Aplicaciones de las Nanopartículas

Trabajo de fin de curso: Biofísica
Aplicaciones médicas de
las Nanopartículas
Marcial Fernández Castro
Curso 13/14
Índice
1. Introducción a las nanopartículas………………………………………………………. pág.2
1.1. Propiedades ópticas de las NPs……………………………………….……………pág.3
1.2. Conductividad de las NPs………………………………………………………………pág.4
1.3. Propiedades superficiales de las NPs…………………………………………….pág.5
1.4. Síntesis de nanopartículas…………………………………………………………….pág.5
2. Sensores ultrasensibles con NPs…………………………………………………………..pág.7
2.1. Sensores por calorimetría……………………………………………………………..pág.8
2.2. Sensores por fluorescencia……………………………………………………………pág.12
2.3. Sensores electrolíticos y electroquímicos………………………………………pág.15
2.4. Sensores basados en el plasmón de resonancia…………………………….pág.17
2.5. Sensores basados en SERS…………………………………………………………….pág.18
3. NPs para el diagnóstico y tratamiento del cáncer…………………………………pág.21
3.1. Vectorización de las Au NPs…………………………………………………………..pág.21
3.2. Ventajas de las Au NPs como vectores…………………………………………..pág.23
3.3. Au NPs para el diagnóstico del cáncer……………………………………………pág.25
3.4. Vectorización pasiva: suministro y liberación de fármacos…………….pág.27
3.5. Vectorización activa: adhesión a las células cancerígenas………………pág.29
3.6. Otras terapias contra el cáncer basadas en Au NPs………………………..pág.31
Bibliografía: Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 242–257, Chem. Rev. 2012, 112, 2739−2779,
Wikipedia.org y otras páginas de la red, apuntes de la asignatura “Física de la Materia
Blanda” (Víctor Mosquera).
NOTA: Se ha imprimido el trabajo a doble cara para ahorrar papel.
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1.
Introducción a las Nanopartículas (NPs)
Una nanopartícula (NP) es una partícula microscópica cuya escala no es mayor que
100 nm, es decir, se encuentra dentro de la mesoescala. Las aplicaciones de las NPs en
son infinitas, tales como en la industria cosmética, industria farmacéutica, fabricación
de cementos, neumáticos, fibras, industria alimenticia… A lo largo de este trabajo
vamos a hablar principalmente de sus aplicaciones médicas, pero antes debemos
entender un poco mejor qué son y qué propiedades poseen las nanopartículas.
Los nanomateriales se pueden clasificar de la siguiente manera:




Materiales de base de carbón: con formas esféricas, elipsoidales o tubulares.
Sus propiedades fundamentales son su reducido peso y su mayor dureza,
elasticidad y conductividad eléctrica.
Materiales de base metálica:
o Quantum Dots (QD, puntos cuánticos, partículas de tamaño 1-5 nm).
o nanopartículas de oro, plata o de metales reactivos como el dióxido de
titanio, entre otras. Nos centraremos en este caso particular.
Dendrímeros: polímeros nanométricos ramificados. Las terminaciones de cada
cadena de ramas pueden diseñarse para ejecutar funciones químicas
específicas.
Composites: combinación de nanopartículas, con materiales de mayor
dimensión.
Además, hay muchas formas y tamaños para las nanopartículas, que se pueden
sintetizar según nos interese, algunas de las más importantes son las siguientes:




Nanoesferas: como el propio nombre indica, tienen forma esférica.
Nanorots: tienen forma de “bastoncillo” alargado.
Nanoestrellas: esferas de las que sobresalen distintos picos, podemos sintetizar
el número de picos más o menos a nuestro gusto, dependiendo del método
empleado.
Otros: nanocubos, triángulos, polígonos…
Muchas de las propiedades que se están aprovechando de las nanoestructuras y
nanomateriales (por ejemplo: su superficie altamente reactiva y su habilidad de
atravesar membranas) tienen un elevado grado de toxicidad y podrían llegar a suponer
cierto riesgo. Las implicaciones ambientales y los efectos de éstas en la salud de la
diversidad de especies (incluido el ser humano), a corto y medio plazo, han de
considerarse pues se cree que pueden afectar a las funciones vitales. La bioacumulación
de las nanopartículas en la cadena alimentaria tampoco se puede despreciar.
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Sin embargo, no todo son contras biológicamente hablando, sino que también
podemos aprovechar estas nanopartículas para diversas aplicaciones médicas, de las
que iremos hablando a lo largo de este trabajo. Son las siguientes:



Fabricación de sensores ultrasensibles.
Aplicaciones en el diagnóstico y la terapia contra el cáncer.
Soportes de apoyo y excipientes para obtener diferentes sistemas de
suministro y liberación de fármacos.
1.1.
Propiedades ópticas de las NPs
Vamos ahora a introducir algunas propiedades ópticas de las nanopartículas,
necesarias para entender su comportamiento.

•
El plasmón de resonancia aparece cuando la radiación electromagnética incide
sobre una NP metálica y aparecen fenómenos físicos relacionados con
oscilaciones (plasmones), de sus electrones libres. La ciencia que estudia la
interacción radiación metal se denomina, además, plasmónica.
Los plasmones son, por tanto, oscilaciones colectivas de los electrones libres
existentes en los metales que llevan asociadas energías discretas de manera tal
que las transiciones electrónicas entre las mismas dan lugar a la extinción de
una parte especifica de la luz incidente, dando lugar a este efecto de absorción
y coloración en estos sistemas. Sólo cuando la frecuencia del campo incidente
produzca una oscilación colectiva y coherente de la nube electrónica se
observará un fenómeno de absorción por parte de la NP y se dice entonces que
ha entrado en resonancia. La frecuencia de absorción o plasmón depende de
cuatro factores que son: la densidad electrónica, la masa efectiva del
electrón, la forma y tamaño de la distribución de carga de la partícula.
En la siguiente figura vemos la diferente absorción de distintas nanopartículas, el pico
de absorción es su plasmón y cada disolución (dependiendo de forma y/o tamaño de
las NPs) presenta un diferente color dependiendo de la longitud de onda absorbida
(espectroscopia de absorción)
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
Una característica fundamental de las NPs metálicas es su capacidad de
absorber luz incidente de una determinada longitud de onda, propiedad que,
por ejemplo, los Quantum Dots no presentan, pues estos absorber en un
continuo de ultravioleta, visible e infrarrojo

Las NPs metálicas soportan Plasmones Superficiales Localizados (LSP)
(también llamadas bandas de plasmón superficial SPB) que afectan a sus
peculiares propiedades ópticas. La excitación resonante del LSP produce que el
campo electromagnético se intensifique sustancialmente en la proximidad de la
superficie de las NPs. El LSP se ve afectado por las características de la NP, tanto
forma, tamaño, constante dieléctrica, material… Este fenómeno tiene
interesantes aplicaciones en espectroscopia óptica, sobre todo en dispersión
Raman. La espectroscopia Raman proporciona una información molecular
altamente específica y permite el análisis de mezclas complejas, aunque
presenta el inconveniente de la baja intensidad de la señal, en presencia de las
NPs ésta se intensifica lo suficiente. Aprovechando esto sale la “SurfaceEnhanced Raman Scattering” (SERS), que es una técnica de detección
altamente sensible.
1.2.
Conductividad de las NPs
De manera breve no podemos pasar por alto que Debido a la distribución de cargas
positivas y negativas sobre la superficie, la NP metálica presenta una carga negativa.
Esto provoca que las nanopartículas metálicas son conductoras. En presencia de
campos electromagnéticos, podemos provocar polarización.
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1.3.
Propiedades superficiales de las NPs
Una propiedad importante de las nanopartículas es su energía superficial ya que,
debido a su tamaño, poseen una apreciable fracción de sus átomos en superficie.




1.4.
Los átomos de la superficie poseen condiciones de contorno características
y diferentes a los átomos que están en el interior del material.
Estos átomos superficiales tienen menor cantidad de átomos vecinos y
cuentan con enlaces libres hacia el exterior. Gracias a este fenómeno, estos
átomos presentan una fuerza neta de atracción hacia el interior del material,
lo que reduce la longitud e sus enlaces internos y las constantes de la red
cristalina.
Existe una energía extra como consecuencia de la asimetría de los átomos
superficiales en comparación con los interiores.
La estabilidad de una suspensión de nanopartículas pasa por el control de
las energías superficiales.
Síntesis de NPs
Aunque no nos vamos a centrar en el tema de la síntesis, pues es extenso y complejo, y
no es necesario profundizar en este tema para la asignatura a la que concierne el
trabajo, es necesario entender el proceso de formación de las nanopartículas y dar
algunas pinceladas a nivel básico sobre la síntesis.
Para la síntesis de nanopartículas podemos emplear métodos muy diversos. La división
que podemos realizar es entre métodos químicos o físicos. No todos los métodos
pueden realizar toda la etapa de formación de las NPs (se complementan).
1) Métodos Químicos: base en reacciones Red-Ox (Oxidación-reducción)
i)
Método semilla-crecimiento: Es la técnica primera técnica que se desarrolló,
aunque se ha renovado en la actualidad mejorando el control del tamaño de las
nanopartículas obtenidas. Se basa en emplear agentes reductores, como un
citrato (que además funciona de estabilizador). Desde una sal metálica (por
ejemplo, para nanopartículas de oro, podemos emplear HAuCl4) obtenemos
semillas cristalinas o “seeds” (en nuestro ejemplo, Au3+) a partir de un agente
reductor (Nucleación). Después de esto, se produce un crecimiento de las
semillas hasta la formación de las nanopartículas, dependiendo de la velocidad
de crecimiento podemos obtener distintas geometrías o procesos de formación.
Mediante este método se pueden obtener partículas de 5-40 nm.
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ii) Método de Brust: se emplea borohidruro de sodio (NaBH4) como reductor y el
dodecanotiol (CH3-(CH2)10-CH2SH) como estabilizante. En este método, el AuCl4se transfiere desde su fase en disolución al tolueno empleando un surfactante
(TOAB) y es reducido por el citrato de sodio en presencia del dodecanotiol. Con
este método se generan nanopartículas muy pequeñas (1-5 nm) con una gran
estabilidad por la fuerte interacción tiol-Au.
iii) Empleo de disolventes como poliol o DMF (n-dimetilformamida)
iv) Deposición por vapor químico: consiste en la vaporización de los precursores
de la reacción en la superficie de un sustrato aplicando una temperatura
elevada.
v) Sustancias anfifílicas: se basa en el empleo de microemulsiones, donde se
controla el tamaño de las nanopartículas controlando el crecimiento de micelas
en la microemulsión. Con sustancias anfifílicas se puede controlar el crecimiento
direccional ya que se pueden emplear surfactantes especiales (como el CTAB)
que se peguen en regiones específicas y permitan crecimientos por otras partes.
vi) Métodos electroquímicos: se basan en la aplicación de un potencial entre dos
electrodos, lo que provoca una corriente y, por tanto, produce reacciones de
oxidación-reducción del material en la disolución.
2) Métodos físicos (la mayoría de estos métodos sólo sirven en la nucleación de las
sales o sólo pueden intervenir en alguna fase de semilla-crecimiento)
i)
ii)
iii)
iv)
v)
Descomposición térmica: se basa en la descomposición de los reactivos
mediante efecto térmico.
Deposición por vapor físico: análogo al químico empleando técnicas físicas
para evaporar (haz de electrones, láser pulsante…).
Microondas: se puede aprovechar el calor de microondas en el proceso de
formación de nanopartículas. Se crea interacción de la radiación
electromagnética con el momento dipolar de las moléculas.
Láser: la irradiación por láser puede emplearse en la generación de
nanopartículas. Esta técnica tiene un elevado coste monetario.
Ultrasonidos: los ultrasonidos permiten controlar la velocidad de reducción del
oro, por lo que son muy utilizados.
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2.
Sensores ultrasensibles con NPs
La detección de agentes químicos y biológicos tiene un papel fundamental en la
biomedicina, las ciencias forenses y medioambientales, así como en la fabricación de
defensas anti-bioterrorismo. El desarrollo sensores ultrasensibles y rentables requiere
una tecnología muy avanzada y conocimiento de química, biología y física de
Materiales. En general, los sensores tienen dos componentes fundamentales: un
elemento de reconocimiento para que se realice una unión selectiva con los analitos
objetivo y un componente transductor para la señalización de dicha unión. La
eficiencia de un sensor se mide en términos de tiempo de respuesta, S/N ratio,
selectividad y límites de detección.
Así pues, diseñar sensores de gran eficacia depende del desarrollo de nuevos
materiales para tratar de optimizar ambos componentes. Los nanomateriales tienen
propiedades fisicoquímicas únicas que pueden ser de gran utilidad a la hora de crear
nuevos procesos de reconocimiento y de transducción en modernos sensores químicos
y biológicos, así como para la mejora del S/N ratio debido a la miniaturización de los
elementos de los sensores.
Las nanopartículas de oro (Au NPs) poseen distintas propiedades físicas y químicas
(que ya comentamos en la introducción del trabajo) que pueden convertirlas en unos
excelentes cimientos para la creación de nuevos sensores.
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Las principales ventajas al trabajar con nanopartículas de oro son las siguientes:

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


Se pueden sintetizar, como ya sabemos, de muy diversas maneras y se pueden
estabilizar.
Poseen unas propiedades ópticas únicas.
Tienen una excelente biocompatibilidad.
Las propiedades de las Au NPs pueden variarse cambiando el tamaño, la forma
y su ambiente químico. Por ejemplo, la unión entre nuestro elemento de
reconocimiento y un analito, puede generar cambios en las propiedades de una
Au NP funcionando como transductor, tales como en el plasmón de resonancia,
la conductividad o el comportamiento redox, lo que a su vez puede generar
como respuesta una señal detectable.
Ofrecen una plataforma adecuada para una multifuncionalización con una
amplia gama de ligandos orgánicos o biológicos para la unión selectiva
y la detección de pequeñas moléculas y objetivos biológicos (los iones o
moléculas que rodean a un metal, en nuestro caso a las Au NPs, en un complejo
se llaman ligandos).
Todas estas ventajas al utilizar nanopartículas de oro como elemento sensorial ha
proporcionado multitud enfoques innovadores en la detección de iones metálicos,
moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, células malignas… de manera rápida y
eficiente.
En este apartado del trabajo, vamos a discutir diferentes estrategias de detección y los
principales avances en la utilización de Au NPs para la detección de
cantidad de analitos de interés biofísico, tales como moléculas orgánicas, proteínas,
ácidos nucleicos, y microorganismos.
2.1.
Sensores por calorimetría
La agregación de Au NPs de tamaños apropiados (d> 3,5 nm) induce un acoplamiento
de plasmón superficial entre partículas, que provoca un cambio de color visible del rojo
al azul en concentraciones nanomolares. El cambio de color durante la agregación de
Au NPs (o redispersión de un agregado) proporciona una plataforma práctica para la
detección colorimétrica basada en la absorción de cualquier analito objetivo que
directa o indirectamente desencadena la agregación o redispersión de Au NPs.
2.1.1. Detección de moléculas orgánicas pequeñas
Empleando conjuntos de concanavalina A (Con A: proteína globular de origen vegetal)
con Au NPs recubiertas con dextrano (polisacárido complejo y ramificado formado por
numerosas moléculas de glucosa) se pueden detectar los niveles de glucosa en
sangre. La presencia de glucosa en el medio se une a la concanavalina, provocando la
liberación de la cubierta de dextrano de las Au NPs. Dependiendo del dextrano que se
libere, que puede controlarse fácilmente por cualquier técnica de espectrometría
convencional, como la Uv-Vis, con un rango de detección de glucosa de 1-40 mM.
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Debido al amplio rango de detección, este sistema ser potencialmente útil para
detectar el nivel de glucosa en sangre en las personas sanas (3-8 mM) y en los
diabéticos (2-40 mM).
Los polímeros de impresión molecular (MIP: polímeros muy estables que no se
degradan bajo la acción de enzimas, calor, pH, presión o disolventes orgánicos) con Au
NPs incrustadas se pueden utilizar como un sensor calorimétrico para la adrenalina. En
ausencia de adrenalina, el gel encogido de MIP cerca de las Au NPs. Cuando hay
adrenalina, el gel de MIP se hincha y provoca un cambio en el color azul
banda de absorción del plasmón de las Au NPs inmovilizadas, con un rango dinámico
de detección de adrenalina de 5 µM a 2 mM.
Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla (por ejemplo, el ssDNA y
ssRNA), aislados de oligonucleótidos por selección in vitro, mediante enriquecimiento
exponencial en presencia del ligando (método SELEX), denominados anticuerpos
químicos. Estas estructuras de ADN o ARN funcionales pueden unirse a una amplia
variedad de objetivos con alta afinidad y especificidad. Métodos analíticos basados en
aptámeros se han utilizado con las Au NPs como plataforma, con el objetivo de la
detección colorimétrica de pequeñas moléculas orgánicas. Por ejemplo, se ha diseñado
un sistema de sensor de adenosina, que se compone de agregados de nanopartículas
que tienen tres componentes funcionales: dos tipos de Au NPs modificadas con ssDNA
y una molécula de ADN enlazante que lleva un aptámero de adenosina. Inicialmente,
las Au NPs y el ADN enlazante se suspenden en una disolución para generar Au NPs
púrpuras. En el proceso de agregación de las Au NPs, dos pares de moléculas de ADN
enlazante se emparejan, respectivamente, con dos Au NPs funcionalizadas con ssADN
donde una parte del aptámero de adenosina también forma parte del proceso de
hibridación de ADN. Cuando la adenosina está presente en el sistema, el aptámero
cambia de estructura al enlazar con la adenosina. El proceso de unión de la adenosina
tiene como resultado el desmontaje de los agregados de Au NPs provocando un
cambio de color de azul a rojo. Utilizando este sistema, la adenosina puede detectarse
en concentraciones de 0,3 a 2 mM.
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2.1.2. Detección de Oligonucleótidos
La detección de mutaciones genéticas es un objetivo crucial para el diagnóstico que
conduce a un creciente interés en pruebas de detección basadas en ácidos nucleicos
para el diagnóstico precoz de muchas enfermedades incluyendo el cáncer, en el que
nos centraremos más adelante.
Aunque los métodos habituales para de detección de oligonucleótidos son la
fluorescencia (que más adelante comentaremos) y la radiactividad se ha demostrado
que los métodos calorimétricos con Au NPs son realmente competitivos.
La fabricación de Au NPs funcionalizadas con cadenas de ADN tiolado permitió adaptar
las propiedades de las sondas de nanopartículas de acuerdo con este método. Este
descubrimiento ha estimulado el uso extensivo de Au NPs agregadas con
oligonucleótidos para detección calorimétrica de otros oligonucleótidos gracias a la
fabricación de estructuras de ensamblaje. En este enfoque, dos sondas de Au NPs
modificadas con ssADN se utilizan para la detección colorimétrica de oligonucleótidos
objetivo. Las secuencias de bases en las sondas de Au NPs se diseñan de manera que
son complementarias a ambos extremos con las de los oligonucleótidos que queremos
estudiar. De esta manera, cuando las Au NPs agregadas, con un color característico,
están en presencia de los oligonucleótidos objetivo, cambian de color como un
resultado de la hibridación de la cadena de ADN. El apareamiento altamente especifico
de bases de hebras de ADN junto con la intensa capacidad de adsorción de las Au NPs
permite la una detección colorimétrica (subpicomolar) cuantitativa de oligonucleótidos.
2.1.3. Detección de proteínas.
Muchos estados de enfermedad (por ejemplo, cáncer) se asocian a menudo con la
presencia de ciertas proteínas (biomarcadores) o concentraciones irregulares de
proteínas. Las Au NPs se han aplicado con éxito para la detección colorimétrica de
dichas proteínas. Una amplia gama de Au NPs funcionalizadas con carbohidratos se
han preparado para la detección de proteínas vinculadas carbohidratos. Por ejemplo,
la agregación de β-D-lactopiranosa (Lac) con Au NPs funcionalizadas ha sido utilizada
para la detección de Recinus communis aglutinina (RCA120). El grado de agregación
coloidal es proporcional a la concentración de proteínas, lo que permite que este
método sea útil en la detección cuantitativa de lactina. Con este sistema se logra una
alta sensibilidad de detección de lactina (1 ppm).
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Posteriormente, la densidad de Lac en la superficie de la partícula se modula para
controlar el intervalo de detección concentración de lactina. Se demostró
experimentalmente que se requiere una densidad crítica de Lac (> 20 %) para
desencadenar la agregación inducida por lactina.
El ensamblaje de proteínas en gliconanopartículas de oro también ha sido desarrollado
para la identificación fácil y sensible de las interacciones proteína-proteína. Por
ejemplo, parejas de unión de concanavalina A (Con A) se han identificado mediante la
utilización de los conjuntos de Con A y Au NPs modificadas con manosa
(monosacárido), ya que las interacciones proteína-proteína interrumpen la unión inicial
nanopartícula-proteína. Del mismo modo, una serie de Au NPs funcionalizadas con
gluco- y mano- oligosacárido se pueden utilizar para detectar carbohidratos y
proteínas utilizando la lactina.
Los ditioles pueden entrecruzarse con nanopartículas de oro, en particular, péptidos
funcionalizados con ditiol se han utilizado para ensamblarse con Au NPs y generar
sensores para detectar peptidasas (son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de
las proteínas). Se han diseñado dos terminales C- y N- cisteinil derivados de sustratos
peptídicos específicos para medir la trombina y el factor genético letal. Para esto, los
péptidos se tratan primero con los analitos. Posteriormente, la disolución se prepara
con Au NPs de 12 nm estabilizadas con citrato. La agregación de nanopartículas se
induce por los péptidos intactos en ausencia de las peptidasas objetivo, mientras que
los péptidos con peptidasa adherida no afectan a las Au NPs. Más tarde, se han
simplificado aún más estas dos etapas empleando Au NPs con péptidos Fmoc
protegidos (9-fluorenilmetoxicarbonilo: es un grupo protector que se elimina
normalmente del extremo N-terminal del péptido), que llevan cisteína anclada. La
presencia de termolisina en el sistema se adhiere los ligandos peptídicos, dando lugar
a la dispersión de las Au NPs, provocando un cambio de color en la disolución de Au
NPs de color azul a rojo, con un aumento de la sensibilidad.
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2.2.
Sensores por fluorescencia
Las nanopartículas de oro pueden servir como excelentes extintores de fluorescencia
para sensores basados en FRET debido a sus extraordinariamente altos coeficientes de
extinción molar y a su amplio ancho de banda energético.
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), también
llamada transferencia lineal de energía (en inglés, fluorescence resonance energy
transfer) es una interacción que ocurre solo a muy corta distancia entre dos estados de
excitación electrónica de dos moléculas fluorescentes en la que la longitud de onda de
emisión de una de ellas coincide con la de excitación de la otra. Las moléculas de
aceptor y donante deben estar muy próximas (10-100 Å). El espectro de absorción del
aceptador debe superponerse al espectro de emisión de fluorescencia del donante. Si
extinguimos la fluorescencia del fluoróforo aceptador (fotobleaching) aumenta la
intensidad de la emisión del fluoróforo donador. Lo que hacemos es destruir la FRET
excitando fuertemente con el láser adecuado (488 nm para GFP) con lo que el
aceptador ya es incapaz de absorber fotones, al excitar al fluoróforo donador (BFP con
350 nm) la intensidad de emisión de éste último aumenta respecto a cuándo se
producía FRET porque los fotones que emite ya no son absorbidos por el aceptador.
2.2.1. Sensores basados en FRET entre QDs y Au NPs
Quantum dots semiconductores (QDs) se han utilizado para métodos para la detección
de proteínas con Au NPs basados en FRET, utilizando la gran eficiencia y la estabilidad
de estos fluoróforos.
Una técnica competitiva para el ADN fluorescente se basa en la identificación mediante
QDs y Au NPs, donde se ensamblan Au NPs con Quantum Dots de Seleniuro de
Cadmio (CdSe QDs) a través de hebras de ADNc (ADN de doble cadena) cortas,
causando la extinción de la fluorescencia de los CdSe QDs. La adición de
oligonucleótidos complementarios separa la ADN-Au NP del ADN-QD, lo que tiene
como resultado una restauración de la fluorescencia.
Se ha conseguido también la detección colorimétrica simultánea y de fluorescencia de
la adenosina y la cocaína en una única solución con sensores de QDs modificadas con
aptámeros.
Se ha también elaborado un método para inhibir enzimas usando Au NPs biotinaladas
y Quantum Dots recubiertos de estreptavina como pareja de FRET donador-aceptor.
Las Au NPs biotinaladas se unen específicamente con los QDs recubiertos y al formar
las uniones la fluorescencia se apaga. Sin embargo, la presencia de avidina
(glicoproteína tetramérica) libera las Au NPs biotilanadas de los Quantum Dots a través
de un enlace con el biotinilado de las Au NPs.
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2.2.2. Estrategia de la “Lengua Química” para la detección de proteínas,
patógenos y células.
La detección basada en la estrategia de “Lengua Química” ofrece una alternativa útil
ya que es una técnica de detección basada en variaciones. Utiliza interacciones
diferenciales selectivas para generar patrones que pueden utilizarse para detectar
analitos o cambios en mezclas complejas.
Recientemente se ha diseñado un sensor de proteínas basado en la técnica de la
Lengua Química. El sensor prototipo se fabrica a partir de seis Au NPs catiónicas con
una “lengua” de radicales de diferentes estructuras y un polímero tipo p-aniónico (PPE).
La composición electrostática de las Au NPs y con el polímero provocan una extinción
de la fluorescencia del polímero (fluorescencia "OFF") a través de la transferencia de
energía. Ahora bien, si se introducen proteínas como analito, éstas provocan una
ruptura polímero-Au NPs ya que se éstas se pegan a las nanopartículas vía enlace,
provocando el polímero recupere su fluorescencia (fluorescencia “ON”).
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Las interacciones proteína-nanopartícula son variables, lo que lleva a un patrón como
“huella dactilar” de las diferentes proteínas, que se mide mediante LDA (Análisis de
Discriminación Lineal). Aquí ponemos un ejemplo de dos proteínas y como su patrón es
variable. Según sea la estructura de cada nanopartícula, las proteínas reaccionan de
diferente manera, lo que se refleja en un patrón. Con este método se ha logrado
identificar proteínas de unos 500 nm en seroalbúmina humana.
Sistemas de Au NPs conjugadas con polímeros se han utilizado para detectar e
identificar bacterias y patógenos. A partir de tres Au NPs catiónicas y un polímero PPE
aniónico se puede fabricar un sensor. Análogamente al caso anterior, la presencia de
bacterias altera los ensamblajes templados inicialmente y se produce una restauración
de la fluorescencia de la PPE. A partir de los distinta patrones de respuesta de
fluorescencia, el conjunto de sensores es capaz de identificar 12 bacterias, incluyendo
tanto especies Gram-positivas (por ejemplo, A. azurea ó B. subtilis) y Gram-negativas
(por ejemplo, E. coli ó P. putida), así como tres cepas diferentes de E. coli.
Los sistemas de polímeros-Au NP se han utilizado para diferenciación rápida y eficaz
entre células normales, cancerosas y metastásicas. Las respuestas de fluorescencia
analizada por LDA son capaces de distinguir también entre diferentes tipos de células
normales tales como de pecho, isogénicas o epiteliales.
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2.3.
Sensores electroquímicos y electrolíticos
Las nanopartículas de oro cuentan con una excelente conductividad, una gran área
superficial y propiedades catalíticas que los hacen excelentes materiales para la
detección electroquímica de una amplia gama de analitos.
Las Au NPs pueden disminuir las sobretensiones de muchas reacciones electroanalíticas
y mantener la reversibilidad de las reacciones RedOx. Hay numerosos enfoques, tales
como interacción electrostática, deposición electroquímica y la mezcla de componentes
en una matriz con un electrodo, se aplican para depositar Au NPs en las superficies de
los electrodos. Por ejemplo, se han utilizado Au NPs como potenciadores
electroquímicos para sensores de quimioluminiscencia (ECL) electrogenerada.
2.3.1. Detección de químicos tóxicos y fármacos
Se pueden emplear nanopartículas de oro para la detección de iones tóxicos tales
como arsénico, mercurio, cromo o antimonio. También se pueden emplear electrodos
modificados con Au NPs para producir oxidación electrocatalítica y detectar químicos
peligrosos para los humanos como el monóxido de carbono o el óxido nítrico.
Diversos plaguicidas (atracina de metilo, carbofurano…) y fármacos (paracetamol,
prednisona…) se pueden detectar también a partir de esta vía.
Recientemente, se ha detectado isoniazida, un fármaco antituberculoso popular, por
absorción electroquímica de Au NPs de 70-100 nm en un gel derivado de una red de
silicato 3D con una sensibilidad de detección de 0,1 nM.
2.3.2. Detección de células con electrodos modificados con Au NPs
Geles de nanocompuestos Au NPs-quitosano (polisacárido lineal) se pueden utilizar
para la supervisión electroquímica de la adhesión, la proliferación y la apoptosis de las
células sobre los electrodos. Las células vivas inmovilizadas sobre un electrodo de
carbón vitrificado (GCE) mostraron una respuesta voltimétrica irreversible y mejorado la
resistencia de transferencia de electrones con un límite de detección de 8,71×102
células por mL. Por ejemplo, se inmovilizaron células de leucemia K562 en una
membrana microporosa de celulosa modificada con Au NPs y la eficacia del fármaco
antitumoral metrotexato se puede supervisar a través de la respuesta electroquímica de
dichas células. Del mismo modo, se inmovilizaron células de adenocarcinoma de
páncreas sobre un electrodo compuesto usando Au NPs y pasta de carbono para
determinar el efecto citotóxico del fármaco antitumoral adriamicina.
Recientemente, se ha desarrollado un sensor electrocatalítico para la específica
identificación de células tumorales. Con este sistema, las moléculas en la superficie
celular son reconocidas por anticuerpos conjugados con Au NPs empleando la
reducción de hidrógeno catalítico para proporcionar la detección celular. Este sistema
se muestra en la siguiente figura.
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2.3.3. Inmunosensores electroquímicos basados en Au NPs. Detección de
antígenos de superficie viral. Detección de inmunoglobulinas.
Los inmunosensores electroquímicos basados en Au NPs mejoran la transducción de la
señal electroquímica que produce la unión entre antígeno y anticuerpo,
proporcionando una mejor superficie para el mantenimiento de la estabilidad del
inmunorreactivo en la inmovilización. La inmovilización de anticuerpos en los
electrodos modificados con Au NPs se puede utilizar para detectar el antígeno de
superficie viral del virus de la hepatitis B (HBsAg) con unos límites de detección de 50
ng/L y 7,8 ng/mL. Del mismo modo, la detección de HBsAg se realizó por adsorción
electrostática del anticuerpo correspondiente en películas con multicapas de polímeros
recubiertas con superficie PTE, donde las Au NPs se encuentran encajadas, empleando
electrodos modificados con cistamina y Au NPs. Inmunosensores basados en el
montaje de multicapas de o-feniladiamina polimerizada y Au NPs se pueden utilizar
para detectar la efectividad de la vacuna “Japonesa B” contra la encefalitis con un
límite de detección de 6 × 10-9 log ufc/ml.
Inmunosensores de Au NPs basados en electroquímica se pueden utilizar para detectar
una amplia gama de analitos de pequeñas moléculas, en la que se incluyen algunas
sustancias carcinógenas (aflatoxina B1, naftaleno…), herbicidas (atracina) y hormonas
(como la gonadotropina, el marcador de la prueba de embarazo o la progesterona).
Por otra parte, la detección de diferentes proteínas en seroalbúmina humana también
es eficaz empleando este método electroquímico.
16
2.4.
Sensores basados en el plasmón de resonancia de las Au NPs
La interacción de la luz en la superficie de una película de metal puro excita ondas
electromagnéticas en la superficie y establece una resonancia con la onda de la luz
incidente, lo que resulta en la absorción de la luz.
Como ya comentamos en la introducción, este fenómeno se conoce como resonancia
de plasmones superficiales (SPR) y depende del índice de refracción de la región
interfacial. Las nanopartículas metálicas, tales como oro y plata, tienen una frecuencia
de resonancia de plasmón superficial (LSPR) muy localizada en longitudes de onda de
incidentes específicos, generando una fuerte dispersión de la luz y la aparición de
bandas de absorción. La intensidad y la frecuencia de la banda de absorción es una
característica del metal en particular de cada nanopartícula, además de ser altamente
dependiente de su tamaño y forma, así como del medio que la rodea.
Aprovechándose del plasmón de resonancia y sus propiedades se pueden realizar
diferentes sensores a partir de nanopartículas. A pesar de que numerosos biosensores
se han desarrollado utilizando nanopartículas de plata, nos centraremos en los sensores
basados Au NPs, como hemos ido haciendo a lo largo de esta sección del trabajo.
Se pueden utilizar Au NPs para mejorar la propagación de señales espectroscópicas del
SPR, aumentando así la sensibilidad del sensor. La amplificación de la señal se explica
por la interacción en el acoplamiento electrónico de la superficie propagación de los
plasmones.
2.4.1. Sensores de proteínas
La detección de proteínas a través de interacción antígeno-anticuerpo se puede
detectar a partir de fenómenos SPR gracias a la amplificación con Au NPs. Por ejemplo,
se ha elaborado de un sistema de inmunosensores SPR mejorados con Au NPs,
utilizando un antígeno o anticuerpo secundario funcionalizado con Au NPs para
amplificar la señal. Por ejemplo, una película de oro recubierta con el anticuerpo Fc
monoclonal específico antihumano IgG (α-H-IgG( Fc )) genera un pequeño cambio en
el plasmón después de añadir IgG humana y el segundo anticuerpo libre. En el cambio
en el plasmón, sin embargo, los tiempos son 28 veces mayores en comparación con un
experimento no amplificado cuando se sustituye el anticuerpo libre secundario por un
conjugado electrostático entre Au NPs y α-H-IgG (Fc). Con este método se ha
alcanzado una detección picomolar de la IgG humana. De manera similar, varios
inmunoensayos competitivos se han desarrollado utilizando señales SPR mejoradas con
Au NPs para detectar el inhibidor tisular de las metalopeptidasas de ser humano,
alérgenos, TNT, IgE humana y testosterona. La sensibilidad de estos métodos se
puede mejorar en cuanto a uso comercial empleando anticuerpos modificados con Au
NPs fluorescentes, dando lugar a la técnica llamado “localización de resonancia de
plasmón de superficie de fluorescencia con sensor de fibra óptica”.
17
2.4.2. Sensores basados en scattering del plasmón de resonancia.
Además de cambios en la absorción del LSPR, el fenómeno de dispersión del plasmón
de resonancia de las Au NPs proporciona una útil herramienta para diseñar sensores. La
dispersión del plasmón de Au NPs de 36 nm de diámetro es de 10 a 100 veces más
fuerte que, por ejemplo, los Quantum Dots. Se puede explotar este fenómeno a escala
nanométrica, por ejemplo, se han desarrollado inmunoensayos para detectar IgG
humano kanamicina y lisozima en orina.
Se ha desarrollado un método altamente selectivo y muy sensible para analizar la
hibridación del ADN usando plasmones de dispersión de una única Au NP como sonda.
Otros inmunoensayos se utilizaron para detectar biomarcadores de cáncer tales como
CEA, AFP en el rango fentomolar y reconocimiento con aptámeros para la trombina a
un nivel tan bajo como 2.72 pM. Recientemente, se ha desarrollado un sensor de
dispersión de luz LSPR para Ag+ con Au NPs no modificadas valiéndose de la
propiedad de reconocimiento específico del Ag+ del reconocimiento específico con una
base de citosina-citosina. La adición de Ag+ elimina el oligonucleótido de la superficie
de la Au NP causando como consecuencia la agregación con un aumento drástico del
valor mínimo de la intensidad de la dispersión LSPR. La intensidad de dispersión de luz
LSPR Intensidad es proporcional a la concentración de Ag+, con un límite de detección
de 62 nM.
Finalmente, cabe comentar una técnica de biosensores utilizando dispersión SPR con la
que se pueden conseguir imágenes y espectros de absorción SPR a partir de Au NPs
funcionalizadas con anti-EGFR para el diagnóstico de las células cancerosas epiteliales.
Las Au NPs funcionalizados se unen 600 % más fuerte a las células malignas que a las
células normales, lo que provoca una absorción más nítida en la SPR con un
corrimiento al rojo en la banda de absorción.
2.5.
Sensores basados en SERS
El fenómeno físico que fundamenta la espectroscopia Raman es la dispersión inelástica
de fotones por una molécula que tiene cuantizada. La dispersión Raman vibracional es
sensible a los diferentes modos de vibración y por consiguiente puede proporcionar
una "huella digital" de las moléculas objetivo. Sin embargo, la aplicación directa de esta
técnica en la detección e identificación de moléculas de analito está severamente
restringida debido a la baja eficiencia de la dispersión inelástica de fotones por
moléculas, lo que se provoca una señal muy débil.
18
La limitación de la baja intensidad de dispersión surge del hecho de que las secciones
transversales de las moléculas bajo dispersión Raman son generalmente pequeñas,
típicamente 10-30-10-25 cm2/molécula, 10-15 órdenes de magnitud inferior que, por
ejemplo, la de la sección transversal de fluorescencia. Sin embargo, en presencia de
nanopartículas o metales específicos la intensidad de dispersión Raman de una
molécula se puede mejorar en hasta en un orden de magnitud de 1014. Este fenómeno
se atribuye a una mejora local del campo electromagnético inducido por el plasmón de
resonancia superficial y se llama superficie mejorada “Surface-Enhanced Raman
scattering” (SERS), propiedad que ya comentamos en la introducción de este trabajo. La
mejora del campo depende del tamaño, forma, orientación y de la agregación de la
nanopartícula. La gran mejora en la señal detectable junto con las huellas dactilares
moleculares únicas que se generan provoca que el SERS sea una poderosa herramienta
para la detección de múltiples analitos, con la capacidad de lograr una detección a nivel
molecular. Vamos a ver algunos ejemplos de utilización de dicha técnica.
2.5.1. Detección de proteínas
Se han utilizado Au NPs en inmunoensayos basados SERS para detección de proteínas.
Por ejemplo, se pueden utilizar Au NPs de 30 nm marcadas con una monocapa de un
fuerte dispersor Raman (5-tiol-2-nitrobenzoato de etilo) seguido por una capa de
anticuerpos con enlaces covalentes. Con este sistema se han utilizado anticuerpos
monoclonales para la detección de PSA libre. La sensibilidad de este sistema ha
mejorado debido a su diseño de un único sensor, que no sólo minimiza la distancia
entre el marcador y la superficie de las partículas, sino que también maximiza el
número de marcadores en cada partícula. El límite de detección de este método es de
~1 pg·ml-1. Se ha demostrado un sistema de detección sin marcadores para detectar
avidina mediante autoensamblaje entre avidina y nanocables de Au y Au NPs
biotinaladas. El proceso inducido de autoensamblaje de la avidina crea "puntos
calientes" entre los nanocables y las Au NPs que mejoraron sustancialmente la señal de
la dispersión Raman. Un sensor basado de SERS basado en la formación de "puntos
calientes” entre nanocables y Au NPs también se ha utilizado para detectar α-trombina
humana. Se pueden utilizar también Au NPs funcionalizados con un aptámero
específico para la detección de trombina basado en su interacción electrostática y
proporcionado un límite de detección de 20 pM. Han utilizado Au NPs funcionalizadas,
ya sea con ligandos de proteínas o anticuerpos y tintas para realzar la dispersión
Raman para realzar las interacciones de pequeñas moléculas-proteína ó también
interacciones proteína-proteína. Se pueden detectar interacciones proteína-ADN
empleando SERS basados en Au NPs. El autoensamblaje de Au NPs funcionalizadas con
se ha utilizado para la detección SERS de peptidasas. También se pueden emplear
técnicas basadas en SERS para detectar la actividad de la enzima fosfatasa alcalina a
concentraciones increíblemente bajas. Finalmente, se puede también realizar una
detección rápida de bacterias patógenas a partir de SERS basado en el empleo de Au
NPs.
19
2.5.2. Detección de Oligonucleótidos.
Se pueden utilizar sondas de Au NP marcadas con oligonucleótidos y tintes Raman
para la detección de objetivos ADN y ARN a base de SERS. Para detectar la presencia
de hebras específicas del ADN se utilizan sondas de Au NPs marcadas con tinte que
son capturadas por las cadenas de oligonucleótidos objetivo. Las Au NPs marcadas con
tintes son capturadas por las hebras del ADN objetivo, seguidas por una mejora de
plata Ag+, generando señales detectables desde los tintes inmovilizados en las
partículas, con un límite de detección de 20 fM. Este método fue capaz de discriminar
polimorfismos de nucleótido en relación a seis virus diferentes.
Se pueden también incorporar marcadores no fluorescentes Raman en Au NPs
conjugadas con ADN (~ 30 nm) para la detección de SERS. En este sistema, la cobertura
de la superficie de los marcadores Raman en la superficie de la Au NP se modulada
para controlar la intensidad de la señal Raman de las sondas.
También se pueden detectar secuencias específicas de ADN utilizando la huella digital
espectroscópica de SERS a partir de sondas de Au NPs marcadas con
oligonucleótidos. Se ha desarrollado un nuevo biosensor basado en la nanoconexión
para la detección subatomolar de VIH-1 ADN. A partir de un modelo de captura
indirecta se puede elaborar un método de detección a base de SERS utilizando Au NPs
mediante el que se sistema se pueden describir segmentos de genes extraídos de
células.
20
3.
Au NPs para el diagnóstico y tratamiento
del cáncer.
El cáncer es una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo. Se
caracteriza por la proliferación incontrolada de células malignas cuyo origen son las
mutaciones genéticas. El principal tratamiento es la cirugía, que, sin embargo, se
encuentra limitada a la hora de acceder a los tumores. Los medicamentos
quimioterapéuticos también se utilizan, pero su acción provoca una enorme cantidad
de efectos secundarios, porque no se limita sólo a afectar a las células cancerosas, sino
también al resto. Los medicamentos pueden ser transportados de manera selectiva a
las células cancerosas, empleando vectores (en términos biológicos, un vector es un
agente que sirve como medio de transporte) con el fin de evitar este problema. Por lo
tanto, el uso de las nanotecnologías en el campo de la medicina está creciendo de
forma exponencial. Lo más utilizados para el cáncer de la nanotecnología incluye
polímeros, dendrímeros, liposomas, perfluorocarbonos, los quantum dots, nanotubos,
nanohilos y nanopartículas de oro (Au NPs)
En este trabajo vamos en centrarnos en el caso de Au NPs, que han sido objeto de
considerables estudios recientes. Se ha demostrado que pueden reconocer
selectivamente las células cancerígenas y sus propiedades las hacen cada vez más
atractivas como vectores de diagnóstico y quimioterapéuticos. Las propiedades ópticas
que a estas alturas ya conocemos bien (plasmón de superficie, SPB), son lo que hace
que los nano-objetos sean ideales para imágenes médicas e incluso para terapia
fototérmica. Este trabajo se dedica particularmente a las aplicaciones de las Au NPs
vectorizadas y funcionalizadas para el diagnóstico del cáncer y su tratamiento.
3.1.
Vectorización de las Au NPs
Los tumores incluyen regiones que están altamente vascularizadas para suministrar los
nutrientes y el oxígeno que conduce al crecimiento tumoral (angiogénesis). Las
nanopartículas se pueden acumular por difusión o convección a través de la
vascularización al tumor. En particular, la focalización pasiva del polietilenglicol
también se puede lograr por retención en los intersticios del tumor (aumento de la
permeabilidad y retención, EPR). Los vectores empleados para el transporte de
fármacos no sólo deben adaptarse fisiológicamente a las propiedades físico-químicas
para dicho transporte, sino también tener en cuenta la resistencia farmacológica a nivel
celular. Un buen vector debe ser soluble en medios acuosos, ser dirigido únicamente
hacia las células cancerosas y sus productos de degradación no deben ser tóxicos para
el organismo.
El taxano (impide la división celular), el paclitaxel (nombre comercial “taxol”:
disfunción del ensamblaje de los microtúbulos, segregación cromosómica y división
celular) y docetaxel (o taxoter, de comportamiento análogo al taxano) son la mayoría
de los medicamentos que actualmente se utilizan frente al cáncer.
21
Tales taxoides se unen a un polímero de tubulina provocando la promoción de su
polimerización, lo que conduce a la detención del ciclo celular y la apoptosis. Estos
taxoides también se administran en combinación con otros fármacos que funcionan de
un mecanismo distinto tales como cis-platino (cis-PtCl2(NH3 )2) y doxorrubicina. Otros
productos naturales recientemente descubiertos contra el cáncer que tienen un
mecanismo taxoide -incluyendo epotilonas, discodermolida, eleuterobina, laulimalida y
peloruside- tienen severas limitaciones ya que los fármacos de tipo taxoide son pobres
en solubidad en agua y tienen toxicidad no selectiva a las células tumorales y la
inactividad contra células resistentes a los medicamentos. La solubilidad de estos
taxoides se puede aumentar con la adición de un surfactante, Cremophor EL (una
mezcla 1:1 de polietoxilado de aceite de ricino y etanol), pero puede provocar
problemas de alergia debido a la liberación de histamina e hipersensibilidad. El vector
debe aumentar la solubilidad en el organismo donde la falta de selectividad es otro
problema importante. De hecho, puede tener efectos tóxicos sobre los órganos no
objetivo y provocar úlceras, anomalías cardíacas, neurotoxicidad y la supresión de la
la médula ósea. Las dosis necesarias debido a esto se deben reducir y el
tumor no queda totalmente suprimido. Entonces, el vector debe encapsular el fármaco
durante su circulación en la sangre y liberarlo sólo cerca de las células cancerígenas.
Por lo tanto, un taxoide asociado con un vector es diez veces más eficiente que el
taxoide solo. La doxorrubicina (DO), un antibiótico de antraciclina, es otra sustancia
quimioterapéutica que se utiliza comúnmente en el tratamiento de una amplia variedad
de cánceres. Se relaciona con la daunomicina, un producto natural (o daunorrubicina)
utilizado especialmente contra leucemia mieloide aguda y leucemia linfática aguda.
Estos medicamentos son agentes que se unen rápidamente al intercalado de ADN
provocando cambios en estructuras del núcleo de la célula y bloqueando la síntesis de
los ADN y ARN así como la proliferación de las células. Cuando el DOX se entrega
solo, tiene un número de efectos secundarios dañinos, y en particular, pone en peligro
la vida debido al daño en el corazón. El fluorouracilo, también llamado 5FU (familia
anti-metabolito), es un medicamento contra el cáncer que está involucrado en la
síntesis de ácidos nucleicos. Por lo general se administra para tratar el cáncer de
intestino, mama, piel, estómago y garganta (esófago). Su toxicidad es reducida cuando
se asocia a un vector, y, por tanto, puede llegar una cantidad más grande a las células
cencerígenas.
22
El principio de funcionamiento de un vector consiste en el uso de la afinidad de ciertos
sustratos para metabolitos receptores. De hecho, las células cancerígenas poseen
mayores tasas de metabolitos en comparación con las células normales, lo que
conduce a un entorno hipóxico que induce un metabolismo anaeróbico que disminuye
el pH de las células cancerígenas. Por lo tanto los receptores de las células cancerígenas
atraen metabolismos primarios (péptidos, polisacáridos, ácidos grasos, etc.) La
asociación entre el vector y el fármaco consiste en la unión del fármaco a un vector que
reconoce la las células cancerígenas. El vector unido al fármaco debe tener una afinidad
selectiva para las células cancerígenas, una buena estabilidad en la circulación
sanguínea y no ser tóxico para las células normales. La unión con el taxoide se realiza
mediante una reacción de esterificación o relacionada. Se produce en el sitio de C2’. El
enlace éster es fácilmente hidrolizable o depredado por enzimas para liberar el
fármaco. Las Au NPs y los dendrímeros se utilizan a menudo como vectores, ya que
permiten aumentar el tiempo de circulación de la sangre. Estos vectores protegen el
medicamento de posibles transformaciones dentro del organismo, y pueden ser
específicos, biodegradables y no tóxico (''bala mágica'').
3.2.

Ventajas de las Au NPs como vectores
Biocompatibilidad: Con el fin de ser útil para el tratamiento del cáncer, las Au NPs
deben ser no citotóxicas, es decir, no tóxico para las células normales. Esta
citotoxicidad ha sido muy estudiada, y varios parámetros están implicados: la
concentración, la naturaleza de los ligandos unidos al núcleo de Au NPs y las
células objetivo.
Los resultados indicaron que algunas Au NPs son tóxicas en una concentración de
100 mM para las células cancerígenas, pero no para células inmunológicas. Los
precursores cetiltetra(metil) bromuro de amonio (CTAB) y HAuCl4, que se utilizan
para su síntesis son tóxicos , sin embargo, a la misma concentración de 100 mM.
Por tanto, es esencial purificar cuidadosamente las Au NPs. Los ligandos de las Au
NPs cargadas positivamente son generalmente tóxicos a concentraciones más
débiles que los los ligandos cargados negativamente, serían citotóxicos. Por
ejemplo, Au NPs funcionalizadas con ligandos con terminales de tri(metil)amonio
alquiltiolato son más tóxicos que los terminados con carboxilatos.
Los efectos de la utilización de Au NPs y su distribución dependen de la forma en
que se administran (subcutánea, intramuscular o por superficie) y de su tamaño. Las
Au NPs llegan a los ganglios linfáticos más fácilmente cuando se administran de
forma subcutánea.
23
Las Au NPs tienden acumularse principalmente en la vejiga, el hígado y los
pulmones (independientemente de su tamaño), pero su distribución en los tejidos
depende de su tamaño. De hecho, las Au NPs de 10 nm se acumulan en numerosos
tejidos, mientras que las de 200 nm se han detectado principalmente en el hígado,
la vejiga, en la sangre, el cerebro y el páncreas.

Detección por imagen gracias a la banda de plasmón superficial (SPB): El color
de las Au NPs está relacionado con su absorción de plasmón que lleva a la banda
de plasmón superficial (SPB) por lo general alrededor 520 nm (para partículas de
oro, varía según el material) y se conoce mucho. El SPB ha sido interpretado de
manera teórica por Mie. El SPB es debido a la oscilación colectiva de electrones
libres de la banda de conducción en las superficies de las Au NPs provocado por el
campo electromagnético de la luz entrante. Como ya hablamos en la introducción,
está influenciado por la forma, tamaño, la naturaleza de las nanopartículas, la
constante dieléctrica media, la distancia entre las partículas y la temperatura. Por
ejemplo, cuando el aumenta el tamaño de la Au NP, el SPB desplaza a una longitud
de onda mayor. Como consecuencia, la anchura de esta SPB depende de la
distribución de tamaño. El SPB es muy útil para el diagnóstico de cáncer utilizando
diversas técnicas de imagen e incluso para la terapia del cáncer usando la
fototérmica, técnica para la destrucción de las células cancerígenas. La sensibilidad
del SPB en la región visible para parámetros físicos y químicos es extremadamente
útil para la formación de imágenes del tumor. Además de TEM, las principales
técnicas de imagen utilizadas son la microscopía óptica, que implica la dispersión
de luz en un campo microscópico oscuro (Dark Field Light Scattering) y las
imágenes fototérmicas, DIC o miroscopía fotoacústica, porque la dispersión de
luz provoca el calentamiento de la “vecindad”. Otras técnicas son la fluorescencia,
la tomografía de coherencia óptica, microscopía multifotónica SPR utilizando
un microscopio láser de barrido para medir el aumento multifotónico de los Au
NPs, cuando la frecuencia de plasmón está en resonancia con la luz láser, y
micrografía de rayos X. La asociación de estas técnicas de detección con la
funcionalización de Au NPs las hace un excelente soporte para la detección de
proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas, como ya vimos con los
sensores de Au NPs. En conjunto, estos métodos de biodiagnóstico representan dar
un paso significativo hacia delante en la lucha contra el cáncer. Aquí vemos una
figura con las imagénes de las diferentes técnicas.
24
3.3.
Au NPs para el diagnóstico del cáncer
3.3.1. Uso del SPB para el diagnóstico del cáncer
Las Au NPs han sido utilizadas en el diagnóstico del cáncer, con ventajas con respecto a
los Quantum Dots y tintes orgánicos de baja toxicidad, pues tienen mucho mejor
contraste que los tintes orgánicos y las propiedades ópticas mejoradas. El enfoque de
biodiagnóstico más frecuente implica el conocimiento de las secuencias de nucleótidos,
que es crucial para el diagnóstico de enfermedades genéticas como el cáncer.
Conjugados de Au NPs-oligonucleótidos se usan para tal diagnóstico, debido a sus
propiedades ópticas.
25
La hibridación no se limita a la unión de los nucleótidos a la secuencia objetivo, sino
que consiste en la formación de una red polimérica extensa por colorimetría. De hecho,
las Au NPs son de color rojo, pero la hibridación de los nucleótidos con las Au NPs
acorta la interdistancia entre Au NPs, y las Au NPs hibridadas se convierten en azul. Por
otra parte, las Au NPs hibridadas con nucleótidos exhiben una menor transición de
absorbancia frente a la temperatura que cuando están desnaturalizadas
Esta característica nos permite diferenciar secuencias específicas imperfectas y por lo
tanto nos sirve para detectar enfermedad. Parte de las Au NPs se funcionalizan con la
mitad de la secuencia complementaria de la secuencia objetivo, y la otra parte con la
otra mitad. Cuando las Au NPs están alineadas cola con cola, se detectan
imperfecciones tales como inserciones. En la figura A vemos alineación cabeza-cola y
en la B cola-cola.
La detección se puede mejorar cuando las Au NPs están cubiertas con plata. La adición
de plata permite aumentar la superficie de Enhanced Raman Scattering Effect (SERS).
Obteniendo de esta manera una alta sensibilidad de detección.
3.3.2. El uso de conjugados Au NPs-Anticuerpos
La expresión de algunos antígenos es importante en los cánceres, y las Au NPs
funcionalizadas con anticuerpos deben entonces permitir el diagnóstico de cáncer. Se
han llevado a cabo experimentos utilizando específicamente antígenos del cáncer de
próstata (PSA). Las Au NPs que están funcionalizadas con anticuerpos para PSA se
incuban con antígenos de PSA. Se mostró que una capa de oro alrededor de la
nanopartícula funcionalizada fue más eficiente que una capa de plata, y la sensibilidad
se incrementa aún más.
26
3.4.
Vectorización pasiva: suministro y liberación de fármacos
3.4.1. Protección de fármacos hidrófobos en Au NPs
El suministro controlado de fármacos en sus formas activas es un desafío clave para
la lucha contra el cáncer y otras enfermedades. Una posible solución reside en la
incorporación de fármacos enlazados de manera no covalente dentro de la cáscara de
ligando que rodea la Au NP. Este tipo de conjunto de vectores con los fármacos se
llama un “complejo”. La estructura de las Au NPs tiolados es similar a la de las micelas
unimoleculares, con un hidrófobo en el interior interior y una superficie hidrófila. La
capa de zwiterón (es un compuesto químico que es eléctricamente neutro pero que
tiene cargas formales positivas y negativas sobre átomos diferentes) tiolado nos
permite encapsular fármacos para suministrarlos de manera eficiente. El número de
moléculas de fármaco encapsuladas depende del tamaño Au NP, su hidrofobicidad y la
estructura de las moléculas hidrófobas. Se produce la acumulación de Au NPs cerca de
las células cancerígenas debido al efecto EPR (Enhanced Permeability and Retention
(EPR: propiedad mediante la cual ciertos tamaños moleculares tienden a acumularse
más en tejidos tumorales que en normales, se debe al rápido crecimiento celular de los
tejidos tumorales), y la vectorización se denomina ''pasiva''. Por ejemplo, se pueden
sintetizar y usar Au NPs cuyo tamaño nuclear sea de 2,5 nm para la encapsulación
tamoxifeno (TAF) y b-lap (LAP), dos fármacos contra el cáncer. El suministro de
fármacos dentro de las células se realiza por difusión a través la membrana, por lo
tanto, el vector no se introduce dentro de la célula.
3.4.2. Suministro de fármacos fotorregulado con Au NPs
Esta estrategia requiere intervención ajena, se necesita emplear luz como un estímulo
que tiene como fin administrar el fármaco. El fármaco se une a la Au NP a través de un
enlace fotosensible como el que involucra el o-nitrobencilo. La superficie de la Au NP
se funcionaliza con ligandos “fotoescindibles” y ligandos tiolados de ion híbrido que
proporcionan biocompatibilidad, solubilidad y evitan la internalización celular. La
acumulación de Au NPs cerca de las células cancerígenas se produce con el efecto EPR.
El grupo o- nitrobencilo es estable bajo la luz en un medio ambiente biológico, pero
permite que la “foto-escisión” cuando está expuesto a una luz UV de 365 nm, liberando
los fármacos.
27
Por ejemplo, podemos emplear Au NPs de 2 nm conjugadas con fluorouracilo.
Después de la irradiación con luz UV durante 10 minutos, el 82 % de las moléculas de
fluoracilo ya se han entregado. En particular, la irradiación de las células antes o
después de la incubación con Au NPs funcionalizadas siendo tiempo de vida de las
células malignas para cada caso. El tiempo de vida celular disminuye cuando aumenta
el tiempo de irradiación, y el tiempo de vida fluorouracilo está también regulado
debido a la irradiación de las Au NPs.
3.4.3. Fármacos y ligandos intracelulares
El glutatión (GSH) se utiliza como un agente endógeno para la entrega de fármacos.
Este mecanismo se basa en la diferencia entre la concentración de glutatión intracelular
(1-10 nM) y la concentración de tiol extracelular (cisteína: 8 mM y GSH: 2 mM). Las
reacciones de intercambio de tiolato/tiol entre los ligandos de tiolato de las Au NPs y
GSH intracelular permiten la entrega del fármaco tiolado
Se ha demostrado que el GSH es el responsable de la administración de fármacos. La
carga superficial de la Au NP y la estructura de capas alrededor de la Au NP son
influyentes en este intercambio
28
3.5.
Vectorización activa: adhesión a las células cancerígenas
3.5.1. Receptores de folato
Los receptores de folato son glicosilfosfatidilinositoles (GPI). Se trata de proteínas
de membrana que se pueden unir a los aminoácidos a través de su grupo carbonilo
terminal. Permiten la internalización del ácido fólico o componentes que se unen al
ácido fólico por endocitosis.
El ácido fólico es un componente de la regulación de la célula que participa en el
crecimiento celular, la replicación genética y en la síntesis de proteínas. Su afinidad por
los receptores de folato es tan importante que los agentes terapéuticos que tengan un
poco de ácido fólico pueden ser fácilmente capturados. En las células normales no hay
proliferación de receptores de folato, lo que es una gran ventaja. Por otro lado,
aparecen ingentes receptores de folato en los casos de las cancerígenas y, en particular,
para las de ovario, cerebro, mama y de pulmón. Llegan a ser accesibles a través de
epitelio vascular sólo después de que las células se vuelvan cancerosas. Se pueden
sintetizar Au NPs “pegelizadas” (funcionalizadas con polietilenglicol, o PEG), unidas o
no al ácido fólico para comparar el nivel acumulación en los tumores, su unión a las
células normales y la importancia del ácido fólico como un agente de reconocimiento
específico. Por ejemplo, se pueden emplear Au NPs de 10 nm de tamaño obtenidas por
reducción utilizando citrato, a continuación, se suspenden) y posteriormente
pegelizadas. Los vectores sintetizados de este modo se ponen en contacto con células
KB (células de línea de células tumorales), en las están presentes los receptores de
membrana de folato, y con células WI38 (células normales). Se puede observar por TEM
que el 20 % de las células KB muestran internalización en la presencia de F-PEG-T. Por
el lado contrario, las células WI38 no pueden internalizar Au NPs debido a la falta de
receptores de folato.
29
3.5.2. Receptores de transferrina
La transferrina es una glicoproteína que puede ser reconocida por los receptores que
también son mediadores de endocitosis. Muchas células cancerígenas presentan una
gran cantidad de receptores de transferrina debido a la rápida división celular y las
grandes necesidades de energía. Las Au NPs que se conjugan con transferrina son
excelentes vectores pues favorecen la dirección a dichas células. Las transferrinas se
unen a Au NPs usando ácido tioglicólico (HSCH2CO2H). De manera similar que
ocurría con los receptores de folato, gracias a la transferrina se pueden internalizar Au
NPs en células cancerígenas. La internalización en las células se produce debido a
transferrinas que están unidas a las Au NPs. Se trata de un direccionamiento “activo”
entre las Au NPs y los receptores de transferrina que están presentes en la superficie de
la célula. Muy recientemente, se ha demostrado que Au NPs funcionalizadas con
transferrinas pegelizadas se internalizan fácilmente por las células cancerígenas y, por
lo tanto, introducer más fármacos que Au NPs sin funcionalizar. Estos subraya la
importancia del contenido del ligando en la Au NP. Las Au NPs funcionalizadas
permiten un mejor suministro de medicamentos para el cáncer.
3.5.3. Factor de necrosis tumoral (Tumor-Necrosis Factor)
El Factor de Necrosis Tumoral (TNF) descubierto en 1975 es una citoquina que
provoca la necrosis de las células cancerígenas. Este excelente agente contra el cáncer
presenta una alta toxicidad, sin embargo, este problema puede evitarse mediante la
asociación con Au NPs pegelizadas. El vector óptimo es PT(PEG)-Au NP-TNF en la que
el PT(PEG) y el TNF están directamente unidos a la superficie de la Au NP. Este
compuesto se denomina CYT-6091.
30
Se han realizado estudios con ratones sobre este tema, comparando el CYT-6091 con
TNF de manera aislada. En primer lugar, cuando se inyecta la misma cantidad de
vectores y de TNF aislado, los ratones tratados con el vector presente, 3 a 6 horas
después de la inyección presentan concentraciones de TNF en la sangre que son 20
veces más elevadas que la de los ratones tratados con TNF aislado.
El TNF ayuda tanto en el reconocimiento del tumor como en funciones terapéuticas. El
papel de reconocimiento permite que el TNF alcance el tumor de forma específica. La
concentración de TNF en las células cancerígenas es 7 veces mayor cuando se entrega
a través de un vector, lo que implica que tampoco se acumula en el resto del
organismo. En el estudio con ratones, empleando 15 mg de TNF aislado, del 25 al 30 %
de los ratones presentan una respuesta incompleta, y 33 % de los ratones mueren,
mientras que para las concentraciones de vectores similares siempre se obtiene una
respuesta negativa con los ratones. En la siguiente figura vemos la evolución temporal
tras la inyección a un ratón de CYT-6091.
3.6.
Otras terapias contra el cáncer basadas en Au NPs
3.6.1. Fototerapia
La fototerapia utiliza el calentamiento óptico para destruir las células cancerígenas. La
irradiación de Au NPs con luz visible en el SPB lleva a absorción de energía de la luz
que se relaja térmicamente dentro de un picosegundo. Las Au NPs son eficaces porque
presentan un gran superficie de absorción y requieren poca irradiación energética. El
tamaño ideal está en el rango de 10-30 nm. Éstas son entregadas a las células
cancerígenas ya sea a partir condiciones fisiológicas o por reconocimiento. Mientras
que las Au NPs de forma clásica (esférica o poligonal) absorben cerca de 520 nm, las Au
NPs con forma de cilindro (nanorots) absorben en la región del IR cercano, existe un
desplazamiento al rojo de la SPB debido a que la relación longitud/anchura es mayor.
Por lo tanto el SPB de Au nanorods se encuentra alrededor de 700-1000 nm. Esto se
corresponde con una longitud de onda de láseres infrarrojos, que penetran debajo de
la piel más fácilmente que un láser de luz visible y pueden alcanzar los tumores más
profundos.
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Para la ''ventana'' biológica de 650-900 nm que se puede obtener por Au nanorots,
nanoesferas y nanocubos, la profundidad de penetración de la luz en el infrarrojo
cercano puede llegar a un centímetro. Una vez que los nanorots se acoplan a células
malignas de cualquiera de las formas que hemos estado viendo, éstos se iluminan con
un haz láser de su frecuencia de resonancia, lo que provoca un calentamiento de toda
la zona y la destrucción fototérmica de las células deseadas, debido a la absorción
energética y posterior desexcitación. Esta destrucción fototérmica de las células
cancerígenas se ha demostrado tanto in vitro como in vivo.
3.6.2. La terapia genética
La terapia génica es el uso de uno o varios genes como fármacos para compensar la
deficiencia de un gen. El ADN se puede enlazar a las Au NPs, como se ha comentado al
hablar de sensores, y los oligonucleótidos que están presentes en la superficie de las
Au NPs tienen una mayor afinidad por sus ácidos nucleicos complementarios que los
oligonucleótidos libres. La eficiencia de transfección génica (introducción de material
genético externo en células eucariotas) depende de la proporción entre cargas positivas
de las aminas que se unen a las Au NPs y las cargas negativas de los grupos fosfato de
los oligonucleótidos y la longitud de la cadena tiolada. Las Au NPs tienen una gran
capacidad de unirse al ADN plásmido y entregarlo al interior de la célula. Así, las Au
NPs son un valioso apoyo para la transfección de genes. Por ejemplo, se han producido
conjugados ácido nucleico bloqueados-Au NP que incorporan azúcares puenteados y
forman un dúplex extraordinariamente estable con ácidos nucleicos complementarios.
Estos ácidos nucleicos bloqueados aumentan la eficacia de caída genértica en
comparación con el conjugado ADN-Au NP. También se informó de la síntesis y la
introducción en las células de conjugados de ARN-Au NPs sin el uso de agentes de
transfección, estos conjugados pueden ser hasta seis veces más estables que el ARN
molecular en medios que contienen suero.
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