capítulo 3 - Biblioteca Virtual

CAPÍTULO 3
Modelo fisicoquímico de los medios de cultivo.
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(1) INTRODUCCIÓN
La producción de algas microscópica se realiza principalmente en medios acuosos, desde ese medio
líquido las algas obtienen todos los nutrientes que necesitan para crecer, incluyendo las fuentes de
carbono, nitrógeno, fósforo, minerales, etc. (Watanabe, M. M., 2005; Pulz, O., 2001). Dos medios de
cultivo muy comunes en la producción de microalgas son BG-11 y BBM, cuyos componentes se
detallan en la Taba1.1.
Tabla 1.1: Fórmula de los medios BBM y BG-11. Concentraciones expresadas en molalidades
[mol / Kg de agua]
Componentes *
BBM
BG-11
Fórmula Molecular
Nitrato de sodio
2.94 10-03
1.77 10-02 NaNO3
Cloruro de sodio
4.28 10-04
NaCl
Fosfato dipotásico
4.31 10-04
2.30 10-04 K2HPO4
Fosfato monopotásico
1.29 10-03
KH2PO4
Sulfato de magnesio heptahidratado
3.04 10-04
3.04 10-04 MgSO4·7H2O
Cloruro de calcio dihidratado.
1.70 10-04
2.45 10-04 CaCl2·2H2O
Ácido cítrico.
3.12 10-05 C6H8O7
-04
EDTA.
1.71 10
H4C10H12N2O8
EDTA disódico dihidratado
2.69 10-06 Na2H2C10H12N2O8·2H2O
Hidróxido de potasio
5.53 10-04
KOH
Carbonato de sodio
1.89 10-04 Na2CO3
Ácido bórico.
1.85 10-04
4.63 10-05 H3BO3
-06
Cloruro de magnesio tetrahidratado
7.28 10
9.14 10-06 MnCl2·4H2O
-05
Sulfato de cinc
3.07 10
7.65 10-07 ZnSO4·7H2O
-06
Trióxido de Molibdeno
4.93 10
MoO3
Molibdato de sodio dihidratado
1.61 10-06 Na2MoO4
Sulfato de cobre pentahidratado
6.29 10-06
3.20 10-07 CuSO4·5H2O
-06
Nitrato de cobalto hexahidratado
1.68 10
1.72 10-07 Co(NO3)2·6H2O
-05
Sulfato ferroso heptahidratado
1.79 10
FeSO4·7H2O
Citrato férrico
2.46 10-05 (C6H5O7)H0,47Fe0,84
*(Atlas, R. M. 2005)
Respecto a las funciones que cada sal cumple en el medio de cultivo, pode podemos hacer la
siguiente descripción (Sanchez, C.A., 2007; Allen V. y col; 2007; Sunda, W. G., 2005; Borchardt, M.
A., 1996):

NaNO3: en ambos medios el NO3-es la fuente de nitrógeno, su concentración en BG-11 es 6
veces superior a la de BBM. Debido a la concentración en la cual se encuentra, hace un aporte
importante a la fuerza iónica del medio. En este compuesto, el estado de oxidación del nitrógeno
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es N5+, por lo cual durante su asimilación e incorporación como nitrógeno orgánicos debe ser
reducido hasta su estado N3-.

NaCl: su incorporación en los medios sirve para la regulación de la presión osmótica y la
fuerza iónica del medio. Solo se adiciona como tal en BBM. Na+ y Cl- son contra-iones de otros
componentes en ambos medios.

K2HPO4 y KH2PO4:son la fuente de fósforo. En BBM la concentración total de fósforo es 7,5
veces mayor respecto a la de BG-11. Debido al comportamiento acido-base en la solución, actúa
como buffer en el medio. Además, son fuente de potasio, el cual participa en muchas funciones
biológicas.

MgSO4·7H2O y CaCl2·2H2O: fuente de Ca2+ y Mg2+, dos minerales de mayor requerimiento
de las algas. Forman parte de la estructura de numerosas proteínas, pigmentos y otros
componentes celulares. Además, el SO42-utilizado como contra ion del magnesio es la fuente
principal de azufre.

C6H8O7: el ácido cítrico sólo está presente en el medio BG-11, es un agente acomplejante de
iones como Fe3+, Ca2+ y Mg2+. Su presencia aumenta la biodisponibilidad de estos minerales. En
solución el ácido cítrico participa en equilibrios acido-base influyendo en el pH del medio.

EDTA: se adicionan a los medios de cultivo para aumentar la biodisponibilidad de iones
como Cu2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Ca2+, Mg2+. En solución acuosa participa en equilibrios
acido-base. La utilización de EDTA o su versión de sal sódica produce una alteración en el pH
final del medio.

Co(NO3)2·6H2O, CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O y MnCl2·4H2O: son fuente de Co2+, Cu2+, Zn2+
y Mn2+, elementos que actúan como coenzimas o unidos a factores de transcripción, son
requeridos en muy bajas concentraciones.

Na2MoO4, MoO3:Es cofactor de numerosas enzimas; entre ellas la nitrato reductasa, la cual
cumple una función de suma importancia en la fijación de nitrógeno (Helt H.W., 2005).

FeSO4 · 7H2O y (C6H5O7)H0,46Fe0,84: son fuente de hierro, en ambos medios el hierro está en
diferentes estados de oxidación: como Fe3+ en BG-11 y como Fe2+ en BBM. Es cofactor de
numerosas enzimas y factores de transcripción.

KOH y Na2CO3: Aportan alcalinidad al medio elevando el pH; son también fuente de K+ y
Na+.

CO2: aunque no esté detallado explícitamente en la composición de los medios BBM y BG-
11, el CO2 atmosférico es la fuente de carbono en el cultivo autotrófico de algas. Su principal
reservorio es el aire en contacto con la fase líquida y su concentración en el medio está gobernada
por la ley de Henry. Participa en equilibrios acido-base y tiene una importante influencia sobre el
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pH del medio. Aunque el BG-11 tenga entre sus sales Na2CO3, la cantidad de C que aporta como
carbonato solo permitiría una concentración final de biomasa igual 40 mg L-1 (considerando que el
C representa aprox. el 50% del peso de la biomasa deshidratada) (Chisti, 2007).
Excepto el CO2, todos estos elementos se agregan a la fase acuosa en forma de sales. Como puede
verse, los medios BG11 y BBM tienen algunos ingredientes en común y algunos que son diferentes.
Sin embargo, muchas de las sales que son distintas aportan un mismo elemento al medio o tienen la
misma función.
Una vez disueltas las sales en la fase acuosa, las especies químicas de cada una de las sales
participan en reacciones acido-base y/o de formación de complejos hasta llegar al estado final de
equilibrio. Aunque el estado de equilibrio depende del tipo y cantidad de sales agregadas
inicialmente, en el estado final las especies pierden su identidad, llegando a una concentración final
en solución, la cual depende de los equilibrios presentes en el medio. En el estado de equilibrio, la
concentración final de las especies en solución es la que da al medio sus características
fisicoquímicas, como pH, fuerza iónica (I) y presión osmótica (PO). Luego, el crecimiento de las
microalgas dependerá de estas características mencionadas.
Para fines prácticos definiremos como fórmula del medio a la cantidad de cada una de las sales que
se agregan a la fase líquida para generar el medio de cultivo, mientras que por composición haremos
referencia a la concentración de cada una de las especies químicas presentes en el medio una vez
disueltas las sales. Así, la composición del medio depende de la fórmula y, mientras esta se
mantenga sin cambios, la composición final del medio preparado será la misma. Sin embargo, una
misma composición final puede alcanzarse a través de diferentes fórmulas.
Para determinar la concentración final de cada elemento en el medio de cultivo, además de la
fórmula original, es necesario considerar todos los equilibrios que se producen en la fase acuosa
entre las especies presentes en el medio. Aunque no está explícito en la fórmula, la concentración de
CO2 en la fase gaseosa, y todos los equilibrios que se produzcan entre las especies químicas del
carbono en la fase acuosa, también deberán ser tenidos en cuenta para caracterizar la composición
del medio.
Al comparar el crecimiento celular en dos medios debe considerarse que hay muchos factores que
pueden ser diferentes entre ambos, y no será sólo uno el responsable de las diferencias observadas.
Incluso al comparar el efecto de un único componente en un mismo medio de cultivo, debe
asegurarse que el resto de sus características fisicoquímicas permanezcan invariables. Por ejemplo, si
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se desea evaluar el efecto de aumentar la concentración de CO2 en la fase gaseosa en contacto con el
medio líquido, una consecuencia directa es la disminución del pH de la fase acuosa. Asimismo, si se
adiciona una base como NaOH para regular el pH, esto resultará en un aumento de la I y la PO en la
solución.
En esta sección se desarrollará un modelo fisicoquímico para el modelado del medio de cultivo con
el objetivo de construir un simulador que sirva para el diseño de los medios, asegurando que el
mismo tenga las características finales deseadas, tales como pH, fuerza iónica, presión osmótica.
Este simulador permite no sólo predecir de qué forma evolucionaran las características
fisicoquímicas de un determinado medio ante un eventual cambio en su fórmula original, sino que
además permite diseñar sistemáticamente los medios de cultivo, modificando a priori la fórmula
original según las características finales que se estén buscando. Una aplicación adicional que resulta
particularmente atractiva en la producción a escala, es que permite incorporar en la fórmula del
medio de cultivo las características de los recursos hídricos disponibles, y adicionar en forma de
sales, sólo los nutrientes que hagan falta para lograr la composición final deseada, evitando la
necesidad de pasos previos de purificación y adecuación del agua desde su fuente original, como por
ejemplo destilación, remoción de durezas o la utilización de resinas de intercambio iónicos.
En esta sección primero se define el modelo termodinámico del medio de cultivo. Luego, debido a la
importancia del CO2 como sustrato y a su participación en equilibrios ácido-base, se calculan los
parámetros incluidos en la regresión de la constante de disolución del CO2 en el medio líquido con la
temperatura. Posteriormente se modela y simula el medio BBM utilizando esta herramienta,
analizándose el efecto que tiene la modificación de la fórmula original sobre la composición final y
las características fisicoquímicas del medio. Por último se modificará el medio BBM remplazando la
fuente original de nitrógeno inorgánico por urea.
(2) DETERMINACIÓN DE LA CONSTATE DE HENRY PARA EL CO2.
El dióxido de carbono inorgánico es la única fuente de carbono utilizada por la enzima RubisCO en
la fijación de CO2 (Devgoswami, C.R. y col., 2011; Cho, S. y col., 2011; Lam, M.K. y col., 2013).
El principal reservorio de CO2 durante el cultivo es la fase gaseosa en contacto con el medio líquido.
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Una vez disuelto, el dióxido de carbono participa en los equilibrios ácido-base descriptos en las
Ecuaciones 2.1 a 2.4.
CO2 g   CO2 aq 
K1 
CO2 ac   H 2O  HCO3  H 
K2 
K3 
HCO3  CO32  H 
1
H Henry ,CO2
aH  aHCO
3
aCO2 aH 2O
aH  aCO
3
aHCO
3
Kw 
H 2O  HO  H 
aHO aH 
aH 2 O



aCO2

pCO2
 CO mCO
2
pCO2
aH  aHCO
3
aCO2
 H  CO


3
 HCO

3
(2.1)
2

 H  HCO


3
 CO
2


mH  mHCO
3
mCO2
mH  mCO
3
mHCO
(2.2)
(2.3)
3
  HO  H  mHO mH 
(2.4)
en donde: ai corresponde a la actividad del la especie i , mi es la concentración molal de la especie
i y  i es el coeficiente de actividad para la especie i . Para los solutos el estado de referencia es una
solución diluida ideal. En ese estado de referencia el estado tipo corresponde a la solución ideal de
molalidad uno en el solvente. Por otro lado, para el solvente el estado de referencia es el solvente
puro.
La molalidad total de carbono inorgánico en la fase acuosa puede obtenerse sumando las
concentraciones de cada una de las especies presentes en solución, según:
mCT  mCO2l   mHCO  mCO2
3
(2.5)
3
Las constantes de equilibrio en las Ecuaciones 2.1 a 2.4 se obtienen refiriendo el potencial químico
del solvente al potencial químico del agua pura a la temperatura y presión de la solución. Para los
solutos, el potencial químico se refiere a una solución ideal de molalidad uno, a la misma presión y
temperatura de la solución. Estas constantes pueden ser relacionadas con la temperatura en grados
Kelvin a partir de la Ecuación 2.6.
pKi   log10 Ki 
A1i 
 A2i   A3i  T
T
 i  1,2,3,w
(2.6)
Los parámetros A1i  , A2i  y A3i  para i  2,3,w fueron obtenidos de Harned & Qwen (Harned y col.,
1943).
Para el caso de la constante K1  1 H CO2 en la Ecuación 2.1, no fue posible encontrar en bibliografía
datos termodinámicos que permitan hacer una regresión de su valor con la temperatura.
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Esta constante representa el equilibrio entre CO2 en fase gas y CO2, como tal, en la fase liquida. Esta
constante es la misma en los medios que tienen otros componentes, con tal que el solvente sea agua y
se mantengan los estados de referencia; incluso frente a modificaciones del pH. De este modo, para
lograr modelar el comportamiento fisicoquímico de los medios de cultivo utilizados para la
propagación de algas microscópicas es necesario determinar los parámetros A11 , A21 y A31 incluidos
en la correlación de la constante K1 con la temperatura.
Para obtener dichos parámetros haremos uso de los datos de solubilidad del CO2 en agua pura, a
temperaturas entre 273,15oK y 303,15oK (Tabla 2.1), publicados por John A. Dean (Dean, J. A.
1999):
TABLA 2.1: Datos experimentales para la concentración total de CO2en
agua pura en temperaturas incluidas entre 20 y 30oC
T
pH2O
pCO2 = (760.0-pH2O)
mCT [moles de CO2 en un
[oK]
[mmHg]
[mmHg]
Kg de H2O]
293,15
17.535
742.465
0.03836
294,15
18.650
741.350
0.03727
295,15
19.827
740.173
0.03614
296,15
21.068
738.932
0.03500
297,15
22.387
737.613
0.03393
298,15
23.756
736.244
0.03293
299,15
25.209
734.791
0.03195
300,15
26.739
733.261
0.03105
301,15
28.349
731.651
0.03016
302,15
30.043
729.957
0.02936
303,15
31.824
728.176
0.02857
Figura 2.1: Esquema del sistema descripto por John A. Dean para la determinación de la solubilidad del dióxido de
carbono en agua pura.
El experimento, según lo describe el autor, consiste en determinar el contenido total de carbono
inorgánico mCT en un sistema líquido-gas una vez alcanzado el equilibrio, para diferentes
temperaturas, manteniendo la presión constante. En la Figura 2.1 se representa esquemáticamente el
sistema en equilibrio.
70
Para construir un modelo fisicoquímico del sistema bifásico haremos las siguientes definiciones
respecto al mismo:
1. La concentración de H2CO3 no ionizado en la fase acuosa es despreciable (Robinson R. A., 1950).
2. El CO2 disuelto no ionizado tiene un comportamiento ideal, respondiendo a la ley de Henry y su
coeficiente de actividad es igual a 1.
3. Los gases a estas temperaturas y presión atmosférica tienen un comportamiento ideal (Pitzer K.
S., 1961).
4. La solución debe ser eléctricamente neutra, es decir:
m z
i i
0
(2.7)
y, para este caso particular:
mH   mOH   mHCO  2 mCO2
3
(2.8)
3
5. La suma de las molalidades de las especies presentes en la solución deberá ser igual a la
concentración total de carbono inorgánico mCT reportada en la Tabla 2.1.
mCT  mCO2  mHCO  mCO2
3
(2.9)
3
6. Los coeficientes de actividad de los iones en solución pueden ser estimados empleando la
ecuación de Debye-Hückel (Alberty R.A., 2003):
log10  i  
A zi2 I
(2.10)
1B I
En la Ecuación 2.9, B  1.6  lt mol 
12
 1.6 1000.0 g solvent mol  , A toma los valores de la
12
Tabla 2.3 de acuerdo a la temperatura, y la fuerza iónica I puede ser estimada según:
I
1
1
2
2
2
c
z

m z 2  mH  zH2   mOH  zOH
z 2  mCO2 zCO
 m
2


i
i
HCO3 HCO3
i
i i i
3
3
2
2
(2.11)
TABLA 2.3: valores para la constante A
T  C 
A 1000.0 g solvente mol 
12
20
25
30
0.5064
0.5106
0.5151
Según la regla de las fases de Gibbs (Kondepudi, D. y col., 1998) se puede caracterizar el sistema
conociendo un número v de propiedades intensivas independientemente variables, obtenido a partir
de
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v C2F
(2.12)
donde F es el número de fases (hay 2: la fase líquida y la fase gaseosa) y C es el número de
componentes menos el de las reacciones químicas estequiométricamente independientes existente en
las fases. Según las definiciones 4 y 5; a que el comportamiento del solvente es considerado ideal; y,
a que en la fase gaseosa la suma de las presiones parciales de cada componente debe ser igual a la
presión en el sistema; el número de componentes independientes en la ecuación 12 se reduce a 3. De
este modo sólo se necesita conocer las variables T, P y la concentración de un único componente
para caracterizar al sistema.
Remplazando los equilibrios 2.1 al 2.4 en las Ecuaciones 2.8 y 2.9, luego de algunas manipulaciones
algebraicas, obtenemos que:
mH  
Kw
mH   H   OH 
 K 2 K1
mCT  K1 pCO2  K 2 K1
pCO2
mH   H   HCO
 2K3 K 2 K1
3
pCO2
mH   H   HCO
 K 3 K 2 K1
3
pCO2
(2.13)
m  H2   CO2
2
H
3
pCO2
(2.14)
m  H2   CO2
2
H
3
Reordenando la Ecuación 2.14 llegamos a:

pCO2
pCO
K1  mCT  pCO2  K 2
 K3 K2 2 2 2

mH   H   HCO
mH   H   CO2
3
3





1
(2.15)
Remplazando la expresión para el valor de K 1 (Ecuación 2.15) en la Ecuación 2.13, el problema se
reduce a una ecuación con una incógnita (Anexo).
La solución al problema podría simplemente resolverse a través de un mecanismo iterativo,
asumiendo un comportamiento ideal para cada una de las especies (esto es.  i  1 para todos los
componentes del sistema). De este modo es posible obtener mH y, a partir de éste, el valor de la

concentración mi de las demás especies, a través de las Ecuaciones 2.1 a 2.4. Con el valor provisorio
para la concentración de cada una de las especies es posible calcular un valor provisorio para I . Con
este valor de I es posible calcular todos los coeficientes de actividad  i . Sucesivamente recalcular
mH  , la concentración de las demás especies, la nueva I y los nuevos
 i ; hasta converger en un
valor estable para mH . Sin embargo, en lugar de esto, utilizaremos un método estocástico de

optimización: el Algoritmo Genético (Rezende, M. C. y col., 2008; Mitchell M., 1998; Deb, K.,
2001). Los fundamentos de la metodología de búsqueda a través de la cual este algoritmo encuentra
la solución fueron oportunamente descriptas en el Capítulo 2.
72
Figura 2.2:Pseudo-código de cálculo desarrollado para la obtención del valor de la constante K1 para el CO2 en agua
pura. En el recuadro gris claro se esquematiza el mecanismo de cálculo del programa de optimización Algoritmo
Genético. En el recuadro gris oscuro el esquema de cálculo para esta aplicación particular. En el esquema de cálculo
existe una sola variable de optimización: el valor de mH+. Las parámetros de cálculo son: temperatura, concentración total
de carbono mCT (Tabla 2.1) y las constantes K2, K3 y Kw de equilibrio. Por otro lado, K1, mCO2, mHCO3, mCO3, mOH, I y los
diferentes  i son variables dependientes calculadas a través de las ecuaciones detalladas en el esquema. Para establecer
la aptitud de cada uno de los sucesivos valores provisorios de mH+ de ser solución al sistema de ecuaciones, se define
como función error err(x) a la condición de electro-neutralidad que debe cumplir el sistema.
La ventaja de este método es que no necesita manipular las Ecuaciones 2.13 y 2.14 para hallar el
valor de mH . Además, como no necesita iniciar el cálculo con valores provisorios, evita los riesgos

que tienen otros métodos numéricos de caer en mínimos locales. Estas dos ventajas no constituyen el
único argumento para esta elección, el motivo más importante es que partiendo de este sistema de
ecuaciones es posible adicionar nuevos componentes a la solución y construir, en forma sencilla, el
sistema de ecuaciones que modela el comportamiento termodinámico de los medios de cultivo como
el BBM o el BG-11. Además, es posible intercambiar en forma simple variables y parámetros, con
mínima o ninguna manipulación del sistema de ecuaciones haciendo al método de cálculo versátil y
sencillo de implementar.
73
2.1 Simulación del sistema agua-CO2 para la determinación de la constante K 1 .
En la Figura 2.2 puede verse el esquema de cálculo utilizado para la determinación de la constante
K 1 en cada una de las temperaturas dentro del rango 293,15 a 303,15oK. En este caso los individuos
portan un solo gen: el valor de mH+, que es la única variable de ajuste. El sistema de cálculo incluye
un mecanismo de iteración para de converger en un valor constate de I.
En el esquema descripto en la Figura 2.2, el cuadro de la derecha corresponde a la parte del programa
definida por el usuario para cada aplicación particular. En la parte izquierda, se puntualiza el
esquema de computo propio del programa de optimización, sobre la cual el usuario no puede
intervenir, excepto para la definición de los parámetros genéticos (número de entrecruzamientos y
mutaciones por generación), poblacionales (número de individuos en cada generación) y
generacionales (número de generaciones que deben transcurrir hasta alcanzar el resultado final).
Mediante este mecanismos de computo se obtuvieron los valores de K1 y de la concentración de las
especies en el medio, en el rango 293,15 a 303,15oK. En la Figura 2.3(a) se grafica el valor de la
constante de solubilidad K1 para el CO2 en la fase acuosa en ese rango de temperaturas. Los
parámetros A11, A21 y A31 incluidos en la regresión de la constante K1 con la temperatura se
obtuvieron ajustando los resultados experimentales al polinomio de segundo orden (Ecuación 2.16).
El resultado de este ajuste se grafica en la Figura 2.3(b).
pK1 T  T  A11  A21T  A31 T 2
(2.16)
(b)
1.340
4,8E-5
pK1 × T
K1 [mol L-1 mmHg-1]
(a)
4,3E-5
1.290
y = -2,22E-2x2 + 2,12E+1x 3,04E+3
R² = 1,00E+0
1.240
3,8E-5
293
298
Temperatura
293
303
[oK]
298
Temperatura
303
[oK]
Figura 2.3:(a) valores obtenidos para la constante K1 en función de la temperatura. (b) Regresión de los parámetros en de
la Ecuación 2.6: A11 =3,045×103; A21 = 2,122×10-3 y A31 = -2,229×10-2, para la constante de equilibrio en la Ecuación 2.1
En la Figura 2.4 se muestran los resultados obtenidos para la concentración de las especies de
carbono en la solución para estas temperaturas. Como puede verse con el aumento de la temperatura
74
disminuye la concentración de CO2 en la fase acuosa, indicando que la disolución de CO2 en agua es
un proceso exotérmico, al igual que para la mayoría de los gases. Las reacciones en las Ecuaciones
2.2 y 2.3 son endotérmicas, por lo que el aumento en la temperatura provoca un desplazamiento de
los equilibrios químicos hacia la formación de productos. Sin embargo, para el caso de HCO3-, este
desplazamiento no compensa la reducción en la cantidad de CO2 en el medio, de este modo, a pesar
de que el equilibrio se desplaza hacia la formación de productos con el aumento de T, la
concentración de sustratos se reduce y el efecto final es una disminución en la concentración de
HCO3-. Esta disminución en la concentración de HCO3- causa un leve aumento en el pH de medio. A
pesar de la reducción en la concentración de HCO3-, la concentración de CO32- en el medio aumenta,
por efecto combinado del aumento en el valor de K3 y el pH.
(b)
(a)
0,04
1,3E-4
0,03
1,2E-4
0,02
1,1E-4
293
298
Temperatura
293
303
[oK]
298
303
Temperatura
[oK]
(c)
5,6E-11
(d)
3,94
5,2E-11
4,8E-11
3,92
4,4E-11
3,90
4,0E-11
293
298
Temperatura
293
303
[oK]
298
Temperatura
303
[oK]
Figura 2.4: Concentración de cada una de las especies presentes en el sistema en función de la temperatura [oK]. (a)
Concentración en [moles L-1] de CO2(aq). (b) Concentración en [moles L-1] de HCO3- (c) concentración en [moles L-1] de
CO32-. (d) pH de la solución.
Conociendo el valor de la constante K1 es posible predecir el comportamiento de la solución frente a
los cambios que se produzcan en la composición de cualquiera de las fases. Como fue dicho
anteriormente, el principal motivo de seleccionar este método de resolución es que permite incluir
nuevos parámetros o variables de ajuste en forma muy simple sin la necesidad de manipular el
75
sistema de ecuaciones. En la Figura 2.5 se muestran a modo de ejemplos dos esquemas de cálculo
para evaluar el comportamiento de la solución. En el primer caso se utiliza el AG para determinar las
propiedades de una solución acuosa en contacto con una atmosfera gaseosa con diferentes presiones
parciales de CO2, En el segundo, se utiliza para calcular la cantidad de base que es necesario
adicionar a la solución en equilibrio con diferentes pCO2, si se quiere mantener el pH constante.
(a)
(b)
Figura 2.5: Esquemas de cálculo para dos aplicaciones del simulador. (a) Variación de la composición de la solución
frente a diferentes presiones parciales de CO2 en la atmósfera gaseosa, a una temperatura constante de 298,15 oK. (b)
Determinación de la cantidad de NaOH que es necesario adicionar a la solución para mantener el pH de la misma
constante, cuando se modifica la presión parcial de CO2 en la atmósfera gaseosa. Cada uno de los esquemas es una
subrutina del programa principal de optimización (AG), cuyo diagrama de cálculo fue detallado en el recuadro gris claro,
en la Figura 3.
A partir de las Figuras 2.5(a) y 2.5(b) puede verse la facilidad con la cual se incorporan nuevos
parámetros y variables dependientes a medida que se agregan componentes al sistema. En las Figuras
2.6(a) y 2.6(b) se observa el resultado de la simulación computacional. Como puede verse en la
Figura 2.6(a) el pH de la solución disminuye marcadamente a cuando se incrementa la presión
parcial de CO2 en la fase gaseosa. Esta disminución es muy pronunciada dentro del rango 0 a
100mmHg; y, a partir de este valor, la disminución del pH es mucho menor, hasta el punto de
mantenerse casi constante cuando la presión de CO2 es mayor a 400mmHg. En la Figura 2.6(b) se
76
puede ver como varía la concentración de NaOH en la solución para lograr un el pH final igual a 6 o
7, en función de la presión parcial de CO2 en la fase gaseosa. Como puede verse, una diferencia de
una unidad en el valor del pH implica una gran diferencia en la concentración necesaria de base.
8
2,5E-1
(a)
pH
7
2,0E-1
6
1,5E-1
5
1,0E-1
4
5,0E-2
3
0,0E+0
0
200
400
600
800
(b)
NaOH
pH 7
pH 6
0
200
pCO2 [mmHg]
400
600
800
pCO2 [mmHg]
Figura 2.6: (a) Variación del pH de la solución frente a diferentes presiones parciales de CO2 en la atmósfera gaseosa, a
una temperatura constante igual a 298,15oK. (b) Concentración en [moles L-1] de NaOH en la solución para un pH final
constante en función de la presión parcial de CO2 en la atmósfera gaseosa.
(3) MODELADO Y SIMULACIÓN DEL MEDIO BBM
El medio de cultivo BBM (Bold's Basal Medium) es un medio extensamente citado en la literatura
(Oncel, S.S. y col,2011; Salama, E.S. y col,2013; Bertoldi, F.C. y col, 2009), es una solución acuosa
de sales, de composición definida (Tabla 1.1). Para modelar el comportamiento fisicoquímico del
BBM se continuará haciendo uso de las hipótesis establecidas en el apartado anterior y que fueran
utilizadas para la determinación de los parámetros incluidos en la regresión de la constante K1 de
equilibrio del CO2 en agua pura. Al conjunto de equilibrios químicos presentes en el sistema CO2agua se incorporan las restante reacciones acido-base y de formación de complejos que se producen
por la adición de los demás compuestos presentes en el medio BBM.
Los equilibrios que se plantean en este medio y sus respectivas constantes de equilibrio son:
 Para la ionización del agua
Kw 
H 2O  HO  H 
 Para los equilibrios acido base de las especies de carbonato
77
aHO aH 
aH 2 O
(3.1)
aCO2
CO2 g   CO2 aq 
K1CO2 
CO2l   H 2O  HCO3  H 
2
KCO

2
HCO3  CO32  H 
K 3HCO3 
(3.2)
pCO2
aHCO aH 
(3.3)
3
aCO2 aH 2O
aCO2 aH 

3
(3.4)
a HCO
3
 Para los equilibrios de las especies de fosfato.
H 3 PO4  H 2 PO4  H 
K aH3 PO4 
H 2 PO4  HPO4  H 
K aH 2 PO4 
aH
aH 

2 PO4
a H3 PO4
a HPO aH 

4
4
a PO aH 

K aHPO4 
HPO42  PO43  H 
(3.6)
a H PO
2
(3.5)
4
(3.7)
a HPO
4
 Para la ionización del acido bórico
H 3 BO3  H 2 BO3  H 
K aH3 BO3 
aH
aH 

2 BO3
a H3 BO3
(3.8)
 Para los equilibrios acido base del EDTA
EDTA  H 4   EDTA  H 3   H 
Ed
K a1

EDTA  H 3   EDTA  H 2 
Ed
K a2



2
 H
a EDTA H

3
aH 

a EDTA H4 
a EDTA H

a EDTA H

EDTA  H 2 
2
 EDTA  H   H 
3
Ed
K a3

3
 EDTA4   H 
Ed
K a4

3

 
a EDTA H
2

 
(3.11)
2
a EDTA4 aH 
a EDTA H
(3.10)

a EDTA H 3 aH 

EDTA  H 
aH 
2
2
(3.9)
(3.12)
3
 Para la formación de complejos entre EDTA y metales
EDTA4   Ca 2  EDTA  Ca 
2
KCEd Ca 
a EDTA4 aCa2

EDTA4   Mg 2  EDTA  Mg 
2
KCEd  Mg 

a EDTA4 aMg 2
a EDTA Mg 2

EDTA4   Fe2  EDTA  Fe 
2
KCEd  Fe 
(3.14)

a EDTA4 aFe2
a EDTA Fe 2

78
(3.13)
a EDTA Ca 2

(3.15)
EDTA4   Zn2  EDTA  Zn 
2
KCEDTA Zn 
a EDTA4 aZn2

EDTA4   Mn2  EDTA  Mn 
2
KCEd  Mn 

a EDTA4 aMn2
2
2

KCEd Cu 
a EDTA4 aCu 2
KCEd Co 
a EDTA4 aCo2
(3.18)
a EDTA Cu 2

EDTA4   Co2  EDTA  Co 
(3.17)
a EDTA Mn 2

EDTA4   Cu 2  EDTA  Cu 
(3.16)
a EDTA Zn 2

(3.19)
a EDTA Co 2


El algoritmo de resolución para el sistema de ecuaciones incluidas en el modelado y simulación del
medio BBM, y el cálculo de la concentración de las especies en el medio de cultivo empleando el
AG, puede llevarse a cabo a través de las siguientes etapas:
(1) Asociar las variables de optimización con los genes de cada individuo.
m
H
;mEd 4

(1')
(2) Definir los valores de la temperatura, la presión y la concentración de cada una de las sales que
intervienen en la formulación del medio.
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
T ; pCO2 ;mNaNO

;mNaCl
;mK0 2 HPO4 ;mKH
;mNaNO
; mCo
 NO3 2 6 H 2 O ;mKOH ;mEDTA ;mH 3 BO3 ;mMgSO4 7 H2 O ;mCaCl2 2H 2 O ;
3
2 PO4
3

 0

0
0
0
0
mMnCl2 4 H 2O ;mZnSO4 7 H 2O ;mCo NO3 2 6 H 2O ;mFeSO4 7 H 2O ;mCuSO4 5H 2O

(2')
(3) Calcular los valores de las constantes de equilibrio y de la concentración de cada una de las especies en
solución:
pKiT 
A1i
 A2i  A3i T
T
(3')
0
0
0
0
T
0
mNa  mNaNO

 mNaCl
; mTP  mK0 2 HPO4  mKH
; mNO  m0NaNO3  2 mCo
 NO3 2 6 H 2 O ; mZn  mZnSO4 7 H 2 O
3
2 PO4
3


T
0
T
0
T
0
T
0
T
0
T
0
mMg


m
;
m

m
;
m

m
;
m

m
;
m

m
;
m

m
MgSO

7
H
O
Ca
CaCl

2
H
O
EDTA
EDTA
H
BO
H
BO
Mn
MnCl

4
H
O
MoO
MoO


4
2
2
2
3
3
3
3
2
2
3
3
 T

0
T
0
T
0
0
0
0
T
0
mCo  mCo  NO3 2 6 H 2 O ; mFe  mFeSO4 7 H 2 O ; mCu  mCuSO4 5 H 2 O ; mK   2mK2 HPO4  mKH 2 PO4  mKOH ; mH 3 BO3  mH 3 BO3 


0
0
0
0
0
0
0
mCl   mNaCl  2 mCaCl2 2 H 2 O  2 mMnCl2 4 H 2 O ; mSO42  mMgSO4 7 H2 O  mZnSO4 7 H 2 O  mCuSO4 5 H 2 O  mFeSO4 7 H 2 O



(4')
(4) Calcular el primer valor de la fuerza iónica I para iniciar la iteración con una primera aproximación
para los valores de los coeficientes de actividad de las especies en el medio.
I

1
m   16mEd 4  mNa  mNO  mCl   mK   4mSO2
3
4
2 H

(5) Calcular las demás variables dependientes incluidas en el sistema de ecuaciones.
79
(5')
log10  i  
A zi2
I
(6')
1B I
m CO2  K1 pCO2
(7')
m CO2
mHCO  K a1
1
(8')
mH   H   HCO
3
3
mHCO  HCO
mCO2  K a2
3
3
(9')
mH   H   CO2
3
3
Kw
1
mH   H   OH 
mOH  
mHPO32 
(10')
mPT
2

  HPO2
mH2 
mH   H   HPO42 K aHPO4  HPO42
4
1
 H PO



mH   H   PO3
K aH3 PO4 K aH 2 PO4  H3 PO4
K a 2 4  H2 PO4
4

2
H
mH2  m HPO2  H2   HPO2
mH3 PO4 
4
K
H 3 PO4
a
K
4
3
(11')
(12')
 H PO
H 2 PO4
a




4

K aHPO4 m HPO2  HPO2
mPO 
4
mH PO 
2
4
mEdH 3 
4
mH  m Ed 4  H  
K
Ed 4
 EdH
K

4
2
EdH 3
a
(14')
 H PO
EdH
a
(15')
3
 H2 

Ed 4 
(16')
 EdH
3
2
2
mH  mEdH2  H   EdH2
2
K
3
2
(17')
 EdH
EdH3
a

3
mH  mEdH  H   EdH
mH 3 BO3 

2 BO3
4

K aH 2 PO4
Ka
mEdH 
mH

4
mH  m HPO2  H   HPO2
EdH22
2
mEdH4 

mH2  m Ed 4
mEdH2 
(13')
4
 H  PO
mH 
4
3
K aEdH4
(18')
3
 EdH
4
mHT 3 BO3
(19')

K H 3 BO3  H3 BO3 
1 a


mH   H   H BO 
2
3 

 mHT 3 BO3  mH3 BO3
KCMEd mEd 4 mMT
mMEd 2 
(20')
 Ed  M
 MEd
4
2
2
(21')

 4   2 
MEd
 1+KC mEd 4 Ed M 
 MEd 2 

80
mM 2 
 MEd
mMEd 2
K
MEd
C
2
M  Ca,Mg,Fe,Zn,Co,Cu,Mn
mEd 4  Ed 4  M 2
(22')
(6) Recalcular el valor de la fuerza iónica IN incluyendo el valor de las concentraciones de todas las
especies en el medio de cultivo. Comparar con el nuevo valor IN de la fuerza iónica con el valor I calculado
anteriormente anterior. Si no son iguales, reemplazar el valor anterior I por el nuevo calculado IN y
reiniciar el cálculo desde el punto 5
mH   mOH   mHCO  4mCO2  mNa  mNO  mCl   mK   4mSO 2

3
3
3
4


m

4m

9m

4m

4m

m

4m
H 2 PO4
HPO42
PO43
Mg 2
Ca 2
EdH 3
EdH 22
1
IN  
2  9mEdH 3  16mEd 4  4mMgEd 2  4mCaEd 2  4mFeEd 2  4mZnEd 2  4mCuEd 2

  4mCoEd 2  4mMnEd 2  mH BO  4 mMn2  4mZn2  4mCu 2  4mCo2  4mFe2
2
3









(23')
(7) Calcular el valor de la función error a partir del cual el AG asignará a cada individuo una aptitud de ser
solución al sistema de ecuaciones.
Err1 
m z
(24')
i i
T
Err2  mEDTA
 mEdH   mEdH 2  mEdH 3  mEd 4  mMgEd 2  mCaEd 2  mFeEd 2  mZnEd 2  mCuEd 2  mCoEd 2  mMnEd 2
(25')
error  Err1  Err2
(26')
3
2
Una vez definido el valor de las concentraciones de cada una de las sales en la fórmula del medio y
teniendo en cuenta la cantidad de reacciones independientes del sistema, existen solo 3 variables
independientes (p.ej. T, P y mH+). A pesar de que todas las demás variables dependientes podrían ser
calculadas a partir de éstas, se incorporó una variables de optimización extra: mEd 4 . La
incorporación de una variable adicional se realizó con el objetivo de evitar la necesidad de intervenir
algebraicamente el conjunto ecuaciones en el modelo. Esta decisión, requiere que se adicione una
nueva restricción a través de una segunda función error (Ecuación 25') para limitar la solución a
aquella compatible con que se cumpla a condición fijada.
A partir del esquema de cálculo expuesto entre las Ecuaciones 1' a 26', es posible determinar las
características de la composición del medio de cultivo según su fórmula original. Además, es posible
evaluar los cambios que se producirán en el medio acuoso cuando se modifiquen una o más variables
del sistema.
3.1 Modificación del medio BBM por agregado de ácido o base.
81
El pH es una de las variables de cultivo de mayor importancia en el crecimiento de microalgas. Por
diferentes motivos, para cada especie existe un valor de pH para el cual el crecimiento celular es
óptimo. Este pH óptimo depende de la especie de microorganismo (Olivieri, G. y col., 2013; Han, F.
y col., 2013). La modificación del pH del medio de cultivo puede realizarse por adición de una ácido
fuerte o una base fuerte a la fórmula original (p.ej. HCl o NaOH). Utilizando este algoritmo de
simulación es posible evaluar a priori en forma sencilla cual será la respuesta del medio frente a la
adición de HCl o NaOH.
(b) Fuerza Iónica [mol L-1]
1,5E-2
(a) pH
HCl
8,0
6,0
HCl
NaOH
(c) Presión Osmótica [mmHg]
300
NaOH
NaOH
HCl
1,0E-2
250
5,0E-3
200
4,0
2,0
BBM
-2,0E-3 -1,0E-3 3,0E-18
1,0E-3
Concentración [mol L-1]
2,0E-3
-2,0E-3
BBM
-1,0E-3 3,0E-18
1,0E-3
Concentración [mol L-1]
2,0E-3
-2,0E-3 -1,0E-3 3,0E-18
1,0E-3
BBM
Concentración [mol L-1]
2,0E-3
Figur3.1:Respuesta del medio BBM por agregado de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. (a) Variación del pH. (b)
Modificación de la fuerza iónica. (c) Cambio de la presión osmótica. El origen de coordenadas corresponde al valor en el
medio original. A la izquierda del origen corresponde al agregado de HCl, a la derecha del mismo al agregado de NaOH.
Para evaluar la respuesta del BBM frente a la adición de HCl o NaOH es necesario incorporar en el
algoritmo de simulación la presencia de estas sustancias en el medio y, para ello, se agregan dos
0
0
nuevos parámetros ( mHCl
y mNaOH
) y se modifican dos variables dependientes según las ecuaciones:
0
0
0
mNa  mNaNO
 mNaCl
 mNaOH
3
(27')
0
0
0
0
mCl   mNaCl
 2 mCaCl
 2 mMnCl
 mHCl
2 2H 2O
2 4 H 2O
(28')
Desde la Figura 3.1(c) puede verse que, como consecuencia de la adición de HCl o NaOH, se
produce el aumento de la fuerza iónica (I) y de la presión osmótica (PO) del medio de cultivo. Estas
dos variables no son para nada triviales a que ambas influyen directamente sobre el crecimiento
celular (Shah, S.M.U. y col, 2013). En este sentido, durante la búsqueda de un pH óptimo para el
crecimiento de un microorganismo, utilizando NaOH o HCl como agente modificador del pH, se
modifica además la PO y la I del medio. Luego, el cambio observado en el crecimiento celular,
corresponde a la modificación de todas estas variables, y no sólo al cambio en el pH del medio.
82
Desde las Figuras 3.1(b) y 3.1(c) puede observarse que la adición de NaOH en el medio de cultivo
produce un aumento más pronunciado en la I del medio que la adición de una cantidad equivalente
de HCl. Por otro lado, la adición de HCl resulta en un aumento más pronunciado de la PO del medio,
respecto a la adición de una cantidad equivalente de NaOH. Este comportamiento se debe a la forma
en que se producen las variaciones en la concentración de especies neutras y/o de las especies
cargadas en el medio de cultivo frente a la adición de estos agentes. Cuando el pH del medio
adquiere valores mayores se produce un aumento en la concentración de especies iónicas en el medio
de cultivo, principalmente fosfatos y carbonatos, con doble o triple carga negativa. En la
determinación de la I la concentración de cada especie está afectada por el cuadrado de su carga, lo
cual resulta en un aumento más pronunciado del valor en la fuerza iónica respecto al aumento en el
valor de la presión osmótica.
La modificación del pH del medio de cultivo produce un desplazamiento de todos los equilibrios
acido-base y de formación de complejo en la solución. En la Figura 3.1(a) puede verse que el medio
BBM se muestra más sensible a la adición de ácido que a la adición de base; es decir la adición de
una cantidad de HCl provoca una cambio en el pH de magnitud mayor que el agregado de una
cantidad equivalente de NaOH. Este fenómeno se debe a la presencia de equilibrios acido base que
actúan como buffer en el medio acuoso. Los dos sistemas buffer más importantes son los equilibrios
entre las especies H2PO4- y HPO42- del grupo fosfato, y el de las especies CO2(aq)y HCO3- del ácido
carbónico. Por otro lado, cuando el pH llega a un valor por debajo de 4, puede observarse una
disminución en la tasa de cambio del valor de pH por adición de HCl. Esta reducción se debe a la
aparición de un nuevo sistema buffer, el cual se produce entre las especies H3PO4 y H2PO4- del
grupo fosfato.
3.2 Modificaciones en el medio BBM por control correctivo del pH.
En el apartado anterior utilizamos el algoritmo de simulación para analizar la forma en que responde
el medio de cultivo frente a la adición de una cantidad determinada de álcali o ácido. Un problema
habitual es hallar la concentración de álcali o base que es necesario adicionar al medio acuoso para
lograr un pH final deseado. La respuesta a esta pregunta puede encontrarse de manera simple
alternando en el algoritmo de cálculo las variables mH+ y m0NaOH o m0HCl (según se desee aumentar o
disminuir el pH). En este sentido las concentraciones iniciales deben ser consideradas como variables
de ajuste y vincularse al conjunto de genes (soluciones tentativas) de los individuos en el Algoritmo
Genético (Ecuación 1'), mientras que la variable mH+ deberá ser calculada como una variable
dependiente (Ecuación 29'), de acuerdo al pH final deseado, el cual deberá ser definido con
anterioridad como un nuevo parámetro del sistema de ecuaciones (Ecuación 2').
83
mH  
10  pH
H
(29')

La Ecuación 29' deberá estar ubicada entre las Ecuaciones 6' y 7', en el esquema de cálculo detallado
con anterioridad.
6,0E-4
(a) Concentración de HCl [mol L-1]
4,0E-2
(b) Concentración de NaOH [mol L-1]
3,0E-2
4,0E-4
2,0E-2
2,0E-4
1,0E-2
0,0E+0
0,0E+0
4,5
5,5
6,5
6,5
7,5
pH
(c) Fuerza Iónica [mol L-1]
5,0E-2
8,5
9,5
pH
(d) Presión Osmótica [mmHg]
1000
4,0E-2
800
3,0E-2
600
2,0E-2
400
1,0E-2
200
0,0E+0
0
4,0
6,0
8,0
4,0
10,0
pH
6,0
8,0
10,0
pH
Figura 3.2:(a) Concentración [mol L-1] de HCl en la fórmula inicial en función del pH final. (b) Concentración [mol L-1]
de NaOH en la fórmula inicial en función del pH final. (c) Fuerza iónica [mol L-1] del medio de cultivo en función de pH
final deseado, modificado por agregado de NaOH o HCl. (d) Presión osmótica [mmHg] del medio de cultivo en función
de pH final deseado, modificado por agregado de NaOH o HCl.
En las Figuras 3.2(a) y 3.2(b) se grafica el valor a adicionar de cada uno de los agentes
modificadores del pH en función del pH final. En estas gráficas puede verse la cantidad de álcali
necesaria para aumentar el pH del medio, destacándose nuevamente el efecto de los sistemas buffer
en esa región de la escala de pH. A partir de los resultados expuestos en las Figuras 3.2(c) y 3.2(d)
podemos ver la consecuencia de este fenómeno en el aumento de la fuerza iónica y la presión
osmótica: ambas variables aumentan en forma casi-exponencial cuando el objetivo es modificar el
pH original del medio alcalinizándolo.
84
(b) Conc. de H2PO4- y HPO42- [mol L-1]
(a) Concentración de H3PO4 [mol L-1]
1,0E-5
(c) Concentración de PO43- [mol L-1]
1,0E-5
2,0E-3
HPO42-
5,0E-6
1,0E-3
5,0E-6
H2PO40,0E+0
0,0E+0
4,0
6,0
8,0
10,0
0,0E+0
4,0
6,0
pH
8,0
10,0
4,0
pH
6,0
8,0
10,0
pH
Figura 3.3: modificación de la concentración de las especies del grupo fosfato de acuerdo al pH del medio de cultivo. (a)
Concentración [mol L-1] de H3PO4. (b) Concentraciones [mol L-1] de H2PO4- y HPO42- (c) Concentración [mol L-1] de
PO43-.
En las Figuras 3.3(a), 3.3(b) y 3.3(c) se observa la variación en la concentración de las especies del
grupo fosfato cuando el pH final del medio de cultivo se modifica por el agregado de NaOH o HCl.
En la Figura 3(a) puede verse que la concentración de H3PO4 comienza a aumentar súbitamente
cuando el pH del medio toma un valor por debajo de 6, comenzando a actuar como agente regulador
del pH.
En las Figuras 3.4 y 3.5, respectivamente, se observa la variación de la concentración de las especies
de ácido bórico y EDTA en la solución según el pH del medio de cultivo. Para el caso del EDTA
además de los equilibrios ácido base se agregan las reacciones de formación de complejos. En las
Figuras 3.5(c) y 3.5(d) puede verse la influencia del pH sobre la formación de complejos entre el
EDTA y dos de los metales en el medio: Fe3+ y Ca2+. Para el Fe3+ (Figura 3.5(d)),
independientemente del pH, la especie predominante es la forma acompleja al EDTA. Sin embargo,
para el Ca2+ (Figura 3.5(d)), cuya constante de formación de complejos con el agente quelante es
sensiblemente menor a la de formación del complejo Fe3+-EDTA, puede verse la influencia que
ejerce el pH del medio sobre la concentración relativa de cada las especies de Ca2+. Este efecto
podría ser un fenómeno importante, ya que la biodisponibilidad del calcio acomplejado es mucho
mayor respecto a la del calcio libre (Lin, Q. y col, 2012; Fujii, M. y col, 2010).
85
(a) Concentración de H2BO3- [mol L-1]
(b) Concentración de H3BO3 [mol L-1]
2,0E-4
2,0E-4
1,0E-4
1,0E-4
0,0E+0
0,0E+0
4,00
6,00
8,00
10,00
4,0
6,0
pH
pH
8,0
10,0
Figura 3.4:.Variación de la concentración de las especies de boro según el pH del medio de cultivo. (a) Concentración
[mol L-1] de H2BO3. (b) Concentración [mol L-1] de HBO3-.
(a) Conc. de EdH22- y EdH3- [mol L-1]
(b) Concentración de Ed4- [mol L-1]
8,0E-10
1,0E-4
EdH22-
6,0E-10
4,0E-10
5,0E-5
2,0E-10
EdH30,0E+0
0,0E+0
4,0
6,0
8,0
10,0
4,0
(c) Conc. de CaEd2- [mol L-1]
2,0E-4
3,0E-5
6,0
8,0
10,0
(d) Conc. de Fe2+ y FeEd2- [mol L-1]
1,5E-4
CaEd2-
2,0E-5
1,0E-4
FeEd21,0E-5
5,0E-5
Ca2+
Fe2+
0,0E+0
0,0E+0
4,0
6,0
8,0
10,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Figura 3.5:.Variación de la concentración de las especies de EDTA según el pH del medio de cultivo. (a) Concentración
de las especies EdH3- y EdH22-. (b) Concentración de la especie Ed4-. (c) Concentración de las especies CaEd2- y Ca2+.
Constante de formación de complejo entre Ca2+ y EDTA a 298.15oK es 5.0×1010 (d) Concentración de las especies
FeEd2- y Fe2+. Constante de formación de complejo entre Ca2+ y EDTA a 298.15oK es 2.1×1014 (Hart, J.,2005).
Respecto a las especies derivadas del CO2, es posible observar que la concentración de CO2(aq) en el
medio de cultivo se mantiene constante en todo el rango de pH evaluado (Figura 3.6(a)). Esto es
consistente con el hecho de que el reservorio de CO2(g) en la atmósfera gaseosa es considerado
infinitamente grande en comparación al volumen de medio de cultivo y, por lo tanto, la presión
parcial de CO2 en esta fase permanecerá sin cambios. En consecuencia, la concentración de dióxido
86
de carbono disuelto deberá ser siempre la misma e igual a la concentración en equilibrio
termodinámico con esa presión parcial de CO2 (Ecuación 2.2)
La especie HCO3- sin embargo presenta una evolución bastante diferente (Figura 3.6(b)), cuando el
pH es bajo su concentración es baja, y su valor está por debajo del de la concentración de CO2(aq). A
medida que el pH del medio de cultivo aumenta, la reacción de equilibrio entre estas especies se
desplaza hacia la formación de bicarbonato (Ecuación 2.3). Como la presión parcial de CO2 en el
reservorio gaseoso y la concentración de CO2(aq) en la fase líquida permanecen constantes, el efecto
del aumento del pH por adición de NaOH es el aumento de la concentración de esta especie en el
medio de cultivo. Al igual que para el bicarbonato, la concentración de carbonato también
experimenta un aumento neto (Figura 3.6(c)), aunque su valor se mantiene siempre por debajo del
valor de la concentración de HCO3-.
(a) Concetración de CO2 [mol L-1]
2,0E-5
(b) Concetración de HCO3- [mol L-1]
2,0E-2
1,0E-5
1,0E-2
0,0E+0
0,0E+0
4,0
6,0
8,0
10,0
4,0
6,0
pH
8,0
10,0
pH
(c) Concentración de CO32- [mol L-1]
1000
(d) Contenido de Carbono
Inorgánico Total Relativo
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0
4,0
6,0
pH
8,0
10,0
4,0
6,0
pH
8,0
10,0
Figura 3.6:Concentración de las especies de Carbono en el medio de cultivo en función del pH del medio de cultivo. (a)
Concentración de CO2(aq). (b) Concentración de HCO3-. (c) Concentración de CO32-. (d) Concentración total de carbono
inorgánico mCT en el medio acuoso expresado en forma relativa a la concentración total de carbono inorgánico en el
medio de cultivo original en equilibrio con aire atmosférico (pCO2 = 0,26 mmHg).
En la Figura 3.6(d) se observa la variación de la concentración total de carbono inorgánico (mCT) en
el medio de cultivo cuando de modifica el pH del medio BBM por adición de NaOH o HCl.
87
Numerosos antecedentes bibliográficos señalan que los medios de cultivo con pH altos suelen ser
más adecuados para la producción de algas microscópicas. Como puede verse en esta figura la
concentración de mCT en el medio líquido aumenta unas mil veces respecto a la concentración de
carbono a pH neutro. Considerando que el dióxido de carbono es uno de los nutrientes más
importantes para el crecimiento fotoautotrófico de microalgas, este fenómeno podría ser la causa de
la que las algas crezcan mejor en medios alcalinos.
3.3 Comportamiento del medio BBM en respuesta a la variación de la concentración de CO2 en
la fase gaseosa.
La presión parcial de CO2 en la atmosfera terrestre es de aprox. 0.26mmHg. Considerando que el
CO2 es el sustrato fuente de carbono utilizado por las algas en la síntesis del material celular, no
resulta extraño que el enriquecimiento de la corriente de aire con CO2 sea una práctica habitual en la
propagación de microalgas con fines comerciales. El fin que se persigue en estos casos es aumentar
la concentración de este sustrato, favoreciendo de este modo el crecimiento celular y, en
consecuencia, incrementando la productividad del proceso. Sin embargo, el aumento de la presión
parcial de dióxido de carbono en el medio de cultivo produce un desplazamiento de todos los
equilibrios ácido-base en el medio acuoso (Neehan, B. y col, 1986; Benemann, J.R., 2003).
En este apartado analizaremos la manera en que varía la composición del medio de cultivo al
aumentar la concentración de CO2 en la atmosfera gaseosa en contacto con el medio de cultivo. Para
ello, en el esquema de cálculo detallado, solo es necesario modificar al parámetro pCO2 incluido en
la Ecuación 2'. Analizaremos a modo de ejemplo el rango de concentraciones que van de 0 a
76mmHg. El límite inferior del rango corresponde a una atmósfera agotada, en la cual todo el CO2
fue consumido. En esta situación, debido a la hipótesis de estado de equilibrio entre las fases, la
concentración de todas la especies de carbono en la fase acuosa será igualmente cero. El límite
superior del rango corresponde a una atmósfera con un 10% de CO2 en su composición, esta
concentración es equivalente a aumentar unas 300 veces la concentración de CO2 en el aire.
Como puede verse en la Figura 3.7, la concentración de CO2(aq) en el medio de cultivo aumenta en
forma lineal con la presión parcial de CO2 (Figura 3.7(a)). La concentración de HCO3- experimenta
un importante aumento cuando los valores de pCO2 cambian de 0 a 40mmHg; a partir de este valor,
el aumento en la concentración de HCO3- es cada vez menor (Figura 3.7(b)). La concentración de
CO32- aumenta sensiblemente con la pCO2 en el rango de 0 a 10mmHg; a partir de este valor la
88
concentración de CO32- comienza a disminuir debido al aumento en la concentración de H+ (Figura
3.7(c)).
Un resultado potencialmente útil para la producción a gran escala es que una concentración de CO2
del 10% en la corriente gaseosa, incrementa unas 150 veces el contenido total de carbono inorgánico
(mCT) respecto a la concentración mCT en el medio original en equilibrio con el aire atmosférico
(Figura 3.7(d)), resultado muy inferior al producido por la alcalinización a pH 9,5 del medio de
cultivo, mediante el agregado de NaOH.
(a) Concentración de CO2 [mol L-1]
4,0E-3
4,0E-4
3,0E-3
3,0E-4
2,0E-3
2,0E-4
1,0E-3
1,0E-4
0,0E+0
0,0E+0
0
50
pCO2 [mmHg]
100
(b) Concentración de HCO3- [mol L-1]
0
(c) Concentración de CO32- [mol L-1]
1,5E-8
150
1,0E-8
100
5,0E-9
50
50
pCO2 [mmHg]
100
(d) Contenido de Carbono
Inorgánico Total Relativo
0
0,0E+0
0
50
pCO2 [mmHg]
0
100
50
pCO2 [mmHg]
100
Figura 3.7:Variación en la concentración de las especies de Carbono en el medio de cultivo con el aumento de la presión
parcial de CO2 en la atmosfera gaseosa. (a) Concentración de CO2(aq) vs pCO2. (b) Concentración de HCO3- vs pCO2. (c)
Concentración de CO32- vs pCO2. (d) Concentración total de carbono inorgánico mCT en el medio vs pCO2, expresado en
forma relativa a la concentración total de carbono inorgánico en el medio de cultivo original en equilibrio con aire
atmosférico (pCO2 = 0,26 mmHg).
Como consecuencia de aumentar la presión parcial de CO2 en la atmósfera gaseosa, se produce en el
medio de cultivo una disminución del pH de la solución, una leve variación en la fuerza iónica y un
aumento en la presión osmótica (Figuras 3.8(a), 3.8(b) y 3.8(c) respectivamente). Como puede
observarse, el pH de la solución disminuye considerablemente, alcanzando valores cercanos a 5. En
numerosas publicaciones se ha encontrado que altas concentraciones de CO2 en la corriente de aire
con la cual se alimenta al cultivo celular perjudican el crecimiento de las microalgas, sugiriéndose
89
que podría existir un mecanismo de inhibición por sustrato (Camacho Rubio, F. y col, 1999; Lee,
Y.K. y col, 1989). Como es posible observar, el motivo de esta reducción en la velocidad de
crecimiento podría ser consecuencia de la reducción del pH.
(a) pH
6,5E+0
(b) Fuerza Iónica [mol L-1]
8,5E-3
(c) Presión Osmótica [mmHg]
300
6,0E+0
8,0E-3
250
7,5E-3
200
5,5E+0
5,0E+0
0
50
pCO2 [mmHg ]
100
0
50
pCO2 [mmHg ]
100
0
50
pCO2 [mmHg ]
100
Figura 3.8: .Modificación del medio de cultivo producto de la modificación de la pCO2 en la fase gaseosa. (a) pH del
medio de cultivo vs pCO2. (b) Fuerza iónica del medio de cultivo vs pCO2.(c) Presión osmótica del medio de cultivo vs
pCO2.
En cuanto al resto de las especies en la solución, el aumento de la pCO2 en la fase gaseosa dentro de
este rango provoca las mismas modificaciones en los equilibrios acido base y de formación de
complejos que el agregado de ácido clorhídrico en concentraciones entre 0 y 5,0×10-4 moles L-1.
3.4 Aumento de la presión parcial de CO2 en la atmósfera con corrección del pH.
El aumento de la presión parcial de dióxido de carbono produce una disminución del pH en la
solución. Para corregir este efecto es habitual la adición de una base fuerte, como hidróxido de sodio,
al medio acuoso. Esta metodología de rectificación tiene dos consecuencias: el aumento de la fuerza
iónica y el aumento de la presión osmótica.
Para analizar el efecto de aumentar la presión parcial de CO2 en la fase gaseosa, corrigiendo el pH de
la solución por agregado de NaOH utilizaremos el algoritmo de simulación, modificando el
parámetro pCO2 en la Ecuación 2' según el valor deseado, definiendo a la concentración inicial
m0NaOH de hidróxido de sodio como una variable de ajuste en la Ecuación 1' y calculando las
concentraciones de protones (mH) y de ion sodio (mNa) como variables dependientes a partir de las
Ecuaciones 29' y 27' respectivamente.
90
(a) Conc. inicial de NaOH [mol L-1]
6,0E-2
(b) Fuerza Iónica [mol L-1]
(c) Presión Osmótica [mmHg]
1,0E-1
2000
5,0E-2
1000
4,0E-2
2,0E-2
0,0E+0
0,0E+0
0
50
100
0
0
50
pCO2 [mmHg]
100
0
pCO2 [mmHg]
50
pCO2 [mmHg]
100
Figura 3.9: .Modificaciones en el medio de cultivo por aumento de la presión de CO2 en la atmósfera gaseosa,
considerando la adición inicial de NaOH para la corrección del pH; para un pH final = 7,0. (a) Concentración de NaOH
en función de la pCO2.(b) Fuerza iónica del medio de cultivo en función de la pCO2. (c) Presión osmótica del medio de
cultivo en función de la pCO2.
(a) Concentración de CO2 [mol L-1]
(b) Concentración de HCO3- [mol L-1]
6,0E-2
4,0E-3
4,0E-2
2,0E-3
2,0E-2
0,0E+0
0,0E+0
0
50
pCO2 [mmHg]
100
0
(c) Concentración de CO32- [mol L-1]
40
60
pCO2 [mmHg]
80
(d) Contenido de Carbono
Inorgánico Total Relativo
2500
2,0E-4
20
2000
1500
1,0E-4
1000
500
0,0E+0
0
0
50
pCO2 [mmHg]
100
0
20
40
60
pCO2 [mmHg]
80
Figura 3.10: Variación de la concentración de las especies de Carbono en el medio de cultivo producto de la
modificación de lo presión parcial de CO2 en la atmosfera gaseosa con corrección del pH por adición de NaOH; para un
pH final = 7,0. (a) Concentración de CO2(aq) según la pCO2. (b) Concentración de HCO3-vs pCO2. (c) Concentración de
CO32-vs pCO2. (d) Concentración total de carbono inorgánico mCT en el medio acuoso vs pCO2, expresado en forma
relativa a la concentración total de carbono inorgánico en el medio de cultivo original en equilibro con aire atmosférico
(pCO2 = 0,26 mmHg).
En la Figura 3.9(a) se observa la concentración de NaOH que es necesario adicionar a la solución
para mantener el pH de la solución igual a 7, a medida que se aumenta la presión parcial de CO2 en
91
la atmósfera gaseosa. Como puede verse en las Figuras3.9(b) y 3.9(c), la adición de base se traduce
en aumentos en la fuerza iónica y en la presión osmótica de la solución. Cuando la presión parcial de
CO2 alcanza el valor de 76mmHg, la cantidad de NaOH que es necesario adicionar es tan elevada,
que la fuerza iónica y la presión osmótica aumentan, respectivamente, unas 10 y 20 veces respecto a
su valor original.
Cuando se efectúa este procedimiento puede verse que la concentración de las especies de carbono
en forma muy diferente a las observadas en las Figuras 3.6 y 3.7. En este caso, las concentraciones
de CO2(aq), de HCO3- y de CO32- aumentan en forma lineal con a presión parcial de carbono (Figuras
3.10(a), 3.10(b) y 3.10(c)). La concentración de carbono inorgánico total mCT también aumenta en
forma lineal y su concentración alcanza unas 2000 veces la concentración en el medio original.
3.5 Variación en la composición del medio BBM en función de la temperatura.
Un cambio en la temperatura modifica las contantes cinéticas que gobiernan los equilibrios acidobase, de formación de complejos y de solubilidad del CO2 en el medio acuoso. En este punto
analizaremos de qué manera la variación de la temperatura repercute en la composición del medio de
cultivo BBM. Para ello, sólo es necesario modificar el valor del parámetro T en la Ecuación 1' en el
esquema de simulación.
(a) pH
7,0E+0
(b) Concetración de las especies
de Carbono [mol L-1]
3,0E-5
2,5E-5
mCT
2,0E-5
6,5E+0
CO2
1,5E-5
1,0E-5
HCO3-
5,0E-6
6,0E+0
CO32-
0,0E+0
290
295
300
305
290
Temepratura [oK]
295
300
Temperatur [oK]
305
Figura 3.11: .Modificaciones en el medio de cultivo por aumento de la temperatura. (a) pH en función de la temperatura
[oK]. (b) Concentración CO2(aq) y HCO3- , y mCT en el medio de cultivo en función de la temperatura [oK].
A partir de los datos obtenidos en las sucesivas simulaciones es posible determinar la variación de las
composición del medio en el rango de temperatura incluido entre 293.15 y 303.15o K. En la Figura
3.11(a) se muestran los cambios en el pH con el aumento de la temperatura, como puede verse el pH
experimenta un leve descenso a pesar de la disminución de la solubilidad del CO2 en la fase acuosa.
92
La razón de esto estaría asociada a desplazamiento de los equilibrios acido-base del grupo carbonato
hacia la formación de H+ (ecuaciones 3.3 y 3.4) con el aumento en la temperatura.
Diversos antecedentes bibliográficos señalan que el crecimiento de las microalgas suele ser más
eficiente en temperaturas por debajo de 30o C. En la Figura 3.11(b), se grafica la concentración de las
especies de carbono en la fase acuosa para cada una de las temperaturas en el rango analizado. Como
puede verse la cantidad de carbono total mCT en el medio disminuye notablemente, entre un 25 –
30%, cuando la temperatura del medio aumenta de 25 a 35 oC pudiendo ser este el motivo de que las
algas crezcan mejor a temperaturas relativamente bajas.
(4) MEDIO BBM-UREA
Sólo algunas bacterias y cianobacterias son capaces de fijar N2 del aire. Alrededor del 99% del
nitrógeno orgánico en la biosfera deriva de la asimilación de nitratos, sin embargo, si se encuentra
disponible, muchas plantas puede también utilizar NH4+ en lugar de nitratos como fuente de
nitrógeno. Las microalgas son capaces de asimilar una gran variedad de fuentes de nitrógeno,
mayoritariamente nitrato (NO3-), amonio (NH4+) y urea, así como extractos de levadura, peptona,
aminoácidos y purinas (Helt H.W.,2005; Lea, P. J., 1997; Perez-Garcia, O. y col, 2011)
Si bien se observa una gran variedad de mecanismos de asimilación de nitratos, amonio y urea en
microalgas debido a la diversidad de los distintos grupos algales (Syrett, P.J. 1981 y 1988); existen
muchas similitudes entre la asimilación de las fuentes de nitrógeno entre microalgas eucariotas y las
plantas superiores.
Para asimilar el nitrato, las células de plantas superiores lo transportan a través de la membrana en un
proceso simporte junto a dos protones. Una vez en el citosol el nitrato es reducido a nitrito en una
reacción catalizada por la enzima nitrato reductasa, utilizando NADH como reductor.
Nitrato Reductasa
NO3  NAD  P  H  H  
 NO2  NAD  P   H 2O

(4.1)
La reducción de nitrito a amonio en microalgas es catalizada por la enzima nitrito ferredoxina
reductasa cuya localización es especie específico (Lopez-Ruiz, A., 1991). La reducción de nitrito a
amonio procede en una reacción que requiere el consumo de seis electrones.
93
Nitrito Reductasa
NO2  3NADPH  5H  
 NH 4  3NADP  2H 2O
(4.2)
Debido a las características de sus vías metabólicas, la utilización de nitratos como fuente de
nitrógeno en la producción de microalgas resulta en un aumento del pH del medio que, como vimos
en la sección anterior, provoca un desplazamiento en los equilibrios acido base y conduce a un
incremento en la concentración del carbono inorgánico en la solución.
El metabolismo de urea y amonio como fuentes de nitrógeno no requiere el consumo de protones
para su transporte al interior de la célula, ni el empleo de potencial reductor para su asimilación.
Cuando amonio y nitrato se suministran conjuntamente en cultivo de microalgas, estas utilizan de
preferencia el amonio en primer lugar, el cual se incorpora a los componentes orgánicos producidos
por las microalgas.
(a)
(b)
Figura 4.1: Comparación de cultivos experimentales de microalgas (Chlorella sp.) utilizando urea o nitrato como fuentes
de nitrato. (a) Concentración de biomasa [g L-1] vs tiempo de cultivo [días] para urea y nitratos. (b) pH vs días de cultivo
para urea y nitratos
La utilización de amonio como fuente de nitrógeno presenta dos problemas principales: (1) es
consumido muy rápidamente, lo que conduce a caídas del pH reduciendo severamente el crecimiento
y el rendimiento de biomasa, y (2) por sus características fisicoquímicas puede ser perdido por
94
arrastre con la corriente de aire como amoníaco gaseoso si las condiciones del medio no son
adecuadas.
La urea es una fuente orgánica de nitrógeno de uso habitual en la producción de microalgas. La
asimilación de urea en las células de microalgas comienza por la hidrólisis de la misma en amonio y
bicarbonato. Las reacciones a través de la cual ocurren son especie específicas como así también las
enzimas que las catalizan.
Las modificaciones en el pH que producen durante el metabolismo de nitratos y amonio introducen
modificaciones en el contenido de carbono inorgánico total en la solución y apartan al medio de
cultivo del pH inicial, generalmente escogido como el pH óptimo para el crecimiento de la especie de
microalgas en cuestión. La corrección del pH por adición de ácido resuelve este problema pero
produce dos nuevas variaciones: la fuerza iónica y la presión osmótica.
A partir de cultivos exploratorios realizados con anterioridad en el laboratorio (Figura 4.1(a)) (Botta,
F.A., 2011; Niizawa, I., 2010), fue posible observar el efecto sobre el pH de la utilización de nitrato
como fuente de carbono. En la Figura 4.1(a), se observa la variación de la concentración de biomasa
en el medio durante 8 días de cultivo utilizando dos fuentes diferentes de nitrógeno: urea o nitrato.
En la Figura 4.1(b) es posible observar la variación del pH en ese período para cada una de las
fuentes empleadas, pudiéndose advertir que en el caso del cultivo con urea como fuente de nitrógeno,
el pH presenta mínimas modificaciones.
Tabla 4.1: Modificaciones introducidas al medio BBM para
reemplazar la fuente de nitrógeno por urea.
Componente
BBM
BBMU
Nitrato
2.94×10-3
--Urea
--1.47×10-3
Cloruro de Sodio
--1.38×10-3
En esta sección, el medio BBM será modificado con el objetivo de reemplazar la fuente de nitrógeno
original por urea. Este reemplazo persigue dos fines: por un lado favorecer el crecimiento celular al
ser una fuente de nitrógeno energéticamente más eficiente y, por el otro, evitar los cambios en el pH
del medio de cultivo que pudieran influir sobre el crecimiento celular, permitiendo a la vez mantener
constante la concentración de carbono en el medio, reduciendo de este modo el número de variables
durante el cultivo celular. El remplazo de nitratos por urea se hizo de manera de mantener las
características fisicoquímicas del medio en su condición inicial. La cantidad de urea a adicionar se
calculó para mantener la concentración de nitrógeno constante, y para corregir las diferencias que se
95
producen en la PO y la I se adicionó cloruro de sodio. En la Tabla 4.1 se detallan las modificaciones
realizadas a la fórmula original en el medio BBMU.
4.1- La descomposición de la urea
La presencia urea en el medio de cultivo agrega a la solución un nuevo conjunto de equilibrios
químicos. La urea es un compuesto de relativa inestabilidad que se descompone en amonio y
carbamato (Ecuación 4.3). El carbamato es un compuesto inestable que se degrada rápidamente en
amonio y dióxido de carbono (Ecuación 4.4). El dióxido de carbono producido participará de los
equilibrios correspondientes hasta alcanzar un equilibrio final con al CO2 en la fase gaseosa. El
amonio, por otro lado, puede perder un protón formando amoníaco en la solución (Ecuación 4.6).
Debido a que el medio de cultivo es continuamente alimentado con aire en cuya composición no
existe amoníaco, el efecto neto de la Ecuación 4.7 es la transferencia continua de amoníaco hacia la
fase gaseosa y la pérdida permanente de nitrógeno en la atmosfera.
K Iurea 
H 2O  H 2 NCONH 2  NH 4  H 2 NCOO


4
H 2 NCOO  NH  2NH 3l   CO2
aNH  aH NCOO
4
(4.3)
2
aurea
K
urea
III

2
aNH
aCO2
3 l 
aH 2 NCOOH aNH 
(4.4)
4
H 2 NCOO  H   H 2 NCOOH
K IIurea 
KVIurea 
NH 4  OH   NH 3l   H 2O
aH 2 NCOOH
aH
2 NCOO

aH 
aNH3l 
aOH  aNH 
(4.5)
(4.6)
4
NH 3l   NH 3 g 
KVurea 
pNH3
aNH3
(4.7)
Las constantes para cada una de estas reacciones puede obtenerse a partir de los trabajos publicados
por Rahimpour, Isla e Irazoqui (Irazoqui, H. A. y col, 1993; Isla, M.A. y col, 1993; Rahimpour, M.
R., 2004).
Asumiendo que la reacción 4.4 se produce de forma instantánea y, por lo tanto, el equilibrio está
totalmente desplazado hacia la formación de productos; y que, además, las Ecuaciones 4.5 y 4.6
alcanzan rápidamente el estado de equilibrio, son las reacciones 4.3 y 4.7 las que determinan la
velocidad con la cual el nitrógeno se pierde hacia la atmósfera en forma de amonio. La velocidad de
la reacción 4.4 es tan alta que las reacciones 1 y 2 pueden plantearse como una reacción de un solo
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paso (Ecuación 4.8). Por otro lado, la velocidad con que ocurre la reacción inversa de formación de
urea es muy baja y puede considerarse cero (Lynn, K. R., 1966; Alexandrova, A. N. y col, 2007).
r1
H 2O  H 2 NCONH 2 
 2NH 3 ac   CO2
r1  k1aH2 NCONH2 aH2O
(4.8)
r1
NH 4  H 2 NCOO 
 H 2O  H 2 NCONH 2
r1  aH
(4.9)
2 NCOO

aNH   0
4
La constante termodinámica k1 en las Ecuaciones 4.8 y 4.9 puede relacionarse con la temperatura a
través de la ecuación k1 T   A1 e
 Ea
RT
. De esta manera la velocidad de descomposición de la urea
pude expresarse mediante:
 Ea
dmUREA
T
 r1  k1  mUREA   A1 e RT mUREA
dt
(4.10)
En consecuencia la concentración de urea en el tiempo, considerando la descomposición química
establecida en las Ecuaciones 4.8 y 4.9, puede calcularse por integración directa
0
mUREA  mUREA
e k1 t
(4.11)
Para determinar el valor de los parámetros termodinámicos A1 y Ea en la Ecuación 4.10
utilizaremos los datos reportados por Shaw y Bordeaux (Shaw, W. H. R. y col, 1955). En este trabajo
se determina la velocidad con la cual se descompone la urea en una solución acuosa con
concentraciones incluidas entre 6,0×10-3 a 1,2 mol L-1; a diferentes temperaturas en el rango de
333,15 a 373,15oK.
(a) mUREA
mUREA = 6,0×10-2 e-4,82E-6 [t]
(b) k1T
6,1E-2
4E-5
5,9E-2
2E-5
k1(T) = 3,4×1014 e-1,63E+4 [1/T]
(c) mUREA
298,15 oK
1,5E-3
1,0E-3
5,0E-4
5,7E-2
0E+0
0
2000
4000
tiempo (s)
6000
2,6E-3
356,15 oK
0,0E+0
2,8E-3
3,0E-3
1/T (oK)
0
10
20
30
días
Figura 4.2: datos reportados en el trabajo realizado por Shaw y Bordeaux (1955). (a) Variación de la concentración de
urea en función del tiempo para una solución acuosa 356,15o K. La constante k1T puede obtenerse a partir de la ecuación
11. (b) Valores de la constante k1Tpara las temperaturas incluidas en el rango 333,15 a 373,15o K. A partir de esta gráfica
puede obtenerse el valor de los parámetros k10 y Ea. (c) Predicción la concentración de urea en una solución acuosa
durante el tiempo típico de cultivo de microalgas a dos temperaturas: 298,15 y 356,15o K.
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En la Figura 4.2(a) se reproducen los valores experimentales obtenidos en el citado trabajo para la
concentración de urea en el tiempo a 356,15 oK, una de las temperatura ensayadas. A partir del ajuste
de los valores experimentales con la expresión detallada en la Ecuación 4.11 es posible obtener el
valor de k1356 . En la Figura 4.2(b) se grafican los valores de k1 T  obtenidos de la misma forma
para el rango de temperaturas incluidos entre 333,15 y 373,15o K, en función de T 1 . A partir de
estos datos y mediante de la igualdad k1 T   A1 e
parámetros A1 y
Ea
R
 Ea
RT
es posible obtener los valores de los
.Conocidos los valores de los parámetros termodinámicos incluidos en las
Ecuaciones 4.10 y 4.11 es posible predecir el valor de la concentración de urea en el tiempo, para
cualquier temperatura.
Como puede verse en la Figura 4.2(c), utilizando los datos reportados por Shaw y Bordeaux es
posible predecir que la descomposición química de la urea a las temperaturas próximas a las de los
cultivos de microalgas será despreciable, y por lo tanto, es posible concluir que la pérdida de
nitrógeno por arrastre de amoníaco en la corriente de aire será mínima.
(5) CONCLUSIONES.
En este capítulo se enunciaron las hipótesis respecto al comportamiento fisicoquímico de las
soluciones de electrolitos y que constituyen la base para la construcción del modelo fisicoquímico de
los medios de cultivo. Con este modelo se desarrolló un método de cálculo basado en un Algoritmo
Genético para la determinación de las propiedades y la simulación de las soluciones de electrolitos,
considerando un sistema compuesto por una fase acuosa en contacto con una fase gaseosa que
contiene dióxido de carbono. Aplicando éste modelo y el esquema de cálculo se determinaron los
parámetros necesarios para realizar la correlación de la constante K1 de disolución del CO2 con la
temperatura a partir de datos de solubilidad disponibles en literatura. A modo de ejemplo se aplicó el
modelo de simulación para predecir el comportamiento de una solución acuosa en equilibrio con una
atmosfera gaseosas con diferentes concentraciones de CO2 y para calcular la cantidad de NaOH que
sería necesario adicionar a esta solución para mantener el pH constante frente a la modificación de la
atmósfera gaseosa.
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Se construyó una herramienta de simulación para la predicción del comportamiento fisicoquímico
del medio de cultivo BBM frente a la modificación de su receta original, considerando todo el
conjunto de equilibrios ácido-base y de formación de complejos presentes en el sistema.
Esta herramienta fue modificada posteriormente para incluir cambios a medida en el medio BBM de
acuerdo a las características fisicoquímicas que se busquen en el mismo (pH, pCO2, I, PO, etc.).
Esta herramienta de simulación, tiene dos atractivos importantes: respecto a la etapa de análisis de
reactores permite disponer de una gran cantidad de información respecto a la composición del
sistema proporcionando una metodología para analizar la forma en que interrelacionan las variables
del sistema, y logrando interpretar de manera más precisa los resultados observados durante la
propagación celular. Por otro lado, pensando en la aplicación a gran escala del proceso, permite
considerar las características y composición del agua disponible, adecuándola según la concentración
final deseada por agregado de los componentes que sean necesarios, evitando los pasos previos de
purificación.
Se modificó el medio BBM cambiando la fuente original de nitrógeno por urea. El motivo de este
cambio fue evitar las modificaciones que produce el metabolismo del nitrato sobre el pH del medio
de cultivo y, en consecuencia, sobre el crecimiento celular y en la concentración total de carbono
inorgánico mCT en la fase acuosa.
Para analizar la posibilidad de pérdidas de nitrógeno hacia la atmósfera por arrastre de amoníaco
producido por descomposición química de la urea se calcularon los parámetros termodinámicos
involucrados en la descomposición de la urea, a partir de datos bibliográficos.
A partir de los parámetros calculados fue posible predecir el valor de la concentración de urea en una
solución acuosa durante 30 días, considerando su descomposición química; concluyéndose que la
descomposición es mínima y por lo tanto la pérdida por arrastre de amoníaco también.
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