Definición Procesos Niveles 1 y 2 - Campus de Ciencias Biológicas

Instructivo para la Toma, conservación y
Envío de muestras al Laboratorio de
Patología
Código:
I-CCBA-LPAT-01
Revisión: 01
Fecha de
emisión: 19/04/10
Página: 1 de 11
CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS
NIVEL DE
REVISIÓN
01
SECCIÓN Y/O
PÁGINA
DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y
MEJORA
Se cambio el nombre del Responsable del
Control de cambios Laboratorio de Patología y el del coordinador de la
y mejoras
unidad de diagnostico.
FECHA DE
MODIFICACIÓN
8 junio 2012
02
03
04
05
Elaboró
REVISÒ
Aprobó
Raquel Miranda Soberanis
Técnico Académico
Responsable del Laboratorio de
Patología
Responsable del Laboratorio de
Patología
1
Instructivo para la Toma, conservación y
Envío de muestras al Laboratorio de
Patología
Código:
I-CCBA-LPAT-01
Revisión: 01
Fecha de
emisión: 19/04/10
Página: 2 de 11
1.-OBJETIVO
Conocer la metodologìa apropiada para la toma, conservaciòn y envìo de muestras para la
recepcìon en el laboratorio de patologìa.
2.- ALCANCE
Aplica para todos los usuarios que envian muestras al laboratorio de patología.
3.- POLITICAS
No se aceptaran muestras congeladas.
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INSTRUCTIVO PARA LA TOMA
CONSERVACIÒN Y ENVIO DE MUESTRAS AL
LABORATORIO DE PATOLOGÌA
M en C. Leonardo Guillermo Cordero
Técnico Académico Raquel Miranda
LCE Aída Alejandra Solís Miranda
3
Introducción.
La patología es la ciencia que comprende todas las anormalidades de la estructura corporal
y su función; es decir estudia las respuestas celulares y tisulares ante una agresión, su objetivo es
entender el proceso de enfermedad, para poder entre otras metas, establecer un diagnóstico
(Romero, 2002a). Por lo tanto entre las herramientas más importantes de esta ciencia se encuentran
los estudios post mortem (necropsias) sin embargo, debido a que con esta técnica el diagnóstico es
de tipo presuntivo y muchas veces es necesario de apoyarnos de pruebas de otros laboratorio
(bacteriología, parasitología, virología, inmunología, análisis clínicos, entre otros) para determinar al
agente etiológico (Moreno et al., 2006). Las que se disponen en el laboratorio de patología son: la
histopatología, la citopatología y la histoquímica.
Por lo que para obtener resultados confiables es de suma importancia que tanto la toma de
muestras necesarias, como su conservación se realicen de manera correcta. Con el fin de evitar
pérdida de tiempo o la realización de trabajo innecesario, el médico veterinario debe saber
exactamente qué muestras se requieren en cada caso (Aluja y Constantino, 2002) Es por esta razón
que la presente guía tiene como fin describir la forma adecuada para tomar, conservar y enviar
muestras al laboratorio de patología
Selección de muestras.
La selección de las muestras adecuadas para obtener el diagnóstico de las enfermedades,
requiere de conocimiento y experiencia,. Las muestras escogidas y pruebas solicitadas de cada caso
deben estar orientadas a ahorrar tiempo, material, dinero y esfuerzo, tanto para el laboratorio como
para el interesado, para lo que es necesario haber realizado un buen diagnóstico clínico presuntivo,
razón por la cual, la selección, conservación y envió de muestras debe ser realizada por un Médico
Veterinario Zootecnista
Siempre conviene llevar a cabo un plan cuidadoso, que contemple lo que se va a hacer, con
qué fin se manda una muestra, las limitaciones y ventajas de cada prueba y qué tipo de resultado se
pretende obtener. (Moreno et al., 2006)
Hay algunos factores de mucha importancia que deben ser tomados en cuenta,
independientemente de qué tipo de muestra se va a enviar:
1. Las muestras deben ser lo más frescas posible.
2. Cada muestra debe ser rotulada, de modo que sea fácil de identificar.
3. La siguiente información debe ser anexada a las muestras de cada caso:
 Nombre, dirección y teléfono del médico.
 Nombre, dirección y teléfono del dueño.
 Especie animal, edad, sexo y raza.
 Número de animales en el hato.
 Número de animales afectados.
 Tiempo de evolución de la enfermedad.
 Signos clínicos que presentó el paciente.
 Datos sobre la morbilidad y mortalidad en el hato.
 Vacunaciones y tratamientos.
 Hallazgos a la necropsia.
 Casos similares en la zona.
 Diagnóstico presuntivo.
 Fecha y hora de la muerte.
 Material enviado al laboratorio, fijador o preservativo
 usado.
 Especificaciones claras relativas al tipo de análisis que se requiere. (Aluja y Constantino,
2002)
Materiales para muestreo.
Los utensilios que se necesitan son: el cuchillo, piedras para afilar, tijeras de cirugía o disección,
pinzas con y sin dientes de ratón, segueta o hacha, costótomo, bisturí. Debe de haber también frascos
con formol buferado al 10% (o con alcohol en su defecto), frascos limpios y otros estériles, hisopos
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estériles, tubos de ensayo con y sin anticoagulante, jeringas, neveras y anticongelantes o hielo, hojas de
registro e hilo. (Torres et al., 2006)
Figura 1. Instrumental básico para el muestreo de cadáveres
Toma conservación y envió de muestras para estudios de necropsia e inspección de órganos.
La necropsia es un examen sistemático de los órganos y tejidos en un cadáver para
determinar la causa de muerte, el grado de enfermedad o lesión, el efecto de la terapia o la
identificación de alguna condición patológica no detectada ante mortem. (Aluja y Constantino, 2002).
Es recomendable enviar inmediatamente los cadáveres u órganos de los animales
afectados, se recomienda su conservación en refrigeración por no más de 12 hrs, nunca congelar, la
razón son los cambios postmortem que se presentan después de la muerte, ya que impiden la
identificación de lesiones, una guía recomendable para poder estimar el tiempo de muerto de un
animal es basarnos en la rigidez cadavérica o rigor mortis, este se caracteriza por un endurecimiento
y una contracción de la musculatura, tanto estriada como. Externamente se presenta primero en los
músculos de la cabeza, después en el cuello, tronco y en los miembros torácicos, por último en los
pélvicos. Se establece entre 2 y 8 h después de haber ocurrido la muerte y desaparece, en el mismo
orden; entre 24 y 48 h, dependiendo de factores como la temperatura, humedad ambiental, estado
nutricional, de salud y pelaje del animal. Si se constata, por tanto, rigidez en los músculos de la
cabeza o del cuello; puede deducirse que la muerte ocurrió pocas horas antes. En cambio, si los
miembros pélvicos están rígidos y existe cierta flacidez en los músculos de la cabeza y del cuello, es
indicio de que el, rigor mortis ya empieza a desaparecer, por tanto, el animal murió entre 24 y 40
horas antes, lo cual lo descartaría para necropsias (Aluja y Constantino, 2002). .
Si es posible se recomienda enviar animales vivos con la signología de la enfermedad, para
obtener las mejores muestras posibles y además asegurar que a la necropsia se puedan observar
lesiones.(Moreno et al., 2006)
Toma conservación y envió de muestras para histopatología.
La histopatología es el estudio microscópico de los cambios tisulares para identificar la
naturaleza de las enfermedades. (Valero et al., 2000a)
Desde un punto de vista práctico, la histopatología es una herramienta diagnóstica excelente
para orientar problemas patológicos de difícil caracterización clínica y problemas de origen
neurológico. Lógicamente, también permite la correlación entre la detección de agentes infecciosos y
la existencia de lesiones asociadas. Este último punto es muy importante, y cada vez más, dado que
la detección de un agente infeccioso no supone necesariamente que éste sea la causa de la
problemática clínica o de las lesiones macroscópicas observadas. (López, 2000)
Cabe recordar que el procesado de las muestras para histopatología requiere mínimo de 24
horas de fijación y aproximadamente unas 24 horas más para la realización de los procesos de corte
de la muestra, inclusión en parafina, corte del bloque de parafina en secciones de 4 μm, y tinción con
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hematoxilina y eosina. Una vez realizados estos procesos, la muestra se encuentra a punto para ser
examinada por el patólogo. (Segalés y Domingo, 2003)
Los tejidos se deben recolectar lo más pronto posible después de la muerte y de preferencia
deben contener una parte del tejido afectado junto con otra de aspecto normal. El grosor de la
muestra depende del tejido, pero como regla general no debe ser mayor de 0.5 cm y debe ser
colocado en un frasco que contenga por lo menos diez veces su volumen de fijador. Cuando se
toman muestras demasiado gruesas se fijarán las partes periféricas mientras que en el centro, al que
no puede penetrar con rapidez el fijador, seguirán los procesos autolíticos, lo que puede llegar a
confundir al patólogo con poca experiencia. La elección del líquido fijador depende, desde luego, de
lo que se pretende investigar. Para trabajos de rutina con coloración de hematoxilina-eosina, el
fijador más utilizado es la formalina a 10% amortiguado a un pH de 7.2. Tiene la ventaja de que en él
pueden permanecer, los tejidos por tiempo indefinido. Si se requiere de alguna técnica especial será
necesario consultar los libros de técnicas histológicas para las indicaciones pertinentes. Los
recipientes para las muestras deben ser de boca ancha para que puedan salir íntegras y fácilmente,
una vez fijadas. Las muestras para exámenes histológicos nunca se deben congelar (dado que se
forma una cantidad muy importante de artefactos asociados a la congelación. (Aluja y Constantino,
2002).
Recomendaciones para la toma, conservación y envió de muestras de algunos órganos:
Cerebro. Se extrae, se corta en dos mitades por su eje longitudinal, una se coloca en un frasco con
el formol amortiguado al 10% y la otra en una bolsa de plástico nuevo. Por si se pretende realizar
estudios de microbiología o inmunología. (Segalés y Domingo, 2003)
Pulmón. Se suelen recoger 3-4 muestras de diferentes partes del pulmón, tanto de la zona
supuestamente lesionada como de la zona aparentemente no lesionada. Se cortan rodajas de unos
0,5 cm de ancho, y especialmente de los lóbulos apicales y medios (son los lóbulos donde
generalmente las lesiones microscópicas son más evidentes). Las muestras deben ser pequeñas
para facilitar la penetración del formol. (Segalés y Domingo, 2003)
Corazón. Se toma una porción de la pared ventricular derecha, izquierda y del tabique
interventricular. En todos los casos, la rodaja no debe medir más de 0,5 cm de ancho. (Segalés y
Domingo, 2003)
Nódulos linfáticos. Se pueden recoger enteros, pero abiertos mediante un corte sagital para
facilitar su fijación. (Segalés y Domingo, 2003)
Estómago/intestino. Estas son probablemente las muestras más delicadas de tomar
adecuadamente. Dado la normal presencia de una flora bacteriana en estas localizaciones
(especialmente intestino), el proceso de autolisis (putrefacción) comienza inmediatamente después
de la muerte del animal. De hecho, se considera que después de 3 o 4 horas postmortem, la mucosa
intestinal ya se encuentra autolizada. Por tanto la muestra ideal es aquélla que procede de un animal
muerto recientemente o al que el propio veterinario le ha practicado la eutanasia. Las muestras que
conviene tomar suelen ser 2 o 3 porciones de unos 4-5 cm de longitud de yeyuno, una de duodeno,
íleon y ciego y 1 o 2 de colon. Se recomienda la apertura longitudinal de la sección intestinal
recogida para poder lograr una fijación eficiente. La no realización de la apertura del tracto intestinal
puede ocasionar que igualmente se produzca la autolisis de la mucosa. También se recomienda
hacer una ligadura con ayuda de un hilo a la sección del intestino a colectar e inyectarle formol, una
vez repleto se coloca en un frasco con el fijador. (Segalés y Domingo, 2003)
Otros órganos. Habitualmente se suelen tomar secciones de órganos parenquimatosos de un
grosor igual o menor a 0,5 cm. En muchos casos es adecuado recoger varias porciones de un
mismo órgano. En caso de órganos pequeños (casos de glándulas adrenales, ganglio trigémino,
etc.) se toma el órgano entero.
En particular de la piel se recomienda tomar la muestra de lesiones primarias (pápulas, maculas,
pústulas, vesículas, ampollas, etc.) previo a cualquier tratamiento y sin necesidad de rasurar el pelo
o realizar asepsia y/o desinfección de la zona, una vez tomada la muestra se coloca entre dos
paletas, sin aplastar la muestra y se coloca en el recipiente con formol. (Segalés y Domingo, 2003)
I
C
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I
C
I
Figura 2. Formas Correctas (C) e incorrectas (I) de conservar las muestras para estudios
histopatológicos.
Toma conservación y envió de muestras para histoquímica
En ocasiones durante la histopatología se requieren demostrar algunas características de las
lesiones, identificar al antígeno o determinar algunas estructuras histológicas, para esto contamos
con el apoyo de la histoquímica. La metodología de la toma, conservación y envió de muestras es la
misma descrita para histopatología. (Valero et al., 2000b)
Toma conservación y envió de muestras para citopatología
Estudio o examen microscópico de las células con el fin de identificar algún desorden
clínico. (De Buen, 2002)
El material para estudios citológicos se observa en frotis obtenidos de mucosas, improntas,
raspados, punciones con aguja delgada (PAD) y líquidos; permitiendo hacer diagnóstico de procesos
inflamatorios, bacterianos, virales, parasitarios, micóticos, neoplasias y procesos degenerativos.
Figura 3. Diagnóstico Citopatológico: mastocitoma.
Punción con aguda delgada (PAD).
Cualquier nódulo o masa, debe ser puncionada, ya que a la palpación y macroscópicamente
se confunden las lesiones, los hemangiomas, lipomas o mastocitomas pueden mostrar la misma
consistencia. Si hay más de un nódulo hay que muestrear cada una y mapearlas, pues no
necesariamente deben de estar relacionadas. (Romero, 2002b)
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Es uno de los métodos más utilizados en citología, ya que se puede obtener material celular
casi de cualquier parte del organismo. Esta técnica se realiza en cualquier lesión o nódulo palpable,
o bien se puede hacer en órganos o tejidos internos con ayuda de ultrasonido, en esta última parte
se necesita emplear antisepsia.
El material con el que se trabaja son con agujas del calibre 22 y jeringas del 10-12 ml; se
puede hacer uso de un porta jeringas, laminillas y fijador (depende de la tinción que se utilice).
(Romero, 2002b)
Después de haber identificado y palpado la lesión, se desinfecta el área seleccionada para la
punción, las manos del operador deben de limitar y sostener la lesión y entonces insertar la aguja en
el tejido, para esto la jeringa no debe de tener aire, ya dentro de la lesión se empieza a aplicar una
presión negativa con el embolo de forma constante. En este preciso momento hay cuatro
consideraciones que hay que remarcar: amplitud, frecuencia, dirección y duración. (Romero, 2002b)
La amplitud se refiere a que tan profundas deben de ser las inserciones (baja o alta
amplitud); la frecuencia es a cuantas veces hay que hacer dichas inserciones por segundo (de dos a
tres); con la dirección nos referimos a que las inserciones deben de ser en una misma dirección;
mientras que con la duración se ve el tiempo que con que se deben de repetir los pasos antes
descritos (5 a 7 seg.), o bien cuando el material aspirado llegue al capuchón de la aguja liberando el
vacío para retirar la aguja. (Romero, 2002b)
Se desconecta la aguja de la jeringa, se mueve el embolo hacia atrás de la jeringa, se
conecta nuevamente la aguja y se impulsa el embolo hacia a dentro, esto liberara varias gotas las
cuales deberán ser depositadas en un porta objetos. Con lo cual se procederá a realizar uno
extendidos para adelgazar el material obtenido. Es preferible realizar dos o tres punciones de áreas
diferentes de la lesión con lo cual se asegura tener material representativo. (Romero, 2002b)
Hay que hacer hincapié, que si al hacer la PAD no se obtiene material en la jeringa, es
probable que se haya quedado en la aguja y hay que rescatarlo de la siguiente forma: primero hay
que regresar el vacío de la jeringa, retirar del sitio de punción aguja y jeringa, sacar la aguja de la
jeringa, hacer vacío de la jeringa, volver a conectar la aguja, y posteriormente desplazar el embolo
con energía para sacar el material de la aguja. (Romero, 2002b)
Figura 4. Método de muestreo para citopatología. Punción con aguja delgada
Citología exfoliativa
Las improntas o raspados son técnicas igualmente utilizadas, En el caso de la primera se
utiliza generalmente durante la colección de órganos en estudios postmortem o en la superficie de
biopsias quirúrgicas, o bien sobre la superficie de lesiones epiteliales. Se necesita superficie de corte
lo más fresca posible por lo que necesitamos una hoja de bisturí para crearla, se elimina el fluido
excedente por adsorción con una toalla, posteriormente se pone en contacto la superficie de un
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portaobjetos con la superficie del tejido y el material que se obtiene se extiende. Si son piezas
pequeñas éste mismo tejido se puede rodar sobre el portaobjetos. (Romero, 2002b)
Los hisopos, raspados a cepillados. En el caso de los raspados son un poco más agresivos
que las demás técnicas, pero igualmente funcional, aquí el material colectado por hisopos (en casos
de vagina conjuntiva, oídos, y mucosas), abatelenguas, hojas de bisturí (piel), y cepillos (bronquios,
estómago, Por endoscopias, es llevado a las laminillas y se realizan los extendidos. (Romero,
2002b)
En el caso de los fluidos es muy recomendable usar citocentrífuga, las cuales concentran las
células en las laminillas, si no se tienen la a la mano, se deja sedimentar al líquido y
aproximadamente 30 minutos después se toma el sedimento y se realiza en frotis, Por otro lado, el
líquido se puede conservar en refrigeración, o alcohol 96º, para su envió posterior al Patólogo
Veterinario. (Romero, 2002b)
Figura 5. Método de muestreo para citopatología. Impronta vaginal (izquierda) y nasal
(derecha)
Realizar los frotis o extendidos.
Existen varias formas de hacer los extendidos, pero como regla general se prefiere que
estos extendidos se hagan de forma rápida (dentro de los primeros cinco a diez segundos
posteriores a la toma de la muestra), pues con esto reducimos al máximo, pérdidas de detalle entre
otros, así mismo al hacer la extensión del material sobre las laminillas se recomienda hacerlo en
ángulo de 90º en un extremo o en varios puntos. (Núñez, 2007)
Se puede aplicar una técnica llamada impulsión, en la cual se coloca en un extremo de la
laminilla o portaobjetos una gota del material recolectado, con la punta de otro portaobjetos y por
delante de dicho material se hace el extendido como se realiza en sangre, un de las causas por la
que se prefiere es que es menos traumática que la técnica de tracción o aplastamiento. (Núñez,
2007)
La técnica de tracción o aplastamiento se caracteriza por cubrir el material recolectado con
otro portaobjetos en ángulo recto y se desplaza suavemente y rápido hacia el extremo inferior de la
laminilla, en este caso se evita hacer presión digital excesiva. (Núñez, 2007)
El esparcido se aplica cuando en el capuchón de la aguja quedan restos de material, por lo
que el material se deposito sobre la laminilla en un ángulo de 5º a 10 º.
Si se obtiene material líquido como en el caso de quistes, higromas, hay que usar una citocentrífuga
(3600rpm/ 5min), o en su lugar realizar la sedimentación con lo que se tira el sobrenadante y se
trabaja con el sedimento como se indicó previamente. (Núñez, 2007)
Fijación de Laminillas.
Es un paso muy importante para una eficiente interpretación de las células, dependiendo de
la técnica de tinción que desee emplear, es la forma en que se deben fijar, pues si se realiza de
forma no adecuada, podría causar alteraciones o simplemente no preservar de forma adecuada a
las células y por lo consecuente dar una mala interpretación.
 Fijación con alcohol al 96º para tinciones con Papanicolau.
 Fijación al aire para tinción de Giemsa y Diff-Quick.
Fijación con formol al 10% para tinciones con hematoxilina y eosina. (De Buen, 2002)
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Figura 6. Tinción para citopatología. Rapid Diff-Quick
Envió al laboratorio
Protección del frotis: Para envió se requiere que las laminillas estén bien protegidas de la
abrasión con superficies rugosas, que puedan raspar la superficie donde esta a muestra, es por ello
que un papel higiénico suave es apropiado, inclusive se puede poner otra laminilla encima para
proteger el frotis y después envolverlas juntas, con papel. (Núñez, 2007)
En caso de traer líquidos se pueden colocar en un frasco o tubo de ensayo con tapa y
conservarlos en refrigeración si se va hacer el envió inmediatamente o agregarles la misma cantidad
de alcohol a 96°. (Núñez, 2007)
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Bibliografías.
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