Tecnologías de Biosensores en la medida de la calidad de agua

IV Jornadas de Ingeniería del Agua
La precipitación y los procesos erosivos
Córdoba, 21 y 22 de Octubre 2015
Tecnologías de Biosensores en la medida
de la calidad de agua
A. Ortega, B. Russo, A. Acero, J. Lorén y O.Ruiz
Escuela Universitaria Politécnica de la Almunia EUPLA
Universidad de Zaragoza, 50100 La Almunia de Doña Godina
1. Introducción.
Existe un gran interés en la monitorización de parámetros para identificar la cantidad y
calidad de los vertidos urbanos. La cantidad se caracteriza por la duración de los vertidos y
por su caudal en función del tiempo y se utilizan tecnologías convencionales en los puntos
de alivio. La calidad por una serie de parámetros de tipo físico, químico y bacteriológico.
Los microorganismos (hongos y bacterias) causan muchas enfermedades y es precisa su
identificación rápida para el tratamiento y prevención de infecciones. La escherichia coli
O157:H7 (E.coli O157:H7), es uno de los más peligrosos. El establecimiento de métodos
rápidos y sensibles para su detección resulta de gran interés en los suministros de agua.
Métodos tradicionales requieren de un día a una semana. En este artículo se va a describir
el estado actual de las tecnologías de biosensores por su interés en la monitorización en
tiempo cuasi-real de vertidos urbanos.
2. Biosensores.
Un biosensor es un dispositivo que hace uso de reacciones bioquímicas específicas que se
producen en receptores biológicos para detectar compuestos químicos, bacterias o virus,
transformando el resultado de dichas reacciones en señales eléctricas (sensor en fig. 1).
Figura 1. Esquema básico de un biosensor genérico [1].
Un biosensor consta de dos partes, el biorreceptor, sensible a parámetros biológicos, y el
transductor que transforma esos cambios en una señal eléctrica. El biorreceptor está
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inmovilizado y en contacto con el transductor. Actúa como un filtro extremadamente
selectivo comparado con cualquier sensor químico, por lo que constituye una herramienta
de gran valor para análisis altamente específicos. A los biosensores con moléculas
inmovilizadas les afectan las condiciones físico-químicas en las que operan (pH,
temperatura y contaminantes).
3. Clasificación de los biosensores por el transductor.

Electroquímicos: Miden magnitudes eléctricas entre una solución y un electrodo. Se
usa el diamante dopado con boro (BDD) como posible alternativa a materiales
convencionales tales como el oro, el platino o en carbón. Pueden clasificarse en:
 Potenciométricos, cuando se mide el potencial eléctrico. Hay dos tipos: los
electrodos selectivos a los iones (ISE) que involucran un equilibrio de intercambio
de iones entre la solución y una membrana de material conductor y los basados
en dispositivos de efecto campo sensibles a los iones (ISFET).
 Amperométricos, cuando la propiedad que miden es la intensidad de corriente.
 Conductimétricos, cuando miden la variación de la conductividad.
 Impedimétricos, cuando el resultado es una variación de impedancia.
 Másicos: Generan una señal eléctrica originada por un cambio de masa detectado
por un material piezoeléctrico de soporte, causado por acumulación del analito.
 Térmicos: Se mide el cambio de temperatura sobre la superficie del sensor debido a
intercambios de calor producidos por reacciones donde interviene el analito.
 Ópticos: Se basan en cambios en las propiedades de la luz en fibras ópticas.
4. Biorreceptores.
El biorreceptor es el elemento sensible específico del biosensor. Es utilizable toda
estructura biológica o bioquímica que posea esta capacidad. Se utilizan estructuras
proteínicas, enzimas y anticuerpos. También ácidos nucleicos (ADN o ARN) de orgánulos
subcelulares, cortes finos de tejidos celulares o receptores de membrana.
Aminoácidos. Los aminoácidos poseen un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (NH2) sobre el mismo que determina a cada aminoácido particular (figura 2). Pueden
conectarse unos a otros en la denominada cadena peptídica.
Proteínas. Están constituidas por un encadenamiento de aminoácidos unidos por enlaces
peptídicos. La naturaleza y el orden del encadenamiento de los aminoácidos constituyen
su estructura primaria. Cada proteína tiene una estructura tridimensional determinada
por su cadena polipeptídica dando lugar a las estructuras secundaria y terciaria.
Enzimas. Las enzimas realizan una actividad catalítica. Todas las reacciones en los
organismos vivos se catalizan por las enzimas. Los reactivos de una reacción catalizada por
una enzima se llaman substratos.
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Figura 2: Aminoácido.
Figura 3: Formación de un dipéptido a partir de dos
aminoácidos.
En una reacción los substratos se unen transitoriamente a la enzima y forman un
complejo. Una enzima caracteriza un solo tipo de reacción.
Figura 4: Anticuerpo.
Figura 5: Escala de los nanomateriales [2].
Anticuerpos. Los anticuerpos son segregados por células especializadas y forman parte del
sistema inmunitario de defensa. Están formados por cuatro cadenas polipeptídicas cuya
ordenación espacial forma una Y. Tienen (figura 4) dos puntos de unión para el antígeno
situados sobre cada una de las ramas de la Y. Son extremadamente específicos.
Células enteras. Ciertas bacterias que metabolizan preferentemente un compuesto
orgánico particular pueden servir de “elemento sensible” del sensor. Esto se acompaña de
la producción y la excreción de una sustancia detectable por el transductor. Presentan una
cierta falta selectividad, pero en medio ambiente a veces es mejor evaluar la toxicidad
potencial global que intentar detectar la presencia de un tóxico particular.
5. Inmovilización del material biológico.
Un paso fundamental en la fabricación de un biosensor es la inmovilización del elemento
de reconocimiento sobre una membrana o matriz que se fija a la superficie del
transductor. Los métodos de inmovilización son:
Adsorción: Se basa en la unión del material biológico mediante interacciones iónicas o
fuerzas de Van der Waals. Es una técnica simple y de bajo coste.
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Inclusión (atrapamiento): Se realiza atrapando el elemento biológico en un gel
incorporándolo antes de su polimerización.
Confinamiento (entrecruzamiento): El biorreceptor queda en solución en un
compartimiento limitado por una membrana semipermeable que sólo deja pasar las
moléculas pequeñas.
Inmovilización covalente: Se basa en la formación de enlaces covalentes entre la superficie
del sensor, previamente activada, y los grupos funcionales de las proteínas.
6. Integración de nanomateriales en biosensores.
En los últimos años, se ha prestado especial atención a la utilización de nanomateriales, en
los sensores y en el recubrimiento de electrodos. En la figura 5 se muestra la escala de los
nanomateriales, cuyo tamaño está comprendido entre 1 y 100 nm.
Nanotubos de carbono. Los nanotubos de carbono (CNT, Carbon Nanotubes), son una de
las formas alotrópicas del carbono. Tienen una estructura atómica similar a una capa de
grafito (grafeno) (figura 6d) y se forman a partir del enrollamiento de la lámina de grafito
(figura 6a). Según el número de capas, se pueden clasificar en nanotubos de pared única
(SWCNT), y de pared múltiple (MWCNT), considerados estos últimos como una serie de
tubos concéntricos alrededor de un tubo central de diámetro nanométrico.
Figura 6: a) diamante, b) grafito, c)
fullereno y d) nanotubo de C.
Figura 7: Formación de un SWCNT a partir
de una hoja de grafeno.
Figura 8: a) SWCNT y b) MWCNT.
Figura 9: a) SWCNT. b) Brazo de silla, c)
zig-zag y d) quiral.
Las propiedades de los SWCNT dependen de la forma en la que se enrolla la lámina de
grafeno. Hay tres tipos de SWCNT (figura 9), en “brazo de silla”, en “zig-zag”, y quiral. Un
SWCNT puede ser metálico o semiconductor. Los de brazo de silla son metálicos y los
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otros dos son semiconductores. Como elementos metálicos, su alta conductividad y sus
propiedades los hace interesantes en el campo de los biosensores electroquímicos.
Nanopartículas de metales nobles. Las nanopartículas (NPs) son agregados aislados, de
entre 1 y 50 nm, compuestos por átomos rodeados de una cápsula protectora que evita la
aglomeración. Las nanopartículas de oro (AuNPs), plata (AgNPs), platino (PtNPs), exhiben
unas excelentes propiedades intrínsecas a su «tamaño nanométrico». Son un material
ideal para la adsorción de biomoléculas.
Liposomas. Los liposomas son pequeñas vesículas esféricas que consisten en una o más
bicapas lipídicas concéntricas que rodean compartimentos acuosos. La parte polar de las
moléculas se sitúa bien hacia el interior de la vesícula o bien hacia el medio externo,
mientras que la parte apolar queda hacia el interior de la membrana.
Dendrímeros. Son macromoléculas tridimensionales con estructuras ramificadas en forma
de árbol (figura 10) que forman parte de los polímeros. Contienen muchos más grupos
superficiales capaces de ser funcionalizados que las proteínas de tamaño similar. Tienen
una alta funcionalidad. Una propiedad de los dendrímeros es su capacidad de formar
complejos huésped-anfitrión, que puede dar cabida a diferentes moléculas.
Figura 10: Dendrímero y su unidad elemental.
Figura 11: Polímeros conductores.
Nanopartículas poliméricas conductoras. Los polímeros conductores, llamados metales
sintéticos, casi todos orgánicos, presentan enlaces con estructura similar a la del silicio.
Cuando se aplica una diferencia de potencial en ellos, aumenta su conductividad eléctrica.
Algunos se comportan como semiconductores y otros como conductores. Entre los
conductores el más prometedor resulta ser la polianilina (PANI). Su conductividad se
controla químicamente y poseen propiedades eléctricas, electrónicas, magnéticas y
ópticas únicas, siendo un material prometedor para sensores biológicos y químicos ultra
sensibles. Son componentes adecuados para la fabricación de electrodos enzimáticos.
Nanocomposites poliméricos. Un material compuesto (composite) está formado por dos
o más materiales de diferente naturaleza que, al combinarse, dan como resultado un
cambio en las propiedades que tienen por separado. Un nanocomposite polimérico es un
material caracterizado por una dispersión homogénea de partículas de relleno de
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dimensiones nanométricas en el interior de una matriz polimérica. Como relleno se usan
sobre todo nanopartículas metálicas. Presentan una elevada superficie interfacial. En [] se
han preparado películas de nanocomposites PANI-Ag-Cu, para la detección de la bacteria
E.coli usando espectroscopía de impedancia electroquímica [3].
- Nanopartículas superparamagnéticas son soluciones coloidales, de 25 a 100 nm de radio,
que constan de un núcleo de óxido de hierro recubierto con polímeros, con grupos
funcionales adicionales para hacer conjugaciones. Cuando el tamaño de un sólido es
inferior al de su dominio magnético, todos sus dominios magnéticos están orientados en
la misma dirección cuando se le aplica un campo magnético externo. Esto da lugar a un
dipolo permanente. En ausencia de campo magnético este dipolo se mantiene hasta bajar
a un tamaño a partir del cual los dipolos se orientan al azar y por tanto el momento
magnético resultante es nulo.
- Ferrofluido, es un líquido que se polariza en presencia de un campo magnético. Se
componen de partículas ferromagnéticas suspendidas en un fluido portador, que suele ser
un disolvente orgánico o agua. A pesar de su nombre, no muestran ferromagnetismo.
Los puntos cuánticos (QDs). Son nanocristales compuestos por un núcleo de un material
semiconductor encerrados en una cápsula de otro semiconductor que tiene una mayor
anchura de la banda prohibida. Dado el carácter cuántico de estas nanopartículas, emiten
luz en diferentes longitudes de onda, dependiendo de su tamaño, por lo que son de gran
utilidad. Se han convertido en uno de los materiales más interesantes para aplicaciones de
diagnóstico de bioimagen y detección, debido a sus excepcionales propiedades ópticas.
7. Biosensores electroquímicos.
Involucran un equilibrio de intercambio de iones entre la solución y una membrana hecha
con un material conductor iónico. Los biosensores potenciométricos miden la diferencia
de potencial, expresada por la ley de Nernst, entre el electrodo selectivo en el que se
inmoviliza el biorreceptor y un electrodo de referencia.
Electrodos enzimáticos. Un electrodo enzimático resulta de la asociación de una
preparación enzimática, inmovilizada sobre un soporte, y de un sensor electroquímico
potenciométrico (diferencia de potencial), o amperométrico (intensidad de corriente), que
detectan una especie química implicada en la reacción enzimática.
Técnicas impedimétricas en reacciones catalizadas de enzimas. Se usan tres electrodos,
un electrodo de trabajo modificado por un biorreceptor, un electrodo de referencia y un
electrodo auxiliar. Se aplica una tensión alterna entre el electrodo de referencia y los de
trabajo y se mide la intensidad de corriente que circula. Se ha utilizado en la medida de
contaminantes del agua usando electrodos modificados con anticuerpos, receptores o
células. Una aplicación de la impedancia eléctrica se utiliza para identificar bacterias. Los
productos metabólicos creados durante el crecimiento de microorganismos cambian la
conductividad en forma proporcional a la concentración de microorganismos [4].
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Transistores enzimáticos de efecto de campo (ENFET, Enzime FET). Es un transistor FET
sensible a los iones (ISFET), en el que se inmoviliza una preparación enzimática sobre una
membrana sensible en forma de una película delgada de algunas micras de espesor. La
principal ventaja es la miniaturización, ya que las dimensiones de un ISFET son del orden
de algunas décimas de milímetro en longitud y en altura, y algunos milímetros en anchura.
Recordemos que un ISFET necesita para su funcionamiento de la presencia de un
electrodo de referencia que no tiene el tamaño de un transistor de efecto de campo.
Figura 12. Transistor enzimático FET.
Figura 13: CNTFET para detección de Escherichia coli.
Biosensores FET con nanotubos de carbono (CNFET). Se puede construir colocando un
nanotubo semiconductor entre dos electrodos metálicos que harían de fuente y colector.
El flujo de electrones pasaría a través del nanotubo, y su conductividad se controlaría
mediante un tercer electrodo situado cerca de él (puerta).
Se han fabricado [6] biosensores basados en transistores de efecto de campo con
nanotubos de carbono de pared única para la detección de Escherichia coli O157:H7,
separando los nanotubos metálicos de los semiconductores con HNO3/H2SO4. El tiempo
de respuesta es pequeño. Se midió la respuesta antes y después de la introducción de la
Escherichia coli O157:H7 con diversas concentraciones.
8. Biosensores de cuarzo piezoeléctrico.
Los cristales de cuarzo tienen una frecuencia de resonancia de 5,9 a 10 MHz, forma de
disco de 10 a 16 mm de diámetro y 0,15 mm de espesor. Los electrodos de oro, tienen un
espesor de 0,3 a 1
y un diámetro de 3 a 8 mm. El biorreceptor se inmoviliza sobre una
de las superficies metálicas tras su funcionalización. Se pueden utilizar nanotubos de
carbono como electrodos. La detección se basa en que la frecuencia de vibración del
cristal depende de la masa absorbida en su superficie, con:
siendo
la variación de frecuencia, f la frecuencia de resonancia del cristal,
la masa
depositada en gramos y A la superficie del depósito en
. es la densidad del cuarzo.
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Un biosensor microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), es un cristal de cuarzo con un corte
AT, intercalado entre dos electrodos metálicos. Se ha utilizado este tipo de sensores para
la detección de E.coli O157:H7. Para ello, se inmovilizaron anticuerpos anti-E.coli O157:H7
en un cristal de cuarzo. El tiempo de detección fue de unos 50 minutos. También se ha
desarrollado un biosensor QCM de 5 MHz fabricado por ICDREC basado en la
inmovilización de anticuerpos para la detección rápida E.coli O157:H7 [5].
9. Termistores enzimáticos.
Se basan en el hecho de que toda reacción enzimática se acompaña de una variación de
entalpía
, que se puede detectar por calorimetría. La variación de temperatura es
siendo n el número de moles que reaccionan,
la variación de
entalpía y C de la capacidad calorífica.
A veces la variación de entalpía es muy débil y las medidas tienen falta de sensibilidad.
Para remediarlo, se puede recurrir a una amplificación química o enzimática. La
amplificación química consiste en trabajar con compuestos cuya interacción con uno de
los productos de la reacción enzimática da lugar a fuerte variación de entalpía. La
amplificación enzimática se obtiene coinmovilizando una enzima que funciona en
secuencia con la reacción enzimática específica.
10. BioMEMS.
Los BioMEMS son sistemas micromecánicos que permiten transformar las interacciones
biomoleculares en parámetros mecánicos originados por la deflexión de una viga en
voladizo. Están constituidos por una biomembrana funcionalizada con moléculas
específicas adherida a una plataforma de silicio que vibra en su modo fundamental por
medio de un parche piezoeléctrico. Las moléculas capturadas incrementan la masa de la
membrana en contacto con la solución acuosa que contenga las especies que se busca
detectar.
11. Biosensores de fibra óptica.
Los sensores ópticos miden el efecto de los biorreceptores a través de la adsorción de la
luz, la fluorescencia o el índice de refracción. Se puede realizar una funcionalización
preliminar del biorreceptor o del analito con una etiqueta ópticamente activa, aunque es
lento, o no alterar ni etiquetar las moléculas diana, con la detección en su forma natural.
Las fibras ópticas son guías de luz cuyo funcionamiento descansa en el principio de la
reflexión total interna. Se componen de un núcleo cilíndrico y de un revestimiento
(cubierta) cuyo índice de refracción es inferior al del núcleo. En la interface núcleocubierta las condiciones de reflexión total interna no son perfectas lo que hace que
aparezcan ondas evanescentes. Esas ondas se propagan paralelamente al interface
núcleo-cubierta y pueden ser explotadas para excitar un fluoróforo (molécula que emite
fluorescencia después de ser excitada con luz) inmovilizado en la superficie del núcleo.
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Hay tres categorías: los enzimáticos, en los que una reacción enzimática detecta uno de
los substratos si posee propiedades ópticas (fluorescencia o absorbancia), los
biorreceptores no catalíticos que hacen intervenir una reacción antígeno-anticuerpo y los
biosensores con detección bio o quimioluminiscente, en los que se inmoviliza en uno de
los extremos de la fibra una enzima que cataliza una reacción de emisión de luz.
Interferómetros de Mach-Zender. Una guía de luz se divide en dos ramas por medio de
una unión en Y. Una funcionalizada con el elemento biosensor, se usa como rama sensible,
la otra es la de referencia (figura 15). Las dos ramas se recombinan a su salida, resultando
una interferencia cuya intensidad se mide con un fotodetector. Un cambio en el índice de
refracción en la superficie de la rama funcionalizada origina un cambio de fase y, por
tanto, una variación de la intensidad de luz medida con el fotodetector.
Figura 14: Biosensor de fibra óptica.
Figura 15: Interferómetro de Mach-Zender [4].
12. Sensores de resonancia de plasmón superficial (SPR).
Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de un metal. Se considera a los
electrones como n gas omog neo inmerso en un potencial positivo impuesto por los
iones inm iles de la red ristalina. Tienen un rol importante en las propiedades ópticas de
los metales. La luz se refleja cuando su frecuencia es inferior a la del plasma debido a que
los electrones en el metal apantallan el campo eléctrico. Por el contrario, la luz de
frecuencia superior a la de plasma se transmite debido a que los electrones del metal no
pueden responder tan rápidamente para apantallar el campo.
En la mayoría de los metales, la frecuencia de plasma está en el ultravioleta, haciéndolos
reflectivos en la banda de la luz visible. Algunos metales como el cobre y el oro presentan
transiciones electrónicas en el rango visible emitiendo su color característico.
Los sensores se basan en el principio físico de la resonancia de los plasmones superficiales.
El biorreceptor se deposita en una superficie metálica que recubre un soporte de vidrio
unida a un prisma. Se puede conocer la interacción en el biorreconocimiento en tiempo
real, a través de la medida de las variaciones del índice de refracción.
13. Fluorescencia de reflexión total interna (TIRF).
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La luz se propaga a través de la guía de ondas, generando una onda evanescente en la
superficie. Solamente se excitan los fluoróforos adheridos a la superficie. Usando TIRF, se
puede medir en tiempo real la cinética de la interacción de los bioanalitos con moléculas
inmovilizadas en la superficie de la guía de ondas. Es una técnica sensible, rápida y no
destructiva de monitorización ambiental.
14. Biosensores que operan a frecuencias de microondas.
Basados en la variación de frecuencia de una cavidad de microondas. Diferentes
microorganismos son responsables de los cambios de la frecuencia de resonancia de una
cavidad de microondas. En [7] se ha desarrollado un sistema analítico mejorado con
potencial para identificar micobacterias en muestras ambientales en unas 2 horas.
Detección de bacterias a frecuencias de microondas utilizando metamateriales. En [8] se
demuestra que los metamateriales que operan en la gama de frecuencias de terahercios
muestran un potencial prometedor para su uso en la fabricación de sensores microbianos
altamente sensibles y selectivos que son capaces de trabajar con una alta velocidad de
detección de microorganismos in situ, en entornos acuosos. Se han detectado cantidades
muy pequeñas de microorganismos, debido a que sus tamaños están en la misma escala
que los micro-huecos de los metamateriales que trabajan a terahercios. Se produce un
desplazamiento de frecuencia de resonancia en términos de la densidad y de las
constantes dieléctricas de microorganismos.
Referencias
[1] Red de biosensores.
[2] www.edica2madrid.org
[3] Huda et al. “PANI-Ag-Cu Nanocomposite Thin Films based Impedimetric Microbial Sensor for
Detection of E.coli Bacteria”. Journal of Nanomaterials. Article ID951640. (2014).
[4] Lagarde and Jaffrezic-Renault. “New Trends in Biosensors for Water Monitoring”. University
of Lion, France. www.intechopen.com. (2011).
[5] Vo Ke Tanh. “Quartz Crystal Microbalance (QCM) as biosensor for the Detecting of
Scherichia Coli O157:H7”. Vietnam Academy of Science and Technology. Adv. Sci. (2014).
[6] Xiaoxian Z. “Electronic Detection of Scherichia coli O157:H7 using Single Walled Carbon
Nanotubes Field Effect Transistor”. Eng. Ing. 5, 94-98. (2012).
[7] Gennarelli G, Soldovieri F. “A Non-Specific Microwave Sensor for Water Quality Monitoring”.
International Water Technology Journal. Vol. 3, nº 2. June (2013).
[8] Park et al. “Detection of Microorganisms using Terahertz Metamaterials”. Scientific Reports
4:4988. May (2014).
C.31.