(1), Mayla F Blanco (1)

C483. EL 99mTc-GLUTATION COMO RADIOFARMACO PARA EL DIAGNOSTICO DE
TUMORES.
Alejandro Perera (1), Mayla F Blanco (1), René Leyva (2), Jorge Duconge (3), Daniel Álvarez (3), Abel
Hernández (1), Anaís Prats (1), Yolicé Valdivia (1).
1. Centro de Investigaciones Clínicas, 2. Centro de Isótopos, 3. Instituto de Farmacia y Alimentos.
Dirección: 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. Teléfonos: 2030087. E-mail:
[email protected]
RESUMEN.
Está reportado que la cantidad de glutatión en las células tumorales se correlaciona con el grado de
malignidad de las mismas. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una formulación para el
marcaje del glutatión con 99mTc con suficiente estabilidad y evaluarlo como posible radiofármaco en el
diagnóstico de melanomas. Materiales y métodos: Se evaluó la influencia del pH, la cantidad de
SnCl2*2H2O y la presencia de Na4P2O7*10H2O en el marcaje y estabilidad del complejo. Se inyectó 0.1
mg (74 MBq) de 99mTc-glutatión a través del plexo ocular de ratas Sprague Dawly (190-210g) para
determinar la farmacocinética y la biodistribución. Se realizaron imágenes gammagráficas hasta 24 h
después de la administración del producto por el plexo ocular de ratones desnudos xenoinjertados con
melanoma B16. Resultados: Se obtuvo un marcaje de 97±2% estable por 24 h a pH=8.2-8.5 y 40µg de
SnCl2*2H2O y 1.7 mg de Na4P2O7*10H2O por cada mg de glutatión. El radiofármaco mostró un
T1/2=18.0±3.6 min en plasma, mientras que el mayor acúmulo fue en riñones (0.90-2.35 %DI/g) y orina
(4.8-7.7 %DI) lo que sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganos
mostraron captaciones inferiores al 0.05%DI/g. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso
acúmulo del radiofármaco en el tumor. La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min)
hasta 8.5 (24 h). Conclusiones: La formulación obtenida permitió el marcaje de glutatión con 99mTc con
elevada eficiencia. Este radiofármaco pudiera ser útil para la detección gammagráfica de melanomas.
INTRODUCCIÓN
El cáncer constituye la segunda enfermedad de mayor morbi-mortalidad, tanto en Cuba, como en
diferentes países del mundo (1, 2). El glutatión es un tripéptido que interviene en el metabolismo celular
(3). En el caso de los tumores se ha determinado que está relacionado con los mecanismos de resistencia
de éstos a determinados agentes citostáticos (4, 5). Se ha planteado por algunos autores la posibilidad de
marcar el glutatión con 99mTc y emplearlo en el diagnóstico de determinadas neoplasias malignas como
melanomas (6) y tumores de cabeza y cuello (7). No obstante, la cantidad de pacientes ha sido pequeña y
no se cuenta con suficiente información hasta el momento.
El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una formulación para el marcaje del glutatión con 99mTc
con suficiente estabilidad y evaluarlo como posible radiofármaco en el diagnóstico de melanomas.
MATERIALES Y METODOS
Determinación de las condiciones de marcaje: Para determinar las condiciones de marcaje del glutatión
(1mg) con 99mTc, se variaron los siguientes factores: pH (7.5-8.5), cantidad de SnCl2*2H2O (20-60µg),
cantidad de Na4P2O7*10 H2O (0-2.0 mg).
Estudio de farmacocinética y biodistribución: Se inyectó 0.1 mg (0.1 mL) de 99mTc-glutatión (74 MBq)
a través del plexo ocular de 30 ratas Sprague Dawly (190-210g) para determinar la farmacocinética y la
biodistribución. Los animales fueron colocados en jaulas metabólicas para determinar el porcentaje de
radiofármaco excretado por la orina y las heces fecales. Se tomaron muestras de, aproximadamente, 400
µL de sangre a los 5, 10, 15, 20, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6 y 8 horas a través del plexo ocular. Estas se
dejaron coagular a temperatura ambiente, se centrifugaron a 1000 rpm (centrífuga SIGMA 201, Francia)
y se tomaron alícuotas de 100 µL de suero, a las que posteriormente se les determinó la velocidad de
conteos en un contador automático. La biodistribución se estudió a los 10 min, 1h, 4h, 12h y 24h. Grupos
de 3 animales por cada tiempo fueron anestesiadas con éter etílico y posteriormente sacrificados para
llevar a cabo la extracción y pesaje de los siguientes órganos: corazón, hígado, riñón derecho, bazo,
pulmón, estómago, intestino grueso, intestino delgado.
Estudio gammagráfico en modelo animal: Se realizaron imágenes gammagráficas a: 0, 20 min., 1 h, 2h,
4h, 6h, 8h, 10h y 24 h después de la administración del producto por el plexo ocular de 6 ratones atímicos
hembras n/n (NMRI) xenoinjertados con melanoma B16. Se utilizó una cámara gamma Sophy DS7
(Sopha Medical, Francia), empleando un pinhole de 2 mm de abertura. Se adquirieron imágenes planas en
formato de 128x128 píxels, con zoom de 2 y 500 Kconteos como condición de parada. Se calculó la
relación tumor/región contralateral sana (T/RC) para cada imagen.
RESULTADOS
Las condiciones óptimas de marcaje fueron pH: 8.2-8.5, cantidad de Na4P2O5*10H2O: 1.7 mg, cantidad
de SnCl2*2H2O: 40 µg. Con esas condiciones el porciento de marcaje del 99mTc-GHS fue de 97±2%. La
impureza que más afectó el rendimiento fue el radiocoloide (3±1%). Sólo en algunos casos aislados se
detectó tecnecio libre (99mTcO4-) en muy pequeñas cantidades.
En la tabla I se muestran los principales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-GSH administrado a
través del plexo ocular en ratas Sprague Dawly a una dosis de 0.1 mg (74 MBq), calculados a partir de un
modelo monocompartimental.
El mayor acúmulo del radiofármaco fue detectado en riñones (0.90-2.35 %DI/g) y orina (4.8-7.7 %DI) lo
que sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganos mostraron captaciones
inferiores al 0.05%DI/g. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco en
el tumor (figura 1). La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min) hasta 8.5 (24 h).
Tabla I. Pricipales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-GSH.
Desviación
Parámetros
Estimado (Media ± DE)
Relativa (%)
Cmax (%DI/mL)
0,38±0,04
10,5
AUC (%DIh/mL)
0,16±0,02
12,6
0,30±0,06
20,0
T1/2 (h)
Vd (mL)
265±10
3,8
Cl (mL/h)
608±70
11,5
Cmax: conc. máxima en sangre, AUC: área bajo la curva,
T1/2: tiempo medio de aclaración, Vd: volumen de dilución,
Cl: aclaración.
DISCUSIÓN
Desde el punto de vista de su biodistribución, el glutatión
pasa a la nefrona por filtración glomerular. Una vez en el
túbulo, una parte es reabsorbida, mientras la otra es
sometida a la acción de la -glutamil-transpeptidasa y la
cisteinilglicina dipeptidasa presentes en las membranas de
las células ciliadas del túbulo proximal (8-10). La
cisteína, producida por la degradación de este péptido en
sus aminoácidos constituyentes, es mayor que la
capacidad de reabsorción de ésta por el lumen tubular (8).
En ratones se ha observado, además, la eliminación del
exceso de GSH en forma de -glutamilcisteína o de
forma íntegra, sin degradar (9). Estos factores permiten
explicar la alta actividad encontrada en orina. Por otra
Tumor
parte, al ser una molécula peptídica con un peso
molecular de 307 Da, con rápida eliminación,
Figura 1. Imagen gammagráfica de un
fundamentalmente renal y acelerada incorporación a los
ratón 2h post-inyección.
tejidos, por las múltiples funciones que cumple dentro de
las células, explican las características de su perfil farmacocinético. El T1/2 obtenido fue de 18.0±3.6 min
(0.30 ± 0.06 h), que se asemeja a los reportados en la literatura por otros autores (6, 8). Los elevados
valores de Vd (265 ± 10 mL) son indicativos de la baja afinidad del radiofármaco por proteínas
plasmáticas, pasando a distribuirse por todo el espacio vascular y el fluido extravascular (11). La rápida
cinética del 99mTc-GSH, permite predecir la elevada relación tumor/región contralateral, que se
evidenció desde los primeros momentos post-administración del radiofármaco. Se apreció además que los
órganos blancos principales eran los riñones, lo cual corrobora los hallazgos de biodistribución
previamente reportados. Estas características permiten suponer la factibilidad del uso de este péptido
marcado para la detección de melanomas.
CONCLUSIONES
La formulación obtenida permitió el marcaje de glutatión con 99mTc con elevada eficiencia. Este
radiofármaco pudiera ser útil para la detección gammagráfica de melanomas.
BIBLIOGRAFÍA
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11. Fernández Sánchez E. Introducción a la farmacocinética. En: Fernández Sánchez E (Ed.)
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C484. EL 99mTc-F11: NUEVO PÉPTIDO MARCADO PARA LA DETECCIÓN
GAMMAGRÁFICA DE MELANOMAS. RESULTADOS PRECLÍNICOS.
Alejandro Perera (1), Anaís Prats (1), Osvaldo Reyes (2), Mónica Bequet (2), Nelson Santiago (2), Abel
Hernández (1), Yolicé Valdivia (1), René Leyva (3), Leydis Alberti (3), Jorge Duconge (4), Eduardo
Fernández (4), Gilmara Pimentel (5), Yecenia Morejón (1).
1. Centro de Investigaciones Clínicas, 2. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, 3. Centro de
Isótopos, 4. Instituto de Farmacia y Alimentos, 5. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.
Dirección: 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. Teléfonos: 2030087. E-mail:
[email protected]
RESUMEN
El melanoma es una de las neoplasias más agresivas. La integrina V 3 es un receptor de adhesión
celular que se sobreexpresa en la membrana citoplasmática de estas células malignas, así como en la
neovasculatura que se desarrolla en el tumor y sus metástasis. El objetivo del trabajo fue desarrollar un
péptido que contuviera la secuencia Arg-Gly-Asp-Ser y marcarlo con 99mTc, para obtener imágenes
gammagráficas de un modelo animal de melanoma. El péptido F11 (AGGG-Abu-GRGDSPK) fue
obtenido por síntesis en fase sólida. El péptido se marcó a pH neutro, variando la relación molar F11: Sn+2
entre 1:0.5 y 1:4.0. Se inyectaron 50µg (37MBq) de 99mTc-F11 por la vena lateral de la cola de ratas
Sprague Dawley para determinar su biodistribución y farmacocinética hasta 18 h. Se realizaron imágenes
gammagráfícas hasta 16 h después de la administración de 50 µg (74MBq) de 99mTc-F11 por el plexo
ocular de ratones C57BL6 injertados con melanoma B16. Resultados: Se obtuvo un marcaje de
95.2±2.1% estable por 24 h, para una relación molar F11:SnF2=1:1.3. La captación en riñones varió de
2.5±0.5 %DI/g (1h) hasta 6.0±1.1 %DI/g (18h), lo que sugiere que esa sea la vía fundamental de
eliminación. El resto de los órganos mostraron captaciones inferiores al 1.0% DI/g. El T1/2 en sangre fue
de 3.54±0.40 h. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco en el
tumor (relación tumor/región contralateral sana de 4 a las 16 h). Conclusiones: El péptido F11 marcado
con 99mTc pudiera ser un radiofármaco útil para la visualización gammagráfica de los melanomas.
INTRODUCCIÓN
El melanoma es una de las neoplasias más agresivas. Según datos del Archivo Nacional de Cáncer, Cuba
presenta una incidencia de 0.9 por 100000 habitantes. En EEUU esta enfermedad ocupa el sexto lugar en
morbilidad entre las neoplasias en el sexo masculino y el séptimo en el femenino (1).
La integrina V 3 es una glicoproteína de transmembrana dimérica que media la adhesión y migración
de las células tumorales. Este receptor juega un rol importante en el crecimiento tumoral, la invasividad
local y el potencial metastásico (2, 3) y se sobreexpresa en la membrana citoplasmática de numerosas
células malignas (osteosarcomas, glioblastomas, neuroblastomas, melanomas y carcinomas de pulmón,
mamas, próstata, ovarios, sistema digestivo y otros) (4). Además, se expresa altamente en células
endoteliales activadas y juega un importante papel en los procesos de angiogénesis (5).
La secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) está considerada el sitio de unión primario a esta integrina. Es por eso
que diferentes autores han reportado péptidos marcados, que contienen esta secuencia para detectar
tumores y sus metastasis (3, 4, 6).
El objetivo del trabajo fue desarrollar un péptido que contuviera la secuencia Arg-Gly-Asp-Ser y
marcarlo con 99mTc, para obtener imágenes gammagráficas de un modelo animal de melanoma.
MATERIALES Y METODOS
Síntesis del péptido: El F11 es un péptido lineal de 12 aminoácidos: AGGG-Abu-GRGDSPK, donde Abu
es el ácido 4-aminobutanoico, empleado como espaciador. La cadena que queda hacia el N-terminal se
adicionó con el fin de que actuara como quelatante del 99mTc, permitiendo así el marcaje de la molécula,
la otra parte es la encargada de unirse a la integrina αVβ3. Este péptido fue obtenido por síntesis en fase
sólida.
Marcaje del F11 con 99mTc: El péptido se marcó a pH neutro. La formulación se optimizó, tomando
como factor la relación molar F11: Sn+2 (1:0.5, 1:1, 1:2 y 1:4). La variable de respuesta fue la pureza
radioquímica del 99mTc-F11. Los resultados obtenidos se graficaron para determinar el valor óptimo.
Estudio de biodistribución y farmacocinética: Se inyectaron 50µg (37MBq) de 99mTc-F11 por la vena
lateral de la cola de ratas Sprague Dawley (190-210 g). Los animales fueron divididos en grupos de tres.
Para el estudio farmacocinético se tomaron muestras de sangre a los 10 min, 30 min, 45 min y 1, 2, 3, 4,
6, 8 y 18 horas. La biodistribución se estudió a 1h, 3h, 6h y 18h. Los animales por cada tiempo fueron
anestesiadas con éter etílico y posteriormente sacrificados para llevar a cabo la extracción y pesaje de los
siguientes órganos: corazón, hígado, riñones, bazo, pulmón, estómago, intestino grueso, intestino delgado,
músculo y fémur.
Estudio gammagráfico en modelo animal: Se realizaron imágenes gammagráficas a: 1 h, 3h, 6h y 16 h
después de la administración del producto por el plexo ocular de 3 ratones C57BL6 hembras injertados
con melanoma B16. Se utilizó una cámara gamma Sophy DS7 (Sopha Medical, Francia), empleando un
pinhole de 2 mm de abertura. Se adquirieron imágenes planas en formato de 128x128 píxels, con zoom de
2 y 500 Kconteos como condición de parada. Se calculó la relación tumor/región contralateral sana
(T/RC) para cada imagen.
RESULTADOS.
El péptido F11 fue sintetizado con una pureza química superior al 95%.
Se determinó que la relación F11:Sn+2 óptima fue de 1:1.3, para la cual los por cientos de marcaje del
péptido con 99mTc fueron superiores a 95%.
En la tabla I se muestran los principales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-F11 administrado a través
de la vena lateral de la cola en ratas Sprague Dawly a una dosis de 50µg (37 MBq), calculados a partir de
un modelo monocompartimental.
El mayor acúmulo del radiofármaco fue detectado en riñones (2.5-6.0 %DI/g) y orina (2.1-14.4 %DI) lo
que sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganos mostraron captaciones
inferiores al 0.5%DI/g. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco en
el tumor (figura 1). La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min) hasta 8.5 (24 h).
Tabla I. Pricipales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-F11.
Desviación
Parámetros
Estimado (Media ± DE)
Relativa (%)
Cmax (%DI/mL) 2,09±0,34
16,2
AUC (%DIh/mL) 10,7±1,6
15,0
3,54±0,40
11,3
T1/2 (h)
Vd (mL)
47,8±2,6
5,4
Cl (mL/h)
9,4±1,5
16,0
Cmax: conc. máxima en sangre, AUC: área bajo la curva,
T1/2: tiempo medio de aclaración, Vd: volumen de dilución,
Cl: aclaración.
Tumor
Figura 1. Imagen gammagráfica de
un ratón 16h post-inyección
DISCUSIÓN
Lister-James J y cols. (7) plantean que de forma general, los péptidos pasan a las nefronas mediante
filtración glomerular y posteriormente son reabsorbidos en el túbulo proximal, donde pueden ser
degradados por la acción de las peptidasas. Estos factores permiten explicar la alta actividad encontrada
en riñones y orina. Los datos de biodistribución son similares a los reportados en la literatura para
péptidos lineales de este tipo (6). Los péptidos cíclicos muestran menor excreción renal, y una captación
hepática superior, debido a su mayor carácter lipofílico (3, 4). El rápido aclaramiento sanguíneo obtenido
(Tabla I), es característico de las moléculas peptídicas de bajo peso molecular (6-8).
Las imágenes gammagráficas confirman los resultados de la biodistribución. La elevada relación
tumor/región contralateral desde los primeros momentos post-inyección, permite suponer la factibilidad
de este péptido marcado para la detección de melanomas. Por otra parte, su baja eliminación a través del
tracto gastrointestinal hacen de este radiofármaco un posible diagnosticador útil para la detección de
lesiones abdominales en comparación con otros radiofármacos (9, 10).
CONCLUSIONES
El péptido F11 marcado con 99mTc pudiera ser un radiofármaco útil para la visualización gammagráfica
de los melanomas.
BIBLIOGRAFÍA
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Las drogas de abuso ¿Inductoras de aberraciones cromosómicas?
Autores: Dr. Aníbal Domínguez Odio*, Lic. Esperanza Lóriga Loaces ** y Lic. Jumirlet Ortega Pérez **
Institución: * Centro de Toxicología y Biomedicina. Autopista Nacinal Km 1 ½. Apdo. Postal 4033. Santiago de Cuba. Cuba.
** Centro Nacional de Toxicología. La Habana. Cuba.
RESUMEN: La existencia de un desconocimiento sobre la agresividad de las drogas de abuso sobre el material hereditario es real, y está
condicionada no solo por los limitados estudios realizados, sino además porque las únicas pruebas capaces de revelar los efectos mutagénicos
y/o carcinogénicos, que pudieran producir las drogas de abuso o sus mezclas sobre la integridad genómica humana, en ausencia de evidencias
epidemiológicas, son hasta hoy las que aportaría el consumidor en si. Por tal motivo se realizó en el Centro de Toxicología y Biomedicina, una
investigación con 125 pacientes drogodependientes, los cuales son adictos al alcohol, alcohol + psicofármacos, alcohol + marihuana, y
Datura estrongénica , L. Mientras que el control negativo consistió en donantes especiales del Banco de Sangre Provincial de Santiago de
Cuba. Como bioindicador de efecto se tomaron en cuenta la frecuencia de aparición de Micronúcleos, Binucleación, Picnositosis, Cromatina
condensada y Cariolisis en células exfoliadas de la mucosa bucal por ser eventos relevantes en los procesos carcinogenéticos. Como principales
resultados se obtuvieron que existen evidencias reales de daño genético severos en las células expuestas, elemento útil para predecir la
aparición y posible evolución de un proceso maligno.
INTRODUCCIÓN. A pesar de los adelantos logrados en este campo existen zonas oscuras sobre la agresividad de las drogas de abuso sobre
el material hereditario y la susceptibilidad genómica del consumidor. Esta situación está condicionada no solo por los limitados estudios
realizados, sino además porque las únicas pruebas capaces de revelar los verdaderos efectos mutagénicos y/o carcinogénicos, que pudieran
producir las drogas de abuso o mezclas de ellas sobre la integridad genómica humana, en ausencia de evidencias epidemiológicas, son hasta
hoy las que aportaría el hombre en si. Los micronúcleos y las atipías celulares valoran en su justa medida la importancia de los distintos
factores endógenos tanto en la modulación de la respuesta mutagénica, como en la vulnerabilidad genómica existente ante la acción de las
drogas. Sin embargo el mayor inconveniente de estos estudios es que tienen lugar a posteriori, una vez que el consumo se ha dado, pero
teniendo en cuenta que la determinación del daño genético diagnosticado se toma como indicador de riesgo carcinogénico y que el periodo de
latencia que media entre la exposición al agente xenobiotico y cáncer es bastante largo; los resultados pueden considerarse como de alto valor
predictivo, aún cuando se desconozcan los niveles reales de exposición.
Teniendo en cuenta la relación causal entre las mutaciones y la transformación maligna de las células (carcinogénesis) y ciertas alteraciones
del desarrollo. Nos proponemos como objetivo determinar el efecto de diferentes drogas de abuso sobre la frecuencia de aberraciones
cromosómicas y atípias nucleares en poblaciones expuestas.
MATERIAL Y METODOS. Población. Para dar cumplimiento a los objetivos trazados y teniendo en cuenta las características de la
población experimental se empleó un estudio de cohorte transversal. La población experimental quedo constituida por cuatro (4) grupos, cuyo
tamaño fue de 25 pacientes, los cuales fueron distribuidos según el motivo del ingreso, y un colectivo control, sin indicación de exposición
previa a drogas de abuso u otro agente sospechoso de genotoxicidad, ni antecedentes de padecimiento de enfermedades infecciosas. (Tabla 1).
Las muestras de células exfoliadas se obtuvieron y manipularon siguiendo las normas éticas establecidas.
Tabla 1. Grupos experimentales según motivo de ingreso.
Código
OH
OH-PT
Grupos
Alcohol
Alcohol + Psicofármacos
OH-THC
Alcohol + Marihuana
DE
Datura estrongenica
NC
Control
Obtención y preparación de las células bucales. Las muestras se obtuvieron mediante un raspado en la parte interna de los mejillas, con
aplicadores de madera y luego las células exfoliadas se depositaron en un tubo de ensayo, que contenía 2- 3 mL de solución salina fisiológica
(0.9 %). A continuación se centrifugo y se le retiró el sobrenadante, para posteriormente agregar la solución fijadora. Al cabo de 20 minutos se
volvió a centrifugar, para finalmente realizar el goteo de la suspensión celular sobre portaobjetos, que se dejaron secar para su posterior tinsión, y
análisis de microscópico.
Evaluación microscópica. Para estimar la frecuencia de micronúcleos, se tomaron en cuenta diversos criterios dentro entre ellos está la
morfología, forma, tamaño, Citoquímica y localización en la célula. Se incluyó otras atípias nucleares como por ejemplo la binucleación,
picnositosis, cariolisis y cromatina condensada. El análisis se le realizó a un mínimo de 1000 células consecutivas cuando la frecuencia de
micronúcleos fue menor de 3/ 1000 se evaluó un máximo de 3000 células para disminuir la probabilidad de que el no encontrar micronúcleos, se
debiera a un evento azaroso.
Análisis de datos. Se calcula la frecuencia de células micronucleadas y con atípias nucleares por 1000 células, obteniéndose los promedios,
luego se compararon las observaciones de la población expuesta y la no expuesta entre si por medio de la prueba de Wilcoxon- Mann Whitney
(P<0.005), conociéndose de esta forma la magnitud de la alteración genética y dependiendo de ello reconocer la existencia de un daño
potencial o efectivo para la salud.
RESULTADOS Y DICUSIÓN. La capacidad de las diferentes drogas de abuso abordadas en este estudio y sus respectivas combinaciones,
para inducir daños genéticos quedo demostrada, al analizar la frecuencia de aparición de micronúcleos y atípias celulares en pacientes adictos.
Los resultados indican (tabla 2), incrementos no solo de micronúcleos en más de 17 veces con respecto al control, sino además de alteraciones
nucleares tales como picnosis, cariolisis, y cromatina condensada alcanzando sus mayores incrementos en pacientes adictos al alcohol, seguido
por las combinaciones alcohol-marihuana y alcohol- psicofármacos.
Los efectos genotóxicos del alcohol encontrados en nuestra investigación están en concordancia con los hallados por otros autores, los cuales lo
describen como inductor prematuro de la separación de los centrómeros durante el proceso mitótico; inhibidor de la diferenciación trofoblástica
en la morula y como teratogénico (Adickes et al, 1993). En el caso concreto de los dos últimos tipos de drogadicción cabía de esperar
frecuencias aún mayores, teniendo en cuenta los reportes anteriores en los cuales describen a la Marihuana como inductora de rupturas
cromosómicas, delecciones, translocaciones y clastogenisidad
tanto in vivo como in vitro (Zimmerman et al, 1990), por su parte los
psicofármacos al interactuar con el alcohol es posible obtener sinergismos o potencialización entre ellos, pero no fue así debido quizás al efecto de
diversos factores de confusión como: características interpersonales específicas, frecuencia de consumo, concentraciones de las diferentes drogas
involucradas en la combinación y la cinética de reeplazamiento de las células bucales (Marcos et al, 1984).
Puede observarse igualmente en la tabla 2, que en el caso de la Datura estrongenica, no indujo daños marcadamente genético, no obstante no se
puede descartar aún el peligro pues es posible, que el efecto genotóxico requiera de un periodo de exposición superior para manifestarse en el
órgano estudiado (Bauluz et al, 1984).
Tabla 2. Incrementos en veces de la frecuencia de micronúcleos y atípias celulares en pacientes toxicómanos con respecto al control.
Tipo de drogas
Daño genético / 1000 células
Micronúcleos Binucleación
OH-PT
3.68 *
Picnosis
Cariolisis
Cromatina C.
1.60 *
4.19 NS
4.66 NS
2.67 *
NS
NS
3.35 *
5.90
OH-THC
4.80 *
1.59 *
3.00
OH
17.37 *
1.97 *
3.33 *
3.00 *
2.67 *
DE
2.98 *
--
5.33 *
--
--
* Significativo para P<0.005, NS No significativo.
Si bien hubo incrementos de la frecuencia de aparición de casi todos los indicadores, tenidos en cuenta para medir las potencialidades
genotóxicas de los diferentes tipos de drogas, estos no siempre fueron estadísticamente significativos siendo el caso de las células picnoticas y
cariolíticas cuando se analizó la s combinaciones OH-PT y OH-THC, sin que medie una explicación actual.
Estos apuntan en principio que el OH ,OH-THC y OH-PT presentan acción clastogénica y anaugénica, por lo que su consumo incrementa el
riesgo de desarrollar procesos carcinogenéticos a sus consumidores.
De lo expuesto y discutido hasta aquí, se deduce que el consumo tanto de alcohol, como de alcohol-marihuana y alcohol-psicofármacos, supone
un riesgo genético para los toxicómanos. Dado el claro incremento particularmente de micronúcleos.
BIBLIOGRAFÍA
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Adickes, E.D.; Mollner, T. J. & Makoid, M.C. Teratogenic effects of ethanol during hyperplastic growth in cardiac myocyte cultures.
Alcohol Clin. Exp. Res. 1993 Oct;17(5):988-92.
2.
Zimmerman, S. & Zimmerman, A. M. Genetic effects of marijuana. Int. J. Addict. 1990. 25(1A):19-33.
3.
Marcos, R.; Carbonel, Elisabeth.; Creus, A.; Galofré, P. & Gutierres, Sara. Evaluación del riesgo asociado a la exposición terapéutica
al I 131. Evaluación mutagénica y genotóxica. Editorial Sociedad Española de Mutagénesis ambiental. Madrid. España. 1998.
4.
Beauluz, C.;Casado, J.A.; Martín, L.; Ortega, M. & Sierra, I. Mutagénesis y carcinogénesis inducida por radiaciones ionizantes en
modelos de ratones transgénicos. Evaluación mutagénica y genotóxica. Editorial Sociedad Española de Mutagénesis ambiental.
Madrid. España. 1998.
En los últimos años, las algas marinas han atraido
Determinación de sustancias fenólicas
la
y actividad antioxidante de la
aplicación
Autores: Alexis Vidal Novoa1, Mario Motidome2,
3
1
Jorge Mancini-Filho , Adyary Fallarero Linares ,
Mirtes Midori Tanae2, Luce Maria Brandao
Torres2, Antonio Jose Lapa2
1
Grupo
de
Farmacologia
y
Toxicología, Facultad de Biología, Universidad de
La Habana, 2INFAR, UNIFESP, São Paulo,
3
Facultade de Ciencias Farmacéuticas, USP, São
Paulo.
con
en
fuentes
amplias
el
naturales
de
perspectivas
de
tratamiento
de
diferentes
patologías, conservación de alimentos y en los
cosmésticos1. Se ha demostrado que extractos
crudos de algunas especies de algas tienen un
notable efecto antioxidante2,3. Los polifenoles,
metabolitos secundarios de las plantas resultan
compuestos
con
una
antioxidante, que están
potente
actividad
presentes en las algas,
entre los que se pueden citar: bromofenoles,
florotaninos, compuestos polifenólicos sulfatados
y ácidos polifenólicos. El objetivo de este trabajo
fue determinar ácidos fenólicos en un extracto
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue demostrar la
actividad
como
antioxidantes
macroalga B.triquetrum..
Instituciones:
atención
antioxidante
Brythamnion
triquetrum
del
y
alga
marina
los
posibles
compuestos que pudieran explicar esta actividad.
El extracto acuoso de esta alga contiene 8.08 mg
de polifenoles totales/g de extracto liofilizado y
una concentración inhibitoria media (CI50) de la
lipoperoxidación espontanea de 23.3 µg. Se
realizo un fraccionamiento con extracciones
liquido-liquido, TLC y columna de Amberlite
XAD-2, monitoreado por TLC y actividad
antioxidante según la técnica de Ohkawa et al.
(1979), resultando activas varias fracciones. Se
cuantificaron
por CGL a los ácidos trans-
cinnámico, p-coumárico y ferúlico en cantidades
acuoso
del
alga
marina
Bryothamnion
triquetreum, que pudieran justificar, al menos
parcialmente, su actividad antioxidante.
MATERIALES Y METODOS.
Colecta y preparación del extracto acuoso: Las
algas se colectaron en el bajo de Santa Ana,
Ciudad Habana en Septiembre del 2000. Las
especimenes
destilada
se
en
homogeneizaron
una
relación
1:4
con
agua
(p/v)
y
o
posteriormente se centrifugaron a 800 g a –4 C,
20 minutos. Los sobrenadantes se liofilizaron y
guardaron en congelación hasta su uso. El
rendimiento
estimado
del
producto
en
comparación con el alga fresca fue de 0.5%.
Determinación
formados
de
después
TBARS:
de
la
Los
TBARS
lipoperoxidación
de 221.9, 4187.3 y 442..3 µg/g de liofilizado. Se
espontanea de homogenados de cerebro ratas se
puede concluir que la actividad antioxidante del
midieron de acuerdo al método de Ohkawa et al4.
alga roja Bryothamnion triquetrum se debe, al
Esquema general del fraccionamiento: El
menos en parte, por la presencia de estos ácidos
extracto acuoso de Bryothamnion triquetrum fue
fenólicos.
fraccionado
utilizando
extracciones
liquido-
liquido, TLC y columnas de Amberlite XAD-2.
INTRODUCCION
Polifenoles totales: Los polifenoles totales se
determinaron según Quettier-Deleu et al5.
interes resultaron las fracciones intermedias de la
Determinación de ácidos fenólicos: Los acidos
columna de con un rendimiento mas bajo pero
fenólicos se determinaron por CGL de acuerdo al
con un grado mayor de pureza.
procedimiento de Miranda et al.6.
El cromatograma de los patrones de ácidos
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
fenólicos se presenta en la Figura 2A mientras
En
el
presente
una
que en la Figura 2B se muestra, de manera
la
ilustrativa, el cromatograma de una de las
lipoperoxidación espóntanea (CI50) de 23.9 µg del
fracciones de la columna de Amberlite XAD-2.
extracto acuoso liofilizado (Figura 1), resultado
En esta fracción se identificaron al ácido trans-
similar a lo obtenido por Miranda et al6.
cinnámico (tr 7.18), ácido p-coumárico (tr 14.93)
investigando
y ácido ferúlico (tr 17.89). En el resto de las otras
concentración
trabajo
inhibitoria
la
actividad
se
obtuvo
media
de
antioxidante
del
microalga Spirulina maxima, lo que evidencia la
fracciones
posible utilidad de esta alga para estos fines. El
fracionamiento sólo se identificaron estos tres
contenido total de compuestos polifenólicos del
ácidos fenólicos.
extracto liofilizado fue de 8.05 mg de sustancias
En el analisis de 1 g del extracto del alga
fenólicas/g de liofilizado. Wong y Cheung7
liofilizado se determinaron: 221.6 µg de ácido
reportan valores similares (8.44 mg/g ) para las
trans-cinnámico, 4187.3 µg de ácido p-coumárico
algas rojas H. charoides e H. japonica mientras
y 442.3 µg de acido ferúlico. Como se puede
Jimenez-Escrig et al.8 trabajando también con
apreciar el compuesto que aparece en mas
extractos del alga roja P. umbicalis y de otras
fracciones y en proporción mayor es el ácido p-
especies de algas marinas encontraron valores
coumárico, aparentemente los tipos y cantidades
entre 5 a 7 mg/g.
de los ácidos polifenólicos en las algas dependen
Al estudiar las diferentes fracciones obtenidas, los
de la especie en cuestión. En los cromatogramas
valores mayores de actividad se observan en las
de las diferentes fracciones aparecen algunos
fracciones mas polares, lo que pudiera resultar
picos presumiblemente de compuestos fenólicos
lógico si consideramos
no identificados, esto resulta lógico si
que generalmente los
de
los
diferentes
pasos
del
compuestos polifenólicos, en buena medida
de
esta
actividad
biológica
presentan cierta polaridad. Varias fracciones
resultaron activas lo que se pudiera explicar por
dos
factores:
poca
especificidad
procedimientos empleados
de
los
y por otro lado un
número alto de compuestos fenólicos que se deben
% de inhibicion de la
lipoperoxidación
responsables
100
80
60
40
20
0
1
10
100
1000
Dosis [extracto de alga] (µg)
resolver, con estructuras químicas muy parecidas,
lo que provoa que en varias fracciones aparezcan
los mismos metabolitos.Las fracciones de mayor
FIGURA 2 - Curva dosis-inhibición de la lipoperoxidación del
extracto acuoso del alga Bryothamnion triquetrum. Cada punto
representa la media de tres determinaciones. Se determino una
concentración inhibitoria media de la lipoperoxidación de 23.3 Ug.
Figura 2. A: Cromatograma de los patrones de ácidos fenólicos y el BSA: a:salicilico,b: trans-cinnámico, c:phidroxibenzoico, d:BSA , e:vanilico, f:gentísico, g:coumárico h:protocatequinico, i:quínico, j:p-coumárico,
k:gálico, l:ferúlico y m:cafeíco.
B: Cromatograma de la fracción F5-8 de la columna de Amberlite XAD-2. Los picos identificados
b′, j′ y l′ se corresponden con los tiempos de retención de los ácidos trans-cinnámico, p-coumarico y ferulico
respectivamente y el pico d con el BSA.
consideramos que las algas rojas presentan una
6.-Miranda MS, Cintra RG,
gran cantidad de compuestos fenólicos simples
Mancini-Filho J. .Braz J. Med. Biol. Res.,
bromados, sulfatados y florotaninos, de los que
31:1075-1079, 1998.
no se poseen patrones, entonces no es posible su
7.-Wong KH, Cheung CK. Food Chem., 72:11-
identificación por esta metodología. Diferentes
17, 2001.
investigadores han
reportado la actividad
8.-Jiménez-Escrig A, Jiménez-Jiménez I, Pulido
antioxidante de los ácidos fenólicos identificados
R, Saura-Calixto J. J. Sci. Food Agric. 81:.530-
en este trabajo
10,11
, por lo que se puede plantear
Barros
SBM,
534, 2001.
que la actividad antioxidante del extracto acuoso
9.-Fukumoto LR, Mazza G. J. Agric. Food Chem.,
del alga marina Bryothamnion triquetrum es
48: 3597-3604, 2000.
explicada, al menos parcialmente, por la presencia
10.-Schroeter H, Williams RJ, Matin R, Iversen L,
de los ácidos fenólicos.
Rice-Evans CA. Free Rad. Biol. Med., 29(12):
REFERENCIAS
1222-1233, 2000.
1.-Potterat O. Curr. Org. Chem., 1:415-440, 1997.
2.-Le Tutour B. Phytochemistry, 29:3759-3765,
1990.
3.-Yan X, Nagata T, Fan X.. Plant Foods Hum.
Nutr., 52(3):.253-262, 1998.
4.-Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K.. Anal. Biochem.,
95:351-358, 1979.
5.-Quettier-Deleu C, Gressier B, Vasseur J, Dine
T, Brunet C, Luyckx M, Cazin M, Cazin J-C,
Bailleul F, Trotin F. J. Ethnopharmacol.,72(12):35-42, 2000.
Perpectivas de las algas marinas como fuentes de antioxidantes naturales.
Fallarero1, C. Zaldivar1, R. Barro1, O. Castañeda1, F. Rivera1, A.Vidal1.
Institución: 1 - Grupo de Farmacología-Toxicología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana
Dirección: Calle 25 # 455 e/ J e I. Vedado. Plaza de la Revolución. Ciudad de La Habana, Cuba.
RESUMEN
Se realizó un tamizaje para identificar actividad antioxidante en 16 especies de algas tropicales del mar Caribe
y se cuantificó la capacidad de inhibir la lipoperoxidación espóntanea. El 68% de las especies analizadas mostró
actividad antioxidante satisfactoria. Este resultado conjuntamente con algunos parámetros biológicos permitió
seleccionar a las especies Halimeda incrassata (Hi) y Bryothamniom triquetrum (Bt). Las curvas de inhibición
de la lipoperoxidación espontánea en cerebro de rata y de la dismutación de los iones superóxido (O2· -)
generados in vitro (actividad tipo SOD) evidenciaron IC50 menores que 0.5 mg/mL, valores que son comparables
a los obtenidos para extractos crudos de otras especies vegetales.
INTRODUCCION
Los compuestos antioxidantes se presentan como sustancias prometedoras para el tratamiento de algunas
patologías debido en buena medida a que las especies de radicales del oxígeno actualmente son reconocidas como
elementos importantes en un número crecientes de enfermedades1. Las algas, las cuales constituyen un importante
recurso dietético en muchos países con menor incidencia de enfermedades neurodegenerativas atraen la atención
como fuente de antioxidantes con amplia aplicación en la Biomedicina y Alimentación2-4. El objetivo del presente
trabajo es presentar evidencias de la actividad antioxidante de extractos acuosos de Bryothamniom triquetrum y
Halimeda incrassata mediante procedimientos “in vitro” .
MATERIALES Y METODOS
Colecta y preparación del extracto acuoso: Las algas se colectaron en el bajo de Santa Ana, Ciudad Habana
en Diciembre de 2001. Las especimenes se homogeneizaron con agua destilada en una relación 1:4 (p/v) y
posteriormente se centrifugaron a 800 g a –4oC, 20 minutos. Los sobrenadantes se liofilizaron y guardaron a –4oC
hasta su uso.
Determinación de TBARS: Los TBARS formados después de la lipoperoxidación espontanea de homogenados
de cerebro ratas se midieron de acuerdo al método de Ohkawa et al5.
Determinación de la actividad de la superoxido dismutasa (SOD). Las condiciones experimentales fueron
similares a las descritas por Fridovich y McCord6.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Los resultados del tamizaje para identificar actividad antioxidante (Tabla 1) muestra que el 68% de las especies
estudiadas tienen más de 70% de actividad inhibitoria de lipoperoxidación, lo que evidencia las perspectivas de
estos extractos con estos fines. A partir de este tamizaje se decidió estudiar a las especies B.triquetrum (Bt) y
H.incrassata (Hi).
La actividad antioxidante de los extractos de
Tabla 1. Tamizaje de la actividad antioxidante de los
extractos acuosos de algas marinas
Hi y Bt fue evaluada en lo referido a su
habilidad para dismutar iones O2•- (actividad
ESPECIES
tipo SOD) y para capturar radicales OH•
Halimeda incrassata
Halimeda copiosa
Halimeda opuntia
Halimeda discoidea
Dictyopteris justii
Galaxaura oblongata
Galaxaura marginata
Bryothamnium triquetrum
Caulerpa racemosa
Gracilaria domingensis
Bryopsis plumosa
Kappaphycus alvarezii
Ulva fasciata
Kappaphycus alvarezii (red)
K. alvarezii (green)
% de inhibición de la
lipoperoxidación
(X ±DE)
100.00 ± 0.0
98.63 ± 1.9
98.47 ± 2.7
97.57 ± 2.4
94.33 ± 1.9
88.15 ± 6.0
85.60 ± 6.3
85.57 ± 4.1
73.83 ± 6.8
70.97 ± 6.5
58.93 ± 12.8
25.4 ± 12.4
16.5 ± 15.4
13.8 ± 8.3
11.7 ± 1.0
K. alvarezii (green-brown)
9.7 ± 13.7
(Figura 1). Como se puede observar, los
extractos de Hi y Bt tienen la capacidad de
inhibir la reducción del NBT de un modo
dosis-dependiente. La IC50 de ambos
extractos fue de 0.50 mg/mL. Un valor
similar de IC50 ha sido referido para la
actividad tipo SOD del extracto acuosometanólico obtenido de la corteza de Betula
platyphylla7.
La eliminación de radicales O2•- tiene
efectos positivos para el mantenimiento de la
homeostasis oxidante. En condiciones in
vivo, estas entidades químicas pueden oxidar
fácilmente
la
familia
de
enzimas
deshidratasas que contienen complejos [4Fe-4S] en sus sitios activos como la dihidroxiácido deshidratasa, la 6fosfogluconato deshidratasa, la aconitasa y las fumarasas A y B lo que conlleva a la inactivación de tales proteínas
y a la pérdida del Fe2+ de dichos clubsters, con lo que se facilita la participación de este metal en la reacción de
Fenton. Del mismo modo, en condiciones in vitro, el anión O2•- puede reducir el Fe3+ que se encuentre disponible
y de esa manera también facilitar su
H. incrassata
B. triquetrum
Porcentaje de inhibición de
la reducción del NBT
(%)
100
intervención en la reacción de Fenton.
80
También el O2•- puede reaccionar no
60
enzimáticamente con el NO• y formar ONOOque es un compuesto químico altamente
40
oxidante con muchos efectos tóxicos probados,
20
0
principalmente neurotóxicos8. En este sentido,
-1,0
-0,5
0,0
0,5
log (concentración de extracto) ( mg/mL)
1,0
la eliminación de O2•- tiene efectos positivos
sobre el equilibrio oxidante del organismo y la
Figura 1. Curva dosis-respuesta para la actividad tipo SOD de
los extractos de Hi y Bt. Los valores se expresan como media ± DS
(n=10).
actividad tipo SOD de estos extractos
resulta beneficiosa.
Producto de la reacción de dismutación
del O2•- se obtiene H2O2 que puede
atravesar fácilmente las membranas biológicas y en presencia de metales de transición como el Fe2+ generar
radicales OH• por medio de la reacción de Fenton entonces la actividad tipo SOD puede contribuir al desequilibrio
de la homeostasis en términos oxidativos.Entonces la actividad tipo SOD de los extractos sólo puede considerarse
Porcentaje de inhibición del
blanqueamiento de la pNDA
(%)
importante si se acompaña de la
capacidad
50
para
descomponer
los
peróxidos generados o para evitar un
40
H. incrassata
30
B. triquetrum
20
daño oxidativo mediado directamente
por H2O2, y/o de la habilidad para
10
capturar los iones OH• que se forman
0
como resultado de la reacción de
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
log (concentración del extracto) (mg/mL)
Figura 11. Curva dosis-respuesta para la capacidad de inhibir el
blanqueamiento de la p-NDA de los extractos de Hi y Bt.
Fenton. En la Figura 2 se puede
observar que sólo el extracto de Hi
muestra
actividad
atrapadora
de
radicales OH•, y que tal actividad es
dosis–dependiente con una de IC50 es
1.64mg/mL. El extracto de Hi puede
resultar útil como antioxidante que
previene la excesiva generación de
oxidantes mediadas por la reacción de Fenton, ya que exhibe simultáneamente la capacidad de dismutar iones O2•y capturar los radicales OH• formados durante esa reacción.
Al analizar estos resultados podemos concluir que existen especies de algas en nuestro sistema ecológico marino
con perspectivas de uso como antioxidantes.
REFERENCIAS.
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626-632, 1993.
CONTAMINACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE POR AGENTES FÍSICOS
Y QUÍMICOS EN LA ZAFRA TABACALERA EN LA PROVINCIA DE
PINAR DEL RÍO.
AUTORES: LIC. ARMANDO CORREA FERNÁNDE; DR. REYNALDO HEVIA PUMARIEGA.
DR. RAFAEL MOYA DÍAZ; LIC. ENMA RODRIGUEZ DURAN.
INSTITUCIÓN: CENTRO NACIONAL DE TOXICOLOGIA. Cuba.
E –mail: cenatox @ infomed. sld.cu
RESUMEN:
Durante los meses de Enero y Febrero del 2002 se produjeron dos intoxicaciones masivas agudas en
la Provincia de Pinar del Río en personas que laboran en la cosecha del tabaco. Los pacientes
expuestos presentaron síntomas tales como: Cefaleas, náuseas, vómitos, debilidad y dolores
abdominales. Se realizó un estudio de impacto ambiental con el objetivo de determinar la posible
etiología, para lo que realizamos visitas a las áreas afectadas. Se comprobó que dichos sucesos se
debieron a la interacción de los trabajadores con factores físicos y químicos. Los agentes químicos
(residuos de plaguicidas y nicotina) se determinaron por la técnica analítica de cromatografía gaseosa
y los agentes físicos (humedad y temperatura) por mediciones termohidrométricas.
INTRODUCCION:
Existen innumerables procesos naturales originados por el hombre que pueden lanzar al ambiente agentes químicos de
una manera inadecuada ó con riesgo para las diferentes formas de vida, ya sea desde el punto de vista cualitativo y
cuantitativo. También se conoces otros (agentes físicos que no dependen de la voluntad del hombre, dentro de los que se
destacan las radiaciones, el ruido, las vibraciones y alteraciones de la temperatura y la presión. En relación con los
agentes químicos, la situación se vuelve bastante compleja debido al elevadísimo número de sustancias que utiliza el
hombre hoy en día bajo las más diversas formas y en los más variados procesos.
Hay indicaciones de que en el mundo se están empleando alrededor de 600 000 productos químicos industriales. Este dato
es alarmante ya que desde el punto de vista toxicológico toda sustancia química está provista de un alto grado de
toxicidad, y puede inducir acciones y efectos nocivos sobre los seres vivos y en los ecosistemas.
Cuando por razones de protección de un cultivo contra plagas, enfermedades y malezas, se aplican los plaguicidas
correspondientes, se produce inicialmente un depósito sobre el objetivo en cuestión, cuya magnitud dependerá de la dosis
utilizada, de la composición del formulado del método y la uniformidad de la aplicación, de las características del medio
donde se aplican, así como las condiciones ambientales. De este modo, las plantas se convierten en depósito de
residuales por la acción de numerosos factores físicos y químicos.
En ocasiones ocurren contaminaciones en el ambiente imposibles de eliminar. Lo que sí es posible
es conocer
exactamente es la dimensión del problema, sus riesgos a corto y largo plazo y las medidas a tomar para reducir al mínimo
sus consecuencias. Contaminación es la presencia en el medio de cualquier compuesto orgánico ó inorgánico en exceso
de su ocurrencia natural y originado por la actividad humana.
OBJETIVOS: El objetivo del presente trabajo es realizar un estudio de impacto ambiental para determinar la posible
etiología de las intoxicaciones ocurridas.
METODOS:
Para la realización de estas investigaciones se visitaron 19 campamentos ó áreas de trabajo en la provincia Pinar del Río,
donde se recolectaban 4 variedades de tabaco (I, II, III, y IV). De ellos 12 donde hubo afectados (66,6%) y siete sin
afectaciones seleccionadas al azar como controles. Se tomaron muestras de fluidos biológicos (sangre y orina) para
análisis toxicológicos, las de rocíos depositados sobre las hojas de tabaco se tomaron temprano en la mañana con apósitos
de algodón esterilizados, luego se exprimieron en frascos de vidrio esterilizado, se taparon y se guardaron en congelación
para su posterior uso. Para la determinación de estos análisis (nicotina y plaguicidas se aplicó la técnica de cromatográfia
gaseosa según PNO 02.01 Norma ISO 10315, con pequeñas modificaciones utilizadas en el Instituto de Investigaciones
del Tabaco (C. Habana). Las temperaturas y humedad relativa en los días de los sucesos fueron emitidas por el Centro
Meteorológico Provincial, dicho centro empleó el método Termohidrométrico.
Se clasificaron las actividades de las 304 personas involucradas.
Se constató que en todas estas áreas se laboraba con el tabaco mojado y que ingerían agua y alimentos en el campo, sin
previo aseo. En dos de los campamentos a los que pertenecían ocho enfermos del mes de Febrero se comprobó que el
tabaco estaba mojado ó húmedo.
Otros aspectos analizados fueron la procedencia del agua potable, en este caso se almacenaban en tanques abastecidos de
pozos ó por pipas, dichos recipientes estaban correctamente tapados y clorados, si los alumnos acostumbraban a bañarse
en ríos, lagos, ó presas cercanas a los campos, lo cual fue negativo.
RESULTADOS Y DISCUSION:
En este estudio preliminar se hicieron algunos hallazgos que aportaron datos relevantes, a la posible etiología del
mencionado evento toxicológico, la determinación cuantitativa de la nicotina (Tabla II), puso de relieve distintas
concentraciones, según la variedad, pero este dato, no refleja exactamente dicha concentración, ya que las muestras no se
tomaron de forma homogénea, en ocasiones no se realizaron embebiendo el algodón en las gotas de rocío y se observaron
partículas de resinas en las muestras. Tampoco se registro correctamente el número de hojas muestreadas, punto de
muestreo, porción de la hoja, todo lo cual, atenta contra la uniformidad de los resultados.
Otro factor que influyó en el posible desencadenamiento de dicho evento, fue la elevadísima temperatura promedio (29
0
C) registrada en el mes de Enero, lo cual es atípico para una estación en la provincia. Otros elementos a destacar fueron
la presencia de niebla y la alta humedad relativa (98%), y las altas presiones migratorias (agentes físicos), la cual
favoreció la absorción de los productos químicos a través de la piel, que fue la vía de entrada del tóxico.
Aunque las concentraciones de residuos de plaguicidas encontrados unos días después del incidente en suelo, agua y
hojas de tabaco, estuvieron dentro de los límites permisibles (1 – 5 ppm), no se descarta la posibilidad de que el momento
de la intoxicación estuvieran cercanos al límite superior, lo que por sensibilidad humana, pudo afectar a algún que otro
individuo susceptible, hecho constatado en los diferentes campamentos visitados. Otro aspecto puede ser la posibilidad de
que haya ocurrido un sinergismo por la biodegradación de los plaguicidas utilizados con la nicotina de las hojas del
tabaco (agente químico).
En cuanto a las concentraciones de nicotina determinada en rocío sobre las hojas de tabaco se encontraron valores altos
teles como 65,28 ; 62,82 y 44,63 ug/mL aunque en cuba no existen valores permisibles de exposición a este alcaloide por
no haberse realizado estos estudio previos. En la literatura consultada (5, 6 y 7) se pudo comprobar que en otros países, se
han hecho estudios donde se identificaron trabajadores con sintomatológia similar a las presentadas en Pinar del Río.
Genbach y Perry (5) reportaron cifras de nicotina en el rocío de las hojas de tabaco entre 33 – 85 ug/mL. Ellos le llamaron
a esta afección “ Enfermedad del tabaco verde”, la causa más probable es la absorción de la nicotina a través de la piel,
cuando se cosecha tabaco verde.La nicotina es altamente soluble en agua, por lo tanto cuando el campo está mojado y los
trabajadores se empapan la ropa, esto favorece la absorción de la misma. Además, si el recolector de hojas de tabaco tiene
las manos o piel con algunas heridas, rasguños o erupción, también propicia la entrada de la sustancia al organismo. Se
comprobó en el presente estudio que los trabajadores que fumaban no se enfermaron, al parecer hacen tolerancia a la
nicotina, mientras los que no fumaban o eran novatos en el trabajo presentaron síntomas de intoxicación. Se constató que
el contacto directo con la hoja del tabaco, según la actividad desempeñada por el trabajador aumentó la incidencia de la
intoxicación, lo cual coincide con otros estudios (5, 6, 7). La intoxicación por nicotina como agente etiológico
(Enfermedad del tabaco verde), adquiere relevancia. Se produce en personas en contacto directo con el tabaco mojado,
cuadro clínico breve que desaparece al cesar la exposición, aparece fundamentalmente en horas de la tarde, como se
describe en esta enfermedad (5).
En el ámbito internacional la enfermedad del tabaco verde, se ha reportado en E.U5, India6 y Japon7, pero no se han hecho
muchos esfuerzos regulatorios para eliminar los peligros potenciales de esta enfermedad. En Cuba, no se tiene
experiencia al respecto, al parecer esta enfermedad había ocurrido con anterioridad al evento descrito en este trabajo pero
como el cuadro clínico es tan breve, se atribuían a otros eventos, sin que se reportaran que era una intoxicación por
nicotina.
CONCLUSIONES:
El sinergismo entre los factores ambientales y los agentes físico-químicos propició el desencadenamiento de dichos
eventos. La vía dérmica fue la puerta de entrada del tóxico. No se pudo establecer un criterio de intoxicación por nicotina
por la no existencia de un protocolo de investigación bien diseñado
REFRENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.
Azevedo FA, Colacioppo S. Guía sobre las necesidades mínimas para un laboratorio de Ecotoxicología. Metepec:
Eco; 1986.
2.
Albert LA. Curso básico de Toxicología Ambiental. Metepec: Eco, 1988.
3.
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2001.
4.
Delgado Díaz C J, Fung Riverón TM. Ecología y Sociedad. Estudios. La Habana; Editorial Ciencias Sociales, 1999.
5.
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lancet 1975; I (7905): 478 – 80.
6.
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School of Medicine, wiston – salem, North Carolina, USA: 1998; 7: 294 – 298 (Autumn).
7.
TA Arcury, SA Quadt, JS Preisser: Predictors of incidence and prevalence of green tobacco sickness among latino
farmworkers in North Carolina, USA:
J. Epidemiol Community Health 2001; 55: 818 – 824 (November).
CALIDAD DE LOS PARÁMETROS FÍSICO – QUÍMICOS DEL AGUA
EN ENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA EN PECES.
AUTORES:
LIC. ARMANDO CORREA FERNÁNDEZ; LIC. ONELIO CARBALLO HONDAL;
LIC. EMILIO ALVAREZ PÉREZ; TÉC. ANIA REYES; TEC. JOSE
TRUJILLO
INSTITUCION: CENTRO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA. E –mail: cenatox @ infomed. sld. cu
RESUMEN: El objetivo del presente trabajo fue determinar la calidad de los parámetros
físico-químicos del agua de los peces, destinados a un ensayo de toxicidad aguda estática
de un bioplaguicida obtenido por vía biotecnológica. La especie de pez empleada fue la
Cebra (Brachidanio rerio). El ensayo duro 96 horas, se empleó técnicas analíticas para
determinar la calidad del agua del Laboratorio de Investigaciones Toxicológicas y del
Ambiente.
Se midieron los parámetros: Oxigeno disuelto, Temperatura del ambiente y de la pecera, pH, Dureza total y
Conductividad como indicador auxiliar. Estas determinaciones son las exigidas por las Agencias Regulatorias
internacionalmente acreditadas para estos ensayos.
INTRODUCCIÓN:
La utilización de sustancias químicas y biológicas todos los aspectos de la vida se ha ido intensificado en los
últimos decenios. El comercio internacional se ha acrecentado proporcionalmente, dando un carácter
imperativo a la necesidad de un análisis y una evaluación constante de los procedimientos para determinar su
toxicidad. La inquietud respecto a los posibles riesgos para la salud que podrían derivarse de la exposición a
estas sustancias es una preocupación creciente en el mundo actual, especialmente en los países
industrializados. Es un requerimiento indispensable que los países dispongan de laboratorios destinados a
estudios de toxicología ambiental.
El comercio internacional se ha acrecentado proporcionalmente, el evidente potencial tóxico de dichos
agentes, pone de relieve la necesidad de evaluar constantemente los procedimientos de la calidad del agua en
aras de determinar su toxicidad.
La producción y aplicación de bioplaguicidas le ha permitido a Cuba contar con recursos propios para la
protección fitosanitaria de los cultivos y reducir el uso de los productos químicos en la agricultura, con el
consecuente beneficio para la protección del medio y la inocuidad de los alimentos.
En sentido general, la calidad del agua se determina por una serie de parámetros biológicos, físicos y
químicos. En cultivo de peces, se define la calidad del agua como la conveniencia de esta para la
supervivencia y crecimiento de los peces, y se controla normalmente por pocas variables. La mayoría de los
piscicultores conocen estas variables y están conscientes de la relación entre ellas y la producción.
MÉTODO:
Se utilizó un sistema de ensayo estático sin renovación de agua durante 96 horas con flujo de aire continuo
para la determinación de la toxicidad letal aguda o signos de toxicidad provocados por el producto de ensayo
sobre el pez cebra (Brachydanio Rerio), especie de agua dulce recomendada por las guías de estudio (EPA(1),
OECD(2) e ISO.7346-1(3)).
Para esto se empleo agua corriente del acueducto de Marianao, a la cual se le
determinaron los siguientes parámetros ; durante los 4 días cada 24 horas, en horas
tempranas de la mañana.
Dureza total entre 10-250 mg Ca CO3 / L
pH = 6 - 8.5
Sin presencia de cloro ( para asegurar que el agua no tuviera cloro, se dejó en reposo 72 horas el agua del
grifo) y se determinó la cantidad de cloro.
Oxígeno disuelto y/o de saturación y conductividad.
La concentración de oxígeno disuelto se determinó por el método electrométrico con un oxímetro, la
temperatura se determinó con termómetro calibrado, pH con pHmetro. En caso de observar cambios en el pH
del agua de las peceras, luego de añadir la sustancia de prueba, entonces se repetirá el procedimiento
ajustando el pH de la solución madre. El ensayo se realizó sin ajustar el pH. La dureza del agua y la
presencia del cloro se determinaron por el método tritrimétrico.
Parámetros físico-químicos a controlar durante el ensayo.
Parámetros físico-químicos a medir durante el ensayo en las peceras (diariamente). Estos comienzan a
medirse momentos antes de añadir los peces a las peceras, después de añadir los peces, luego cada 24 horas y
al concluir el ensayo.
PARÁMETROS
MÉTODOS
VALOR ESPERADO
Oxígeno disuelto (ppm)
Oxímetro
6-9 (ppm)
Termómetro
23± 20c
pH metros
6.6 – 7.2
Temperatura del líquido en la
pecera y del local
pH
Dureza del agua
(solamente el primer día)
Conductividad
(medida adicional)
Método tritímetro
Conductímetro
10-250
mg CaCo3/L
< 700 µs/cm
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
El oxígeno es el principal componente del aire, constituye un 20.95% pero es escasamente soluble en agua.
Las concentraciones de oxígeno disuelto son mayores a 0 0C y disminuye la temperatura como por ejemplo a
00c la concentración es 14,16 ppm y a 24 es 8.25 mg/l.
En este ensayo no hubo diferencias significativas del oxígeno disuelto entre el grupo control (8.97 ppm) y los
grupos de ensayo (8.48; 8.53; 8.87; 8.54; 8.50 ppm) durante las 96 horas de estudio. El valor más bajo
registrado durante la prueba fue de 8.16 ppm y el más alto 8.96 ppm, estos resultados son permisibles para
estos tipos de ensayos.
Las temperaturas (peceras y ambiente) se mantuvieron constantes durante el ensayo y dentro del rango
requerido.
El pH se define como el logaritmo negativo de la actividad del ion hidrógeno
pH= - log (H+).
Las aguas más naturales tienen valores de pH de 6.5-9 aunque existen muchas exposiciones, los puntos
ácidos y alcalinos letales para los peces oscilan entre 4 y 11 respectivamente.
Los pH obtenidos en el presente estudio oscilaron entre 6.5 y 7.0 como promedio durante el ensayo, lo cual
explica que no hubo variación significativa y que tanto las condiciones ambientales como el producto
evaluado no interfirieron en el comportamiento de dicho pH, el rango obtenido de pH estuvo dentro de los
valores esperados.
La dureza total se refiere a la concentración de metal divalente en agua, expresado en miligramos por litro del
carbonato de calcio equivalente.
Es necesario que el agua que se utilice para los peces contenga cierta cantidad de calcio y magnesio porque
de esta manera reacciona también la alcalinidad total. En este ensayo se observó claramente que los valores
obtenidos (75.06 mg de CaCO3/L-200 mg de Ca CO3L) estuvieron dentro del rango esperado.
La conductividad es la capacidad que tiene el agua de conducir la corriente eléctrica y sus valores indican los
grados de salinidad relativos; dependiendo esta en cierta medida de las proporciones de los iones principales
disueltos en el agua.
El rango de conductividad obtenido en el ensayo fue de 403.2 a 629.28 µ/cm y estuvieron dentro de los
valores esperados.
CONCLUSIONES:
La calidad de los parámetros físico-químicos del agua de los peces, tales como: dureza total, pH, cloro,
conductividad eléctrica y oxígeno disuelto se mantuvo dentro del rango establecido durante el estudio.
BIBLIOGRAFÍA:
1.
Azevedo FA de Colacioppo S. Guía sobre las necesidades mínimas para un laboratorio de
Ecotoxicología. México: ECO/OPS;
2.
Albert L. Curso básico de Toxicología Ambiental. México: ECO/OPS; 1988.
3.
Delgado Díaz CJ. La Habana: Editorial Ciencias sociales; 1999.
4.
United States Enviromental Agency (EPA) 712 – 6 –96 – 280 Febreary 1996 Mo.
5.
OECD. Guidilines for Testing of Chemicals. Vol. 1, París, 1993.
6.
Directiva del Consejo de la Comunidad Económica Europea Relativa a la Comercialización de Productos
Fitosanitarios. CEE 414, 119).
FARMACOCINETICA DEL4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHIDO POR VIA ENDOVENOSA EN PERROS
BEAGLE
Dr. Carlos A. González Delgado (MsC) 1, Lic. Lourdes Olivera Ruano (MsC) 1, Lic. Yoagne Trapero Quintana 2,
Lic. Armando Correa Fernández 1, Dr. Juan F. Sánchez de la Morena 1
1- Centro Nacional de Toxicología
2- Centro de Biofísica Médica
Resumen:
Introducción: El 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido, producto flavorante que se encuentra en alimentos y bebidas, es
un aldehído aromático de escasa toxicidad que está siendo evaluado como un nuevo fármaco para el tratamiento de la
Sicklemia por su capacidad de inhibir la polimerización de la hemoglobina S. Objetivo: Caracterizar farmacocinéticamente
al mismo administrado en dosis única por vía endovenosa en perros Beagle. Materiales y Métodos: Se administró a 5
animales una dosis de 75 mg/Kg en solución hidroalcohólica al 15 %. Se extrajeron muestras de sangre a diferentes tiempos
antes y después de la administración para cuantificar sus niveles plasmáticos por cromatografía líquida de alta presión
(HPLC). El análisis farmacocinético se realizó mediante el programa de computación PKCALL. Los valores de
concentración plasmática se ajustaron a través de un modelo abierto de dos compartimiento y se calcularon los parámetros
“modelos dependientes” y “no dependientes” que definen este modelo utilizando las expresiones matemáticas
correspondientes. Resultados: El tiempo de vida media biológico ( t ½
fase alfa (
) o de distribución el t ½
) fue de 19.71 ± 16.04 min., mientras que para la
fue de 5.06 ± 1.45 min. La Cmax. alcanzada fue de 60.06 ± 25.04 µg/mL, con un
área bajo la curva total (AUC 0 - ∞ ) igual a 440.63 ± 149.92 µg-min/mL. Se obtuvo un valor para el aclaramiento plasmático
de 18.27 ± 5.71 mL/min/Kg y un volumen de distribución (Vd
Área)
igual a 491.10 ± 333.51 mL/Kg. Conclusiones: La
cinética de este producto una vez administrado por vía endovenosa puede ser descrita a través de un modelo abierto de dos
compartimientos con una eliminación muy rápida del organismo y un alto volumen de distribución.
Introducción:
La Sicklemia, enfermedad molecular bajo estudio desde hace mucho tiempo, permanece en la actualidad sin una terapéutica
efectiva con pocos o ningún fármaco disponible para este propósito. Es causada por la presencia de la hemoglobina mutante
S (Hb-S). El trastorno genético fundamental es la sustitución del ácido glutámico por la valina en la posición 6 de la cadena
que provoca la polimerización de la Hb-S formando agregados moleculares en forma de estructuras microtubulares
alongadas que rigidifican y distorsionan el glóbulo rojo y disminuye su flexibilidad. Estas células obstruyen los pequeños
vasos capilares y ocasionan una oxigenación deficiente en los tejidos. La hipoxia tisular causada por la vaso oclusión en la
microcirculación y el consiguiente daño de los órganos, constituye la primera causa de morbilidad y mortalidad en esta
enfermedad. Desde el punto de vista terapéutico, han sido evaluado in vitro diferentes productos que inhiben el proceso
de polimerización de la Hb-S. Uno de ellos, el 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido es el de mejores resultados por su
moderada acción antisickling y escasa toxicidad
(1, 2)
. El objetivo del presente estudio fue el de evaluar la farmacocinética
del mismo por vía endovenosa (EV) en dosis única con vistas a una mejor interpretación de los resultados
farmacodinámicos y toxicológicos preclínicos.
Materiales y Métodos:
Se utilizaron cinco perros Beagle, machos, jóvenes, con pesos comprendidos entre 9.3 y 13.5 kg (10.54 ± 1.71 kg),
procedentes del CENPALAB. La administración de la sustancia de prueba se realizó de forma aleatoria. Se administró una
dosis única por vía oral de 75 mg por Kg de peso empleando para ello una solución de 45 mg/ml de vainillina en solución
alcohólica al 15%. Los animales se encontraron en ayunas desde la noche anterior al día de administración permitiéndosele
tomar agua. La misma se realizó en forma de infusión EV rápida a través de la vena safena. Después de la administración
del producto tuvieron libre acceso a la toma de agua y alimentos. Se realizaron extracciones de muestras de sangre de 5mL
mediante un trocar colocado en la vena yugular para la determinación de los niveles plasmáticos de la sustancia de prueba
antes de administrar la misma (t=0) y después a los siguientes intervalos de tiempo posterior a su administración: 1, 5, 10,
15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 y 180 minutos. La sangre extraída fue centrifugada inmediatamente a 2000
rpm durante 5 minutos. Del plasma obtenido se tomó una alícuota de 1ml la cual fue almacenada a -20oC hasta su posterior
análisis por HPLC. Los datos de concentración plasmática fueron analizados utilizando el programa de computación
PKCALC. Los valores de concentración plasmática se ajustaron a través de un modelo abierto de dos compartimiento y se
calcularon los parámetros “modelos dependientes” y “no dependientes” que definen este modelo utilizando las expresiones
matemáticas correspondientes según Gibaldi y Perrier
(3)
. Los valores de concentración plasmática inferiores al límite de
cuantificación de 0.2 µg/ml, no fueron tomados en consideración en el análisis farmacocinético.
Resultados y Discusión:
El volumen promedio de la solución administrada en este estudio fue de 17.56 mL, lo cual se corresponde con una dosis
única promedio de 790.38 mg (0.79 g).
La figura 1 muestra la curva promedio de los niveles plasmáticos en función del tiempo observada experimentalmente y la
ajustada según la ecuación del modelo. Los parámetros farmacocinéticos obtenidos se muestran en las tablas 1 y 2.
Tabla 1: Valores promedios de las constantes de velocidad y tiempos de vida
media.
K12
K21
T½ β
T½ ∝
∝(min-1)
β (min-1)
(min)
(min.)
(min-1)
(min-1)
0.0522
19.71
0.1508
5.06
0.0165
0.0673
±0.0237
±16.04
±0.0493
±1.46
±0.010
±0.036
Conce ntración (mcg/mL)
F ig ura 1 : P erfil d e lo s d ato s p ro m ed io
70
60
50
40
Ke
(min-1)
0.1192
±0.027
Tabla 2: Valores promedios de los parámetros farmacocinéticos de disposición.
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tie mpo (min)
Observada
80
Cmax
ABC0-∞
CL
Vd Ctral/kg
VdZ/kg
VdSS/kg
MRT
(µg/mL)
60.06
±25.04
(µg-in/mL
440.63
±149.92
(mL/min)
195.35
±76.19
( mL/kg )
118.32
±31.41
(mL/kg
491.10
±333.5
(mL/kg
254.88
±106.5
(min.)
14.18
±6.07
Estimada
Al analizar la figura 1, se observa una disminución rápida en los primeros 30 minutos seguido de una disminución más lenta
así como el buen ajuste de los datos experimentales mediante el modelo bicompartimental ya que la curva estimada a partir
de la ecuación que describe el modelo propuesto prácticamente se superpone a la curva de los datos experimentales. De esta
forma, se obtuvo la siguiente ecuación que describe el modelo propuesto:
Ct = 56.3993 e – 0.1508 t + 11.0061 e – 0.05225 t
La caracterización farmacocinética (Tablas 1 y 2), muestra una permanencia muy corta de este producto por los bajos
valores del tiempo de vida media beta (t ½ = 19.71 min.) y del tiempo medio de residencia (MRT= 14.18 min.). En
correspondencia con estos resultados los valores de aclaramiento fueron muy elevados (195.35 mL/min.). Si embargo, al
plotear a escala logarítmica los valores de concentración plasmática se observa a partir de los 50 minutos una tendencia a
un estado de meseta o plateau con una disminución mucho más lenta de los niveles plasmáticos. El límite de cuantificación
de la técnica analítica empleada (0.21 µg/mL) no nos permitió obtener valores de concentración en todos los tiempos de
extracción. Por tal motivo, el comportamiento observado con los últimos valores de concentración nos hace suponer que la
eliminación del 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido del organismo sea un proceso mucho más lento lo cual se
correspondería con un t ½ y un MRT más prolongados.
Por su parte, durante la distribución o fase
en la cual se dan simultáneamente los procesos de distribución y eliminación
se produce un descenso de los niveles plasmático muy rápido correspondiéndole un tiempo de vida media (t
½
)
igual a
5.06. Si tomamos en consideración que este producto para ejercer su acción penetra al interior de los eritrocitos y se une de
forma estable mediante enlaces covalente a la hemoglobina, esta disminución rápida de los niveles plasmáticos esta dada
por la ocurrencia simultanea de los procesos de distribución al interior de de los eritrocitos y a su eliminación propiamente
dicha del organismo. De esta forma, la cinética de distribución al interior de los eritrocitos y su posterior eliminación del
organismo una vez que se haya alcanzado el equilibrio final de distribución pudiera ser un proceso complejo en el cual
intervengan diferentes factores tales como: afinidad del mismo por los sitios activos presentes en la hemoglobina, número
de sitios activos, concentración de hemoglobina y valor del hematocrito, etc.
Las constantes de velocidad intercompartimentales K12, K21 presentaron valores de 0.01652 ± 0.01063 y 0.06735 ± 0.03637
min-1 respectivamente. La constante de velocidad de eliminación desde el compartimento central (Ke) presenta un valor de
0.1192 ± 0.0277 min-1.
Respecto al volumen de distribución se obtuvieron valores muy elevados para el volumen de distribución área (VdZ/kg) y el
volumen de distribución en estado estacionario (VdSS/kg) corregidos para los pesos de los animales de 491.10 mL/kg y
254.88 mL/kg respectivamente tomando en consideración el volumen plasmático del modelo animal empleado
(4)
, lo cual
demuestra que este producto presenta un alto grado de internalización. En cuanto a esto, aunque no contamos con
antecedentes en la literatura que nos permitan explicar este comportamiento consideramos que pueda estar dado por su
entrada y almacenamiento en el interior de los eritrocitos y su posible distribución a otros órganos, tejidos o fluidos lo cual
debe ser objeto de futuros estudios. A partir de los datos experimentales obtenidos concluimos que la cinética de este
producto una vez administrado por vía endovenosa puede ser descrita a través de un modelo abierto de dos compartimientos
con una eliminación muy rápida del organismo y un alto volumen de distribución.
Bibliografía.
1. Zaugg RM, Walder JA, Klotz IM. Schiff base aducts of hemoglobin. J. Biol.Chem. 1977:252(53):8542-8.
2. Abraham DJ, Mehanna
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1991:77(6):1334-1341.
3. Gibaldi M, Perrier D. Pharmacokinetics 2ª ed. New York: Marcel Dekker Inc., 1982.
4. Mitruka B.M. and Rawnsley H.M. Clinical biochemical and hematological reference values in normal experimental
animals. New York, Paris, Barcelona, Milan: Masson Publishing. USA Inc. 1977.
Influencia de las especies reactivas de oxígeno en la diabetes mellitus tipo 2
Autores: Caridad Margarita García Peña1, María Teresa Díaz Soto2.
1
Centro de investigación y desarrollo de medicamentos. CIDEM. Ave. 26 # 1605 e/ Puentes Grandes y
Boyeros. Plaza. Ciudad de la Habana..Cuba.C,P.10600. Telef: (537)881-0818 881-0830. Fax: (537) 33-5556.
Cidem·@infomed,sld.cu.
2
Centro de estudios para las investigaciones y evaluaciones biológicas. Instituto de Farmacia y alimentos.
Universidad de la Habana.
Resumen.
Se ha comprobado en los últimos años la implicación que han tenido las especies reactivas de oxígeno
(EROS) en la patogénesis de la diabetes mellitus (DM). Conociendo que estas células presentan el más bajo
potencial secuestrador de estas especies se realizó un estudio clínico en pacientes diabéticos controlados, no
controlados comparándolos con un grupo control, midiendo variables bioquímicas relacionadas con el estrés
oxidativo: superóxido dismutasa (SOD),
catalasa (CAT), malonildialdehído (MDA), y con el control
metabólico: fructosamina. Como resultado se obtuvo un incremento significativo de la fructosamina de los
pacientes diabéticos no controlados con respecto a los pacientes diabéticos no controlados y a su vez con
respecto al grupo control. Los niveles de CAT se vieron incrementados en los pacientes diabéticos no
controlados, con respecto a los controlados y al grupo control; ocurriendo lo mismo con los niveles de MDA.
Introducción.
La diabetes mellitus es considerada una afectación metabólica crónica, que puede ser causada por un déficit
relativo o absoluto de insulina
1,2
. En los últimos años se ha comprobado que las EROS participan en la
destrucción de las células beta pancreáticas y por tanto en el desarrollo de la diabetes.
Atendiendo a los antecedentes antes expuestos constituyó objeto del presente trabajo la evaluación del estrés
oxidativo en pacientes diabéticos tipo 2 con y sin control glicémico mediante la determinación de parámetros
bioquímicos que permiten caracterizar el estrés oxidativo en pacientes diabéticos tipo 2 y la relación entre el
grado de control glicémico y el estrés oxidativo.
Materiales y métodos.
El estudio se realizó de forma aleatorizada con un grupo de pacientes diabéticos controlados, no controlados
y un grupo control.Para la selección de los pacientes se tuvo en cuenta los siguientes criterios: pacientes
diabéticos tipo 2 conocidos, mayores de 15 años de edad..
Desarrollo experimental.
1.
Determinación enzimática de la catalasa: se realiza el seguimiento de la descomposición del
peróxido de hidrógeno por la enzima a λ=240 nm 3.
2.
Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa: Las lecturas se realizan a 420 nm 4
3.
Determinación de malonildialdehído: se determina a 535 nm.5
4.
Determinación de contenido relativo de fructosamina: se determina por la reducción que estas
originan sobre el indicador nitrobluetetrazolium (NBT) 6
El procesamiento de los datos se realizó a través del método Anova precedida de un Test de Homogeneidad
de Varianza, también se realizó un Test de Comparación Múltiple y se determinó el coeficiente de correlación
de Pearson (r2).
Resultados.
En la Tabla I se reporta la caracterización clínica de la muestra estudiada.
En la figura 1 se muestra la actividad de la enzima SOD en los grupos analizados: el valor promedio de
(23089.57 ± 4209.38) U/L, en los pacientes diabéticos no controlados (34298.94 ± 2648.07) U/L y en el
grupo control de (45086.00 ± 2894.11) U/L.
En la figura 2 se muestra la actividad de la enzima catalasa (CAT) en los tres grupos analizados
comportándose de la siguiente manera: en el grupo de individuos diabéticos controlados fue de (1111.67 ±
231.66) U/L, en el grupo de pacientes diabéticos no controlados de (3036.00 ± 513.16) U/L y el grupo
control de (800.00 ± 92.87) U/L.
Tabla I: Caracterización clínica de la muestra.
Edad (años)
15-30
31-45
46-60
F
M
Sexo
Control
n=24
Diabéticos con control
glicémico
n=24
Diabético sin control
glicémico n=24
11/46%
12/50%
1/4%
2/8%
22/92%
3/11%
8/28%
17/61%
18/64%
10/36%
37 ± 12
3/13%
7/29%
14/58%
13/54%
11/46%
38 ± 9
Edad debut de la
enfermedad (años)
SOD (U/L)
60000
a
c
40000
b
20000
0
Control
Diabéticos
Diabéticos no
Controlados
Controlados
Grupos con igual letra no son significativamente diferentes (p>0.05).
Figura 1: Actividad enzimática de la SOD.
CAT (U/L)
4000
b
3000
2000
1000
a
a
0
Control
Diabéticos
Diabéticos no
Controlados
Controlados
Grupos con igual letra no son significativamente diferentes (p>0.05).
Fig 2 Actividad enzimática de la CAT.
Se determinan las concentraciones de MDA, tanto en pacientes diabéticos controlados (3015.7 ± 892.47)
nmol/L, en diabéticos no controlados (9174.10 ±
1290.77) nmol/L como en el grupo control
(2212.00 ± 1007.12) nmol/L
Se evalúa el contenido relativo de fructosamina en cada uno de los grupos analizados mostrando los
siguientes valores: en el grupo de pacientes diabéticos sin control glicémico (0.07 ± 0.02), en los pacientes
con control glicémico (0.02 ± 0.01) y el grupo control (0.018 ± 0.015).
Discusión.
En la Tabla I se observa que en los grupos etarios 31-45 años y 46-60 años existe una mayor incidencia de la
enfermedad ello reafirma que la edad debut de la enfermedad es a partir de los 30 años, aunque es
excepcional encontrarla en sujetos jóvenes. En los dos grupos de individuos diabéticos estudiados se observó
el predominio del sexo femenino. La edad debut de la enfermedad fue de (38 ± 9) años en los pacientes
diabéticos sin control glicémico y de (37 ± 12) años en los pacientes diabéticos controlados metabólicamente.
Al analizar la actividad de la enzima SOD (Fig.1), se observa que en el grupo de diabéticos controlados y no
controlados disminuyó significativamente con respecto al grupo control (p<0.05), entre los dos primeros
grupos se encontraron diferencias significativas (p<0.05), apreciándose una disminución en la actividad de la
enzima de los pacientes diabéticos controlados en comparación con los pacientes diabéticos no controlados.
En la Fig. 2 se puede observar que existen diferencias significativas entre los dos primeros (p<0.05) y
observándose un incremento en la actividad de la enzima en los pacientes diabéticos controlados y no
controlados con respecto al grupo control. Se manifiestan diferencias significativas (p = 9.87 x 10-5) entre el
grupo control y el grupo de diabéticos no controlados. Estos resultados demuestran que esta inhibición de la
SOD en pacientes diabéticos no controlados se debe a las altas concentraciones de H2O2, el cual provoca una
estimulación marcada de la CAT (Fig 2), y la disminución de la actividad de la SOD de los pacientes con
control glicémico es debido a bajas concentraciones del radical anión superóxido que conlleva a la formación
de bajas concentraciones de H2O2 (sustrato de la CAT), manifestando una disminución en la actividad de esta
enzima.
Los niveles de MDA se relacionan con los obtenidos de la actividad de la SOD y la CAT , demostrándose
que en pacientes con control glicémico hay una disminución de la peroxidación lipídica con respecto a los
pacientes sin control glicémico.
Los valores obtenidos al determinar el contenido relativo de fructosamina demuestran que en los pacientes sin
control glicémico existe una correspondencia entre la ocurrencia de peroxidación lipídica y los niveles de
glucosa en sangre, coincidente este resultado con los obtenidos por Paolisso y col, en1998 quien planteó que
las altas concentraciones de glucosa sanguínea pueden generar EROs 7
Conclusiones.
En los pacientes diabéticos sin control glicémico, la glicosilación de proteínas contribuye a la generación de
EROs; el adecuado control glicémico influye positivamente en el estado oxidativo del paciente diabético;
en los pacientes diabéticos tipo 2 sin control glicémico hay presencia de peroxidación lipídica.
Bibliografía.
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Cameron W.I. Diabetes Mellitus in the australiam aborigens of bourke, New South Wales. Diabetes
Research and Clinical Practice. (1996), 2, (307-3114).
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Basargi, D. SH3 the domains direct. Cellular localization of signaling molecules. (1993), 74, (83-91).
3.
Chance B. (1995). Assay of catalases and peroxidases. Methods in enzimology II, (764-775).
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Boehringer M. (1988). Manual de técnicas y datos bioquímicos, Alemania. (350-386).
5.
Buege, J. A. (1978). Microsomal lipid peroxidation. Methods in enzimology. 30: (301-310).
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Thome J. (1996). Advanced glycation end products associated parameters in the peripherol bloor of
patients with Alzhiemers disease. Life sciences. Vol. 59, No. 8, (679-685).
7.
Paolisso y col. (1998). Oxidative strees and type 2 diabetes. Diabetes Monitor International. 10, (2), (16).
8. Rakesh, K y col. (1995). Lipid peroxidation and activity of antioxidant enzymes in diabetic rats.
Molecular and celular Biochemistry. 151, (113-119).
Caracterización histopatológica del daño inducido por Doxorrubicina en Corazón e Hígado.
Autores: Msc. Martínez Sánchez B.(1), Lic. Bequer Gessa P.(2), Dr. Merino N.(1), Dra. Torres Alemán MA.
(1)
1 Centro de Estudios para las Evaluaciones e Investigaciones Biológicas. Instituto de Farmacia y Alimentos.
Universidad de la Habana
2 Centro de Investigaciones Biomédicas
Resumén:
El presente estudio se diseño con el afán de conocer las principales alteraciones en la arquitectura de las
células cardíacas y hépaticas después de ser expuestas a la Doxorrubicina en dos modelos experimentales,
para los cuales se empleo una dosis de 3 mg/Kg de peso corporal durante 4 días consecutivos; la diferencia
entre ambos rádico en el tiempo en que duró el estudio para el primer caso se sacrificaron los animales al 5to
día (estudio 1)y para el segundo al 11no día, de comnezado el tratamiento(estudio 2).
Finalmente se pudo concluir que con la metodología empleada para ambos casos no se logró desarrollar daño
celular irreversible.
Palabras Claves: cardiotoxicidad, antraciclinas, miocardiopatias, Doxorrubicina, Insuficiencia
Cardíaca Congestiva
Introducción:
Es conocido que los medicamentos empleados en le tratamiento del cancér son extremadamente citotóxicos.
Las antraciclians son muy utilizadaspor su eficacia clíncia en el tratamiento de diferentes tipos de tumores;
pero muchos reportes indican que son altamente tóxicas principalmente para las células
cardíacas,constituyendo este una limitante para su uso clínico. (Casarett M. 1996, Goodman A. 1994)
Las razones antes comentadas son el motor que impulsa el desarrollo de investigaciones al respecto y para
tales fines se hace necesario contar con herramientas experimentales donde los resultados histológicos son de
incalculable valor para el conocimiento humano, en su lucha por mejorar la calidad de vida; reduciendo el
sufrimiento humano.
Metodología:
Se utilizaron ratas hembras de la especie Sprague-Dowley procedentes del Centro Nacional para la
Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), las cuales se encontraban en un intervalo de peso
corporal entre 200-270 gramos. En el tiempo que duró el ensayo los animales recibieron comida y agua ad
libitum, las condiciones ambientales fueron controladas con ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperatura
de 20-22 ° C y humedad de 50-52 %.
El esquema de tratamiento a continuación se detalla:
Se administró Doxorrubicina a una dosis de 3mg/Kg de peso corporal (i.p) durante cuatro días. Los animales
se dividieron para la realización de dos estudios: (1)- a dosis repetidas con sacrificio 24 horas después de la
ultima administración, (2)- a dosis repetidas con sacrificio a los 6 días después de la ultima administración.
En ambos casos los animales empleados se distribuyeron en dos grupos, control(agua p/ inyección) y tratado
(Doxorrubicina) en los días señalados se procedio al sacrificio, para lo cual se empleó cámara saturada con
eter etílico. Seguidamente se procedio a la necropsia de los animales tomandose muestras de
aproximadamente 5mm de diámetro de los tejidos seleccionados y se fijaron en una solución de formol al
10%. El método empleado fue la inclusión en parafina con la técnica de tinción convencional en eosinahematoxilina. Este estudio se realizó en el Centro de Estudios para las Evaluaciones e Investigaciones
Biológicas del Instituto de Farmacia y Alimentos de la Universidad de la Habana por el Dr. Nelson Merino.
Resultados:
Al realizar la necropsia a los animales incluidos en el estudio 1 se pudo visualizar claramente, en todos
tratados con la antraciclina, la presencia de hidrotórax e hidroperitoneo, alteraciones que no estuvieron
presentes en los pertenecientes al grupo control. Estos resultados coinciden con los reportados en la literatura
(Niitsu N.1997).
Los resultados obtenidos en relación al daño histológico en miocardio detectados en los animales sometidos al
estudio aparecen reflejados en la tabla 1, algunas de estas lesiones pueden observarse en las microfotografías
(Fig 1 y 2)
1
Tabla 1: Principales alteraciones histopatológicas en corazón de ratas tratadas con Doxorrubicina y agua para
inyección, n =5. Animales del estudio 1.
Alteraciones
Edema
Pericarditis
Necrosis focal
Discreta
interfibrilar
subaguda
de cardio
degeneración
Grupos
miocitos
granular de fibras
Control
Tratado con Dox
n
0/5
n
0/5
n
0/5
n
0/5
%
0%
%
0%
%
0%
%
0%
n
1/5
n
1/5
n
1/5
n
1/5
%
20%
%
20%
%
20%
%
20%
Fig 1: Microfotografía de corazón donde se observan infiltración mononuclear, y discreta degenaración
granular de fibras
Fig 2: Microfotografía de corazón donde se observa edema interfibrilar
Las alteraciones encontradas en hígado se presentan en la tabla 2 que a continuación se muestra:
Tabla 2: Principales alteraciones histopatológicas en hígado de ratas tratadas con Doxorrubicina y agua para
inyección, n =5. Animles del estudio 2.
Alteraciones
Lipidosis
Zona focal de
Grupos
necrosis
Control
n
0/5
n
0/5
%
0%
%
0%
Tratado con Doxorrubicina
n
2/5
n
1/5
%
40%
%
2
20%
En el estudio 2 solo se obtuvieron par ale grupo tratado con el antitumoral, en 2 casos una discreta
degeneración granular de las fibras del miocardio y un discreto infiltrado mononuclear en otro animal.
En lo que al hígado se refiere, sólo se pudo encontrar en 2 de los animales sometidos al tratamiento lipidosis y
en el grupo control no se visualizaron cambios aparentes.
Discusión:
De la Doxorrubicina se conoce su rápida captación por el corazón e hígado fundamentalmente siendo
metabolizada en mayor parte por este último, rindiendo un metabolito altamente tóxico por sus caraterísticas
de radical libre. Tales razones se tuvieron en cuenta para seleccionar los tejidos a estudiar en el presente
trabajo. Los resultados obtenidos en el estudio histopatológico de corazón donde aparecen leves lesiones, no
observándose todas éstas en el estudio 2; debe señalarse que las alteraciones que se producen en este caso son
generalmente más discretas, dando a entender cierta recuperación de las alteraciones reversibles provocadas
en el miocardio durante la terapia con el antitumoral.
A partir del análisis conjunto de todos estos resultados podemos arribar a las siguientes conclusiones:
Conclusiones:
Con el diseño experimental propuesto no se logran inducir daños en las céluas cardíacas y hepáticas
Referencias Bibliográficas:
Casarett M, Doull S. Toxicology: the basic science of poisons. 6ª ed. Millan: Mac Millan Publishing
Company; 1996.
Goodman A. Las bases farmacológicas de la terapeútica. 9ªed . Habana: Editorial Revolucionaria; 1994.
Niitsu N, Kato M, Shicishi K, Umeda M. Doxorrubicin-induced myocardial damage in erderley patients with
hematologic malignacies. Nippw-Ronen-Igakkai-Zasshi 1997; 34(1):38-42.
3
Modelos experimental de daño cardíaco tardío inducido pòr Doxorrubicina
Autores: Msc. Martínez Sánchez B.(1), Lic. Bequer Gessa P.(2), Dr. Suardíaz J. (3), Lic. Pérez Trueba G. (2),
Dra. Torres Alemán MA. (1)
1 Centro de Estudios para las Evaluaciones e Investigaciones Biológicas. Instituto de Farmacia y Alimentos.
Universidad de la Habana
2 Centro de Investigaciones Biomedicas
3 Hospital Hermanos Ameijeiras
Resumén:
El presente trabajo estuvo encaminado a instrumentar un modelo de daño cardíaco tardío, utilizando una dosis
de Doxorrubician de 3 mg/Kg de peso corporal durante 4 días consecutivos, descansando 6 días. Al 11no día
de iniciado el estudio se procedió a la caracterización del modelo crónico de citotoxicidad cardiaca a través de
diferentes indicadores bioquímicos-enzimáticos séricos: creatinin fosfokinasa (CPK), transaminasas (TGO y
TGP), albúmina (Alb), triglicéridos (Trig), glucosa.
Se concluyó que bajo las condiciones experimentales descritas se logran alteraciones cardíacas reversibles,
por lo que consideramos que para lograr un modelo de daño irreversible sobre cardiomiocitos debe
modificarse el régimen de administración del antitumoral en los animales de experimentación.
Palabras Claves: cardiotoxicidad, antraciclinas, miocardiopatias, Doxorrubicina, Insuficiencia
Cardíaca Congestiva.
Introducción:
En la quimioterapia de las enfermedades neoplásicas juega un papel fundamental el grupo de las antraciclinas,
dentro de las cuales se encuentra la Doxorrubicina, ampliamente utilizada por su acción antitumoral. Sin
embargo, limita su uso clínico la cardiotoxicidad, estudiada por muchos investigadores (Kesavan S. 1996,
Godoy L. 1997) y de la que se conoce la alta incidencia en desenlaces fatales, relacionada con Insuficiencia
Cardiaca Congestiva. (ICC) Diferentes investigadores han demostrado que la miocardiopatía que inducen las
antraciclinas tiene diferentes formas de presentación y una de las más temibles es el desafío tóxico tardío que
se produce. Se han mostrado datos que incluyen la existencia de Insuficiencia Cardiaca Congestiva (ICC),
transcurridos hasta 20 años después de culminada la quimioterapia con Doxorrubicina. Todas estas razones
justifican los esfuerzos encaminados a lograr la instrumentación de un biomodelo experimental de daño
cardíaco inducido por Doxorrubicina.
Metodología:
Se utilizaron ratas hembras de la especie Sprague-Dowley procedentes del Centro Nacional para la
Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), las cuales se encontraban en un intervalo de peso
corporal entre 200-270 gramos. En el tiempo que duró el ensayo los animales recibieron comida y agua ad
libitum, las condiciones ambientales fueron controladas con ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperatura
de 20-22 ° C y humedad de 50-52 %.
El esquema de tratamiento que se siguió fue el siguiente:
Inicialmente para cumplimentar nuestro objetivo de trabajo en relación a la caracterización de un modelo de
daño cardíaco tardío, se administro una dosis de Doxorrubicina(Dox) de 3 mg/kg de peso corporal por vía
intraperitoneal durante 4 días consecutivos. Para ello los animales se distribuyeron en 2 grupos de
tratamiento: control y tratado con el antitumoral. A continuación se dejaron un tiempo de lavado (6 días) y
posteriormente a todos los animales incluidos en el estudio se les extrajo sangre del plexo ocular, con previa
anestesia en cámara saturada con éter etílico. Las muestras de sangre se colectaron en microtubos de ensayo.
Se prepararón los sueros que fueron almacenados en microtubos individuales a –4 º C hasta su posterior
utilización. (Thielman K. 1973) en la determinación de los diferentes biomarcadores:
Actividad de las enzimas: transaminasa glutámico pirúvica (TGP) y transaminasa glutámico oxalacética,
(TGO), creatinin- fosfoquinasa (CPK).
Concentraciones de: glucosa (GLU), albúmina (ALB) y triglicéridos (TRIG).
Resultados:
Las enzimas están consideradas catalizadores biológicos, los cuales favorecen múltiples reacciones y son
altamente específicos en muchos casos. Ciertos tejidos contienen enzimas características que sólo penetran en
1
la sangre cuando existe una lesión celular en las cuales éstas se encuentran, por lo que la presencia de las
mismas son indicadores del probable sitio de daño tisular.
♦ Actividad de la Creatinin fosfokinasa total sérica:
Por varios autores se ha considerado a la enzima
creatinin kinasa como un marcador ideal de daño en
cardiomiocitos. (González-Sastre F. 1995, Wallach J.
1200
1998) El comportamiento de la enzima Creatinin
1000
fosfokinasa total sérica puede observarse claramente
tratado con
800
a través de la figura 1, a partir de la cual podemos
dox
U/L 600
decir que en el grupo tratado con Doxorrubicina la
control
*
actividad de la misma es menor significativamente
400
cuando la comparamos con el grupo control.
200
0
1
2
grupos de tratamiento
Fig. 1. Comportamiento de la actividad enzimática de la creatinin kinasa en suero, en los grupos de tratamiento. (*)
indica diferencias significativas respecto al grupo control (p<0.05).
♦ Comportamiento de la Albúmina sérica:
La albúmina es sintetizada en el
hígado, por lo que siempre la
aparición de alguna alteración de sus
30
*
tratado
concentraciones séricas es sinónimo
con dox
de afectación a nivel de la función
g/L 20
hépatica. La figura 2 muestra los
control
10
niveles séricos de albúmina a través
de la cual podemos apreciar que para
0
el grupo tratado con el antitumoral se
grupos de tratamiento
obtuvo un valor significativamente
menor al compararlo con el grupo
control.
Fig. 2. Comportamiento de los niveles de albúmina para los grupos de tratamiento. (*) indica diferencias
significativas respecto al grupo Control (p< 0.05).
♦ Comportamiento de la Transaminasas (TGP y TGO):
Según los resultados obtenidos a las actividades de TGP y TGO, podemos plantear que no se encontraron
diferencias significativas entre los grupos estudiados.
♦ Comportamiento de los niveles de Glucosa y Triglicéridos.
La glucosa y triglicéridos séricos no mostrarón variaciones significativas en sus niveles, entre los grupos en
estudio
40
1
2
Discusión:
El desarrollo de la cardiotoxicidad cardiovascular es la consecuencia más común del efecto farmacológico
exagerado después de la administración a sobredosis de medicamentos utilizados en el tratamiento de
enfermedades cardiovasculares , aunque también se conoce la afectación de este sistema por otros tipos de
fármacos. Sin embargo, no son suficientes los estudios realizados para tratar de conocer el papel que juegan
en la etiología de enfermedades cardiovasculares crónicas diferentes compuestos químicos –durante y
después- de la exposición a los mismos.
A pesar de que algunos reportes indican que la enzima CPK no se encuentra en el suero de pacientes con ICC,
en 1996 Kesavan y cols, reportaron un incremento de la misma debido al tratamiento con adriamicina. Por
otra parte, este grupo de investigadores demostrao una asociación entre la patogénesis de la cardiomiopatía
crónica por antraciclinas y la inhibición selectiva de los genes de expresión para la CPK in vivo. Se conoce
además que la misma puede alterarse en muchas otras situaciones y que los cambios aparecen rápidamente en
el tiempo, pero también tienden a normalizarse en el transcurso de los días después de provocado el daño
(González-Sastre F. 1995); lo cual ocurre en el presente trabajo al dejar de administrar el antitumoral y
2
realizar posteriormente las determinaciones. Aunque es de señalar que para este caso en particular ha ocurrido
algo interesante, y es que la CPK en el modelo tardío disminuye su actividad significativamente, incluso por
debajo, de los niveles del grupo control. En primer lugar, podemos pensar en una inhibición de la enzima
directamente por la doxorrubicina o sus metabolitos, producto de su biotransformación, hipótesis que habría
que corroborar en estudios futuros. Las Transaminasas son enzimas intracelulares que aparecen en cantidades
considerables por afectación de la membrana citoplasmática celular o de aquellos organelos subcelulares. Es
conocido en la actualidad que la TGO es una enzima ubicua marcadora de daño tanto a nivel hepático como a
nivel cardíaco. El comportamiento de estas en el presente estudio, nos está sugiriendo la posible recuperación
celular del daño inducido durante los primeros días de tratamiento.
La toxicidad que limita el uso clínico de los antibióticos antraciclínicos es la evidencia de cardiomiopatía,
cuya más grave consecuencia, como se conoce, es el desarrollo de Insuficiencia Cardiaca Congestiva
(Kesavan S. 1996, Godoy L 1997,Yamashita JI. 1994,Lipshultz SE. 1995). Conceptualmente, se define esta
alteración como el estado patológico en el cual una anormalidad de la función miocárdica es causa de la
incapacidad del corazón para impulsar sangre con un ritmo que corresponda a la necesidad de los tejidos y su
metabolismo. En la literatura se plantea que se ha prestado mucha atención al problema de conocer si la
insuficiencia del miocardio resulta de un defecto en la producción de energía, en su conservación o en su
utilización (Robbins SL. 2000). Todo este conocimiento, unido a la imposibilidad práctica de medir gasto
cardíaco en los animales empleados (ratas SD), justifica la necesidad de determinar una serie de indicadores
del metabolismo energético.
Aunque se conoce que la disminución de los niveles de albúmina ocurre debido a malnutrición, trastornos
hepáticos, pérdidas a través de la orina debida a glomérulonefritis , entre otras condiciones morfológicas
(Tilton RC. 1992), los reportes publicados por Robbins SL en 2000 indican que los efectos a distancia de la
ICC se manifiestan en diferentes órganos, perturbando sus funciones. Los riñones se encuentran entre los
órganos afectados, debido al trastorno hemodinámico que se produce en estos casos. Según reportes de
investigadores del Departamento de Nefrología del Instituto Gromigen para Estudios de Drogas, de Irlanda, la
Doxorrubicina produce nefrosis en ratas Wistar (De Boer E. 1999). Todos estos trabajos coinciden con los
resultados hallados en relación con la hipoalbúminemia, para el caso de animales tratados con Doxorrubicina,
en el presente trabajo experimental.
Conclusiones:
Con la metodología propuesta en nuestro trabajo, no se logra desarrollar un daño cardiaco tardío irreversible,
sustentado este planteamiento por los resultados obtenidos en las diferentes variables estudiadas y
principalmente en el exámen histopatológico de corazón e hígado
Referencias bibliográficas:
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with malignancies. Acta Pediátrica Japónica 1997; 39:188-193.
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271.
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Tilton RC, BalowsA, Hohnadelz DC, Reiss RF. Clinical Laboratory Medicine. St. Louis (Missouri): MosbyYear Book, Inc; 1992.
3
FARMACOCINETICA DEL 4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHIDO POR VIA ORAL EN PERROS BEAGLE
Dr. Carlos A. González Delgado (MsC) 1, Lic. Lourdes Olivera Ruano (MsC) 1, Lic. Yoagne Trapero Quintana 2,
Lic. Armando Correa Fernández 1, Dr. Juan F. Sánchez de la Morena 1
1- Centro Nacional de Toxicología
2- Centro de Biofísica Médica
Resumen:
Introducción: El 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido, producto flavorante que se encuentra en alimentos y bebidas, es
un aldehído aromático de escasa toxicidad que está siendo evaluado como un nuevo fármaco para el tratamiento de la
Sicklemia por su capacidad de inhibir la polimerización de la hemoglobina S. Los resultados obtenidos en estudios previos
administrado por vía endovenosa indican que su cinética puede describirse a través de un modelo bicompartimental con una
eliminación rápida y un gran volumen de distribución. Objetivo: Caracterizar farmacocinéticamente al mismo administrado
en dosis única por vía oral en perros Beagle. Materiales y Métodos: Se administró a 5 animales una dosis de 250 mg/Kg
en solución hidroalcohólica al 15 %. Se extrajeron muestras de sangre a diferentes tiempos antes y después de la
administración para cuantificar sus niveles plasmáticos por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). El análisis
farmacocinético se realizó mediante el programa de computación PKCALL. Los valores de concentración plasmática se
ajustaron a través de un modelo abierto de un compartimiento y se calcularon los parámetros “modelos dependientes” y “no
dependientes” que definen este modelo utilizando las expresiones matemáticas correspondientes. Resultados: La absorción
fue rápida. El valor máximo de concentración plasmática (Cmax.) fue de 26.76
g/mL y se obtuvo a los 15 minutos
(Tmax.) El tiempo de vida media de absorción fue de 5.51 minutos. El área bajo la curva (ABC0-∞ ) alcanzada fue de 807.7
g-min/mL. La biodisponibilidad absoluta resulto ser del 60 %. El tiempo de vida media de eliminación (t½) fue de 13.42
minutos. Los valores obtenidos para el volumen de distribución (Vd) y aclaramiento plasmático (CL) fueron similares a los
obtenidos por vía endovenosa con valores de 298.64 mL/kg y 18.8 mL/min/kg respectivamente. Conclusiones: Este
producto al ser administrado por vía oral se absorbe inmediatamente y alcanza una biodisponibilidad del 60 %. Su cinética
se describe a través de un modelo abierto de un compartimiento con una eliminación muy rápida del organismo y un alto
volumen de distribución.
Introducción:
La Sicklemia, enfermedad molecular bajo estudio desde hace mucho tiempo, permanece en la actualidad sin una terapéutica
efectiva con pocos o ningún fármaco disponible para este propósito. Es causada por la presencia de la hemoglobina mutante
S (Hb-S). El trastorno genético fundamental es la sustitución del ácido glutámico por la valina en la posición 6 de la cadena
que provoca la polimerización de la Hb-S formando agregados moleculares en forma de estructuras microtubulares
alongadas que rigidifican y distorsionan el glóbulo rojo y disminuye su flexibilidad. Estas células obstruyen los pequeños
vasos capilares y ocasionan una oxigenación deficiente en los tejidos. La hipoxia tisular causada por vaso oclusión en la
microcirculación y el consiguiente daño de los órganos, constituye la primera causa de morbilidad y mortalidad en esta
enfermedad. Desde el punto de vista terapéutico, han sido evaluado in vitro diferentes productos que inhiben el proceso
de polimerización de la Hb-S. Uno de ellos, el 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido es el de mejores resultados por su
moderada acción antisickling y escasa toxicidad
(1, 2)
. El objetivo del presente estudio fue el de evaluar la farmacocinética
del mismo por vía oral en dosis única con vistas a una mejor interpretación de los resultados farmacodinámicos y
toxicológicos preclínicos.
Materiales y Métodos:
Se utilizaron cinco perros Beagle, machos, jóvenes, con pesos comprendidos entre 9.2 y 12.7 kg (10.78 ± 1.66 kg),
procedentes del CENPALAB. La administración de la sustancia de prueba se realizó de forma aleatoria. Se administró una
dosis única por vía oral de 250 mg por Kg de peso empleando para ello una solución de 50 mg/ml de vainillina en solución
alcohólica al 15%. Los animales se encontraron en ayunas desde la noche anterior al día de administración permitiéndosele
tomar agua. Después de la administración del producto tuvieron libre acceso a la toma de agua y alimentos. Se realizaron
extracciones de muestras de sangre de 5mL mediante un trocar colocado en la vena yugular para la determinación de los
niveles plasmáticos de la sustancia de prueba antes de administrar la misma (t=0) y después a los siguientes intervalos de
tiempo posterior a su administración: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 y 180 minutos. La sangre extraída fue
centrifugada inmediatamente a 2000 rpm durante 5 minutos. Del plasma obtenido se tomó una alícuota de 1ml la cual fue
almacenada a -20oC hasta su posterior análisis por HPLC. Los datos de concentración plasmática fueron analizados
utilizando el programa de computación PKCALC. Los valores de concentración plasmática se ajustaron a través de un
modelo abierto de un compartimiento y se calcularon los parámetros “modelos dependientes” y “no dependientes” que
definen este modelo utilizando las expresiones matemáticas correspondientes según Gibaldi y Perrier
(3)
. Los valores de
concentración plasmática inferiores al límite de cuantificación de 0.2 µg/ml, no fueron tomados en consideración en el
análisis farmacocinético.
Resultados y Discusión:
El volumen promedio de la solución administrada en este estudio fue de 53.9 mL, lo cual se corresponde con una dosis
única promedio de 2.7 g.
La figura 1 muestra la curva promedio de los niveles plasmáticos en función del tiempo observada experimentalmente y la
ajustada según la ecuación del modelo. Los parámetros farmacocinéticos obtenidos se muestran en las tablas 1 y 2.
Tabla 1: Valores promedios de los parámetros farmacocinéticos de disposición
Conce ntración
F ig ura 1 : P erfil d e lo s d ato s p ro m ed io
30
Ke
25
(Min-1)
20
0.0522
±0.006
15
T½
CL
VdZ/kg
(min)
13.42
±1.7
(mL/min)
197.94
±84.95
(mL/kg)
349.55
±120.85
CL/Kg
(mL/min/kg)
18.80
±9.53
Vdss/Kg
(mL/kg)
298.64
±87.84
MRT
(min)
20.98
±2.72
Tabla 2: Valores promedios de los parámetros farmacocinéticos de biodisponibilidad
ABC0-∞
t½ (Abs.)
Cmax
MAT
Tmax.
FAbs
Ka
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tie mpo (min)
Observada
(min -1)
0.1616
±0.01
(min)
5.51
±3.00
(µg/mL)
26.76
±7.57
(µg-in/mL)
807.7
±326.73
(min)
14
±5.57
(%)
0.60
±0.27
(min)
9.42
±4.31
Estimada
Los resultados experimentales se ajustaron a un modelo monocompartimental. Se observa, sin embargo, una ligera
tendencia a la bicompartimentalidad como en el caso de la administración EV, aunque la influencia del proceso de
absorción junto con el hecho de que los niveles plasmáticos obtenidos son lógicamente menores la bicompartimentalidad no
es tan aparente. Este hecho provoca que la semivida biológica de eliminación obtenida este fundamentalmente determinada
por la fase alfa y ligeramente prolongada por una posible fase beta. De esta forma, se obtuvo la siguiente ecuación que
describe el modelo propuesto:
C = -63.8120 e – 0.1575 t + 65.2897 e – 0.05156 t
Al analizar la figura 1, se observa que la absorción es rápida alcanzándose la Cmax (26.76µg/mL) en plasma
aproximadamente a los 14 minutos después de su administración. así como el buen ajuste de los datos experimentales
mediante el modelo monocompartimental ya que la curva estimada a partir de la ecuación que describe el modelo propuesto
prácticamente se superpone
a la curva de los datos experimentales. Una vez alcanzada la Cmax, se produce una
disminución rápida de los niveles plasmáticos y al final una disminución algo más lenta. La caracterización farmacocinética
(Tablas 1 y 2), muestra una permanencia muy corta de este producto por los bajos valores del tiempo de vida media (t ½ =
13.42 min.) y del tiempo medio de residencia (MRT= 20.98 min.). En correspondencia con estos resultados los valores de
aclaramiento fueron muy elevados (197.94 mL/min.). El valor obtenido para la constante de absorción (Ka) fue de 0,1616
min −1 lo cual se corresponde con un T½ de absorción igual a 5,5 min. No se observó tiempo de latencia. El Tiempo Medio
de Absorción (MAT) fue de 9.42 min.
El ABC 0 - calculada por el método de los trapezoides lineales presentó un valor de 807.7 µg-min/mL. La biodisponibilidad
absoluta resulto ser del 60 %. Este valor de biodisponibilidad relativamente bajo pudiera estar condicionado entre otros por
los siguientes factores: características físico-químicas, coeficiente de reparto lípido-agua y grado de ionización a los
diferentes valores de pH del tracto gastrointestinal, precipitación y formación de complejos insolubles, metabolismo
presistémico, efecto de primer paso hepático y una ventana de absorción localizada en alguna porción específica del tracto
gastrointestinal
Respecto al volumen de distribución al igual que para la vía endovenosa, se obtuvieron valores muy elevados para el
volumen de distribución área (VdZ/kg) y el volumen de distribución en estado estacionario (VdSS/kg) corregidos para los
pesos de los animales de 349.55 mL/kg y 298.64 mL/kg respectivamente tomando en consideración el volumen plasmático
del modelo animal empleado (4), lo cual demuestra que este producto presenta un alto grado de internalización. En cuanto a
esto, aunque no contamos con antecedentes en la literatura que nos permitan explicar este comportamiento consideramos
que pueda estar dado por su entrada y almacenamiento en el interior de los eritrocitos y su posible distribución a otros
órganos, tejidos o fluidos lo cual debe ser objeto de futuros estudios. A partir de los datos experimentales obtenidos
concluimos que este producto al ser administrado por vía oral se absorbe inmediatamente y alcanza una biodisponibilidad
del 60 %. Su cinética se describe a través de un modelo abierto de un compartimiento con una eliminación muy rápida del
organismo y un alto volumen de distribución.
Bibliografía.
1. Zaugg RM, Walder JA, Klotz IM. Schiff base aducts of hemoglobin. J. Biol.Chem. 1977:252(53):8542-8.
2. Abraham DJ, Mehanna
A.S. Vainillina, a potencial agent for the treatment of sickle cell anemia. Blood
1991:77(6):1334-1341.
3. Gibaldi M, Perrier D. Pharmacokinetics 2ª ed. New York: Marcel Dekker Inc., 1982.
4. Mitruka B.M. and Rawnsley H.M. Clinical biochemical and hematological reference values in normal experimental
animals. New York, Paris, Barcelona, Milan: Masson Publishing. USA Inc. 1977.
ESTUDIO DE TOXICIDAD A DOSIS ÚNICA VÍA DÉRMICA DE LA MELAGENINA PLUS
Autores: MSc. Emilio Monteagudo Jiménez, Lic. Virna Cepero Rivero, Dra. María Boffill Cárdenas
Tec. Luis Días Costa
UNIDAD DE TOXICOLOGÍA EXPERIMENTAL
INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS MEDICAS DE VILLA CLARA
INTRODUCCIÓN
La Melagenina es empleada en la repigmentación de la piel dañada por quemaduras de cualquier origen y
sobre todo en el tratamiento del vitiligo. Es un extracto alcohólico al 50% de placenta humana que contiene
una lipoproteína que estimula la reproducción de los melanocitos y la síntesis del pigmento melánico. Más
tarde se demostró que enriqueciendo este producto con calcio aumentaba su eficacia terapéutica y de esta
forma surgió la Melagenina Plus(1,2).
Independientemente de la inocuidad comprobada de los preparados precedentes de Melagenina, el estudio
preclínico de una sustancia nueva no puede prescindir de los ensayos toxicológicos experimentales(3), estos
estudios se convierten en un paso infranqueable en la conformación del expediente de la sustancia para su
registro, distribución y comercialización. Dentro de estos estudios el de Toxicidad Aguda Dérmica(4-6) cobra
especial importancia presuponiendo que el uso de la sustancia es vía tópica por tanto es necesario comprobar
experimentalmente los efectos tóxicos sistémicos de posible presentación por esta vía. Por lo antes expuesto
el presente trabajo se propone el siguiente objetivo: evaluar la toxicidad vía dérmica, a dosis única, de la
Melagenina Plus.
MATERIALES Y MÉTODOS
Niveles de dosis:
A solicitud del productor se trabajó con producto terminado (1 solo nivel de dosis) utilizándolo tal y como se
presenta (extracto alcohólico de placenta humana al 50%) y el diseño experimental se muestra a continuación:
Grupo Tratamiento
Número de
Total
animales
H
M
I
Control negativo (agua destilada)
5
5
10
II
Control vehículo (etanol 70%)
5
5
10
III
Tratados (Melagenina Plus)
5
5
10
Descripción de la técnica (4-7)
El día anterior al comienzo del experimento se depiló el área de aplicación de la sustancia, alrededor de 4 X 5
cm en el área interescapular. Los animales se pesaron antes de su dosificación la que se efectuó mediante
aplicación de 1 ml del producto sobre el área de la piel rasurada, mediante frotación con los dedos índice y
mediano.
Los animales se observaron sistemáticamente para determinar signos y síntomas generales de toxicidad y en
particular la presencia de edema y eritema los que se evaluaron a las 24 horas por la metodología de Draize.
El peso corporal se controló nuevamente el día 7 y 14 (antes del sacrificio de los animales).
La eutanasia se ejecutó acorde con las exigencias bioéticas actuales. Una vez sacrificados se sometieron a
análisis anatomopatológicos macroscópicos en busca de lesiones groseras en todos los órganos.
El análisis estadístico de los datos se realizó empleando el paquete SPSS versión 8.0 para Windows.
RESULTADOS
El experimento culminó con un 100% de supervivencia.
En las observaciones sistemáticas realizadas durante las primeras 24 horas no se detectaron signos ni síntomas
clínicos indicativos de toxicidad sistémica, comportándose de la misma forma los 13 días restantes del
experimento.
De manera similar, la determinación de edema y eritema arrojó valores de 0 para todos los animales.
Todos los animales ganaron peso durante el estudio. El análisis estadístico se realizó de forma independiente
para ambos sexos, debido a las diferencias propias de la especie; se obtuvo como resultado que no existieron
diferencias significativas en cada medición entre los tres grupos de tratamiento, ni en el incremento de peso
total en el experimento.
El análisis macroscópico arrojó la no existencia de lesiones en los órganos estudiados.
DISCUSIÓN
Los resultados del presente estudio coinciden con otros de investigaciones, tanto farmacológicas como
toxicológicas, precedentes(8-10) efectuadas a productos de la familia Melagenina, debe recordarse que en el
caso de la Melagenina Plus solo ha sido enriquecida con Ca para optimizar su esquema de aplicación por lo
que se presupone que su toxicidad continuase siendo baja, tal como se ha obtenido en este ensayo y
coincidiendo con lo anteriormente reportado.
CONCLUSIONES
La Melagenina Plus no provoca signos ni síntomas tóxicos tras su aplicación dérmica en el modelo
experimental empleado por lo que bajo nuestras condiciones experimentales particulares se considera No
Tóxico Sistémico por esta vía.
BIBLIOGRAFIA:
1.
Miyares Cao,C. Melagenina: nuevo y eficaz medicamento para el tratamiento del vitiligo. Serie
Reseñas Nacionales. La Habana . p 397-401.(1986)
2. Miyares Cao,C. Et al. Informe preliminar sobre el empleo del extracto placentario humano en la
terapéutica del vitiligo. Rev.Cub.Farm. 11(1):67-72(1976)
3.
European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of chemicals (ECETOC). Good Laboratory
Practice, Monograhp 11. Brussels, Belgium. 1985 (Actualizado 2001)
4.
Organization for the Economic Cooperation and Development (OECD). Guidelines for testing of
chemicals, 401, Acute dermal toxicity. Disponible en: http://www.oecd.org
5.
EPA. Acute oral toxicity. Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.1100. Public Draft. Prevention
Pesticides and Toxic Substances(7101). EPA 712-C-96-190. June 1996.
6.
Hayes A. Acute toxicity and eye irritancy . In Principles and methods of toxicology. Chapter 16.
Raven Press. New York. 1994.
7.
National Academic Press. Guide for the care and use of Laboratory Animals. Washington DC.
USA.1996.
8.
García,R. Comprobaci{on experimental del efecto estimulante de la pigmentación cutánea de la
melagenina . En: La melagenina, nuevo medicamento cubano para el tratamiento del vitiligo.
Resultados de su utilización en Cuba y en el extranjero. La Habana.(1989).
9.
Randon,L.A. et al. Estudio doble ciego comparativo entre melagenina y placebpo en el tratamiento
del vitiligo. Dermatol. Venez. 25(3/4): 45-8(1987).
10. Cárdenas MB et al. Estudio farmacotoxicológico de la melagenina en ratas. Informe Final.
Departamento Unidad de Garantía de la Calidad.Unidad de Toxicología Experimental. Instituto
superior de Ciencias Médicas de Villa Clara. 1994.
THE ALTERANTIVE TOXICOLOGY. THE CELL LIKE ONE OF THE MOST IMPORTANT
PROTAGONIST.
MSc. Gastón García Simón.
LABORATORIOS LIORAD.
The Toxicology is the Science that studies among other aspects the potentiality of producing toxic effects in
man, experimental animals and environment by chemical substances. The same as most of the branches of the
knowledge it has had a tremendous development starting from the second half of last century, and begins with
the principle of 3ERRES that constitutes the rationale of what today is know as Alternative Toxicology. The
Alternative Toxicology is based in the procedures that Reduce, Refine and Replace animals in the Biomedical
experimentations, the teaching and the regulatory and toxicological studies. The cell, as structural and functional
basic unit of the human body is also playing a very important role in the evolution of this Science. Its
employment is in numerous procedures developed by Institutions so noted as the ECVAM (European Center for
the Validation of Alternative Methods), the CAAT (Center for Alternative Animal Testing), the ERGATT
(European Research Group for Alternatives in Toxicity Testing), Some of these institutions have protocols
worked out with those but refined validation procedures, based on the GLP (Good Laboratory Practice), to
mention some of the most important ones. The assays that have been described and use the cell or the cellular
cultures have been proposed to substitute test very well known like the Draize test, that determines the potential
irritating effect of chemical substances on the ocular structures. Among these are also for example the one that
uses the Red Blood Cells (RBC), an in vitro assay which allow the estimation of the irritation potential of
tensides and tenside containing materials such as shampoo, shower gels, cleaning products etc. The estimation is
based on the fact that surfactans interact strongly with cellular membranes and proteins. Both effects are
measured photometrically by use of the inherent native dye, oxyhemoglobin. Unlike other cell based systems,
the RBC assay is able to differentiate between membrane damage and protein damage, or the studies of
Photoirritation carried out on the shaved skin of animals exposed to the UV radiation, but now is doing using
erytrocytes too, with a similar mechanism.. This assay have been used by a number of investigator as a model
for phototoxicity studies. The Assay of reception of the neutral red coloring for the 3T3 cells of mouse
fibroblasts to demonstrate the cytotoxicity of some products, based on a comparison of the cytotoxicity of a
chemical when tested in the presence and in the absence of light after the exposure of the UVA radiation, the in
vitro 3T3 phototoxicity assay was recently evaluated in animals and human and has been shown to be predictive
for these effects, this procedure has been approved by the European Union for their use inside the countries
members and it is under study by the OECD (Organization Economical for the Cooperation and Development)
for their acceptance. Another alternative method is the use of the cytotoxic effects that produce some substances
over the cells L929, in order to study the Acute Toxicity (Undue) described in International Pharmacopeia for
the evaluation of the security of the ¨Medical Devices¨ and approved by the Directive 93/42/EEC, and the
ECVAM workshop ¨Alternatives to the animal testing on Medical Devices ¨ indicated that is recommended that
the requirement for the abnormal toxicity test to be conducted on batches should be deleted in all standards
harmonized. Medical Devices produced in compliance with GMP should not result in unexpected systemic
toxicity. Any failure in cleaning procedures, etc. could easily be detected by using simple cytotoxicity tests. Also
is known the use of the cells HEp-2 to study the cytotoxic effect of implantable materials used in Medicine and
Dentistry, the assay system determine the changes in cell morphology and proliferation of HEp-2 cell that occur
as a result of exposure to the test substances, The changes in cell number in a defined area of the culture are
recorded, to only mention some examples. In our conference we will address the procedures currently used in
view of substituting the traditional assays used in toxicology, the actual state of research in this field, and we will
also show some results obtained in our laboratory using the procedures of RBC. In this case we studied 19
substance and we can classified them as non, lightly, moderate and extremely irritant according to the
INVITTOX , protocol. In the case of the Photohemolisis test we study 5 substances and also we can classified it
as photoxic or non , and that of the L 929 cells to detect possible harmful effects of , 5 lots of two different
Manufactures of rubber plugs, as well as a total of 6 lots of plastic flasks, we classified the material like the USP
XXIV, and don ´t obtain any adverse effect over the cell. We can demonstrate convincingly that the cell is one
of the main protagonist in the development of the Alternative Toxicology.
Reference:
1.Invittox protocol Number 37. (1992) RBC test. ¨INVITTOX data Bank., Nottingham, U.K.
2. Pape, W.J.W. and Hoppe, U (1988)
Second World Surfactants Congress, Paris. Evaluation of acute irritation potentials of tenside using the in
vitro alternative red blood cell test system.
3. Vives M.A., Infante M.R., García E. et al (1999). Chemicobiological Interactions 118, 1-18.
4.Holzhutter H. G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose response
curves and its use for predicting in vivo phototoxicity of chemicals . ATLA 25, 445-462.
5.INVITTOX (1994). INVITTOX protocol No 78: 3T3 NRU Phototoxicity assay ¨INVITTOX data Bank,
Nottingham, U.K.
6. ZEBET/ECVAM/COLIPA (final version 7 sept 1998) Standard Operating Procedure, In vitro 3T3 NRU
Phototoxicity test.
7. OECD GUIDELINES FOR TESTING OF CHEMICALS DRAFT PROPOSAL FOR A NEW GUIDELINE
(February 2000). In vitro 3T3 NRU phototoxicity assay.
8. Spielmann H., Lovell W.W., Hozle E., et al (1994). In vitro phototoxicity testing: the report and
recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA 22, 314-348.
9. INVITTOX protocol No 38 LS 929 Cytotoxicity test (July 1992). ¨INVITTOX data Bank, Nottingham, U.K.
10. INVITTOX protocol No 50. Hep-2 Cytototcity test for implant Materials (july 1992). ¨INVITTOX data
Bank, Nottingham, U.K.
11. Svendesen O., Garthoff B., Spielmann H., et al. (1996)Alternatives to the animal testi8nf of medical devices.
ECVAM Workshop Report 17.
12. Anon. (1993). Council Directive 93/42/EEC of 14 June 1993 concerning medical devices. Official Journal of
the European communities L 169, 1-43.
EVALUACIÓN FÁRMACO TOXICOLOGICA DE DOS MEDICAMENTOS PROCEDENTES DE
ECUADOR OBTENIDOS A PARTIR DE PRODUCTOS NATURALES.
MSc. Gastón García Simón, MSc. Marcos Dehesa González, Téc. Luis A. Dios Oliva, Téc. Arturo Valdivieso
García.
Ave 35 # 23406, apto 20, San Agustín, La Lisa, Ciudad de la Habana, Cuba
Fax.271 7899
Teléfono: 2719531 hasta el 38.
[email protected]
[email protected]
LABORATORIOS LIORAD. CONSEJO DE ESTADO.
POSTER.
En la actualidad el retorno a la Medicina Natural y Tradicional es algo muy extendido en el mundo entero. El
Ecuador no es una excepción. En este trabajo se estudiaron dos medicamentos elaborados con plantas
medicinales, procedentes del mencionado país, en igual número de forma farmacéutica, la Uña de Gato (Uncaria
tomentosa) y el Chuchuguazo (Maytenus laveis), a las que se les han atribuido poseer efecto antiinflamatorio. El
estudio estuvo encaminado a evaluar el efecto biológico de: dos Jarabes (Uña de Gato y Chuchuguazo) y de una
cápsula (Uña de Gato) empleando el ensayo del edema plantar en ratas Wistar inducido por carragenina (al 1%).
La concentración utilizada para esta prueba, de cada forma, fue de 100 mg/Kg, según se reporta por el CYTED
(Programa Iberoamericano de la Ciencia y Tecnología para el Desarrollo). Se empleó para comprar a la
Indometacina en la dosis recomendada por el mencionado programa (7 mg/kg). Para el estudio de Toxicidad
Aguda se utilizó la vía oral empleando para ello una cánula intragástrica, (la dosis de 2000 mg/kg), en la misma
especie animal, siguiendo la guía de la OECD (Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico). Los
resultados obtenidos indicaron que las dos formulaciones estudiadas presentaron efecto antiinflamatorio similar
al de la Indometacina, medicamento ampliamente utilizado para estos fines. En cuanto al posible efecto tóxico
agudo oral, a la 2000 mg/kg, (Dosis Límite), según la OECD los producto evaluados se consideran como sin
clasificar y no son necesarios estudios a dosis superiores.
INTRODUCCIÓN.
Los productos naturales son en la actualidad uno de los principales arsenales de la terapéutica sus bondadosos
efectos y su escasa toxicidad hacen de ellos los medicamentos de elección para diferentes patologías, sin
embargo muchos se emplean solo por la tradición popular y sin haber efectuado los correspondientes estudios
farmatoxicológicos. El jarabe de Chuchuguazo y el de Uña de Gato, así como las cápsulas de esta última son
elaborados sobre la base de plantas oriundas del Ecuador, se les atribuyen efectos antiinflamatorios entre otros,
por lo que se hizo necesario demostrar el mencionado efecto empleando las técnicas descritas en la literatura
como la que aparecen en el programa Iberoamericano para el desarrollo y otras consultadas (1,2). Por otra parte
son necesarios los estudios de Toxicidad Aguda como requisito indispensable que aparece detallado en
numerosas guías internacionales, el cual nos garantiza dentro del margen del error que tiene aparejada la técnica
que los compuestos que sean ingeridos o que incidentalmente puedan entrar al organismo se les conozca el
posible potencial tóxico agudo para el humano. El estudio de Toxicidad Aguda Oral detallado en las guías
internacionales es de obligatorio cumplimiento para todo producto que vaya a introducirse por vez primera en el
mercado (3,4,5).
Nuestro trabajo por tanto estuvo encaminado a la demostración del efecto farmacológico fundamental así la
ausencia de efectos tóxicos agudos de los mencionados productos naturales.
MATERIALES Y METODOS
EXPERIMENTO I: EFECTO ANTIINFLAMATORIO
EXPERIMENTO II. ESTUDIO DE TOXICIDAD AGUDA DOSIS LIMITE.
DESARROLLO:
EXPERIMENTO I: VARIABLES A MEDIR.
ƒ
Volumen desplazado por la pata del animal.
•
% de inflamación.
Se determinó el efecto antiinflamatorio agudo mediante el ensayo que induce inflamación en la pata de la rata
por la carragenina utilizando el procedimiento del CYTED (1).
Se hicieron 5 grupos, todos recibieron la carragenina 0.1 % (0.1 mL), dos fueron tomados a manera de control
uno positivo y el otro negativo (indometacina 7 mg/kg) carragenina al 0.1 % (0.1 mL) y los tres restantes los
medicamentos objetos de estudio en las dosis de 100 mg/kg para los jarabes y 300 mg/kg para las cápsulas
Se procesaron los resultados obtenidos siguiendo las fórmulas descritas en el CYTED.
Experimento II. Toxicidad Aguda.
Se siguieron los procedimietos descritos en la OECD # 401.
Dosis Empleadas.
Jarabe de chuchuguazo: 2000 mg/kg.
Jarabe de Uña de Gato: 600 mg/kg (3 tomas)
Cápsulas de Uña de Gato: 2000 mg/kg.
ƒ Pesadas de los animales: días 1, 7 y 14.
ƒ Necropsias:
ƒ A todos al final de la experiencia.
ƒ Signos clínicos:
ƒ Durante los 14 días del ensayo
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
EXPERIMENTO I:
Los resultados del efecto farmacológico se encuentra en la figura # 1 que se muestra a continuación
100
% de inflamación
80
60
40
20
0
1
2
3
4
indometacina
32.68
40.1
26.48
31.31
Carragenina
36.32
57.2
79.15
61.31
J. chuchuguazo
17.73
25.2
13.85
5.8
J. De uña de gato
26.5
42.4
30.07
22.74
Cápsulas U. de Gato
36.7
46.08
50.76
32.58
horas
Como se puede apreciar el que mejor efecto antiinflamatorio comparado con la Indometacina presentó fue el
Jarabe de Chuchuguazo, seguido del Jarabe de Uña de Gato y de las cápsulas que aunque el % de inflamación
fue mayor que para los dos anteriores aun así estaban por debajo de la Carragenina tomada a manera de control.
TOXICIDAD AGUDA ORAL. OECD 401.
Los Pesos corporales no disminuyeron en el tiempo es decir que los tres tratamientos presentaron ganancia en
peso.
La necropsia efecuada a los órganos seleccionados (corazón, riñones, pulmones, corazón, hígado y bazo ), no
mostraron alteraciones macroscópicas por lo que se decidió no tomar muestras para su procesamiento.
Los animales no mostraron signos clínicos producto de la administración de los diferentes medicamentos.
CONCLUSIONES
ƒ Los JARABES de Chuchuguazo y de Uña de Gato, y las cápsulas de Uña de Gato, presentaron efecto
antiinflamatorio por la vía oral en las dosis seleccionadas en le modelo empleado.
ƒ Los medicamentos ensayados a las dosis que se estudiaron, dosis límite (jarabesy en uno la mayor que
se puede suministrar en un día de tratamiento., no presentaron efectos tóxicos agudos por la vía oral.
BIBLIOGRAFÍA:
1. CYTED. Programa iberoamericano de ciencia y Tecnología para el Desarrollo Lineal. Noviembre del
1996.
2. Vogel H. G. And Vogel W. Drug Discovery and evaluation . Pharmacological Assay. Ed. Springer
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5. ISO Biological Evaluation 1, 10, 12, 1992, 1999.
ESTUDIO PARA LA DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL FOTOTOXICO DE 10 PERFUMES DE
PRODUCCIÓN NACIONAL, EMPLEANDO EL PROTOCOLO 81 DEL INVITTOX.
García Simón G., Martínez Pacheco, Michel; Oliva Dios L. A. y Valdivieso García, A.
LABORATORIOS LIORAD. CONSEJO DE ESTADO.
Hasta hace muy poco tiempo los estudios que se realizaban para la determinación del potencial fototóxico,
empleaba a los animales, pero no había una guía para estos fines. Con el desarrollo de las técnicas de la
Toxicología Alternativa se establecieron varios procedimientos, entre los que se destaca el de la determinación
del potencial fotohemolítco y de la oxidación de la metahemoglobina para el tamizaje del posible efecto
fototóxico de los químicos o productos. En el presente estudio se empleó el protocolo 81 del INVITTOX, para
determinar el posible efecto fototóxico de 10 perfumes de Producción Nacional. La Cloropromacina y el Sodio
Dodecilo Sulfato se tomaron a manera de controles positivo y negativo respectivamente. Los resultados
obtenidos indicaron que ninguno de los perfumes empleados ni el Sodio Dodecilo Sultafo mostraban efectos
fotohemolítos puesto que el F F (Factor Fotohemolíto, relación entre la concentración hemolítica media no
irradiada con respecto a la irradiada) fue menor que 3, e igualmente los valores de la diferencia de Densidad
Optica (tratado y control) no superaban a 0.05, mientras que para la Cloropromacina se apreció que estos eran
mayores que los mencionados valores. Los resultados obtenidos nos permite plantear que los 10 perfumes de
Producción Nacional no son potencialmente Fototóxicos para los humanos, así como la utilidad del mencionado
protocolo para estos fines.
INTRODUCCIÓN:
Los cambios en los hábitos sociales en el desarrollo de los países guió al incremento de la exposición de los
humanos al potencial fototóxico o fotoalérgico o sea fotosensibilizante de los compuestos (1). Estas respuestas a
las drogas que son administradas sistémicamente son reportadas frecuentemente como reacciones adversas.
Varias clases de agentes farmacéuticos han sido implicados, los que incluyen antibacterianos, NSAID,
antidepresivos tricíclicos, diuréticos agentes anticancerosos y retinoides. (2) Los sistemas de ensayos para la
fototoxicidad basados en animales aún no cuentan con una guía internacional para su estudio (1), por lo que un
número de ensayos in vitro se han desarrollado, los que incluyen cultivos celulares, Cándida albicans, sistemas
bacterianos y células rojas de humanos (3,4).
En 1994, el INVITOX ( In Vitro Toxicology) publicó el protocolo 81 titulado: ¨RBC PHOTOASSAY¨ (5), cuyo
propósito es estudiar el potencial fototóxico de los químicos o productos terminados por su habilidad para alterar
la membrana del eritrocito y/o oxidar a la hemoglobina, bajo la exposición a la luz Ultra Violeta y visible (luz
solar). El propósito de esta investigación fue identificar el potencial Fototóxico mediante el cálculo del Factor
Fotohemolítico (FF), así como la formación de la metahemoglobina empleando un procedimiento similar y
obteniendo la
DO, de 10 perfumes de producción Nacional, y utilizando como controles positivo a la
cloropromacina, y negativo al Sodio Dodecilo Sulfato, puesto que al no existir una guía que norme el uso de un
procedimiento in vivo y dado a la importancia de que nuestro país se incorpore a la cada vez más importante
Toxicología Alternativa y en consonancia con el principio de las 3ERRES, el mencionado ensayo del RBC
PHOTOASSAY puede darnos una idea veraz de la peligrosidad o no de los mismos para la salud humana., sin el
empleo de animales de experimentación.
MATERIALES Y METODOS.
EXTRACCIÓN DE LAS CELULAS ROJAS SANGUÍNEAS (RBC).
Este procedimiento se hizo siguiendo lo descrito en el protocolo 81, que nos sirvió de base.
CONTROLES.
Control positivo: se utilizó a la cloropromacina, en una concentración del 0.03 % (0.3 mg/mL).
Control negativo: se utilizó al SDS, en una concentración del 0.1 % (1 mg/mL).
Sustancia a ensayar:
Se emplearon 10 perfumes provenientes de la firma Suchel Tropical, con su correspondiente certificado de
calidad los que se denominaban:
Bonabel amarillo; azul; rosado; violeta; Tropical 1 y 2; Agua de violetas; Café de París; Angel y Blue Sky
Control de lisis espontánea y 100 % de lisis.
Se determinó la lisis espontánea y el 100 %
DETERMINACIÓN DE LA METAHEMOGLOBINA:
Se efectuó con las mismas condiciones que para el ensayo de fotohemólisis.
Pero se adicionó a cada pocillo de las placas (con y sin irradiación), 100 (µL) de una solución al 1 % de tritón X
– 100
CALCULO DEL FACTOR FOTOHEMOLITICO Y CLASIFICACION DEL POTENCIAL
FOTOTÓXICO.
Se empleó el método de los mínimos cuadrados para determinar la concentración que lisa al 50 % de los
hematíes con y sin luz y posteriormente se utilizó la siguiente descrita en el mencionado protocolo.
Se consideró a la sustancia como fototóxica si el Factor Fotohemolítico era mayor que 3.
Formación de la metahemoglobina.
DO = D.O. (con luz) – D.O. (sin luz)
Cuando la DO es mayor de 0.05, igualmente se consideró al producto como Fototóxico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
FACTOR FOTOHEMOLITICO Y FORMACIÓN DE LA METAHEMOGLOBINA
TABLA # 1. RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL FOTOTÓXICO DE 10
PERFUMES DE PRODUCCIÓN NACIONAL.
PRODUCTOS
FF
DO
CLASIFICACION
CLOROPROMACINA
3.14
0.321
FOTOTOXICO
SDS
1.18
0.009
NO FOTOTOXICO
Agua de violetas
1.75
0.021
NO FOTOTOXICO
Angel
1.30
0.29
NO FOTOTOXICO
Bonabel amarillo
2.00
0.046
NO FOTOTÓXICO
Bonabel Rosado
1.59
0.001
NO FOTOTÓXICO
Bonabel Violeta
1.98
1.66
0.033
NO FOTOTOXICO
0.31
NO FOTOTOXICO
Café de París
1.97
0.31
NO FOTOTOXICO
Tropical 1
1.41
0.10
NO FOTOTOXICO
Tropical 2
Bonabel azul
2.01
0.40
NO FOTOTOXICO
Blue sky
2.45
0.47
NO FOTOTÓXICO
La cloropromacina tomada como control positivo y reportada como tal por el protocolo que nos sirvió de base
para este estudió (2) mostró un valor del FF de 3, y su DO fue mayor igualmente que 0.05 por lo que se puede
considerar como Concentración Fototóxica, sin embargo el Sodio Dodecilo Sulfato, control negativo, a pesar de
producir hemólisis pues está referido que a la Concentración empleada (0.1 %) debe ocasionar la lisis de los
hematíes (1), los resultados indicaron que tanto sin luz como con ésta los efectos fueron similares sobre las
mencionadas células por lo que el valor del FF fue de 1.09, lo cual lo clasifica como no potencialmente
Fototóxico. Cuando se analizó los resultados obtenidos para los 10 perfumes de Producción Nacional, ninguno
de ello mostró un valor del FF igual o mayor que 3, ni tampoco la DO fue en caso alguno superior a 0.05, por
lo que siguiendo lo descrito en el mencionado protocolo 81 (2), las sustancias se considera como Potencialmente
no Fototóxico. En un estudio realizado por Pape y col se encontró que cuando se utiliza solo el factor
fotohemolítico se pueden producir aunque en un porciento bajo, falsos negativos, pero cuando se incluye la
determinación de la formación de metahemoglobina entonces los resultados se acercan más a la realidad, o sea
detecta correctamente a los que son o no potencialmente fototóxicos. Mariko y col también reportaron la utilidad
de este ensayo para la determinación del potencial fototóxico de las sustancias (6), pero indicaron que no
determina la fototoxicidad de compuestos como el 8 o el 5 metoxy-psoraleno, de las que se conoce su potencial
para producir este tipo de efectos en los humanos, pues ellos no causan hemólisis, por lo que concluyen que es
importante para estudiar la fototoxicidad in vitro, al igual que la mayoría de las otras determinaciones
toxicológicas, lo correcto es tener una batería de ensayos, al menos dos de ellos, y que de una gran ayuda puede
ser el QSAR (relación estructura química, actividad biológica).
No obstante como los perfumes analizados no presentan en su composición estos compuestos, y dado a que no se
dispone de una técnica in vivo validada y normada por las guías mencionadas, entendemos que con el
conocimiento de las dificultades que este test presenta el mismo puede servirnos para la determinación de los
potenciales fototóxicos de los perfumes que producen nuestras industrias.
CONCLUSIONES.
™ Los 10 perfumes de Producción Nacional no fueron potencialmente fototóxicos en el ensayo realizado.
™ Se demostró por vez primera que la técnica in vitro de determinación de fototoxicidad, es factible,
rápida, reproducible y económica.
RECOMENDACIONES.
9 Estudiar la factibilidad de otro ensayo como el de las células 3T3 de fibroblasto de ratón para
determinar la Fototoxicidad de los compuestos en general.
BIBLIOGRAFÍA.
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el grado académico de maestro en Ciencias, Habana, junio del 2000.
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vitro Skin toxicology vol 10, 203-211, 1994.
8. Mariko S., Itagaki H. and Kato S. Photohemolysis test and yeast growth inhibition assay to assess
phototoxic potencial of chemical (ibid) 213-221.
Irritabilidad dérmica y oftálmica de la Crema Anticelulitis MB.
Autores: MSc. Emilio Montegudo Jiménez, MSc. Geidy Lorenzo Monteagudo, Dra. María Boffill Cárdenas,
Téc. Luis Díaz Costa, Téc. Belkys Verdecía Machado
UNIDAD DE TOXICOLOGÍA EXPERIMENTAL
INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS MEDICAS DE VILLA CLARA
INTRODUCCIÓN
Los productos naturales, aunque generalmente no son asociados con la producción de efectos tóxicos
considerables, no constituyen una excepción, por lo que también deben ser sometidos a evaluaciones que
garanticen la seguridad de su uso. Los estudios de Irritabilidad Dérmica y Oftálmica se sitúan dentro de las
pruebas de Primera Barrera imprescindibles a realizar a productos cuyo uso presupone el contacto con la piel.
Son ampliamente utilizados por los toxicólogos para evaluar el daño potencial de las sustancias sobre las
estructuras de la piel y el ojo. Los mismos aparecen estipulados como
obligatorios por las Agencias
Regulatorias internacionales(1-6) así como por la Agencia Regulatoria Cubana (CECMED) para sustancias
que presuponen el contacto con piel u ojos. Es por ello que nuestro trabajo se propone como objetivos:
evaluar el potencial irritante dérmico de la Crema Anticelulitis MB y determinar el potencial irritante
oftálmico de este producto
MATERIALES Y MÉTODOS
(2-4)
IRRITABILIDAD DÉRMICA
: se utilizaron 3 conejos de la raza Nueva Zelanda, hembras, de 2 – 3 kg
PV, hembras, procedentes del CENPALAB, con su correspondiente certificado de calidad.
Aproximadamente 24 horas antes de la aplicación, se rasuró la piel de la región dorsal a ambos lados de la
espina dorsal y se escogieron los animales que presentaron la piel intacta los que fueron alojados de manera
individual en módulos para esta especie e identificado cada box(7,8). Se aplicaron 0.5 g de la sustancia (2
aplicaciones por animal) directamente sobre la piel y se mantuvieron en contacto con ella durante 4 horas
mediante apósitos de gasa de 6cm2 y esparadrapo. Pasado este tiempo se retiraron los apósitos y la superficie
de la piel fue lavada con agua atemperada para eliminar la sustancia residual. Se observaron las áreas de
aplicación a las 1, 24, 48 y 72 horas posteriores a la retirada de los apósitos con el objetivo de determinar el
grado de eritema y edema, asignándosele la puntuación correspondiente según la escala propuesta por Draize.
Con los datos obtenidos se calculó el Índice de Irritación Primaria (IIP) para la clasificación final del
producto.
IRRITABILIDAD OFTÁLMICA(5,6): en esta técnica también se utilizaron 3 conejos de la raza Nueva
Zelanda, de 2 – 3 kg PV, hembras, procedentes del CENPALAB, con su correspondiente certificado de
calidad. La
semana antes del comienzo del estudio, los conejos fueron trasladados al cubículo de
experimentación para lograr su aclimatación. Durante este tiempo se realizaron inspecciones diarias para
garantizar un adecuado estado de salud de los mismos. 24 horas antes del comienzo del experimento se
examinaron ambos ojos de los animales y se seleccionaron aquellos sin daño alguno ubicándose de manera
individual en módulo de la especie e identificado cada box. Se instilaron 0.1g de la sustancia de prueba en el
fondo del saco conjuntival del ojo derecho de cada animal, manteniendo los párpados unidos durante 5
segundos. El ojo izquierdo se tomó como control.
Transcurrida 1 hora de la aplicación de la sustancia se procedió a lavar el ojo con solución salina fisiológica
para realizar las observaciones correspondientes. Las lecturas posteriores se realizaron a las 24, 48 y 72 horas
para graduar los daños en estructuras tales como: córnea, iris y conjuntiva. Para determinar los posibles daños
corneales se tiñó el ojo con Fluoresceína sódica al 2% y se observó con el auxilio de una lámpara de luz
ultravioleta (Kamag). Con los resultados obtenidos se determinó el Índice de Irritación Ocular (IIO) a fin de
clasificar el producto.
RESULTADOS
El estudio de irritabilidad Dérmica evidencia los siguientes resultados:
Animal
OBSERVACIONES (HORAS)
Sitio de
1
aplicación
I
1
II
I
24
48
72
Ed
Er
Ed
Er
Ed
Er
Ed
Er
0
2
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
2
II
I
3
II
Leyenda: Ed: Edema
Er: Eritema
Estos resultados conducen a la obtención de un Índice de Irritación Primaria (IIP) de 0,16, acorde a lo
esperado teniendo en cuenta el origen natural de los componentes esenciales de la crema y la estimada baja
toxicidad de los mismos el producto pasa la prueba como No irritante dérmico según la escala de clasificación
del método de ensayo.
Respecto a los resultados de la Irritabilidad Oftálmica estos se muestran en la siguiente tabla:
Tiempo
(horas)
1
24
Animal
Córnea
Iris
Conjuntiva
Quemosis
Secreciones
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
3
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
Opacidad
Área
1
1
2
48
72
1
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
Estos resultados conducen al cálculo del Índice de Irritación Ocular (IIO) el cual arroja un valor de
0,5 que comparándolo con la escala de clasificación establecida en el método de ensayo lo ubican
en la categoría de No Irritante Ocular también.
DISCUSIÓN
Tomando en consideración el origen natural de los componentes de la crema en estudio los
resultados se ajustan a las predicciones efectuadas a tal efecto, o sea, nula toxicidad tanto cutánea
como oftálmica, además no se reportan resultados relacionados con esta crema pues es de nueva
creación y el perfil de estudios efectuados es extremadamente reducido introducción además de por
razones de protección del producto.
CONCLUSIONES
De acuerdo al sistema de clasificación empleado, la Crema Anticelulitis MB se comporta como: NO
IRRITANTE CUTÁNEO y como NO IRRITANTE OCULAR
BIBLIOGRAFIA
1.
Comisión de las Comunidades Europeas. Propuesta de Directiva del Parlamento y del Consejo por la
que se modifica por séptima vez la Directiva 76/768/CEE relativa a la aproximación de las
legislaciones de los Estados Miembros en materia de productos cosméticos. Bruselas; 2000.
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animales de experimentación. In: Stol L, editor. Ontario: CCAC; 1998. Disponible en:
URL:http://www.ccac.ca.
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA DEL 4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHÍDO
EN HEMATÍES SS.
Grisel del Toro García,— José E. Falcón Dieguez,— Yamirka Alonso Geli,— Yolanda Valdés Rodríguez.
—
Centro de Biofísica Médica, Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n, 90500, Santiago de Cuba, Cuba. Fax: (53) (22) 686214, 632545.
E. mail: [email protected], [email protected]

Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Calle 222 y 23 No.250, La Coronela, la Lisa, La Habana.
Palabras claves: 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído, anemia drepanocítica, hematíe, hemólisis, polimerización, vainillina.
Resumen
La Anemia Drepanocítica es una hemoglobinopatía frecuente en el mundo y un modelo de enfermedad molecular. Se expresa por
una combinación homocigótica autosómica del gen β-globin mutado, que determina la sustitución del ácido glutámico (Glu) por la
valina (Val), en la posición 6 de cada cadena polipeptídica β (β6
glu→val
), dando lugar a la hemoglobina S. Las moléculas de
desoxihemoglobina S se polimerizan formando estructuras microtubulares elongadas que rigidifican, distorsionan y disminuyen la
flexibilidad del hematíe. La polimerización es el evento primario de la drepanocitemia; los hematíes distorsionados obstruyen los
vasos de menor calibre de la microcirculación, provocando una oxigenación deficiente de los tejidos. Actualmente no existe un
tratamiento efectivo por lo que se impone el estudio de compuestos con actividad antisickling como posibles candidatos a
fármacos. El presente trabajo comprende el estudio de la actividad hemolítica del 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído en hematíes SS
según el método Stanley 1987. El porcentaje de hemólisis promedio calculado para diferentes relaciones molares de hemoglobina
S: compuesto (1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:8 y 1:10) fue inferior al 3%. No se detectaron diferencias significativas entre las medias
(P 0.05%) al comparar 1:1, 1:2, 1:4, 1:5 y 1:8, ni entre 1:8 y 1:10. Sin embargo, hubo diferencias significativas entre las medias
de 1:1, 1:2, 1:4 y 1:5 vs 1:10. Esto indica ausencia de actividad hemolítica significativa del 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído sobre
los hematíes SS, lo cual pudiera potenciar la moderada actividad biológica observada para este agente antisickling.
Introducción
La Anemia Drepanocítica (AD) es un problema de salud pública en Cuba, afectando al 3.1% de la población general distribuida en
Ciudad de la Habana, Santiago de Cuba y Guantánamo.1 Aún no existe un tratamiento efectivo contra esta anemia hemolítica
congénita, constituyendo una de las principales vías la búsqueda de un compuesto capaz de inhibir la polimerización de la
Hemoglobina S (HbS) que es el evento fisiopatológico primario de esta enfermedad.2,3 La presencia en sangre periférica de
numerosos eritrocitos de forma semilunar o drepanocitos es la causa de todas las manifestaciones clínicas y hematológicas de la
misma como consecuencia de la excesiva destrucción eritrocitaria e hiperplasia del sistema eritropoyético.4,5,6,7
La destrucción o hemólisis de los hematíes ocasiona hipoxia en los tejidos con un consecuente desgaste físico de la médula ósea y
la liberación al flujo sanguíneo de los llamados reticulocitos o hematíes jóvenes.8,9 A este daño celular intrínseco se adiciona la
lisis celular que puede ocurrir por la acción de diferentes agentes físicos o químicos externos. Por esta causa una de las pruebas de
utilidad en el estudio y desarrollo de un fármaco es la determinación de su actividad hemolítica, especialmente si está dirigido a los
hematíes. Atendiendo a estos criterios y, a la anemia hemolítica crónica que caracteriza la enfermedad, se impone determinar,
mediante estudios in vitro, la actividad hemolítica de aquellos compuestos que poseen actividad antisickling y que por sus
características toxicológicas inocuas puedan considerarse como posibles candidatos a fármacos. En estudios previos por
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC),10,11 Electroforesis,12 y Relajación Magnética Nuclear (RMN)13,14,15, se demostró
que el aldehído aromático 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído (C8H8O3, vainillina) posee una moderada actividad antisickling.
Materiales y Métodos
Se utilizó etanol (ALFA AESAR); heparina sódica (SIGMA); NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, NaCO3, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído
(vainillina) (Panreac) y soluciones Drabkin 1 y 2 (Imefa). La vainillina, aldehído aromático de olor agradable, es un flavorante
presente en los alimentos16,17,18 para el que se reportan diferentes estudios de toxicidad oral con ratas, donde altas dosis fueron
consumidas por extensos períodos sin efectos adversos.19 Se utilizó una Centrifuga Tehtnica LC-320c, el Espectrofotómetro
ULTROSPEC III y el monitor de pH de Pharmacia LKB, y una Balanza electrónica ER-182A.
Se realizaron nueve pruebas in vitro en concentrados de hematíes obtenidos a partir de sangre total heparinizada de pacientes con
hemoglobinopatía SS,20 suministrada por el Laboratorio Clínico del Hospital General Santiago. Para el lavado de los hematíes y la
preparación de las soluciones hidroalcohólicas del compuesto se utilizó un tampón fosfato salino (PBS) a pH 7.4. El 4-hidroxi-3metoxibenzaldehído se preparó en 1 mL de solución hidroalcohólica (relaciones molares 1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:8 y 1:10). Se
determinó la concentración de Hb por el método de la cianometahemoglobina21,8 con soluciones Drabkin 1 y 2.
Se determinó la actividad hemolítica mediante el cálculo del porciento de hemólisis (%H) (1), a partir de la medición de la
absorbancia para la Hb libre (λ= 545 nm) en el sobrenadante.22,23
%Hem. =
DO M - DO CN
DO CP - DO CN
⋅ 100
(1)
donde: DO = Densidad óptica, M = Muestra, CN = Control
Negativo, CP = Control Positivo.
Se utilizó un control positivo (0.1 % de Na2CO3), un control negativo de PBS a pH=7.4 y un control negativo* al que se añadió la
solución vehículo. Se tomó 1 mL del concentrado lavado y se resuspendió en PBS (pH=7.4, 10 mL), tomando 0.2 mL que se
añadieron a cada uno de los controles. Para cada relación molar se adicionó 10 µL de la solución del compuesto, así como 10 µL
del vehículo al control negativo*. Las soluciones se prepararon en un volumen final de 10 mL y para cada lectura se realizaron dos
réplicas. Una vez añadido el compuesto se agitaron las muestras, se dejaron reposar 30 min., posteriormente se centrifugaron y se
tomó el sobrenadante al cual se le midió la absorbancia y se le calculó el %H (1). Los resultados se representaron gráficamente,
usando el Microsoft Excel 97, y se obtuvieron las curvas de actividad hemolítica por relación molar y la curva promedio para cada
prueba. Se utilizó el Statgraphics Plus 2.1 para comparar las medias con el test de rangos múltiples, el análisis de varianza simple
(ANOVA) y el Kruskal-Wallis Test (P 0.05%).
Discusión de los Resultados
En el estudio realizado no se detectó actividad hemolítica significativa, obteniendo el menor %H (0.02%) en una prueba para la
relación molar 1:8 y los mayores (5.46 y 5.94 %) en una sola prueba para 1:8 y 1:10, respectivamente. Para todas las relaciones
molares el %H se movió en un rango de 0.2-1.42%. El cuadro clínico y hematológico en esta enfermedad molecular varía de un
paciente a otro, por lo cual los cambios morfológicos celulares y la resistencia a factores externos también serán variables y
dependientes de las características individuales. Al comparar las medias no existieron diferencias significativas entre 1:1, 1:2, 1:4,
1:5 y 1:8; ni entre 1:8 y 1:10, sólo entre 1:10 y el resto de las relaciones molares al realizar el test de rangos múltiples (P 0.05%).
Al no detectar dependencia de la actividad hemolítica vs la concentración, se promediaron los valores del %H de todas las
relaciones molares por prueba (Gráfico 2) con su respectiva desviación estándar. Teniendo en cuenta las características de la
muestra en estudio y que el %H promedio estuvo por debajo del 3%, las variaciones obtenidas fueron pequeñas. Las dos
manifestaciones hematológicas más comunes de la AD son las crisis dolorosas recurrentes y la hemólisis crónica, la severidad de
expresión de ambas varía entre individuos y parece ser que el número de células irreversiblemente falciformes circulantes
determina la componente hemolítica.24 Los hematíes SS, debido a la polimerización de la Hb, son más frágiles y rígidos que los
normales, por estar sometidos a cambios intracorpusculares que causan pérdida en su elasticidad, y su tiempo de vida medio es de
aproximadamente 60 días.8
Gráfico 1: Relación entre el %H calculado y cada relación molar en nueve
Gráfico 2: Actividad hemolítica promedio para las nueve pruebas en
pruebas en hematíes SS.
hematíes SS. Las barras muestran la desviación estándar.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8
6
6
5
%H
Porciento de Hemólisis (%H)
7
4
4
3
2
2
0
1
1
0
2
3
4
5
6
7
8
9
No. Ensayos
1:1
1:2
1:4
1:5
1:8
1:10
Relación Molar
Algunos autores han informado, que la sangre oxigenada de estos pacientes muestra una viscosidad aumentada asociada a la
presencia de drepanocitos irreversibles y, que probablemente debido a la reducida flexibilidad de su membrana aumentan la
viscosidad interna, la cual está asociada con la elevada concentración de Hb corpuscular media (CMHC).25 Se ha informado que la
numeración de drepanocitos, en sangre tanto arterial como venosa, procedente de distintas áreas del organismo, es notablemente
constante para el mismo paciente.25 Presumiblemente esta constancia numérica resulta del balance entre la velocidad de formación
y la destrucción, y esta última consiste en lisis intravascular debida a la fragilidad mecánica aumentada y la extracción por
retención y fagocitosis en el sistema reticuloendotelial.25 Todos estos factores deben ser considerados al estudiar el efecto
hemolítico de un agente antisickling. Aún cuando se observó un ligero incremento de la actividad hemolítica al utilizar una
relación molar aumentada en 10 veces, el %H (<3) obtenido nos lleva a pensar en una baja actividad hemolítica del compuesto en
estudio.
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2
INFLUENCIA DEL 4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHÍDO (VAINILLINA) EN LA POLIMERIZACIÓN DE
LA HEMOGLOBINA S.
INFLUENCE OF 4-HYDROXY-3-METHOXYBENZALDEHYDE (VANILLIN) ON HEMOGLOBIN S
POLYMERIZATION.
G. del Toro García—, A.R. Pozo Díaz—, J.C. Rodríguez Tito, A.A Fernández García—, C. Soler Martínez.
—
Centro de Biofísica Médica, Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n, 90500, Santiago de Cuba, Cuba. Fax: (53)
(22) 686214, 632545. E. mail*: [email protected], [email protected]

Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n, 90500, Santiago de Cuba, Cuba.
Palabras claves: célula roja, polimerización, hemoglobina S, relajación, antisickling.
1
Resumen
Se presenta un estudio de la influencia del 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina) en el tiempo de demora de la
polimerización de la Hemoglobina S utilizando la Relajación Magnética Nuclear Protónica (RMN-1H). Se utilizaron las
relaciones molares (HbS/vainillina) 1:1, 1:2 y 1:10. Estudios anteriores demostraron que la vainillina tenía una moderada
actividad antisickling cuando se comparaba con otros aldehídos. Las muestras incubadas con 4-hidroxi-3metoxibenzaldehído mostraron un incremento en el td y el porciento de variación del td por relaciones molares fue: (3.5 ±
1.5)% (1:1), (8 ± 2.4)% (1:2) y (21 ± 6.5)% (1:10). De este modo, incrementando la concentración de vainillina aumentó su
efecto en el retardo de la polimerización de la HbS. Los resultados por RMN confirmaron la moderada actividad
antisickling de la vainillina y se discute su utilidad terapéutica en el tratamiento de la Anemia Drepanocítica.
Abstract
The influence of 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde (vanillin) on the delay time of Hemoglobin S polymerization was
examined using Nuclear Proton Magnetic Relaxation (NMR-1H). HbS/vanillin molar ratio 1:1, 1:2 and 1:10 were used.
Earlier studies indicated that vanillin had moderate antisickling activity when compared with other aldehydes. The samples
incubated with vanillin showed an increase in delay time, and the percent increase vs molar ratio was: (3.5 ± 1.5)% (1: 1),
(8 ± 2.4)% (1: 2) and (21 ± 6.5)% (1: 10). Thus, increasing the concentration of vanillin increased its effect in delaying the
polymerization of Hemoglobin S. These NMR results confirmed the moderate antisickling activity of vanillin and its
therapeutic utility in the treatment of sickle cell disease is discussed.
2
Introducción
La Anemia Drepanocítica (AD) es una hemoglobinopatía frecuente en el mundo y constituye un modelo genuino de
enfermedad molecular. Sus principales manifestaciones clínicas son una anemia hemolítica crónica y las crisis
vasooclusivas (CVO) que causan dolor severo y el daño generalizado de los órganos.1,2,3,4,5,6 Resulta de la expresión
homocigótica de un gen β-globin mutante autosómico que determina la sustitución de un residuo polar (ácido glutámico)
por un residuo hidrofóbico (valina) en la posición 6 cada cadena polipeptídica β (β6 glu→val) de la molécula de hemoglobina
S (HbS).1,2,7 Las moléculas de desoxihemoglobina S (dHbS) polimerizan formando agregados moleculares en forma de
estructuras microtubulares elongadas que rigidifican, distorsionan el glóbulo rojo y disminuyen su flexibilidad. La
polimerización es el evento primario en la fisiopatología de la AD; las células rojas distorsionadas provocan la obstrucción
de los pequeños capilares en la microcirculación y una oxigenación deficiente de los tejidos.2,3,8,9,10 Se ha reportado que sólo
una de las dos Val β6 en cada tetrámero forma un contacto en el polímero.
En la polimerización existe un tiempo de demora (td) o proceso de nucleación durante el cual las unidades de HbS se
asocian unas con otras para formar un núcleo crítico, haciendo la posterior adición de unidades de Hb energéticamente
favorable. Los estudios realizados por difracción de rayos X y microscopía electrónica sugieren que en el polímero los
tetrámeros de dHbS se van uniendo alrededor de un eje vertical formando anillos helicoidales espirales de moléculas de Hb
que se encajan unas encima de las otras dando lugar a la formación de largas fibras.8,11,12,13,14
Se ha demostrado que los agentes antisickling pueden inhibir la polimerización. Muchos compuestos químicos han sido
estudiados, incluyendo los aldehídos aromáticos15,16,17,18, los ácidos aromáticos19,20,21, el ácido etacrínico22,23, los ácidos
alcanoicos24 y drogas como el ácido clofíbrico y el gemfibrozil.25 Sin embargo, muchos compuestos antisickling son
extremadamente tóxicos a las concentraciones terapéuticas, y por esta razón no es posible utilizarlos en el tratamiento
clínico de la AD.
El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina), aldehído aromático, tiene una actividad antisickling moderada.15,16 Este
compuesto reacciona con los grupos amino libres de la Hb intracelular para formar una Base Schiff. Los estudios por
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)18 y Enfoque Isoeléctrico (IE)15 sugieren que la vainillina modifica
covalentemente la Hb, de modo que el aducto vainillina-Hb inhibe la polimerización por vía de un mecanismo dual de
acción: (1) incrementando la afinidad de la Hb por el oxígeno, modificando la curva de disociación de oxígeno; y (2)
causando inhibiciones estereoquímicas de la polimerización de dHbS.18
La polimerización de la HbS ha sido estudiada utilizando la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de Relajación (RMN1
H)26 por nuestro grupo de investigación. Las moléculas de agua que se encuentran asociadas a la molécula de HbS
disminuyen su movilidad debido a la formación de polímeros en el medio, provocando una reducción del tiempo de
relajación spin-spin (T2).Utilizando esta metodología se evaluó la actividad antisickling de aldehídos aromáticos entre los
que se encontraba la vainillina27,28,29,30, encontrando que los mismos incrementaron el td de la polimerización de la HbS. En
este de este trabajo se presenta un estudio sobre la influencia de la concentración de vainillina en la polimerización por
RMN.
3
Materiales y Métodos
Reactivos y Equipamiento
Todos los reactivos fueron obtenidos de suministradores comerciales, el etanol de ALFA AESAR, la heparina sódica y el
NaCl de SIGMA, Na2HPO4 y KH2PO4 de Merck. El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina) fue suministrado por
Dallant S.A. Este es un flavorante presente en los alimentos31,32,33 para el que se han reportado diferentes estudios de
toxicidad oral con ratas en los cuales altos niveles de vainillina fueron consumidos por extensos períodos sin efectos
adversos.34
Se utilizó una Centrífuga Jouan MR 18.12, con rotor angular, 50 mL; un Espectrofotómetro ULTROSPEC III y un monitor
de pH de Pharmacia LKB y la Balanza electrónica ER-182A. Se realizaron las mediciones del tiempo de relajación T2 en el
Relaxómetro Giromag 01®, equipo construido y registrado por el Centro de Biofísica Médica.
Preparación de las muestras
Se realizaron cuatro ensayos in vitro en muestras de solución de HbS obtenidas a partir de sangre venosa total de los
individuos homocigóticos SS de la consulta de Hematología Especial del Hospital Provincial "Saturnino Lora" y como
referencia se realizaron dos ensayos en muestras de individuos voluntarios (HbA). La muestra de sangre venosa
heparinizada se centrifugó a 3000 r.p.m. durante diez minutos. Posteriormente, se removió el plasma y las células rojas
fueron lavadas tres veces con PBS (pH=7.4). Se realizaron 4 pool de glóbulos (de 6 a 7 muestras cada uno), se hemolizó la
masa globular por congelación y se centrifugó (3000 r.p.m, 10 min.). La concentración de Hb fue determinada usando el
método de Drabkin en un espectrofotómetro ULTROSPEC III (Pharmacia). La solución de Hb fue dividida en porciones
(1.5 mL) y almacenada a 4°C hasta su posterior uso. Con las muestras de referencia (HbA) se realizó el mismo
procedimiento.
Las soluciones de vainillina fueron preparadas en 20% etanol/PBS. Se utilizó una muestra control en cada ensayo a la que
se le añadió la solución vehículo. Las muestras (500 µL) fueron depositadas en las ámpulas de RMN y termostatadas a
36°C durante el curso de las mediciones.
Medición por RMN
Para el Relaxómetro Giromag 01® se reporta un 5% de error sistemático y un rango de 3-9% de error aleatorio en la
medición y determinación del td. Se utilizó la serie de impulsos 90º- τ-180º, a la frecuencia de 4 MHz, con un intervalo no
mayor de 20 minutos entre cada medición. Las curvas de la variación temporal de T2 que describen la cinética del proceso
de polimerización fueron ajustadas evaluándose la diferenciación de los valores obtenidos de los tiempos de relajación, y se
normalizaron en un rango de 0 a 1 para facilitar la diferenciación del td entre las diferentes muestras. El cálculo del td fue
realizado partiendo de la curva sigmoidal normalizada, se tomaron los puntos límites (máximo y mínimo) en el tramo de la
curva donde disminuyen los valores de T2, se realizó un ajuste por regresión lineal y en el punto donde la recta coincidió
con el valor inicial de T2 se obtuvo el valor denominado td, a partir del cual se ha reportado que se inicia el crecimiento
rápido e irreversible de los polímeros.
La influencia de la concentración del compuesto en el proceso de polimerización se evaluó a partir del cálculo del porciento
de variación del td (%Vtd) para cada relación molar (rm) con relación al patrón (pat), el mismo fue calculado como sigue:
%Vtd =
td ( rm) − td ( pat )
× 100
td ( pat )
(1)
Se controló el pH, la concentración de HbS, la temperatura y el número de réplicas.
4
Discusión de los resultados
Medición por RMN y cálculo del td.
Con la metodología por RMN se estudió la cinética de polimerización de la HbS reproduciéndose para todas las muestras la
curva sigmoidal que la describe (Gráfico1). En la curva se observaron tres etapas características: la primera se corresponde
con las moléculas de hemoglobina en estado de disolución predominantemente; la segunda caracteriza el equilibrio
existente entre las moléculas en solución y las que están formando el polímero, el proceso de nucleación, durante la cual los
valores de T2 comienzan a disminuir debido al rápido crecimiento y la posterior alineación de los polímeros de HbS, que
provoca una disminución en la movilidad de las moléculas de agua con un consecuente aumento del tiempo de correlación
y en la tercera etapa se encuentran predominantemente las moléculas de hemoglobina en el polímero.29
Gráfico 1: Curva Sigmoidal que describe la polimerización de la HbS siguiendo la variación temporal de T2 por RMN en el Relaxómetro
Giromag 01®. T2 (ms): tiempo de relajación en milisegundos.
HbS en solución
140
T2 (ms)
120
100
80
Polímeros de HbS
60
Tiempo de demora (td)
40
0
200
400
600
800
Tiempo (min.)
El td fue determinado a partir de la curvas para cada una de las réplicas y se calcularon los valores promedios por ensayo y
cada relación molar, incluyendo la muestra control (Tabla 1).
Tabla 1: Tiempo de demora (td) de la polimerización de la HbS determinado a las muestras control e incubadas con vainillina (1:1, 1:2
y 1:10) para cada pool de HbS estudiado.
Pool
Control
1:1
1:2
1:10
No.1
352 (1.6%)
370 (2.7%)
388 (2.7%)
403 (0.9%)
No.2
267 (2.2%)
279 (4.9%)
291 (5%)
347 (6%)
No.3
329 (2%)
335 (2.2%)
355 (2%)
407 (1.2%)
No.4
360 (0.6%)
369 (0.8%)
376 (1.4%)
422 (1.4%)
Los valores de td son en minutos, expresados como la media de mediciones realizadas por triplicado y con el valor del error dentro del
paréntesis.
5
Abraham18 en sus estudios empleando HPLC planteó la existencia de un 50% de modificación de la Hb para la relación
molar 1:1 y un 100% para 1:2. El hecho de que la vainillina incrementa el td en la polimerización de la HbS confirma los
resultados obtenidos en otros estudios, observándose en este caso una dependencia del alargamiento del td con la
concentración del compuesto para cada una de las relaciones molares. Si la vainillina se enlaza a la Hb formando aductos
base de schiff puede inhibir o retardar la polimerización, ya que bloquea los sitios de unión o de contacto entre las
moléculas de Hb dentro del polímero.
En el Gráfico 2 se muestran las curvas normalizadas comparativas entre el patrón y las diferentes relaciones molares para
uno de los pool evaluados.
Gráfico 2: Curvas de la polimerización de la HbS para el pool No.2 obtenidas en el Relaxómetro Giromag 02®. (T2med/T2ini, T2med:
tiempo de relajación medido, T2ini: tiempo de relajación inicial). Los datos representan el promedio de los experimentos realizados por
triplicado para las muestras control y tratadas con diferentes relaciones molares (RM).
1.0
Control
td = 267 min.
RM 1:1
td = 279 min.
RM 1:2
td = 291 min.
RM 1:10 td = 347 min.
T2 med/T2 ini
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
100
200
300
400
500
Tiempo (min.)
A partir de los valores medios del td se calculó, utilizando la expresión (1), el porciento de variación del td (%Vtd),
obteniéndose para la relación molar 1:1 una variación de 3.5 ± 1.5%, mientras que las relaciones molares 1:2 y 1:10
mostraron los resultados más significativos con 8 ± 2.4% y 21 ± 6.5% de variación respectivamente. Los valores de error
relativo se corresponden con las variaciones reportadas entre pacientes. Estos resultados sugieren que para la mayor
concentración ensayada aún podrían existir sitios de enlace en las moléculas de Hb, los cuales continúan ocupándose por las
moléculas del compuesto y bloqueando los sitios de contacto del polímero. La polimerización de la HbS es un proceso
complejo y sobre el mismo ejerce una contribución especial la concentración de oxígeno, factor que no pudo ser controlado
durante el estudio. Se ha reportado que la vainillina desplaza el equilibrio oxi-desoxi a favor de la forma oxi de la Hb,15,18
por esta razón se puede esperar la contribución de este efecto en el alargamiento del td y en el aumento de la solubilidad de
la HbS .
A partir de los datos experimentales de los 4 ensayos se realizó el gráfico del % de variación del td vs la relación molar (no
se muestra en el trabajo), observándose una zona que muestra un aumento lineal del td con respecto al aumento de la
concentración del compuesto. Sugerimos continuar los ensayos con relaciones molares intermedias (entre 1:2 y 1:10) con el
objetivo de determinar a partir de que concentración se inicia la saturación, teniendo en consideración lo planteado por
6
Abraham.
Un factor que no fue controlado durante el ensayo para cada uno de los pool utilizados fue la concentración de hemoglobina
fetal (HbF). Al analizar los valores del % de HbF reportados en la historia clínica se observó una diferencia marcada entre
los mismos. Conociendo los efectos inhibidores de la polimerización que ejerce este tipo de hemoglobina35 puede
identificar a esta como otro de los factores que provocan diferencias entre los valores del T2 y del td, encontrando valores
de desviación estándar elevados entre cada uno de los pool.
El ensayo realizado en HbA mostró que en las condiciones experimentales establecidas la misma no polimeriza, no
observándose por RMN la curva sigmoidal. En estudios anteriores, utilizando la técnica del Isoelectroenfoque, se comprobó
la ocurrencia de la reacción entre esta y la vainillina para la formación de la base de Schiff15,16.
Los resultados obtenidos en este trabajo corroboran que la vainillina tiene una moderada actividad antisickling demostrada
con el incremento del td de la polimerización de la HbS, lo cual la convierte en un potencial agente para el tratamiento de la
Anemia Drepanocítica.
7
Agradecimientos
Los autores agradecemos al colectivo de investigadores de la sección de BiofísicoQuímica del Centro de Biofísica Médica,
al Dr. Jorge Losada Gómez, especialista de 2do. Grado en Hematología Clínica del Hospital Clínico Quirúrgico “Saturnino
Lora” por su colaboración en el suministro de las muestras y su asesoría en todas nuestras investigaciones. Además, a la
Dra. Ana Teresa Govín Cid, especialista de 2do. Grado en Hematología Clínica del Hospital Infantil Norte “Juan de la Cruz
Martínez Maceira”, al Dr. Carlos Cabal Mirabal y al Dr. Eloy D. Alvarez Guerra por sus sugerencias en la revisión del
manuscrito y su colaboración en las investigaciones.
8
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10
PARTICIPACIÓN DE LA NAD(P)H OXIDASA Y LA CICLOOXIGENASA EN LA RESPUESTA
VASODILATADORA DEL ÓXIDO NÍTRICO EN LAS ARTERIAS PULMONARES DE LECHÓN
José Gustavo López-López*, Francisco Pérez-Vizcaíno§, Angel L Cogolludo§, Francisco Zaragozá-Arnáez§,
Manuel Ibarra§. Juan Tamargo§. *Benemérita Universidad Autónoma de Puebla-México. §Instituto de
Farmacología y Toxicología, CSIC-UCM-Madrid.
RESUMEN. El tratamiento de la Hipertensión Pulmonar Persistente Neonatal (HPPN) con oxido nítrico por
vía inhalatoria (NOi) ha mostrado una clara selectividad por el territorio pulmonar (en modelos animales),
sin embargo los estudios clínicos controlados demostraron que la eficacia del tratamiento con NOi era
parcial. Una de las posibles causas de la menor reactividad vascular al NO es el aumento de la inactivación
del NO por los radicales superóxido. En el presente estudio analizamos la influencia del estrés oxidativo
sobre la vasodilatación pulmonar in vitro inducida por el NO exógeno y además determinamos la fuente
enzimática de radicales superóxido (O2-) en este territorio vascular. En las arterias pulmonares de lechones
de 1 y 15 días de edad, el estrés oxidativo basal modula la acción vasodilatadora del NO, siendo la NAD(P)H
oxidasa de la adventicia la principal fuente endógena del anión superóxido. Mientras que en arterias
pulmonares de lechones de 1 día de edad, la ciclooxigenasa (COX) también participa en dicha modulación.
INTRODUCCIÓN. En 1969, Gersony y cols. describieron a la HPPN como un cuadro en recién nacidos a
término, que presentaban una presión arterial pulmonar superior a la sistémica y signos de cortocircuito de
derecha a izquierda, que conducían a un cuadro de hipoxemia grave. La terapia con NOi demostró una clara
selectividad por el territorio pulmonar, sin embargo los estudios clínicos controlados demostraron que la
eficacia de este tratamiento era parcial. Una de las posibles causas de la menor reactividad vascular al NOi es
el aumento de la inactivación del NO por el radical superóxido (O2-).
OBJETIVO. Determinar la fuente endógena que participa en el estrés oxidativo y su influencia sobre la
vasodilatación inducida por el NO en arterias pulmonares de lechón.
MATERIAL Y MÉTODOS. Se utilizaron anillos de arterias pulmonares procedentes de lechones de raza
híbrida Landrace-Largewhite de 1 día y de 2 semanas de edad. Al final del periodo de estabilización se añadió
al baño de órganos un análogo del Tromboxanoa A2 (TXA2) el U46619 (10-7 M). El aumento de tensión
alcanzaba valores estables al cabo de 20 minutos y, posteriormente, se añadía su correspondiente vehículo (o
el pretratamiento). Al cabo de unos 15 minutos se adicionaban volúmenes crecientes de solución saturada de
NO, que equivalían a concentraciones crecientes del mismo (2 x 10-10 - 2 x 10-7 M). Para la expresión de la
COX se utilizó la técnica de Western blot. Los resultados experimentales y controles se contrastaron
comparando las medias mediante el análisis de varianza (ANOVA) de 1 vía seguido del test de NewmanKeuls, considerando estadísticamente significativas aquellas diferencias en las que la P fue menor de 0.05.
RESULTADOS. La adición de concentraciones crecientes de NO producía una respuesta vasodilatadora
concentración-dependiente (pIC30 = 7.23 ± 0.03, 1 día de edad y 7.56 ± 0.06, 2 semanas). El pretratamiento
1
con la superóxido dismutasa (SOD) desplazaba la curva de relajación del NO hacia la izquierda tanto en
arterias de animales de 1 día (pIC30=7.67±0.1) como de 2 semanas de edad (pIC30=8.62±0.16). El bloqueo de
la SOD tras la administración del DETCA producía una inhibición significativa del efecto relajante del NO en
las arterias pulmonares de lechones de 1 día (pIC30 = 6.05 ± 0.1) y de 2 semanas de edad (pIC30=6.66±0.3).
El Inhibidor de la NAD(P)H oxidasa (DPI) redujo de forma significativa el valor del pIC30 tanto en las
arterias pulmonares de los lechones de 1 día (pIC30 = 7.5 ± 0.05), como en las obtenidas de los animales de 2
semanas de edad (pIC30 = 8.13 ± 0.03). En las arterias pulmonares procedentes de los lechones de 1 día de
edad, la indometacina potenciaba el efecto relajante del NO de manera significativa (pIC30 = 7.51 ± 0.02). Sin
embargo, el pretratamiento con indometacina no modificaba la respuesta vasodilatadora del NO en arterias
pulmonares procedentes de lechones de 2 semanas de edad.
Relajación (%)
100
Control
DPI
L-NAME
Oxipurinol
Rotenona
SKF525A
Ì
AA861
75
50
**
**
**
**
25
0
-10
-9
-8
Figura 2. Efecto relajante del NO en arterias
pulmonares de lechón sin endotelio de 2 semanas
de edad en presencia de DPI (10-5 M), L-NAME
(10-4 M), Indometacina (10-5) M), Oxipurinol (10-7
M) o Rotenona (5x10-5 M), SKF525A (10-5M)
AA861 (10-5M). Los resultados se expresan como
la media ± e.e.m. de 5-12 experimentos. **p<0.01
vs control.
-7
Log [NO]
DISCUSIÓN. Papel del estrés oxidativo. Se ha descrito que algunos modelos de hipertensión pulmonar
(Steinhorn y cols., 2001) están asociados a un aumento en los O2-. Por esta razón decidimos estudiar en
nuestras condiciones experimentales el efecto del estrés oxidativo sobre la respuesta vasodilatadora del NO en
arterias pulmonares. Para ello, utilizamos diversas herramientas farmacológicas que sabemos que modifican
el status del estrés oxidativo: la SOD (transforma el O2- en H2O2), y DETCA (inhibidor de la SOD) (Wang y
cols., 1998). En las arterias pulmonares de animales de ambas edades, observamos un aumento en la potencia
del NO con el pretratamiento con la SOD, mientras que con el DETCA encontramos un efecto contrario.
60
Control (2 semanas)
*
Indometacina (2 semanas)
Figura 1. Efecto relajante del NO en las arterias
pulmonares sin endotelio de los lechones de 1 día y
de 2 semanas de edad, pretratadas con indometacina
(10 -5 M). Los resultados se expresan como la
media ±e.e.m. de 6-14 experimentos. *p<0.05 y
**p<0.01 arterias control vs arterias tratadas con
indometacina (animales de 1 día).
Relajación (%)
Indometacina (1día)
Control (1día)
40
**
20
**
0
-10
-9
-8
-7
Log [NO] (M)
Por todo lo anterior, proponermos que el efecto vasodilatador del NO está modulado por el nivel de los O2generado endógenamente por las arterias pulmonares.
2
Fuente del O2- en el tejido. Los principales sistemas enzimáticos generadores de los O2- son: la NAD(P)H
oxidasa, la NOS, la ciclooxigenasa, la lipoxigenasa, la citocromo P450 oxidasa, la xantina oxidasa y la cadena
mitocondrial de transporte electrónico y para estudiar la influencia de estos sistemas enzimáticos, se han
utilizado los respectivos inhibidores (el DPI, el L-NAME, la indometacina, el AA861, el SKF 525A, el
oxipurinol y la rotenona respectivamente). En arterias de animales de 1 día y 2 semanas de edad, el DPI
potenció la relajación inducida por el NO, sugiriendo que esta respuesta producida por el DPI es debido a su
efecto inhibidor sobre la NAD(P)H oxidasa. Por tanto, proponemos que la NAD(P)H oxidasa de la membrana
es una fuente importante de producción del O2- en arterias pulmonares de lechón, tal y como se ha descrito en
otros vasos (Wang y cols., 1998). Sin embargo, en presencia de indometacina, las curvas concentraciónrespuesta a NO de preparaciones de animales de 1 día de edad se desplazaron hacia la izquierda,
desapareciendo las diferencias en la respuesta a NO entre las preparaciones de animales 1 día o de 2 semanas
de edad; este resultado sugiere que estas diferencias podrían ser secundarias a cambios en la actividad de la
COX. Estos datos concuerdan con la mayor expresión de la COX en animales de 1 día con respecto con las
preparaciones de 2 semanas de edad. El mecanismo por el que un aumento de la actividad de la COX inhibe la
respuesta al NO es desconocido. Sin embargo, podríamos especular que en las arterias pulmonares de
animales de 1 día de edad, otra fuente de producción del O2- (diferente a la NAD(P)H oxidasa) sería la COX.
También estos resultados indicarían que la menor potencia del NO en arterias pulmonares procedentes de
animales de 1 día con respecto a la de las 2 semanas de edad, estaría relacionada con el estrés oxidativo
inducido por la COX.
CONCLUSIONES: En las arterias pulmonares de lechones de 1 y 15 días de edad, el estrés oxidativo basal o
el estimulado exógenamente, modula la acción vasodilatadora del NO. Nuestros resultados demuestran que la
NAD(P)H oxidasa es la principal fuente endógena del anión superóxido y que la vasodilatación inducida por
el NO aumenta con la edad postnatal. Sin embargo, el aumento de la respuesta al NO desapareció en
presencia de indometacina, sugiriendo un aumento en la actividad de la COX en los primeros momentos de
vida postnatal.
BIBLIOGRAFÍA.
Gersony W., Duc G. y Sinclair J. (1969) Circulation 1969; 30: 87-94.
Steinhorn R., Russel J., Lakshminrusimha S., Gugino S., Black S. y Fineman J. (2001) Am J Physiol. 280:
H311-H317.
Wang H., Pagano J., Du Y., Cayatte J., Quinn T., Brecher P. y Cohen A. (1998) Circ Res. 82: 810-818.
3
EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA DE LOS EFECTOS DEL 1-O-DODECILGLICEROL
SINTÉTICO EN UN MODELO DE ANGIOGÉNESIS INFLAMATORIA.
Hélade Sotomayor Pérez, Beatriz González, Marisel Negret, Theudis Mosquera, José Luis León,
Francisco Merchán, Miguel Bilbao, Yolanda Valdés.
Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de La Habana. Ave. 23 No. 21425 e/ 214 y 222.
La Coronela, Lisa..
RESUMEN.
Los éteres lipídicos son modificadores de las respuestas biológicas. Entre los efectos que se les han
descritos a estos compuestos se encuentra la inhibición de la angiogénesis, observada en diferentes
modelos experimentales. Los 1-O-Alquilgliceroles, análogos de esta familia, conservan varias de sus
actividades farmacológicas. En este trabajo se evaluaron los efectos del 1-O-Dodecilglicerol (C12) en el
modelo de angiogénesis inflamatoria del granuloma inducido por adyuvantes. El C12 disminuyó el peso
del granuloma e inhibió la neovascularización asociada a éste, de forma similar a la hidrocortisona,
reconocido antinflamatorio y antiangiogénico.
INTRODUCCIÓN.
La angiogénesis o neovascularización es el proceso de formación, crecimiento y desarrollo de nuevos
vasos sanguíneos a partir de otros pre-existentes. Ocurre en determinadas condiciones fisiológicas y en
muchos estados fisiopatológicos, designados como enfermedades angiogénicas, entre los que se
encuentran el desarrollo de los tumores sólidos y sus metástasis, la retinopatía diabética y diversas
afectaciones de base inflamatoria como la artritis reumatoidea y la psoriasis1. En el tratamiento de las
enfermedades angiogénicas, reviste gran importancia la inhibición farmacológica de la angiogénesis. Los
éteres lipídicos (E.L.) constituyen modificadores de las respuestas biológicas y poseen diferentes efectos
farmacológicos. Entre los mecanismos de acción que han sido propuestos para éstos se encuentra la
inhibición de la angiogénesis. De ellos, la Edelfosina y el S-fosfonato han mostrado efectos
antiangiogénicos en diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. Los 1-O-Alquilgliceroles
(AQG) son análogos de esta familia de compuestos ya que conservan el grupo 1-O-Alquilo de cadena
larga. En el presente trabajo nos propusimos estudiar los efectos del AQG 1-O-Dodecilglicerol (C12) en
un modelo de angiogénesis inflamatoria.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Material Químico. El C12 fue obtenido en el IFAL mediante una síntesis de Williamson. Su pureza
resultó mayor de un 90%.
Preparación de las muestras. El C12 fue disuelto en solución hidroalcohólica al 10 %.
Animales de Experimentación. Se emplearon ratas Wistar macho, entre 200 y 270 g, del Centro
Nacional de Producción de Animales de Laboratorio, mantenidas en cajas adecuadas con agua y comida
ad libitum y temperatura e iluminación óptimas.
Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Se empleó la técnica de
Kobayashi et al; 19982, modificada. A los animales anestesiados con éter dietílico se les creó una bolsa de
aire subcutánea por inyección de 3 ml de aire en la región dorsal. En la bolsa de aire, se inyectaron los
adyuvantes Montanide (0.8 ml) y aceite de croton (0.1 %). Pasados 6 días, se sacrificaron los animales
por inyección en la vena de la cola de 1 ml de solución del colorante rojo carmín, conteniendo 5 % de
gelatina blanca, que se mantuvo a 40ºC en un baño termostatado (Ultraterm 6000383). Los animales
muertos fueron sometidos por 20 minutos a temperaturas por debajo de 4ºC. Se extrajo el granuloma y se
lavó con agua destilada, antes de pesarlo en la balanza analítica. El contenido de carmín en el tejido
granulomatoso se tomó como indicativo de la angiogénesis lograda. Con el propósito de medir la cantidad
de colorante en los vasos formados en el tejido del granuloma, se cortó éste y se solubilizó con 4 ml de
NaOH a 3 N. Después se añadieron 2 ml de HCl al 37 %, dejándolo reposar 15 minutos. A continuación
se centrífugo (Sigma 2K15, Alemania) durante 10 minutos a 3000 rpm, seguidamente se filtró el
sobrenadante y se midió la densidad óptica a 490 nm en un espectrofotómetro (Ultrospec Plus
Spectrophotometer, Pharmacia LKB).
Evaluación de los efectos del C12 en el modelo de granuloma inducido por adyuvantes. Los animales
se distribuyeron al azar en 6 grupos experimentales. A 5 grupos se les aplicó tratamiento 2 horas más
tarde de habérseles inducido el granuloma y durante 5 días, mientras que el sexto grupo se mantuvo como
control al que se le administró el vehículo. Los tratamientos consistieron en inocular por vía i.p el C12 a 5,
10, 20 y 30 mg/kg de peso y al grupo restante como control positivo, hidrocortisona a 10 mg/kg por igual
vía. La evaluación de los efectos del C12 se realizó mediante el peso del granuloma y el contenido de
carmín en el mismo.
Visualización de la vasculatura asociada a la formación del granuloma. Se extrajo la piel que recubría
la bolsa de aire, la que fue cortada, estirada cuidadosamente y fotografiada con Cámara Epson PC. Para el
procesamiento de las imágenes se empleó el Programa Adobe PhotoShop 5.0, para WINDOWS. Se
empleó además un control sin granuloma.
Procesamiento estadístico. Se empleó el paquete de programas STATISTICA Versión 5.0 (StatSoft Inc.,
1995) para WINDOWS. Posterior a la estadística descriptiva, se realizó un test de Levene de
Homogeneidad de Varianza y la prueba de comparación múltiple de medias de Duncan.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Transcurridos 6 días de la
inyección de los adyuvantes, se divisó un granuloma bien establecido, en todos los grupos
experimentales. En el control, el peso promedio del granuloma fue de 4.97 ± 0.65 g. Resultados
similares fueron informados al emplear el adyuvante completo de Freund2 e, inclusive, el propio
Montanide y aceite de croton3. La neovascularización asociada fue medida por espectrofotometría en
términos del contenido de carmín en los tejidos del granuloma, lo cual es un índice de la formación de
nuevos vasos sanguíneos2. En el grupo control, es decir con granuloma y sin tratar, el contenido de
carmín fue de 0.103 ± 0.029 mg. La efectividad del modelo experimental para permitir la evaluación de
los efectos antiangiogénicos de un compuesto, fue comprobada al evaluar la acción de la
hidrocortisona, reconocido antinflamatorio esteroidal que exhibe marcados efectos antiangiogénicos2.
Ésta, a 10 mg/kg, redujo significativamente el peso del granuloma y el contenido de carmín en el
mismo; lo que permite corroborar que el modelo del granuloma inducido por Montanide y aceite de
croton, es adecuado para esta finalidad.
Evaluación de los efectos sobre el peso del granuloma y el contenido de carmín en el modelo del
granuloma inducido por adyuvantes. En la tabla 1 se resumen los resultados obtenidos al evaluar los
efectos del C12 sobre la angiogénesis inflamatoria.
Peso del Granuloma. (g)
Contenido de carmín.
Grupo
(x±SD)
(mg) (x±SD)
Control
4.97 ± 0.65 (a)
0.103 ± 0.029 (a)
Hidrocort. (10 mg/kg)
2.95 ± 0.16 (b)
0.049 ± 0.010 (b)
C12 (5 mg/kg)
2.85 ± 0.23 (b)
0.047 ± 0.007 (b)
C12 (10 mg/kg)
2.29 ± 0.27 (c)
0.037 ± 0.005 (b)
C12 (20 mg/kg)
1.34 ± 0.32 (d)
0.019 ± 0.005 (c)
C12 (30 mg/kg)
0.97 ± 0.10 (d)
0.011 ± 0.002 (c)
Tabla 1. Peso del Granuloma y Contenido de Carmín en los grupos experimentales: Control con
granuloma sin tratar, Hidrocortisona a 10 mg/kg como control positivo y C12 a 5, 10, 20 y 30 mg/kg,
respectivamente (n=6). En los parámetros Peso del Granuloma y Contenido de Carmín, grupos con una
letra en común no tienen diferencias significativas ( p>0.05).
Todos los grupos experimentales tienen diferencias estadísticamente significativas con respecto al control
con granuloma sin tratar, para ambos parámetros; lo que demuestra que el C12 inhibió la formación de
tejido granulomatoso en el modelo empleado y la neovascularización asociada a éste, expresadas mediante
el peso del granuloma y el contenido de carmín, respectivamente.
Esto constituye una evidencia experimental de los efectos antinflamatorios y antiangiogénicos de este
compuesto, resultados que coinciden con lo informado en la literatura sobre la acción antinflamatoria y
antiangiogénica de otros E.L. en diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. A partir de 1997 se
realizaron varios experimentos con AQG de origen natural que evidenciaron sus efectos antinflamatorios4
ya que inhibieron la liberación de AA en cultivos de macrófagos hiperactivados4. Además, se obtuvo un
efecto similar al de la indometacina en cuanto a la inhibición de la respuesta inflamatoria inducida por
carragenina5. Por otra parte, también se observó un efecto antinflamatorio de éstos en el modelo de
inflamación crónica del granuloma inducido por pellet de algodón4.
Con respecto a sus efectos
antiangiogénicos, ha sido demostrado que la edelfosina inhibe la formación de túbulos en las células de la
microvasculatura endotelial humana (HMEC-1), exhibiendo así actividad antiangiogénica in vitro, aunque
los mecanismos exactos por los cuales este compuesto ejerce estos efectos son desconocidos. Otro éter
lipídico, el s-fosfonato, constituye un potente inhibidor de la angiogénesis, lo que ha sido demostrado in
vivo empleando el modelo de la CAM del embrión de pollo6.
Visualización de la vasculatura. En la figura 1 se muestra la vasculatura de la piel de la bolsa de aire
asociada al granuloma. La inducción de la neovascularización se demostró al comparar la piel de los
animales del grupo control con granuloma sin tratar (B) con la de los animales del control sin granuloma
(A). Como se observa, el C12 (30 mg/kg) provocó una reducción en la vasculatura, lo cual se evidenció al
comparar la piel de los animales tratados con este AQG (C) con la de los animales del control con
granuloma sin tratar (B).
A
B
C
Figura 1. Vasculatura de la piel de la bolsa de aire asociada al granuloma. La piel fue cortada, estirada
y fotografiada con Cámara Digital Epson PC. A) Control sin granuloma, B) control con granuloma sin
tratar y C) grupo tratado con C12 a 30 mg/kg.
Entre los mecanismos implicados en los efectos de los AQG, se encuentra la inhibición de la actividad
Fosfolipasa A25 pues, al bloquear la liberación del ácido araquidónico disminuye la generación de
eicosanoides, muchos de los cuáles son potentes mediadores de la inflamación. Ésta también podrían
justificar, al menos parcialmente, sus efectos antiangiogénicos; ya que de ellos, fundamentalmente las
prostaglandinas, inducen la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular, estimulando así la
angiogénesis.
BIBLIOGRAFÍA.
1- Folkman, J (1995): The New England Journal Medicine; 333(26):1157-1763.
2- Kobayashi, S; Inaba, K; Kimura, I; Kimura, M (1998): Biol.Pharm. Bull. 21(4): 346-349.
3- Sotomayor, H (2001): Revista Cubana de Química. Vol. XIII, No. 2, 2001.
4- Valdés, Y (1997): Tesis de Doctorado en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología.
Universidad de La Habana.
5- Jackson, JK; Burt, HM; Oktaba, AM; Hunter, W; et. al., (1998): Cancer Chemother
Pharmacol 41: 326-332.
6- Bilbao, M (2001): Tesis en opción al título de Master en Ciencias. IFAL, Universidad de La
Habana.
EFECTOS DEL 1-O-HEXADECILGLICEROL Y EL 1-O-OCTADECILGLICEROL EN UN MODELO DE
ANGIOGÉNESIS INFLAMATORIA.
Hélade Sotomayor Pérez, Fara Amelia Primelles, José Luis León, Francisco Merchán, Miguel Bilbao.
Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de La Habana. Ave. 23 No. 21425 e/ 214 y 222. La Coronela, Lisa..
RESUMEN.
Los éteres lipídicos introducen un concepto terapéutico relativamente nuevo en el tratamiento de múltiples afectaciones humanas.
Tienen efectos antitumorales directos, antinvasivos, adyuvantes de poliquimioterapia y antinflamatorios, entre otros. Una
multiplicidad de mecanismos de acción ha sido propuesta para éstos. Uno de ellos es la inhibición de la angiogénesis, observada en
diferentes modelos experimentales. Los 1-O-Alquilgliceroles (AQG) son análogos de esta familia de compuestos. En este trabajo
se evaluaron los efectos de los AQG, 1-O-Hexadecilglicerol (C16) y 1-O-Octadecilglicerol (C18), en el modelo de angiogénesis
inflamatoria del granuloma inducido por adyuvantes. Estos AQG disminuyeron el peso del granuloma e inhibieron la
neovascularización asociada a éste, de forma similar a la hidrocortisona, compuesto de reconocida acción antinflamatoria y
antiangiogénica. Estos resultados, constituyen una importante pauta para profundizar en los efectos de los AQG y para avanzar en
la comprensión de los mecanismos de acción que median éstos.
INTRODUCCIÓN.
La mayoría de los tejidos necesitan vasos sanguíneos para desarrollarse y sobrevivir. La angiogénesis o neovascularización es el
proceso de formación, crecimiento y desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros pre-existentes. Ocurre en
determinadas condiciones fisiológicas y en muchos estados fisiopatológicos, designados como enfermedades angiogénicas, entre
los que se encuentran el desarrollo de los tumores sólidos y sus metástasis, la retinopatía diabética y diversas afectaciones de base
inflamatoria como la artritis reumatoidea y la psoriasis1. Una propuesta actual para la terapéutica de las enfermedades
angiogénicas, incluyendo las de componente inflamatorio, es la inhibición farmacológica de la angiogénesis. En el caso de las
enfermedades de base inflamatoria, casi siempre están acompañadas de una intensa neovascularización2; la que se desarrolla para
posibilitar varios de los eventos del proceso inflamatorio crónico. Los éteres lipídicos (E.L.) introducen un nuevo concepto
terapéutico en el tratamiento de múltiples afectaciones humanas. Entre los mecanismos de acción que han sido propuestos para
éstos, se encuentra la inhibición de la angiogénesis. Los E.L. Edelfosina y S-fosfonato han mostrado efectos antiangiogénicos en
diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. Los 1-O-Alquilgliceroles (AQG) son análogos de esta familia de compuestos
ya que conservan el grupo 1-O-Alquilo de cadena larga al que se le atribuyen los efectos farmacológicos que poseen. Tomando en
consideración el importante papel de la angiogénesis en distintas patologías, entre éstas, las que tienen un componente
inflamatorio, y, por otra parte, el hallazgo reciente de efectos del 1-O-Dodecilglicerol (C12) en la inhibición de la angiogénesis
inflamatoria3; nos propusimos como objetivo estudiar los efectos de los AQG, 1-O-Hexadecilglicerol (C16) y 1-O-Octadecilglicerol
(C18) en un modelo de angiogénesis inflamatoria.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Material Químico. El C16 y el C18, fueron obtenidos en el IFAL mediante una síntesis de Williamson. La pureza de los
compuestos resultó mayor de un 90%.
Preparación de las muestras. Los AQG fueron disueltos en solución hidroalcohólica al 10 %, en las cantidades apropiadas para
conformar las dosis empleadas, a saber, 1, 10 y 20 y 30 mg/kg. Estas se encuentran dentro del rango dosis no tóxicas para ambos
compuestos.
Animales de Experimentación. Ratas Wistar macho, entre 240 y 270 g, del Centro Nacional de Producción de Animales de
Laboratorio, fueron mantenidos en cajas adecuadas con agua y comida ad libitum y temperatura e iluminación óptimas.
Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Se empleó la técnica de Kobayashi et al; 19982,
modificada. A los animales anestesiados con éter dietílico se les creó una bolsa de aire subcutánea, por inyección de 3 ml de aire en
la región dorsal. Seguidamente, en la bolsa de aire, se inyectaron los adyuvantes Montanide (0,8 ml) y aceite de croton (0.1 %).
Pasados 5 días, se sacrificaron los animales (anestesiados con éter) por inyección en la vena de la cola de 1 ml de solución del
colorante rojo carmín, conteniendo 5 % de gelatina blanca, que se mantuvo a 40ºC en un baño termostatado (Ultraterm 6000383).
Los animales muertos fueron sometidos por 20 minutos a temperaturas por debajo de 4ºC. Se extrajo el granuloma y se lavó con
agua destilada, antes de pesarlo en la balanza analítica. El contenido de carmín en el tejido granulomatoso se tomó como indicativo
de la angiogénesis lograda. Con el propósito de medir la cantidad de colorante en los vasos formados en el tejido del granuloma, se
cortó éste y se solubilizó con 4 ml de NaOH a 3 N. Después se añadieron 2 ml de HCl al 37 %, dejándolo reposar 15 minutos. A
continuación se centrífugo (Sigma 2K15, Alemania) durante 10 minutos a 3000 rpm, seguidamente se filtró el sobrenadante y se
midió la densidad óptica a 490 nm en un espectrofotómetro (Ultrospec Plus Spectrophotometer, Pharmacia LKB).
Evaluación de los efectos de los AQG C16 y C18 en el modelo de granuloma inducido por adyuvantes. Los animales se
distribuyeron al azar en 5 grupos experimentales. A 4 grupos se les aplicó tratamiento 2 horas más tarde de habérseles inducido el
granuloma y durante 4 días, mientras que el quinto grupo se mantuvo como control al que se le administró el vehículo (solución
hidroalcohólica al 10%). Los tratamientos consistieron en inocular por vía i.p el C16 o el C18 a 1,10, 20 y 30 mg/kg de peso y al
grupo restante como control positivo, hidrocortisona a 10 mg/kg por igual vía. La evaluación de los efectos de los AQG en este
modelo se realizó mediante los parámetros peso del granuloma y contenido de carmín en el mismo según fue descrito.
Procesamiento estadístico de los resultados. Se empleó el paquete de programas STATISTICA Versión 5.0 (StatSoft Inc., 1995)
para WINDOWS. Posterior a la estadística descriptiva, se realizó un test de Levene de Homogeneidad de Varianza y después la
prueba de comparación múltiple de medias de Duncan (p<0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Transcurridos 5 días de la inyección de los
adyuvantes, se divisó un granuloma bien establecido, en todos los grupos experimentales. En el control, el peso promedio del
granuloma fue de 4.89 ± 0.74 g. Resultados similares fueron informados al emplear el adyuvante completo de Freund2 e, inclusive,
el propio Montanide y aceite de croton3. La neovascularización asociada fue medida por espectrofotometría en términos del
contenido de carmín en los tejidos del granuloma, lo cual es un índice de la formación de nuevos vasos sanguíneos2. En el grupo
control, es decir con granuloma y sin tratar, el contenido de carmín fue de 0.104 ± 0.034 mg. La efectividad del modelo
experimental para permitir la evaluación de los efectos antiangiogénicos de un compuesto, fue comprobada al evaluar la acción de
la hidrocortisona, reconocido antinflamatorio esteroidal que exhibe marcados efectos antiangiogénicos2. Ésta, a 10 mg/kg, redujo
significativamente el peso del granuloma y el contenido de carmín en el mismo; lo que permite corroborar que el modelo del
granuloma inducido por Montanide y aceite de croton, es adecuado para esta finalidad.
Evaluación de los efectos de los AQG C16 y C18 en el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. En la tabla 1 se
resumen los resultados obtenidos al evaluar los efectos del C16 y C18 sobre la angiogénesis inflamatoria en el modelo antes referido.
Todos los grupos difieren del control, lo que da cuenta de que ambos productos exhiben efectos inhibitorios del peso del granuloma
y del contenido de carmín en los tejidos del mismo, en este modelo. Existe una tendencia a que la reducción del peso de granuloma
Grupo
Peso del Granuloma. (g)
(x±SD)
Contenido de carmín.
(x±SD)
Control
4.89 ± 0.74 a
0.104 ± 0.03 a
Hidrocort. (10 mg/kg)
2.40 ± 0.82 bc
0.054 ± 0.01 bc
C16 (1 mg/kg)
2.96 ± 0.39 b
0.059 ± 0.01 b
C16 (10 mg/kg)
2.42 ± 0.26 bc
0.054 ± 0.01 bc
C16 (20 mg/kg)
1.88 ± 0.57 ce
0.047 ± 0.01 bc
C16 (30 mg/kg)
1.10 ± 0.34 d
0.036 ± 0.01 c
C18 (1 mg/kg)
2.98 ± 0.70 b
0.061 ± 0.02 b
C18 (10 mg/kg)
2.57 ± 0.34 bc
0.055 ± 0.02 bc
C18 (20 mg/kg)
2.33 ± 0.32 bc
0.055 ± 0.01 bc
C18 (30 mg/kg)
1.32 ± 0.52 de
0.038 ± 0.02 c
Tabla 1. Peso del Granuloma y Contenido de Carmín en los grupos experimentales, a saber, Control con granuloma sin tratar,
C16 y C18 a 1, 10, 20 y 30 mg/kg, respectivamente e Hidrocortisona a 10 mg/kg como control positivo. (n=6). Grupos con al menos
una letra en común no tienen diferencias significativas. Nivel de significación: p<0.05.
se acentúe con el incremento de la dosis de ambos productos, no obstante, este efecto tienen un comportamiento sólo parcialmente
dependiente de la dosis, aunque es más acentuado en el caso del C16. Esta tendencia también se observa, aunque ligera, en la
reducción del contenido de carmín en los tejidos del granuloma con el incremento de la dosis de ambos AQG, no obstante, estos
efectos en la reducción del contenido de carmín como medida indirecta de la neovascularización asociada al granuloma en el
modelo empleado, tienen un comportamiento esencialmente independiente de la dosis para ambos, en el rango utilizado. Es
oportuno destacar, que los resultados obtenidos en cuanto al peso del granuloma, para ambos AQG a las diferentes dosis, inclusive a
la menor,
no tuvieron diferencias estadísticamente significativas con los resultados correspondientes al grupo tratado con
hidrocortisona; a excepción de la dosis de 30 mg/kg, a la cual, tanto el C16 como el C18 exhibieron un mayor efecto. Esto es de gran
importancia ya que la hidrocortisona es un fármaco de elección en la clínica de múltiples patologías de naturaleza inflamatoria.
Los resultados obtenidos coinciden con la escasa información en la literatura sobre la acción antinflamatoria y antiangiogénica de
otros E.L. en diferentes modelos. La edelfosina inhibe la formación de túbulos en las células de la microvasculatura endotelial
humana, lo cual es muestra de actividad antiangiogénica in vitro. El s-fosfonato, constituye un potente inhibidor de la angiogénesis,
lo que ha sido demostrado en el modelo de la membrana corioalantoica del embrión de pollo observándose que una acumulación de
s-fosfonato en ésta conduce a una lisis celular no específica, aunque existen evidencias de la inducción de apoptosis en las células
endoteliales por éste4. Varios pueden ser los mecanismos implicados en los efectos observados de los AQG. Entre ellos se
encuentra la inhibición de la actividad Fosfolipasa A25 pues, al bloquear la liberación del ácido araquidónico disminuye la
generación de eicosanoides, muchos de los cuáles son potentes mediadores de la inflamación. Ésta también podrían justificar, al
menos parcialmente, sus efectos antiangiogénicos; ya que de ellos, fundamentalmente las prostaglandinas, inducen la expresión
del factor de crecimiento del endotelio vascular, estimulando así la angiogénesis. Los resultados obtenidos son de gran importancia
ya que permiten, por una parte, corroborar los efectos antinflamatorios de C16 y el C18, en tanto que por otra, constituyen la
primera evidencia experimental de los efectos antiangiogénicos de estos AQG.
BIBLIOGRAFÍA.
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2- Kobayashi, S; Inaba, K; Kimura, I; Kimura, M (1998): Biol.Pharm. Bull. 21(4): 346-349.
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4- Jackson, JK; Burt, HM; Oktaba, AM; Hunter, W; et. al., (1998): Cancer Chemother Pharmacol 41: 326-332.
5- Bilbao, M (2001): Tesis en opción al título de Master en Ciencias. Universidad de La Habana.
Niveles plasmáticos de Ibuprofeno y la administración combinada con cafeína
José Raúl Medina López
Muñoz
1
1, 2
Helgi Jung Cook
2
Marcela Hurtado y de la Peña
1
y Francisco Javier López
3
Dpto. de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco
2
Fac. de Química,
3
UNAM y Dpto. de Farmacobiología, CINVESTAV-IPN.
Resumen: En trabajo anexo de nuestro grupo, se establece que la administración simultánea de Ibuprofeno
(IBU) con cafeína (CAF) produce sinergismo antinociceptivo, pero no se sabe si este efecto puede ser
explicado por cambios farmacocinéticos. En este trabajo se determinaron los niveles plasmáticos de IBU en
ratas Wistar, después de administrar a dos grupos (n=6) una dosis de 17.8 mg/kg de IBU (vía oral), uno de
ellos combinado CAF a 17.8 mg/kg. El IBU se cuantificó por cromatografía de líquidos de alta resolución.
Los experimentos se llevaron a cabo en ratas macho de 180 a 200 g de peso. A tiempos previamente
establecidos se tomaron muestras de 0.2 mL de sangre de la arteria caudal mediante un catéter colocado
previa ligera anestesia con éter después de administrar el o la combinación de compuestos. El plasma se
congeló a -20°C hasta el momento del análisis. Se calculó la Cmáx, el Tmáx y el área bajo la curva (ABC). Los
datos se ajustaron a un modelo abierto de dos compartimentos mediante el programa WinNonlin V02.0A. El
ABC (µgh/mL) del grupo que recibió IBU fue 68.81±10.52 unidades de área (ua) y el que recibió la
combinación IBU+CAF: 66.68±8.65 ua. Un análisis multivariable de medidas repetidas indicó que los
perfiles plasmáticos fueron paralelos (p>0.05). Estos resultados concuerdan con lo reportado por diversos
autores para otros analgésicos y apoyan la teoría de que la potenciación antinociceptiva producida por CAF
no se debe a una interacción farmacocinética, sino probablemente a un conjunto de mecanismos
farmacodinámicos.
Introducción: El Ibuprofeno es un agente no esteroide ampliamente prescrito con propiedades
antiinflamatorias y analgésicas usado principalmente en el tratamiento de la artritis reumatoide y osteoartritis.
Diversos métodos analíticos han sido publicados para la determinación de IBU o sus metabolitos en fluidos
biológicos1. Investigaciones recientes en modelos experimentales de dolor han utilizado combinaciones de
analgésicos-antiinflamatorios con CAF para determinar el efecto farmacológico2. Algunos reportes sugieren
que la potenciación ejercida por la cafeína puede ser atribuida a una interacción farmacocinética3 pero no hay
nada claro por la escasa información farmacocinética de la combinación IBU+CAF. El presente trabajo tiene
como objetivo determinar los niveles plasmáticos de IBU en ratas Wistar al administrarlo solo y combinado
con una dosis de CAF.
Material y métodos: El IBU o la combinación IBU+CAF se administró vía oral suspendido en
carboximetilcelulosa al 0.5% a dos grupos de ratas Wistar macho de 180 a 200 g de peso. Un grupo de seis
ratas recibió la dosis de IBU de 17.8 mg/kg y otro grupo similar una dosis combinada de IBU+CAF 17.8-17.8
mg/kg respectivamente. Se eligió administrar IBU solo y combinado con CAF a esta dosis porque en un
estudio farmacodinámico previo ésta combinación fue una de las que más potenciación mostró3. La
determinación del fármaco se realizó de 0.25 hasta 4 h. después de administrar el compuesto solo o
combinado. Se tomaron muestras de 0.2 mL de sangre de la arteria caudal. Las muestras de plasma se
congelaron a -20°C hasta el momento del análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR).
Se determinó la Cmáx, el Tmáx y el área bajo la curva (ABC). Además mediante un análisis multivariable de
medidas repetidas se compararon los perfiles plasmáticos. Las concentraciones plasmáticas de IBU fueron
determinadas por un método en CLAR previamente reportado por Shah4 con algunas modificaciones. Antes
de ser utilizado, el método fue validado en los principales parámetros: linearidad, precisión, exactitud,
estabilidad y selectividad. Como estándar interno se utilizó ácido mefenámico en acetonitrilo (40 µg/mL). El
equipo consistió en un cromatógrafo de líquidos Perkin Elmer Series 200 LC equipado con bomba binaria,
inyector manual y detector de UV de longitud de onda variable. La extracción de IBU del plasma se realizó
adicionando a muestras de 0.05 mL un volumen de 0.1 ml de solución de estándar interno. Las muestras
fueron centrifugadas a 5000 rpm durante 15 min. y se inyectaron 20 µL del sobrenadante al sistema
cromatográfico. Los compuestos fueron separados en una columna Symmetry C18 (Waters) eluída con la fase
móvil acetonitrilo:agua:metanol:ácido fosfórico (58:37:5:0.05 v/v) a una velocidad de flujo de 1.8 mL/min y
detección a 196 nm. La integración de los picos se llevó cabo en computadora con el programa PE NelsonTurbochrom. Los tiempos de retención fueron 1.8 y 2.4 min. para IBU y ácido mefenámico respectivamente.
Resultados: En todos los parámetros el método cumplió con los criterios de validación. La CAF no interfirió
en la determinación de IBU. En la Fig. 1 se muestran los niveles plasmáticos de IBU (Media±EE) en función
del tiempo de los dos grupos de ratas. Los datos fueron ajustados a un modelo abierto de dos compartimentos.
El análisis multivariable de medidas repetidas indicó que los perfiles plasmáticos son paralelos (p>0.05). En
la Tabla I se registran los principales parámetros farmacocinéticos determinados en cada tratamiento. El ABC
(µgh/mL) calculada para el grupo que recibió IBU fue 68.81±10.52 y del grupo que recibió la combinación
IBU+CAF: 66.68±7.89 En la Fig. 2 se muestra la comparación gráfica del ABC. Estos valores de ABC
representan los niveles plasmáticos globales alcanzados hasta las 4 h que duraron los experimentos.
Discusión: Los resultados en este trabajo permiten afirmar que no hay diferencia estadísticamente
significativa en los niveles plasmáticos de IBU al administrarse solo o combinado con CAF. Esto concuerda
con lo reportado por diversos autores2,5 apoyan la teoría y dan evidencias que la potenciación producida por
CAF no se debe a una interacción farmacocinética que eleva los niveles plasmáticos en este caso de IBU, sino
más bien a un conjunto de mecanismos farmacodinámicos responsables del sinergismo producido por CAF en
la administración combinada con analgésicos no esteroides.
Fig. 2 ABC de IBU en los diferentes tratamientos
Fig. 1 Niveles plasmáticos de IBU Media±EE n = 6
Tabla I Parámetros farmacocinéticos de IBU Media±EE
Parámetro
Cmáx (µg/mL)
Tmáx (h)
ABC (µgh/mL)
TMR (h)
Ibuprofeno
40.86±8.33
0.54±0.14
68.81±10.52
1.65±0.08
Ibuprofeno+cafeína
40.62±5.92
0.58±0.13
66.68±7.89
1.54±0.05
Bibliografía:
1. Martindale, The Extra Pharmacopoeia, Thirtieth edition, The Pharmaceutical Press. USA 1993
2. Díaz-Reval Ma. Irene, Ventura-Martínez Rosa, Hernández-Delgadillo Gloria Patricia, Domínguez-Ramírez
Adriana Miriam y López-Muñoz Francisco Javier. Effect of caffeine on antinociceptive action of ketoprofen
in rats. Arch Med Res 32 (2001) 13-20
3. López-Muñoz Francisco Javier, Medina López Raúl y Jung Cook Helgi. Potentiation of the analgesic effect
of ibuprofen by caffeine in the PIFIR model. Int Cong & Symp Ser 218 Mar (1996) 43-56
4. Shah Anita y Jung Donald. An improved high performance liquid chromatographic assay of ibuprofen in
plasma. J Chromatogr Biomed Appl 344, 408-411 (1985)
5. Flores-Acevedo DM, Flores-Murrieta FJ, Castañeda-Hernández G y López-Muñoz FJ. Potentiation of the
analgesic effect of tolmetin, a potent non-steroidal anti-inflamatory drug by caffeine in the rat. Pharm Sci
(1995) 1: 441
Efecto antinociceptivo de la combinación Ibuprofeno y cafeína en ratas
José Raúl Medina López1, 2 Helgi Jung Cook
Muñoz
1
2
Marcela Hurtado y de la Peña
1
y Francisco Javier López
3
Dpto. de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco
2
Fac. de Química,
3
UNAM y Dpto. de Farmacobiología, CINVESTAV-IPN.
Resumen: En este trabajo se determinó si la cafeína (CAF) produce efecto de sinergismo antinociceptivo
cuando es administrada simultáneamente con Ibuprofeno (IBU) empleando el modelo Disfunción Inducida
por Dolor (PIFIR por sus siglas en inglés) utilizando ratas Wistar. Los animales recibieron intraarticularmente
0.05 mL de ácido úrico al 30% en la articulación de la pata trasera derecha (rodilla). Inmediatamente después,
se les adhirió a ambas patas traseras un electrodo y luego fueron colocadas en un cilindro de acero inoxidable
de 30 cm de diámetro, que fue rotado a 4 rpm. Cuando los electrodos colocados en las patas de los animales
hicieron contacto con la superficie del cilindro se cerró un circuito, y se registró en una computadora. El
cilindro fue rotado por periodos de dos minutos y se permitió descansar a las ratas por periodos de 15 ó 30
min. Después de la administración del ácido úrico las ratas desarrollaron una progresiva disfunción de la
articulación. Los datos fueron expresados como índice de funcionalidad (IF %), el cual se calculó dividiendo
el tiempo de contacto de la pata derecha lesionada entre el tiempo de contacto de la pata izquierda control.
Cuando el IF % fue 0, los animales recibieron una dosis oral de los compuestos. Un grupo recibió IBU a 17.8
mg/kg y otro IBU+CAF 17.8-17.8 mg/kg respectivamente. El efecto acumulado durante un periodo de 4 h
fue 70.9±39.9 unidades de área (ua) con IBU solo, mientras que combinado con CAF: 214.7±23.8 ua. La
diferencia fue estadísticamente significativa (p<0.01) por lo que se aportaron evidencias de generación de
sinergismo antinociceptivo cuando fue empleada una asociación IBU+CAF.
Introducción: El uso de la cafeína en modelos experimentales de dolor ha sido evaluado por diversos autores.
Este compuesto se añade para mejorar la eficacia analgésica de compuestos antiinflamatorios.1,2
El
Ibuprofeno es un fármaco analgésico-antiinflamatorio utilizado principalmente en clínica para el tratamiento
del dolor moderado o de algunas formas de artritis. La poca información farmacológica sobre la combinación
IBU+CAF es hasta cierta forma controversial por la variabilidad y subjetividad de los modelos utilizados para
evaluar dolor.3,4 Recientemente se ha descrito un modelo de disfunción inducida por dolor en ratas en el cual
se produce inflamación en una articulación por la administración de ácido úrico.5 Los padecimientos por la
acumulación de ácido úrico en el organismo es una situación común en la práctica clínica. El objetivo de este
trabajo es determinar el grado de potenciación de la CAF al administrarse con una dosis de IBU .
Material y métodos: Todos los experimentos se llevaron a cabo en ratas Wistar macho de 180 a 200 g de peso.
Doce horas antes de los experimentos se les privó de alimento y tuvieron libre acceso al agua todo el tiempo.
La intensidad y el efecto del o los compuestos fueron medidos usando el modelo PIFIR reportado por López-
Muñoz4. En este modelo los animales reciben -bajo los efectos de una ligera anestesia con éter- una inyección
intraarticular de 0.05 mL de ácido úrico al 30% en la articulación derecha (rodilla) para inducir nocicepción.
Inmediatamente después se les adhiere a las patas traseras un electrodo. Una vez que se recuperan de la
anestesia los animales son colocados en un cilindro de acero inoxidable de 30 cm de diámetro. El cilindro es
rotado a 4 rpm forzando a las ratas a caminar. La variable a medir es el tiempo de contacto entre cada pata y
el piso del cilindro. Cuando el electrodo colocado en la pata del animal hace contacto con el piso del cilindro
se cierra un circuito y el tiempo en que el circuito permanece cerrado se registra en una computadora. El
cilindro se rota por periodos de dos minutos y se permite descansar a las ratas por periodos de 15 ó 30 min.
Después de la administración del ácido úrico las ratas desarrollan una progresiva disfunción de la articulación,
esto es registrado como una disminución del tiempo de contacto entre la pata derecha y el cilindro. Los datos
son expresados como índice de funcionalidad (IF %) y se calcula dividiendo el tiempo de contacto de la pata
derecha lesionada entre el tiempo de contacto de la pata izquierda control y el resultado multiplicado por 100.
Después de cierto tiempo de administrado el ácido úrico el IF es cero (aproximadamente 2 a 2.5 h). En este
momento los animales reciben una dosis oral del o los analgésicos suspendidos en el vehículo adecuado y los
registros se llevan a cabo durante las 4 h siguientes. El recobro del IF es considerado como expresión del
efecto analgésico del fármaco o de la combinación de fármacos administrados. Con un análisis de varianza se
determina si las diferencias son estadísticamente significativas.
Resultados: En la Fig. 1 se presenta el curso temporal del efecto analgésico producido por la administración
de IBU a 17.8 mg/kg y de la combinación IBU+CAF 17.8-17.8 mg/kg respectivamente. La diferencia fue
estadísticamente significativa. (p<0.01) El Emáx observado se incrementa de 26.5% cuando se administra IBU
a 74.0% cuando se administra IBU+CAF. El Tmáx observado no varía (1 h). El efecto analgésico global hasta
las 4 h que dura el experimento es expresado como área bajo la curva (ABC) calculada por regla trapezoidal.
El ABC (%h) determinada para el grupo de ratas que recibió IBU fue 70.9±39.9 y para el grupo que recibió la
combinación IBU+CAF: 212.7±23.8 En la Fig. 2 se representa gráficamente este cambio.
Discusión: El ABC fue 299 % con la combinación IBU+CAF que con IBU solo. La generación de sinergismo
antinociceptivo es evidente con la administración IBU+CAF pero solo en ciertas combinaciones.6 El uso de
este modelo tiene por objeto reducir la variabilidad en la respuesta producida por los pacientes y evaluar el
dolor sin la subjetividad con que otros protocolos han tratado de medir el dolor. Es posible utilizar
compuestos antiinflamatorios no esteroides o del tipo aspirina o combinaciones incluso con opioides para
evaluar la actividad analgésica.7 Los resultados obtenidos concuerdan con lo reportado por diversos autores,
algunos sugieren que el sinergismo presentado por la administración de CAF en compuestos analgésicosantiinflamatorios se debe a un conjunto de mecanismos farmacodinámicos que es necesario dilucidar.1,2,8
Fig. 1 Curso temporal de IBU Media±EE n = 6
Fig. 2 Antinocicepción de IBU e IBU+CAF
Bibliografía:
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Villarreal Julián E. y Flores-Murrieta Francisco J. Characterization of the analgesic effects of paracetamol and
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3. Laska Eugene M., Sunshine A., Zighelboim I., Roure C., Marrero I., Wanderling J. y Olson N. Effect of
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5. López-Muñoz Francisco J., Salazar Luis A., Castañeda-Hernández G. y Villarreal Julián E. A new model to
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6. López-Muñoz Francisco Javier, Medina López Raúl y Jung Cook Helgi. Potentiation of the analgesic effect
of ibuprofen by caffeine in the PIFIR model. Int Con & Symp Ser 218 Mar (1996) 43-56
7. Domínguez Ramírez Adriana M., Hernández Delgadillo Gloria P., Ventura Martínez Rosa, Díaz Reval Ma.
Irene y López-Muñoz Francisco J. Analgesic efficacy of the combination metamizol+morphine after
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8. Sawynok Jana y Yaksh Tony L. Caffeine as an analgesic adjuvant: a review of pharmacology and
mechanism of action. Pharmacol Rev 1993;45(1)43-85
Predicción de la actividad antibiótica y posible mecanismo de acción usando la metodología March
iside.
Luis Torresa,b, Humberto Gonzalezb Yaima Guevaraa. §
a Departamento de Farmacia. Universidad Central de las Villas, Santa Clara, 54830, Villa Clara, Cuba.
b Centro de Bioactivos Químicos, Universidad Central de las Villas, Santa Clara, 54830, Villa Clara, Cuba.
E-mail: [email protected]
Resumen
En el trabajo se aplica la aproximación March Inside a la predicción de la actividad antibiótica y posible
mecanismo de acción, con vistas a ello se realizó el cálculo de los descriptores moleculares a 820
compuestos activos e inactivos. Los descriptores calculados fueron usados en el diseño de una serie de
entrenamiento y otra de predicción Con la serie de entrenamiento se desarrolló una función discriminante
para la actividad antibiótica mediante el análisis Discriminante por Regresión Lineal Multivariada
obteniéndose una buena clasificación total de 92.85 %. El modelo fue validado mediante el uso de la serie
de predicción alcanzándose una buena clasificación de un 94 %. Se realizó el análisis discriminante lineal
para obtener un modelo matemático que permita la clasificación en cuatro posibles mecanismos de acción
con un porcentaje de buena clasificación para la serie de entrenamiento de 82.19%, este modelo fue
validado con una serie de predicción externa en la que se obtuvo un 81.44 % de buena clasificación. Se
realizó el cálculo de las contribuciones de enlaces para una serie de moléculas empleadas en la serie de
entrenamiento.
Introduction.
En la actualidad, el enfoque grafo-teorico es una importante alternativa para los metodos de diseño
molecular asistido por computadoras [1]. Los mas usados y conocidos son los llamados indices topologicos
[2]. Estos indices son obtenidos a partir de una representacion grafo-teorica de la molecula, en forma de
invariantes (no depende de la numeracion de los vertices o aristas del grafo molecular) [3]. Estas
invariantes grafo-teoricas constituyen un numero o un conjunto de numeros que describen de forma
cuantitativa la estructura molecular, por lo que pueden ser usados en estudios QSPR y QSAR [2-3].
En la actualidad el diseño de nuevos antibióticos constituye una linea priorizada por el Centro de
Bioactivos Quimicos y una promisoria alternativa en el desarrollo de nuevos fármacos en el tratamientos de
las enfermedades baterianas que afectan al hombre.
2. Materiales y Métodos.
Los datos de los compuestos usados en la serie de entrenamiento y predicción fueron tomados de la
referencia [4, 5]. Los descriptores moleculares calculados con la metodología March Inside. La regresión
lineal múltiple fue realizada con el paquete de programas estadísticos STATISTICA
En este trabajo se ha contado con una amplia data de 629 compuestos que comprenden compuestos activos
e inactivos. Dentro del grupo de los activos encontramos compuestos con actividad antibiótica que pueden
actuar por cuatro mecanismos diferentes. Esta data fue dividida en dos subseries, una conteniendo 333
compuestos activos y otra de 296 inactivos. Se tomaron como variables para caracterizar al fármaco las
probabilidades calculadas por la metodología March inside, teniendo estos cálculos se procedió a realizar
el tratamiento estadístico de la data obteniendo el siguiente modelo.
Y = 0.017 * P0 + 15.866 * P2 − 35.344 * P3 + 43.043 * P4 − 192.905 * P6 + 246.981 * P7 −
79.647 * P9 + 4.221
D2 = 5.33
N = 629
F = 139.27
3
= 0.38
Donde Y es la actividad antibiótica y Pi las probabilidades del fármaco calculadas según la metodología
March inside.
Donde λ es la lambda de Wilks’, D2 es la distancia de Mahalanobis y la F es la razón de Fisher.
Para la discriminación de compuestos activos / inactivos estudiados en este trabajo el modelo clasifica
correctamente el 91.89 % de los activos y el 93.92 % de los inactivos en la serie de entrenamiento para una
buena clasificación global del 92.85 %. El porcentaje de falsos activos y falsos inactivos en la serie de
entrenamiento es 6.08 y 8.11 % respectivamente. Los falsos activos son aquellos compuestos inactivos que
el modelo clasifica como activos y los falsos inactivos son los positivos que el modelo clasifica como
inactivos
La estadística indica que nuestro modelo es apropiado porque presenta un porcentaje de 92.85 % de buena
clasificación en la serie de entrenamiento y 94.00 % en la serie de predicción.
El porcentaje de falsos activos e inactivos como se describió anteriormente es el % de compuestos mal
clasificados en cada una de las respectivas series, esto puede estar motivado por diversos factores; uno de
los cuales puede estar asociado con la metodología de cálculo March inside, y como es bien conocido de
los estudios de REA en la molécula de un fármaco se puede encontrar una parte farmacófora y otra
correspondiente a los grupos transportes, los cuales no son esenciales para la actividad pero al estar
presentes en la molécula se tiene en cuenta su influencia sobre el cálculo del descriptor molecular, entonces
puede darse el caso que exista una mayor contribución de los grupos transportes al descriptor que no del
grupo farmacóforo; esto evidentemente puede llevar a clasificar un fármaco inactivo como activo y
viceversa.
Contribución de enlaces a la propiedad.
Una medida de lo que se ha planteado con anterioridad en relación con la contribución de los grupos
transportes y farmacóforos a la actividad lo es el cálculo de la contribución de fragmentos o de enlaces a
la actividad, para lo cual se calculan los descriptores locales y se evalúan posteriormente en el modelo de
clasificación general, de esta forma cada enlace se clasifica como activo o inactivo donde la suma total de
estas contribuciones será la contribución total de la molécula.
-
Clasificación según los mecanismos de acción de los antibióticos.
Para llevar a cabo este estudio solo se trabajó con compuestos de actividad antibiótica, los que pueden
actuar según diferentes mecanismos de acción, fueron agrupados en cuatro mecanismos de acción, el
primer grupo corresponde a los compuestos que actúan por inhibición de la síntesis del ácido fólico, el
segundo grupo a los que actúan inhibiendo el DNA, el tercer grupo agrupa a los compuestos que inhiben la
formación de la pared celular y un cuarto grupo que incluye a los compuestos que actúan sobre las
subunidades 50s y 30s del ribosoma; de igual forma que para la obtención del modelo general de
clasificación anteriormente expuesto se emplearon los descriptores moleculares ya calculados inicialmente,
y se realizó posteriormente el análisis discriminante obteniéndose las ecuaciones con las que podemos
evaluar a cada uno de los compuestos y según las probabilidades posterior de clasificación, pero para una
mayor precisión esta evaluación se realiza directamente en el stadistica, o sustituyendo en las ecuaciones
canónicas encontradas y que se reportan a continuación.
y1 = −0.876 * P0 − 51.175 * P2 + 177.360 * P3 − 163.054 * P4 − 55.810 * P6 + 127.825 * P7
− 31.528 * P9 − 1.310
y 2 = 0.223 * P0 − 17.187 * P2 − 32.109 * P3 + 247.33 * P4 − 9.95.324 * P6 + 1038.283 * P7
− 239.677 * P9 − 1.255
4
5
y 3 = −1.569 * P0 − 7.833 * P2 + 39.532 * P3 + 27.119 * P4 − 361.344 * P6 + 402.234 * P7
− 93.710 * P9 − 1.153
Porcentaje de buena clasificación y compuestos bien clasificados por cada mecanismo de acción y
total.
Ac. Fólico
DNA
Pcel
Ribosoma
Total
λ = 0.186
%
Correct
84.91
90.91
81.37
79.21
82.19
Ac Fólico
p=.30000
90
0
8
17
115
F = 33.71
DNA
p=.05000
0
10
1
0
11
Pcel
p=.10000
5
0
83
4
92
Ribosoma
p=.55000
11
1
10
80
102
N = 320
Conclusiones
En el trabajo se propone un modelo matemático que permite la clasificación de los compuestos en activos o
no como antibióticos, así como la clasificación dentro de cuatro posible mecanismos de acción, y la posible
zona farmacófora de la molécula.
6. References
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EFECTOS DEL “STRESS” OXIDATIVO SOBRE LAS PROPIEDADES DE LOS CANALES DE SODIO
CARDIACOS Nav 1.5.
Loipa Galán1, Karel Talavera1, Mayppe González1, Merly de Armas1, Eduardo Salinas2, Gerardo Orta2, Guy
Vassort3 y Julio Alvarez1.
1
Laboratorio
de
Cardiovascular,
Electrofisiología,
Apartado
de
Instituto
Correos
6152,
de
CP
Cardiología
10600,
La
y
Cirugía
Habana,
CUBA.
Teléfono: 552646. Email: [email protected].
2
Laboratorio de Fisiología, Instituto de Fisiología, Universidad Autónoma de
Puebla, MÉXICO.
3
U-390 INSERM, Montpellier, FRANCIA.
RESUMEN:
Estudios previos han demostrado la existencia de cambios importantes en la
+
cinética y/o la selectividad del canal de sodio (Na ) en cardiomiocitos de
ratas que sobreviven a un infarto agudo del miocardio (PIM). A diferencia de
+
los cardiomiocitos normales, el canal de Na
2+
de cardiomiocitos de ratas PIM,
+
puede conducir Ca en ausencia de Na extracelular. Estos cambios, pudieran
estar potencialmente relacionados al “ stress” oxidativo sufrido por las
células cardíacas en el curso del infarto. Con el objetivo de comprobar esta
hipótesis, realizamos estudios en canal de Na+ humano (hH1) clonado y
expresado en oocitos de Xenopus laevis y en el canal de Na+ de cardiomiocitos
+
de rata normal. En ausencia de Na
extracelular el canal hH1, en condición
2+
control, no conduce Ca . Para inducir “ stress” oxidativo, los oocitos y los
cardiomiocitos se incubaron durante 3 - 5 min en peróxido de hidrógeno
(H2O2,). Este tipo de “ stress” oxidativo no indujo cambios significativos en
+
la cinética de la corriente de Na con respecto al control. La perfusión con
+
2+
solución extracelular libre de Na , no evidenció conducción de Ca
a través
+
de los canales de Na . Estos resultados sugieren que el “ stress”
oxidativo,
+
no provoca cambios en la cinética o la selectividad de los canales de Na
2+
cardíacos que permitan la conducción de Ca
a través del canal en medio
+
extracelular
libre
de
Na .
Otros
mecanismos
adicionales
al
“ stress”
2+
oxidativo pudieran ser responsables del fenómeno de conducción de Ca
a
+
través del canal de Na .
INTRODUCCION:
Existen evidencias de que el “stress” oxidativo es causa mayor del daño celular y tisular durante los episodios de
isquemia-reperfusión del miocardio, lo cual provoca arritmias ventriculares severas incluyendo la fibrilación
ventricular
1-2
. La estructura y función de muchas proteínas que contienen residuos de cisteína, como los canales
iónicos, son críticamente dependientes del estado de oxidación de los grupos sulfidrilos de esos residuos de
cisteínas. La importancia de los residuos de cisteína en el funcionamiento del canal de sodio ha quedado bien
establecida 3.
Estudios previos han demostrado la existencia de cambios importantes en la cinética y/o la selectividad del canal
de sodio en cardiomiocitos de ratas que sobreviven a un infarto agudo del miocardio (PMI). A diferencia de los
cardiomiocitos normales, el canal de sodio de los cardiomiocitos de ratas PMI puede conducir calcio en ausencia de
sodio extracelular y esta corriente es sensible a la tetrodotoxina (TTX) (ICa(TTX))
4-6
. Algunos laboratorios han
obtenido evidencias que favorecen al canal de sodio clásico (hH1 o Nav 1.5) como el candidato para ICa(TTX) 7,
mientras que otros proponen la existencia de un nuevo tipo de canal de sodio 8.
Estos cambios pudieran estar potencialmente relacionados al “stress” oxidativo sufrido por las células cardíacas
en el curso del infarto.
Con el objetivo de comprobar esta hipótesis, realizamos estudios en el canal de sodio humano (hH1) clonado y
expresado en oocitos de Xenopus laevis y en el canal de sodio de cardiomiocitos de ratas normales, bajo
condiciones de “stress” oxidativo.
MATERIALES Y METODOS
Estudios con la técnica de “patch-clamp” en cardiomiocitos aislados de ratas:
Los cardiomiocitos fueron aislados enzimáticamente por un método desarrollado en nuestro laboratorio 9. Estas
células se fijan a micropipetas de vidrio llenas con una solución intracelular. Estas micropipetas a su vez se
conectan a la entrada de un amplificador de "patch-clamp", a través del cual se aplican a la célula, los pulsos de
voltaje deseados y se registran las corrientes iónicas que esta genera. Estos registros se hicieron en la modalidad de
"whole cell recording".
Para estudiar la corriente de sodio se utilizó CsCl intra y extracelular (para bloquear las corrientes de potasio) y
CoCl2 (1-3 mM) para bloquear la corriente de calcio. Se midieron las siguientes variables: amplitud máxima,
tiempo hasta el máximo de la corriente y constantes de tiempo de inactivación, así como la relación de la corriente
con respecto al potencial de membrana. Para caracterizar sus cinéticas, se determinaron las curvas de disponibilidad
(o inactivación). Todas estas variables se midieron en condiciones control y después del “stress” oxidativo causado
en presencia del peróxido de hidrógeno (H2O2), así como en presencia de diferentes concentraciones extracelulares
de sodio y calcio como iones permeantes.
Estudios con la técnica de “voltage-clamp” en oocitos de Xenopus laevis que expresan el canal de sodio humano
NaV 1.5.
Expresión del canal Nav 1.5 en oocitos de Xenopus laevis: Esta técnica se realizó en el laboratorio de Biofísica
Cardíaca del Instituto de Fisiología de la Universidad de Puebla. En breve: se seleccionaron oocitos de Xenopus
laevis en estadíos IV-VI, los cuales se inyectaron con ADNc que codifica para la sub-unidad
(o hH1, humano), así como ADNc que codifica para la sub-unidad
1 del canal Nav 1.5
1 asociada a este canal en proporción
1 1:5 1 (1 ng/nL). Los oocitos se incubaron durante dos días en una solución de la siguiente composición (mM):
NaCl 96, KCl 2, CaCl2 1.8, MgCl2 2 y HEPES 5 a pH = 7.4, suplementada con gentamicina (sulfato) 50 mg/L.
Registros con la técnica de “voltage-clamp” de dos microelectrodos en oocitos de Xenopus: Se registraron las
corrientes de sodio con la técnica de “voltage-clamp” de dos microelectrodos 10. Los electrodos (0.1-0.2 MΩ) de
corriente y potencial se llenaron con KCl 3M. La composición de la solución fue la adecuada para garantizar
corrientes de una amplitud tal que permitiera un control adecuado del potencial de membrana durante el “voltageclamp”. En los experimentos se utilizó un amplificador para oocitos controlado por un sistema pClamp (versión 8,
Axon Instruments, USA) para adquisición y procesamiento de estas señales. Los protocolos de imposición de
voltaje fueron similares a los referidos anteriormente para la técncia de “patch-clamp” en cardiomiocitos de rata.
Para inducir estrés oxidativo, los oocitos se incubaron durante 3 - 5 min en H2O2.
RESULTADOS Y DISCUSION
A diferencia de lo que ocurre en cardiomiocitos de ratas PIM, en ausencia de sodio extracelular, tanto en
N a
+
= 0 + H
2
O
(n A )
0
0
IN
a
+
= 0
-6
C o n tro l
C o n tro l
-8
a
N a
2 nA
(nA )
-2
-4
1 0 m s
-1 0
0
Figura 1
2
4
6
8
T ie m p o (m in )
10
b
= 0
0
2
IN
N a
+
C a
-5
2 +
C a
5 m M
2 +
1 0 m M C a
2 +
2 0 m M
b
-1 0
0
-1 5
-2 0
2 0 n A
-2 5
-3 0
0 .0
F ig u ra 2
5 m s
a
a
0 .5
2
3
4
T ie m p o (m in )
cardiomiocitos de rata (figura 1) como en el canal hH1 expresado en oocitos (figura 2), en condición control y bajo
condiciones de “stress oxidativo”, no conduce calcio, aún a concentraciones elevadas (20 mM) de este catión.
En los cardiomiocitos de rata el H2O2 produjo una disminución de la corriente de sodio, de manera no
dependiente de la concentración y sin cambios en la cinética de inactivación de la corriente, sin embargo en los
oocitos pretratados con H2O2 no hubo cambios significativos en la corriente de sodio, sin embargo después de 5
minutos de pretatratamiento con H2O2 las células mueren, lo mismo ocurrió en los cardiomiocitos de rata.
Los presentes resultados sugieren que el “stress” oxidativo, en estas condiciones y preparaciones, no provoca
cambios en la cinética o la selectividad del canal de sodio hH1 que permitan la conducción de calcio a través del
canal en un medio extracelular libre de sodio. Otros mecanismos adicionales al “stress” oxidativo pudieran ser
responsables del fenómeno de conducción de calcio a través del canal de sodio en las ratas PMI. Sin embargo, la
reducción de la corriente de sodio en los cardiomiocitos de rata bajo condiciones de “stress” oxidativo, pudiera ser
la responsable de los fenómenos de arritmias dados después de un infarto agudo del miocardio.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Estudio Genotóxico del extracto acuoso de Boldoa purpurascen utilizando dos sistemas de ensayo a
corto plazo.
Autores
Lic.Jumirlet Ortega Pérez1, Lic.Esperanza Lóriga Loaces1, Mcs.Lourdes Cancino Badías2, Mcs.Dulce María
Mosquera3, Lic.Lázara Milián3, Lic.Yamila López Linares1.
Instituciones
1
Centro Nacional de Toxicología, 2Centro de Investigaciones Biomédicas, 3Facultad de Química, Universidad
Central de Las Villas.
Resumen
La evaluación genotóxica de aquellos productos que se pretende introducir en el ambiente humano como
medicamento es una tarea de especial importancia. Con frecuencia se ha reportado actividad mutagénica y
carcinogénica en muchos productos de origen vegetal por lo que la realización de ensayos a corto plazo para
determinar mutagenicidad es particularmente ventajoso con respecto a los ensayos de carcinogénesis en
animales en cuanto a tiempo y costo. En el presente estudio nos propusimos evaluar la genotoxicidad del
extracto acuoso de Boldoa purpurascen, producto que se encuentra en fase de estudios pre-clínicos y de gran
interés por su efecto diurético para el tratamiento de la litiasis. En la evaluación se utilizó el ensayo de
mutaciones reversas en Salmonella typhimurium cepas TA100 y TA98 en ausencia y presencia de activación
metabólica y el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón. Los resultados obtenidos indicaron que el
extracto acuoso de dicha planta no produce mutaciones puntuales en las cepas empleadas a las dosis usadas,
ni produce efectos clastogénicos, ni aneuploidías en los eritrocitos jóvenes de la médula ósea de ratón.
Introducción.
La identificación de aquellos agentes a los que se expone el hombre es una tarea importante que enfrenta la
genética toxicológica. Dentro de los ensayos diseñados para la evaluación de productos, las pruebas a corto
plazo ofrecen numerosas ventajas; siendo los ensayos bacterianos de mutagénesis fácilmente reproducibles.
Estos ensayos se limitan a la detección de mutaciones puntuales (sustituciones, desfases y pequeñas
inserciones o deleciones). No obstante, en la actualidad está bien establecido que la inducción de mutaciones
puntuales en oncogenes y genes supresores provoca la aparición de tumores tanto en el hombre como en
animales, y son la causa de numerosas enfermedades hereditarias. Los ensayos de mutaciones reversas
emplean bacterias mutantes en un locus cuyos efectos fenotípicos son detectables, por ejemplo, por
incapacidad para sintetizar un metabolito esencial. Mediante una segunda mutación, el agente con actividad
mutagénica elimina el efecto de la mutación original, seleccionándose las bacterias revertantes por su
capacidad para crecer en medio mínimo carente del metabolito requerido por la cepa parental. El ensayo de
reversiones más usado es el de la histidina propuesto por Ames y colboradores en 1973 (1).
El test de micronúcleos en médula ósea es otro ensayo corto de genotoxicidad ampliamente utilizado para
detectar daños celulares inducidos por sustancias químicas a cromosomas o al aparato mitótico. Este ensayo
permite el registro de alteraciones cromosómicas por vía indirecta, monitoreando el rango de micronúcleos en
eritrocitos. Los micronúcleos (MN) se forman a partir de fragmentos acéntricos de cromátidas y de
cromosomas, así como de cromosomas completos que quedan rezagados en anafase y que se incorporan al
núcleo principal de la célula hija, apareciendo en el citoplasma de las células divididas en interfase como uno
o varios núcleos (2).
El extracto acuoso obtenido de las hojas de Boldoa purpurascen es usado por su acción diurética para el
tratamiento de afecciones renales. Este efecto es atribuible a la presencia entre sus componentes de sales
inorgánicas, flavonoides y saponinas. En el presente estudio nos propusimos la evaluación del potencial
genotóxico de Boldoa purpurascen mediante el ensayo de Ames en Salmonella typhimurium y el ensayo de
micronúcleos en médula ósea de ratón.
Materiales y Métodos
Como sustancia de prueba: se empleó el extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurascen.
Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón.
Se utilizó como modelo animal 25 ratones machos consanguíneos línea Balb/c, con una edad entre las 8-12
semanas y cuyos pesos corporales estaban entre 22+/-3g. Como control positivo se utilizó la ciclofosfamida a
la dosis de 60mg/Kg , por vía intraperitoneal, ya que es la vía más biodisponible por alcanzar con facilidad el
órgano diana. Como control negativo fue empleado el disolvente agua destilada. A la dosis de 10mg/Kg. .
Para la sustancia de prueba se utilizó la vía oral, que es la vía terapeútica propuesta para el producto, a las
dosis de 500, 1000 y 2000 mg/Kg de peso. Los animales se trataron durante dos días consecutivos, espaciados
los tratamientos 24 horas y el sacrificio de los mismos luego de 24 horas de la última administración. Para el
procesamiento estadístico se utilizó el paquete estdístico TONYSTAT para determinar si los datos seguían
una distribución normal y homogeneidad de varianza. Para el por ciento de micronúcleos se realizó la
transformación 1/ x+ 1 y así cumplir con las condiciones para utilizar una prueba paramétrica. Se compararon
las medias entre los tratamientos por los tratamientos por el test t de Student utilizando el paquete estadístico
MICROSTAT.
Ensayo de Ames.
Se empleó como sistema biológico la enterobacteria Salmonella typhimurium, cepa TA 98 para detectar
corrimientos del marco de lectura y la cepa TA 100 para detectar sustituciones de pares de bases. Como
controles positivos el 2- acetilaminofluoreno y la Azida de sodio y como control negativo agua destilada
estéril. Para la determinación de la posible capacidad del extracto de inducir mutaciones puntuales se empleó
la variante de incorporación en placas.Cada cepa fue cultivada en caldo nutriente durante 16 horas, sin
agitación. Al finalizar la incubación fueron adicionados 0.1 mL de cada una de las dosis del extracto acuoso
(50, 100, 150, 300 y 500 µg /pl), -previamente seleccionadas en un estudio exploratorio- a tubos de agar que
contenían 0.1 ml del cultivo de 16 horas de Salmonella typhinmurium y 0.5 mL de la mezcla S9 (esta última
en el caso del experimento con activación metabólica).Los tubos fueron mezclados vigorosamente en vórtex y
añadidos en placas con medio mínimo, las cuales fueron incubadas durante 66 horas a 37oC (3). Para el
registro se sacaron las placas y se cuantificaron las colonias revertantes con ayuda de un contador digital.Se
calcularon las medias y la relación existente entre el número de colonias revertantes tratadas y el control (
Razón de Mutagenicidad, RM). Se evaluó la posibilidad de que el extracto produjera una respuesta positiva en
alguna de las cepas empleadas con y sin activación metabólica, al incrementar al menos dos veces el número
de revertantes por placa en relación con los controles. La relación dosis-respuesta fue analizada
estadísticamente mediante el empleo del programa estadístico SALMONEL, elaborado por Myers y
colaboradores de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos en 1987 (4). Se consideró una
muestra como positiva cuando la razón de mutagenicidad (RM) fue mayor o igual a dos en al menos tres dosis
consecutivas, y hubo efecto dosis respuesta. A su vez hemos seguido como criterio de negatividad a aquellos
productos que a ninguna de las dosis probadas para ninguna de las cepas muestran un incremento significativo
en el número de revertantes al compararlas con el control.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
En las siguientes tablas se recogen los resultados de ambos ensayos.
Tabla .1. Resultados del ensayo de micronúcleos en ratones Balb/c.
Tratamiento
Control
(X±DS)
500mg/Kg
(X±DS)
1000mg/Kg
(X±DS)
2000mg/Kg
(X±DS)
Ciclofosfamida
(X±DS)
Total EPC
8301
Total EPCmn
38
IG (%EPCmn)
0.416±0.24
IC (EPC/ENC)
0.967 ±0.25
4706
17
0.442±0.345
1.015±0.463
8349
28
0.0415±0.374
0.814±0.151
8009
29
0.362±0.281
0.852±0.460
9568
538
5.530±2.272
0.650±0.555
Como se observa en la tabla anterior el índice de citotoxicidad encontrado para los animales tratados con el
producto demuestra que el mismo no induce efectos citotóxicos en los eritrocitos de la médula ósea.
Tabla No.2. Media de colonias revertantes. Razón de mutagenicidad.
Dosis
(µg/ml)
H2O ctrol
50
100
150
300
500
No.
de
TA100
-S9
114.5
101.1
118
128.6
149
140
Colonias
+S9
108
101.3
106.3
109.6
115.2
117.3
RM
-S9
+S9
12
18.6
24.4
34
1.22
16.6
17.3
18.6
18.6
1.08
No. De
TA98
Colonias
-S9
20.5
12
18.6
24.4
34
31
+S9
17
16.6
17.3
18.6
18.6
19.6
RM
-S9
+S9
0.58
0.90
1.19
1.65
1.51
0.97
1.01
1.09
1.09
1.15
En la Tabla No.2 podemos observar que la media del número de revertantes para cada una de las dosis
empleadas no sobrepasa el doble de la media del control, lo mismo con activación metabólica que en ausencia
de ésta, tanto para la cepa TA 100 como para la TA 98. Por consiguiente la razón de mutagenicidad es menor
que dos, condición que hace al extracto acuoso no mutagénico por no cumplirse el criterio de mutagenicidad.
Los resultados del tratamiento estadístico fueron no significativos, es decir no hubo efecto dosis-respuesta,
por lo tanto, nuestros resultados cumplen con el criterio de negatividad.
Considerando los resultados obtenidos en ambos ensayos podemos concluir que el extracto acuoso de Boldoa
purpurascen no presenta efecto mutagénico probado por el ensayo de Ames en presencia y ausencia de
activación metabólica, ni produce efecto clastogénico, ni aneuploidías en los eritrocitos jóvenes de la médula
ósea.
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INSTITUTO NACIONAL DE ONCOLOGIA Y RADIOBIOLOGIA
Inducción de apoptosis por el arsemín en una línea de leucemia murina.
Autores: Juan Carlos Rodríguez Aurrecochea1, Mayrelis Azcue1, Yovana Pereira2, Dámarys Suárez3, Ramón Ropero1, Lissbet Pimienta1,
Melba Betancourt1,.Zulema Carreras2
1
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
2
Instituto Nacional de Endocrinología
3
Estación Experimental Apícola
RESUMEN.
Se utilizaron ratones BDF1 machos de 20-21 g de peso, inoculados con la leucemia P-388 y tratados intraperitonealmente
con una dosis única del producto (2.5 mg/kg) a los 7 días de inoculado el tumor, y sacrificados a las 0, 1, 6, 24, 30, 48 y 54
horas .En cada sacrificio se tomó muestra del líquido ascítico tumoral para la determinación de apoptosis hallándose el
porciento de estas. Se procedió a la coloración de Von Kossa para determinar los niveles de calcio intracelular ,así como del
líquido ascítico se tomaron muestras para la determinación de fósforo y calcio, al analizar los resultados comprobamos que
el arsemín indujo apoptosis en esta línea celular, así como se incrementaron los niveles de calcio intracelular, comprobando
la relación de este compuesto con la muerte celular.
INTRODUCCIÓN.
El cáncer o neoplasia es una enfermedad que se caracteriza fundamentalmente por una proliferación celular descontrolada,
las células cancerosas forman tumores malignos que invaden tejidos vecinos y posteriormente pueden colonizar tejidos
distantes a través de la sangre, la linfa o las superficies serosas1.
Los eventos involucrados son entre otros, la pérdida del control del ciclo celular, lo que justifica la rápida proliferación2, la
capacidad de invadir la respuesta inmune del organismo, y el incremento de la formación de vasos sanguíneos o
angiogénesis4,5,6.
La muerte celular programada o apoptosis es un proceso fisiológico que hace desaparecer una población de células en un
tiempo específico o en respuesta a una señal dada7,8.
MATERIALES Y MÉTODOS.
En los experimentos se empleó una solución de trióxido de arsénico, líquido incoloro, suministrado por el Centro de
Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), en bulbos que contenían 10 ml a una concentración de 1mg/ml. Se
emplearon 35 ratones entre 20-21g de peso corporal., inoculados con la línea tumoral leucémica P-388 por vía
intraperitoneal. El tratamiento consistió en la administración intraperitoneal de una dosis única del producto a los 7 días de
inoculado el tumor, la dosis empleada fue de 2.5 mg/kg, siendo sacrificados a las 0, 1, 6, 24, 30, 48 y 54 horas.
En cada sacrificio se tomó muestra del líquido ascítico tumoral para una extensión en una lámina o portaobjeto, para luego
ser coloreada por la técnica convencional de hematoxilina y eosina, Las células en apoptosis fueron identificadas
morfológicamente. Se contaron 300 células en cada lámina hallándose el porciento de células apoptóticas en cada animal.
Se empleó la técnica de Von Kossa para determinar las concentraciones de calcio intracelular. Se tomaron muestras del
liquido ascítico para la determinación de fósforo y calcio.
1
RESULTADOS.
Al analizar los resultados obtuvimos un índice máximo de apoptosis a las 30h para luego decrecer rápidamente alrededor de
las 48h (Gráfica 1).
Gráfica 1 Porciento de apoptosis en la leucemia P388 tratadas con trióxido de arsénico.
14.0
células apoptóticas (%)
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
0
1
6
24
tiempo (horas)
30
48
54
%Apoptosis
Los niveles de fósforo y calcio disminuyeron sus concentraciones extracelulares en el transcurso del tiempo. Así el fósforo
alcanzó sus valores más bajos a las 48h con una concentración de 3.8 (mmol/ml) y el calcio también disminuyó para
alcanzar sus valores más bajos a las 24h con una concentración de 2.15 (mmol/ml) (Gráfica 2). Los dos elementos
estudiados fueron aumentando posteriormente hasta alcanzar valores parecidos a los iniciales.
Gráfica 2 Concentración de calcio del líquido extracelular en la leucemia P388 (mmol/ml).
Concentración de Calcio
2.4
2.4
2.3
2.3
2.2
2.2
2.1
2.1
2.0
0
1
6
24
30
tiempo (horas)
Conc.
48
54
Analizando los resultados anteriores decidimos comprobar las concentraciones de calcio intracelular por lo que recurrimos
a la técnica de Von Kossa en todas las muestras de aquellos animales sacrificados antes y a las 30h, demostrándose la
afinidad del nitrato de plata por el calcio en los animales sacrificados a las 24 y 30 hs respectivamente (Fig. 1).
2
Fig. 1 Muestra de células leucémicas coloreadas con la técnica de Von Kossa.
Obsérvese el calcio intracelular (x 40).
DISCUSIÓN.
Al analizar los resultados del fósforo y calcio podemos suponer que la disminución extracelular de estos compuestos es
debido a la penetración de ellos al medio intracelular suponiendo que el arsénico al dañar la célula tumoral hace que la
membrana se haga más permeable a la entrada de agua, iones y solutos presentes en el líquido extracelular. La pérdida
precoz de la permeabilidad selectiva de la membrana que conduce finalmente a una lesión franca de la membrana es un
rasgo constante de todas las formas de muerte celular9.
Boobis et al. plantearon la “hipótesis del calcio” donde su incremento es considerado como un activador en la citopatología
de la muerte celular. La isquemia y ciertas toxinas causan un aumento inicial de la concentración de calco citosólico debido
a la afluencia neta de Calcio a través de la membrana plasmática y a liberación de calcio desde la mitocondria y el retículo
endoplásmico. Los aumentos sostenidos del calcio de la célula se producen por aumentos inespecíficos de la permeabilidad
de la membrana 10.
La importancia clínica de leucemias y linfomas ha motivado un mayor número de estudios y conocimientos sobre la
apoptosis en estas enfermedades, Las alteraciones en el gen o en la expresión de bcl-2 son las que cuentan con más aportes
en la bibliografía11. La sobreexpresión de bcl-2 se ha correlacionado con la resistencia a la remisión completa en la leucemia
mieloide aguda.Un aumento relativo del cociente bcl-2,bax se correlaciona in vitro con la quimiorresistencia y la
disminución de la supervivencia en la leucemia linfática crónica 12.
Como puede observarse, la demostración de una alteración de la apoptosis en las enfermedades hematológicas malignas
puede mejorar la precisión diagnostica e identificar grupos que debieran tratarse de forma más agresiva y probablemente,
con nuevas estrategias.
El reconocimiento de que la mayoría de los agentes antineoplásicos actúan induciendo apoptosis en las células tumorales
abre nuevos horizontes para el desarrollo de productos más resolutivos en el control del cáncer 13.
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12. Reed, J. C. (1997). Bcl-2 family proteins:regulators of apoptosis amd chemoresistance in hematologia malignancies.
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13. Chen. G. Q. et al. (1996). In vitro studies on cellular and molecular mechanism of arsenic trioxide (AS2O3) in the
treatment of acute promyelocitci leukemia: AS2O3 induces NB4cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression
and modulation of PML-RARα/PML proteins Blood. 88. 1052-1061.
4
EFECTOS DEL AGONISTA COLINÉRGICO OXOTREMORINA-M SOBRE LA SECRECIÓN DE
INSULINA INDUCIDA POR GLUCOSA EN CÉLULA β PANCREÁTICAS INDIVIDUALES
María del Carmen Ramírez-Medeles y Alma Rosa Cortés Arroyo.
Departamento Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, México.
Resumen
Utilizamos el ensayo hemolítico inverso (RHPA) para estudiar la respuesta de células β pancreáticas
individuales al agonista muscarínico oxotremorina-m (Oxo-m). El fármaco produjo un aumento en el índice de
secreción (IS) de insulina inducida por glucosa 5.6 mM en forma dependiente de la concentración (0.2-50 µM). Este
efecto es resultado de un reclutamiento de las poblaciones funcionales de células β, así como de un aumento en la
cantidad de hormona liberada por cada célula. La magnitud de la pendiente de Hill (n = 0.9) para el IS de insulina
sugiere que el agonista actúa sobre un solo subtipo de receptor muscarínico en las células β del páncreas.
Introducción
La secreción de insulina por células β de islotes de páncreas está regulada por glucosa, nutrientes no glucósidos,
así como por varias hormonas y neurotransmisores (1,2). La ACh estimula la secreción de insulina de una manera
dependiente de la concentración plasmática de este nutriente (2). Este efecto es fundamental para asegurar la
tolerancia óptima de glucosa durante la digestión. La hiperinsulinemia es una característica de la obesidad, y la
cinética de secreción de insulina a menudo está alterada en la diabetes tipo 2 (3), sin embargo, aún no está claro si
estas patologías son consecuencia de una alteración en la actividad del sistema nervioso autónomo (2).
La investigación de los mecanismos de acción de agonistas muscarínicos en las células β pancreáticas es
fundamental para entender la fisiología y patología de la actividad colinérgica en la secreción de insulina.
Se estudió la respuesta de células β pancreáticas individuales al agonista muscarínico Oxo-m, medida como
secreción de insulina inducida por 5.6 mM de glucosa, utilizando el ensayo hemolítico inverso, RHPA (4). Este
método, se basa en la medición de imágenes de placas de hemólisis de eritrocitos de borrego formadas tras la
activación del complemento por complejos de antígeno ( hormona) - anticuerpo alrededor de las células que han
secretado la hormona ante un estímulo fisiológico o farmacológico.
Métodos
Se aislaron células β de páncreas de ratas Wistar normales por digestión con colagenasa, como se describe
previamente (5). Los procedimientos para el uso de animales se aprobaron por el comité interno para uso de animales
de experimentación. Las células se cultivaron en medio RPM1-1640 con 10% de SFB, penicilina (100 U/mL) y
estreptomicina (100 µ/mL) a 37°C (5% C02-95% aire) durante un día. En el RHPA seguimos el procedimiento ya
descrito (5), y utilizamos un antisuero contra insulina obtenido en el laboratorio (6).
Análisis estadístico. La asociación y la diferencia entre las proporciones de células que secretaron o no insulina en
cada condición estudiada se analizó con la prueba Chi-cuadrada con el programa SPSS v. 10.0. Los valores del IS se
ajustaron a la ecuación de Hill con regresión no lineal con el programa SigmaPlot v.5.0.
1
Resultados y discusión
La respuesta de las células β se midió como el área de hemólisis que rodea a cada célula, la cual es una medida
cuantitativa de la cantidad de insulina secretada por cada célula (4). Con una concentración basal (5.6 mM) de
glucosa, las células secretan cantidades moderadas de insulina y algunas no responden a este nivel de glucosa, como
se indica con la flecha en la figura 1A.
Figura 1. Detección de secreción de insulina por células β de páncreas con el
ensayo hemolítico inverso. (A) Secreción con 5.6 mM de glucosa, (B) con 5.6
mM de glucosa en presencia de 50 µM de Oxo-m.
Las células β muestran una respuesta heterogénea a la glucosa (5), a los agonistas colinérgicos como carbacol,
(CCh) (7 ), y a otros nutrientes (8). Con una concentración basal de glucosa, secreta un 50% de las células (5,7-8), y
la cantidad de hormona liberada es moderada, aunque varía entre las poblaciones funcionales (5). La aplicación de
Oxo-m (50 µM) en el medio de incubación estimuló la secreción de insulina inducida por glucosa, que se manifiesta
como un aumento en el área de las placas de hemólisis alrededor de las células β (figura 1B), así como un aumento
en el porcentaje de células (reclutamiento) que responden a este nivel de glucosa (figura 2). La dosis más alta de
Figura 2. Reclutamiento de células β que responden a
glucosa 5.6 mM, en función de la concentración de Oxo-m.
Oxo-m (50 µM) aumentó el porcentaje de células secretoras hasta un 80%, similar al que produce una concentración
estimulante de glucosa (15.6 mM). La acción insulinotrópica de los agonistas muscarínicos resulta, entre otros
mecanismos complejos, de un aumento en la concentración de Ca2+ intracelular, [Ca2+ ]c, y un aumento sustancial en
2
la eficiencia de este segundo mensajero para promover la exocitosis de la hormona (2). El aumento en el [Ca2+ ]c es
debido, en parte, a la activación de mecanismos de transducción de señales que inician con la activación de una
proteína Gq mediada por receptores muscarínicos M3, seguido por estimulación de una fosfolipasa C y liberación de
inositol trifosfato (IP3), el cual promueve la movilización de Ca2+ del retículo endoplásmico (9).
Figura 3. Índice de secreción de insulina inducida con
glucosa 5.6 mM, en función de la concentración de Oxo-m.
El IS de insulina es una medida de la cantidad de hormona secretada por una población de células β ante un
estímulo (5), y resulta de multiplicar el área promedio de las placas de hemólisis por el porcentaje de células que
secretan insulina. La Oxo-m aumentó el IS de insulina inducido por glucosa 5.6 mM en forma dependiente de la
dosis (figura 3). La máxima concentración de Oxo-m (50 µM) produjo un aumento en el IS cuantitativamente similar
al que produce una concentración estimulante de glucosa (15.6 mM). Esto es, el IS aumentó casi dos veces respecto
del observado sólo con glucosa 5.6 mM. Este efecto es semejante al que produce el CCh (7 ), pero con una
concentración 500 veces menor, lo cual refleja una menor potencia de la Oxo-m. La magnitud de la pendiente de Hill
para el IS en función de la concentración de Oxo-m (0.2-50 µM) fue de 0.9, y sugiere que la oxo-m potencia la
secreción de insulina inducida por glucosa por activación de un subtipo de receptor muscarínico. Estos resultados son
congruentes con los efectos del agonista en islotes completos de páncreas de rata (10), donde, al parecer, la Oxo-m
estimula la secreción de insulina inducida por glucosa por activación del receptor muscarínico M3.
Referencias
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3
VALORACIÓN DE LA CAPACIDAD DE IRRITACIÓN CUTANEA DEL ACEITE DE CASTAÑA
DEL PARÁ Y DEL GEL RESONANTE.
Lima, A. L.1; Costa, A. M. L.1; Fonseca, K. L.T.1; Silva-Jr., J.O.C.1; Dolabela, M.F.1 y Carvalho, R.A.2
1- CESUPA- Centro Universitário del Estado del Pará. 2- Instituto Evandro Chagas. Av. Almirante Barroso,
492, Belém, PA, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMEN
Se le realiza el test de irritación cutanea, en conejo, del gel resonante contiendo 50 % água, 30 % tensoactivo
(trilaureth-4- phosphate) y 20 % aceite de castaña del Pará (Bertholletia excelsa H.B.K.) y tambien del aceite
de castaña del pará. El gel resonante resultó ser ligeiramente irritante ya el aceite muestró no ser irritante. Es
possible solamente la utilización del aceite de castaña del pará en la terapéutica.
Palabras claves: Irritación, aceite de castaña del pará y gel resonante.
SUMMARY
Skin test in rabbits was realized from ressonant cream with 20% of brazilian nut oil, 30% of thilaureth-4 –
phosphate and 50% of the water from brazilian nut oil. This cream was less irritating athough brazilian nut oil
use is possiblein therapeutic analisis.
Key words: irritating, brazilian nut oil and ressonant cream
INTRODUCCIÓN
Para cuidados com la piel y tratamientos de enfermedades hay una grande variedad de vahículos,
como preparaciones sólidas, “semi-sólidas” y líquidas, que eston disponiblespara uso clínico. Entre las
preparaciones “semi-sólidas”, el uso de geles expandido tanto en el campo cosmético quanto en el campo
medicamentoso (PROVOST, 1986).
Usando água, trilareth-4-phosphate y aceite de castaña del pará fue obtenido un gel resonante estable.
Apesar de tener presentado estabilidad física, el gel resonante no puede ser usado como base, debido no ser
conocido su potencial irritante y alergênico (BRITO, 1994).
El objetivo de este trabajo fue valorar el potencial irritante del gel resonante y del aceite de castaña
del pará.
MATERIAL Y METODOS
El aceite fue obtenido de la almendra de la castaña del Pará (Bertholletia excelsa H. B. K) y fue un
donación de la Brazmazon Industria de Oleaginosas do Pará. Ya el trilaureth-4- phosphate fue un donativo de
la Clariant del Brasil. Para el estudio se emplearon 6 conejos albinos machos de la espécie Oryctolagus
cuniculus, procedentes del bioterio del Instituto Evandro Chagas, cuyos pesos medios fueron 2,5Kg éstos se
ubicaron en jaules individuales adecuadas.
El gel resonante usado en el trabajo tiene la siguiente composición: 50 % água, 30 % tensoativo
(trilaureth-4- phosphate) y 20 % aceite (castaña- del- Pará). En cada animal fueron inicialmente pelados con
tijera en el dorso 6 regiones con aproximadamente 10X10cm. En tres regiones fueron hecho abrasion con
lamina de afeitar. Veinticuatro horas después, en cada conejo una region com abrasión y otra sin abrasión, se
procedió la administración de 0,5g de aceite, 0,5g de gel resonante y soló procedimiento de aplicación
(control). La irritación cutanea fue valorada 5, 24, 48 y 72h después de la aplicación. Para calcular el indice
de irritabilidad cutanea primaria se adoptó los seguientes critérios:
Tabla 1: Escala descritapor Draize para la evaluación de las lesiones en la piel
1-Eritema y formación de escaras
-
Si no aparece nada
0
-
Muy ligero el eritema
1
-
Eritema bien definido
2
-
Eritema moderado a severo
3
-
Eritema severo con formación de úlceras y
4
costras
2-Formación de edemas
-
Si no hay edema
0
-
Edema poco perceptible
1
-
Edema ligero
2
-
Edema moderado
3
-
Edema severo
4
Fuente: Pargas et al., 1996
La media aritmética obtenida del edema y eritema del aceite fueron sumados, donde se obteve el
potencial de irritacin cutanea. Se procedeu de modo semejante com gel resonante y control, se aplicó la escala
seguiente: 0,0-1,0 no irritante; 1,1-2,0 levemente irritante; 2,1- 3,0 moderadamente irritante y
>3,1
severamente irritante (Brito, 1994).
RESULTADOS Y DISCUSION
En el grupo control no fue observado la presencia de edema o eritema. En las aréas tratadas con
aceite, el edema y eritema fueron pocoperceptibles (Tabla 2). Ya las áreas tratadas con gel presentaron
eritema ligero después de 72h del tratamiento.
El potencial de irritación cutanea de las areas con abrasion tratadas con aceite y gel fueron mayor que
el potencial de irritación sin abrasión (Tabla 3). Tambien áreas tratadas con gel resonante presentaron mayor
irritación de el que áreas tratadas con aceite, y cuanto mayor el tiempo de exposición (aceite y gel), mayores
fueron los potenciales de irritaciones (Tabla 3). Apesar del bajo potencial irritante del tensioactivo y leve
potencial irritante del aceite, cuando una formulación los contien ocuerre uno aumento del potencial irritante.
Tabla 2: Valoracion de la presencia de edema y eritema.
Tiempo Grupo control(eri- Grupo aceite- ede- Grupo aceite- eri- Grupo Gel- ede- Grupo Gel- eri(h)
tema y edema)
ma
tema
ma
tema
Sin
Con
Sin
Con
Sin
Con
Sin
Con
Sin
Con
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
abrasion
5
0
0
0
0
0,5
0,5
0
0
1,17
1,17
24
0
0
0
0
0,5
0,67
0
0,5
1,17
1,34
48
0
0
0,17
0
0,5
0,83
0,5
1,0
1,34
1,50
72
0
0
0,17
0,17
1,0
1,17
0,84
1,5
2,0
2,17
Leyenda: 0- Si no hay edema o eritema; 1- Edema o eritema poco perceptible; 2- Edema o eritama ligero; 3Edema o eritema moderado; 4- Edemao eritema severo. Fuente: Formulario de Investigación.
Tabla 3: Avaliação do potencial de irritação do óleo de castanha do pará e do gel ressonante
Tempo (h)
Grupo controle
Grupo óleo
Grupo Gel
Sem abrasão
Com abrasão
Sem abrasão
Com abrasão
Sem abrasão
Com abrasão
5
0
0
0,5
0,67
1,17
1,17
24
0
0
0,5
0,67
1,17
1,83
48
0
0
0,67
0,83
1,83
2,5
72
0
0
1
1,51
2,83
3,55
Leyenda: 0,0-1,0: no irritante; 1,1-2,0: levemente irritante; 2,1-3,0: moderadamente irritante y > 3,1:
severamente. Fuente: Formulário de Investigación.
CONCLUSIONES
Estos resultados indican que: el aceite de castaña del pará presenta bajo potencial irritante para piel
integra y potencial moderado para piel lesada. La asociación de este aceite al trilareth-4-phosphate produz una
respuesta “sinérgica” para el poder irritante cutaneo, tanto para piel integra como para piel sometida la
abrasion. Y que toda la irritación observada no está relacionada la metodologia adoptada para la abrasion y
aplicación de las substancias.
AGRADECIMIENTO
El Raimundo Bahia Pantoja por el apoyo técnico
Apoyo Financeiro: CESUPA y IEC-FUNASA
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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farmacêutica e/ou cosmética contendo óleo de castanha-do-pará. Belém: CESUPA, 200. 46p.
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Nuevas aproximaciones teóricas para la determinación de propiedades Farmacocinéticas y Farmacodinámicas de
6-Fluoroquinolonas.
A Novel Approach to Determining Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Properties of 6-Fluoroquinolone
Derivatives.
a*
Authors: Miguel Angel Cabrera Pérez , Carlos Fernández Teruel b, Isabel González Álvarezb, and María del Val
Bermejo Sanz b.
a
*
[email protected]
Chemical Bioactive Center. Central University of Las Villas. Santa Clara 54830, Villa Clara, Cuba.
b
Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology. University of Valencia. Burjassot 46100, Valencia, Spain.
Abstract
The ToSS MoDe approach is used to estimate the human bioavailability (F) and the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC90) against Streptococcus pneumoniae from a data set of 17 fluoroquinolone. Both pharmacokinetics
and pharmacodynamic properties were well described by the present approach. In order to obtain a qualitative model
that permit the classification of drugs with high and moderate bioavailability a discriminant analysis was carried out.
The percentage of good classification was 100 % for compounds of the training set. The leave-one-out cross validation
procedure showed an 88.23% of good classification. Later, a quantitative model, by the piecewise linear regression, was
developed. On the other hand a linear regression model that explained the 84% of variance was developed to predict the
MIC90 values.
1. Introduction
The primary goal of the drug discovery and development process is to obtain a new molecule possessing good
pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Recently, we developed a theoretical method, based on the use of a
Topological – Sub-Structural Molecular Design approach [1] in order to obtain predictive models for the n-octanol
/buffer partition coefficient, apparent intestinal absorption rate constant and intestinal permeability of 6fluoroquinolones derivatives [2].
Taking into consideration the broad antibacterial spectrum of 6-fluoroquinolones the aims of the work were: to use
the ToSS MoDe approach in generation of a discriminant function that permits the classification of molecules as a
high/moderate bioavailability (F); to obtain quantitative models, through the Piecewise Linear Regression, for this
biopharmaceutical property and finally to obtain a quantitative model of minimum inhibitory concentration (MIC90)
against Streptococcus pneumoniae by a multivariable linear regression model (MLR).
2. Materials and methods
The present approach is based on the calculation of the spectral moments of the topological bond matrix. In this
work the difference of electronegative between atoms that form a bond were used to weight the diagonal entries of the
edge matrix and were determined the local and total spectral moment of the quinolone molecular base. The variables
were selected considering the different rings, the influence of the polar and non-polar surface area as well as the
hydrogen-bonding capacity [3] on the physicochemical and absorption properties.
2.1 Development of the discrimination function and the Piecewise linear regression for human bioavailability
In the present work 17 compounds composed the data set of 6-fluoroquinolones derivatives. The classification
criterion for the discriminant function was selected in the following way: If the compound has an oral bioavailability ≥
90% is a well-absorbed drug (high F) and if a bioavailability value is between 90% and 10% the drug is moderately
absorbed. Also the validation of the model was carried out by a cross-validation (leave-one-out) procedure. The
discrimination function was obtained by using the stepwise linear discriminant analysis as implemented in
STATISTICA version 5.5.
The development of the Piecewise Linear Regression (PLR) was carried out. The estimation procedure was by
Simplex and Quasi-Newton method. The breakpoint chose was 90 due to this point is the frontier between 6fluoroquinolones with high and moderate bioavailability as selected in the previous discriminant analysis.
2.3 Development of a linear regression function for a pharmacodynamic property.
The best linear equation for the description of MIC90 against Streptococcus pneumoniae was obtained by a multiple
linear regression (MLR) method, using the forward stepwise regression, as a strategy variable selection. The quality of
the model was determined by examining the correlation coefficient, standard deviation of regression, standard deviation
of the cross validation “leave-one-out” procedure, Fisher ratio (Fexp > Ftab, α= 0.05) and the number of variables in the
equation.
3. Results and Discussion
The best discriminant function obtained for the bioavailability in the training set is given below:
Bioavailability = -0.956 – 0.119 µ1-DE + 1.559 · 10-10µ15-DE + 7.916 · 10-10µ15-PA-DE
(1)
The value of the Wilk´s λ parameter for the model is 0.268 and the Fisher ratio F (3, 13) = 11.85. In Table 1 is illustrated
the percentage of probabilities obtained in the classification of compounds of the training and the external prediction set
(first and second columns of data). This model shows that the F values employed in the study is mainly dependent on the
total spectral moment (µi) and the polar area (µi-PA) of the molecules. The percentage of overall accuracy of the model
was 100 % for the training set. If we take into account the cross-validation by leave-one-out procedure, the model
showed an 88.23 % of good classification (15/17). Only Enoxacin regardless of good classified had the lower
probability. This compound has a naphthyridone structure, thus increasing the electronic density around the N atom and
the possibility of hydrogen bond formation using the unbound nitrogen electrons, with the consequent change in the
biological properties [2].
Table 1. Experimental and predicted values of bioavailability (F) and minimum inhibitory concentration (MIC90) of 6fluoroquinolones by qualitative and quantitative theoretical methods.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Name
Ciprofloxacin
Clinafloxacin
Difloxacin
Enoxacin
Fleroxacin
Gatifloxacin
Grepafloxacin
Lomefloxacin
Moxifloxacin
Norfloxacin
Ofloxacin
Pefloxacin
Rufloxacin
Sitafloxacin
Sparfloxacin
High F a (%)
Moderate F a (%)
99.8
99.7
99.9
52.7
98.0
97.6
98.5
81.3
81.7
82.4
99.9
99.3
97.7
99.9
99.9
FH exp b
70
80
90
90
96
96c
70d
95
86
40e
90
95e
50
84f
92d
FH pred h
60
66
91
93
93
95
69
93
87
48
93
93
53
97
94
MIC90 expi
2
0.06
2
16
8
0.39
0.39
16
0.25
16
2
8
16
0.05
0.5
MIC90 predj
2.2
0.35
5.7
11.1
3
0.28
0.53
4
0.22
27
1.3
23
6
0.05
0.6
16
Temafloxacin
99.5
92g
91
17
Trovafloxacin
96.2
80
77
a
F predicted by Eq. (1); b F, Ref. [5]; c F, Ref. [6]; d F, Ref. [7]; e F, Ref. [8]; f F, Ref. [9]
g
h
i
j
F, Ref. [10], F predicted by Eq. (2 and 3); MIC90, taken from Ref. [5]; MIC90, predicted by Eq. (4)
1
0.25
0.8
0.42
The three main descriptors in the Eq.1 are in relation with the size and the area of the polar groups of the molecules.
The descriptors of high magnitude, from both kind of spectral moment, have a positive contribution to the
bioavailability, which is in correspondence with the influence that the molecular weight and the hydrogen bond capacity
have on this biopharmaceutical property.
Once the human bioavailability has been classified by a discriminant function, a predictive piecewise linear
regression model for drugs with high and moderate F values was carried out. The best predictive models obtained for F
is given below:
Log FM = 1.275 + 4.346 · 10-7 µ8-DE + 3.840 · 10-3µ2-NPA
-8
(2)
-4
Log FH = 1.963 + 5.858 · 10 µ8-DE – 2.320 · 10 µ2-NPA
N = 17
R = 0.926
(3)
2
R = 0.858
The bioavailability values obtained for the moderate and high groups are showed in Table 1 (forth column of data).
The model for Log F depends on the total spectral moments and the local spectral moments on non-polar area of the
molecules. If we analysed, for example, the Eq. 3, when the non-polar area is fairly high their negative contribution
make lower the F value for drugs with high bioavailability. This is a logic result, which is in concordant with the
findings reported by other authors [4] where a balance between polar and non-polar area is important to obtain a good
absorption profile.
The best predictive model obtained for the minimum inhibitory concentration (MIC90) against Streptococcus
pneumoniae (SP) is given below:
Log (1/MIC90)SP = -10.35 – 3.98 · 10-9µ15-R1 + 5.43 · 10-8µ14-R3 + 2.69 · 10-6µ8-DE
N = 19;
R = 0.915;
2
R = 0.837;
S = 0.363;
SCV = 0.379;
(4)
F (3,15) = 25.85
This model shows that the MIC90 of 6-fluoroquinolone derivatives employed in the study is dependent on the local
spectral moments in the rings 1 and 3, and also of the total spectral moments weighted with electronegative difference.
The experimental and predicted MIC90 values are summarized in Table 1 (fifth and sixth column of data).
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“PAPEL DE LOS RADICALES LIBRES SOBRE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. EFECTO EN LA CARCINOGENESIS”
Autores: Lic. Mayté Eirez Izquierdo, Lic. Adonis E. Zorrilla García.
Centro: Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clínicos (CENCEC)
RESUMEN
Según los resultados de incidencia obtenidos por los registros de cáncer de base poblacional existentes en el mundo y de
los datos de mortalidad mundial disponibles, se puede estimar que se producen más de 8 millones de casos nuevos de
cáncer al año (exceptuando los cánceres de piel diferentes del melanoma). 1 Han sido estas las razones que han convertido
al cáncer en un problema sanitario de primer orden, con la paradoja de que tanto su incidencia como su mortalidad
aumentan a pesar de los grandes progresos en el diagnóstico y tratamiento alcanzados en los últimos años. De manera
general el tratamiento clínico de esta enfermedad consiste en el tratamiento de los síntomas, buscando mejorar la calidad
de vida de estos pacientes, y no en el tratamiento de la causa, como constituye la generación de radicales libres en el
organismo.
No obstante se han realizado una serie de investigaciones enfocadas fundamentalmente al estudio del papel de sustancias
químicas exógenas en la carcinogénesis y la mutagénesis a través de la generación de especies reactivas de oxígeno como
mediadores del daño al ADN donde se abordan, como en nuestro caso, aspectos relacionados con el efecto de los radicales
libres sobre los ácidos nucleicos , mecanismos moleculares involucrados en la producción de Especies Reactivas del Oxígeno
(EROs) que afectan al ADN, acción de los radicales libres sobre el DNA que pueden inducir la carcinogénesis e incluso el
papel de las EROs en cada una de las etapas de la carcinogénesis, pretendiendo de esta forma encontrar una estrategia de
tratamiento adecuada para pacientes oncológicos, que proporcione no solamente una mejoría en la calidad de vida de los
mismos, sino también un arma potente contra una de las causas que conllevan a al desarrollo de esta patología.
INTRODUCCIÓN
El incremento del estrés oxidativo puede resultar de un aumento en la producción de precursores de radicales de oxígeno
reactivos, de un aumento de las Especies Reactivas del Oxígeno (EROs), de un incremento de las catálisis pro-oxidantes,
de una reducción de los sistemas antioxidantes o de una combinación de todos ellos. 2
Las especies reactivas de oxígeno presentan una alta reactividad tanto que son capaces de reaccionar con una amplia
gama de estructuras celulares, conociéndose que sus blancos fundamentales son los ácidos grasos insaturados de las
membranas fosfolipídicas, proteínas y ácidos nucleicos.2
EFECTO SOBRE ÁCIDOS NUCLEICOS
La molécula de ADN es uno de los principales blancos del ataque por radicales libres en la célula y las modificaciones que
sufre como consecuencia de esos ataques son relevantes para la pérdida de la homeostasis celular, pérdida que puede
prolongarse como consecuencia de las funciones del ADN como reservorio activo de información. Es por ello que se estudian
intensamente los agentes y mecanismos del daño por EROs puesto que su esclarecimiento va parejo a la elucidación de la
etiopatogenia de enfermedades de gran morbimortalidad como el cáncer .
En la molécula de ADN, los grupos nucleofílicos de la desoxirribosa y de las bases nitrogenadas quedan expuestos al ataque
electrofílico de las especies reactivas del oxígeno (EROs). 3
Existen diferentes tipos de daño oxidativo al DNA, entre los que se han reportado:
1) Rotura del esqueleto azúcar fosfato de una o de las dos hebras.
2) La modificación de las bases nitrogenadas. (saturación y fragmentación del anillo de timina)
3) La formación de uniones cruzadas (cross-links) ADN-ADN ó ADN- proteína.
ACCION DE LOS RADICALES LIBRES SOBRE EL DNA. CARCINOGENESIS
Las EROs pueden actuar sobre el DNA a través de diferentes mecanismos:
1.
Modificación de las bases de DNA.
2.
Generación de sitios AP.
3.
Ruptura de una cadena del DNA.
4.
Mutaciones.
5.
Activación de oncogenes y inactivación de genes supresores.
6.
Daño endotelial que favorece la metástasis.
PAPEL DE LAS EROs EN CADA UNA DE LAS ETAPAS DE LA CARCINOGÉNESIS
El cáncer se desarrolla como un proceso microevolutivo que requiere de la acumulación de múltiples eventos que tienen
lugar en un clón de células
4
y comprenden tres estadíos: 1-Inducción de mutación en el ADN de una célula somática
(Iniciación); 2-Estimulación de la expansión tumoral del clón mutado (Promoción) y Malignización del tumor
(Progresión). Se ha comprobado que las EROs pueden estimular el desarrollo tumoral en las tres etapas señaladas 5-7.
EROs en la iniciación tumoral
La iniciación requiere de una modificación permanente del material genético de una célula. Los posibles mecanismos por
los que transcurre el daño al ADN inducidos por estrés oxidativo son:
•
Formación del. OH•, generado por la interacción del H2O2 con el hierro (Fe
2+
) o cobre (Cu2+) constitutivos,
unidos o cercanos al ADN, o liberados en el interior celular a causa del estrés oxidativo. 2,,8
•
Incremento del calcio (Ca2+) libre intracelular, ya sea producto de la movilización del mismo a partir de sus
depósitos intracelulares o a través del influjo extracelular. Esta respuesta es provocada por una sobrecarga de
estrés oxidativo que agota las reservas de antioxidantes endógenos, lo que constituye una señal para la liberación
de este elemento; que una vez liberado, además de provocar otras respuestas, conduce a la activación de
endonucleasas que fragmentan al ADN (proceso que normalmente tiene lugar durante la apoptosis) 9. Estos
mecanismos no son excluyentes, por lo que pueden tener lugar simultáneamente.
EROs en la promoción tumoral
En la promoción las EROs inducen un incremento notable del Ca2+ citosólico, movilizándolo de las reservas intracelulares
e incrementando su flujo desde el medio extracelular 10. El efecto del Ca
2+
puede tener lugar por vía directa induciendo
proto-oncogenes como c-fos o de forma indirecta, modificando la fosforilación de factores transcripcionales por proteína
quinasa C dependiente de Ca2+ (PKC)
la cual, conjuntamente con otras quinasas, regula la actividad de factores
transcripcionales por múltiples cascadas de fosforilación.
Las EROs pueden estimular la actividad PKC por vía directa mediante la oxidación de sus residuos de cisteína en el
dominio regulatorio de la enzima. Puede ejercer efectos directos sobre la regulación de la actividad de factores
transcripcionales como el factor NF-Kappa B que tiene bajo su control una gran variedad de genes 11.
EROs en la progresión tumoral
El estadio final del cáncer es la malignización tumoral que se caracteriza por un crecimiento acelerado de las células, la
evasión de la vigilancia inmunológica y la invasión de otros tejidos.
Muchos de estos cambios involucran lesiones adicionales al ADN, pensándose que la generación elevada de EROs en las
células originan un estrés oxidativo persistente que incrementa su inestabilidad genómica, acompañándose de una
disminución de las enzimas antioxidantes lo cual incrementa a su vez la sensibilidad de estas células a las EROs 12.
Muchos tipos de tumores pueden originar una respuesta de intensidad variable del sistema inmune. En dependencia de la
intensidad de esta respuesta y la susceptibilidad del tumor, las EROs generadas por leucocitos activados pueden: originar
un proceso inflamatorio crónico que incrementa la progresión tumoral y conducir a la muerte celular por citotoxicidad o
inducir la muerte apoptótica.
CONCLUSIONES
Intensas y profundas son las investigaciones que como esta, al final solo aportan una pieza al inmenso rompecabezas que
identifica el tratamiento “ideal” de los pacientes oncológicos, que garantice una mejora en la calidad de vida y al mismo
tiempo una resección total de la lesión tumoral.
Consideramos que ciertas modificaciones dietéticas, con un contenido adecuado de antioxidantes, pudieran resultar
eficaces en la prevención o el tratamiento de diversos procesos patológicos que involucran la formación de EROs.
No todos los tratamientos dietéticos tienen el mismo grado de eficacia para lograr el objetivo deseado ni la misma
importancia en el tratamiento del proceso patológico. En algunas enfermedades la dieta constituye el tratamiento
fundamental; mientras que en otras, como el cáncer, puede representar un tratamiento coadyuvante.
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PREVALENCIA DEL USO DE TABACO Y ALCOHOL ENTRE ESTUDIANTES DE FARMACIA
GOMES, V.D.; PATRINY- ALMEIDA, F.; PRISCILA- ALMEIDA, F.; GARCEZ, F. y DOLABELA, M.F.
CESUPA- Centro Universitário d Estado do Pará. Dirección para correspondencia: Av. Nazaré, 630, CEP
66035-170. Belém, PA, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMEN
En este trabajo valoró la prevalencia del uso de alcohol y tabaco entre los estudiantes del curso de farmácia
del CESUPA. Los estudiantes que participaron de este estudio responderon cuestionario conteniendo
preguntas que investigaban la edad del primer contacto con la droga, motivos del consumo, frecuencia del
uso, consumo entre los familiares y principales enfermedades familiares. Los no usuarios relataron los
motivos del no consumo de la droga. Los resultados obtenidos mostraron mayor prevalencia del uso del
alcohol entre los estudiantes que del tabaco.
Palabras claves: tabaco; alcohol y prevalencia del uso
SUMMARY
In this paper, alchol and tobbaco usings among pharmacy students from CESUPA were analized. The students
answer a questionary to investigate: how old they were at the frist drug contact, why they consumed, how
often they use it, as well as the consume among their family and main family deseases. The non- users have
reported why they haven’t consumed drugs. The results showed that alcohol is more consumed than tobbaco
among the students.
Keys words: tobbaco, alcohol and consumed
INTRODUCCIÓN
La verificación de que, algunas veces, los dependientes utilizon drogas asociadamente fue
demostrada por la primeira vez en 1972. Experimentalmente se sugirió que cuanto mayor la dependencia de
nicotina tanto mayor el consumo de alcohol, o que el alcohol ejerciese un estímulo inespecífico en varias
etapas comportamentales, aumentando el consumo de cigarrillos. Se sugiere entonces que ese tipo de
dependencia deba tener el mismo origen, esto és, que sea determinada por los mismos factores (CHAIEB et
al, 1998). No hay gene único para abuso o dependencia de drogas, asi como no hay evidencias de genes
exclusivos para este fenótipo. La acción del medio ambiente sobre estas condiciones biológicas produce la
expresion del fenótipo (MESSAS, 1999).
La preocupación de detectar el uso y abuso de alcohol y cigarrillo, bien como actitudes en individuos
con profesiones unidas a la salud se basea en: probabilidad de que esos estudiantes se tornen profesionales de
salud dependientes o se presume de que sirvieron de modelo para sus pacientes (CORRÊA, 1999). El objetivo
de este estudio fue determinar la prevalencia de tabaquismo y alcoholismo en estudiantes de farmacia del
Cesupa.
METODOLOGIA
Fue un estudio del uso de prevalencia populacional (N 125) por médio de cuestionario
autoadministrado contenindo cuestiones que investigaban el uso de tabaco y alcohol. El cuestionario contenía
preguntas que investigaban la edad del primer contacto con la droga, motivos del consumo, frecuencia del
uso, consumo entre los familiares y principales enfermadades familiares. Los no usuarios relataron los
motivos del en el consumo de la droga.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Respondieron al cuestionario 114 escolares y 11 no responderon. Solamente 6% de los entrevistados
relataron consumir tabaco, pero no se consideraban dependientes siendo esta droga consumida por la primera
vez entre 15- 18 años motivados por curiosidad e influencias de amigos, principalmente. La baja prevalencia
del consumo de tabaco puede estar relacionada la extensa campaña gubernamental brasileño contra el tabaco.
En relación al alcohol, 49,5% relataron consumirlo “socialmente” y en los fines de semana. El primer
contacto con alcohol ocurrió, principalmente, antes de los 18 años (65,9%) motivados por la recreación/
diversión, curiosidad e influencias de amigos (Tabla 1). Semejante al descripto en otros estudios (ELDERS et
al., 1994), el primer conctato de los escolares con las drogas se inició principalmente en la adolecencia,
reforzando la importancia de estrategias de control de propagandas y marketing sobre estas drogas, dirigida a
esta faja etária. Pues de acuerdo con Lima (2001), la adolescencia es una etapa en la cual frecuentemente
ocurre la experimentación de drogas sean lícitas o ilícitas.
Usuarios del alcohol relataron historias familiares de enfermedades, como diabetes (41,4%),
hipercolesterolemia (6,9%), diabetes/ hipertensión (27,5%) y otras (13,8%) (Tabla 2), el que demuestra la
predisposición genética en relación la estas patologías, que asociadas con las condiciones externas y hábitos
del individuo, como tabaquismo y/o alcoholismo, puedon desencadenar procesos patológicos o hasta mismo
agravar el estado del enfermo.
Tambien, los usuarios de alcohol (72% de los usuarios) relataron el consumo de entre familiares
(Tabla 2). De acuerdo con los estudiantes de la Unesp (CORRÊA, 1999), el consumo familiar de drogas,
influencia (estadísticamente) en el consumo de los hijos, una vez que se torna un hábito común en la vida de
estos estudiantes, yá que crecen asistiendo la estas costumbres y hábitos. El uso simultáneo de alcohol/ tabaco
fue de 5,3% de los escolares.
Entre los no- usuarios (57 entrevistados), 49,2% relataron no consumir drogas por ser cientes cuanto
a los daños, 24,6% no tiene curiosidad en el consumo, 2,3% desagradan el aroma de la humareda y sabor,
3,5% por aconsejamiento familiar, 3,4% dejaron el vicio y 7% no respondieron la pregunta. Estos resultados
confirmon la importancia de realizarse campañas educativas anti- tabaquista y anti-etilista volvida la
adolescentes y jóvenes.
Tabla 1: Características cuanto a la prevalencia de la droga, consumo e edad.
Características
Prevalencia/Alcohol
Primeir conctato
Motivos
13 años
14 años
15 años
16 años
17 años
18 años
19 años
20 años
Curiosidad
Nº
57
06
07
11
06
07
14
01
05
08
%
50,0
10,5
12,3
19,3
10,5
12,3
24,6
1,8
8,7
14,0
Influencia
Diversión/ocio
Otros
1 vez/semana
Finales de semana
Socialmiente
Todos los días
Frecuencia
04
36
09
03
23
31
00
7,0
63,0
16,0
5,3
40,3
54,4
00,0
Leyenda: Nº = número de escolares e % = percentaje. Fuente: Formulario de investigación.
Tabla 2: Percentual de usuarios cuanto al los tipos de casos de enfermedad y de consumo de drogas en la
família.
Usuarios de alcohol
(n= 57 personas)
(n= 57 personas)
% de relatos de casos de enfermedad familiar
Hipercolesterolemia
Diabetes/
hipertensión
41,4
6,9
27,5
% de uso de drogas entre familiares de los usuarios de alcohol
Alcohol
Tabaco
Alcohol/Tabaco
44
8
22
Diabetes
Leyenda: Nº = número de escolares y % = percentaje.
Otras
13,8
-
Fuente: Formulario de investigación.
CONCLUSIONES
En comparación el uso del tabaco y del alcohol en esta población se considera bajo el consumo del 1o y
elevado del 2o y aún apuntándose con un recurso adecuado al no uso la conciencia de los daños que causan.
Como las estrategias de prevención vienen siendo recomendadas, principalmente hasta los 18 años, son
necesarios estudios que apunten tales acciónes y su significancia.
AGRADECIMIENTOS
Al Raimundo Bahia Pantoja por el apoyo técnico.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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dependências humanas.
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MESSAS, G. P. A participação genética nas dependências químicas. REVISTA BRASILEIRA DE
PSIQUIATRIA. vol 21 nº2 São Paulo. outubro, 1999.[WWW.SCIELO.BR]
VALORACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE OURATEA SEMISERRATA CLANS.
ESPIRITO – SANTO, A.P.1; FARIAS, T.P.O.1; VALADARES, Y.M.2; OLIVEIRA, A.B.2; BRAGA, F.C.2;
CARVALHO, R.A.3 y DOLABELA, M.F.1
1
Cesupa- Centro de Ensino Superior do Pará;
2
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas
3
Gerais; Instituto Evandro Chagas. Direción para correspondência: Av. Nazaré, 630, cep. 66035-170. Belém,
PA, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMEN
En este trabajo se valoró la toxicidad aguda dosis única del extrato hidroalcóolico del caule de Ouratea semisarrata
Clans. Para realización de este ensayo se utilizó ratones pequeños Mus musculus adultos y machos, que fueron
pesados y tratados con el extrato y observados inmediatamente, 24 y 48 horas despues del tratamiento. Despues 48
horas los animales supervivientes fueron sometidos la punción intracardíaca, y la sangre fue utilizado en examenes
bioquímicos (glucosa y colesterol). Los resultados obtenidos sugieren que el extrato tiene toxicidad elevada, y
tambien promove redución de los niveles sanguíneos de glucosa y no altera significativamente los niveles de
colesterol.
Palabras claves: Ouratea semiserrata Clans, toxicidad
SUMMARY
The severe drugs problems (single dose) were appraised from O. semiserrata Clans hidroalcoholic extrate. Males
and adult mice were used in this study. They were weighed, treated with extrate and observed, immediately, 24 and
48 hours after treatment. After 48h, survival aminals suffered intracardiac punches. The collected blood was used in
biochemistry exams (glycosis and colesterl). The extrate has so high toxic level and it promotes glycosis blood level
reduction, but it doesn’t transform the colesterol levels so much.
Key words: Ouratea semiserrata Clans and irritation
INTRODUCIÓN
La Ouratea semiserrata pertenece a la família Ochnaceae que es una grande família de árboles que ocurron
en las regiones pantotropicais siendo constituída por cerca de 600 espécies, distribuídas en 39 géneros (VELANDIA
et al., 1998a y b). Ouratea semiserrata (Mart.) Engl. corresponde la un arbusto de tamaño medio, con hojas de bordas
serrilhadas y flores pequeñas, con pétalos amarillos (VELANDIA, 1997).
La actividad inibidora in vitro de la enzima conversora de angiotensina (ECA) fue previamente relatada
para el extrato de caules de Ouratea semiserrata Clans (BRAGA et al., 2001), bien como su actividad relaxadora en
preparaciones de aorta (Cortes et al., 2002). El presiente trabajo tebe como objetivos valorar la toxicidad aguda del
extrato de O. semiserrata y determinar su actividad sobre los niveles de la sangue de glucosa y colesterol.
METODOLOGIA
La planta fue coletada en la Serra do Cipó, MG, en octubro de 1999 y su excicata se encuentra en el
herbário do ICB/UFMG, sob el número 49269. El material vegetal pulverizado fue sometido a la extracción por
percolación exhaustiva con etanol a 96o y concentrados en evaporador rotatório, a 70ºC ,sob presión reducida
(VALADARES, 2000). Durante los ensayos, el extracto fue solubilizado en água destilada, permanecendo en
banho-maria por algunos minutos, para mejor solubilización, y todo el processo protegido de la luz.
Los animales seleccionados fueron ratones pequeños Mus musculus, procedentes del Biotério del Instituto
Evandro Chagas, pesando entre 34-36g (± 35g), edad entre 55- 58 días. Estos animales fueron acondicionados en
cajas de polipropileno autoclaves (Beiramar – modelo GC 111/30x20x13cm), con tapa tipo reja en acero inoxidável
y divisiones para ración balanceada y água. Las cajas fueron forradas con cáscara de arroz autoclavadas (cama de
los animales) y mantenidas en temperatura ambiente de 21 a 23ºC, con alternancia de luz la cada 12 horas y libre
acceso a la água y la comida (ração nuvital/Curitiba-Paraná/tipo: nuvilab)
Durante la execución del ensayo, el peso de los animales fueron determinados en balanza digital (Marte
A500) siendo que este procedimento fue realizado tambien 24, 48 y 72 horas despues del tratamiento. Por via IP
fueron adminstrados las siguintes dosis 2,42g/Kg; 0,47g/Kg; 0,123g/Kg; 0,013g/Kg e 0,0015g/Kg.
Los efeictos fueron observados, inmediatamente, 24, 48 y 72 horas despues el aplicación. Simultaneamente,
se anotó la tasa de mortalidad y la Dl50 (dosis letal 50%) fue calculada por el método próbito. Una observación
clínica de los síntomas producidos pela administracion de la substancia fueron observadas. Despues de las
observaciones de 72 horas, fueron realizadas las punciones intracardíaca en los ratones pequeños que superviveron
al tratamiento, con la sangre obtenido fueron realizados los examenes bioquímicos (glucosa y colesterol). Se resalta
aún que todos los animales sometidos a la sangria morreron.
La dosagem de glucosa sangüínea fue realizada pelo método enzimático, Glicose oxidase, Colorimétrico y
de Ponto final (LABORLAB). Yá la dosagem de colesterol sangüínea fue realizado pelo método enzimático
Colesterol Oxidase, Colorimétrico y de Punto final (LABORLAB). Los resultados fueron analisados
estatisticamente at ravés del teste t de Student, y fueron considerados significativos diferentes cuando p <0.05.
RESULTADOS E DISCUSIÓN
La DL50 fue de 0,092 + 0,038 g/Kg siendo el extrato considerado extremamiente tóxico (DL50 < 0,2g/kg de
animal). Los animales tratados, con las dosis de 2,42 y 0,47g/kg de animal, presentaron prostración en todas las
observaciones (100%) y vello eriçado (100% en 72h). La prostracion puede estar relacionada a un cuadro
hipotensivo inducido por el extracto de Ouratea semisserata. A pesar de prostrado, estos animales presentaron
aumento del peso semejante al grupo control (p>0,05, Teste T Student). El aumento de peso de estos animales
puedon o no estar relacionado la presencia de edema, secundário la hipotensión.
Examenes bioquímicos demonstraron que ocurreron redución en la tasa glicemica dosis – dependiente y
aumento de la tasa de colesterol sangüíneo, tambien dosis-dependiente (Tabla 1). La reducion de la tasa de glucosa
puede estar relacionada la inhibición del sistema nervioso simpático, esta inibición debe estar relacionada al
principio activo que inhibio la ECA causando vasodilatación. Yá el aumento de; colesterol, puede tambien esta
relacionado con o principio ativo de la planta.
Tabla 1 :Resultados de los examenes bioquímicos de glucosa e colesterol
Dosis (g/Kg )
Tasa Glucose + SD
Tasa de Colesterol + SD
114,28 + 36,55
Control
142,5 + 64,5
2,42
∗
∗
57,69à + 0
212,5 à + 0
0,47
182,5 à + 24,49
0,123
72,11à
21,4
0,013
⊕
⊕
112,63Š + 18,73
162,5 à + 41,45
0,0015
Leyenda: ∗ animales mortos; ⊕ perda de los animales durante el ensayo. (à) diferente del control (p<0,05, Ensayo
T- Student), (Š) igual al control (p>0,05, Ensayo T- Student). Fuente: Formularios de investigaciones.
CONCLUSIÓN
Los resultados obtenidos sugerem que el extrato de caules de O. semiserrata tiene toxicidad elevada (CL50
< 0,2 g/Kg), y promove reduciones de los niveles sanguíneos de glucosa y no altera significativamente los niveles de
colesterol.
AGRADECIMIENTOS
Al Raimundo Bahia Pantoja por el apoyo técnico.
APOYO FINANCIERO: Centro de Ensino Superior do Pará y Instituto Evandro Chagas (FUNASA)
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VELANDIA, J, R.; CARVALHO, M. G., BRAZ-FILHO, R.Novel trichloro- and terAChloroisoflavone isolated fron
Ouratea semiserrata. Nat. Prod. Lett., v.12, p.191-198, 1998. (a)
VELANDIA, J, R.; CARVALHO, M. G., BRAZ-FILHO, R. Ácido ent-16 , 17 diidroxicauran-19-óico isolado de
Ouratea semiserrata e os desafios estereoquímicos dos carbonos quirais C-4 e C-16. Química Nova, v.21 (4), p.397404, 1998.(b)
EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA DE LA SERIE HOMÓLOGA DE LOS 1-O-ALQUIL
GLICEROLES EN EL MODELO DE EDEMA INDUCIDO POR CARRAGENINA.
Miguel Bilbao Díaz, Yolanda Valdés Rodríguez, José Luis león Álvarez, Francisco Merchán González,
Iván Santana Segura y Yadira Peña Proenza.
Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Ave. 23 No. 21425 entre 214 y 222, La
Coronela, La Lisa, Ciudad Habana. Teléf: (537) 2715512 Fax. (537) 336811. E-Mail: [email protected]
Introducción
La reducción de la respuesta inflamatoria en modelos animales constituye un factor de extraordinaria
importancia a la hora del establecimiento de compuestos con efectos antinflamatorios. A partir del
descubrimiento de los 1-O-alquil gliceroles en 1921, algunos investigadores han evaluado los efectos
farmacológicos de este grupo de compuestos. Dentro de los efectos más importantes que se han
encontrado sobresalen: los antitumorales directos, antinvasivos, adyuvantes de poliquimioterapia (1,2),
inmunoadyuvantes (3,4), inductores de la diferenciación celular y la apoptosis (5) y antinflamatorios (1).
Uno de los mecanismos por los cuales se han propuesto a estos compuestos como antinflamatorios lo
constituye la inhibición de la FLA2 en diversos modelos experimentales (1,6).
Teniendo en cuenta este hipótesis y además los resultados que se han obtenido con las mezclas de los 1O-Alquil gliceroles naturales sobre la reducción de la respuesta inflamatoria (1), nos propusimos en este
trabajo evaluar los efectos de la serie homóloga de los 1-O-alquil gliceroles sintéticos en un modelo de
edema inducido por carragenina.
Materiales y Métodos
¾ Modelo de inflamación local Aguda inducida por carragenina.
La acción antinflamatoria, fue seguida a través de la inducción del edema por carragenina, según la técnica
descrita por Winter y el PNT 0123 del CEIEB, donde se usó el Pletismómetro Ugo Basile 7150 para la
determinación de la variación de volumen en cada uno de los casos.
Se emplearon ratas Wistar hembras de 175 a 250 g de peso. Se dividieron en grupos experimentales con
grupos de tratamiento (n=5), donde fue testada la modificación de la actividad proinflamatoria de la
carragenina a la 3 hora de trabajo (3h), por parte de los 1-O-alquilgliceroles sintéticos (1-O-octadecil glicerol
(C18), 1-O-hexadecil glicerol (C16) y el 1-O-dodecil glicerol (C12) disueltos en una solución hidroalcohólica,
donde se comparó dichas actividades respecto a un grupo tratado con Indometacina (Sigma) 5 mg/kg como
control positivo.
¾ Análisis Estadístico.
En el caso del experimento antinflamatorio se calcularon los estadísticos de posición y dispersión en cada una
de las muestras experimentales (tiempo/sustancias). Con el objetivo de corroborar las premisas requeridas
para la aplicación de un análisis de varianza, se aplicó el test de Kolmogorov- Smirnov, así como diversas
pruebas para establecer la condición de homogeneidad de varianzas muestrales. Posteriormente se aplicó un
análisis de varianza Modelo Factorial (efectos fijos) tomándose como factores, a los tiempos y a las distintas
sustancias usadas en el experimento.
Al encontrarse diferencias significativas para cada factor (tiempo y sustancias) se aplicó un test de rangos
múltiples de Duncan para cada factor por separado, además se aplicó un análisis de varianza de clasificación
simple (efectos fijos).
Resultados y Discusión.
• Resultados obtenidos para los 1-O-alquilgliceroles evaluados.
Tabla 1: Efectos del C18 sobre la inflamación local aguda inducida por carragenina, con una n =5 ratas y 5
grupos experimentales.
Grupos
% de Inflamación (3h)
(X±DS)
% de Reducción de la
Inflamación (3h)
Carragenina (1%)
52,8 ± 4,2
-
Indometacina (5 mg·kg-1)
23,9 ± 5,4
54,73 (a)
C18 (3 mg·kg-1)
35,6 ± 4,1
32,57 (b)
C18 (5 mg·kg )
41,1 ± 1,8
22,15 (b)
C18 (7 mg·kg-1)
40,2 ± 2,4
23,86 (b)
-1
Grupos con al menos una letra en común no tienen diferencias significativas (p<0,05).
Tabla 2: Efectos del C16 y la mezcla C16:C18 (1:1) sobre la inflamación local aguda inducida por carragenina
con una n =5 y 5 grupos experimentales.
Grupos
% de Inflamación (3h)
(X±DS)
% de Reducción de la
Inflamación (3h)
68,0 ± 7,5
-
Indometacina (5 mg·kg )
30,0 ± 6,3
55,88 (a)
C16 (1 mg·kg-1)
47,0 ± 8,2
30,88 (b)
43,0 ± 8,8
36,76 (b)
Carragenina (1%)
-1
C16 (3 mg·kg-1)
-1
28,0 ± 5,1
58,82 (a)
C16 +C18 (1 mg·kg )
Grupos con al menos una letra en común no tienen diferencias significativas (p<0,05).
Tabla 3: Efectos del C12 sobre la inflamación local aguda inducida por carragenina con una n =5 y 5
grupos experimentales.
Grupos
% de Inflamación (3h)
(X±DS)
% de Reducción de la
Inflamación (3h)
Carragenina (1%)
73,0 ± 2,5
-
Indometacina (5 mg·kg-1)
21,0± 3,5
71,23 (a)
C12 (3 mg·kg )
56,0 ± 2,9
23,28 (b)
C12 (5 mg·kg-1)
60,0 ± 4,1
17,08 (b)
-1
62,0 ± 4,.8
15,06 (b)
C12 (7 mg·kg-1)
Grupos con al menos una letra en común no tienen diferencias significativas (p<0,05).
En la tabla 2 se presentan los valores más significativos obtenidos para los 1-O-alquil gliceroles evaluados a
la 3h, intervalo al cual se obtuvo el pico máximo de inflamación inducido por la carragenina. En la tabla
puede observarse como el C16 (1 y 3 mg·kg-1) provocó una disminución entre un 30.88% y un 36.76%
respectivamente de la inflamación inducida por carragenina. Este efecto resultó significativamente diferente
(P<0.05) versus la indometacina (5 mg/kg). Sin embargo, la mezcla del C16 y el C18 (1 mg/kg de peso) mostró
una reducción significativa (P<0.05) del % de la inflamación provocado por la carragenina, y éste valor
(58.82%) no difirió del mostrado por la indometacina (5 mg·kg-1 de peso), lo cual coincide con trabajos
anteriores donde se utilizaron mezclas de 1-O-alquil gliceroles, las cuales redujeron la respuesta inflamatoria
inducida por la carragenina de igual forma que la indometacina a la misma dosis utilizada de 5 mg·kg-1 (1).
Con respecto al C18 y C12, aunque también fueron capaces de reducir la respuesta inflamatoria inducida por la
carragenina a la 3h, no resultaron estadísticamente diferentes al compararse con la indometacina. Al parecer,
aunque estos compuestos tienen efectos sobre la reducción de la respuesta inflamatoria, necesitan utilizarse
en mezclas para lograr un efecto farmacológico sinérgico y poder reducir la respuesta inflamatoria inducida
por la carragenina.
Bibliografía.
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Ciencias Biológicas. Universidad de la Habana, 1997.
2- Sotomayor H: Efectos antitumorales in vivo de los 1-O-Alquil gliceroles del aceite de hígado de
tiburón Galeocerdo cuvieris y del 1-O-Hexadecil glicerol sintético. Tesis en opción al título de Master en
Ciencias. Universidad de la Habana, 1999.
3- Valdés Y, Pignol B, Coulomb H, Sedeño C y Braquet P: Efecto de los 1-O-Alquil gliceroles sobre la
producción de citoquinas por macrófagos humanos. J. Biomedical Supl. 11(10) 1991.
4- Pignol B, Chaumeron S, Coulomb H, Maisonnet T, Vandamme B, Broquet C, Mencia-huerta Y
(1992): citado por Houlihan WJ, Lohmeyer M, Workman P y Cheon S: Phospholipid antitumor agents.
Medicinal research reviews 15(3): 157-223, 1995.
5- Hernández M: Efecto de los éteres lipídicos sobre líneas tumorales del sistema nervioso. Libro de
Resúmenes I Congreso Internacional Farmacología’98. La Habana, Cuba. pp. 72, 1998.
6- Burford, RG, and Gowdey, C.W. Anti-Inflammatory activity of alkoxyglycerols in
rats.Inter:Pharmacodyn.,173:56-70,1968.
EVALUACIÓN DE LA IRRITABILIDAD DERMICA DE UN PRODUCTO DE BASE SILÍCICA CON
ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DEMOSTRADA.
Autores:
MSc. Mirta Morales Díaz. ∗, Dr. Remigio Cortés Rodríguez∗∗, Dr. Omar Prieto García∗∗∗, Dr Orel Pérez García∗∗∗∗
∗Departamento de Farmacia.Universidad Central de Las Villas, ∗∗Centro de Bioactivos Quimicos.Universidad Central
de Las Villas, ∗∗∗ Departamento de Química. Universidad Central de Las Villas, ∗∗∗∗ Investigador de la planta de
zeolitas de Tasajeras. Villa Clara.
Resumen:
En nuestro grupo de investigaciones fue sintetizado un producto de base silícica, hasta el momento no reportado en la
literatura denominado Dermasel que ha demostrado poser muy buena actividad cicatrizante y antibacteriana en los
ensayos con animales de laboratorio
Se realizó su estudio de Irritabilidad Dérmica, para ello se utilizó la técnica propuesta por Draize en 1944. Se
utilizaron conejos albinos jóvenes adultos de la raza Nueva Zelanda, conformándose dos grupos de tres animales cada
uno a los que se les depiló la región dorsal, seleccionando cuatro áreas de 2.5x 2.5 cm, las que fueron numeradas en
zona 1,2,3,4 aplicándoseles el producto en forma pura, al 15%, 5% y una zona como control respectivamente. A las
zonas tratadas se les aplicó 0.5g del producto y se cubrieron con parches de 6cm2 durante cuatro horas, se lava y se
evaluan los resultados. Se tomaron muestras de piel para evaluarlas microscópicamente, no detectándose alteraciones
en ninguno de los casos . El producto resultó clasificado de no irritante a ligeramente irritante sobre piel, mostrando
una relación dosis-respuesta. Esto resulta favorable con vistas a una posible aplicación.
Introducción:
En la actualidad se encuentran variadas aplicaciones de productos de base silícica
en la rama veterinaria,
microbiología, agricultura, e industria farmacéutica, donde se reportan diversos trabajos de
su aplicación en
preparaciones usadas sobre la piel . A partir de los años 80 se intensificaron las investigaciones con vistas a
diversificar su uso. En este sentido en nuestro grupo de investigación fue sintetizado un producto de base silícica, hasta
el momento no reportado en la literatura denominado DERMASEL1, que ha demostrado poseer muy buena actividad
como cicatrizante y antibacteriano, por lo que se decidió comenzar su estudio toxicológico.
Materiales y Métodos:
La técnica expuesta desarrolla una metodología donde se empleó la escala de puntuación propuesta por Draize; 1944
para observar macroscópicamente si existe edema y eritema en la piel.
Se determinó la irritabilidad primaria en este órgano según las observaciones macroscópicas en esta estructura ,
clasificando la sustancia en irritante o no de acuerdo con la tabla de irritación propuesta por la OECD, 19972. En esta
técnica la estadística no procede por ser un método estandarizado.
Se utilizaron conejos albinos jóvenes adultos de raza Nueva Zelanda, de edad entre 5 y 7 meses, con una masa
corporal entre 2,5 y 3 kg , los cuales portaban el certificado de salud. La alimentación fue la recomendada para la
especie. Se conformaron 2 grupos de 3 animales cada uno para probar concentraciones diferentes (5% y 15%) del
principio activo, la asignación de los animales a cada grupo se realizó de forma aleatoria, así como las zonas donde se
efectuó la aplicación del mismo. Los animales se distribuyeron de forma individual en jaulas para conejos, marcados
mediante presillado en la oreja. Tanto la alimentación como el agua se administró ad libitum .Los utensilios se
fregaron con agua de la pila y detergente, secados al horno y esterilizados en la autoclave al igual que el pienso y el
agua.
Los animales se colocaron en cepos, depilando la región dorsal, seleccionando cuatro áreas de 2,5 x 2,5cm, 24 horas
antes de la aplicación, dos de ellas se afectaron con un objeto cortante fino que sólo dañó la epidermis, corroborado
por la ausencia de sangramiento. Las mismas se numeraron según el diseño acorde con la metodología modificada por
Knapec y Beitz 1976, para valorar la piel. Donde las áreas son numeradas aleatoriamente en zonas 1, 2, 3 y 4, la
numeración corresponde respectivamente a la aplicación del producto puro, forma terminada al 15%, forma terminada
5 % y control.
A las zonas tratadas se les aplicó 0,5 g del producto y se cubrieron con los parches de 6 cm2 recomendados
internacionalmente, sostenidos por una cinta adhesiva no irritante. El tiempo de exposición fue de 4 horas, al concluir
el mismo se eliminaron los parches y se lavó con agua atemperada, comenzándose a evaluar las manifestaciones de
edema y eritema según la escala de Draize. Las lecturas se efectuaron a 1, 24, 48 y 72 horas , los estudios de
reversibilidad de las lesiones transcurren hasta 21 días.
Se calcula el Indice de Irritabilidad Primaria en Piel (IIPp) mediante la suma individual de edemas y eritemas
dividiéndose entre el número de animales por la cantidad de observaciones desechándose las efectuadas a la hora, el
resultado del IIPp se lleva a la escala propuesta por la OECD, 1997 para piel, se clasifica el producto y se aprueba o se
rechaza.
Al concluir el experimento se efectúa la eutanasia y se extraen muestras de piel de los animales dañados para estudios
histopatológicos y estudios de reversibilidad del efecto.
En la preparación de la crema (5%,15%) se utiliza una mezcla de PEG 400 y PEG4000, según lo recomendado en la
farmacopea. El principio activo puro se aplica directamente sobre la piel después de ser remojado con agua.
Resultado y discusión:
Al realizar este tipo de estudio para el producto DERMASEL, se obtuvieron los resultados siguientes:
Al valorar la formación de eritemas y edemas y determinar el IIPP se obtienen valores comprendidos en el rango desde
0.5 a 1.3, lo que nos permite evaluar este producto de origen zeolítico como no irritante, siguiendo como criterio de
clasificación el elaborado por Draize que asume como no irritante a aquellas sustancias con IIPP menores de 2.0. Al
usar como criterio de clasificación el propuesto por la OECD en 1997 es clasificado como ligeramente irritante ya que
los valores de IIPP están comprendidos entre 0.4 y 1.9. No fue observado en los animales durante el tiempo del ensayo
ningún otro síntoma que indicara manifestaciones tóxicas, los mismos se mantuvieron siempre con buen estado
general y apetito normal.
Los resultados obtenidos están acordes con lo reportado por otros autores al utilizar este tipo de producto en
preparaciones cosméticas de baja irritabilidad 3,4,5,6 .
A las 72h los signos de irritabilidad son muy bajos para la mayoría de los animales. Al continuar las observaciones se
pudo comprobar que ya al quinto día post-aplicación ningún animal presentaba manifestaciones de eritemas o edemas,
situación que se mantuvo hasta los 21 días inicialmente establecidos para observar reversibilidad.
En la tabla 1, se aprecia que a pesar de obtenerse valores de irritabilidad muy bajos, estos son mayores en la piel
dañada que para la piel intacta, lo cual es justificable, teniendo en cuenta que en esta zona la integridad física de la piel
como barrera eficaz a la acción de diferentes agentes está afectada7 . Además se observa como el grado de irritación
aumenta en la medida que aumenta la concentración del producto, lo que evidencia una relación dosis respuesta.
Tabla 1. Piel dañada e intacta evaluada a las 24, 48 y 72 horas
Piel Dañada
Piel Intacta.
Sustancia
IIP
IIP
Zeolita Pura
1.3
0.9
Zeolita 15%
1.16
0.6
Zeolita 5%
1.05
0.5
IIP: Indice de Irritabilidad Primaria.
A pesar de que no fueron detectados síntomas tóxicos, se confeccionaron 2 réplicas de láminas (por cada
concentración empleada) con muestras de piel, para su estudio microscópico, no detectándose alteraciones en ninguno
de los casos.
Teniendo en cuenta los resultados satisfactorios obtenidos por este producto en las pruebas farmacológicas en la cura
de quemaduras y teniendo además presente que la extrapolación al humano de los resultados obtenidos en los estudios
de irritabilidad en animales es limitado7,8 y a pesar de que en nuestro ensayo se utilizan como animales de
experimentación conejos albinos, cuya piel resulta muy sensible a las sustancias irritantes, es recomendable corroborar
estos resultados con otra especie animal, lo cual dará validez a su extrapolación al humano.
Conclusiones
1.
El DERMASEL resultó ser clasificado de no irritante a ligeramente irritante sobre piel con valores de IIP mayores
para piel dañada, mostrando una relación dosis - respuesta tanto para la piel dañada como para la intacta.
2.
Los efectos tóxicos causados manifestaron reversibilidad al ser aplicado el producto sobre la piel.
Bibliografía
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Toxicol.Appl.Pharmacol. 19:276-280,1971
“ Ciguatera:Clínica y epidemiología de l61 pacientes.”
Autores: Dr. Reynaldo B. Hevia Pumariega, Dr. Angel Suárez Escandón, Dra. Alida O.
Hernández Mullings y Dr. Javier Herrera Acosta.
CENTRO NACIONAL DE TOXICOLOGIA.( CENATOX).
INTRODUCCION:
La ciguatera es una enfermedad conocida desde hace siglos, causada por la ingestión de
una gran variedad de peces de hábitat coralino que acumulan las toxinas por vía de la
cadena alimentaria, siendo propia de áreas tropicales y subtropicales (1).
Varios son los aspectos que pueden influir en el desarrollo de la toxicidad, ninguno de ellos
exento de polémicas: edad, sexo, área geográfica, condiciones ambientales, estación del
año, tipo de pez, porción y cantidad ingerida, antecedentes previos de la enfermedad,
variabilidad individual, toxinas presentes, ruta de intoxicación y otros (1,2).
Las manifestaciones clínicas son pleomórficas y pertenecen a tres grupos fundamentales
(gastrointestinales, neurológicas y cardiovasculares), ellas son debilitantes y tienden a
prolongarse por semanas, meses o años; es de suma importancia el conocimiento de las
mismas por ser el diagnóstico clínico (3,4).
Esta investigación tiene como objetivo analizar algunas características clínicas y
epidemiológicas de la ciguatera.
METODO:
Se realizó un estudio descriptivo de carácter retrospectivo, para lo cual se revisaron todas
las historias clínicas de los pacientes ingresados por ciguatera en el CENATOX entre
Noviembre de 1998 y Octubre del 2001. De cada una de ellas se recogieron las siguientes
variables: tipo de pez, manifestaciones clínicas iniciales, período de incubación, cuadro
clínico general y evolución.
Se confeccionó una base de datos que fue procesada en una computadora personal Pentium
MMX con Windows 98 y Software Microsoft Excel (Microsoft Office 2000). Los
resultados se dan en porcientos y se muestran en tablas y gráficos.
RESULTADOS:
Se ingresaron 161 casos los cuales se distribuyeron en todos los meses, predominando en
el período Mayo-Agosto con 92 pacientes (Tabla No. 1).
Tabla No. 1: Distribución de ingresos por meses.
No.
%
Enero Feb.
14
8
8,7
5
Mar.
12
7,5
Abril
12
7,5
Mayo Jun.
27
24
16,8 14.9
Fuente:Registro de ingresos del CENATOX.
Jul.
21
13
Agos. Sept.
20
9
12,4 5,6
Oct.
7
4,3
Nov.
5
3,1
Dic.
2
1,2
Total
161
100
Se identificaron 18 tipos de peces: Picúa 53 (32,9%), Aguají y Cherna 9 para ambos
(5,6%), Serrucho 8(5%), Gallego 7(4,3%), Sierra 7 (4,3%); otros como Pargo, Dorado,
Medregal, Salmón, Peto, Emperador también aparecieron. De los afectados 46
desconocieron la especie ingerida.
El período de incubación varió de 30 minutos hasta 72 horas, siendo en 132 (82%) de los
enfermos menor de 12 horas. Las manifestaciones clínicas iniciales predominantes fueron
las gastrointestinales en 122 casos para un 75,8% , seguido de astenia 9,3%, neurológicas
Gastrointestinales
Astenia
Neurológicas
Prurito
SOMA
8,1%, prurito 3,7% y las relacionadas con el sistema osteomioarticular 3,1%.(Gráfico 1).
Gráfico No. 1: Manifestaciones clínicas de debut.
Fuente: Historias Clínicas.
Los síntomas y signos ascendieron a 42, siendo los más significativos: diarreas(70,8%),
astenia(67,1%), acroparestesias (58,4%), vómitos (55,3%),parestesias en labios y lengua
(54,7%), disestesias paradójicas (42,2%). Se observaron con menor frecuencia: artralgias,
molestias abdominales, mialgias, prurito, hipotensión, náuseas, cefalea, odontalgias,
mareos, visión borrosa, ardentía genital, fiebre y otros.Todos los pacientes mejoraron
egresándose en las primeras 72 horas.
DISCUSION:
Se ha sugerido una toxicidad estacional de los peces, planteándose que las especies
capturadas entre los meses de Febrero-Agosto tienen más probabilidad de estar ciguatos
(3,5); tuvimos casos todos los meses del año aunque con mayor incidencia en el período
Abril-Agosto. Creemos que la teoría de la cadena alimentaria justifica que las toxinas
permanezcan en los mismos durante años, pero el auge de la pesca en verano y el
fenómeno de las mareas rojas pueden contribuir al incremento del número de afectados
durante esta estación.
Hasta el presente se ha vinculado la intoxicación con alrededor de 425 especies (6); a pesar
de estar descrita la misma en peces no ciguatos (5), es significativo algunas referencias
(serrucho, cherna, pargo, emperador y salmón) lo cual pudo deberse a confusiones por
parte de pescadores y consumidores o a la venta ilícita de forma irracional por comerciantes
individuales con fines lucrativos.
El período de incubación concuerda con la mayoría de los reportes (1,3); aunque no se
puede describir una secuencia exacta de las manifestaciones lo más común es que las
gastrointestinales sean las iniciales, esto puede atribuirse a un efecto local irritativo sobre la
mucosa digestiva mientras que los cambios a otros niveles parecen requerir más tiempo.
Se han señalado alrededor de 175 síntomas en la enfermedad. Encontramos 42 con
características muy variables y con una frecuencia similar a la habitualmente descrita
(1,3,4). Por lo anterior podemos plantear que el antecedente de ingestión de pescado
asociado a un cuadro gastrointestinal y neurológico sugieren este diagnóstico. El prurito y
los trastornos cardiovasculares no resultaron comunes quizás por las variaciones reportadas
en las diferentes zonas geográficas (1,3). La presencia de fiebre (manifestación
excepcional) pudiera responder a la acción de alguna de las toxinas involucradas sobre el
centro termorregulador del hipotálamo.
Todos los pacientes mejoraron en breve tiempo posiblemente por la evolución natural de la
patología (cuadro gastrointestinal fugaz) combinado con la terapéutica establecida.
CONCLUSIONES:
1.- La ciguatera apareció durante todo el año con predominio en el verano.
2.- Las especies tóxicas fueron diversas, siendo más común la barracuda.
3.- El inicio resultó precoz con síntomas gastrointestinales.
4.- Las manifestaciones clínicas fueron múltiples primando las digestivas y neurológicas,
las cuales mejoraron en breve tiempo.
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Editions INSERM1997;147.
7. Di Nubile M.J, Hokama Y. The ciguatera poisoning syndrome from farmaised salmon.
Ann Interm Med 1995; 122(2):113-4.
Estudio bioquímico y cardiovascular de pacientes drogodependientes.
Autores: Lic. Onel Fong Lores, Lic. Maibia Tamayo Irzula, Lic. Clara Azalea Berenguer Rivas, Lic. Daniel
Reina, Dra. Liset García Cabrera, Lic. José Carlos Rodríguez Tito, Dr. Alberto Cutié Bressler.
Institución: Centro de Toxicologia y Biomedicina. Autopista Nacional Km 1 ½. Apdo Postal 4033, CP:
90400. Santiago de Cuba. Cuba. [email protected]
Resumen: El consumo de drogas ha sido, es, y lamentablemente seguirá siendo uno de los problemas más
acuciantes que la sociedad actual tiene planteados. Nuestro país se ha sumado a la lucha mundial contra este
flagelo, llevando a cabo labores de prevención y atención a la drogodependencia, donde nuestra provincia se
ha insertado con la apertura de un Servicio de Deshabituación en el Hospital Clínico Quirúrgico GinecoObstétrico General Santiago. Un total de 160 pacientes bajo tratamiento en este Servicio fueron evaluados en
el Centro de Toxicología y Biomedicina, en el período de enero del 2001 a mayo del 2002, donde se
identificaron las sustancias o grupos de ellas, que con mayor frecuencia fueron consumidas por estos
pacientes y se monitoreó el comportamiento de parámetros bioquímicos y cardiovasculares. El Alcohol (99
%) y la Marihuana (65 %) fueron las sustancias que más se utilizaron. Las enzimas hepáticas Aspartato
aminotransferasa (62.5 %) y Fosfatasa alcalina (55 %), fueron las más afectadas, así como los metabolitos
Proteína (45 %) y Glucosa (35 %). Desde el punto de vista cardiovascular, la Hipotensión Arterial (32.5 %),
la Alteración de la Frecuencia Cardíaca (17.5 %) y el Trastorno de la Conducción (15 %) fueron las
afectaciones más prominentes. Estos resultados ameritan profundizar en el conocimiento de las drogas de
abuso, y dirigir principalmente los esfuerzos, del personal médico y paramédico, hacia la prevención,
diagnóstico precoz, tratamiento y rehabilitación de la drogodependencia.
Introducción: En los albores del siglo XXI, el fenómeno drogas se califica como uno de los más graves
problemas de la humanidad, uno de sus principales retos, una preocupación común. Aunque en Cuba este
flagelo no es expresión, ni reflejo del modo de vida de la población, en los últimos años ha comenzado a
manifestarse progresivamente, debido fundamentalmente al auge de las relaciones internacionales y el
turismo, así como la situación económica del país. Es por estas razones que el Ministerio de Salud Pública ha
llevado a cabo en toda la Isla un Programa Nacional Integral de Prevención del uso Indebido de Drogas 1, en
el cual nuestra provincia se ha insertado elaborando el Programa para la Prevención del Uso Indebido de
Droga y Atención al Drogodependiente 2. Atendiendo a los objetivos de ambos programas se pone en marcha
un Servicio de Deshabituación en el Hospital Clínico Quirúrgico Gineco-Obstétrico General Santiago, el cual
en colaboración con el Centro de Toxicología y Biomedicina (TOXIMED) se encarga del tratamiento de
pacientes drogodependientes y debido a las particularidades del mismo en la provincia, se estudian los
posibles efectos que tienen estas sustancias en el organismo. Por estas razones realizamos el presente estudio
trazándonos los siguientes objetivos:
1. Identificar sustancias o grupos de sustancias que con mayor frecuencia son utilizadas por pacientes
drogodependientes que acudan al Servicio de Deshabituación del Hospital Clínico Quirúrgico Ginecoobstétrico General Santiago.
2. Determinar las posibles variaciones en el comportamiento de parámetros
bioquímicos, en pacientes
drogodependientes.
3. Caracterizar las posibles variaciones en el Electrocardiograma de pacientes drogodependientes.
Materiales y Métodos: Se realizó un estudio descriptivo-transversal, donde el universo de trabajo
correspondió con la muestra de 160 pacientes drogodependientes que acudieron al Servicio de
Deshabituación del Hospital Clínico Quirúrgico Gineco-Obstétrico General Santiago en el período
comprendido entre enero del 2001 y mayo del 2002. Los pacientes fueron remitidos inmediatamente al
Centro de Toxicología y Biomedicina, donde fueron realizados los estudios analíticos toxicológicos en orina,
para la identificación de las sustancias de consumo, los cuales se realizaron por Cromatografía de Capa Fina
(Silica Gel G60) en el caso de los medicamentos Barbitúricos, Benzodiazepinas, Anfetaminas, Trihexifenidilo
y por tira reactiva ACCUSTRIP para las drogas ilegales: cocaína, marihuana y opiáceos 3. A continuación se
realizaron los estudios bioquímicos en sangre: Hemoglobina (Método de Drabkin), Conteo Global y
Diferencial de Leucocitos, Glucosa (Método de Glucosa Oxidasa), Proteínas (Método de Biuret), Colesterol
total (Método de Pearson), Urea (Método de Berthelot), Alanin aminotransferasa ALAT y Aspartato
aminotransferasa ASAT (Método de Frankel y Reitman), Fosfatasa Alcalina (Método de Bessey), Amilasa
(Método de Smith-Roe-Ugolev) y Colinesterasa (Método de La Huerga) 4. Finalmente, se procedió al
Examen Clínico Cardiovascular y a la realización del Electrocardiograma.
Los resultados se procesaron con ayuda del paquete estadístico Statistica for Windows, versión 4.3, de tal
manera que permitieron obtener Estadígrafos como la Media, Desviación Estándar y Coeficiente de
Variación; determinándose además el porcentaje (%) de pacientes por cada variable, cuyos valores se
encontraron fuera de los límites normales registrados para cada una de las pruebas.
Resultados y Discusión: En los pacientes estudiados en este periodo se identificaron un total de 11
sustancias (Tabla I), donde predominó el consumo de alcohol (99 %), droga lícita de fácil adquisición y
amplia aceptación social, la cual ha resultado en la gran mayoría de los casos la droga portera hacia otras
sustancias tal es el caso de la marihuana (65 %), cuyo cultivo en zonas montañosas del territorio y recalo en
las costas cubanas ha contribuido a incrementar su uso. La poca disponibilidad de drogas ilícitas y el alto
costo que presentan algunas, así como el control de las drogas psicotrópicas en el país, hacen que se
favorezca la exploración de otras modalidades de consumo con la utilización medicamentos lícitos lo que
genera, y se demuestra de forma general en el estudio, la presencia de poliadicciones a los psicofármacos
(trihexifenidilo, fenobarbital, diazepam, amitriptilina, nitrazepam, meprobamato) los cuales se consumen
preferentemente mezclados con el alcohol. En este sentido el farmacéutico debe jugar un papel fundamental
para evitar el desvío y uso indebido de estos medicamentos, lo cual puede afectar el bienestar y la armonía de
su comunidad, haciéndose cada vez más necesaria la labor educativa de la población, en cuanto a las
consecuencias del consumo indiscriminado de estos medicamentos. Por último, a pesar de su alto costo, se
destaca el consumo de cocaína en sus dos modalidades inhalable y fumable (crack).
Tabla I. Sustancias identificadas en pacientes drogodependientes.
AlcoholMarih.TrihexifDiazepFenobCrackCoca
InhAmitripNirazepBenadrilNo.
Pacientes1581047770615134202014%9965484438322114149Marih: marihuana, Trihexif: trihexifenidilo,
Diazep: diazepam, Fenob: fenobarbital, Crack: cocaína fumable, Coca Inh: cocaína inhalable, Amitrip:
amitriptilina, Nitrazep: nitrazepam, Benadril: benadrilina.
Los resultados del estudio bioquímico (Tabla II) reflejan alteraciones fundamentalmente en las enzimas
hepáticas Aspartato (ASAT 62.5 %) y Alanin (ALAT) aminotransferasas, así como la Fosfatasa alcalina (55
%), dado por la hepatotoxicidad de estas sustancias, en especial el alcohol y la cocaína, reportándose en
pacientes alcohólicos incrementos de los niveles de ASAT por encima de la ALAT 5. En el caso de Fosfatasa
alcalina, mayoritariamente sus valores fueron disminuidos, lo cual junto a la disminución en la síntesis de
proteína (45 %), muestran una tendencia a la desnutrición proteica del drogodependiente 6. A esto se suma la
hipoglicemia (35 %) y la anemia (13 %). También es de destacar la disminución de los leucocitos (32 %) en
estos pacientes, de ellos los Neutrófilos y los Linfocitos 7, lo cual trae aparejado una alteración del Sistema
Inmune, que propicia en estos pacientes la aparición frecuentes de enfermedades infecciosas.
Tabla II. Alteraciones bioquímicas y cardiovasculares en pacientes drogodependientes.
ASATALATFAAmilChEProt.Gluc.Col.Hb.Leuc.T.A.T.F.C.T.C.No.
pacientes10124783207256422151642824%63155520045352613324017.515ASAT: Alanin transaminasa,
ALAT: Alanin transaminasa, FA: Fosfatasa Alcalina, Amil: Amilasa, ChE: Colinesterasa, Prot: Proteínas
totales, Gluc: Glucosa, Col: Colesterol, Hb: Hemoglobina, Leuc: Leucocitos totales. TA: Tensión arterial,
TFC: Trastornos de la frecuencia cardíaca, TC: Trastornos de la conducción.
Las principales alteraciones cardiovasculares encontradas aparecen en la Tabla II, donde se destaca en primer
lugar el comportamiento de la Tensión Arterial (40 %), medida a través del Examen Clínico Cardiovascular.
En este caso se destacan 52 casos de Hipotensión Arterial (32.5 %), que deben estar asociados al alto
consumo de drogas depresoras del Sistema Nervioso Central 8, además se observaron 24 casos de
hipertensión (7.5 %) que se reportan fundamentalmente en pacientes consumidores de cocaína 9. Las
restantes alteraciones observadas están en relación con modificaciones de la Frecuencia Cardíaca,
específicamente Bradicardia (17.5 %), así como Trastornos de Conducción Intraventricular (15 %), dentro de
ellos los trastornos de Repolarización Ventricular y Bloqueos Ventriculares de Rama Derecha, debe
destacarse que estos bloqueos encontrados no se acompañan de alteraciones acústicas (Soplos), percibidos a
través de la auscultación de los pacientes estudiados.
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INFLUENCIA DEL TIEMPO DE ISQUEMIA SOBRE EL BALANCE REDOX EN UN MODELO DE
ISQUEMIA PARCIAL HEPATICA EN RATAS
M.C. Niurka Pons Rodríguez, Michel Batista Carvajal, Dr. Nelson Merino García, Dra. Olga Sonia León
Fernández.
Centro de Investigaciones y Evaluaciones Bilógicas, Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de la
Habana.
Resumen
En el presente trabajo se realizó un estudio sobre la influencia que ejercen diferentes tiempos de isquemia sobre
algunos parámetros indicadores del balance redox utilizando para ello un modelo de isquemia parcial hepática en
ratas. Se seleccionaron tiempos de isquemia de 30, 60 y 90 min y se utilizó un grupo control no sometido a
isquemia. Se obtuvieron homogenados del lóbulo hepático isquémico para la determinación de los niveles de
peróxidos orgánicos totales, niveles de malonildialdehído (MDA)
y actividad enzimática de catalasa. Se
obtuvieron además muestras de suero sanguíneo para determinar la actividad de aspartato amino transferasa
(ASAT) y se realizó un estudio histológico del lóbulo isquémico.Los resultados obtenidos muestran que en los
grupos sometidos a isquemia por 60 y 90 min se produjo un incremento de las concentraciones de peróxidos
orgánicos totales y de MDA respecto al grupo control. Por el contrario, los niveles de actividad de la catalasa se
mantuvieron invariables en todos los grupos experimentales. Desde el punto de vista histológico solo se
produjeron algunas modificaciones estructurales moderadas en los grupos sometidos a isquemia de 60 y 90 min,
no encontrándose signos de necrosis en ningún caso. Los niveles de ASAT para todos los grupos fueron similares
al del control.
Introducción
Los procesos de isquemia y reperfusión constituyen un proceder quirúrgico inevitable en el trasplante de órganos
y la cirugía cardiopulmonar en general. El daño por isquemia / reperfusión es multifactorial y dentro de los
factores de mayor relevancia se encuentran las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) (1). Sin embargo, todavía
no se han esclarecido completamente los mecanismos moleculares de producción del estrés oxidativo ni el curso
temporal de estos fenómenos. En la isquemia / reperfusión se produce una primera etapa de daño por isquemia y
una segunda por reperfusión.. En el daño por isquemia, la disminución del flujo sanguíneo provoca un proceso de
hipoxia que afecta la fosforilación oxidativa en la mitocondria con la consiguiente reducción de los niveles de
ATP. Se ha reportado que la severidad del estrés oxidativo y el daño celular durante la reperfusión dependen del
tiempo de isquemia (2), sugiriéndose que la interrupción del flujo sanguíneo por un período de 60 min. ocasiona
daños celulares reversibles y que el punto de no retorno celular para los hepatocitos se produce con tiempos de
isquemia de 90 min (3).El presente trabajo se propone determinar de manera preliminar la influencia que ejerce el
tiempo de isquemia sobre el comportamiento de algunos parámetros asociados al estrés oxidativo en un modelo de
isquemia parcial hepática en ratas.
Materiales y Métodos
Se utilizaron ratas Sprague-Dawley (300g – 350g), procedentes de CENPALAB, las que se mantuvieron en
cuarentena por 7 días. Se dividieron aleatoriamente en 4 grupos, uno de ellos correspondiente al control (no
sometido a isquemia) y el resto sometidos a tiempos de interrupción del flujo sanguíneo de 30, 60 y 90 min. Se
utilizó un modelo de isquemia parcial del lóbulo hepático derecho, según la técnica descrita por Peralta y col. (4).
Como indicador del daño hepático se determinaron los niveles séricos de ASAT utilizando un kit de laboratorio
comercial. Se realizó además un estudio histológico utilizando la tinción con hematoxilina- eosina. Para los
estudios bioquímicos se obtuvieron homogenados del lóbulo hepático derecho utilizando solución amortiguadora
KCL-Histidina pH 7.4. Se determinaron las concentraciones de peróxidos orgánicos totales mediante una técnica
espectrofotométrica utilizando xilenol naranja. Como indicador de la peroxidación lipídica se determinaron los
niveles de MDA según la técnica reportada por Esterbauer y Cheeseman en 1990 (5). La actividad de catalasa fue
determinada por seguimiento de la variación de la densidad óptica por descomposición del H2O2. En todas las
muestras se determinó la concentración total de proteínas utilizando azul de Coomasie. Los cálculos se realizaron
utilizando una curva patrón con BSA.
Procesamiento estadístico: Se calculó la media y la desviación estandar de cada grupo. Se realizó un análisis de
varianza (ANOVA) y posteriormente se aplicó el test de Levene. Se compararon los grupos utilizando el test de
Duncan y el de U-Man-Whitney.
Resultados
La medición de los niveles de ASAT sérica no mostró diferencias significativas entre los grupos. La actividad
para el grupo control fue de 89 ± 28 U/L. A los 30 min de isquemia la actividad de ASAT era de 65±30 U/L,
mientras que a los 60 y 90 min. de isquemia los valores encontrados fueron de 63±33 U/L y 66±37 U/L
respectivamente. Los resultados se obtuvieron utilizando una n=6. Desde el punto de vista histológico, solamente
se apreciaron daños moderados para los tiempos de 60 y 90 min. de isquemia, no encontrándose signos de
necrosis en ningún caso. Las principales manifestaciones de daño encontradas fueron lipidosis microvesicular,
edema y hemorragia sinusoidal. La determinación de peróxidos orgánicos totales mostró un incremento de los
mismos a partir de los 30 min. de isquemia, manteniéndose esta situación para el resto de los tiempos estudiados
(fig. 1). Por otra parte, se encontró que los niveles de MDA se encontraban significativamente elevados para los
grupos correspondientes a los 60 y 90 min. de isquemia (fig.2)
M.D.A
Peróxidos Orgánicos Totales
Concent. de peróxidos
250
*
200
*
150
100
*
50
0
0
30
60
90
Tiempos de Isquemia (minutos)
(µmol/mg.proteínas)
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
30
60
90
Tiempos de Isquemia (minutos)
*
Concent. de peróxidos
(µmol/mg.proteínas)
*
fig. 1. Niveles de peróxidos orgánicos totales en dife- fig. 2. Niveles de M.D.A en diferentes tiempos de
rentes tiempos de isquemia.
isquemia.
• Las barras representan la media ± la desviación estándar de 6 determinaciones. * p<0.05
La actividad enzimática de la catalasa se mantuvo al nivel del control en todos los grupos sometidos al proceso
isquémico. En el grupo sin isquemia la actividad de la enzima fue de 38 ± 13. En los restantes grupos los valores
fueron de 40 ± 10, 50 ±28 y 44 ± 20 para los tiempos de 30, 60 y 90 min. respectivamente. La actividad
enzimática fue expresada en u/g proteínas.
Discusión
Los resultados presentados brindan algunos elementos que apoyan el criterio de otros autores de que el tiempo de
isquemia influye en la magnitud de los daños que se manifiestan durante la reperfusión. En este trabajo las
alteraciones histológicas encontradas fueron moderadas. Los cambios estructurales comienzan a hacerse evidentes
a partir de los 60 min. de isquemia y no se encontraron signos de necrosis. Por otra parte, los resultados
encontrados con los niveles de ASAT corroboran que al menos hasta los 90 min. no se producen cambios
importantes de la integridad celular. Sin embargo, desde el punto de vista bioquímico sí se aprecian algunos
cambios tempranos. Se pudo apreciar que ya a los 30 min. se produjo un incremento significativo de los niveles de
peróxidos orgánicos y a partir de los 60 min. en el nivel de MDA. Estos resultados indican que ya a los 60 min. de
interrumpirse el flujo sanguíneo se comienzan a manifestar alteraciones en el estado redox del órgano.
La catalasa fue medida como un indicador de las defensas antioxidantes del órgano. No se apreciaron cambios
significativos en la actividad de la misma lo cual sugiere que los niveles de H2O2 no se han elevado, o al menos,
no lo suficiente para activar a dicha enzima. Hubiera sido necesario determinar la actividad de la glutatión
peroxidasa que es capaz de activarse a menores concentraciones de H2O2 que la catalasa.
Con este trabajo se concluye que durante la isquemia los cambios bioquímicos se manifiestan más rápidamente
que los estructurales. Por otra parte, el tiempo de isquemia influye en el comportamiento bioquímico e
histológico, siendo las alteraciones más numerosas en la medida que se incrementa el mismo. Deben ser
estudiados tiempos superiores a los 90 min. y otros parámetros asociados con el balance redox.
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malonaldehyde and 4- hydroxynonenal. Meth. Enzymol., 186: 407-421.
DETERMINACION DE LA TOXICIDAD AGUDA (VIA ORAL) A UN NUEVO PRODUCTO SINTETICO
CON ACTIVIDAD FARMACOLOGICA DEMOSTRADA.
Autores:
MSc. Mirta Morales Díaz∗, Dr. Remigio Cortés Rodríguez∗∗, Dr. Omar Prieto García∗∗∗, Dr Orel Pérez García∗∗∗∗
∗Dpto de Farmacia.Universidad Central de Las Villas, ∗∗Centro de Bioactivos Químicos Universidad Central de Las
Villas, ∗∗∗ Dpto de Química. Universidad Central de Las Villas, ∗∗∗∗ Investigador de Tasajeras.
Resumen:
Se determinó la toxicidad aguda vía oral a un nuevo producto con actividad farmacológica demostrada llamado
DERMASEL. Se emplearon ratones OF1 , conformándose 8 grupos de 10 animales , administrándoseles las dosis de :
700,1050,2362,3543 y 5314 mg/kg de peso. La formulación utilizada se preparó en forma de suspensión conteniendo
el principio activo, goma tragacanto y agua . La determinación de la DL50 se efectuó por el método de LitchfieldWilcoxon . Como resultado se obtuvo una disminución marcada de peso corporal en los grupos de mayores dosis
hasta el quinto día, con una recuperación posterior. La mortalidad muestra un efecto retardado y dosis dependiente. El
producto resultó no clasificado según la OECD con una DL50 de 2028.433mg/kg de peso.
Introduccion:
Teniendo en cuenta las múltiples aplicaciones reportadas para los silicatos en nuestro país en los servicios de
ginecobstetricia y clínico–quirúrgicos1,en la prevención y tratamiento del pie de atleta2,como antibacteriano en la cura
de enfermedades bucales y heridas infectadas3, en nuestro grupo de investigación fue sintetizado un producto de base
silícica, hasta el momento no reportado en la literatura denominado DERMASEL4, que ha demostrado poseer muy
buena actividad como cicatrizante y antibacteriano, por lo que se decidió comenzar su estudio toxicológico
Materales y Métodos:
Se emplearon 120 ratones de la línea OF1, hembras y machos, con masa corporal entre 20 y 30 gramos de 2 meses de
edad, marcados mediante ponche en la oreja y mantenidos en cajas T2 de policarbonato. Como encamado se empleó
viruta de caña deshidratada y esterilizada. Los animales se distribuyeron de forma aleatoria en gupos de 5 por sexo en
cada caja. La alimentación consistió en pienso para ratones. Tanto el pienso como el agua se administraron ad libitum.
Inicialmente se realizó un tanteo de las dosis a aplicar, para el que se utilizaron 40 animales, 20 hembras y 20machos,
determinándose la DL0 y la DL100 para cada sexo, al no existir diferencias para las mismas entre los dos sexos, se
determinó la DL50 utilizando solamente animales machos. Las dosis a aplicar se selaccionaron aplicando un factor de
progresión gueométrica (1.5)entre la DL0 y DL100. De los animales en cuarentena se seleccionaron 80 machos de forma
aleatoria y se distribuyeron en 8 grupos de 10 animales cada uno, ubicando 5 por caja, administrandoles las dosis de:
700,1050, 1575,2362,3543 y 5314mg/kg de peso corporal, respectivamente a los grupos 1al 6, los grupos 7 y 8 se
mantuvieron como control de vehículo y control no tratado. Tres horas antes de la administración se retiraron los
alimentos. Las inspecciones clínicas se efectuaron durante las próximas 24 horas y luego se continuó con una
observación diaria hasta el día 14, cada animal se pesó el día en que se ralizó la administración y luego en días
alternos. Los animales que sobrevivieron se sacrificaron por dislocación cervical, realizándoseles la necropsia
conjuntamente con los que murieron durante el experimento para observar alteraciones macroscópicas en los pricipales
órganos (Estómago,Intestino,Hígado,Riñón,Ecéfalo).
La formulación a utilizar en el estudio de toxicidad aguda se preparó en forma de suspención conteniendo el principio
activo, goma tragacanto, y agua. Las dosis aplicadas se obtuvieron a partir de suspenciones de concentraciones
constantes y después de una agitación vigorosa durante 2 minutos. Para la administración se utilizó una jeriguilla de
insulina de 0.3mm de diámetro. La estabilidad se garantizó preparando la misma "in situ"y administrando
inmediatamente después. La determinación del valor de la DL50 se efectuó por el método de Litchfiel-Wilcoxon
computarizado usando Microsoft Excel para Windows 95. Posteriormente se clasifica el producto según la OECD.
Resultados y discusión:
Los signos tóxicos observados con posterioridad a la administración oral de los 6 niveles de dosis muestran que en los
siete días siguientes a la administración, los animalaes presentaron síntomas de depresión evidenciado por la
disminución de la actividad motora y la cabeza caída. Se presentaron además algunos casos de piloerección.
El resultado del peso corporal se muestra en la figura1. Del análisis de la misma se evidencia una disminución menor
del 10% de este parámetro para los gupos 1,2,3 y 4, hasta los días 5 y 8 posteriores a la aplicación.
Figura 1. Determinación de la masa corporal durante el estudio a dosis única por vía oral.
2 6
Los grupos que mostraron mayores afectaciones de peso fueron
2 4
el 5 y 6, con una disminución hasta el quinto día de 11.4% y
(g )
2 2
26% respectivamente. A partir del quinto y octavo día
2 0
comienza el proceso de recuperación de los animales que
p e s o
1 8
G
G
G
G
G
G
C
C
1 6
1 4
1 2
r
r
r
r
r
r
o
o
u
u
u
u
u
u
n
n
p
p
p
p
p
p
t
t
o
1
o
2
o
3
o
4
o
5
o
6
r o l
r o l
sobreviven al experimento, caracterizado por el incremento de
peso y desaparición de los síntomas tóxicos.
v e h í c u l o
n o
t r a t a d o
1 0
0
2
4
6
t ie m p o
8
1 0
(d ía s )
1 2
1 4
1 6
La mortalidad se comportó como sigue: Durante los tres días
siguientes a la administración no ocurrió ninguna muerte, todas
ocurrieron entre los días 4 y 7 con un máximo de muertes en el día 5, para un 41.9% del total de muertes ocurridas.
Los grupos de dosis más elevadas manifestaron las muertes los días 4 y 5, mientras que el resto de los grupos de dosis
más bajas estas ocurrieron fundamentalmente en los días 6 y 7. El análisis de la mortalidad presentada muestra la
existencia de un efecto retardado para dicho producto, puesto de manifiesto entre los días 4 y 7, su análisis por grupos
mostró un incremento de la misma con la dosis, lo que sugiere un efecto dosis dependiente.
Teniendo en cuenta algunas de las características físico químicas del producto en estudio podemos argumentar mejor
los resultados expuestos. Es importante señalar que el DERMASEL es un polvo muy cohesivo que posee una elevada
tendencia a formar bóvedas lo cual justifica su mala fluidez y su significativa compresibilidad, esto nos induce a
pensar que el silicato objeto de estudio al adherirse a la mucosa gastroitestinal forme acúmulos. Esto nos permite dar
explicación a la disminución de la masa corporal hasta aproximadamente el quinto día posterior a la administración ya
que al adherirse el producto a las paredes gastrointestinales provoca una disminución de la absorción de los nutrientes
y electrolitos, llegando incluso en los casos de las dosis más elevadas, a ser tal la depauperación de los animales que
muchos de ellos mueren a partir del cuarto día de haber sido administrados.
En apoyo a lo planteada estan los resultados obtenidos por varios autores que han demostrado que algunos
aluminosilicatos se adsorven en las paredes del tracto gastrointestinal, interfiriendo en la absorción a través del mismo
e incluso en la absorción de otras sustancias administradas al mismo tiempo5,6. El efecto tóxico que ejerce el producto
sobre el tracto gastrointestinal se comprobó mediante necropsia de los animales que murieron durante la experiencia,
resultados similares fueron obtenidos por otros autores en sus trabajos con silicatos de aluminio y magnesio. La
recuperación paulatina expresada por la ganancia de la masa corporal y la desaparición de los signos tóxicos de
aquellos animalaes que sobreviven al experimento es explicada por la eliminación progresiva del producto del tracto
gastrointestinal, lo que va posibilitando la absorción de nutrientes y agua.
Figura 2 . Determinación de la DL50 para el producto DERMASEL administrado por vía oral.
Probit = 2.35 + 0.0013·
Dosis
r = 0.9465
÷2 = 0.3522
p = 0.161
DL50= 2038.433
1328.13<DL50<3459.914
1 2
1 0
P ro b it
8
6
4
Al hacer un análisis anatomopatológico de los animales
2
que sobrevivieron se comprobó la presencia de restos del
0
0
1 0 0 0
2 0 0 0
D o s is
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
(m g /k g )
compuesto en forma de pequeños grumos en el tracto
gastrointestinal (estómago, intestino).
En los animales que murieron, se observó un mayor cubrimiento de las paredes de estos órganos por los grumos del
compuesto. El resto de los órganos analizados (hígado, riñón, encéfalo), no presentaron alteraciones macroscópicas.
Los resultados obtenidos nos permiten de forma preliminar plantear que es el tracto gastrintestinal el órgano que
mayor número de efectos negativos manifiesta.
El procesamiento de los resultados dio un valor para la DL50 de 2038.433mg/kg de peso corporal (1328.13<DL50 <
3459.91).Teniendo en cuenta este resultado el producto es catalogado como no clasificado , siguiendo las normativas
de la OECD, según Loomis se clasifica como ligeramente tóxico.
Conclusiones
La DL50 para el principio activo de base silícica (DERMASEL ) administrado por vía oral a ratas Sprague Dawley es
2038.433mg/kg de peso corporal con intervalos de (1328.13<DL50 < 3459.91), resultando no clasificado según las
normativas de la OECD.
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6.Khalil S, Mortada L M. Shams em . Drug. Dev. Ind. Pharm. 13:547-563, 1997
EFECTO PROTECTOR DE LA SPIRULINA PLATENSIS EN EL DAÑO PULMONAR INDUCIDO
POR PARAQUAT.
Autores:
MsC Rosario Megret Despaigne.
Dra: María Antonia Torres Alemán.
Dr: Nelson Merino García.
Lic. Liliana Marquez Sierra
Lic.Felipe Rosete Rosete.
Instituciones:
•
Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biológicas(CIEB)
Instituto de Farmacia y Alimentos(IFAL)
Universidad de la Habana.
•
Dpto de Farmacia.
Facultad de Ciencias Naturales
Universidad de Oriente
Resumen
Se realizó el estudio del efecto protector de la Spirulina platensis en el daño pulmonar inducido por paraquat,
a través de un experimento donde se utilizaron 5 grupos experimentales: Control, Paraquat, Spirulina,
Spirulina + Paraquat y Vitamina E + Paraquat, los compuestos antioxidantes se administraron 7 días previo a
la aplicación del paraquat, al finalizar la investigación, se evaluaron los signos clínicos, la observación
macroscópicas y el estudio histopatológico de los pulmones, de todos los animales utilizados en el
experimento. Los resultados demostraron que la Spirulina platensis administrada por vía oral, disminuyó los
signos clínicos, las alteraciones macroscópicas y el daño celular pulmonar producido en este modelo de
toxicidad, sugiriendo que está microalga confiere una acción preventiva contra el daño oxidativo inducido por
paraquat.
Introducción:
El paraquat ha sido muy estudiado, desde el punto de vista de su toxicidad. El mecanismo de toxicidad de este
herbicida esta basado en la formación del radical bipiridilo y consecuentemente la Peroxidación Lipídica
(POL) y el daño celular; el mismo es tóxico a nivel pulmonar, hepático, renal y cardíaco, debiendo la muerte
a la asfixia causada por la progresiva y generalizada proliferación de fibrosis del tejido conectivo en los
alvéolos pulmonares, donde el tóxico se concentra selectivamente, desarrollándose esta reacción de 48 horas a
2 semanas posteriores a la ingestión1. Este herbicida es el causante del mayor número de fallecidos, en
intoxicaciones por plaguicidas en nuestro país, datos que nos permiten conocer en que medida el paraquat
resulta altamente perjudicial para el hombre. 2
En aras de encontrar una sustancia que sea capaz de atenuar el efecto tóxico de este compuesto, se han
realizado estudios con sustancias antioxidantes como es el caso de la Vitamina E, la Vitamina C y N-Acetil
cisteína; de los cuales se han obtenido resultados clínicos y experimentales satisfactorios3..Por lo que nos
propusimos utilizar la Spirulina platensis, que contiene VIT.E, VIT. C, VIT. A, Ficocianina, enzima
superóxido dismutasa, entre otros compuestos, los cuales le confieren poderosa actividad antioxidante; para
evaluar el efecto protector de esta microalga en el daño pulmonar inducido por las Especies Reactivas de
Oxigeno(EROs), producidas por el paraquat.
Materiales y métodos.
Para este estudio experimental, se utilizaron ratas hembras Sprague Dawley, las cuales son tratadas con
Spirulina platensis al 10% en carboximetil celulosa 0.5%, a una dosis de 2g/kg durante 7 días vía oral y el
Paraquat es administrado en solución salina 40mg / kg vía intraperitoneal. Todos lo animales se mantuvieron
de acuerdo a las normas internacionales, para el cuidado de los animales de experimentación.
Grupos Experimentales.
•
Grupo 1. Control. Los animales de este grupo no recibieron tratamiento, los mismos se utilizaron como
patrón de comparación.
•
Grupo 2. Los animales de este grupo recibieron Paraquat en solución salina, con el objetivo de inducir el
pulmonar, se utilizó como grupo de toxicidad para compararlo con los restantes grupos.
•
Grupo 3. Recibieron Spirulina platensis 2g/Kg vía oral, durante 7 días.
•
Grupo 4. Recibieron Spirulina platensis 2g/Kg vía oral, durante 7 días y luego se administró Paraquat en
solución salina, 48 h después se realizó el sacrificio.
•
Grupo5. Recibieron vitamina E 50mg/Kg vía oral, como control de la actividad antioxidante, durante 7
días y luego se administró Paraquat en solución salina, 48h después se realizó el sacrificio.
Todos los animales se pesaron diariamente y se observaron los signos clínicos, luego de aplicar los
tratamientos correspondientes y por último se sacrificaron en ambiente de Eter etílico, se realizó el examen
macroscópico de los órganos, y la toma de muestra del pulmón para el estudio histopatológico por el método
de tinción con solución de hematosilina – eosina. Con observación al microscopio óptico.
Resultados y Discusión:
Durante el experimento, no se encontraron manifestaciones de toxicidad en los primeros 7 días de
pretratamiento con Sp y Vit E, en ninguno de los animales de estos grupos, una vez administrado el PQ
comenzaron a aparecer alteraciones en la función respiratoria, los grupos pretratados con Vit E, se
encontraban clínicamente más afectados con respecto a los pretratados con Spirulina platensis, destacándose
la mayor toxicidad en el grupo de PQ, lo que se corresponde con el estudio macroscópico, observándose una
disminución de los daños en los grupos pretratados con los compuestos antioxidantes utilizados, como se
observa en la tabla No. 1. Las lesiones histopatológicas que aparecieron en las muestras de pulmón de los
grupos tratados con paraquat, fueron: hemorragia alveolar y edema inflamatorio perivascular, aunque las
mismas disminuyeron en los grupos pretratados con los compuestos antioxidantes utilizados, este resultado
fue más significativo, para los animales previamente tratados con Spirulina platensis..
Tabla No. 1. Observaciones macroscópicas por grupos experimentales.
Grupos Experimentales.
Afectaciones macroscópicas.
Control
No se observaron daños macroscópico.
Paraquat
Pulmones completamente hemorrágicos..
Spirulina
No se observan daños clínicos a nivel
macroscópico.
Spirulina +PQ
Ligera congestión pulmonar.
Vit E+ PQ
Pulmones hemorrágicos, principalmente en 2
animales
Los resultados de las observaciones clínicas y las observaciones macroscópicas de los pulmones analizados
en los diferentes grupos experimentales, indican la toxicidad del PQ, apuntando al daño pulmonar4 .
El pretratamiento con Spirulina y en menor medida el pretratamiento con Vit. E, confieren una disminución
de la toxicidad inducida por PQ. Estos resultados están en correspondencia con otras investigaciones5 6,
donde se han utilizado compuestos naturales y sintéticos con actividad antioxidante para contrarrestar el estrés
oxidativo producido por el exceso de O2.- que produce este compuesto. Los resultados histopatológicos
describen las lesiones pulmonares producidas por el PQ, que son
característica en la toxicidad de este
herbicida, donde se explica la muerte celular y la alveolitis como consecuencia de la POL en los neumocitos
tipo I y II4. A diferencia de los grupos pretratados con Spirulina platensis donde el aumento de la actividad
antioxidante, contribuye en parte a elevar el sistema de defensa celular, lo que disminuye las lesiones
histopatológicas en este grupo, estos resultados indican un efecto atenuador en la toxicidad del paraquat, por
esta microalga,
Referencias Bibliográficas:
1.Torres M A. Estudio de los mecanismos radicalarios, asociados al daño hepático, inducido por Paraquat y
Amiodarona [tesis para optar por el grado de Doctor en Ciencias Farmacéuticas]. 1997.Universidad de la
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5.Melchiori D and et al . Potent protective effect of melatonin or in vivo Paraquat-induced oxidative damage
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6.Suntres Z E and et al. The pulmonary uptake of intravenously administered liposomal alfa tocoferol is
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Estudio de Clasificación Tóxica Aguda oral del alga Gracilaria cylindrica.
Autores: Lic. Virna Cepero Rivero*, MSc. Emilio Monteagudo Jiménez*, MSc. Daniel Cordovés Torres**,
Ing. Ramón Corona Martínez**, Dra. María Boffill Cárdenas*, Tec. Luis Díaz Costa*, Tec. Belkis Verdecía
Machado*, Tec. Ángel Mollineda Trujillo***
*
Unidad de Toxicología Experimental (UTEX). Instituto Superior de Ciencias Médicas de Villa Clara.
**
Facultad de Química y Farmacia. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.
***
Centro de Investigaciones Agropecuarias (CIAP). Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.
Introducción:
Los productos de origen marino, especialmente las algas, se utilizan ampliamente, tanto a nivel internacional
como en nuestro país, en la industria de los cosméticos, donde tienen una amplia demanda. Actualmente han
comenzado a introducirse en la industria médico – farmacéutica, debido al gran potencial farmacológico que
poseen1. Cuba, por ser una isla rodeada de mar, presenta una posición privilegiada en cuanto a la explotación
de este recurso2.
Como primer paso en la estimación del potencial tóxico de una sustancia está la toxicología aguda, referida
como el estudio cualicuantitativo de los fenómenos tóxicos y de su aparición en función del tiempo tras la
administración de una dosis única de la sustancia o de varias dosis fraccionadas en el transcurso de 24 horas3.
El test de Clasificación Tóxica Aguda o Método de las Clases fue adoptado en la Guía No. 423 de la OECD4
como alternativa a la prueba clásica aguda. El método se basa en evaluaciones biométricas5 con dosis fijas
separadas adecuadamente para permitir la clasificación tóxica de una sustancia según el Sistema Global
Armonizado y utiliza 90% menos de animales que los de LD506.
Objetivos:
•
Evaluar el potencial tóxico del extracto seco del alga Gracilaria cylindrica tras una exposición simple
por vía oral.
•
Clasificar este extracto de acuerdo a la metodología internacional establecida para este modelo.
Materiales y Métodos:
Se emplearon ratas Wistar, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio
(CENPALAB), de rango de peso comprendido entre 190 y 230 gramos, adultas, jóvenes y de ambos sexos, las
que fueron mantenidas en las siguientes condiciones ambientales: temperatura: 22±2 oC, humedad relativa:
40-70%, ciclo luz-oscuridad: 12 / 12 horas, intensidad luminosa: 200-250 Lux. Recibieron como alimento la
dieta peletizada estipulada para la especie, con el correspondiente certificado de calidad. Consumieron agua
de la pila apta para consumo humano. Se permitió libre acceso tanto al agua como a los alimentos.
Se utilizaron 6 animales distribuidos por sexo en 2 grupos de 3 animales, los que fueron alojados en cajas de
policarbonato, modelo T-3 de fondo de rejilla.
La sustancia de ensayo se preparó suspendiendo el alga seca, molinada y tamizada (tamaño de partícula
menor de 0.1 mm) en un vehículo acuoso con carboximetilcelulosa al 2%.
A las 4 horas de retirado el alimento se administró la sustancia de ensayo por vía oral mediante cánula
intragástrica 18G a dosis única de 2 000 mg/Kg utilizando un volumen de administración de 15 ml/Kg,
comenzando por las hembras. Al día siguiente se administraron
los machos siguiendo este mismo
procedimiento.
Los animales fueron observados de manera sistemática durante las primeras 24 horas postadministración y
con frecuencia diaria hasta el día 14 del experimento, las observaciones estuvieron dirigidas a la
determinación de: muerte, tiempo de ocurrencia de la muerte, signos y síntomas de toxicidad además de su
comienzo y duración. Posterior a lo cual fueron sacrificados bajo anestesia, realizándose un examen
anatomopatológico. El peso corporal se controló al inicio, séptimo día y final de experimento.
La clasificación final del producto se efectuó de acuerdo a los criterios establecidos por la OECD4.
Posteriormente se ensayó un nivel de dosis de 5 000 mg/Kg utilizándose un diseño experimental similar al
anterior. Para esto se preparó una suspensión de mayor concentración, administrándose un volumen de 15
ml/Kg, fraccionado en dos administraciones, con un intervalo de 4 horas entre ellas.
Resultados:
En el nivel de dosis de 2 000 mg/Kg, el ensayo culminó con un 100% de supervivencia. No se observaron
signos ni síntomas clínicos de toxicidad luego de la administración y los animales mostraron un
comportamiento normal durante todo el desarrollo del experimento.
El peso corporal, como índice de toxicidad, no mostró alteraciones, pues los animales ganaron peso dentro del
rango establecido como normal dentro de la curva de crecimiento de la especie y línea7.
El análisis anatomopatológico macroscópico no reveló alteraciones en los órganos y tejidos estudiados.
Las evidencias experimentales generadas permiten ubicar la LD50 de este producto por encima de 5 000
mg/Kg, lo que se corresponde con la clase
: no clasificado.
Cuando se ensayó el nivel de dosis de 5 000 mg/Kg solamente un animal murió. El resto de los animales
mostró un comportamiento y ganancia de peso normales, no observándose signos ni síntomas clínicos de
toxicidad.
Discusión:
Hasta nuestros días, para dar un criterio de toxicidad aguda era necesario emplear un gran numero de
animales, sin embargo, en los últimos años han surgido métodos alternativos que tienen como objetivo
reemplazar, reducir y refinar el número de animales8.
Es por esta razón que se ha empleado este método, que por demás está acorde con el tipo de compuesto a
evaluar, del cual se espera una baja toxicidad9,10, razón que permitió considerar el comienzo del estudio partir
de la dosis de 2 000 mg/Kg PV.
Con estos resultados, de acuerdo con la Guía 423 de la OECD, puede procederse a la clasificación del
extracto evaluado. No obstante, se decidió probar, con fines informativos (screenig), los efectos producidos
por una dosis de 5 000 mg/Kg ya que se prevé la aplicación de este producto como suplemento nutricional, lo
que pudiera implicar un uso de altas dosis del mismo.
Esto nos permitió también corroborar los resultados obtenidos con el primer nivel de dosis estudiado, que
están en correspondencia con los esperados para un producto de esta naturaleza.
Conclusiones:
•
La LD50 del alga Gracilaria cylindrica se encuentra por encima de los 5 000 mg/Kg y se ubica dentro de
la clase
de toxicidad aguda, considerándose como no clasificada.
Bibliografía:
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inmunomoduladora de la fracción polisacárida de origen marino PC-1. Rev Cubana Oncol
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Análisis de la eficiencia de la Ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el reajuste de dosis de
Aminoglucósidos en pacientes sin antecedentes patológicos de enfermedad renal diagnosticada.
Autor: MSc Zoe González Hernández.
DraSc. Yolanda Valdés Rodríguez.
DrSc. Luis Martín García.
Institución: Hospital Universitario “Arnaldo Milián Castro”.
Resumen: Se realizó un estudio experimental en el Hospital Universitario “Arnaldo Milián Castro”, de la
provincia Villa Clara, con el objetivo de analizar la eficiencia de la Ecuación de Cockcroft y Gault como
patrón para el reajuste de dosis de Aminoglucósidos en pacientes sin antecedentes patológicos de enfermedad
renal. Se demostró que cuando individualizamos dosis en pacientes según el Indice de Filtración Glomerular,
se puede obtener igual o mayor beneficio con menor costo, ya que la cantidad de medicamentos usadas es
menor, con un tiempo de mejoría menor también y una evolución clínica más satisfactoria. Asimismo se
comprobó que no existía vínculo entre el diagnóstico microbiológico y el diagnóstico presuntivo del médico,
provocando, por tanto, un uso irracional de medicamentos; se aprovechó en gran medida el sinergismo de
acción con otros antimicrobianos en los tratamientos impuestos a los pacientes.
Introducción: Bajo la hipótesis de que el empleo de la ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el
reajuste de dosis de Aminoglucósidos en pacientes sin daño renal previo o conocido tiene valor práctico en la
práctica diaria, decidimos realizar el presente trabajo con los objetivos:
General: Analizar la eficiencia de la Ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el reajuste de dosis de
Aminoglucósidos en pacientes sin antecedentes patológicos de enfermedad renal diagnosticada.
Específicos: -Valorar el sistema de dosificación utilizado por el personal médico, tomando como patrones el
Peso Corporal y la Tasa de Filtración Glomerular.
- Comparar el método de reajuste de dosis de Aminoglucósidos según la IFG con el regido por el
peso corporal mediante la aplicación un estudio Beneficio/Riesgo y Beneficio/Costo a cada uno de los grupos.
Material y Métodos: Se realizó un estudio experimental y prospectivo en el Hospital Universitario “Arnaldo
Milián Castro”, de la ciudad de Santa Clara, en el período comprendido entre enero y septiembre de 1997. Se
trabajó con 132 pacientes hospitalizados La muestra fue dividida en dos grupos pareados según los rangos de
Intensidad de Filtrado Glomerular que encierran los diferentes estadíos de deterioro renal, al primer grupo se
le administraron las dosis de Aminoglucósidos teniendo en cuenta el criterio médico y acorde al peso
corporal, al segundo se le reajustó la dosis de estos antimicrobianos usando como patrón el Indice de
Filtración Glomerular (IFG). Se extrajeron de las historias clínicas de los pacientes los datos necesarios para
el análisis de los objetivos trazados. A todos se les determinó la IFG según la ecuación de Cockcroft y Gault,
teniendo en cuenta también la edad, peso, sexo, creatinina sérica y factor de corrección:
IFG =
(140 − E ) * P
.
*Q
72 * CSC
A todos aquellos pacientes cuya IFG se comportó fuera del rango de 80-120 mL/min,
se les individualizó la dosis.
Luego se estableció un análisis comparativo entre ambos criterios de dosificación y entre los resultados
clínicos observados de los dos grupos de pacientes, para concluir en estudios Beneficio/Riesgo y
Beneficio/Costo de los tratamientos con Aminoglucósidos.
Análisis y Discusión de Resultados: En los dos grupos, el sexo masculino fue el más atendido con
Aminoglucósidos, con edades de más 60 años. Las patologías más comúnmente tratadas con
Aminoglucósidos correspondieron a Sepsis de Herida Quirúrgica (33.33 %) y Bronconeumonías Bacterianas
(80.30 %). Tales resultados concuerdan con lo demostrado por la literatura (1),(2),(3),(4). En ambas muestras
no se les realizaron cultivos microbiológicos antes de comenzar los tratamientos antimicrobianos en su mayor
porciento. Muchas veces se trabajó en base a la experiencia acumulada sobre los casos ingresados en el
hospital que padecieron iguales afecciones, por la demora que existía en obtener los resultados de los estudios
microbiológicos, que implicaba, de esperarse estos, un atraso en la rehabilitación de los pacientes. Los
gérmenes causales de las enfermedades tratadas con Aminoglucósidos en ambos grupos (los que se
estudiaron), se correspondieron con lo reportado por los autores consultados. Cuando analizamos las
combinaciones medicamentosas más frecuentes con Aminoglucósidos, detectamos que en ambos grupos se
hicieron combinaciones con Penicilinas en mayor cuantía, aprovechando el sinergismo de acción y para
aumentar el radio de acción antibacteriano. (5). Al primer grupo se le realizó un análisis de la dosificación de
Aminoglucósidos (Gráfica 1), según el criterio aplicado por el médico (peso corporal) y el que proponemos
(según IFG). De este análisis resultó que un porciento considerable estuvo sobredosificado y otro tanto
subdosificado según el peso corporal del paciente, lo que indica que no se aplicó para esta muestra un criterio
certero y único de dosificación, pudiendo provocar subsecuentes resistencias antimicrobianas o efectos
tóxicos, de ser las dosis menores o mayores, respectivamente que las estipuladas en la literatura (3), (6).
Cuando lo analizamos teniendo en cuenta la función renal detectamos que más de la mitad de este grupo se
encontraba sobredosificado si se consideraba tal sistema excretor, de lo que puede esperarse un incremento en
la probabilidad de aparición de los acostumbrados efectos indeseables que provocan estos Aminoglucósidos,
Según Peso Corporal
10
17
Sobredosificado
Bien dosificado
Subdosificado
39
Según IFG
7
2
Sobredosificado
Bien dosificado
Subdosificado
57
Cuando se realizó el estudio Beneficio/Riesgo se observó que en cada grupo el beneficio fue mayor que el
riesgo resultante, observándose mayor diferencia para el grupo reajustado (mayor cociente B/R), lo que
demuestra la eficacia de este método de individualización de dosis en nuestra muestra de estudio.
Tabla 1: Relación Beneficio/Riesgo de los grupos de tratamiento con Aminoglucósidos.
Tratamiento Grupo Reajustado
Kanamicina
Gentamicina
Amikacina
Tratamiento Grupo no Reajustado
Kanamicina
Media B/R
7.45
7.82
7.40
Desviación estándar
1.97
2.28
2.67
3.37
3.16
Gentamicina
Amikacina
5.50
5.14
3.39
3.62
Fuente: Historias Clínicas.
Al realizar un estudio Beneficio/Costo de cada tratamiento se observó que en el primer grupo, en el que se
dosificaron los pacientes por el peso corporal, se gastaron 132.05 pesos por concepto de antibióticos, en
relación al supuesto reajuste por la IFG, mientras que en el segundo se experimentó un ahorro global de
215.82 pesos respecto al método inicial, por lo tanto, pudimos demostrar, para ambos grupos, que al emplear
la Ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el reajuste de dosis de Aminoglucósidos, el costo de estos
tratamientos disminuye considerablemente, sin decremento de los beneficios clínicos que reporta.
Conclusiones:
•
El personal médico, generalmente, no sigue el criterio de dosificación según el peso corporal del
paciente, por lo que existe una elevada tendencia a la sub y sobredosificación de estos.
•
No se tiene en cuenta la Intensidad de Filtrado Glomerular como función del estado renal, sino los
valores de creatinina sérica solamente, descartando la influencia que ejercen la edad, el sexo y el peso de
los pacientes en el funcionamiento de este sistema excretor.
•
No se consideró en múltiples ocasiones el diagnóstico microbiológico emitido por el Laboratorio,
teniendo que recurrir a tratamientos empíricos que pueden o no resultar efectivos.
•
La Relación Beneficio/Riesgo se comportó a favor del primero en ambos grupos de tratamiento, siendo
mayor en el grupo en que se tuvo en cuenta el estado renal de los pacientes, lo que valida la eficacia del
método de reajuste de dosis según la ecuación de Cockcroft y Gault. Asimismo, cuando se dosificó según
el estado renal de los pacientes, se obtuvo un mayor beneficio con un menor costo.
Recomendaciones:
•
Tomar en cuenta los resultados del presente estudio en la práctica clínica diaria, en aras de incrementar la
calidad de la atención hospitalaria con un uso racional de medicamentos.
•
Profundizar en la determinación de concentraciones plasmáticas de los Aminoglucósidos cuando se
individualiza su dosis empleando la ecuación de Cockcroft y Gault.
Bibliografía:
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6.
Programa de Computación “Vademecum” (1998).
Ensayo de Toxicidad Aguda Oral del 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB) en conejos albinos
Nueva Zelanda.
Autores: Trapero. Y1, Mancebo A2, González Y2, Arteaga M2, Fuentes D2 ,González B2, Hernández Y2
Instituciones: Centro de Biofísica Médica1, Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio
CENPALAB2
Resumen
Se presentan los resultados de un estudio de toxicidad aguda oral en conejos albinos Nueva Zelanda del
producto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB). Este es un saborizante de amplio uso en bebidas y
alimentos, reportado como sustancia sintética flavorante admitida por la Food Chemical News Guides (1990).
Estudios preliminares reportan este producto como agente antisickling, por lo que puede ser, eficaz en el
tratamiento de la Drepanocitosis o Sicklemia. El objetivo del ensayo fue la evaluación a corto plazo, 14 días,
de la administración del (4H3MB). La sustancia se aplicó por vía oral, a 32 conejos de ambos sexos, previo
ayuno de 12 a 18 h y 3 niveles de dosis. Durante este período, los animales fueron observados diariamente
con el fin de determinar muerte o algún síntoma de toxicidad, y se determinó el peso corporal los días 0, 7 y
14 del ensayo. Se realizó la necropsia a todos los animales al finalizar el estudio con el objetivo de observar
lesiones macroscópicas. Los resultados mostraron la ausencia de signos clínicos en los niveles de dosis
tratados, al igual que en el grupo con vehículo , así como no se detectaron alteraciones macroscópicas,
inclinando a considerar la no toxicidad del (4H3MB) hacia los animales tratados. Sin embargo, se constataron
diferencias en el comportamiento del peso corporal en los diferentes grupos, demostrándose que, a pesar de la
variabilidad existente, el (4H3MB) fue capaz de alterar el comportamiento normal del peso corporal de los
animales tratados con las dosis Media y Alta.
1.
Introducción
El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB), de fórmula molecular C8H8O3, posee cristales en forma de
agujas finas de color blanco a amarillo pálido con olor agradable y sabor a vainilla es un saborizante de
amplio uso en bebidas y alimentos, el cual se reporta como sustancia sintética flavorante admitida por la Food
Chemical News Guides (1990). Conociendo el amplio uso de la Vainillina como flavorante y en busca de
nuevas perspectivas en la Industria Farmacéutica, se estudiaron los efectos de la misma en eritrocitos por
Abraham y colb. los cuales no encontraron cambios significativos en el contenido iónico y de agua de los
mismos incubados a concentraciones de Vainillina desde 1 hasta 10mM. Al valorar el potencial terapéutico de
la misma en el tratamiento de la Siklemia, argumentaron la posibilidad de hallar dosis efectivas en el rango de
1-4 g/día o valores inferiores a éstos.
2. Materiales y Métodos.
2.1 Sustancia de Ensayo.
El (4H3MB), producida por Panreac, NCI, España. Por sus características de baja solubilidad en sistemas
acuosos, se utilizó como solvente una solución de Carboximetilcelulosa (CMC) al 2 %. Se preparó una
solución madre de 20 mg/ml de (4H3MB), para su administración al grupo de Dosis Alta. Para los demás grupos
tratados, y a fin de minimizar las diferencias de volumen a administrar, se realizarán las diluciones
correspondientes de esta solución madre.
2.2 Animales
Se ejecutó con conejos Nueva Zelanda procedentes de la Colonia de Conejos del CENPALAB. Se utilizaron 32
conejos jóvenes adultos, 16 H y 16 M, de 1.5 a 2 Kg de peso corporal, de 12 semanas. Las hembras eran nulíparas
y no grávidas. Los animales se pesaron para su selección. Los animales se mantuvieron en condiciones
convencionales con temperatura de 24°C, humedad relativa de 78%, ciclo luz/oscuridad 12:12, agua y comida ad
libitum.
2.3 Dosificación y Administración.
Se utilizaron 4 grupos, cada uno compuesto por 8 animales, 4 H y 4 M. Los niveles de dosis fueron (1600,
1000, 400 mg/Kg de PC). Dado que la sustancia requiere el uso de un solvente específico, se estableció el
grupo control al cual se le administró el vehículo en similares condiciones a las utilizadas para el (4H3MB).
La sustancia se administró de forma fraccionada, en 24 horas, mediante intubación intragástrica, utilizando
una cánula curva metálica. A los animales se les retiró el alimento la noche anterior a la administración.
Luego de administrada la sustancia, se esperó 3 horas para reanudar el suministro de alimento.
2.4 Procedimiento Experimental
Los animales se mantuvieron en cuarentena durante 7 días. El período de observación fue de 14 días luego de la
administración. Los animales son observados diariamente para determinar muerte o síntoma de toxicidad, y se
determinó el peso corporal los días 0, 7 y 14. A los animales que murieron durante la prueba y a los que
sobrevivieron los 14 días, se les realizó la necropsia a fin de observar si existian lesiones macroscópicas.
2.5 Análisis estadístico.
El análisis estadístico se realizó con la ayuda del paquete estadístico SPSS 8.0 para Windows , tomando un nivel p
< 0.05 para la aceptación e interpretación de los resultados. La normalidad se determinó por el test de
Kolmogorov-Smirnov.
3. Resultados
Fueron encontrados muertos en los días 1 y 4, dos H , una del grupo dosis baja y una del de dosis alta. Ambos
fueron enviados al Dpto. de anatomía patológica. Todos los animales mostraron un comportamiento normal
para la especie, sin manifestar signos clínicos de toxicidad.
El peso corporal sufrió variaciones diferentes entre grupos. El análisis visual de los gráficos permite aseverar
que hubo afectación del PC de los animales. En las hembras los grupos Dosis Baja y Control mantuvieron un
crecimiento constante durante el ensayo. La media del grupo Dosis Media aumentó hacia el día 7, aunque un
animal disminuyó marcadamente. Entre los días 7 y 14 la media del grupo disminuyó, así como todos los
valores individuales. La media del grupo Dosis Alta disminuyó hacia el día 7, aunque es de señalar que de los
3 animales tomados para este análisis, únicamente un animal disminuyó de peso ostensiblemente. Entre los
días 7 y 14, dos aumentaron de peso en cambio, uno disminuyó. En general, entre los días 7 y 14 el valor de la
media aumentó. El análisis estadístico, arrojó diferencias significativas en las hembras entre los grupos Dosis
Alta y Dosis Media contra el resto de los grupos.
En los machos los grupos Dosis Baja y Control mantuvieron un crecimiento constante durante el ensayo. La
media del grupo Dosis Media aumentó hacia el día 7, aunque un animal disminuyó marcadamente. Entre los
días 7 y 14 la media del grupo disminuyó, así como todos los valores individuales, excepto uno que aumentó
ligeramente. La media del grupo Dosis Alta aumentó hacia el día 7, aunque es de señalar que un animal
disminuyó ostensiblemente. Entre los días 7 y 14, uno aumentó de peso ;el resto de los animales disminuyeron
de peso. En general, entre los días 7 y 14 el valor de la media disminuyó. El análisis estadístico arrojó que los
tres grupos tratados tuvieron diferencias significativas con el control vehículo.
Variaciones del peso corporal
machos
2.1
2.05
2
1.95
1.9
1.85
1.8
1.75
1.7
1.65
1.6
1.55
Media (g)
Media (g)
Variaciones del peso corporal
hembras
0
7
2.15
2.1
2.05
2
1.95
1.9
1.85
1.8
1.75
1.7
1.65
1.6
14
0
7
Día
control
dosis baja
14
Día
dosis media
dosis alta
control
dosis baja
dosis media
dosis alta
Fig1 y Fig2 . Comportamiento del peso corporal de los animales durante el ensayo.
Los animales que murieron fueron analizados macroscópicamente, detectándose en ambos la presencia de una
sustancia amarillenta en la cavidad toráxica, con pleuritis, pericarditis fibrinosa y hepatización pulmonar, por
lo que se concluyó que las muertes se debieron a deficiencias técnicas en la administración. En el resto de los
animales, sacrificados al final del ensayo, no se encontraron alteraciones anátomopatológicas atribuibles a la
sustancia de ensayo.
4. Discusión
En nuestro ensayo, la no presentación de signos clínicos en ninguna de las dosis ni en el grupo tratado con
vehículo, así como la no detección de alteraciones macroscópicas, inclina a considerar la no toxicidad del
(4H3MB). Esta consideración, sin embargo, queda contrarrestada por las diferencias surgidas en el
comportamiento del peso corporal en los diferentes grupos.
Los datos referentes al peso corporal poseen una gran sensibilidad para detectar alteraciones debidas a
químicos de baja toxicidad. La medición de este parámetro resultó de particular interés, ya que a pesar de la
variabilidad existente, queda firmemente demostrado que el (4H3MB), si fue capaz de alterar el
comportamiento normal del PC de los animales tratados con las dosis Media y Alta. Además, el uso de un
grupo tratado con el vehículo, que no presentó alteración alguna en ninguno de los parámetros, excluye la
posibilidad de que este ocasione las variaciones del peso corporal registrada en los grupos tratados.
La sustancia de ensayo no ocasiona, a ninguna dosis evaluada, alteraciones clínicas ni anatomopatológicas,
aunque si altera ostensiblemente, a las dosis de 1000 y 1600 mg/Kg, el crecimiento normal de los animales.
5. Bibliografía.
1.
2.
Abraham DJ et al. (1991) Vainillin, a potential agent for the treatment of Sickle Cell Anemia. Blood. Vol. 77.
No. 6 (March 15). pp 1334-1341.
Hayes , P. et al. Principios y métodos de toxicología, tercera edición Raven Press . New York. 1994.
3.
Reppeto, M. Toxicología fundamental. Segunda edición aumentada. Editor Científico médica. 1998.
4. Acute Oral Toxicity. OECD Guideline for testing of chemicals, 1987.
Toxicidad Aguda Oral del 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído en ratas Sprague Dawley.
Autores: Trapero. Y1, Arbesún. O2, García. M3
Instituciones: Centro de Biofísica Médica1, Centro de Toxicología y Biomedicina2 ,Lab. .Farmacéutico
Oriente 3.
Resumen
Se presentan los resultados del estudio de toxicidad aguda oral del producto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído
(4H3MB), requisito necesario para su evaluación preclínica. Estudios preliminares de carácter biológico y
químico – físico han indicado que este producto puede ser eficaz en el tratamiento de la Drepanocitosis o
Sicklemia, enfermedad genética para la cual hasta el momento no hay tratamiento efectivo en el mundo. Los
resultados muestran un bajo efecto lesivo asociado con los signos y síntomas, comportamiento normal en
cuánto a los parámetros bioquímicos y hematológicos analizados para los grupos experimentales, así como
incremento de peso entre los grupos tratados y el control, no encontrándose diferencias significativas entre
estos. La sustancia en estudio se incluye en la categoría de Sustancia sin clasificar en conformidad con lo
establecido por la organización para la Economía, Cooperación y Desarrollo (OECD) entidad regulatoria de la
Unión Europea. Esto es un índice de la baja toxicidad que presenta el producto por lo que hace a este, como
el idóneo para su evaluación como candidato a fármaco para esta enfermedad.
1. Introducción
El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB), es un aldehído aromático, posee cristales en forma de agujas
finas de color blanco a amarillo pálido con olor agradable y sabor a vainilla. Es un flavorante presente en los
alimentos, bebidas y tabacos.
Zaugg et al, reportaron la evaluación de 29 aldehídos con acción antisickling. En este estudio el (4H3MB),
muestra una moderada actividad antisickling in vitro . Debido a la alta prevalencia de la Sicklemia en
nuestro país. Desarrollamos algunos estudios para corroborar su actividad biológica y continuar con los
correspondientes a la parte pre clínica. Entre estos está el estudio de toxicidad oral aguda. Estos ensayos
comienzan evaluando las sustancias químicas que tienen un interés biológico y miden los efectos generales
sobre animales de experimentación en un periodo corto de tiempo a dosis única o a dosis repetida a pequeños
intervalos dentro 24 horas. Con el objetivo de determinar los síntomas correspondientes a la administración
del producto, su grado de letalidad y los efectos adversos para la salud humana atribuibles al mismo.
2. Materiales y Métodos.
2.1 Sustancia de Ensayo.
El (4H3MB), producida por Dallant, SA, España. La poca solubilidad en agua de la sustancia motivó que el
vehículo empleado fuera aceite de almendras refinado, Fravop, Alemania. Se preparó la solución a una
concentración de 36.36 mg/mL y 18.18 mg/mL, mezclando y agitando a una velocidad de 254 rpm,
llevándose a baño termostatado por espacio de 430 min a temperatura de 40°C. La solución resultó ser estable
a la temperatura de 22°C. Se utilizó la norma No. 401 Toxicidad Oral Aguda de la OECD, del año 1992.
2.2 Animales
60 ratas (30H y 30M) adultos jóvenes entre 42 y 50 días de la línea Sprague Dawley con procedencia:
División de roedores gnotobióticos, CENPALAB. El peso de las hembras 167.6-205.0gr y los machos 196.4232.8gr. las hembras nulíparas y no grávidas. Se utilizaron 6 grupos de 10 animales (5H,5M) cada uno.
Fueron distribuidos según muestreo aleatorio simple. Los animales se mantuvieron en condiciones
convencionales con temperatura de 22°C, humedad relativa de 55%, ciclo luz/oscuridad 12:12, agua y comida
ad libitum.
2.3 Dosificación y Administración.
Se utilizaron 5 niveles de dosis, diferenciados para producir un amplio rango de efectos tóxicos. El factor
geométrico empleado fue de 1.355, exigido por los métodos para el cálculo de la DL50. .
Los niveles de dosis fueron (2000, 1476,1089, 803 y 593 mg/Kg ). El (4H3MB) disuelto previamente en el
vehículo, fue administrado por vía oral utilizando para ello una sonda gástrica ¨Vygón¨ # 8 adaptada a una
jeringuilla plástica desechable de 5mL a razón de 1mL por cada 100gr de PC, por tratarse de una solución
oleosa. El grupo control recibió el vehículo a la misma temperatura.
2.4 Procedimiento Experimental
Los animales se mantuvieron en cuarentena durante 7 días. Las ratas fueron pesadas, marcadas y distribuidas
al azar 24 hora antes de iniciar el estudio. El pesaje se realizó al inicio de la cuarentena, a los 0,7 y 14 días.
Finalizado el proceso de administración comenzó la observación clínica de los signos y síntomas mas
representativos en intervalos de 2 horas: 1er día 6 observaciones, 2do día 3 observaciones, 3er día en adelante
una observación. Al concluir los 14 días se realizó toma de muestra de sangre por punción del seno
retroorbitario, previa anestesia de los animales con éter dietílico para determinaciones bioquímicas, se
sacrificaron los animales y se enviaron al Dpto. de Anatomía Patológica después de realizada la observación
clínica con el objetivo de realizar la observación microscópica de los órganos y sistemas. Se procedió a
prepararlos para su posterior análisis histopatológico.
2.5 Análisis estadístico.
Se utilizó el programa Statistical for Windows para estimar las variaciones de peso, a través de un análisis de
Varianza Multivariado (Bifactorial), utilizando como variables los pesos de los días 0,7 y 14 y como factores
el sexo y los niveles de dosis empleados, con un nivel de significación de un 5% (p<0.05)
3. Resultados
Dos horas después de la administración, se observa en todos los grupos experimentales somnolencia,
decremento de la actividad motora espontánea , disminución de los reflejos y diarrea. Los grupos de 2000,
1476 y 1089 mg/Kg presentaron además disnea, piloerección y catalepsia. Los grupos de 803 y 593 mg/kg
presentaron además balanceos, caída en posición lateral. Cuatro horas después los animales de todos los
grupos permanecían con todos los signos y síntomas de la 1ra observación, aunque se observó un aumento
apreciable en la consistencia de las heces. Seis horas después de la administración los animales continuaban
con los mismos signos y síntomas. Ocho horas después de la administración en el grupo control se observa
incremento de la actividad motora, respuesta a estímulos exteriores y mayor avidez por el agua y la comida.
En los grupos 2 000,1476, 1089mg/kg los animales continuaron en el mismo estado, se aprecia un ligero
aumento de la actividad motora, supresión de la disnea y baja respuesta a estímulos exteriores. Los grupos
803y 503 mg/kg se observa mayor avidez por el agua y la comida, mayor respuesta a estímulos exteriores y
en algunos animales se apreciaba somnolencia. En las otras observaciones persistía somnolencia y
piloerección, ya presentaban mayor respuesta a estímulos exteriores, avidez incrementada por el agua y la
comida, se observa de forma aislada acicalamiento y hábitos de aseo corporal normal. En el segundo día los
animales de los grupos control 1089, 803 y 593 poseían comportamiento y hábitos normales, los de los grupos
2000 y 1476 se comportaron de forma normal aunque se observó piloerección y agrupación en los extremos
de la caja. Del 3er día al 14 no se apreciaron signos ni síntomas de toxicidad, el comportamiento fue normal.
No hubo diferencia en el peso corporal de los animales. Los valores de las determinaciones bioquímicas
realizadas se observan en la siguiente tabla.
Tabla 1: Parámetros bioquímicos obtenidos en ratas.
Sexo
Grupos mg/kg
Proteínas
TGP
Creatinina
Conteo
totales
Hembras
Machos
2000
1476
1089
803
593
Control
2000
1476
1089
803
593
Control
62,5 ± 4,4
66,2 ±6,5
64.7 ±2,9
61,1 ±1,0
68,3 ± 0,8
60,7 ± 0,6
60,0 ± 2,3
58,6±2,6
60,9±3,7
59,1±1,5
63,4±2,5
60,2±3,0
global
21,0 ± 3,9
25,2 ± 4,5
29,9 ± 2,7
23,3 ± 7,2
23,3 ± 0,2
22,3 ± 5,1
28,6±2,8
29,1±2,0
22,3±5,3
26,2±3,7
26,1±0,5
27,7±3,7
67,6 ± 4,0
70,3 ± 1,5
65,1 ±3,0
62,8 ± 1,2
63,5 ± 3,7
66,4 ± 3,0
55,6 ±8,9
57,8±0,8
46,8±1,9
55,5±2,8
54,8±2,9
54,7±2,0
7,4 ± 3,9
9,4 ± 2,2
9,3 ±1,3
9,3 ± 2,8
5,7 ± 0.8
10,3 ± 2,7
10,7±0,5
10,6±3,9
11,4±2,1
8,5±1,3
9,3±1,7
8,9±2,3
Conteo diferencial
Monocitos
Linfocitos
Neutrofilos
2,0 ± 1,0
4,7 ± 1,1
2,0 ± 0,9
4,3 ± 1,6
3,0 ± 1,1
2,3 ± 1,7
3,3±2,5
3,7±2,1
2,0±1,0
3,3±1,1
2,7±0,6
2,0±1,7
75,0 ± 2,0
64,7 ± 1,5
81,0 ± 2,0
78,3 ± 3,2
79,7 ± 2,1
75,0 ± 2,0
76,0±2,6
68,7±7,2
78,3±0,6
77,0±3,6
78,7±4,0
76,3±5,0
6,7 ± 5,0
5,0 ± 2,0
16,0 ± 5,2
7,7 ± 4,2
16,7 ± 2,5
10,0 ± 5,0
10,7±8,6
10,7±8,9
15,0±5,0
17,7±8,1
12,3±0,6
12,3±6,0
4. Discusión
Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que la toxicidad (4H3MB) es muy baja. Al no
ocurrir muerte en ninguno de los niveles. Según lo establecido por la OECD el producto se incluye en la
categoría de sustancia sin clasificar. Los síntomas y signos apreciados pudieran estar relacionados con la
toxicidad inherente al producto, debido a que los animales del grupo control mostraron una recuperación mas
rápida que los restantes niveles de dosis. Sin embargo la pronta recuperación observada en todos los grupos y
la no aparición de muerte demuestran que el efecto lesivo asociada a la sustancia parecer ser muy bajo. No se
descarta que el distres que provoca la excesiva manipulación y administración reiterada, se relacionen con los
resultados obtenidos. Los animales sometidos al (4H3MB) no manifestaron alteraciones anatomopatológicas.
Los hallazgos morfohistopatológicos a nivel hepático se caracterizaron por esteatosis centrolobulillar de ligera
a moderada en algunos animales, en los diferentes niveles de dosis y el grupo control. Inferimos que esta
alteración se debe al aceite utilizado como solvente y no a daño tóxico o lesional de la sustancia.De los
parámetros bioquímicos determinados en los que los valores medios relativos a los niveles de dosis con los
del grupo control y el rango de valores normales establecidos mostraron un comportamiento normal. Hubo en
algunos grupos tendencia al límite superior de la TGP, la causa de este comportamiento es la presencia en
algunos animales de discretos incrementos de TGP sérica que puede ser motivado por la esteatosis hepática
referida en el estudio anatomopatológico. Esta enfermedad se caracteriza por la acumulación de grasa en el
hígado y puede ocasionar depleción de las reservas de glucógeno hepático y lesión de las membranas del
hepatocito lo que permite la salida de la TGP dejándola escapar al líquido intersticial y por tanto a la corriente
sanguínea.
5. Bibliografía.
1. Hayes , P. et al. Principios y métodos de toxicología, tercera edición Raven Press . New York. 1994.
2. Reppeto, M. Toxicología fundamental. Segunda edición aumentada. Editor Científico médica. 1998.
3. Acute Oral Toxicity. OECD Guideline for testing of chemicals, 401. 1987.
4. Abrahm, D.J.; Mehanna, A, S. Et al. Vanilina , a Potential agent for the treatment of Sickle cell anemia .
Blood , 1991; vol 77, no.6: pp 1334 –1341.
5. Toxicología preclinica. Anteproyecto, BPL, La Habana, 1991.
Quadratic Index and quantitative structure-mutagenicity relationship in 2-furylethylene derivatives.
Yovani Marrero*,§, † Giselle P. Machado† & Vicente Romero Zaldivar.
§
Departmento de farmacia, Facultad de Química-Farmacia. Universidad Central de las Villas, Cuba.
†
Centro de Bioactivos Químicos, Universidad Central de las Villas, Santa Clara, 54830, Villa Clara, Cuba.
Faculty of informatic. Universidad de Cienfuegos, cienfuegos, Cuba.
*
Author to whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]
Summary
A novel approach to topologic-molecular has been introduced for the classification of the 2-furyletilenos in
mutagenic and non-mutagenic. They were developed, using the quadratic indexes as molecular descriptors,
a discriminant function that allows the correct classification of 100% of the compounds in the training set
and external prediction set. Also, two quantitative models were found for the description of the mutagenic
power of the active compounds in structural terms.
Keywords: Quadratic indexes, QSPR, nitrofurans, 2-furylethilenes, mutagenic activity.
1. Introduction
The nitrofurans are an important family of chemical compounds that have been used as therapeutic agents
in human and veterinary medicine.1 Besides these biological properties, the nitrofurans are potential
mutagenic 2 molecular entities. The toxicity of the nitrofurans has restricted their development and their use
as medicinal agents (table I). Subsequent studies have opened new opportunities for the furylethylenes.
Table I. Common name, principal uses and toxicity nitrofurans derivates.
No
Common name
Use
Mutaga
Carcina
1
AF-2: Furylfuramide
Food additive
+
+
2
Furylacrylic acid:2-furan
preservative
+
*
3
Nitrofurazone
Topical disinfectant
+
+
4
Nitrofurantoin
Urinary tract disinfectant
+
-
5
Furazolidone
Additive and prevent intestinal disease
+
*
6
Nifurtimox
Treatment of chagas disease
+
?
7
Fanft
Experimental bladder carcinogen
+
+
2. Materials and methods
2.1 The TOMO-COMD Approach. The Quadratic Indexes were calculated with the program TOMOCOMD3. The k-th total [ec.1] and local [ec. 2] quadratic indexes qk(x) are defined :
n
qk(x)= ∑
i =1
n
∑
j =1
k
aijXiXj
[1]
qkL
m
m
i =1
j =1
(x)= ∑ ∑
k
aijLXiXj
[2]
where n is the number of atoms of the molecule. The coefficients kaij are the elements aij of the k-th power
of the matrix M of the molecular pseudograph (G). Then, M = [aij], and the elements aij are defined:
aij = Pij if i≠j y ∃ ek ∈ E / ek ∼ vi,vj
= Lij if i = j
= 0 otherwise
where Pij is the number of edges that comply with ek ∼ vi,vj among the vertexes vi y vj. Lij is the number of
loops in vi. In ec. 2, m is the number of atoms of the fragment of interest and kaijL is the element of the file
“i” and column “j” of the matrix MkL=Mk(G, Fi). The matrix MkL=[kaijL] and the elements kaijL is defined:
k
aijL= kaij if both vi and vj are vertexes contained in the fragment of interest.
=1/2 kaij either vi or vj is contained in the fragment of interest but not both of them
=0 otherwise
2.2 Mutagenicity Data. Table II The compounds used in the present study were taken from the literature.4
R
o
1
H
R
No
R1
R2
R3
1
NO2
NO2
2
H
3
Br
4
5
R
2
SOS
A. Calc
H
+ (6.602) + (1.30)
6.460
0.142
1.36
-0.06
NO2
H
-
-
COOCH3
NO2
-
-
NO2 COOCH3
NO2
+ (6.602) + (0.24)
6.744
-0.142
0.69
-0.45
NO2
-
H
COOCH3
Ames
3
Residual S. Calc
Residual
-
6
NO2 COOC2H5 COOC2H5 NS
+ (0.70)
0.81
-0.11
7
NO2
+ (3.20)
3.03
0.17
8
NO2 COOCH3
NO2
CH3
NS
CN
+ (5.301) + (0.45)
9
H
COOCH3
CN
-
-
10
Br
COOCH3
CN
-
-
CN
CN
+ (6.046) + (0.33)
CN
CN
NS
CH3
+ (4.699) NS
11 NO2
12
H
13 NO2 COOCH3
5.349
-0.048
-0.05
0.50
5.991
0.055
0.38
-0.05
4.706
-0.007
-
Logarithm (in parenthesis) of the inverse of concentration producing the maximum number of revertant
per plates. Value (in parenthesis) of the potency of induction of SOS (SOSIP). Calculated Value for the
(predicted) models 4 y 5 for the toxic power according to Ames y SOS (SOSPI) respectively.
2.3 Statistical analysis. All the statistical analyses were carried out with STATISTICA.5
3. Results and Discussion.
With the purpose of developing a discriminant function, the lineal discriminant analysis was employed.
P= -151.214 + 40.76x10-2 Aeq4L(x)
[3]
N= 10
=0.093 D2=38.96 F(1.8)=77.934 p<0.0000
In table III the results obtained are illustrated in the classification of the compounds in training and
prediction sets. Discriminant functions for this same training and prediction set can be found in the
literature.4 Nevertheless, equation 1 y 2 of the reference4 classifies incorrectly the 13 compounds.
Table III. Results of the classification of 2-furylethylenes.
Noa Class. Obs. Prob. Ec. 3
Nob Class. Obs. Prob. Ec. 3
1
-
100
8
+
100
1
+
100
2
-
100
9
-
100
2
+
100
c
-
86
10
-
89
3
+
100
4
+
100
11c
+
100
4
+
100
5
-
100
12
-
100
5
+
100
6
+
100
13
+
100
6
+
100
c
+
100
7
+
100
3
7
a
Noa Class. Obs. Prob. Ec. 3
b
c
Compounds of Table II. Compounds of Table I. Compounds in the external prediction.
One of the important aspect of the structure-property activity relation of the models is the ability to predict
the activity studied. In table III the results of the virtual screening is of the 7 compounds presents a proven
mutagenicity activity. Finally, we develop 2 quantitative models using linear regression.
[4]
Log (1/C)= 0.850296 + 35.732x10-3 .NO2eq1L(x) +1.56x10-9. Aeq15L(x)
N= 5
R=0.99
S=0.15
F(2.2)=60.123
p<0.016
SOSIP= -110.373-1.82x10-3. eq4(x)+9.89x10-3. Aeq5L(x)
[5]
N= 6
R=0.96
S=0.40
F(2.3)=17.702
p<0.021
In table II, the two regression models show the obtained results. Both models present the values of the
correlation coefficient and of the ratio of Fisher higher than that of equations 3 and 4 of the reference4.
Therefore, the positive contribution of
NO2e
q1L(x) indicates that the presence of a nitro group in the molecule,
independent of the position it occupies, it increases the value of the log (1/C), and is logic if we keep in
mind that the capacity to accept one electron from the medium to produce an ion-radical will be increased.
Conclusions
Using the quadratic indexes as molecular descriptors function discriminant was developed, that allows the
correct classification of 100% of the compounds in training and external prediction sets. The predictive
quality of the model was also determined by evaluating 7 additional molecular entities with a proven
mutagenic activity. Two quantitative models were found for the description of the mutagenic power. The
comparison with another methodology shows a good behavior of the proposed descriptors.
References
1. Bryan, G.T. In Carcinigenesis -A comprehesive survey- nitrofurans: Chemestry, metabolism, mutagensis
and carcinigenesis; Bryan, G. T., Ed.; Raven Press: New York, 1978; Vol. 4, pp 1-12.
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4. Estrada, E. Mutat. Res. 1998, 420, 67-75.
5. STATISTICA ver. 5.5, Statsoft, Inc. 1999.
Elaboración de un “Extracto con Actividad Antinflamatoria” a partir de un residuo placentario.
G.Coto, G.Garcia, L.Oruña, G.Lago, D. Da’Lama , M.Alvarez
El uso de subproductos para evaluar su posible empleo ha sido una actividad constante en nuestro Centro para
disminuir cada vez más sustancias que pueden contaminar el ambiente, siendo aún una fuente potencial de principios
activos . Es por eso que se consideró que la masa placentaria generada en la extracción del principio activo de la
Pilotrofina Loción pudiera ser una fuente rica para la obtención de un extracto placentario acuoso (EPA) con
actividad antinflamatoria similar al informado por la literatura conocido como Extracto Filatov . Se diseñó un
proceso de obtención para lograr un producto estéril con calidad inyectable, libre de pirógenos y de AcVIH -1
(incluye subtipo 0) y VIH-2; Ag de Hepatitits B y AcHCV. Se comparó con un producto Suizo de características
similares, el perfil protéico de pesos moleculares entre ambos fué similar sobre todo en el volumen muerto no se
detectó presencia de proteinas de alto peso molecular en ambos productos. El nivel de metales pesados, minerales,
conductividad y otros indicadores químico-físicos fueron similares al patrón de referencia . La evaluación del efecto
antinflamatorio se realizó por dos vias intramuscular e intraperitonial empleando ratas albinas hembras dividida en
tres grupos I Control (+) Betametason, II Control( -) Carragenina 1% y III EPA . En la vía intramuscular la
Betametasona presentó los mejores resultados estadísticos pero EPA superior a la Carragenina en el mayor efecto
inflamatorio representando una reducción mayor del 50%. Por la via intraperitoneal los resultados de Betametasona y
EPA fueron similares
Introducción
Desde 1945, el profesor Filatov (1945, 1953) empleó la placenta humana para realizar extractos acuosos en sus
tratamientos para diferentes patologías oftalmológicas como son: procesos inflamatorios, queratitis e iritis y procesos
crónicos como retinosis pigmentaria. Existen diferentes laboratorios que han fabricado este producto, en Rusia (Medic
Export), Suiza (Serolab Sa), Italia (Lucchini) y Cuba (Centro De Histoterapia Placentaria)
En Cuba Miyares (1984) siguiendo la metodología propuesta por Filatov obtuvo este antinflamatorio el cual se
caracterizó por Melgares (1996) comparándolo con otro similar de procedencia Suiza. Rodríguez (1998) recopiló la
información obtenida y evaluó el efecto de diferentes enzimas termoestables presentes en estos extractos y que ha sido
una de las características distintivas de este compuesto que a pesar de ser expuesto a temperatura de 105 C enfriando,
centrifugando o filtrando y posteriormente liofilizado, al ser reconstituidos se ha detectado actividad enzimática.
También Jiménez (1993) presentó una modificación al procedimiento original el cual se comprobó su actividad
antiinflamatoria una vez que el producto se esterelizó en autoclave.
Miyares (1984, 1996) mostró la actividad antinflamatoria utilizando la técnica descrita por Germny y Martin (1971)
que se basa en provocar la peritonitis química en el ratón o la formación del edema inflamatorio de la pata de la rata
mediante la inyección de una solución de dextrana al 6 %. El presente trabajo propone una nueva metología a partir
de la masa placentaria después de haber sido sometida a la extracción del principio activo de la Pilotrofina Loción
para obtener un extracto antiinflamatorio.
Materiales y Métodos
Se utilizó la masa residual de placentas humanas empleadas en la elaboración Pilotrofina Loción de tres lotes
diferentes. Se realizaron tres lotes experimentales a partir de la masa residual de placenta. Esta masa ya pasó por un
proceso de extracción acuosa, el resto (la masa sólida) se almacenó a - 20 C hasta su posterior procesamiento para el
procedimiento propuesto en este trabajo. A un peso de masa placentaria residual se le añadió 2 volúmenes de suero
fisiológico (Solución de cloruro de sodio 8.5 g / L)(P/ 2 V) se agitó con agitador de paleta en forma de "U" a 750 rpm
durante 30 min a temperatura ambiente. Seguidamente se continuó la agitación a 350 rpm a 80 C durante 30 min.
Una vez terminado el tiempo se dejó reposar todo el material a temperatura ambiente. Posteriormente se ajustó el pH
con ácido láctico hasta pH 5.4 - 5.5 y se conservó a 8 C durante 20 horas con agitador de paleta a 350 rpm. Cumplido
este tiempo todo el material se dejó reposar, decantándose y se filtró por tres capas de gasa, se desechó la fase sólida y
la líquida se centrifugó a 10 000 rpm a 10 C durante 20 min, terminada esta operación se separó la fase líquida del
sedimento y se rectificó pH con ácido láctico hasta pH de 5.4 - 5.5. La solución se calentó a 100C durante 2 min, se
filtró el líquido cuando alcanzó la temperatura de 50 - 60 C mediante placas filtrantes esterelizantes (dos veces).
Previamente las placas se lavan con suero fisiológico a 60 C , seguidamente envasar en frascos, autoclavear a 121 C,
1 at durante 30 min, enfriar y centrifugar, separar fases desechar el sedimento y ajustar el pH con NaOH 0.5 N, pasar
por placas filtrantes esterelizantes similar a la filtración anterior, autoclavear en el envase final donde se considera ya
terminado para ser evaluado como un inyectable.
Ensayo Microbiológico y Pruebas de Efectividad Farmacológica y Tolerancia Local.
Las muestras (Tres lotes consecutivos) se enviaron al Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos
(CIDEM) donde se realizaron las pruebas de esterelidad y de pirógenos según las normas y procedimientos
establecidos por esta Institución. Las pruebas se efectuaron en los laboratorios LIORAD, CIEB e IFAL empleando las
técnicas según los Procedimientos Normalizados de Operación establecidos.
Resultados y Discusión:
Tabla 1. Características físico químicas del extracto placentario acuoso. Promedio de tres lotes experimentales.
Características organolépticas: Líquido transparente, ligera tonalidad amarilla, excento de partículas en suspensión.
pH :
6.5 - 7.1 =
NaCl (g/L)
6.8
Metales Pesados:
>10 ppm cumple
7.5 - 7.76
Lípidos:
0 mg/100ml
Conductividad
14 ms/ cm
Proteínas (N x 625)
194 mg /100 ml
Densidad
0.990
Lowey:
59mg/ 100 ml
Sólidos totales
1 g / 100 ml
M.O:
1 - 0.08 = 0.919 g/100ml
Cenizas:
0.081
Tabla 2. Caracterización de los minerales presentes en el extracto acuoso de placenta (PPM)
Lotes experimentales.
SEROLAB SA.
I
II
III
REF
Cu
0.01
0.78
0.27
0.01
Mg
18.04
18.80
17.66
1.04
Ca
141.00
111.20
92.28
3.70
Mn
0.02
0.01
0.01
0.01
En la tabla 2. se aprecia la variabilidad que existe entre lotes para los minerales evaluados en los diferentes lotes
experimentales analizados. Se sugiere seguir analizando este indicador que refleja un mayor contenido de Magnesio,
calcio y cobre estos tres cationes influyen beneficiosamente en los procesos reparadores y bioestimulantes de los
tejidos, Filatov (1945).
Tabla 3. Determinación del peso molecular por cromatografía de filtración .
No. Tubo
Ads
Com/tub
T.R
12
0.023
0.016
48
17
0.010
0.007
21
0.010
0.007
Ve
Kav
P. Molec.
9.6
0.111
382 340
68
13.6
0.358
30 575
84
16.8
0.555
4 053
Leyenda: Abs. Absorbancia a 612 nm, Ve. Volumen de elusión, Kav. Constante promdio P.Molec: Peso molecular.
Como se puede apreciar el producto obtenido a partir de residuo de placenta que queda de la obtención de la
Pilotrofina si se compara con el obtenido por los Laboratorios SEROLAB SA es muy similar en cuanto al rango de
pesos moleculares lograndose tres picos (Tabla 2 ) y ninguno eluyen en el volumen muerto similar comportamiento
presenta el antiiflamatorio de referencia. Al parecer en la extracción acuosa que se realiza a la masa placentaria para
la obtención de Pilotrofina Loción así como en el procedimiento de fraccionamiento (cambio de pH, centrifugación y
calor) se eliminan las fracciones de altopeso molecular lo cual permite aprovechar la masa residual que queda
simplificandose un gran números de pasos en la tecnología propuesta en los procedimientos normalizados
operacionales de los laboratorios SEROLAB SA.
Conclusiones:
1.
Se pudo emplear la masa placentaria que se desechaba una vez terminada el proceso de obtención de la
Pilotrofina Loción en la fabricación de un nuevo producto con actividad antiinflamatoria, ahorrando materia
prima (placenta fresca).
2.
El extracto acuoso obtenido de la masa placentaria mostró efecto antiinflamatorio por vía intramuscular a la dosis
ensayada con un porcentaje de inhibición de la inflamación de 35.6.
3.
El extracto acuoso mostró un efecto similar al de la Betametazona por vía intraperitonoal a la dosis ensayada con
un porcentaje de inhibición de la inflamación de 396.
4.
En las pruebas de Tolerancia Local el producto se considera no tóxico.
Referencias:
Germany y Martin. 1971. Experimental study of antinflamatory drugs of diferent chemical structure. Ciencia cultura
Jiménez M.A. 1993. Peocedimiento para la obtención del antiinflamatorio autoclaveado. Informe Técnico. CHP.
Melgares. P.1996. Resultados de algunos indicadores físico químicos del antiinflamatorio oftálmico del CHP.
Comparación con uno comercial de fabricación rusa. Informe Técnico.
Miyares C. M. 1996. Plegable informativo del extracto acuoso de placenta humana. Antiiflamatorio oftálmico. CHP.