Ciclo celular animal

CICLO CELULAR ANIMAL SU CONTROL
AUTORES
-Chris Norbury
-Paul Nourse
ANALISIS DEL TRABAJO
La mayoría de las células eucariontes atraviesa una serie de acontecimientos ordenados,
llamado ciclo celular, en el cual sus cromosomas se duplican y una copia de cada uno se
distribuye en cada una de las células hijas. La regulación del ciclo celular es decisiva para el
desarrollo de los organismos multicelulares. La pérdida del control lleva en última instancia al
cáncer.
Recientemente se demostró que los procesos moleculares reguladores del ciclo celular
(replicación de cromosomas y división celular) eran similares en todas las células eucariontes.
Esta semejanza contribuyó a un conocimiento mayor de cómo están coordinados y controlados
estos acontecimientos.
Técnicas bioquímicas y genéticas al igual que la tecnología de ADN (Ácido Desoxirribonucleico)
recombinante fueron utilizadas para estudiar aspectos del ciclo celular eucarionte, los cuales
demostraron que la replicación de las células es controlada por la regulación de la replicación
del ADN nuclear y la mitosis.
Los embriones tempranos de muchas especies animales experimentan ciclos celulares
excepcionalmente rápido, a través de los cuales el gran huevo se subdivide en muchas células
más pequeñas, sin aumentar de tamaño. Estos ciclos celulares de embriones tempranos, en
los cuales las fases S (síntesis de DNA) y M (mitosis) se alternan y se suceden rápidamente sin
que se produzcan fases G1 y G2 (G = gap: intervalo), nos muestra como actúa el sistema de
control del ciclo celular en su forma mas simple. Se observó que la transición desde fase G2 a
fase M requiere de células eucariotas superiores para iniciar coordinadamente procesos de:
ruptura de envoltura nuclear, condensación de la cromatina y reorganización del citoesqueleto.
El inicio de la fase M ocurre después del completado de una vuelta de replicación de ADN
previa en el ciclo, mostrando controles operativos en el límite entre G2 y M.
Existe un factor intracelular responsable de la formación de la fase M, llamado Factor de
promoción-maduración (MPF); el cual fue detectado en células huevos detenidas en Metafase y
en extractos de células somáticas de eucariotas. Este factor induce cambios en la fase M, como
en la dinámica de microtúbulos, inducción de formación del huso mitótico, condensación del
cromosoma, inhibición de la fusión de vesículas y ruptura de la envoltura nuclear. Además de
las funciones mencionadas, el MPF amplifica o diversifica la señal de inicio de la fase M a
través de cascada de proteínas Kinasas.
El MPF es fundamental para el control del ciclo celular. Su activación, mediante un proceso
autocatalítico, conduce a la célula a la mitosis; la inactivación del MPF permite a la célula salir
de mitosis y replicar su DNA. Este se activa e inactiva cíclicamente en los ciclos embrionarios
tempranos, independientemente del núcleo. Al purificarse el MPF de Xenopus Lavéis mostró
tener dos subunidades proteicas, una que es una kinasa dependiente de ciclina, con actividad
enzimática (p34cdc2) y otra que es una ciclina que presenta actividad accesoria (ciclina B).
La subunidad Cdc2 tiene que asociarse con ciclina para adquirir actividad MPF. La destrucción
de la ciclina inactiva al MPF en el punto de salida de la mitosis, y la acumulación de la ciclina
acabada de sintetizar permite la reactivación del MPF en el ciclo siguiente. En estos embriones
tempranos el tiempo necesario para reactivar el MPF es suficiente para permitir una única
ronda de replicación del DNA.
La p34cdc2 regula, junto con la ciclina B el ingreso a la fase M. Se vio que los niveles de ciclina
son máximos en cada fase M, habiendo dos tipos: A y B. La función de la ciclina B permanece
incierta aunque dos posibilidades han sido propuestas: (1º) determina la locación subcelular de
la p34cdc2, (2º) determina la especificidad del sustrato del complejo MPF in vivo.
La actividad del MPF es regulada por la fosforilación y desfosforilación de sitios específicos de
la p34cdc2. La acumulación y degradación de ciclina B puede ser responsable directo de la
duración del MPF y su consiguiente presencia.
Los mejores sustratos para la fosforilación son los residuos serina o treonina, Vimentina,
Caldesmosina, y la histona H1. El complejo p34cdc2/ciclina B es responsable de las
fosforilaciones de la fase M.
En general bloqueando la replicación de DNA inhibimos la entrada a la mitosis, y su replicación
incompleta bloquea la activación del MPF y consecuentemente la desfosforilación de la p34cdc2,
esto fue vencido por adición de un grupo de proteínas confirmando estos estudios en levadura.
Las defosforilaciones de proteínas son las causantes de la mayoría de los cambios
morfológicos que acompañan a la mitosis: los cromosomas se condensan, la envoltura nuclear
se rompe, el retículo endosplasmático y el complejo de Golgi se fragmentan, las células afloja
sus adhesiones y el citoesqueleto se transforma facilitando la complicada organización de los
movimientos que segrega los cromosomas y la división celular.
CONCLUSION
Diversos estudios realizaos sobre el huevo y el embrión temprano de la rana de Xenopus han
sido útiles en el análisis de las moléculas que controlan el ciclo cromosómico. El huevo de
Xenopus es una célula excepcionalmente grande (1mm de diámetro) y además del DNA
contiene reservas de casi todos los materiales, necesarios para la construcción del embrión
temprano. Por estas características resulta sencillo inyectar sustancias en su citoplasma y los
ciclos de replicación del ADN y la división están condensados mediante la aceleración de las
fases S y M haciendo que G1 y G2 sean tan cortas que resulten imperceptibles, observándose
las oscilaciones entre niveles bajos y altos de actividad de MPF.
Las investigaciones sobre el ciclo celular en los últimos tiempos han conducido al modelo de
control del ciclo celular eucarionte sustentado mediante una lógica exacta a nivel molecular.
Cada fenómeno regulador tiene dos funciones importantes: activar un paso del ciclo celular y
preparar la célula para el próximo acontecimiento de ciclo. Esto asegura un orden adecuado de
las fases del mismo.
Aunque en la actualidad la lógica general de la regulación del ciclo celular parece estar bien
establecida, todavía falta descubrir muchos detalles decisivos.
Un conocimiento detallado de los aspectos del control de ciclo celular tendrá enormes
consecuencias en particular para el tratamiento de los cánceres.
La regulación de la replicación celular es de importancia obvia para la estructura y formación
adecuada de los aparatos y sistemas vertebrados, por eso podemos concluir que queda mucho
para prender acerca de este control durante el desarrollo de los organismos multicelulares
BIBLIOGRAFIA
-Albert Bruce et al, “Biología Molecular de la Célula”, II edición, Ediciones Omega; 1992.
-Lodish, Harvey et al; “Biología Celular y Molecular”; IV edición, Editorial Médica Panamericana;
2002.
-Diccionario Inglés –Español Larousse, II Edición, Ediciones Larousse.
-Norbury, Chris y Nurse Paul, “Animal Cell Cycles and their Control”.
INICIO DE LA FASE M EN CELULAS ANIMALES
Muchos tipos de células en cultivo tienen fases G2 de duración relativamente constante,
aunque contrariamente a nuevos argumentos de la bibliografía; esto no debería ser tomado
como evidencia contra la regulación del ciclo de células animales. La transición G2/M requiere
de células eukariotas superiores para iniciar de una forma altamente coordinada procesos
complejos que incluyen: ruptura de envoltura nuclear, condensación de la cromatina y
reorganización del citoesqueleto.
El inicio de la fase M es normalmente permitido luego de completada una vuelta de replicación
de ácido desoxirribonucleico (DNA) previa en el ciclo, además demostrando la existencia de
controles operativos en el límite entre G2 y M.
Experimentos usando transferencia citoplasmática dentro de oocitos anfibios y células de fisión
somáticas provieron la primer evidencia directa de que un factor intracelular que actúa en forma
dominante es responsable de la formación / constitución del estado de fase M.
La naturaleza universal de este factor en las células eucariota se ha vuelto evidente durante los
últimos tres años.
FACTOR DE PROMOCION Y MADURACION (MPF) Y KINASA
ASOCIADA AL CRECIMIENTO
Ensayos comparativamente sencillos para la complejidad de los eventos de la fase M han
facilitado la búsqueda de las moléculas que ponen en funcionamiento la fase M. Estos ensayos
se basaron inicialmente en la microinyección de material dentro de oocitos inmaduros
detenidos en profase meiótica. Del material inyectado fue evaluada su capacidad para causar
la maduración meiótica, es decir ingresar a la metafase meiótica, sin requerir la síntesis de
otras proteínas. La maduración fue evaluada por observación microscópica de la ruptura de la
membrana nuclear del oocito, la vesícula germinal. Dicho factor de promoción y maduración
(MPF) fue detectado en huevos atrapados en metafase y en extractos de células somáticas
eucariota distantemente emparentadas. Durante los ciclos celulares meióticos y mitóticos, fue
visto que la actividad específica del MPF oscilaba, alcanzando un máximo en la fase M.
Una oscilación similar fue informada para una proteína kinasa llamada “kinasa asociada al
crecimiento” o “kinasa histona H1 de la fase M ”.
El MPF induce cambios en la fase M en extractos preparados de células huevo activadas en la
interfase del primer ciclo celular embrionario, específicamente cambios en la dinámica de
microtúbulos, incluyendo la formación del huso mitótico, condensación del cromosoma,
inhibición de la fusión de vesículas y ruptura de la envoltura nuclear. El Latter fue usado en un
ensayo in vitro para actividad del MPF, facilitando la purificación de MPF mas grande que el
3000 de huevos de Xenopus Laevis. El MPF de Xenopus Laevis altamente purificado mostró
tener 2 especies proteicas, una de 45 Kda y otra de 32 Kda. Este material mostró tener
actividad de proteína kinasa. También se purifico MPF de estrellas de mar en fase M, y se lo
encontró unido a proteínas “Kinasas histonas H1 de la fase M”, implicando claramente la
actividad de esta proteína en los eventos que conducen a la iniciación de la fase M.
P34CDC2LA SUBUNIDAD CATALÍTICA DEL MPF
Una línea genética paralela de investigación estableció que una proteína kinasa de 34 Kda, que
es un tipo restrictivo para el ingreso a la fase M en levaduras, está conservada funcionalmente
en células humanas.
Esta kinasa es el producto de la fisión del gen cdc2 de levaduras, cuya contraparte en
levaduras de gemación es el cdc 28.
En ambas levaduras, el producto génico p34cdc2, p34cdc28 es una proteína Serina/Treonina
kinasa, y la función del gen es requerida para el ingreso a la fase M y para atravesar el punto
de control del inicio de la fase G1, en el cual la célula se prepara a entrar en la fase S. En
levaduras de fisión, el p34cdc2 estaba implicado en determinar la regulación del comienzo de la
fase, esto se vio mediante el descubrimiento de cdc2 mutantes que adelantan las células para
la mitosis, acortando la G2. Un complemento funcional de un cdc mutante termosensible fue
usado para clonar un gen humano que codifica una kinasa de 34 Kda capaz de ejecutar el rol
del p34cdc2 tanto en G1 como en G2, demostrando así la conservación de esta función a través
de la evolución de los eukariotas superiores. El gen humano cdc2, llamado cdc2HS (por Homo
Sapiens) codifica una proteína que muestra en su secuencia de aminoácidos un 63% de
similaridad con los p34cdc2 de levaduras de fisión. Homólogos funcionales del cdc2 fueron
aislados posteriormente de ratones, pollos, mosca de la fruta, plantas , y también anticuerpos
que reconocen las secuencias conservadas de las p34cdc2 de tamaño similar en todas las
eukariotas estudiadas. Los avances bioquímicos y genéticos para entender el control de la
iniciación de la fase M fueron fortalecidos al demostrarse que el componente de 32 Kda del
MPF es un polipéptido relacionado al p34cdc2. Es así que una proteína con actividad kinasa,
idéntica a la proteína kinasa asociada al crecimiento y los fundamentos enzimáticos de la
actividad del MPF, parecen ser responsables de dirigir el ingreso a la fase M en todas los
eukariotas. Esta conclusión fue justificada mediante experimentos en los cuales se demostró
que la microinyección de anticuerpos contra p34cdc2 bloqueaban el ingreso a fase M en
fibroblastos, y mediante la identificación de una línea de células termosensibles de ratones que
tiene una proteína p34cdc2 que se descompone a cierta temperatura, y que debido a esto, a una
temperatura limitada se logra detener en la fase G2 tardía.
En la evolución, la aparición de la función de cdc2 probablemente ocurrió cercano al
surgimiento de los eukariotas, y efectivamente es posible que hayan sido esenciales para la
evolución de algunos de los rasgos distinguibles de las células eukariotas, tales como el
compartimiento nuclear y formación del huso.
CICLINA B: EL SEGUNDO COMPONENTE ESENCIAL DEL MPF
Las ciclinas fueron descriptas primero como proteínas sintetizadas periódicamente durante el
desarrollo embrional temprano de invertebrados marinos. Se ha visto que los niveles de ciclina
son máximos en cada fase M, con 2 tipos, A y B, siendo distinguibles por sus distintas
movilidades en gel y por la aparición / desaparición del tipo A un poco más temprana. El
clonado molecular de genes de ciclinas de una variedad de eukariotas confirmó las diferencias
entre la A y la B a nivel de aminoácidos, aunque la similitud limitada entre ciclinas de distintas
especies estaba restringida a una región interna de aproximadamente 150 aminoácidos, y
también se identificó el producto de 56 KDa del gen cdc13 como una ciclina B en levaduras de
fisión.
Este descubrimiento brindo un ejemplo profundo de la fuerza de la Bioquímica Combinante y
las estrategias génicas, y en este caso los análisis puramente genéticos de levaduras han
demostrado recientemente que el p56cdc13 y el p34cdc2 interactúan estrechamente al inicio de la
fase M. Esta información, combinada con la descripción del comportamiento de ciclinas en
embriones prematuros, prepararon la escena para el descubrimiento de que el componente de
45 Kda del MPF purificado es una cicilina B.
Ninguna actividad enzimática ha sido atribuida a las partes de Ciclina B, mientras que el p34cdc2
tiene actividad de proteína Kinasa que parece ser esencial para la iniciación de la fase M.
La Ciclina B funcional es requerida para el ingreso a fase M, y la asociación a una ciclina es
considerada esencial para la actividad del p34cdc2.
Por lo tanto se ha concluido que el p34cdc2 es la subunidad catalítica del MPF, y que la Ciclina B
tiene una función accesoria no catalítica. Esta función permanece incierta, aunque 2
posibilidades ya han sido propuestas. La primera es que la Ciclina B determina la especificidad
del sustrato del complejo MPF in vivo. Como la fase M normalmente es transitoria, debe haber
mecanismos que aseguren que el MPF sea inactivado una vez que su función esté completada.
Esta inactivación se alcanza en parte por degradación proteolítica de la subunidad Ciclina B, lo
que probablemente conduzca a la perdida de la actividad kinasa de la proteína p34cdc2. Una
ciclina trunca, carente de secuencias N-terminal requeridas para la proteólisis causó que los
extractos de huevos entraran a la mitosis y se vuelvan bloqueadas en la fase M. Las
secuencias delecionadas de esta proteína trunca eran capaces de conferir ubiquitina, mediada
por proteólisis en una proteína marcadora a la cual eran fusionadas, sugiriendo que la
degradación de ciclina puede ocurrir por la vía de la ubiquitina. Los medios por los cuales esta
degradación es puesta en funcionamiento solo después de que el MPF haya ejecutado su
función son desconocidos.
La función de la ciclina A no está claramente entendida. El mRNA exógeno de ciclina A causó
la entrada a la fase M tras inyectarse dentro de los oocitos de Xenopus Laevis, sugiriendo un
envolvimiento potencial del ciclo celular y las proteínas ciclinas A son capaces de formar
complejos con la proteína p34cdc2, los cuales presentan actividad de proteína kinasa que llega a
niveles máximos durante el ciclo celular, antes que el complejo p34cdc2/ciclina B.
En Drosophila,el gen de ciclina A demostró ser esencial, pero el análisis de una ciclina A
homocigota con una mutación por deleción no denunciaba función alguna para la ciclina A en
alguna fase específica del ciclo celular. La ciclina A mutante fue capaz de completar los
primeros 15 ciclos celulares embrionarios, se presume usando la reserva de ciclina A materna,
antes de completar el siguiente ciclo con niveles muy bajos de ciclina A, se detiene antes de
alcanzar la mitosis 16. En células de mamíferos y extractos de huevos de Xenopus Laevis la
ciclina A se une a una proteína de 32-33 Kda a la que está relacionada estructuralmente, que
no es la p34cdc2. La inmunodepleción de esta proteína, llamada cdc2b o cdk2, desde extractos
de huevo de Xenopus Laevis, redujo significativamente la capacidad de los extractos para
replicar DNA, demostrando un posible rol para las especies de 32-33Kda en fase S. La
inhibición de la resíntesis de ciclina en este sistema no inhibió la replicación de DNA, a pesar
de esto, se presume que el complejo cdk3/ciclina A no es importante normalmente para el
comienzo de la fase S.
La ciclina A es también capaz de formar complejos con los factores de transcripción celular
E2F y DRFT1 y también con la proteína de adenovirus Ela. Aún no es conocido si alguno de
estos complejos participa directamente en algún aspecto del Ciclo Celular.
Regulación de la actividad de fosforilación
La acumulación de ciclina B durante S y G2 es un proceso gradual, pero el comienzo de la
Mitosis es en contraste un cambio abrupto y dramático.
Este contraste ha sido explicado de 2 formas generales, considerando el rol esencial de la
ciclina b en el ingreso a MPF y a la fase M .
• En el 1* modelo la ciclina b debe acumularse en un nivel particular de inicio, el cual
determina cuando la actividad de MPF aparece.
• En el 2* modelo se sintetiza relativamente temprano, suficiente ciclina b para soportar el
ingreso a fase M y acumular antes de ser activados rápidamente, un grupo de
heterodímeros o “pre-MPF”inactivos del complejo p34cdc2/ciclina b, para iniciar la
transición de G2/M.
Este 2* modelo está soportado por un número de observaciones experimentales. Primeramente
cuando la ciclina b fue hallada, siendo la única proteína encontrada en la síntesis de Novo en
Xenopus, requerida para la interfase del extracto de huevo para continuar al estado de fase M
su síntesis se completa totalmente antes de la transición en fase M. Antes de entrar a la fase
M, el nivel inicial de ciclina b requerida es sobrepasado.
Las evidencias de la acumulación de los grupos inactivos (pre-MPF), ya se observan desde la
amplificación de la Auto catálisis de MPF.
Cantidades pequeñas inyectadas de MPF, dirigen la actividad de los oocitos inmaduros,
generando una mayor actividad de MPF, sin la necesidad de síntesis de la proteína.
La acumulación y activación de Pre-MPF se observa por los cambios en el estado subsiguiente
de fosforilación del p34cdc2. Estudios sobre la levadura de fisión dan la condición para entender
el control operativo de especies eucariotas superiores. Esta fisión fue encontrada fosforilada en
2 sitios: Tyr15 (tirosina) y Thr167 (treonina).
En el inicio de la Mitosis de las células de levadura, la tyr15 se halla desfosforilada, y esto
podría ser importante para la activación de la actividad de la proteína Quinaza p34cdc2.
Esta interpretación tiene como soporte el comportamiento observado de un cdc2 mutante en
donde la Tyr15 fue reemplazada por un residuo de fenilalanina, donde este último no pudo ser
más fosforilado. Esta mutación en cdc2 provoca que las células de levadura entren a la mitosis
prematuramente, sugiriendo que las funciones normales de la desfosforilación del Tyr15 retrase
el inicio de fase M, a través de la activación de p34cdc2.
Como la Tyr15 se encuentra en la región de p34cdc2, la fosforilación en esta posición puede
inhibir a la proteína quinaza por influencia del ATP (directamente), aunque debe ser evaluado.
La proteína Quinaza responsable de la fosforilación de Tyr15 es identificada inequívocamente,
pero posibles candidatos serían los productos de los genes wee1 y mik1 de las levaduras de
fisión. La actividad de esta proteína es esencial para prevenir la mitosis prematura del fenotipo
visto en el mutante cdc2 de Phe15.
Ambas parecen ser proteínas quinazas por el fundamento de su secuencia de aminoácidos, y
la proteína p107wee1 de serina / tirosina in vitro.
La activación de p34cdc2 en levaduras de fisión dependen normalmente de la actividad del
producto del gen cdc25, el PSOcdc25, el cual parece ser una proteína fosfatasa directamente
responsable de la desfosforilación de la Tyr15. la acumulación cíclica de PSOcdc25 y su
correspondiente mRNA juegan un papel importante en la regulación de la función del gen. Esta
regulación puede cumplir un rol en unir la finalización de replicación de DNA al inicio de fase M.
Así como también la pérdida de dependencia del ciclo celular, cuando la función del
gen(cdc25) es desregulado.
Esta organización regulatoria ha sido conservada en las células animales.
La región de p34cdc2 Tyr15 es idéntica en secuencia de aminoácido desde las levaduras hasta
los mamíferos. La Tyr15 es el sitio exclusivo de fosforilación de tirosina de p34cdc2 en animales.
La fosforilación adicional en el residuo adyacente (Thr14) también suprimen la actividad de
p34cdc2 en interfase, por eso ese fosfato podría ser removido de Thr14 y Tyr15, para activar los
complejos pre-MPF. La desfosforilación de estos residuos es probablemente mediado por una
proteína animal homóloga al p80cdc25, el cual podría tener un rol general en la determinación de
la duración del inicio de la mitosis en el ciclo celular animal post- embrionario.
Tales funciones homólogas han sido clonadas de humanos, de moscas como de levadura de
gemación, por complementación de una levadura de fisión mutante cdc25 o en secuencias
conservadas de aminoácidos que son altamente limitados por el residuo de aminoácido que son
altamente limitados por el residuo de aminoácido 100 carboxilo terminal.
En el cdc25 homologo de Drosophila, se identificó independientemente como un gen esencial
requerido para comenzar la mitosis en el blastoderma, inmediatamente después se activa la
expresión del gen cigótico. Esta expresión ectópica se encontró competente para determinar la
duración de la mitosis durante el desarrollo del post-blastoderma, cuando la rápida
sincronización del ciclo de división nuclear de temprana embriogénesis, es reemplazada por
ciclos que difieren en la duración de G2 en la célula.
En este sistema , la entrega de subsecuencias se da en G2, entran luego en la mitosis como
respuesta de un impulso de expresión de forma de collar completando la replicación de DNA en
el siguiente ciclo.
Se demostró que la activación de pre-MPF fue debido a una proteína fosfatasa distinta a las
clásicas 1, 2 A, 2B o 2C, dando una idea de que esta especie era la responsable(p80cdc25).
El mecanismo de amplificación de MPF (resultado de la reserva de los pre-MPF), debe ser
elucidado. Probablemente la generación de una pequeña cantidad de MPF activo realimentado
positivamente para uno ó más controles de p34cdc2 en la fosforilación y desfosforilación de
Thr14 y Tyr15.
La fosforilación de Thr14 y Tyr15 es seguida por la asociación de p34cdc2 y la ciclina B. Así el
mutante p34cdc2 Asp161 con un ciclo reducido no comienza la fosforilación en ese residuo,
después el doble mutante Ala14 Phe15 no puede ser fosforilado fuertemente, pudiendo
adherirse a la ciclina b. La perdida del monómero p34cdc2 para comenzar fosforilado en Thr14 y
tyr15 puede implicar un cambio conformacional de la ciclina b, resultando en la exposición de
residuos de proteína quinazas todavía incaracterizables (tal vez análogas del producto de
genes weel y mikl de la fisión).
Es notable que p107 no sea capaz para fosforilar p34cdc in Vitro, sugestionando que si p34cdc2
es el blanco in vivo, puede ser presentado con una conformación específica, como resultado de
la ciclina B.
En relación a esta interpretación, p34cdc2 fue fosforilado en tyr15 con la coexpresión de
p107weed en una vacuola virósica de un sistema celular de un insecto. Y fuertemente
fosforilado cuando la ciclina b fue coexpresada en esa misma célula. A pesar de todo el
mecanismo: la fosforilación de Thr14 y Tyr15 y la reunión o agrupación de los pre-MPF
heterodímeros facilita su acumulación inactiva , aunque potencialmente activable (en su forma).
La fosforilación de la treonina adicional de p34cdc2 puede ser importante para a regulación dela
agrupación de MPF. La fosfo-treonina detectada luego P32 (fosfato)in vivo atribuidos a la
fosforilación de residuos 161, análogos a la Thr167(único sitio reportado de fosforilación de
treonina en la fisión).
La mutación de esta treonina produce: residuo no-fosforilado, ciclina b reducida, pérdida de la
actividad de la proteína Quinaza.
La fosforilación de la treonina adicional es parecida a la fosforilación de Thr14 y Tyr15 que
dependen de la ciclina b. La interpretación sencilla de este resultado es:
La fosforilación de P34cdc2 de Thr161 estabiliza de otra forma la asociación transitoria entre
p34cdc2 y la ciclina B. (fig.1).
Aunque el p34cdc2 es fosforilado durante la interfase en el primer ciclo mitótico embrionario y en
células derivadas de animales, Tyr15 no se ha visto fosforilada en el ciclo mitótico del embrión
Xenopus.
Si los cambios en la fosforilación son los responsables de la aparición de MPF, es posible que
esto ocurra en Thr14 ó Thr161 ó en otra posición.
Alternativamente, la acumulación y degradación periódica de ciclina b puede ser responsable
directo de la determinación de la duración de MPF y de su aparición y desaparición en este
ciclo.
Sustratos de P34 cdc2 y su importancia para los eventos de la fase M.
Un gran incremento en el números de proteínas han sido descubiertas como sustratos para el
complejo ciclina B/p34 cdc2 cuando se examinó “in Vitro” (Tabla 1).
Los blancos para la fosforilación son los residuos serinas o treoninas frecuentemente donde los
residuos de aminoácidos adyacentes son básicos. En muchos casos los sitios de fosforilación
in Vitro han sido mostrados para ser fosforilados in vivo pero su propio sitio no puede ser
tomado como una evidencia lógica para su fosforilación in Vivo por el p34cdc2. Esto es en parte
porque el p34cdc2 es una de una familia de nexo cercano a las proteínas kinasas presente en
eucariotas superiores y miembros de esta familia pueden tener sustratos específicos similares.
Los posibles sustratos para MPF son más aptos para ser fisiológicamente significativos si el
sitio pro serina/treonina se convierte fosforilando o hiperfosforilando en fase M y si una
secuencia funcional de esta fosforilación para un proceso en fase M puede ser identificado.
Usando este criterio, los posibles sustratos mejor calificados hasta aquí descriptos para p34cdc2
en células animales son laminillas nucleares, vimentina y caldesmosina. Las láminas A, B y C
son proteínas de filamentos intermedios que polimerizan para generar la lámina nuclear, una
estructura esencial para la membrana nuclear en interfase, mientras que la vimentina es un
constituyente para la red de filamentos intermedios que se extiende hacia fuera del citoplasma
en células eucariotas superiores. La caldesmosina es un componente no estructural de los
filamentos citoplasmáticos que se cree que inhibe la ATPasa actomiosina de estos filamentos.
Las laminas, la vimentina y la caldesmosina son nuevamente fosforiladas en mitosis in Vivo y
por P34cdc2 in Vitro en algunos de los sitios iguales. La hiperfosforilación de las láminas por esta
y los sitios adicionales in Vivo coinciden con el desembalaje de la lámina nuclear y la ruptura de
la estructura nuclear y además la mutación de dos de los sitios fosforilados de la lámina A para
residuos no fosforilables generando una lámina de proteína mutada que proviene del
desembalaje nuclear. La fosforilación de una lámina de gallina B por extractos de levadura de
fisión depende de la activación de la p34cdc2 y el tratamiento del núcleo de gallina aislado con
ciclina B / p34cdc2 purificado causando la despolimerización de la lámina, mientras otra proteína
con actividad kinasa tal como la proteína kinasa A ó C, no tuvo tal efecto en la estructura
nuclear.
La suficiencia de complejo p34cdc2/ciclina B sólo para causar el desamblaje completo de la
lámina ha sido cuestionada, sin embargo, es posible que las actividades adicionales sean
requeridas en vivo. No obstante un vínculo claro ha sido establecido entre la activación de la
p34cdc2 y la degradación del desarrollo nuclear, una característica principal de la fase M en las
eucariotas superiores.
La reorganización del citoesqueleto en la fase M pueden resultar en la fosforilación de la
caldesmosina y la vimentina. Como las láminas, estas proteínas son objeto de una fosforilación
específica en la mitosis en un número de sitios, un subconjunto de las cuales pueden ser
fosforilados in Vitro por el p34cdc2.
Se descubrió que una preparación altamente enriquecida de uno de las dos vimentina-kinasa
endógenas contenía p34cdc2 y altamente purificada p34cdc2/ ciclina B causaba despolimerización
in Vitro de los filamentos intermedios. De manera similar, la fosforilación in Vitro de p34cdc
redujo la afinidad de la caldesmosina por actina y calmodulina. Se cree que la disociación de la
caldesmosina de actina promueve la contracción de microfilamentos, vital para la función del
anillo contráctil durante citocinesis y posiblemente también involucrado en las características
“en la redondez de la célula” de la mitosis de muchos tipos de células animales.
En adición a los sustratos supuestos in Vivo antes descriptos, un número de proteínas han sido
encontradas para actuar como sustratos para p34cdc2 in Vitro (Tabla 1). Esta incluye la Histona
H1 perfectamente usada en ensayos para fase M de proteínas p34cdc2 con actividad kinasa y
los productos de un número de oncogenes viral y celular y tumor supresor de genes. Para
estos posibles sustratos, la evidencia sugerida de la función del ciclo celular es tanto
incompleta como ausente y en algunos casos la fosforilación en Vivo p34cdc2 todavía debe ser
distinguida de la fosforilación por una proteína kinasa relacionada de sustrato de especificidad
similar.
Es de importancia que los candidatos a sustrato mayor calificados para p34cdc2 son tanto
componentes estructurales como proteínas accesorias de características subcelulares que
sobrellevan la reorganización a gran escala durante la fase M. Esto sugiere que una función
principal de la p34cdc2 en la mitosis puede ser directamente la responsable para efectuar
algunos de los cambios intercelulares que caracterizan la transición de G2 a M. En tales casos
esto no estaría oportunamente para una amplificación adicional de la señal generada por la
activación de la p34cdc2, quizás la explicación de la evolución de un mecanismo para la
activación rápida de un conjunto mayor de pre-MPF discutida antes. Sin embargo, aunque el
heterodímero p34cdc2/ciclina B es capaz de iniciar los sucesos de la fase M, probablemente sea
responsable sólo de un subconjunto de fosforilaciones especificas de la fase M. Esto implica
que en adición para las funciones anteriormente aludidas, hay otras funciones de las MPF, las
cuales inician tanto directa como indirectamente la actuación de otras proteínas kinasas,
potencialmente generando amplificación o diversificación de la señal de la fase M a través de
cascadas de proteínas kinasas. Los efecto in Vitro del MPF sobre el comportamiento del
microtúbulo evita la transición Interfase-Metafase in vivo pero este efecto puede ser indirecto,
así como los Xenopus purificados las proteínas kinasas asociadas (MAP) a los microtúbulos
causó un comportamiento similar in Vitro. Como fue encontrado que la MAPkinasa de Xenopus
era fosforilada y activada en fase M, es posible que una cascada de proteína kinasa que
comience con p34cdc2 e incluya MAPkinasa es responsable para la organización de la red
microtubular para el inicio de la fase M.
Dependencia de la mitosis en la finalización de la replicación de DNA
Los estados de interfase y fase M son tan mutuamente exclusivos que entran en la fase m
siendo altamente regulados. Si esto no fuera así, el estado de fase M parcial potencialmente
dañado como la condensación de la cromatina podrían ser generados en las células de la
interfase. En general bloqueo la replicación del ADN inhibe la entrada a la mitosis la
interrupción de este orden del ciclo celular ha sido reportada solo en líneas de células mutadas,
en células tratadas con cafeína o ácido oxálico, o en embriones tempranos en los cuales la
replicación de DNA es bloqueada. La aparición de características amitóticas bajo estas
inusuales circunstancias puede ser tomada como evidencia de que en el curso normal de los
eventos, el principio de la fase M es pospuesto hasta considerar que estos mecanismos
celulares son apropiados.
Mecanismos como estos que posponen el inicio de procesos del ciclo celular hasta que un
proceso temprano halla sido completado han sido llamados “Puntos de Control”.
Un mecanismo semejante aparece dando un sentido para percibir la carencia del
completamiento de la replicación de ADN cromosomal, tal que el principio de la fase M es
normalmente retrasado en respuesta a agentes que prolongan la fase s.
Aunque los embriones tempranos proveen uno de los pocos ejemplos de un sistema animal, en
el cual la inhibición de la replicación de DNA falla al bloquear la entrada en la fase M, esta
dependencia pudo ser impuesta sobre extractos de huevos activados, si ellos son provistos de
una concentración suficientemente alta de de ADN no replicado.
El uso de este sistema mostró que la replicación incompleta de DNA bloque la activación de
los PRE-MPF, probablemente por prevenir la desfosforilación de P34cdc2 a TRY15 y
probablemente algo de THR 14, y este bloqueo de la activación de los MPF fue vencida por la
adición de un producto proteico de la drosophila cdc 25 homologa, confirmando estudios
análogos en levaduras. El mutante de levadura de fisión aparece entrando en la mitosis sin
necesariamente primero completarse la fase S, y fue independiente de la función del gen cdc
25que parece formar parte de un camino de eslabones, el principio de la fase M con la
finalización de la fase S. la sobreproducción de P80 cdc 25 causa en las células de levadura de
fisión arrastrar a la fase S a sufrir una mitosis prematura.
El bloqueo de la activación de los MPF por la no replicación de DNA en un extracto de huevos
de Xenopus, fue vencido por la adición de cafeína, o una droga antes mostrada por inducir
eventos en la fase M en células de riñón de hámster bebe cultivadas deteniendo la fase S.
similares resultados fueron obtenidos en células BHK usando ácido oxálico, un inhibidor de
fosfoproteínas fosfatasa, o por un cambio de la sensibilidad térmica de tsBN2 línea célula BHK,
a su temperatura restringida.
En algunos mamíferos, las características mitóticas no aparecen al menos que la célula haya
entrado a la fase M después de la adición de la droga o modificación de la temperatura, y la
adquisición de la capacidad para ejecutar los eventos relativos de la fase M con la primera
fosforilación de P34cdc2 en TRY 15.
La incubación de los mutantes tsBn2 en su temperatura restringida inicia la degradación del
producto termolábil del gen RCCI, una proteína de unión al DNA que previene la condensación
prematura de los cromosomas por un mecanismo todavía desconocido. Esta pretina es también
requerida para progresar a través de la fase G1, donde se podría ejecutar una función
diferente.
MADURACION MEIOTICA Y FACTORES CITOSTATICOS.
Los huevos maduros de los vertebrados en la metafase meiótica contienen un factor
citoplasmático distinto del MPF, que es capaz de inducir la terminación de la metafase cuando
es inyectado dentro del embrión prematuro.
Este factor citostático, (CSF) aparece al actuar estabilizando al MPF y evitando la salida de la
fase M. Un número de líneas de evidencia indica que el producto proto-oncógeno c-mos puede
actuar como un CSF. La regulación de la expresión de c-mos sigue cerca la apariencia de la
actividad del CSF y en efecto el producto c-mos de la proteína p39mos era detectable solo
durante la maduración del oocito. Microinyección de antisense oligonucleótidos c-mos dentro
del oocito evitó tanto la expresión de la p39mos como la maduración meiótica.
Aunque esto sugirió una función para la p39mos promoviendo la maduración en vez de
estabilizando la fase M, la inyección de c-mos del mRNA dentro de dos células embrionarias
resultó una terminación en la metafase y la actividad del CSF fue eliminada del citoplasma del
huevo cuando éste fue inmunoagotado de p39mos.
Como el CSF, la p39mos tanto en vivo como in vitro es sensible al calcio, siendo degradada
selectivamente por la proteasa cisteína dependiente de calcio on release desde la terminación
de la metafase hasta la fertilización. La inactivación del CSF y del MPF fueron encontradas al
ocurrir por caminos independientes, y la desaparición de la p39mos precedida por la proteólisis
de la ciclina B. De esta manera la inactivación del MPF no es el simple resultado de la pérdida
de la actividad del CSF.
Los sustratos importantes para la proteína kinasa p39 todavía han sido identificados, a través
de la ciclina b pueden actuar como un sustrato in vitro, y la fosforilación de la ciclina B en
extractos de oocitos fue disminuida por tratamientos previos con oligonucleótidos antisense de
c-mos.
La disposición de los datos sugiere que p39mos tiene una doble función, en primer lugar en la
maduración meiótica, y en segundo lugar estabilizando la terminación de la metafase, pero no
indica si la fosforilación de un solo sustrato podría explicar ambas actividades. Puede haber
otro camino alternativo causando la terminación de la metafase, como el producto oncógeno de
la p21ras mutante activada indujo la maduración meiótica en oocitos de Xenopus y exhibió la
actividad típica del CSF cuando se introdujo dentro de los embriones jóvenes, en cada caso
independientemente de p39mos.
El grado con que ésta p39mos toma caminos independientes es relevante para establecer los
restos in vivo de la maduración y terminación de la metafase. Un 20% de las histonas kinasas
H1 específicas de la fase M de huevos de Xenopus fueron encontradas al derivar fracciones de
proteínas deficientes de p34cdc2. Las fracciones conteniendo esta actividad de histona kinasa
eran capaces de acelerar la progesterona e inducir la maduración del oocito a través de un
MPF distinto ellas no podrían inducir solo la maduración. La actividad de la kinasa H1 era
unirse al anticuerpo monoclonal MPM-2 específico de la mitosis, previamente a inhibir la
maduración del oocito.
Esta actividad adicional de la kinasa H1 aparece al actuar como un regulador positivo de la fase
M entrante, pero los sustratos fisiológicamente relevantes para ésta actividad todavía han sido
identificados.
FUNCION DEL
FOSFATASAS.
CICLO
CLULAR
POR
FOSFOPROTEINAS
Si bien el control de la progresión a través del ciclo celular animal puede ser explicado al
menos en parte como el nivel de cambios en la fosforilación de proteínas, luego las proteínas
fosfatasas son potencialmente importantes para este control como lo son las proteínas kinasas
tal como la p34cdc2 y la p39mos. Un número de roles para las proteínas fosfatasas en el control
del ciclo celular han sido sugeridas, de las cuales la más completamente entendida es la
función por la p80cdc25-relacionada con las fosfatasas que aparecen al activar el pre-MPF por
remoción de fosfato de los residuos de Tirosina15 de la p34cdc2 y probablemente de Treonina14
como se discutió más arriba.
Mas o menos se definieron los roles para la serina/treonina-también han sido propuestas como
tipos de fosfatasas específicas 1 y 2A. La inhibición específica del tipo de fosfatasa 2A por
ácido oxálico fue encontrada a causa de la activación temprana del complejo p34cdc2/ciclinaB en
extractos de huevos activados. La inhibición de la enzima de tipo 2A fue probablemente
también responsable por las características observadas después del tratamiento de células
BHK con ácido oxálico. Un fraccionamiento bioquímico grosero de extractos de oocito identificó
una fracción de proteína INH inhibió la activación del pre-MPF. Usando esta inhibición como un
ensayo, el INH fue purificado más de 2000-plegadas por extractos de oocitos. Las fracciones
puras contenían seis especies de proteínas detectables por tinción con Plata (Ag), una de las
cuales era la subunidad catalítica de la fosfatasa 2A .
Mas evidencias para la identidad entre el INH y un tipo de actividad de la 2 A viene de la
demostración de que el INH se inhibió por incubación con ácido oxálico. El grupo fosfato de la
proteína agregado por el INH, estabilizado por la adición del ácido oxálico, y el responsable de
la activación temprana del MPF en extractos de huevos no han sido identificados. Sin embargo,
la observación de las características mitóticas tempranas por inhibición de la fosfatasa 2 A
indica un requerimiento positivo para esta actividad de suprimir el MPF durante la interfase.
Esto podría ser un efecto indirecto que fomentaría la fosforilación de p34cdc2 en treonina14 y
tirosina15 por influencia de sus índices de fosforilación y defosforilación. La adición de INH al
complejo activo y purificado p34cdc2/ciclinaB (en el cual los residuos de tirosina15 y treonina14
de la p34cdc2 eran en gran parte defosforilados, pero la treonina161 era probablemente
fosforilada) resultó en la defosforilación tanto de la p34cdc2 como de la ciclinaB, y pérdida de la
histona kinasa H1 con actividad cinética similar a las p34cdc2 de defosforilación. Así la remoción
de fosfato de treonina161 de la p34cdc2 puede ser responsable de la inactivación de la kinasa
H1/actividad del MPF in vitro, quizás por estabilización del heterodímero p34cdc2/ciclinaB.
Queda por ver si este mecanismo está relacionado con la acción fisiológica normal del INH/tipo
2A de fosfatasa previniendo la activación temprana del pre-MPF.
La inhibición de la fosfatasa de tipo 1 por los péptidos inhibidores específicos de 1 y 2 no causó
la activación temprana del MPF en la fase mitótica de los extractos de huevos, pero bloqueó la
maduración cuando los inhibidores eran inyectados dentro de oocitos Xenopus.
Experimentos usados en Aspargillas, levaduras, Drosophila, todo muestra que el tipo 1 de
fosfatasa tiene dos roles adicionales en mitosis reciente. Estas funciones son bien conservadas
en células de vertebrados , pero nuevamente los blancos relevantes para la defosforilación
todavía han sido identificados.
El estado de fase M es caracterizado en parte por aparición de recientes proteínas fosforiladas
e hiperfosforiladas. El complejo p34cdc2/Ciclina B es capaz de fosforilar una gama de proteínas
in Vitro, pero el grado con el que estos sustratos son fosforilados in Vitro por la p34cdc2 y la
relevancia fisiológica para la progresión del ciclo celular no han sido establecidos en muchos
casos. Sin embargo la fosforilación de las laminas nucleares para promover el desamblamiento
nuclear y la fosforilación de Vimetina y Caldesmosina, sustratos potencialmente involucrados
en el regeneramiento del citoesqueleto, son razonablemente buenos sustratos para los roles de
la p34cdc2 en el principio de la fase M.
Mientras la fosforilación de las proteínas es claramente de fundamental importancia para la
inactivacíon de la fase M, las proteínas fosfatasas también tienen roles importantes, no solo en
la activación del complejo pre-MPF, sino que además en remover la fosforilación del MPFdriven. Para restaurar el estado de interfase en la finalización de la fase M, en algunos
sistemas biológicos posponen el ciclo celular y detienen el período de elongación en G2 , son
fenómenos bien documentados, pero mucha de la variación en la cantidad de tejido en la
duración del ciclo celular está prevista por la variabilidad en el largo de G1.
Una aproximación tomada por algunos investigadores ha sido reconstituir in Vitro los
componentes requeridos para la iniciación de la replicación de DNA, pero la relevancia de esta
aproximación para los puntos obligatorios de G1 todavía debe ser establecida. Una posibilidad
interesante sugerida inicialmente por analogía con el sistema de levaduras, es que la p34cdc2 es
requerida para el proceso obligatorio de G1 en células animales, tan buenas como para el
comienzo de la fase M. Investigaciones sobre estos aspectos del control del ciclo celular animal
es complicada por la abundancia de p34cdc2 referentes a proteínas presentes en especies
eucariotas superiores.
Todavía menos entendida son las relaciones entre las células es crecimiento y el control del
ciclo celular, y los caminos con que los controles negativos termina con los actos de
proliferación para bloquear el nacimiento de células en crecimiento y la progresión del ciclo
celular.
Estrategias bioquímicas, notables para la purificación y caracterización del MPF, llevan
adelante mejores avances en el campo del control del ciclo celular, pero la contribución de
aproximación genética son siempre de gran importancia, particularmente para establecer el
significado funcional del producto del gen.
Las funciones del gen animal requeridas para la progresión del ciclo celular pueden ser
identificadas correspondiendo a la condición mínima de líneas de célula animal defectuosa en
cada función.
Una aproximación alternativa ha sido identificada y aislada de genes animales en la base de su
capacidad para complementar levaduras mutantes defectuosas en funciones particulares del
ciclo celular. Muchas de las dificultades experimentales asociadas con los sistemas de células
mamíferas son evitadas.
La combinación de estas estrategias genéticas con aproximaciones bioquímicas y fisiológicas
son principales para una unificación panorámica de los caminos en los que los ciclos de la
célula animal son controlados.