06 TECNOLOGÍA DNA RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
El desarrollo de la tecnología de DNA recombinante o ingeniería genética, ha
cambiado el concepto de la biología dado que ha permitido, no solo
comprender a nivel molecular los seres vivos, sino modificar en forma
controlada su información genética.
Los trabajos de Watson y Crick que permitieron descifrar la estructura del DNA
en los años -50 fueron el punto de partida para el desarrollo de esta nueva
rama de la biología. Al mismo tiempo se han dado importantes desarrollos
científicos que son fundamentales en la tecnología del DNA recombinante:
1. La capacidad de introducir DNA en una célula, proceso conocido como
transformación, asi como la selección de las células transformadas.
2. Purificación de DNA con altos rendimientos.
3. Descubrimiento y purificación de enzimas de restricción y enzimas de
modificación del DNA.
Básicamente con estos tres procedimientos se han podido modificar
genéticamente organismos como bacterias, plantas y animales con el objetivo
que, tras la introducción de un gen foráneo no presente en su genoma, el
organismo sea capaz de expresar la proteína codificada por dicho gen.
Si bien existen numerosos ejemplos de las aplicaciones biotecnológicas
derivadas de la tecnología del DNA recombinante, solo vamos a hacer
referencia a los procedimientos más usados para generación de plantas
transgénicas.
El principal objetivo de la biotecnología vegetal es la generación mediante
ingeniería genética de nuevas variedades de plantas que presentan alguna
característica que mejore su valor frente a la especie ya existente. Por ejemplo,
plantas resistentes al ataque de diferentes patógenos y/o resistentes a
determinados herbicidas, asi como plantas capaces de tolerar a condiciones
adversas de cultivo.
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Un ejemplo particular del uso de las técnicas de DNA recombinante es el
desarrollo de líneas de maíz transgénico. Estas plantas transgénicas tienen la
capacidad de producir moléculas con acción insecticida en forma endógena y
se denominan maíz Bt. La resistencia al ataque de insectos como los taladros
fue lograda por la introducción en el genoma del maíz del gen que codifica para
la proteína CryIAb. La fuente natural de está proteína es una bacteria, Bacillus
thuringensi, que ha sido empleada en forma de aspersión para el control de
estos insectos en el cultivo de maíz desde hace más de 30 años.

Introducción del gen de interés en un vector.

Plásmidos
Los plásmidos son DNA extracromosómico que se encuentran con
frecuencia en bacterias y levaduras. Estas moléculas de DNA circular
confieren a las células características como resistencia a antibióticos,
metales pesados y a sustancias aromáticas.
Los plásmidos son usados por la ingeniería genética como vectores de
clonación para introducir el gen de interés, obteniéndose un plásmido
recombinante. Posteriormente el plásmido recombinante se usa para ser
transferido a la célula hospedadora.

Introducción del gen de la proteína Bt en un plásmido
Para llevar adelante la introducción del gen Bt es necesario:
a) cortar el DNA de interés con enzimas de restricción
b) cortar el plásmido vector con enzimas de restricción
c) unir el DNA de interés al plásmido vector
Las enzimas de restricción o endonucleasas son enzimas de origen bacteriano,
que reconocen secuencias específicas en el DNA e hidrolizan el enlace
pentosa-fosfato, produciendo asi un corte en la molécula de DNA. El esqueleto
pentosa-fosfato se rompe entre dos bases en una hebra y en otras dos bases
equivalentes en la otra hebra lo que puede generar un corte a distinta altura en
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cada hebra y formar extremos cohesivos como se ve en la figura. Otras
enzimas de restricción realizan cortes rectos produciendo extremos romos, que
también se muestran en la figura.
En la actualidad se conocen cientos de enzimas de restricción y en la mayoría
de los casos la secuencia que se reconoce es un palíndromo o secuencia
simétrica de 4, 5, 6 ó más nucleótidos. Algunos ejemplos se muestran en la
Tabla siguiente.
Si se digiere el DNA de interés y el vector plasmídico con la misma enzima de
restricción se generaran extremos cohesivos complementarios y de este modo
las moléculas de DNA pueden aparear sus bases. De todas formas para que se
una el esqueleto pentosa fosfato se necesita una enzima de modificación del
DNA denominada DNA ligasa. La ligación es un paso fundamental para la
generación de DNA recombinante ya que permite la unión del esqueleto de
DNA de distinto origen. Esta enzima sella tanto extremos cohesivos como
romos y requiere la presencia de un grupo fosfato en el extremo 5´y de un –OH
en un extremo 3´.
Como consecuencia de la acción de la ligasa se producirán moléculas del
vector, es decir del plásmido bacteriano, que contienen el gen de interés, en
este caso el gen Bt. Una vez obtenido el plásmido recombinante, se procede a
transformar las células maíz.

Transformación de una célula vegetal
El proceso de transformación consiste en introducir el vector que contiene el
gen de interés en una célula hospedadora. Hay varias formas de transformar
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una célula vegetal y se describirá uno de los métodos que permite introducir el
gen Bt en una célula de maíz.
Un método para introducir DNA aislado en células vegetales es la biolística,
que consiste en recubrir partículas de oro con plásmido recombinante (vector +
gen Bt). Estas partículas son usadas como proyectiles en la medida que son
disparadas por un sistema de aire comprimido “cañón de genes” sobre tejido
vegetal.
Estas partículas van a atravesar las paredes celulares hasta el interior celular
donde el DNA que las recubre se libera y probablemente un número reducido
del DNA alcance el núcleo y se integre en el DNA vegetal.
Otro requisito imprescindible para obtener plantas transgénicas es la
integración estable de ese DNA exógeno en una célula vegetal asi como contar
con un método para poder seleccionar las células vegetales que han sido
transformadas. El método más usado consiste en usar plásmidos con
resistencia a antibióticos, de manera que al cultivar las células vegetales en un
medio selectivo, es decir complementado con antibiótico, solo crecerán se
dividirán y originarán una planta transgénica las células transformadas.
A partir de una célula transformada con el gen exógeno se obtiene una planta
que se denomina transgénica, que son clones respecto a la célula original.
Las variedades de maíz transgénicos con la proteína Bt han demostrado
ofrecer un control eficaz de los taladros de maíz, primero en ensayos de campo
que se viene realizando desde comienzo de los 90, y posteriormente en la
experiencia comercial, con millones de hectáreas cultivadas desde 1997.
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Electroforesis de DNA
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución de moléculas con carga
neta, éstas se deplazarán hacia el polo contrario a su carga. En este principio
se basa la técnica denominada electroforesis y el deplazamiento de la molécula
en cuestión depende de dos factores: la carga y el tamaño.
Un equipo de electroforesis consta de una fuente de poder que genera el
campo eléctrico y una cuba, recipiente con dos compartimentos con un
electrodo cada uno.
En la foto que aparece abajo se indican los componentes del sistema.
La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar
moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más
comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polimeros como la
acrilamida y la agarosa. Estos geles van en la cuba, sumergidos en un tampón,
con pH superior a 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a
electroforesis se desplazarán al polo positivo, porque poseen carga neta
negativa a pH superiores a 5.
Cuando la electroforesis se realiza en un gel, este se comporta como un
tamiz molécular y permite separar moléculas cargadas basándose en su
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tamaño y forma. Así una mezcla de moléculas de DNA de diferente tamaño,
que pueden resultar de una reacción con enzimas de restricción, se separarán
en función de su tamaño. En la figura que aparece a continuación se observa
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, donde se visualizan bandas
que corresponden a fragmentos de DNA con diferente masa molecular. Las
moléculas de DNA de mayor masa molecular migran menos respecto a las
moléculas de DNA de menor masa molecular que quedan más próximas al polo
positivo.
Es importante el empleo de un marcador de masa molecular conocida porque
permite calcular la masa molecular de las bandas de DNA: la movilidad relativa
suele ser una función lineal del logaritmo de la masa molecular.
DNA de un fago se digirió con
varias enzimas de restricción y
los poductos obtenidos se
separaron en un gel de agarosa.
A la izquierda del gel se
observan
las
bandas
del
marcador del peso molecular.
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EquipoCCH.
de electroforesis,
a la izquierda
se ve la Experimentales.BIOLOGÍA
cuba de
electroforesis conectada a una fuente de poder.