo/Estanque
Sustancia
Control
F1
F2
Sol. Fisiológica
Formulación 1
Formulación 2
Dosis ml/pez N° Peces
0,1
0,1
0,1
36
72
72
Tras la vacunación y con un día de descanso, se alimentaron de igual forma según el
2% del peso vivo distribuido mañana y tarde. Los peces se mantuvieron en la Sala de
Estanques, con agua dulce a temperatura ambiente con sus respectivos filtros y bombas de
aire.
De forma diaria tanto en la mañana como en la tarde, se registró la temperatura de los
estanques calculando el promedio, con lo cual se calculó la sumatoria de esta medida hasta
alcanzar las 500 Unidades Térmicas Acumuladas (UTA), considerado el punto de partida para
el desafío con la bacteria (Anexo 2).
12
4.2.4. Desafío
Cumplido las 500 UTA para los dos grupos vacunados y control, se dio paso a la
inoculación de los peces con peso entre 20 a 35 gramos (promedio de 25 g) con el agente P.
salmonis.
El desafío se realizó en la Sala de Inoculación Experimental del Laboratorio,
trasladando los peces desde la Sala de Estanques, para su posterior inoculación.
Cada grupo fue dividido en dos estanques de 100 l de capacidad denominados a y b
(duplicados), llenados con agua según el número de peces que contenían, manteniendo una
densidad cercana a 1 especímen por cada 2 l de agua (aproximadamente 12,5 kg/m3). Los
estanques contaron con igual implementación que la señalada en la etapa anterior, agregando
la adición de una bomba de emergencia conectado a un generador eléctrico en caso de corte de
electricidad y de calefactores regulados en 14ºC. El tipo agua que se utilizó en estos estanques
para el desafío, fue agua de mar mezclada con agua dulce para obtener una salinidad de entre
15 a 17 ‰ medidos con densímetro. Cada tres días se realizó cambio de agua (hasta el 50% de
su contenido), junto a esto se efectuó lavado de filtros y desinfección del agua eliminada con
cloro (5%) durante 24 h mínimo antes de su evacuación.
Para la prueba de potencia de las vacunas experimentales se inocularon vía
intramuscular (i.m.), el agente P. salmonis cepa R-28 en dosis de 1x105,82 TCID50/0,1ml/pez,
según dosis letal 50 (DL50) (Rojas2000), como se muestra en la siguiente tabla.
Tabla N° 2: Inoculación intramuscular de P. salmonis cepa R-28 para el desafío en trucha
arco iris (O. mykiss) de 20-35 g, en duplicado de las formulaciones 1 y 2, además de los
controles, en agua salada a 15-17 ‰ y 14 °C.
Estanque
C(a)
C(b)
F1(a)
F1(b)
F2(a)
F2(b)
Grupo
Control
Control
F1
F1
F2
F2
Vacuna
Suero fisiológico
Suero fisiológico
Formulación 1
Formulación 1
Formulación 2
Formulación 2
Dosis por pez
5,82
1x10
1x105,82
1x105,82
1x105,82
1x105,82
1x105,82
N° de peces
18
18
36
36
36
36
Inoculados los peces y ya en sus respectivos estanques, transcurridos 3 días post
desafío, se volvieron a alimentar de igual forma que para el resto del ensayo con una ración
diaria de alimento comercial del 2% del peso vivo promedio de los especímenes, según el
número de peces en cada estanque, distribuido mañana y tarde.
Se acordó como duración del desafío, cuando la mortalidad del grupo control fuera
50% aproximadamente y se estabilizara en dos a tres días.
13
4.2.5. Mortalidad diaria y exámenes para comprobar presencia del agente durante el
desafío
La mortalidad se evaluó a partir del día cero (día de inoculación) de forma diaria
mínimo dos veces (mañana y tarde), observándose las condiciones y comportamiento en que
se encontraban los peces desafiados, registrándose las mortalidades incluyendo en este grupo a
los especímenes moribundos, o sea, aquellos que presentaran natación errática, evidencia
externa de enfermedad o actitud anormal como anorexia y separación del cardumen.
A los especímenes que se encontraron muertos o moribundos, se les trasladó hasta las
instalaciones correspondientes del laboratorio, para la realización de las necropsias junto a
todo el material estéril necesario.
Para cada caso en particular, se comenzó con la observación externa del pez buscando
lesiones evidentes que pudieran corresponder a los típicos de SRS. Finalizado lo anterior, y
tras una limpieza externa de la piel con alcohol 75%, se tomó una muestra de sangre con
jeringa de tuberculina de la vena caudal, o bien, por corte de pedúnculo, para realizar el
correspondiente frotis de sangre. En él se realizó tinción Giemsa, para observación de células
de la línea blanca (en especial macrófagos) en donde se busco mediante microscopía óptica a
aumento de 1000X la presencia de microorganismos tipo Rickettsiales intracelular, como
indicio de la presencia P. salmonis.
Se continuó con la inspección interna, para esto mediante bisturí y tijera se procedió la
necropsia. Se observaron en busca de alteraciones los órganos hígado, bazo y riñón, además
de musculatura, intestino y características generales del abdomen. De hígado, bazo y riñón
anterior se hicieron improntas sobre portaobjeto para hacer tinción Gram, tras lo cual,
mediante microscopio óptico con aumento de 1000X, se busco la presencia de
microorganismos gram negativos intra y extracelulares con la morfología y distribución
típicos de P. salmonis, los que además fueron cuantificados por campo observado en cada uno
de los órganos mencionados. Se utilizó como referencia el siguiente criterio:
•
•
•
•
- :
+ :
++ :
+++:
0 bacterias
< 10 bacterias
≥ 10 y < 50 bacterias
≥50 bacterias
Para los frotis de sangre con tinción Giemsa se indico la presencia o ausencia del
agente sospechoso P. salmonis con las letras P y A, respectivamente. La cuantificación del
agente se describe en el Anexo 3.
Los peces examinados, luego de la inspección y toma de muestras, fueron eliminados
previa esterilización por autoclave.
14
4.2.6. Diagnóstico por prueba de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR).
Como prueba confirmatoria de la presencia, infección y mortalidad por P. salmonis, se
tomó muestra de riñón anterior para realizar examen de PCR anidado en el Laboratorio de
Biotecnología y Patología Acuática de la Universidad Austral de Chile.
Los tejidos de riñón anterior se maceraron, individualmente, dentro de bolsas estériles
para homogenizar la muestra. Estas muestras se pasaron a tubos Eppendorf y se mantuvieron
congeladas a -20 °C hasta que se tuvieran todas las muestras necesarias para la realización de
la prueba.
De forma individual a cada muestra mediante digestión enzimática se extrajo su
material genético y se separó de los restos celulares. Con el DNA genómico se realizó el PCR
anidado inicialmente con dos partidores universales de eubacterias, UN 5´ACG GAT ACC
TTG TTA CGA GTT 3´ y EB 5´AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3´, para la primera
amplificación del fragmento de aproximadamente 1500 pares de bases (pb) del DNA
ribosomal (DNAr) en 35 ciclos. El producto de PCR correspondiente al gen 16S se utilizó
posteriormente como templado en una segunda amplificación de PCR anidado con partidores
específicos para P. salmonis, PS2A2 (223f) 5´CAT GGA GAT GAG CCC GCG TTG 3´ y
PS2A2 (690r) 5´GCT ACA CCT GCG AAA CCA CTT 3´, que dan origen a un fragmento de
470 pb, en igual número de ciclos.
Los productos de PCR anidado específicos de P. salmonis, fueron resueltos en una
electroforesis en gel de agarosa 1,5%, teñido con bromuro de etidio, comparando su migración
con un control positivo y un estándar de DNA de 100 pb. Terminado esto se llevó a
observación con luz ultravioleta y se fotografió el resultado.
4.2.7. Análisis de Resultados
De los datos obtenidos de las mortalidades diarias y la comprobación de la
participación de la bacteria a través de los exámenes, se trabajo con dos fórmulas. Es así que la
eficacia de las vacunas se evaluó mediante el Porcentaje de Mortalidad Acumulada (PMA) y
el Porcentaje Relativo de Sobrevivencia (RPS) presentados a continuación.
PMA=
RPS=
N° Individuos muertos por P. salmonis
N° De individuos al inicio
1 - % Mortalidad de peces vacunados
% Mortalidad de peces control
X 100
X 100
15
4.2.8. Pruebas realizadas en los especímenes sobrevivientes al desafío
Los peces sobrevivientes al periodo de ensayo, fueron sacrificados con sobredosis de
Benzocaína, de los cuales se tomaron 5 peces de cada uno de los estanques, a los que se les
realizó la necropsia individual correspondiente con su toma de muestra y tejidos para realizar
las tinciones antes mencionadas.
16
5. RESULTADOS
Este ensayo tuvo un periodo de desafío de 36 días de duración a contar desde el
momento de la inoculación de P. salmonis en las truchas arco iris. Se excluyeron de los
resultados el estanque b control y el estanque a del grupo F2 por fallas técnicas en la
oxigenación que significaron la eliminación de los peces.
5.1. ACLIMATACIÓN, CHEQUEO SANITARIO Y VACUNACIÓN
Durante la aclimatación no se observaron alteraciones en los peces, sólo el estrés
natural de ellos producto del traslado hasta las instalaciones.
En la realización del chequeo sanitario no se evidenció presencia de patógenos
bacterianos, virales o alteraciones que intervinieran en el ensayo.
En el procedimiento de vacunación y durante los 512 UTA alcanzados, no se
presentaron mortalidades en los peces.
5.2. REGISTRO DE MORTALIDADES
A contar desde el momento de inoculación se registraron las mortalidades de los
especímenes de forma diaria, indicando el día, grupo y el duplicado (estanque a o b) afectado.
En las mortalidades de los estanques que tuvieron fallas en sus bombas de aireación, los cuales
se excluyeron de los análisis, no se detectó mediante necropsia y tinción Gram evidencia de
SRS como bacterias tipo P. salmonis, ni otro tipo de patología. Estos datos están expresados
en la Tabla N° 3.
17
Tabla N° 3: Registro de mortalidades diarias de trucha arco iris (O. mykiss) de 20 a 35 g
inmunizados con la formulación 1 (F1) y formulación 2 (F2) y los no inmunizados del grupo
control, post desafío con P. salmonis i.m., a 14ºC y 15 – 17 ‰ de salinidad, según duplicado
(estanque a y b)
Día post
desafío
Control (n=36)
F1 (n=72)
a
a
b
7
10*
8
2*
9
6*
12
1
17
1
20
1
21
1
22
1
1
24
1
25
1
26
1
28
1
1
29
1
30
31
1
1
32
2
1
33
1
34
1
2
35
1
36
1
Total
11
18*
12
* Mortalidad por fallas en la bomba de aireación.
F2 (n=72)
b
a
b
1
1
1
1
1
1
1
1
8
31*
5*
36*
1
2
1
2
4
1
2
13
5.3. EXAMEN ANATOMOPATOLÓGICO
5.3.1. Signología clínica, lesiones externas e internas
Los especímenes muertos y moribundos durante el desafío, presentaron en su gran
mayoría signos como anorexia, oscurecimiento de la piel, exoftalmia, alteración de la
natación, movimiento opercular aumentado y disminución de reacción a estímulos. Así
también se observó por medio de la necropsia, lesiones externas como palidez branquial,
abdomen abultado, úlceras con compromiso muscular en la zona de inoculación intramuscular
18
(i.m.), lesiones internas como ascitis serosanguinolenta, hemorragias petequiales en
musculatura, renomegalia, esplenomegalia y hepatomegalia con palidez y nodulaciones
blanquecinas en este último. En la Figura 1 se pueden apreciar para los tres distintos grupos
F1, F2 y control las alteraciones mencionadas.
A
B
C
D
Figura 1. Especímenes de truchas arco iris (O. mykiss) de 25g promedio, desafiadas con P.
salmonis. La figura 1A, muestra lesiones externas como oscurecimiento de la piel y úlceras
con compromiso muscular. La figura 1B, muestra un control con nodulaciones blanquecinas
en hígado. La figura 1C, muestra un vacunado (formulación 1) con palidez branquial,
abdomen abultado y úlcera en piel. Figura 1D, muestra un vacunado (formulación 2) con
nodulaciones en hígado y esplenomegalia
5.3.2. Examen microscópico
En las Figuras 2 y 3, se puede apreciar la evidencia microscópica del agente P.
salmonis, encontrado en los tres grupos en ensayo mediante las tinciones Gram y Giemsa.
19
Figura 2. Impronta de riñón anterior
con tinción Gram, se observa presencia
organismos tipo Rickettsia intra y extra
celulares. Aumento aproximado 1100X.
Figura 3. Frotis de sangre con tinción
Giemsa, se observa presencia de bacterias
cocoides intracelulares en macrófagos.
Aumento aproximado 1100X.
La cuantificación de la bacteria mediante tinción Gram y de la presencia del agente en
tinción Giemsa, se muestran en la Tabla N°4.
Tabla N° 4: Cuantificación de organismos tipos Rickettsiales en tinción Gram para hígado
(H), bazo (B) y riñón (R) según criterio de cantidad expresadas por cruces. Además de tinción
Giemsa de frotis de sangre (S) para ver presencia (P) o ausencia (A) del agente, y con s/m para
los casos sin muestra. Para cada una de las truchas arco iris (O. mykiss) desafiados con P.
salmonis i.m. muertos/moribundos durante los 36 días post desafío.
H
Control a
B
R
++
++
++
++
++
++
++
++
+
++
+
++
++
+
++
+
+
+
++
++
+
+
S
++ P
+
P
++ P
++ P
+
P
+
P
++ P
++ P
++ s/m
+
P
+
P
H
F1 a
B
R
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+
+
++
++
+
++
++
+
++
++
++
+
+
+
++
++
+
+
++
++
++
++
++
+
+
+
S
H
F1 b
B
R
s/m
s/m
P
P
P
P
P
P
P
s/m
P
P
+
++
++
++
++
++
+
+
++
++
+
++
+
+
++
+
S
H
F2 b
B
R
++ P ++ ++ ++
+ s/m +++ ++ ++
++ P ++ +
+
++ P +++ + ++
++ P +++ ++ ++
+
P ++ ++ ++
++ P ++ ++ ++
+
P
+ ++ ++
+
+ ++
++ ++ ++
++ ++ ++
++ ++ ++
++ +
+
- : 0 bacterias; + : < 10 bacterias; ++ : ≥ 10 y < 50 bacterias; +++ : ≥50 bacterias
S
s/m
P
P
P
s/m
P
P
P
P
P
P
P
P
20
5.4. PRUEBA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Como prueba confirmatoria de la infección y mortalidad por P. salmonis se realizó la
prueba de PCR anidado a las muestras de riñón anterior tomadas para los grupos control
estanque a, F1 estanque a y b, y F2 estanque b. Los resultados se muestran en la Figura 4 con
la electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % del producto de amplificación de PCR anidado.
pb St (+)
(-)
A
B
C
D
(+)
1000
500
400
300
200
100
Figura 4. Resultado de PCR anidado del fragmento diagnóstico para identificación y
confirmación de la infección por P. salmonis. St: Estándar; (+): control positivo; (-): control
negativo; los grupos de ensayo, A: control estanque a; B: F1 estanque a; C: F1 estanque b; D:
F2 estanque b. La fecha indica el segmento de 470 pb específico para la bacteria.
Se observa banda específica de P. salmonis al coincidir con el control positivo en los
470 pb en el gel de agarosa (indicado en la flecha), confirmando la presencia del agente
patógeno en los peces.
5.5. CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE MORTALIDAD ACUMULADA (PMA) Y
PORCENTAJE RELATIVO DE SOBREVIVENCIA (RPS)
Para los grupos desafiados, se consideró la mortalidad registrada en la Tabla N° 3,
como causada por P. salmonis a los especímenes que mostraron signología y lesiones
semejante a SRS y que por microscopía óptica mostrasen los microorganismos tipo
Rickettsiales, junto a los resultados positivos de PCR anidado para cada duplicado. Se
excluyeron por esta consideración el estanque b del grupo control y el estanque a del grupo
21
F2, por fallas en sus bombas de aireación. A continuación se presenta la mortalidad diaria,
acumulada y el Porcentaje de Mortalidad Acumulada (PMA), en la Tabla N° 5 y Figura 5.
Tabla N° 5: Mortalidad diaria (D), acumulada (A) y porcentual acumulada (PMA), en trucha
arco iris (O. mykiss) de 20 a 35 g inmunizados con la formulación 1 (F1) y formulación 2 (F2)
y los no inmunizados del grupo control, post desafío con P. salmonis i.m., a 14ºC y 15 – 17 ‰
de salinidad.
F1
F2
Control
Días post
Desafío
D/A
PMA
D/A
PMA
D/A
PMA
12
17
20
21
22
24
25
26
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Total
0/0
0/0
1/1
1/2
1/3
2/5
1/6
1/7
1/8
1/9
1/10
2/12
1/13
0/13
3/16
2/18
2/20
20
0
0
1,39
2,78
4,17
6,94
8,33
9,72
11,11
12,50
13,89
16,67
18,06
18,06
22,22
25,00
27,78
27,78
0/0
0/0
0/0
1/1
2/3
1/4
2/6
0/6
0/6
0/6
4/10
0/10
0/10
1/11
0/11
2/13
0/13
13
0
0
0
2,78
8,33
11,11
16,67
16,67
16,67
16,67
27,78
27,78
27,78
30,56
30,56
36,11
36,11
36,11
1/1
1/2
0/2
0/2
1/3
0/3
1/4
0/4
1/5
1/6
0/6
1/7
2/9
1/10
1/11
0/11
0/11
11
5,56
11,11
11,11
11,11
16,67
16,67
22,22
22,22
27,78
33,33
33,33
38,89
50,00
55,56
61,11
61,11
61,11
61,11
22
Porcentaje de Mortalidad Acumulada (PMA) atribuible a P. salmonis en trucha
arco iris (O. mykiss )
70.00
60.00
%
50.00
Control
40.00
F1
30.00
F2
20.00
10.00
0.00
12 17 20 21 22 24 25 26 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Días post desafío
Figura 5. Porcentaje de Mortalidad Acumulada (PMA) en trucha arco iris (O. mykiss) de 20 a
35 g, desafiados con P. salmonis para el grupo control y de las vacunas experimentales (F1 y
F2), durante un periodo de 36 días post desafío, a 14ºC y 15 a 17 ‰ de salinidad.
Las variables para el cálculo de RPS, obtenidos de la Tabla N° 5, para cada uno de los
grupos testeados fue el siguiente:
% Mortalidad peces vacunados con la Formulación 1:
27,78%
% Mortalidad peces vacunados con la Formulación 2:
36,11%
% Mortalidad peces no vacunados o Control:
61,11%
RPS Formulación 1:
1 -
27,78
61,11
X 100 =
54,54%
RPS Formulación 2:
1 -
36,11
61,11
X 100 =
40,91%
23
5.6. PECES SOBREVIVIENTES AL DESAFÍO CON P. SALMONIS
Al término del ensayo se sacrificaron los peces sobrevivientes a la prueba de potencia
de las formulaciones de vacuna y peces controles. Los resultados de los peces de cada
estanque se muestran a continuación, según el mismo criterio que para las mortalidades.
Tabla N° 6: Cuantificación de microorganismos tipos Rickettsiales en trucha arco iris (O.
mykiss) mediante tinción Gram para hígado (H), bazo (B) y riñón (R) expresadas por cruces y
tinción Giemsa de frotis de sangre (S) para ver presencia o ausencia del agente, indicado con P
y A, respectivamente, y con s/m para los casos sin muestra (1000X). .
F1 a
F1 b
Muestra
n°
H B R S H B R S
F2 b
H
B
Control a
R S H B R S
1
- - - A + + + s/m ++ ++ + P - - - A
2
+ ++ + P + + + s/m ++ ++ ++ P - - - A
3
+ + + P - - - - ++ ++ ++ P - - - A
4
- - - A + + + + + + + P - - - A
5
- - - A - - - A + + + P - - - A
- : 0 bacterias; + : < 10 bacterias; ++ : ≥ 10 y < 50 bacterias; +++: ≥50 bacterias
24
6. DISCUSIÓN
El objetivo del estudio fue evaluar dos nuevas formulaciones experimentales contra
Piscirickettsia salmonis. Para ello, se utilizaron especímenes de trucha arco iris
(Oncorhynchus mykiss) provenientes de una piscicultura de la zona, no vacunados y sin
registros de brotes de enfermedades infecciosas como Septicemia Rickettsial del Salmón
(SRS) o piscirickettsiosis, de manera que se evitara la posibilidad de inmunidad previa o de
que el agente estuviese en los peces a desafiar. Así también, en el periodo de adaptación
(previo al desafío), como sugiere Amend (1981), se examinaron sanitariamente los peces,
mediante inspección y pruebas de bacteriología y virología realizados en el chequeo sanitario,
en el cual no se observaron alteraciones de los especímenes más que sólo el provocado por el
estrés propio del transporte, corroborando el buen estado sanitario de los peces y
disminuyendo la posibilidad de generar resultados erróneos.
Para la vacunación se utilizó la vía clásica con inyección intraperitoneal (i.p.), por ser
una excelente forma de asegurar la dosis individual de cada uno de los peces, además de ser la
ruta más potente de vacunación, generando protección que puede extenderse durante toda la
vida productiva del pez, también por permitir el uso de adyuvantes y ser el método con la
mejor relación costo-beneficio en peces más grandes (Horne 1997). Sin embargo, esta técnica
también presenta desventajas, es conocida por ser estresante para los peces, observándose en
ocasiones un lento retorno a la alimentación post vacunación, mortalidades ocasionales y
también traumas atribuibles a la vacunación en sí. Pero, con el correcto manejo antes, durante
y después de la vacunación se puede disminuir de forma importante los efectos adversos
(Brown y col 2003). Razón por la cual se tomo precaución en el procedimiento de vacunación
de las truchas, indicándose la correcta técnica al no presentarse mortalidades durante este
período.
Durante el desafío se midió como parámetro del agua la temperatura (T°), factor
importante ya que la severidad de una enfermedad depende, entre otras cosas, de la T° del
agua (Amend 1981, Ellis 1988), la que puede afectar la respuesta inmune celular y especifica
del pez (Bowden 2008). Por esto la T° se controló por medio de calefactores calibrados,
manteniendo casi invariable los 14°C entre los diferentes lotes de peces. Cabe mencionar que
la T° óptima de la bacteria in vitro es entre 15 y 18°C (Fryer y col 1990) y que la enfermedad
se presenta de forma natural principalmente en otoño y primavera, cuando la T° del agua varía
entre los 9 y 16°C (Lannan y Fryer 1994). Además, Larenas y col (1997), según los resultados
de su ensayo, señalaron que la T° más favorable para reproducir la enfermedad en condiciones
experimentales es justamente 14°C.
La salinidad del agua, se mantuvo entre los 15 y 17‰ para simular las condiciones
naturales cuando aparece la enfermedad, ya que se ha observado que la aparición de SRS
transcurre posterior al traslado de los peces a agua de mar, incluso la sobrevivencia del
25
patógeno se ve beneficiada en este medio, actuando también como un factor de transmisión
horizontal (Lannan y Fryer 1994). Respecto a la densidad de los estanques, esta se mantuvo
cercana a los 12,5 kg/m3, en relación a esto, Larenas y col (1997) observaron al comparar
resultados entre densidades de 5 y 20 kg/m3, que a mayor densidad poblacional se favorece la
reproducción de la enfermedad, en especial al estar asociada a 14°C, por lo que se mantuvo
una densidad aproximadamente intermedia durante el ensayo.
Con el fin de reproducir experimentalmente la enfermedad se escogió la vía
intramuscular para inocular P. salmonis cepa R-28 con dosis de 1x105,82 TCID50/0,1ml/pez,
dosis letal 50 (DL50) según Rojas (2000). Cabe señalar, que desde principios de la aparición
de la enfermedad se han estudiado diversas rutas de infección en salmónidos para reproducir el
SRS, así Cvitanich y col (1991) y Garcés y col (1991), lograron reproducir la enfermedad por
medio de inyección intraperitoneal (i.p.). Posteriormente, otras rutas se han evaluado, por
ejemplo en salmón coho (Oncorhynchus kisutch), han mostrado ser vías efectivas piel,
branquias e intestino (Smith y col 2004).
En relación a la trucha arco iris (O. mykiss), esta especie es una de las más utilizadas
como modelo para la reproducción experimental de SRS, tanto por su susceptibilidad al
patógeno como por su buena adaptación a las condiciones de ambiente controlado (Contreras
1995). Pérez (1996), por ejemplo, desafío por medio de inoculación vía i.p y por inmersión a
peces con y sin lesiones en piel y branquias, logrando reproducir la enfermedad en los peces
desafiados vía i.p., no así en los especímenes desafiados por inmersión. Pero posteriormente,
en estudios realizados por Pizarro (1998) y Ojeda (2000), lograrían mediante inmersión,
inocular de forma exitosa el patógeno. En otros ensayos, Smith y col (1999) desafiaron truchas
arco iris con inoculación i.p., inyección subcutánea, parche de contacto embebido con el
patógeno en piel y branquias, intubación intestinal y gástrica, alcanzando mortalidades
acumuladas de 98%, 100%, 52%, 24%, 24%, y 2 %, respectivamente, sugiriendo de esta
forma como principales vías de entrada piel y branquias (sobre todo con soluciones de
continuidad) por sobre la vía oral.
Si bien no hay información bibliográfica específica de P. salmonis desafiado por vía
intramuscular (i.m.), existen ensayos con otros patógenos bacterianos que han probado esta
ruta con éxito, como Vibrio ordalii en salmón del Atlántico (Paredes 2005) y trucha arco iris
(Almonacid 2006), en el cual se incluyó la vía i.m. como método de inoculación, logrando la
reproducción de la enfermedad y mortalidades acumuladas del 100% y 23,33%,
respectivamente. Además, en consideración a que la vacunación en este estudio se realizó por
la vía i.p., se optó por la vía i.m. para el desafío, evitando de esta forma mayores efectos
adversos intraabdominales y sorteando la respuesta local contra P. salmonis. Por los resultados
obtenidos en el ensayo, se sugiere que esta es una forma eficaz de desafío, como bien queda
demostrado por la reproducción de piscirickettsiosis y su diagnóstico positivo.
Cabe mencionar que la inyección de agentes infecciosos no es un método de desafío
natural. Muchos de los mecanismos de defensa son sobrepasados, aunque podría superarse
esto realizando las pruebas bajo condiciones de campo, pero esto se ve limitado por la variable
e impredecible exposición del agente, dificultando el control del experimento (Amend 1981).
26
Nordmo (1997) establece al respecto, que idealmente los desafíos debieran imitar la
exposición natural del patógeno y asegurar que los mecanismos inmunes locales en la
superficie del pez cumplan su rol, y que para esto los baños o cohabitación serían efectivos
pero menos controlables que las inyecciones i.p. o i.m.
La aparición de mortalidad en el ensayo comenzó el día 12 post desafío en el grupo
control, aunque cabe indicar que esto es variable según la dosis, cepa, vía de infección y
especie utilizada, como bien se muestra en el ensayo de Ojeda (2000) donde las mortalidades
comenzaron desde los 4 hasta los 15 días, según el esquema de inoculación de P. salmonis
utilizado. También se debe señalar que las mortalidades para las vacunas experimentales
formulación 1 y formulación 2 demoraron más en ocurrir, comenzando al día 20 y 21 post
desafío, respectivamente; sugiriendo una respuesta que puede estudiarse posteriormente.
Tanto para los especímenes vacunados con los productos experimentales F1 y F2 como
para los que fueron inyectados con solución fisiológica estéril, se observaron signos clínicos
como anorexia, oscurecimiento de la piel, exoftalmia, letargia, alteración de la natación con
nado superficial, separación del cardumen, movimiento opercular aumentado y disminución de
reacción a estímulos. Signos que se le han atribuido a la enfermedad y que están incluidos en
las descripciones de diversos autores para esta patología (Bravo y Campos 1989a y 1989b,
Alvarado y col 1990, Branson y Nieto 1991, Cvitanich y col 1991).
En el examen anatomopatológico (necropsia), las lesiones externas correspondieron a
palidez branquial, abdomen abultado, úlceras con compromiso muscular en la zona de
inoculación i.m., y lesiones internas observadas como hemorragia petequiales en musculatura,
renomegalia, esplenomegalia y hepatomegalia, con este último órgano pálido y con
nodulaciones blanquecinas. Estas lesiones están descritas en la bibliografía de la enfermedad
(Alvarado y col 1990, Cubillos y col 1990, Cvitanich y col 1991).
La detección por métodos microbiológicos tradicionales de algunas bacterias tienen
inconvenientes en su realización, por ejemplo, la localización intracelular de P. salmonis
dificulta su detección (Fryer y col 1992). Según indica la OIE (2006) para piscirickettsiosis
(SRS), se puede hacer un diagnóstico presuntivo mediante la visualización del agente causal
en los cortes histológicos o en las improntas de los tejidos, pero para el diagnóstico
confirmativo se requiere del aislamiento del agente en cultivo celular, con la confirmación de
P. salmonis por inmunofluorescencia indirecta (IFI) o por la prueba de reacción en cadena de
polimerasa (PCR). En general siempre se busca aislar al agente como prueba irrefutable, pero
en el caso de la aislación de P. salmonis en cultivos celulares, Fryer y Lannan (1996) no lo
recomiendan como diagnóstico rutinario ya que es de fácil contaminación al no contar con
antibióticos el cultivo celular. Recientemente Mikalsen y col (2008) han logrado desarrollar un
medio bacteriológico para el cultivo en agar de este agente, habrá que evaluar a futuro su
posibilidad de uso masivo como prueba diagnóstica.
Conforme a lo anterior, para el diagnostico presuntivo de P. salmonis, se realizó
tinción Gram para las improntas de hígado, bazo y riñón, además de tinción Giemsa para los
frotis de sangre. Ambas tinciones se usaron para evaluar e identificar organismos tipos
27
Rickettsiales por medio de la tinción del agente, su morfología, distribución y ubicación
característica, así como lo hicieran Fryer y col (1990) y Cvitanich y col (1991), por tener la
propiedad de ser tinciones rápidas, si bien no específicas.
De lo anterior, de forma similar a Contreras (1995) se cuantificó el número de bacterias
para cada uno de los órganos de las improntas con tinción Gram, además de la búsqueda del
agente en los frotis de sangre con tinción Giemsa. De este modo se encontró la presencia del
patógeno en la mayoría de los órganos evaluados, lo cual junto a la presencia positiva en los
frotis de sangre, sugieren la cualidad septicémica de P. salmonis.
Continuando con las recomendaciones de la OIE para el diagnóstico confirmativo, se
optó por la prueba de PCR, por ser una forma rápida con buena sensibilidad y especificidad,
además de su aplicación directamente a tejidos (Mauel y col 1996, Marshall y col 1998).
Mediante PCR anidado, que permite la detección de P. salmonis de dosis menores a 1
TCID50/ml (Mauel y col 1996), los resultados obtenidos para los estanques que continuaron el
ensayo, revelaron en el gel de agarosa 1,5%, el fragmento de DNA específico de P. salmonis
al coincidir con el control positivo en los 470 pares de bases (pb), confirmando el diagnóstico
del agente en los grupos inoculados.
Amen (1981) para la comparación de la eficiencia de vacunas en peces, propuso la
prueba de potencia por medio del cálculo del porcentaje relativo de sobrevivencia (RPS). De
esta forma, con el diagnóstico anterior y las mortalidades diarias registradas se calculó el
porcentaje de mortalidad acumulada (PMA) para los tres grupos evaluados durante los 36 días
post desafío, obteniendo para el grupo formulación 1, formulación 2 y control un PMA de
27,78%, 36,11% y 61,11%, respectivamente. Con estas variables el cálculo del RPS para las
vacunas experimentales de formulación 1 y formulación 2 fue 54,54% y 40,91%,
respectivamente. Así también, la evaluación de la eficiencia de vacunas en peces incluiría
ciertos criterios de satisfacción para validarla. En este ensayo se cumplieron los criterios
como el chequeo sanitario; grupos en duplicado como resguardo frente a posibles accidentes;
una tasa de infección (mortalidad) sobre 60% para el grupo control; infecciones no específicas
menores a 10%, en este caso no se presentaron mortalidades por patologías ajenas a P.
salmonis; la diferencia en las tasas de mortalidad entre los duplicados no superó el 20%, para
el caso de la formulación 1 que fue el único que finalizó con los duplicados a y b, cuyas tasas
de mortalidades fueron de 33,33% y 22,22%, respectivamente . Sin embargo, la tasa de
infección en los grupos vacunados superó el 25% por lo que los resultados serían
insatisfactorios.
Nordmo (1997), a su vez, indica tres categorías para clasificar a una vacuna utilizando
el RPS:
•
•
•
RPS < 70 % = Vacuna deficiente.
RPS > 70 % = Vacuna suficiente.
RPS > 80 % = Vacuna exitosa.
28
Según esto las vacunas experimentales formulación 1 y formulación 2, se catalogan como
“deficientes”.
El Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), es la autoridad sanitaria encargada de
autorizar los permisos de comercialización de vacunas en Chile, para ello exige en la
evaluación de la eficiencia de vacunas un PMA del grupo control > 60% y un RPS del grupo
vacunado > 75%3. De acuerdo a esto, las formulaciones experimentales no cumplirían este
último requisito.
Se debe señalar que este juicio, según el RPS, puede variar significativamente entre un
ensayo y otro con una misma vacuna (Nordmo 1997). Los resultados obtenidos en un desafío
pueden variar si se aplican otras vías de infección (Amend 1981). Lo anterior señala las
dificultades que presenta la realización de ensayos de vacunas en peces mediante la
reproducción de la enfermedad bajo condiciones controladas, por la diversidad de protocolos
utilizados (Contreras 1995, Pérez 1996, Smith y col 1999, Ojeda 2000, Rojas 2000). Por
ejemplo, el efecto del sistema de ensayo empleado, que por motivos de bioseguridad emplea la
recirculación del agua en cada uno de los estanques, lo que supone un aumento progresivo de
la dosis inoculada. Se ha establecido que P. salmonis es excretada vía heces y orina al agua
por los peces infectados (Larenas y col 2005).
Con relación a los especímenes sobrevivientes al desafío, los resultados dieron positivo
para P. salmonis para ambas formulaciones de vacuna, pero para el grupo control fue
negativo. Con estos resultados se sugiere, que si bien las vacunas experimentales disminuyen
la mortalidad al compararlas con el grupo no vacunado, podemos suponer que las vacunas
evaluadas pudieran generar un estado portador de P. salmonis. Es por esto necesario realizar
mayor investigación al respecto.
Es recomendable seguir estudiando nuevas posibilidades de vacunas para SRS, en
virtud de suprimir el excesivo uso de antibióticos utilizados para su control, por los efectos
adversos que conllevan como es el aumento de la resistencia bacteriana (Smith y col 1996) y
por las restricciones comerciales por su uso.
6.1. CONCLUSIONES
Considerando los resultados obtenidos se concluye que:
Se logro reproducir la Septicemia Rickettsial del Salmón (SRS) en las truchas arco iris
(O. mykiss) desafiadas con P. salmonis por vía i.m. consiguiendo mortalidades menores en los
especímenes vacunados con las formulaciones experimentales.
3
http://www.sag.gob.cl/OpenDocs/asp/pagDefault.asp?boton=Doc56&argInstanciaId=56&argCarpetaId=1845&a
rgTreeNodosAbiertos=(1845)(-56)&argTreeNodoActual=1845&argTreeNodoSel=568 Consultado 7 Julio 2009
29
La respuesta para ambas vacunas experimentales medidas en RPS < 70 %, determina
que estas son deficientes en la protección de trucha arco iris para SRS.
30
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35
8. ANEXOS
Anexo 1: Manejo de la vacunación de peces por vía inyectable intraperitoneal para las 2
formulaciones experimentales (F1 y F2) y solución fisiológica estéril (control).
•
Ayuno de los peces a vacunar por 24 h.
•
Sedación por grupos de 5 peces utilizando Benzocaína 10 a 20 mg por litro de agua en
baldes de 20 l.
•
Luego de sedados, por medio de quechas son retirados de a uno para la vacunación.
•
El punto de inyección de la vacuna intraperitoneal se ubicó en la línea media del
ventral del pez, a un largo de aleta pélvica anteriormente de las mismas, con un ángulo
de inyección de 90° respecto del vientre del pez.
•
El manejo post inyección consistió en la recuperación del proceso anestésico (en
estanques de 200 l).
•
Se retornó a la alimentación, después de la recuperación de los peces, al día siguiente
de la vacunación.
36
Anexo 2: Temperatura promedio diaria del agua registrada en la Sala de Estanques con las
Unidades Térmicas Acumuladas (UTA).
Temperatura del agua (°C)
Dia T° AM T° PM Promedio UTA
Dia T° AM T° PM Promedio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
6
6
5,5
6
7
7
6,5
7
7
8
7,5
7,5
7
6,5
7
7
7
8
8
7
8
7,5
8
8
7
7,5
8
7
8
7
7,5
7
7
7,5
7,5
8
8
7,5
9
9
8,5
8
7,5
7,5
8
8
9
9
9
8
9
9
8,5
8
9
9
7,5
10
6,5
6,75
6,25
6,5
7,25
7,25
7,25
7,5
7,25
8,5
8,25
8
7,5
7
7,25
7,5
7,5
8,5
8,5
8
8
8,25
8,5
8,25
7,5
8,25
8,5
7,25
9
6,5
13,25
19,5
26
33,25
40,5
47,75
55,25
62,5
71
79,25
87,25
94,75
101,75
109
116,5
124
132,5
141
149
157
165,25
173,75
182
189,5
197,75
206,25
213,5
222,5
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
6
8
8,5
8
7
8
9
9
8,5
9
9
9
10
9
10
9,5
10,5
10
9
8
9
9,5
9
10
10
9
10
11
12
8
9
9
8
9
9,5
9
10
10
10
11,5
11
12
10
12
12
11,5
11
12
11
12
11,5
12
13
12
12
12
12
12
7
8,5
8,75
8
8
8,75
9
9,5
9,25
9,5
10,25
10
11
9,5
11
10,75
11
10,5
10,5
9,5
10,5
10,5
10,5
11,5
11
10,5
11
11,5
12
UTA
229,5
238
246,75
254,75
262,75
271,5
280,5
290
299,25
308,75
319
329
340
349,5
360,5
371,25
382,25
392,75
403,25
412,75
423,25
433,75
444,25
455,75
466,75
477,25
488,25
499,75
511,75
37
Anexo 3: Promedio de bacterias tipo Rickettsiales por campo (15 campos observados) para las improntas de hígado, bazo y riñón
con Tinción Gram señalando los rangos con los signos +, ++, +++ y - según si se contabilizaron <10, entre 10 a 49, ≥50 o
ninguna bacteria, respectivamente. Todo para las truchas arco iris (O. mykiss) de los grupos F1, F2 y control con sus
correspondientes estanques (a o b), desafiados con P. salmonis intramuscular (i.m.) durante los 36 días post inoculación (p.i.).
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
Control (a) 12 días p.i.
H
B
R
11
4
3
0
29
0
9
0
4
12
19
7
25
8
11
14
10
2
8
18
17
33
10
21
13
18
47
12
11
16
24
27
7
21
15
18
26
21
13
18
24
14
29
10
8
17,00 14,93 12,53
++
++
++
Control (a) 17 días p.i.
H
B
R
15
8
14
7
12
5
5
15
3
29
14
8
10
5
7
12
15
4
9
16
15
14
10
6
8
7
11
9
21
12
12
14
14
20
15
7
16
17
6
9
10
18
4
8
5
11,93
12,47
9,00
++
++
+
Control (a) 22 días p.i.
H
B
R
4
3
8
19
10
24
25
4
13
5
11
17
31
3
34
28
9
11
13
7
8
10
3
12
27
2
14
34
6
23
22
9
17
13
12
13
15
14
19
21
3
23
24
15
18
19,40
7,40
16,93
++
+
++
Control (a) 25 días p.i.
H
B
R
33
16
12
20
2
6
21
11
13
29
8
5
18
16
11
9
9
16
57
20
21
16
112
15
10
31
29
17
8
8
19
18
14
26
13
6
14
18
15
16
14
16
8
12
12
20,87 20,53 13,27
++
++
++
Control (a) 28 días p.i.
H
B
R
4
6
18
7
3
4
18
4
4
8
15
7
10
9
16
9
8
4
47
3
6
20
23
5
22
6
5
19
0
8
0
12
0
4
11
12
23
4
14
21
16
9
14
21
7
15,07
9,40
7,93
++
+
+
Control (a) 29 días p.i.
H
B
R
5
6
9
9
4
12
28
9
4
12
8
9
43
3
10
13
5
3
14
3
7
11
7
6
14
10
7
16
4
2
12
8
9
19
9
2
21
9
7
9
4
5
17
6
3
16,20
6,33
6,33
++
+
+
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
Control (a) 31 días p.i.
H
B
R
23
9
14
14
5
17
9
7
8
13
11
13
17
8
16
12
7
9
10
5
12
8
12
15
11
6
11
27
8
12
23
15
6
18
3
14
15
5
24
19
13
28
14
4
17
15,53
7,87
14,40
++
+
++
Control (a) 32 días p.i.
H
B
R
19
6
17
13
15
12
6
7
7
12
18
12
8
25
9
15
14
19
7
19
3
18
22
16
16
13
4
10
16
17
9
11
8
18
14
6
24
8
12
15
12
10
12
9
15
13,47 13,93 11,13
++
++
++
Control (a) 32 días p.i.
H
B
R
8
10
14
14
13
15
16
12
7
9
8
9
13
14
3
3
7
16
12
15
8
5
17
16
21
23
28
8
4
3
5
22
2
7
16
17
6
17
10
9
13
19
4
14
4
9,33
13,67
11,40
+
++
++
Control (a) 33 días p.i.
H
B
R
13
4
11
16
0
12
14
3
7
7
2
6
10
6
10
28
4
8
18
0
3
11
0
7
8
7
5
15
14
12
18
3
5
7
0
19
29
0
4
16
7
10
12
0
0
14,80
3,33
7,93
++
+
+
Control (a) 34 días p.i.
H
B
R
8
31
0
0
0
14
0
7
0
3
0
13
0
0
0
11
16
11
0
0
0
8
17
10
28
0
0
0
0
19
0
21
4
21
0
2
0
12
12
23
0
14
0
14
3
6,80
7,87
6,80
+
+
+
F1 (a) 20días p.i.
H
B
R
3
10
9
15
9
14
6
27
15
10
8
8
38
6
18
14
7
7
15
11
27
17
4
10
6
12
13
9
18
16
15
0
0
18
29
29
23
27
16
29
14
17
11
9
14
15,27 12,73 14,20
++
++
++
38
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
F1 (a) 21 días p.i.
H
B
R
21
17
40
29
21
14
71
35
9
68
43
20
33
14
22
45
27
11
38
21
14
26
26
18
13
13
23
27
14
27
18
22
34
22
18
9
9
30
4
41
11
7
12
6
25
31,53 21,20 18,47
++
++
++
F1 (a) 22 días p.i.
H
B
R
52
4
3
15
13
10
27
5
11
22
14
4
26
4
4
49
5
2
17
10
33
12
5
9
23
4
8
21
7
3
32
6
7
17
9
0
12
5
5
28
3
6
29
8
4
25,47
6,80
7,27
++
+
+
F1 (a) 24 días p.i.
H
B
R
52
6
7
15
5
9
27
3
3
22
38
5
26
7
3
49
5
4
17
35
8
12
10
16
23
12
4
21
3
2
33
15
5
24
21
17
12
14
3
13
12
9
17
16
2
24,20
13,47
6,47
++
++
+
F1 (a) 26 días p.i.
H
B
R
10
2
1
22
33
6
30
14
11
5
22
8
23
11
46
39
31
27
26
24
19
9
22
16
14
27
10
17
16
22
23
23
25
15
21
13
26
18
18
17
15
11
14
25
16
19,33 20,27 16,60
++
++
++
F1 (a) 28 días p.i.
H
B
R
12
4
13
14
9
9
19
10
12
29
4
7
48
8
9
15
9
21
10
8
16
33
17
7
52
21
18
11
18
17
15
4
5
16
13
14
21
12
17
14
8
11
25
9
9
22,27 10,27 12,33
++
+
++
F1 (a) 31 días p.i.
H
B
R
23
18
12
14
11
14
19
17
17
9
14
13
28
10
9
4
9
12
7
23
11
16
25
24
19
17
17
21
15
8
10
12
16
16
17
5
13
26
4
15
21
15
22
16
10
15,73 16,73 12,47
++
++
++
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
F1 (a) 32 días p.i.
H
B
R
26
3
8
5
12
9
31
7
21
14
15
17
9
9
9
27
24
32
13
18
15
6
33
18
15
17
19
18
14
14
13
19
8
19
6
16
11
13
11
14
18
27
10
7
12
15,40 14,33 15,73
++
++
++
F1 (a) 34 días p.i.
H
B
R
8
16
4
13
26
25
27
8
36
21
5
28
18
17
44
31
8
8
26
14
22
10
16
10
12
23
9
21
15
17
15
21
24
21
12
15
19
17
31
14
11
9
23
18
20
18,60 15,13 20,13
++
++
++
F1 (a) 34 días p.i.
H
B
R
10
6
19
15
0
8
14
14
0
33
7
0
18
0
13
6
9
0
0
6
7
4
5
21
13
0
0
14
7
0
12
4
16
17
0
14
22
3
17
43
11
9
16
15
5
15,80
5,80
8,60
++
+
+
F1 (a) 35 días p.i.
H
B
R
4
22
0
0
0
12
12
0
0
0
0
0
0
9
0
7
0
11
0
0
0
15
16
23
0
0
0
8
0
0
11
7
20
0
0
0
17
0
9
16
5
4
7
0
10
6,47
3,93
5,93
+
+
+
F1 (a) 36 días p.i.
H
B
R
5
8
6
0
0
0
6
2
3
0
0
0
0
0
0
9
7
4
8
6
9
0
0
12
7
9
0
12
5
0
0
11
3
0
0
0
14
0
7
0
3
0
8
0
5
4,60
3,40
3,27
+
+
+
F1 (b) 24 días p.i.
H
B
R
6
8
9
13
7
2
2
4
20
15
19
11
3
5
6
9
14
15
11
10
19
7
11
25
8
14
13
2
11
21
19
12
9
11
17
17
4
14
23
6
16
14
2
22
12
7,87
12,27
14,40
+
++
++
39
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
F1 (b) 25 días p.i.
H
B
R
30
22
12
28
21
22
33
6
14
21
17
9
19
15
3
17
14
14
38
11
5
27
5
3
14
18
7
37
12
10
42
9
8
26
7
6
31
12
7
44
4
11
48
5
9
30,33
11,87
9,33
++
++
+
F1 (b) 29 días p.i.
H
B
R
24
3
41
19
7
12
7
4
8
48
16
37
31
5
11
22
17
9
97
5
12
18
4
4
46
25
7
12
11
21
31
0
0
28
30
32
24
5
0
13
7
29
25
3
28
29,67
9,47
16,73
++
+
++
F1 (b) 30 días p.i.
H
B
R
3
23
13
8
21
5
19
19
16
4
11
18
12
17
7
16
12
19
17
9
21
22
5
9
9
13
8
5
4
5
7
6
10
14
12
6
15
3
4
23
5
3
5
4
8
11,93 10,93 10,13
++
++
++
F1 (b) 31 días p.i.
H
B
R
21
8
19
26
17
11
49
4
8
31
12
17
23
9
10
42
0
23
17
5
18
15
8
12
23
14
14
19
15
15
38
4
9
29
6
7
34
16
16
32
12
7
29
9
14
28,53
9,27
13,33
++
+
++
F1 (b) 34 días p.i.
H
B
R
7
9
8
8
2
4
7
4
9
4
2
3
39
3
2
14
5
2
6
2
4
49
0
0
63
0
5
58
2
0
34
0
0
32
4
3
17
9
7
28
0
0
14
0
2
25,33
2,80
3,27
++
+
+
F1 (b) 35 días p.i.
H
B
R
6
19
21
8
20
6
10
9
10
15
18
4
4
12
3
14
11
11
7
25
8
8
31
19
19
27
16
3
48
8
4
19
12
6
31
14
19
18
17
5
15
9
7
27
15
9,00
22,00
11,53
+
++
++
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
F1 (b) 36 días p.i.
H
B
R
0
0
6
0
7
0
4
0
0
9
0
21
0
11
0
0
0
0
12
0
4
0
3
0
0
0
24
3
2
0
0
0
2
5
4
7
0
5
3
6
9
0
0
10
8
2,60
3,40
5,00
+
+
+
F2 (b) 21 días p.i.
H
B
R
18
4
5
13
19
11
68
23
10
37
16
12
19
5
6
8
10
21
14
28
13
11
4
32
16
15
23
21
14
19
19
17
16
23
21
17
16
16
20
9
6
12
15
17
15
20,47 14,33 15,47
++
++
++
F2 (b) 22 días p.i.
H
B
R
10
39
12
27
21
15
84
12
13
62
13
11
67
15
26
26
11
6
19
10
7
59
6
30
73
39
16
58
12
8
75
19
17
49
21
15
58
12
14
55
24
25
47
15
18
51,27 17,93 15,53
+++
++
++
F2 (b) 22 días p.i.
H
B
R
52
7
10
36
5
6
21
13
17
35
4
11
19
11
7
55
10
12
17
4
5
33
3
3
87
7
8
81
10
10
49
11
12
56
15
15
59
12
5
47
4
3
38
3
7
45,67
7,93
8,73
++
+
+
F2 (b) 24 días p.i.
H
B
R
14
4
6
25
3
21
61
0
9
58
15
14
46
7
16
48
21
9
52
10
10
83
4
8
45
7
9
62
8
6
76
0
11
63
23
14
49
18
13
38
6
19
52
9
12
51,47
9,00
11,80
+++
+
++
F2 (b) 25 días p.i.
H
B
R
25
22
8
110
9
3
15
3
15
48
10
4
59
11
16
98
23
38
73
48
22
52
3
13
47
7
12
22
4
56
38
8
10
25
3
7
62
20
12
26
6
4
51
9
5
50,07 12,40 15,00
+++
++
++
40
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
F2 (b) 25 días p.i.
H
B
R
19
22
23
43
18
8
26
3
27
17
14
5
29
11
56
12
14
15
39
17
13
25
23
39
14
12
5
21
18
14
18
19
19
32
13
23
14
15
22
17
10
21
15
17
15
22,73 15,07 20,33
++
++
++
F2 (b) 30 días p.i.
H
B
R
12
2
16
32
21
14
17
43
9
5
6
42
16
27
18
32
19
4
18
8
8
30
9
17
24
7
28
15
10
12
19
16
18
27
17
19
21
12
15
18
10
12
20
9
14
20,40 14,40 16,40
++
++
++
N° de
Campos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Promedio
Signo
F2 (b) 30 días p.i.
H
B
R
4
16
21
13
12
18
12
9
7
3
11
13
7
10
9
8
15
12
11
9
16
5
6
14
10
14
18
7
7
12
6
18
11
14
12
19
8
13
8
15
15
16
9
17
10
8,80
12,27
13,60
+
++
++
F2 (b)30 días p.i.
H
B
R
16
12
3
9
15
17
12
5
12
5
7
9
8
9
18
3
11
14
10
4
15
12
15
22
14
14
19
7
4
21
11
6
16
14
2
13
12
16
14
5
12
18
3
7
23
9,40
9,27
15,60
+
+
++
F2 (b) 35 días p.i.
H
B
R
16
7
17
39
41
11
8
23
4
35
10
12
13
11
7
22
15
32
9
13
43
25
8
26
21
19
12
18
16
8
23
17
15
25
21
22
16
15
23
19
23
14
21
18
17
20,67 17,13 17,53
++
++
++
F2 (b) 35 días p.i.
H
B
R
79
16
5
23
7
4
10
9
6
21
12
14
34
10
8
18
8
12
37
5
7
14
2
19
39
0
5
75
0
10
45
12
7
29
6
16
34
7
5
39
15
9
28
3
8
35,00
7,47
9,00
++
+
+
F2 (b) 30 días p.i.
H
B
R
14
12
9
6
15
11
8
48
15
14
36
8
32
29
12
24
17
21
19
25
17
15
18
19
23
16
15
14
28
9
31
14
13
17
17
16
12
22
12
26
19
15
15
14
19
18,00 22,00 14,07
++
++
++
F2 (b) 33 días p.i.
H
B
R
37
12
8
31
34
2
89
32
8
26
120
10
32
23
18
58
28
34
20
48
10
31
33
17
42
40
9
28
21
5
26
25
23
39
16
14
48
55
7
51
58
5
15
62
12
38,20 40,47 12,13
++
++
++
41
9. AGRADECIMIENTOS
•
Esta Memoria de Título fue financiada por el Proyecto Fondef DO3i1137 de la
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso.
•
Al Dr. Ricardo Enríquez por su continua ayuda y paciencia en el desarrollo de esta
memoria, le agradezco por su disposición siempre amable y cordial, pero por sobre
todo por enseñarme a abordar las dificultades de forma positiva.
•
A la Sra. Mónica Monrás, Sra. Vania Quinteros y Dr. Alex Romero por su constante
ayuda e interés en la elaboración del estudio, gracias por entregarme sus conocimientos
para poder abordar los temas evaluados en el ensayo. También le agradezco al Sr.
Esteban Henríquez por su ayuda y buenos consejos en terreno.
•
A mis amados padres, Héctor e Ivonne. Por entregarme la confianza y el cariño
suficiente para emprender el desafío de estudiar una carrera tan lejos de casa. Sin
ustedes nada de esto podría haberse logrado. Son mi ejemplo a seguir y los amo por
todo lo que son.
•
A mi muy querida familia, Mami Gordi, Abuelita Lucy, hermanas Mely y Vane,
sobrinito Cristóbal, tíos y primos que me alentaron siempre a seguir adelante con todo
el amor que podían darme. En especial a mi tía Vero, que no estará presente para
abrazarme, pero que aún su afecto me sigue inspirando.
•
A mis amigos, tanto para los que hice durante mi vida universitaria como a los que se
mantuvieron firmes a pesar de la distancia y el tiempo, esos son amigos de verdad, en
especial a Andrés, Jorge y Ángeles por estar siempre disponibles a brindarme su cariño
y apoyo. Y muy en especial agradezco a Claudio por su incondicional cariño.
•
A Cristian, por ser la persona que me acompaño durante mucho tiempo y que a pesar
de todo estuvo en las buenas y en las malas.
•
Por último, pero no menos importante, agradezco a mi segunda familia, aquella que
conocí en Valdivia y que me recibió como una hija y hermana más. A mi tía Pauli y
Tío Mario, Camilo, Matías. Cristóbal y mi lindo niño Tomás. Les agradezco por
brindarme su hogar y hacerme parte de su familia, pero por sobre todo por entregarme
el cariño que me hizo sentir como en casa.