Práctica Identificación de proteinas por MSMS con Mascot La Huella

Práctica Identificación de proteinas por MSMS con Mascot
La Huella peptídica tiene algunas limitaciones. Mediante esta técnica solo se pueden identificar proteínas
que estén secuenciadas y cuya secuencia esté en alguna de las bases de datos. La proteína no debe estar
en una muestra compleja con otras proteínas, y además la sensibilidad es menor ...
La espectrometría de masas en tandem, MS/MS o MS2, consiste en seleccionar un ion (péptido) precursor
en base a su relación m/z. Éste es fragmentado y los fragmentos resultantes son observados en el espectro.
En funcion del punto en que el el ion precursor se fragmenta, y según se mire desde el extremo amino- o el
extremo carboxi-terminal, se obtienen las series x, y, z ; y a,b,c
Observando la diferencia de masa entre los picos del espectro de fragmentación, y dado que conocemos las
masas de los aminoácidos, podemos obtener la secuencia del péptido precursor fragmentado. Es lo que se
denomina Secuenciación “de novo”, y es posible incluso si la proteína original no estaba secuenciada
EJERCICIOS MSMS
− Ir a http://www.ucm.es/proteomica → Enlaces → Mascot → MSMS
−
Abrir ejemplos_pmf_y_msms.xls
1) Proteína Ole
a) Búsqueda por PMF
- Mascot → PMF
Database : NCBInr
Modif: : Carbamidomethyl(C) y Oxidation(M)
Pep.Tol: 50 ppm
b) MS/MS
Rellenar los parámetros comunes con PMF más los nuevos parámetros específicos de MSMS.
−
Parámetros de búsqueda:
Introducir Name, Mail y Title (título opcional)
Database: NCBInr
Enzyme: Trypsine
Allow up to 1 missed cleavage
Taxonomy: All entries
Peptide tol: 100 ppm.
Fragment tol: 0.4 Da
Peptide charge: 1+ (MALDI)
Instrument: Default
Subir la lista de picos en un archivo (Incluyendo BEGIN IONS y END IONS)
− Ir a Peptide view pinchando en Query 1
c) Afinar la búsqueda cambiando algunos parámetros.
Taxonomy: Viridiplantae
Instrument: MALDI-TOF-TOF
− Ir a Protein view pinchando en el identificador de la proteína (gi|144...)
Observar como con un pequeño coverage (sólo un péptido) es suficiente para identificar la proteína por
MSMS
− Ir a Peptide view pinchando en Query 1
2) Proteína Klebsiella
a) Rellenar los parámetros comunes con PMF más los nuevos parámetros específicos de MSMS.
−
Parámetros de búsqueda:
Introducir Name, Mail y Title (título opcional)
Database: NCBInr
Enzyme: Trypsine
Allow up to 1 missed cleavage
Taxonomy: Bacteria
Peptide tol: 100 ppm.
Fragment tol: 0.4 Da
Peptide charge: 1+ (MALDI)
Instrument: MALDI-TOF-TOF
Subir la lista de picos en un archivo (Incluyendo BEGIN IONS y END IONS)
− Ir a Peptide view pinchando en Query 1
3) Ejercicios ppw_1.txt