Superficies y Vacío 23(S) 27-30, agosto de 2010 ©Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales Caracterización y respuesta biológica de nanoceramicas de óxido de circonio sintetizado por el método de rocío pirolítico ultrasónico Janeth Serrano Bello, Javier de la Fuente Hernández, Marco Antonio Álvarez-Pérez* Laboratorio de Bioingeniería Celular, Facultad de Odontología, UNAM Coyoacán 04510, México, D.F. Manuel García-Hipólito, Carlos Hernández-Pérez, Alejandro Arellano-Riasgo, Julio Alberto Juárez-Islas, Octavio Álvarez-Fregoso Instituto de Investigaciones en Materiales, UNAM Coyoacán 04510, México, D.F. José Luis Suárez-Franco Facultad de Odontología Río Blanco, Universidad Veracruzana C.P. 94730, Río Blanco Veracruz. (Recibido: 18 de febrero de 2010; Aceptado: 04 de mayo de 2010) Películas delgadas de ZrO2 fueron sintetizadas en función de la temperatura de substrato, por la técnica de rocío ultrasónico para determinar su biocompatibilidad celular in Vitro. La estructura cristalina del ZrO2 depende de la temperatura de substrato y los patrones de difracción de rayos X indican que a bajas temperaturas < 400°C, su estructura es de carácter amorfo mientras que a mayores temperaturas, su estructura es tetragonal con una dirección preferencial de crecimiento (101). Para determinar la biocompatibilidad celular de estas cerámicas se hicieron pruebas de adhesión celular sobre la superficie del ZrO2 , así como, pruebas de citotóxicidad celular. Los resultados indican que las células presentan una adhesividad mayor al 100% respecto a la adhesividad celular de la superficie de vidrio corning 7059 utilizado como referencia patrón. Por otro lado, no se detecto ningún efecto citotóxico de las cerámicas de ZrO2 sobre las células osteoblásticas, en consecuencia se determinó que el ZrO2 es un buen candidato para usarse como biomaterial en diversos aspectos dentales. Palabras clave: Rocío pirolítico ultrasónico; ZrO2; Biocompatibilidad celular ZrO2 thin films were synthesized by ultrasonic spray pyrolysis process as a function of deposition temperature for study their cellular biocompatibility in vitro. The crystal structure of ZrO2 films are dependent of temperature of deposition process and X-ray diffraction studies showed that a low temperature < 400°C the films have poor cristallinity, but for higher temperatures of deposition, the patterns indicate a tetragonal crystalline structure with a preferential orientation of growth (1 0 1). For biocompatibility studies of these films we evaluated the cellular adhesion process and cytotoxicity assays over the surface of ZrO2 thin films. The results indicate that cells showed a good adhesion respond enhanced over 100 % with respect to control corning glass 7059. The cytotoxicity assay showed no effects of the surface ZrO2 ceramics over the cellular behavior of the osteoblastic cells; in addition ZrO2 thin films can be used as good candidate as biomaterial coating on diverse dental and orthopedic applications. Key words: Ultrasonic spray pirolysis; ZrO2; Biocompatibility en rangos nanométricos con buenas propiedades físicas con una alta velocidad de depósito, con mayor control y calidad sobre grandes áreas superficiales en un corto periodo de tiempo [6]. Esta técnica ha sido empleada en el depósito de diversas películas delgadas tales como Al2O3, ZnAl2O4, ZrO2 y HfO2 [7-10]. De entre las anteriores películas delgadas la que mayor aplicación presenta en el área de ingeniería de tejidos óseos es la referente a la del oxido de circonio (ZrO2). Esto es debido a que el oxido de circonio es ampliamente utilizado para el diseño y recubrimientos de materiales de implante por sus excelentes propiedades fisicoquímicas, tales como una alta estabilidad química, baja conductividad iónica y térmica, su alta resistencia mecánica, su alta resistencia a la fractura y por considerarse bioinerte y biocompatible [11]. Por otro lado, el ZrO2 exhibe excelentes propiedades ópticas, 1. Introducción El incremento en la demanda de prótesis ortopédicas y dentales en los últimos años ha estimulado la investigación de nuevas técnicas de recubrimiento y depósito para modificar la superficie del implante y así otorgarle nuevas propiedades fisicoquímicas, de protección a la degradación, a la corrosión y al control de la fricción en las interfaces de interacción celular, incrementando la respuesta biológica y de integración del tejido con la superficie del implante [1-3]. Esto ha dado lugar a la aparición de múltiples técnicas de depósito desarrolladas en función de las propiedades específicas que se espera de los recubrimientos a base de materiales cerámicos [4, 5]. La técnica de rocío pirolítico ultrasónico es una técnica de bajo costo que permite la obtención de películas delgadas * 27 [email protected] ©Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales Superficies y Vacío 23(S) 27-30, agosto de 2010 fotoluminiscentes, eléctricas, químicas y posee un amplio rango de aplicaciones catalíticas y como biomaterial. Por esta última razón, el interés de este trabajo radica en caracterizar la morfología superficial y la composición química de la película delgada de oxido de circonio depositada por el método de rocío pirolítico ultrasónico y evaluar el efecto en la biocompatibilidad celular de la nanotopografía de las cerámicas de ZrO2 en cultivos celulares in vitro. 300 ZrO2 (101) Fase tetragonal 500 °C (202) 150 (103) (112) 200 (002) XRD intensidad (u. a.) 250 100 50 2. Procedimiento Experimental 450 °C 400 °C 350 °C 2.1. Depósito y Caracterización de las Cerámicas Nanoestructuradas 0 10 20 30 40 50 60 70 El proceso de elaboración de las cerámicas en película delgada, se llevó a cabo por la técnica de rocío pirolítico ultrasónico, utilizando como precursor Oxicloruro de Circonio Octa-hidratado a una concentración de 0.05 M disuelto en agua de-ionizada (ZrOCl2 · 8H2O, Aldrich Chemical Co.). Para el depósito de las películas de ZrO2 se utilizaron sustratos de vidrio de 1.5 cm2 (Corning glass 7059), y se controló su temperatura (Ts) de 350ºC hasta 500°C. Esta técnica consiste en la generación de un fino vapor desde la solución precursora por medio de un generador ultrasónico que trabaja a 800 kHz,. El vapor es dirigido a través de un tubo que contiene aire filtrado como portador a una velocidad de flujo de 10L min-1; a la superficie del sustrato caliente localizado sobre una base de estaño fundido que es en donde se lleva a cabo la reacción química depositando la película. La estructura cristalina de las cerámicas fue analizada por medio de difracción de Rayos X (XRD), utilizando el equipo Siemens D-5000 con una longitud de onda de radiación de 1.5406 Å (Cu kα). Para caracterizar la morfología superficial de las cerámicas se utilizó la técnica de microscopia electrónica de barrido por medio del microscopio SEM: Leica-Cambridge 440. Por último, para caracterizar la composición química de las cerámicas se usó la técnica de dispersión de energía (EDS) por medio del microscopio SEM acoplado con el detector Pentafet con microsonda marca Oxford. Los sustratos cerámicos de ZrO2 y los sustratos control (vidrio) utilizados en los estudios de la respuesta biológica, fueron sometidos a luz ultravioleta durante 24 horas, para garantizar su esterilidad y evitar contaminaciones con microorganismos como bacterias y hongos. 2θ (grados) Figura 1. Difractograma de Rayos X de la cerámica de óxido de circonio depositada a diferentes Ts: 350, 400, 450 y 500°C. Figura 2. Imagen de microscopia electrónica de barrido de la morfología superficial de la cerámica de óxido de circonio depositada en función de la Ts: 350 (a), 400 (b), 450 (c) y 500 (d). En la imagen se aprecia la distribución de la morfología de aglomerados superficiales y de las nanofibras porosas interconectadas. Barra = 10 µm. 2.2. Ensayo de Biocompatibilidad celular Para establecer el efecto de la topografía de las cerámicas depositadas a una Ts = 500°C sobre la biocompatibilidad celular, se utilizaron células osteoblásticas, las cuales se mantuvieron en un medio de cultivo Mínimo Esencial de Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y una solución de antibióticos (penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 Figura 3. Adhesión celular de las células osteoblásticas en las superficies de oxido de circonio a una Ts = 500°C después de un periodo de incubación de 6 y 12 h. 28 Superficies y Vacío 23(S) 27-30, agosto de 2010 ©Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales cultivo se le adiciona una solución con 0.04 M de ácido clorhídrico (HCl) en isopropanol y la placa se lleva a un lector de ELISA, para obtenerse la densidad óptica a una longitud de onda de 570 nm. 3. Resultados y Discusión Los patrones de difracción de rayos X (XRD) de las muestras depositadas a Ts de 350 hasta 500°C; indican que a temperaturas por debajo de <400°C las cerámicas de ZrO2 presentan una baja cristalinidad (material amorfo); pero a altas Ts; estas cerámicas muestran picos que corresponden con la fase tetragonal del ZrO2 (JCPDS 17923) con un incremento en el tamaño de grano cristalino. Los picos representativos en los difractogramas de XRD a 30.2°, 34.8°, 35.2°, 50.2°, 50.6°, 59.5°, 60.1° y 62.9° pueden asignarse a la estructura tetragonal con índices: (1 0 1), (0 0 2), (1 1 0), (1 1 2), (2 0 0), (1 0 3), (2 1 1) y (2 0 2) como se observa en la Figura 1. La composición química de las cerámicas se determinó por medio de la técnica de espectroscopia de dispersión de energía (EDS). Los estándares de energía asociados a cada átomo para obtener la composición química se adquirieron del programa: Multi-elementos químicos estándares de referencia Microspec serial 0034, parte N° 8160-53 ubicados en la PC del SEM. Los resultados experimentales promedio son representados en la Tabla-1 que indican la composición química en porcentajes atómicos de oxigeno, circonio y cloro que se encuentran presentes en las cerámicas de ZrO2 depositadas en función de la temperatura de sustrato. De acuerdo a estos resultados, las cerámicas son de óxido de circonio envenenadas con cloro, el cual disminuye con el aumento de la temperatura de substrato. El análisis de la morfología superficial de la cerámica de ZrO2 por medio de SEM muestra que la cerámica presenta una diferencia en morfología dependiente de la Ts (Figura 2). Como se puede observar en la figura 2(a); a una temperatura de 350°C la superficie de la cerámica muestra una morfología de agregados cumulares que indica que el material no ha sido procesado completamente debido a que la energía térmica no es suficiente para realizar eficientemente la reacción pirolítica en la superficie del substrato evitando así una formación compacta de ZrO2. Con el incremento en la Ts ≥ 400°C (Figura 2(b-d)); la morfología de la cerámica cambia de granos semiesféricos, a un arreglo de nanofibras porosas intercaladas. Esta característica superficial es debido a una alta temperatura de depósito que ayuda a incrementar la energía cinética superficial y con ello producir una reacción pirolítica completa del vapor incidente, lo cual resulta en una cerámica más compacta y cristalina [12]. Figura 4. Grafica de viabilidad celular de las células osteoblásticas en las superficies de oxido de circonio a una Ts = 500°C después de un periodo de incubación de 1, 3, 5 y 7 días. μg/ml). La biocompatibilidad celular fue evaluada analizando dos procesos importantes: 1) la adhesión y 2) la viabilidad de los osteoblastos relacionada a la toxicidad del material. Para la respuesta de adhesión celular; los osteoblastos fueron cultivados a una densidad de 1x103 células/mL sobre las cerámicas de ZrO2 a un tiempo de cultivo de 6 y 12 horas. Pasado este tiempo, los sustratos fueron lavados con buffer de fosfatos (PBS) para retirar las células que no se adhirieron a las superficies. Posteriormente las células adheridas se fijaron con 4% de paraformaldehído por 5 minutos e incubadas con 0.1% de toluidina por 4 horas. Para remover el colorante no específico se realizaron 3 lavados con PBS y posteriormente el colorante fue extraído con 500μL de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1%. De la solución obtenida se tomaron 100μL que se colocaron en un pozo de una placa de 96 pozos para obtener su absorbancia a una longitud de onda de 605 nm. Los valores de la absorbancia obtenidos fueron utilizados para obtener el porcentaje de células adheridas a las cerámicas de ZrO2. Los cultivos controles fueron las células sembradas sobre sustratos de vidrio. Los experimentos de adhesión celular se realizaron por triplicado. Para evaluar el efecto de la topografía de las cerámicas de ZrO2 depositadas a una Ts = 350°C en la viabilidad celular se llevo a cabo el ensayo de azul de triazol (MTT) basado en la habilidad de la enzima deshidrogenada mitocondrial para oxidar una sal de tetrazolio (3-[4,5dimetiltiazol-2-y]-2-5 bromuro difeniltetrazolio) a un producto insoluble de color azul. La generación del producto azul es directamente proporcional a la actividad oxidativa de la enzima deshidrogenasa; por ello, una disminución en los valores de absorbancia a 570 nm nos indicará una medida de la viabilidad celular que puede ser relacionada a la toxicidad del material. Las células osteoblásticas se sembraron a una densidad de 2x104 por triplicado por 1, 3, 5 y 7 días de cultivo sobre las superficies de las cerámicas de ZrO2. Después de cada periodo experimental, las células fueron incubadas con una solución de MTT (120 mg/ml) a 37°C por 4 horas. Pasado este tiempo, el sobrenadante es removido y a cada pozo de 3.1. Biocompatibilidad celular Los ensayos de biocompatibilidad se realizaron con el objeto de investigar si la topografía a una Ts = 500°C de la cerámica de ZrO2 -considerándose como la mejor 29 Tabla-1. Contenido porcentaje atómico oxígeno, circonio y cloro de las©cerámicas depositadadepor rocío pirolítico ultrasónico dependiente de la Superficies y Vacíode 23(S) 27-30, agosto dede 2010 Sociedad Mexicana Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales temperatura de depósito analizadas por EDS. Ts (°C) 350 400 450 500 Oxígeno (at. %) 58.8 61.9 63.8 64.2 Circonio (at. %) 32.1 31.2 30.5 31.0 Cloro (at. %) 5.9 4.3 3.3 3.1 citotóxicidad por parte del ZrO2 hacia las células osteoblásticas, ya que las células muestran una adhesividad mayor al 100% en las superficies cerámicas respecto a la superficie del vidrio corning glass 7059 utilizado como patrón de referencia, así como, una viabilidad celular excelente. Basándonos en estos resultados, podemos concluir que las cerámicas de ZrO2 proveen un medio ambiente adecuado para la biocompatibilidad celular lo cual representa un probable recubrimiento cerámico biocompatible en materiales de implante dental. superficie morfológicamente obtenida debido a una alta porosidad y una excelente interconexión de fibras superficiales- afecta la respuesta celular de los osteoblastos, utilizando el sistema de cultivo celular in vitro. En la grafica de la Figura 3 se muestra la evaluación de la adhesión de los osteoblastos después de un periodo de incubación de 6 y 12 h. Los resultados se presentan como porcentajes de células adheridas a la superficie de la cerámica de ZrO2 en relación al cultivo control que son las células osteoblásticas adheridas a la superficie de vidrio Corning 7059. La adhesión de las células osteoblásticas se ve favorecida excediendo el 100% de adhesión encontrándose diferencias estadísticamente significativas a p<0.05 cuando se compara el proceso de adhesión de las células osteoblásticas en la cerámica de ZrO2 con el cultivo control. Aunque es importante remarcar que un incremento en la adhesión celular obtenida en las cerámicas de ZrO2 es un buen indicador de que la superficie no es toxica; sin embargo, nosotros llevamos a cabo un ensayo de citotoxicidad para confirmarlo. Los resultados del ensayo de viabilidad celular (citotoxicidad) son presentados como absorbancia a 570 nm como se muestra en la Figura 4. Los resultados del ensayo de viabilidad por la conversión de la sal de MTT muestra un incremento en dicha reacción comparada con el cultivo control a los días 3 y continuando hasta el día 7. Este incremento es directamente proporcional al incremento de las células metabólicamente activas sobre las superficies de ZrO2; lo cual nos indica que las células están proliferando, creciendo y no existe ningún efecto citotóxico del material a las células osteoblásticas. Esto concuerda con resultados de investigaciones recientes que reportan que en la escala nanométrica del material (en promedio de 13 a 100 nm) juega un papel esencial en mediar la adhesión celular y posteriormente la proliferación celular; y que el incremento en dichos procesos celulares es dependiente solo cuando el nanomaterial presenta una rugosidad superficial homogénea de entre (0.020 a 0.1 µm) [13-16]. Agradecimientos Los autores le dan agradecimientos a J. Guzmán, C. Flores, H. Zarco, O. Novelo-Peralta y R. Reyes-Ortíz por su asistencia técnica durante el curso de este estudio. Esta investigación fue financiada por DGAPA-UNAM proyecto IN200808 a MAAP. Referencias [1]. Gu YW, Khor KA, Pan D, Cheang P. Biomaterials 16, 3177 (2004). [2]. Yang Y, Ong JL, Tian J. Biomaterials 4, 619 (2003). [3]. Kim BK, Bae HE, Shim JS, Lee KW. J. Prosthet Dent 4, 357 (2005). [4]. Bertrand G and Mévrel R. Thin Solid Films 292, 241 (1997). [5]. Tomaszewski H, Haemers J, de Roo N, Denul J, de Gryse R. Thin Solid Films 293, 67 (1997). [6]. Viguie JC, Spitz J. Electrochem. Soc. 122, 585 (1975). [7]. Aguilar-Frutis M, García M and Falcony C. Appl. Phys. Lett. 72, 1700 (1998). [8]. García-Hipólito M, Alvarez-Fregoso O, Martínez E, Falcony C, Aguilar-Frutis MA, Opt. Matter 20, 113 (2002). [9]. García-Hipólito M, Hernánde-Pérez CD, Alvarez-Fregoso O, Martínez E, Guzmá-Mendoza J, Falcony C. Opt. Matter 22, 345 (2003). [10]. García-Hipólito M, Alvarez-Fregoso O, Guzmán J, Martínez E, Falcony C. Phys Status Solidi (a) 201, R127 (2004). [11]. Piconi C, Maccauro G. Biomaterials 20, 1 (1999). [12]. Langlet M, Joubert JC. Chemistry of Advances Materials. Ed CNR Rao (Oxford; Blackwell) p 55 (1993). [13]. Webster TJ, Hellenmeyer EL, Price RL. Biomaterials 26:953 (2005). [14]. Anselme K. Biomaterials 21:667 (2000). [15]. Stevens MM, George JH. Science, 310:1135 (2005) [16]. Dalby MJ, Yarwood SJ, Riehle MO, Johnstone JH, Affrossman S, Curtis ASG. Exp Cell Res 276:1(2002). 4. Conclusiones En este estudio nos avocamos a determinar la biocompatibilidad de células osteoblásticas sobre la superficie de cerámicas a base de ZrO2 . Nuestros resultados demuestran que no existen efectos de 30