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Memorias del XXXIV Encuentro Nacional y III Congreso Internacional de la AMIDIQ
7 al 10 de mayo de 2013, Mazatlán, Sinaloa, México
CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES ENO2, IFI35, SLC39A7
Y RPS28 EN MACRÓFAGOS MURINOS INFECTADOS CON Mycobacterium
tuberculosis Y Mycobacterium bovis BCG
Marina Melisa Avendaño Felixa Kenia López Lópeza, Carolina Murúa Lópeza, José Geovanni Romero
Quintanaa, Rosalío Ramos Payana, Elsa Maribel Aguilar Medinaa*.
a
Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Av. de las Américas s/n. Col
Villa Universidad, Culiacán, Sinaloa, 80010, México. *[email protected]
Resumen
La Tuberculosis (TB) es de las enfermedades más antiguas que afecta a seres humanos,
causada por micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) (Mathema y
cols., 2006). A pesar de contar con vacuna y terapia efectiva, continúa siendo problema de
salud mundial (WHO, 2009). Además, los mecanismo de patogénesis y de evasión del
sistema inmunológico aún se desconocen (Cabrera, 1998). Cuantificar la expresión de los
genes ENO2, IFI35, SCL39A7 y RPS28 en macrófagos murinos infectados con cepas de
M. tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG. Implementando la RT-qPCR observamos que los
genes que codifican para ENO2 e RPS28 muestran una supresión en su expresión a las 6
h.p.i. (horas post-infección) en células infectadas con ambas cepas, a las 24 h.p.i.
aumentaron su expresión notablemente en ENO2 en las células infectadas con H37Rv. A
las 48 h.p.i ENO2 normaliza su expresión y RPS28 continúa incrementando su expresión
en células infectadas con ambas cepas. IFI35 manifestó una disminución en su expresión a
las 24 h.p.i. para células infectadas con BCG, a las 48 h.p.i. normalizo su expresión.
SLC39A7 disminuyo su expresión a las 6 h.p.i. en células infectadas con BCG y se observo
un incremento a las 24 h.p.i, y a las 48 h.p.i., disminuye significativamente su expresión en
células infectadas con H37Rv. Durante la infección de macrófagos con H37Rv y BCG
ocurren cambios importantes en la expresión genética. Los genes en estudio modificaron su
expresión durante la infección con ambas cepas del CMTB.
Introducción
La tuberculosis (TB) es de las enfermedades más antiguas que afectan a los seres humanos,
generalmente los pulmones [1]. A lo largo de la historia se han registrado eventos que
demuestran el grado de afección que puede tener esta enfermedad infecciosa [2], la cual es
causada por un conjunto de micobacterias pertenecientes al Complejo Mycobacterium
tuberculosis [3]. A pesar de contar con una vacuna y una terapia farmacéutica efectiva y
accesible, la TB continúa siendo un problema de salud mundial debido a su alta prevalencia
e índices de morbilidad y mortalidad [4]. Además, la problemática se ha agravado debido a
diversos factores como la aparición y expansión de cepas mútidrogorresistentes, y a la
marcada susceptibilidad de los pacientes con SIDA al desarrollo de la enfermedad [5]. La
gran mayoría (90%) de los individuos infectados con M. tuberculosis nunca desarrollan la
enfermedad clínicamente. Sin embargo, se piensa que la bacteria logra sobrevivir durante
años en los pulmones, y posteriormente puede reactivarse para multiplicarse y causar daño
cuando el sistema inmunológico del hospedero se ve comprometido [1]. El mecanismo de
patogénesis de M. tuberculosis, así como los mecanismos de evasión del sistema
inmunológico aún no se conocen a profundidad y a medida que se comprendan estos
mecanismos se podrán desarrollar mejores estrategias para la creación de vacunas más
eficientes [6].
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Existen pocos estudios sólidos sobre la interacción hospedero-patógeno [7]. Durante la
infección, ocurren cambios transcripcionales en el patógeno y el hospedero, los cuales
determinan la sobrevivencia del patógeno o el control de la infección. Por lo que identificar
los genes que se expresan diferencialmente en el hospedero cuando se presenta la infección,
podría permitir un mejor entendimiento de la patogenia de esta enfermedad.
En 2004, Ramos-Payán y col. realizaron un estudio donde se analizó la expresión de genes
en macrófagos murinos J774A.1 infectados y no infectados con M. bovis BCG y M.
tuberculosis H37Rv durante 6, 24 y 48 h usando “Differential Display” y RT-PCR [8].
Posteriormente, Murúa-López y col., en enero de 2011, mediante RT-qPCR, observaron
que los genes que codifican para α-L-Fucosidasa, Vcp y las quimiocinas MCP-1 y MIP-1α
reflejaron cambios importantes en su expresión genética [9].
Por lo anterior, se planteó cuantificar los niveles de transcripción de los genes en estudio en
macrófagos infectados con M. tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG a diferentes tiempos,
mediante la técnica de RT-qPCR.
Metodología
Se realizó un experimento por triplicado, utilizando la línea celular de macrófagos murinos
J774A.1 y cepas de M. tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG. Se realizó la infección de
macrófagos usando una MOI (“multiplicity of infection”) de 30:1 para M. bovis BCG y
20:1 para M. tuberculosis H37Rv. Posteriormente, se calculó la viabilidad de macrófagos
utilizando un colorante vital azul tripano (0.32% p/v). El porcentaje de infección se
determinó mediante tinción de Kinyoun (HYCEL) de macrófagos infectados, se produjo un
lisado de células infectadas para el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC)
preparando una serie de diluciones de 10-1 a 10-6 de las cuales se sembraron 20 µl en placas
de Middlebrook 7H10 con ADC. Después, se llevo a cabo la extracción del RNA a partir de
TRIZOL y se cuantificó por espectrofotometría a una absorbancia de 260 nm (A260).
Mediante la técnica RT-qPCR se obtuvo el cDNA y se realizó la cuantificación relativa de
la expresión génica tras la infección de macrófagos J774con H37Rv y BCG durante 6, 24 y
48 h post-infección. Se utilizó GAPDH como gen constitutivo. Todos los datos obtenidos
de la RT-qPCR fueron evaluados por medio del Análisis de Varianza (ANOVA) de un
factor, y la prueba de comparaciones múltiple de Bonferroni y de Dunnet. La significancia
fue dada con un valor de p<0.05. Todos los datos se analizaron con el programa PASW
v.18.0 [10].
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Resultados
Se obtuvieron los porcentajes de infección a los diferentes tiempos p.i. mediante la tinción
de Kinyoun. Lo cual junto a las cuentas viables permitió conocer el curso de la infección, y
la resistencia o susceptibilidad de los macrófagos hacia las diferentes cepas de
micobacterias utilizadas.
Se observó que los macrófagos muestran una buena capacidad para controlar la infección
causada por M. bovis BCG, debido a que el porcentaje de infección disminuyó del 83% al
69%, durante el transcurso de la infección, mientras que la infección causada por H37Rv
muestra un porcentaje de 62% de células infectadas en un inicio y alcanza hasta el 74% al
final del estudio. En la figura 1 se observan los macrófagos J774A.1 sin infectar e
infectados con cepas BCG y H37Rv. Durante los tiempos p.i. estudiados se observó a las
micobacterias en el interior de los macrófagos.
El conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) permitió cuantificar el número de
bacilos viables en el interior de las células infectadas en los diferentes tiempos p.i. donde
observamos el crecimiento bacteriano de las dos cepas utilizadas a través de la cinética de
infección. Las UFC para BCG resultaron ser mayores que las de H37Rv, también se
observó que el número de micobacterias viables se incrementó al transcurrir el tiempo, lo
cual indica que durante la infección temprana las células no logran controlar el proceso
infeccioso a ningún tiempo. Sin embargo, se encontró que el número de micobacterias
aumenta durante el curso de la infección con ambas cepas aunque en diferente proporción.
El número de bacilos vivos de BCG en el interior de los macrófagos (aproximadamente 3
millones de células/pozo) fue de: 20 X 105, 22 X 105 y 24 X 105 bacilos/ml a las 6 h, 24 h y
48 h p.i. respectivamente, mientras que para H37Rv fue de 12 X 105, 12 X 105 y 14 X 105
bacilos/ml en los tiempos antes mencionados.
En el cuadro 1, observamos que los genes que codifican para ENO2 e RPS28 muestran una
supresión en su expresión a las 6 h p.i. en células infectadas con ambas cepas, mientras que
a las 24 h p.i. aumentaron su expresión, siendo más notable para ENO2 en las células
infectadas con H37Rv. A las 48 h p.i ENO2 normaliza su expresión y RPS28 continúa
incrementando ligeramente su expresión en células infectadas con ambas cepas. IFI35
manifestó una disminución en su expresión a las 24 h p.i. para las células infectadas con
BCG, mientas que a las 48 h p.i. normalizo su expresión. Finalmente, SLC39A7 disminuyo
su expresión a las 6 h p.i. en células infectadas con BCG; por otra parte, se observo un
incremento a las 24 h p.i, y a las 48 h p.i., disminuye significativamente su expresión en
células infectadas con H37Rv.
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Figura 1. Tinción de macrófagos J774A.1 infectados con BCG y H37Rv. Se realizó la infección de los
macrófagos con un MOI de 30:1 y 20:1, se hizo la tinción de las monocapas a las 6, 24 y 48 h p.i. mediante la
técnica de tinción de Kinyoun (Aumento 100X).
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Tabla 1. Cuantificación relativa de la expresión de los genes en estudio.
DE: Desviación estándar, d: aumento (↑) o disminución (↓) de la expresión génica con respecto al control, b:
aumento o disminución de la expresión entre los grupos de células infectadas.
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Conclusiones
Con el presente trabajo confirmamos la hipótesis que durante la infección de macrófagos
J774A.1 con cepas de M. tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG ocurren cambios
importantes en la expresión genética. Mediante RT-qPCR observamos que los genes en
estudio modificaron su expresión durante la infección con ambas cepas del complejo M.
tuberculosis.
1. ENO2 suprime su expresión a las 6 h p.i. en ambas cepas, a las 24 h p.i. aumenta su
expresión significativamente en células infectadas con H37Rv y a las 48 h p.i. normaliza su
expresión. Mientras que en células infectadas con BCG aumenta su expresión conforme
transcurren los tiempos p.i.
2. IFI35 mantiene su expresión en niveles basales, sin embargo a las 24 h p.i. en células
infectadas con BCG suprime su expresión.
3. SLC39A7 suprime su expresión a las 6 h p.i. en células infectadas con BCG, sin
embargo regresa a niveles basales a las 24 y 48 h p.i. Mientras que en células infectadas
con H37Rv aumenta su expresión a las 24 h p.i. y muestra una disminución
estadísticamente significativa a las 48 h p.i.
4. RPS28 suprime su expresión significativamente a las 6 h p.i. en ambas cepas, mientras
que en las 24 y 48 h p.i. incrementan su expresión.
Estos resultados, podrían ser relevantes, dado que la participación de los genes en estudio
no está descrita en la infección con micobacterias, y su estudio podría ayudar al mejor
entendimiento de la tuberculosis.
Referencias
1.
Kumar V, Cotran RS y Robbins SL. “Patología Humana”, 6ª Edición en Español. McGraw - Hill
Interamericana Editores. 1999.
2. Báguena Cervellera MJ. “La Tuberculosis y su historia”, Fundación Uriach. 1992.
3. Mathema B, Kurepina NE, Bifani PJ, y Kreiswirth BN. “Molecular Epidemiology of Tuberculosis:
Current Insights”, Clinical Microbiology Reviews 658-685. 2006.
4. WHO
“Pursue
high-quality
DOTS
expansion
and
enhancement”,
http://www.who.int/tb/dots/treatment/en/index.html. 2011.
5. WHO “Global Tuberculosis Control”, WHO Report. 2009. Disponible en línea: http://www.who.int/.
6. Cabrera CR. “Eventos adversos temporalmente asociados a vacunación”, Rev Fac Med UNAM
41(1):22-26. 1998.
7. Bloom BR, Murray CJL. “Tuberculosis: Commentary on a reemergent killer”, Science 247:1055–
1064. 1992.
8. Ramos-Payan R. “Expresión diferencial de genes en macrófagos murinos infectados con cepas de
complejo Mycobacterium tuberculosis”. Tesis de Doctorado, Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas, IPN. México DF. 2004.
9. Murúa-López C. “Cuantificación de la expresión de los genes MCP-1, MIP-1α, α-L-Fucosidasa y VCP
en macrófagos murinos infectados con Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BC”,.
Tesis de Maestría, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, UAS. Culiacán, Sinaloa. 2011.
10. Chacón-Salinas R, Serafín-López J, Ramos-Payán R, Méndez-Aragón P, Hernández-Pando R, Van
Soolingen D, Flores-Romo L, Estrada-Parra S, Estrada-García I. “Differential pattern of cytokine
expression by macrophages infected in vitro with different Mycobacterium tuberculosis genotypes”,
Clin Exp Immunol. 140(3):443-9. 2005.
1826
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ISBN: 978-607-95593-1-1