Estudio de actividad antibacteriana de potenciales

UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias
Químicas y Farmaceúticas
"Estudio de actividad antibacteriana de
potenciales biocontroles sobre bacterias acéticas
involucradas en la pudrición ácida de la uva".
Profesor Guía: Sr. Guillermo Figueroa Gronemeyer.
Profesor Patrocinante: Sr. José Romero Reyes.
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO EN
ALIMENTOS
RODRIGO ANDRES MATELUNA ESTAY
Santiago, Chile.
2006
A mi familia y a Karen
2
AGRADECIMIENTOS.
Agradezco a mi gran compañera, polola y amiga Karen Ellis por todo su amor,
comprensión y afecto incondicional. Gracias “Conejo”, por todos estos años de apoyo y
por ayudarme a terminar con esta gran tarea, sin ti me hubiera costado muchisimo más.
Gracias a mis padres por todo su esfuerzo en brindarme la educación que hoy
tengo y por inculcarme valores como persona. Gracias viejita, por darme ánimo en los
momentos dificiles, por sacar fuerzas de flaqueza, por las enseñanzas que siempre me
has regalado, y por tu dureza sabia. Gracias papá, por la alegria que siempre nos
inculcaste, por tu amistad, por estimular mis habilidades y potenciar mis virtudes, gracias
por querer sacar lo mejor de mi. Gracias a mi hermano Hernán, mi mejor amigo y eterno
compañero, gracias por todo tu apoyo a lo largo de mi carrera y mi vida, por tu simpleza y
grandeza, por estar siempre al lado mío.
Gracias al profesor José Romero y al profesor Guillermo Figueroa, por permitirme
descubrir un hermoso tema y por su confianza y apoyo entregados. Agradezco a todos los
profesores que tuve durante mi vida universitaria por lo que han dejado en mí.
Agradezco a mis compañeros y amigos de N.N., ademas de mis compañeros de
quinto año, especialmente a la Verito, por toda su ayuda y amistad entregada en estos
años de universidad.
Agradezco a la gente que conoci en el INTA, a toda la bella gente del Laboratorio
de Microbiología, especialmente a mi querida Isabel Mella por su inmensa ayuda,
paciencia y dedicación.
Gracias a mis familiares, a mis tíos y primos de Salamanca por su estímulo
constante y su preocupación; a mi primo Claudio por su amistad y colaboración
permanente; a mis tíos Cortés Gerbaud por su cariño y atenciones; a mis primos Cerón
Estay por su gran confianza y aprecio; a Don Oscar Valenzuela, por todos sus consejos, a
Angélica Ellis y a Laura Acuña, por el gran apoyo y afecto entregados.
Agradezco finalmente a todos mis compañeros del Instituto Nacional, mi querido
colegio; a Rienzi, mi amigo fiel y al gran profesor Marrese, por despertar en mi el interés
por la química.
A todos ellos, muchas gracias.
3
INDICE
RESUMEN ............................................................................................................................. 7
SUMMARY ........................................................................................................................... 9
1.- INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 10
2.- OBJETIVOS ................................................................................................................... 12
3.- MARCO TEÓRICO........................................................................................................ 13
3.1.- Uva de mesa en Chile............................................................................................... 13
3.2.- Principales enfermedades......................................................................................... 13
3.3.- Pudrición ácida......................................................................................................... 14
3.4.- Métodos de control de pudricion acida .................................................................... 17
3.5.-Biocontroles. ............................................................................................................. 18
3.6.- Métodos de evaluación de biocontroles in vitro....................................................... 22
4.- MATERIALES ............................................................................................................... 24
5.- METODOLOGÍA ........................................................................................................... 27
5.1.- Determinación de actividad antibacteriana de potenciales cepas biocontroles para
Acetobacter aceti. ............................................................................................................. 27
5.1.1.- Métodos de evaluación de actividad antagónica. .............................................. 28
5.1.2.- Ensayos en sobrenadante libre de células ......................................................... 29
5.2.- Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. ............................................................... 30
5.3.-Detección de plásmidos............................................................................................. 32
5.3.1.- Extracción y aislamiento de ADN plasmídico. ................................................. 32
5.3.2.- Electroforesis en gel de agarosa. ....................................................................... 33
5.4.- Identificación de especies de potenciales biocontroles. ........................................... 33
6.- RESULTADOS............................................................................................................... 35
6.1.- Determinación de actividad antibacteriana de potenciales cepas biocontroles para
Acetobacter aceti. ............................................................................................................. 35
6.1.1.- Evaluación de actividad antagónica .................................................................. 35
6.1.2.- Ensayos en sobrenadante libre de células. .......................................................... 37
6.2.- Prueba de susceptibilidad antibiótica. ...................................................................... 38
6.3.- Detección de Plásmidos. .......................................................................................... 40
6.4.- Identificación de especies......................................................................................... 43
7.- DISCUSIÓN ................................................................................................................... 46
4
7.1.- Actividad antibacteriana de potenciales cepas biocontroles contra A. aceti............ 46
7.2.- Susceptibilidad a antibióticos y perfil plasmidial en cepas biocontroles. ................ 49
7.3.- Análisis de identificación de especies...................................................................... 51
8.- CONCLUSIONES .......................................................................................................... 54
9. - BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................ 56
10.- ANEXOS....................................................................................................................... 67
5
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Pudrición ácida en uva de mesa.....................................................................…15
Figura 2: Diagrama con secuencia de patógenos asociados a la pudrición ácida de la
vid…………………………………………………………………………………………………..18
Figura 3: Formación de halo de inhibición de crecimiento por parte de Cepa potencial
biocontrol N° 25 contra bacteria acética Ac 148-1..............................................................43
Figura 4: Formación de halo de inhibición de crecimiento por parte de Cepas potenciales
biocontroles N°19 y 20 contra bacteria acética Ac 102-5……........................................... 44
Figura 5: Gel primera extracción de plásmidos en potenciales biocontroles.....................52
Figura
6:
Gel
segunda
extracción
de
plásmidos
en
potenciales
biocontroles………………………………………………………………………………….........53
INDICE DE GRAFICOS
Gráfico 1: Distribución por especie de los biocontroles.....................................................56
INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Tabla de criterio de susceptibilidad a antibióticos............................................... 29
Tabla 2: Resumen de actividades antagónicas de biocontroles probables.......................34
Tabla 3: Resultados de pruebas de inhibición de sobrenadantes filtrados de biocontroles
contra dos bacterias blanco (Acetobacter aceti) sobre las cuales hayan tenido algún efecto
inhibitorio.................................................................................................................................35
Tabla 4: Diámetros de inhibición de las cepas contra antibióticos ensayados.....................36
Tabla 5: Resultados de susceptibilidad para las cepas ensayadas...................................37
Tabla 6: Cantidad y porcentajes de cepas con diferentes niveles de resistencia a
antibióticos..........................................................................................................................37
Tabla 7: Porcentajes de resistencia a cada uno de los antibióticos testeados..................38
Tabla 8: Resumen de pesos moleculares aproximados de plásmidos hallados en cepas
biocontroles........................................................................................................................40
Tabla 9: Pruebas bioquimicas realizadas a cepas biocontroles para su identificación de
especie...............................................................................................................................41
6
Tabla 10: Resumen Identificación de especies de cepas biocontroles.............................43
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Superficies de vides de mesa en hectáreas.......................................................66
Anexo 2. Producción nacional de huertos industriales......................................................68
Anexo 3. Cálculo del tamaño molecular de los plásmidos encontrados en cepas
potenciales biocontroles………………………………………………………..…….………….69
7
RESUMEN
La uva de mesa es una de las principales especies frutales en Chile, ya que es
uno de los mayores exportadores a nivel mundial y líder en el hemisferio sur.
La principal enfermedad que ha afectado en Chile a la uva ha sido la Pudrición
Gris, pero una nueva patología de la vid denominada "Pudrición ácida" ha aparecido
progresivamente en la zona centro-norte. La etiología de esta fitopatología indica que los
responsables serían hongos, levaduras y bacterias acéticas, sin haber determinado los
roles y mecanismos de acción de estos microorganismos.
En un estudio realizado en el INTA (Instituto de Nutrición y Tecnologia de los
Alimentos), se encontró presencia de bacterias acéticas en un 52% de las uvas enfermas
y se obtuvieron recuentos bajos de hongos filamentosos fitopatógenos en uvas enfermas,
sugiriendo revisar las teorías sobre un origen principalmente fungoso. Luego, se investigó
acerca de la asociación de las principales especies de acetobacterias, obteniéndose un
predominio de Acetobacter aceti, con un 71% de presencia en uvas enfermas.
Hasta el momento no se dispone de tratamientos eficaces que eviten el desarrollo
de la pudrición ácida. Por eso, es que en el presente estudio se busca un método
alternativo, amigable con el medio ambiente denominado “control biológico”.
Para ello se seleccionaron un grupo de 42 cepas provenientes de la microbiota
natural de vides, potenciales biocontroles por tener actividad inhibitoria contra BGA
(Bacillus subtilis) y Escherichia coli. De estas, hubo 14 que manifestaron cierta propiedad
antágonica contra sobre las bacterias acéticas. No se encontró actividad inhibitoria en el
sobrenadante libre de células de los biocontroles, lo que sugiere que el principal
mecanismo de acción de antagonismo, no sería la producción de metabolitos antibióticos.
En las cepas potenciales biocontroles, no se halló un nivel importante de
resistencia a antibióticos (solamente resistencia a la ampicilina y la eritromicina en 3
cepas); encontrándose presencia de plásmidos en 4 cepas (ninguno relacionado con el
desarrollo de un cuadro de multidrogo-resistencia); y siendo todos los biocontroles
pertenecientes al género Bacillus con predominio de Bacillus circulans y licheniformis.
8
SUMMARY
Study of antibacterial activity of potential biocontrols against acetic
bacterias involved in sour rot of table grapes.
The table grape is one of the main fruit species in Chile, since it is one of the
greater exporters of this fruit at world-wide level and leader in the South hemisphere.
The main disease that has affected in Chile the grape has been the Grey Mold, but
a new pathology denominated “Sour rot” has progressively appeared in the center-north
zone.
The etiology of this pathology indicates that “Sour rot” would be caused by yeasts,
molds and acetic bacterias, without to have determined the roles and mechanisms of
action of these microorganisms.
In a study carried out in the INTA, presence of acetic bacteria in a 52% of the sick
grapes was found and low recounts of filamentous molds were obtained in sick grapes,
suggesting revising the theories on a mainly fungous origin. Then, thet investigated about
the association of the main species of acetobacterias, being obtained that dominated
Acetobacter aceti, with a 71% of presence in sick grapes.
Until now there aren´t completely effective treatments that controls the
development of the sour rot. For that reason, the present study looks for an alternative
method, friendly with environment denominated “biological control”. Therefore, was
selected a group of 42 environmental strains native of grapevines, potentials biocontrols
with inhibiting activity against BGA (Bacillus subtilis) and Escherichia coli. Of these, there
were 14 that showed certain antagonistic activity against the acetic bacterias.
It wasn´t detected inhibiting activity in the cell-free supernadant, which suggests the
main mechanism of antagonism action; it would not be the production of antibiotic
metabolites.
In the 14 potential biocontrols strains was not found an important presence of
resistance to antibiotics (only resistance to the ampiciline and the eritromicine in 3 strains);
there was presence of plasmids in 4 strains (not related to the development of a multidrug
resistance); and all biocontrols belonged to the genus Bacillus with predominance of
Bacillus circulans and Bacillus licheniformis.
9
1.- INTRODUCCIÓN
La uva de mesa tiene una gran relevancia económica en Chile, ya que es a nivel
mundial uno de los mayores exportadores de uva de mesa. La uva de mesa chilena
encabeza con un 77% las exportaciones de esta variedad a nivel sudamericano y se ubica
en segundo lugar a nivel mundial, con un 24% (Odepa, 2006).
La uva de mesa (Vitis vinifera) es susceptible a varios organismos fitopatógenos
causantes de pudriciones en pre y postcosecha (Hewitt, 1988). Entre otros se han descrito
previamente en Chile: Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger, Alternaria
alternata, Cladosporium herbarum, Mucor racemosus y Penicillium expansum (Mujica y
Vergara, 1980, Latorre et al., 2002; Pszczolkowski et al., 2001, Auger y Esterio, 1999).
Pero desde hace algún tiempo, una nueva patología de la vid denominada
"Pudrición ácida", aparentemente asociada al progreso en el control químico de la Botrytis
cinerea, ha tomado especial relevancia. Esta enfermedad es cada vez más frecuente,
principalmente en regiones de climas más cálidos de la zona centro-norte, afectando
principalmente a la variedad Red Globe, y a partir de la temporada 1999-2000 en la zona
central de Chile causando pérdidas de importancia en variedades de mesa Thompson
Seedless, Ruby Seedless y en viníferas como Chardonnay y Sauvignon Blanc (Auger y
Esterio, 1999).
La pudrición ácida es conocida internacionalmente como "Sour Rot" y afecta
también a vides viníferas cultivadas en ltalia, Francia, España y Estados Unidos, donde
se la ha descrito como una afección provocada por un complejo de microorganismos,
entre los cuales destacan diversas especies de levaduras, bacterias y hongos, siendo las
dos primeras los agentes secundarios y los hongos los primarios.
De cualquier manera, la etiología de la pudrición ácida no está del todo
determinada y además las investigaciones acerca de esta enfermedad son escasas. En el
año 2003, se realizó un estudio en el INTA, que arrojó resultados que sugirieron que las
bacterias acéticas tienen una importante asociación con el desarrollo de esta fitopatología,
cuestionando la teoría que indicaba que la patología tenía un origen fungoso
fundamentalmente (Figueroa et al., 2003a).
En lo respectivo al control de la enfermedad, no se dispone hasta ahora de
tratamientos completamente eficaces o de métodos preventivos que eviten o permitan
aminorar el impacto económico asociado al desarrollo de la pudrición ácida. Se han
utilizado esencialmente tratamientos antifúngicos que habitualmente eran empleados para
10
Botrytis cinerea, pero éstos no tienen efectos sobre el o los agentes que causan esta
enfermedad.
La tendencia en el manejo de fitopatologías va acompañada con la tendencia cada
vez más acentuada a disminuir los costos de producción y los niveles de residuos de
pesticidas en los productos agrícolas. Por otra parte, el respeto por el medio ambiente y la
falta de productos químicos eficaces, sitúa al control biológico como una alternativa o al
menos un complemento del control químico (Durán y Cazorla, 1996).
En cuanto a la pudrición ácida, esta tendencia no ha estado ausente, ya que se ha
intentado su control con el desarrollo de algunos biocontroladores, como es el caso de
Lonlife, BSC 1000 y Serenade, los que han logrado disminuir la incidencia de la patología,
pero aún distan de controlarla totalmente. Por esto es que se hace indispensable
continuar con esta línea ecológica para hallar un biocontrol eficaz que permita evitar el
desarrollo de la pudrición ácida (Mendoza, 2005; Aguirre Hood y Pinilla, 2005; Soffia,
2005).
11
2.- OBJETIVOS
General:
•
Determinar actividad antibacteriana de potenciales biocontroles sobre bacterias
acéticas involucradas en la pudrición ácida de la uva de mesa de los cultivares Red
Globe y Thompson seedless.
Específicos:
1. Seleccionar de entre un grupo de cepas ambientales, aquellas con actividad
inhibitoria sobre bacterias acéticas in vitro.
2. Identificar a nivel de especie bacteriana las cepas seleccionadas como potenciales
biocontroles.
3. Evaluar resistencia a antibióticos en los biocontroles seleccionados.
4. Detectar plasmidios en las cepas con actividad antagonista a las bacterias
acéticas.
12
3.- MARCO TEÓRICO
3.1.- Uva de mesa en Chile
Chile se ha convertido a través del tiempo en uno de los más importantes
exportadores de uva de mesa a nivel mundial, y el líder en el hemisferio sur (Pérez, 1999).
Los competidores en los mercados más importantes donde Chile exporta su uva de mesa,
son Sudáfrica, Argentina, Australia, Namibia e India principalmente. Pese a que estos
países han mostrado una tendencia creciente, no logran ni siquiera sumando cada uno de
sus respectivos volúmenes de producción, alcanzar la exportación chilena (Del Solar et
al., 2002; Pérez, 1999).
En lo referido a los productores de uva en el hemisferio norte, Chile a diferencia de
ellos, se encuentra mucho más lejos de los mercados, por lo que la uva chilena debe
mantenerse con óptimas características de calidad y apariencia por un período extenso de
almacenaje refrigerado, durante su transporte y a la espera de su comercialización
(Pérez, 1999).
El papel de líder en los principales mercados del mundo, las rigurosas exigencias
de estos importadores y la desventajosa situación descrita en el párrafo anterior, hace que
permanentemente se desarrollen modernas tecnologías que intenten mejorar la calidad de
la uva de mesa chilena, de forma de presentarle al consumidor extranjero, un producto de
apariencia atractiva y de condiciones deseables.
3.2.- Principales enfermedades
La principal enfermedad que se ha desarrollado en Chile históricamente ha sido la
Pudrición Gris, ya sea en uvas viníferas como en uva de mesa. Esta patología se extiende
a lo largo de prácticamente todo el terreno cultivable del país y es generada por el hongo
Botrytis cinerea (Latorre et al., 2002).
La pudrición gris manifiesta su daño como piel suelta (slip skin) al comienzo de la
infección y termina en un compromiso total de la pulpa, produciendo ablandamiento,
desarrollo de micelio y coloraciones oscuras (Pérez, 1999). La enfermedad progresa por
contacto entre bayas enfermas y sanas formando nidos de Botrytis cinerea en los racimos
(Latorre et al., 2002).
13
Además se han señalado como enfermedades de importancia en cultivares de
Vitis vinifera, el moho verde ocasionado por Cladosporium herbarum, la pudrición negra
causada por Rhizopus stolonifer y el moho azul producido por Penicillium sp. (Latorre,
1992).
Sin embargo, se ha presentado otra patología de la vid cada vez más frecuente en
las últimas temporadas denominada “Pudrición ácida”. La pudrición ácida constituye un
importante problema que ha afectado severamente la producción de uva de mesa a partir
de la temporada 1999-2000 hasta ahora, y ha abarcado desde los climas cálidos de la
zona del norte chico (III y IV región) hasta las regiones centrales con climas templados,
provocando un deterioro notable e irreversible de bayas y racimos (Alvarez y Pinilla, 2000;
Auger y Esterio, 1999).
3.3.- Pudrición ácida
La enfermedad se caracteriza por la aparición de una importante oxidación de las
bayas, las que presentan una fragilidad progresiva en la cutícula y una pérdida de jugo,
escurriendo éste sobre la parte del racimo ubicado bajo la baya infectada. Otros síntomas
reconocibles son la aparición de un color café de diversa intensidad, y la brillantez del
racimo producto del jugo desprendido por las uvas (Figura 1). Además, se puede
identificar por un fuerte olor a ácido acético (olor a vinagre) y por presencia de mosquitos
del vinagre o Drosophila sp. Eso si se utiliza sólo la percepción sensorial, ya que si se
dispone de metodología más avanzada se podría advertir una reducción de acidez fija,
una pérdida de ácido galacturónico, un aumento de grados Brix, glicerol, ácido glucónico y
un nivel de ácidos volátiles más allá de los límites considerados como aceptables (Auger y
Esterio, 1999; Bisiach et al., 1986; Guerzoni y Marchetti, 1987; Zoecklen et al., 2000).
Figura 1: Pudrición ácida en uva de mesa.
14
Los daños provocados por la pudrición ácida se relacionan directamente con la
calidad y condición de las bayas y racimos, los que pierden parcial o totalmente su valor
para la vinificación, dado que se produce una reducción en los niveles de nitrógeno
amoniacal, tiamina (vitamina B1) y piridoxina (vitamina B6) para las levaduras (Zoecklen et
al., 2000).
La pudrición ácida se manifiesta en forma explosiva casi exclusivamente en la fase
de maduración más avanzada de la uva, es decir en períodos de pinta y precosecha, lo
que hace muy difícil la evaluación de la dinámica del proceso de infección (Alvarez y
Pinilla, 2000; Auger y Esterio, 1999).
La etiología de la pudrición ácida es muy ambigua y controversial, además existen
escasos estudios e investigaciones acerca del tema. En éstos se afirma que los
responsables de esta patología son hongos, levaduras y bacterias acéticas, sin
determinar claramente los roles y mecanismos de acción de estos microorganismos
(Bisiach et al., 1986; Guerzoni y Marchetti, 1987; Latorre, 1992).
De acuerdo a los estudios más recientes de Latorre et al. (2002) y Franck (2003),
los microorganismos más importantes relacionados a la pudrición ácida aparte de la B.
cinerea, corresponderían a A. niger, C. herbarum, Cladosporium cladosporoides,
Alternaria alternata, Mucor racemosus, Penicillium expansum y R. stolonifer., También
detectaron la presencia de otros microorganismos como levaduras y bacterias acéticas en
cantidades significativas (Muñoz, 2004; Franck, 2003; Latorre, 1992).
Según Latorre (1992), durante la pudrición ácida se desarrolla una secuencia
sintomatológica en la que participan varios microorganismos fitopatógenos incluyendo
hongos filamentosos, levaduras y bacterias acéticas. En la Figura 2, se presenta una
secuencia de agentes que se han asociado al desarrollo de esta enfermedad. Son
indispensables los daños en las bayas, los que incluso se pueden deber inicialmente a la
acción de B. cinerea, motivo por el cual se le considera factor predisponente, al igual que
insectos como los trips y las avispas. Una vez producido un daño (macro o microscópico)
es posible que sean primeramente invadidas por algunos de los hongos filamentosos,
indicados como patógenos primarios en la Figura 2. Posteriormente pueden actuar,
separada o conjuntamente, ciertas especies de levaduras y bacterias (Latorre et al., 2002;
Auger y Esterio, 1999).
15
Figura 2: Diagrama con la secuencia de patógenos asociados a la pudrición ácida de la
vid propuesta por Latorre. Rs: Rhizopus stolonifer; An: Aspergillus niger; Pe: Penicillium
sp.; Ka: Kloeckera apiculata; Cs: Candida stellata; Glu: Gluconobacter; Ace: Acetobacter.
Auger y Esterio (1999) describen un comportamiento sucesivo de dos tipos de
microorganismos, para los cuadros de pudrición en vid. Se refieren a un tipo como
primario o patógeno, que sería el que inicia la infección en forma directa (mencionando B.
cinerea, A. alternata, C. herbarum y Phomopsis viticola) y a otro tipo como secundario, y
que sería aquel que puede actuar solamente después que actuase el primario o
aprovechando algún daño o herida, señalando dentro de este grupo a A. niger, Penicillium
sp., Rhizopus sp., varias levaduras y bacterias acéticas.
Otras investigaciones de carácter fitopatológico, se realizaron en el lnstituto de
Investigaciones Agropecuarias (INIA). Estas señalan que la gran mayoría de los
aislamientos obtenidos en tejidos infectados de las bayas, eran correspondientes a
levaduras de las especies Kloeckera apiculata, Saccharomycopsis vini, Hanseniaspora
uvarum, Candida sp. y Pichia sp. y a bacterias acéticas como Gluconobacter sp., Bacillus
sp.y Acetobacter sp.
Hewitt (1974) asocia los síntomas de pudrición ácida con la presencia de
levaduras y de bacterias del género Acetobacter, en uvas de madurez ya avanzada y que
jamás se presenta en bayas de un contenido de azúcar menor al 12%.
16
Experimentalmente se ha determinado que, de un total de 78 inoculaciones
artificiales de cepas de levaduras mediante heridas en bayas maduras, hubo 17 cepas
(21,8%) que reprodujeron en forma rápida y completa los síntomas típicos de la pudrición
ácida; 25 cepas (32%) que desarrollaron síntomas limitados y 36 (46,1%) que no
desarrollaron síntomas (Oliva, et al., 1999).
Por otra parte, de 18 cepas de bacterias acéticas inoculadas, 6 (33,3%)
reprodujeron los síntomas de la enfermedad, 5 (27,8%) desarrollaron síntomas dudosos o
inciertos y 7(38,9%) no provocaron alteración de las bayas inoculadas. Las levaduras y
bacterias inoculadas en bayas intactas, sin heridas, no provocaron alteración después de
su inoculación. En conclusión se ha señalado a las bacterias acéticas como los mayores
responsables de brotes de la fitopatología en estudio, sobretodo si se trata de años
lluviosos y en la etapa de maduración de las bayas (Oliva et al., 1999; Figueroa et al.,
2003a).
Según relaciones filogenéticas con base en la comparación de secuencia
nucleotídica del gen ribosomal 16S con el de muchas otras bacterias, las bacterias
acéticas se situarían dentro de las proteobacterias (Fuentes et al., 2003).
3.4.- Métodos de control de pudrición ácida
Los compuestos derivados del cobre se han empleado para atacar fitopatologías
que ocurren en la vid, esencialmente la Pudrición Gris. Además se ha utilizado para
combatir enfermedades de las uvas, compuestos tales como dinitroanilidas (como el
diclorán),
bencimidazoles
(como
el
benomilo),
ptalamidas,
anilinopirimidinas,
estrobilurinas e hidroxianilidas, entre otros. Dichos compuestos químicos han logrado en
algunos casos, ejercer un control total sobre algunos de los microorganismos involucrados
en la pudrición ácida, especialmente en hongos filamentosos como el R. stolonifer, A.
niger, C. herbarum o P. expansum (Franck, 2003).
En Chile, en la actualidad, se recomiendan para la pudrición ácida productos
como el Phyton-27 y Botran 75 WP. Tanto el Phyton 27, cuyo ingrediente activo es el
sulfato de cobre pentahidratado, como el Botran 75 WP, cuyo ingrediente activo es
diclorán, son productos agroquímicos que se han utilizado por varios años en productores
de uva de mesa para lidiar contra las enfermedades que atacan los patronales (Cartilla
Informativa Phyton-27 y Riveros, 2005).
17
En el último tiempo se ha impulsado el desarrollo de controladores biológicos
para cuadros fitopatológicos de uva de mesa en Chile. El primero en desarrollarse fue el
biocontrolador Serenade, el que es un fungicida biológico basado en la acción de
Bacillus subtilis strain QST 713 (Soffia, 2005).
Tambien está, Lonlife que es un fungicida-bactericida cuyo ingrediente activo es
Citrex, una mezcla de ácido ascórbico, ácido cítrico, tocoferoles, ácido palmítico, ácido
esteárico, glucosa, manosa, péptidos y gliceroles, cuyo modo de acción es la alteración
de la permeabilidad de las membranas, afectando también los procesos respiratorios
(Mendoza, 2005).
BC 1000 es el último biocontrolador que se ha probado contra la pudrición ácida,
tiene como ingrediente activo, extracto de semilla y pulpa de toronja (ácidos orgánicos
más bioflavonoides). El modo de acción de este biocontrolador es por contacto,
provocando alteración de la membrana celular e inhibición de la respiración celular del
patógeno (Aguirre Hood y Pinilla, 2005)
Pese a que estos productos de carácter natural y ecológico han dado resultados, en
ciertas enfermedades de la uva, distan aún de convertirse en una opción de control total
para la pudrición ácida. Es por esto que se ha convertido en una ardua tarea encontrar un
método de control probado contra esta enfermedad, que compatibilice una óptima
respuesta contra la enfermedad, protección ambiental y una máxima inocuidad en el
producto final (Franck, 2003; Thomson, 1988).
3.5.-Biocontroles.
El control biológico busca mantener, a través de ciertas prácticas, un equilibrio en
el agro-ecosistema, de forma tal de proteger a la planta, para que no sufra daños
significativos en presencia del patógeno (Grigoletti Jr. et al., 2000).
Desde una perspectiva se acepta que: “El control biológico es el control de los
patógenos por uno o más organismos, logrado de forma natural o a través de la
manipulación del medio ambiente, huésped o antagonistas, o por la introducción masiva
de uno o más antagonistas”. Por otra parte, se encuentra el concepto clásico que se
restringe a que “Control biológico es el uso deliberado de un organismo para controlar a
otro”. Sin embargo, y en relación a este último concepto, es necesario considerar que las
interacciones de múltiples variables presentes en el medio ambiente pueden modificar las
18
interacciones entre los microorganismos y su entorno, muchas de las cuáles pueden
favorecer o impedir un control biológico efectivo (Pérez, 2005).
En un sentido amplio y según la definición de Cook y Baker (1983), el control
biológico involucraría todas aquellas prácticas tendientes a disminuir la incidencia de
enfermedades excluyendo el control químico.
Para ser más eficaces, los antagonistas o controladores biológicos deben ser:
•
Genéticamente estables.
•
Efectivos a bajas concentraciones.
•
Fáciles de reproducir en medios de cultivo económicos.
•
Efectivos para controlar un amplio rango de patógenos.
•
Preparados para ser distribuidos en una forma fácil.
•
No tóxicos para los seres humanos.
•
Resistentes a los pesticidas.
•
Compatible con otros tratamientos (químicos y físicos).
•
No patogénico para las plantas.
•
Activos contra el patógeno de múltiples formas (Díaz y Pons de Labrador,
1974).
Los microorganismos antagónicos usualmente provienen de la microflora
autóctona o del entorno mismo del ser afectado, lo que permite que no existan
desequilibrios dinámicos en la naturaleza al emplearlo. Esto último es el principal atributo
en el empleo de biocontroles, ya que no sugiere ninguna modificación artificial, tal como
los residuos de los químicos, ni probable alteración a las características naturales del
organismo tratado (Biocontrols Portal; Guerrero, 2004).
Hasta el momento, se han descrito varios mecanismos de acción de los
antagonistas para controlar el desarrollo de patógenos. Algunos de estos son
competencia por espacio o por nutrientes, interacciones directas con el patógeno
(parasitismo y lisis enzimática), inducción de resistencia y secreción de sustancias
antibióticas.
La competencia puede definirse como el comportamiento desigual de dos o más
organismos ante un mismo requerimiento, siempre y cuando la utilización del mismo por
uno de los organismos reduzca la cantidad disponible para los demás. Un factor esencial
para que exista competencia es la escasez o limitación de un elemento porque si hay
19
exceso no hay competencia (Fernández-Larrea, 2001). Hasta el momento este fenómeno
ha sido posible apreciarlo principalmente en hongos y levaduras y en Phytium por
Pseudomonas fluorescens en un medio con falta de hierro (Vero-Méndez y Mondino,
1999).
Otro importante mecanismo descrito para el control biológico es la interacción
directa entre los antagonistas y los patógenos, esto es el parasitismo y la predación. El
parasitismo consiste en la utilización del patógeno como alimento por su antagonista y
puede ser definido como una simbiosis antagónica entre organismos. Generalmente se
ven implicadas enzimas extracelulares tales como quitinasas, celulasas, beta-1-3glucanasas y proteasas, las que lisan las paredes de las hifas, conidios o esclerotos
(Melgarejo et al., 1989; Ulhoa, 1996). En cambio, en la predación el antagonista se
alimenta de materia orgánica entre la cual ocasionalmente se encuentra el patógeno. No
ha sido un mecanismo de acción muy importante en el desarrollo de agentes de
biocontrol. Los reportes más conocidos citan la presencia de amoebas en suelos
supresores de enfermedades las cuales se alimentan de las hifas de hongos patógenos
entre otras fuentes de alimento (Campbell, 1989).
Otra forma de antagonismo lo constituye la inducción de resistencia en vegetales.
Así, se puede inducir resistencia en productos cosechados mediante el uso de diferentes
inductores como bajas dosis de luz ultravioleta, compuestos naturales de las plantas
como quitosano (producto de la deacetilación de la quitina), y también mediante el uso de
microorganismos antagonistas. Se ha demostrado que levaduras utilizadas para el
biocontrol de patógenos de postcosecha además de competir por espacio y nutrientes son
capaces de inducir resistencia en la planta. Tal es el caso de Pichia guillermondii (US-7),
la cual ha mostrado ser inductora de la producción de fitoalexinas en frutos cítricos
(Wilson y Wisniewski, 1989).
La antibiosis, se refiere a la producción por parte de un microorganismo de
sustancias tóxicas para otros microorganismos, las cuales actúan normalmente en bajas
concentraciones. La antibiosis es el mecanismo de antagonismo entre microorganismos
más estudiado (Guerrero, 2004).
Uno de los géneros más estudiados en el tema de los biocontroles es el género
Bacillus sp. El ejemplo más representativo dentro de las especies de los Bacillus sp. lo
constituye el B. subtilis, que si bien es cierto, no se conoce con completa certeza su
mecanismo antibacteriano y antifúngico, se han reportado evidencias de producción de
metabolitos antibióticos tales como la surfactina, la iturina A, la subtilina, la subtilisina, la
20
micosubtilina y la bacitracina entre otras (Bais et al., 2004; El-Hassan y Gowen, 2006;
Gong et al., 2006; Korsten y Jager, 1995; Leclere et al., 2005; Kilian et al., 2000; Bacon et
al., 2001). Además de su reconocida importancia como biocontrol, el B. subtilis se ha
caracterizado últimamente como la única cepa capaz de matar a microorganismos de su
misma especie, pasando a ser conocida esta conducta como el “canibalismo del subtilis”
(González-Pastor, 2006).
Otro caso representativo de este género lo constituye el Bacillus thuringiensis, el
que no sólo previene los daños representados por microorganismos, sino que también
posee propiedades sobre algunos tipos de insectos nocivos para la agricultura. Este
produce un cuerpo paraesporal o cristal de proteína, conocido como delta-endotoxina;
estos cristales se forman durante la esporulación y tienen actividad tóxica para larvas de
insectos (Shieh, 1988). La mayor parte de los reportes relacionados con B. thuringiensis
tiene que ver con las proteínas insecticidas Cry y Cyt, fuera de reportarse 5 bacteriocinas
producidas por diferentes especies de B. thuringiensis (Paik et al., 1997; Cherif et al.,
2001; Cherif et al., 2003). Las bacteriocinas de B. thuringiensis tienen además actividad
contra
algunas
monocytogenes,
bacterias
patógenas
Pseudomonas
presentes
aeuroginosa,
en
alimentos
Bacillus
cereus
como
Listeria
y
Bacillus
Weihenstephanensi (Barboza-Corona et al., 2004).
Además se han reportado otros casos estudiados, donde figuran Bacillus
mojavensis, B. mycoides, B. licheniformis, B. coagulans, B. amyloliquefaciens, B. cereus,
B. pumilus, B. polymixa, B. circulans y Brevibacillus brevis (Oscáriz et al., 2006; Veloz et
al., 2003; Bizani y Brandelli, 2002; Bais et al., 2004; Foldes et al., 2000; Leifert et al.,
1995; Yoshida et al., 2001; Alam et al., 1996; Gong et al., 2006; Basha y Ulaganathan,
2002). A la mayoría de estos biocontroladores se les ha descrito como secretores de
metabolitos extracelulares de diferente composición (especialmente peptídica), aunque en
un par de casos se ha indicado que la competición por nutrientes podría ser el mecanismo
de inhibición (Korsten y Jager, 1995). La secreción de estos compuestos antibióticos se
ha relacionado con las condiciones de pH y concentraciones de determinadas substancias
en los medios de cultivo, especialmente de peptona. Por esto es que, se recomienda un
medio enriquecido para la optimización de la producción de antibióticos en ciertos
ensayos de antagonismos (Leifert et.al, 1995).
En general, los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad
de estos es una característica importante para su selección como agentes de control
biológico. Si el antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo
21
de resistencia en el patógeno. Este riesgo de resistencia también se reduce mediante el
uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo de acción.
El uso de biocontroles para prevenir o combatir la pudrición ácida pretende convertirse en
una solución inocua para esta fitopatología, ya sea por si sola, o en acción sinergista con
pequeñas dosis de los agentes empleados en la actualidad. De este modo, se podría
contar en la agricultura, con un método de control biológico efectivo para lidiar con el o los
agentes asociados a esta nueva enfermedad, que afecta de forma progresiva a las dos
especies de uva de mesa de exportación con mayor trascendencia económica.
3.6.- Métodos de evaluación de biocontroles in vitro
El antagonismo microbiano se puede manifestar de distintas formas. En los
estudios preliminares, las pruebas de antagonismo se realizan generalmente utilizando
medios de cultivo sólidos e implican la detección de la inhibición del crecimiento que
ejerce el microorganismo analizado (activo) en el microorganismo indicador (pasivo)
(Tagg et al., 1976).
En la prueba directa, el microorganismo a evaluar y la cepa indicadora se
desarrollan al mismo tiempo. Una de las pruebas directas más sencillas es la prueba de la
gota y cuyo empleo está muy difundido (Daeschel y Klaenhammer, 1985; Gonzalez y
Kunka, 1987; Geis et al., 1983; Raccach et al., 1989; Spelhaug y Harlander, 1989;
Daeschel et al., 1990). Para ello, una gota del cultivo del microorganismo problema se
deposita en un medio de cultivo sólido previamente inoculado con el microorganismo
indicador. Una de las variantes de este procedimiento, emplea pocillos excavados en el
medio sólido, que se rellenan con una cantidad conocida del cultivo del microorganismo
problema (Sabine, 1963; Tagg y Mc Given, 1971; Tagg et al., 1976; Silva et al., 1987;
Harris et al., 1989; Rodríguez et al., 1989). Otra modificación de gran utilidad, consiste en
sembrar por picadura los microorganismos a estudiar en placas cuya superficie se ha
sembrado previamente con el microorganismo indicador (De Klerk y Smith, 1967;
Gagliano y Hinsdill, 1970; Davey y Richardson, 1981; Barefoot y Klaenhammer, 1984).
Este último método ha sido aplicado en el primer screening de actividad de los
biocontroladores en el presente estudio, y ha permitido evaluar la capacidad antagónica
de dichas cepas frente al crecimiento de bacterias acéticas, dado que se daban las
condiciones para que ambos tipos de microorganismos pudieran tener un pH adecuado y
las condiciones aeróbicas suficientes como para crecer en el mismo medio de cultivo.
22
Además de los mencionados anteriormente, existe otro método muy empleado
para investigar bacterias bacteriocinogénicas, que consiste en colocar los sobrenadantes
en papeles de filtro o sensidiscos estériles. Los discos de papel, impregnados con el
sobrenadante de interés, se depositan en placas
de agar sembradas con el
microorganismo indicador (Shahani et al., 1976; Ferreira y Gillily, 1988) o bien se deposita
en los filtros una cantidad determinada de los sobrenadantes (Abdel-Bar et al., 1987;
Bhunia et al., 1987; Bhunia et al., 1988; Rodríguez et al., 1989). Esta segunda opción ha
sido utilizada en este trabajo, con el fin de observar y comparar la actividad inhibidora de
los diversos sobrenadantes analizados.
Diversos microorganismos han contribuido al control biológico de patógenos de
plantas, pero la mayoría de los esfuerzos de la investigación y desarrollo tecnológico se
han enfocado en tres géneros; Pseudomonas, Trichoderma y Bacillus (Brian et al., 2003).
Sobre este último género se han escrito numerosas investigaciones que describen
mecanismos de antagonismo con diversos géneros de bacterias y también de hongos y
levaduras (Foldes et al., 2000). Además, se ha descrito como un género con ciertas
ventajas relativas sobre otros organismos dado que puede formar endosporas y de esa
manera puede tolerar condiciones osmóticas, de temperatura y de pH extremas (Basha y
Ulaganathan, 2002).
Los Bacillus en general están clasificados dentro de los microorganismos
aeróbicos o anaeróbicos facultativos y productores de catalasa. Las células vegetativas
de Bacillus son de bordes rectos con extremos cuadrados o redondos. Pueden agruparse
en cadenas o encontrarse solas. La espora, por su parte, puede ubicarse central, terminal
o subterminalmente y ésta puede ser cilíndrica, oval o redonda. La mayoría de los Bacillus
son móviles y morfológicamente los Bacillus típicos forman colonias largas y planas (Holt
et al., 1994; Ballows et al., 1991; Murray et al., 1995; Murray et al., 1999).
23
4.- MATERIALES
EQUIPOS:
•
Autoclave
•
Horno - Pasteur
•
Microscopio
•
Estufa de incubación de 37 °C
•
Estufa de incubación de 30 °C
•
Estufa de incubación de 50 °C
•
Agitador
•
Vortex
•
Centrifuga
•
Centrifuga para tubos Eppendorf refrigerada
•
Cámara de electroforesis
•
Trans-iluminador
•
Espectrofotómetro
•
Balanza analítica
•
Balanza granataria
•
Fuente de poder
•
Refrigerador
•
Congelador
MATERIALES:
•
Cepas de bacterias acéticas, de referencia y potenciales biocontroles aislados.
•
Portaobjetos.
•
Asas.
•
Placas petri.
•
Vasos precipitados.
•
Probetas
•
Tubos Eppendorff
•
Botellas estériles
24
•
Matraces
•
Pipetas
•
Micropipetas
•
Papel filtro
•
Tubos de ensayo estériles
•
Tubos de espectrofotómetro
•
Pro-pipetas
•
Puntas estériles
•
Guantes
•
Jeringas
•
Agujas estériles
•
Filtros de membrana
•
Portafiltros
•
Gotarios
•
Termómetro
•
Mechero
MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO:
•
Agar Schram, pH 5
•
Agar GyC, pH 4,5.
•
Agar WL, pH 5,0.
•
Agar Nutritivo, pH 7,0.
•
Agar Mueller-Hinton normal(pH 7,2) y con pH modificado (pH 6,0)
•
Caldo Luria Bertani, pH 7,0.
•
Caldo Schram, pH 5,0.
•
Caldo Nutritivo, pH 7,0.
•
Caldo Mueller-Hinton, pH 6,0.
•
Caldo Agua peptonada tamponada, pH 7,2.
REACTIVOS Y MISCELÁNEOS:
•
Cristal violeta
25
•
Lugol
•
Alcohol
•
Safranina
•
Aceite de inmersión
•
Gel de agarosa al 1%
•
Ácido acético
•
Cloroformo
•
Fenol
•
Alcohol isoamílico
•
SDS (Sodio-dodecil-sulfato)
•
Cloruro de sodio
•
Acetato de potasio
•
Buffer TAE (tris – acetato – EDTA)
•
Solución de EDTA
•
Solución de Tris
•
Bromuro de etidio
•
Buffer carga (glicerol y azul bromofenol)
•
Ladder de 250 pb
•
Agua destilada
•
Suero fisiológico
•
Agua bidestilada
•
Lizosima
•
Sacarosa
•
Ácido Clorhídrico
26
5.- METODOLOGÍA
El estudio presente tuvo como finalidad seleccionar desde un grupo de 187 cepas
obtenidas de la microbiota nativa de uvas sanas y parras, aquellas que pudieran tener
alguna actividad inhibitoria contra bacterias acéticas implicadas en el desarrollo de la
pudrición ácida. Todas las cepas fueron obtenidas del cepario del laboratorio de
microbiología del INTA.
Una vez hecha esta selección, se continúa el estudio con las cepas escogidas,
observando y analizando variables mediante las cuáles actúan, analizando su
susceptibilidad a antibióticos, efectuándoles detección de plasmidios e identificando la
especie a la cual pertenecen.
5.1.- Determinación de actividad antibacteriana de potenciales
cepas biocontroles para Acetobacter aceti.
Los biocontroles potenciales utilizados fueron cepas pertenecientes a la
microflora nativa de uvas sanas, hojas o sarmientos de parronales de las regiones IV, V,
Metropolitana y VI, y correspondientes a las variedades Red Globe y Thompson
Seedless. A estas 187 cepas ambientales aisladas desde el entorno natural de las vides,
se les enfrentó anteriormente ante dos cepas blanco (B. subtilis BGA y E. coli ATCC
25922) para verificar su capacidad antibiótica ante una cepa Gram positiva y otra Gram
negativa. En dicho screening se obtuvo como resultado que, 42 cepas manifestaron
alguna actividad antagónica contra dichas bacterias. Estas 42 cepas bacterianas son
consideradas como potenciales biocontroles ante las bacterias acéticas implicadas en el
desarrollo de la pudrición ácida.
Por otra parte, las cepas blanco del presente estudio correspondieron a bacterias
acéticas que pertenecían a la especie A.aceti, y que provenían de bayas de las
variedades Thompson Seedless y Red Globe con indicios de desarrollo de pudrición
ácida. El detalle de las bacterias acéticas empleadas, se encuentra a continuación:
1)
Ac 102-5: Acetobacter aceti, proveniente de cosecha, TS, Uva
enferma, V región.
2)
Ac 148-1: Acetobacter aceti, proveniente de cosecha, TS, Uva
enferma, Región Metropolitana.
27
3)
Ac 165-5: Acetobacter aceti, proveniente de cosecha, RG, Uva
enferma, V región.
4)
Ac 175-2: Acetobacter aceti, proveniente del remanente, TS, Uva
enferma, V región.
5)
Ac 233-6: Acetobacter aceti, proveniente del remanente, TS, Uva
enferma, Región Metropolitana.
* RG: Red Globe, TS: Thompson Seedless
Estas bacterias fueron aisladas e identificadas en una fase previa al desarrollo de
este estudio, por el Laboratorio de Microbiología del INTA. La identificación se llevó a
cabo
realizando pruebas
bioquímicas,
y confirmada
posteriormente utilizando
metodología molecular rápida, Nested-PCR (Reacción en cadena de Polimerasa). Para
la diferenciación de géneros y especie de bacterias acéticas se empleó RFLP
(Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción).
Tanto las cepas blanco, como los biocontroles probables, se mantuvieron a -20ºC
en el cepario del laboratorio y se subcultivaron para los ensayos de inhibición. Las cepas
de bacterias acéticas fueron recuperadas en agar Schram a pH 5, incubado a 37°C por 48
hrs., mientras que los biocontroles en agar nutritivo e incubados a 30°C por 24 hrs.
5.1.1.- Métodos de evaluación de actividad antagónica.
Con el objetivo de obtener los mejores resultados, se ensayaron tres métodos
diferentes en la determinación de actividad antibacteriana. Estos fueron:
a) Método en placa no selectiva con doble capa (PNSD): El ensayo se realizó, a
partir de una placa Petri con 15 mL de agar Mueller-Hinton solidificado, sobre el cual se
agregó 5 mL de agar Schram semisólido (0,8% agar- pH 5) inoculado con A. aceti
(Ac 102-5) de una suspensión en suero fisiologico (50 µL) en una concentración de 106
u.f.c./mL. Luego, sobre esta capa de soft agar, se inocularon 10 potenciales biocontroles
mediante una picadura con asa estéril de cultivo sólido de 24 hrs. La placa se incubó a
30°C por 7 días. El mismo procedimiento se realizó con las cepas Ac 130-2 y Ac 1091, empleando los medios de cultivo semisólidos GYC (pH 4,5) y WL (pH 5,0). Se midió la
actividad antibacteriana mediante la aparición de halos de inhibición.
b) Método en placa selectiva (PS): Sobre una placa de 15 mL de agar
28
Schram (1,2% agar - pH 5,0) se diseminó en césped una alícuota de cultivo de A.
aceti (50 µL) en una concentración 106 u.f.c./mL. Luego se aplicó un spot de 5 µL de
cada potencial biocontrol, proveniente de un caldo nutritivo 24 hrs., 30ºC (fase
exponencial de crecimiento luego de 24 hrs.). La placa se incubó en aerobiosis a 30°C por
7 días. Se midió la actividad antibacteriana mediante la aparición de halos de inhibición.
c) Método del pinchazo en placa no selectiva a diversos pH con agitación:
Para evaluar la actividad antagónica se preparó una placa Petri con 15 mL de agar
Mueller-Hinton con pH 5,6 y 7. Sobre dicha placa se diseminó en césped una alícuota (5
µL) de un cultivo líquido de A. aceti a una concentración de 106 u.f.c./mL incubado por 48
hrs. a 37°C con agitación de 150 rpm. Posteriormente se inoculó el potencial biocontrol
mediante una picadura con asa estéril, de un cultivo sólido de 24 hrs. a 30°C. La placa
se incubó en aerobiosis a 30°C por 7 días. Se midió la actividad antibacteriana mediante
la aparición de halos de inhibición.
El único método que otorgó resultados de inhibición fue este último, al utilizar agar
Mueller-Hinton a pH 6 para el crecimiento de los biocontroles probables y caldo MuellerHinton con el mismo pH para el crecimiento de las bacterias acéticas. Conforme a estos
hechos, se eligió dicha metodología para evaluar la actividad antibacteriana de todos los
potenciales biocontroles incluidos en el estudio.
5.1.2.- Ensayos en sobrenadante libre de células
Se traspasaron los biocontroles desde un cultivo sólido a un caldo nutritivo, y se
incubaron durante 24 hrs. con agitación constante (130 rpm) a 37°C, para optimizar la
producción de bacteriocinas (Bizani y Brandelli, 2002). Posteriormente se tomó una alícuota
de 1 mL de cultivo y se llevó a centrifugación durante 10 minutos a 12.000 rpm. Se extrajo el
sobrenadante con una jeringa estéril y se filtró con membranas Milipore de 0,2 µm. Desde
este líquido filtrado se tomó una alícuota de 30 µL, que se aplicaron sobre un sensidisco
dispuesto sobre un césped de A. aceti y se observó la actividad antibacteriana según el
Método de Kirby-Bauer (Bauer et al., 1996) modificado. Al pellet obtenido de la
centrifugación, se le hizo un tratamiento de secado en la cámara de seguridad biológica
para posteriormente, inocularlo sobre la misma placa donde se aplicó el líquido filtrado, pero
en el extremo opuesto. La placa se incubó en aerobiosis a 30°C por 5 días. Se hizo lo
mismo, utilizando caldo de agua peptonada tamponada para observar si la concentración de
peptona influía en el desarrollo de bacteriocinas.
29
Se evaluó también la actividad antibacteriana mediante el método de difusión de
pozos modificado de Paik et al. (1997), haciendo pozos de 6 mm de diámetro y
depositando 100 µL de sobrenadante filtrado. En este ensayo, también las cepas
biocontroles se hicieron crecer en caldo nutritivo y caldo de agua peptonada tamponada,
para luego ser centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos a 4 ºC.
Por su parte, la bacteria testigo fue crecida en Mueller-Hinton a pH 6 a 37 ºC por
24 hrs. Se vertieron 25 mL del agar con la bacteria en placas Petri, se dejó solidificar y se
hicieron pozos de 6 mm de diámetro. Se agregaron de 100 µL de muestra de biocontrol
incubado como se indicó previamente. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 5 días
y se observó la formación de halos de inhibición alrededor de los pozos (Vázquez et al.,
2005).
5.2.- Prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
La determinación de la susceptibilidad antimicrobiana se realizó por el método de
difusión en discos en agar (Kirby-Bauer), para lo cual se utilizaron 9 compuestos
antimicrobianos, los cuales fueron testeados mediante un ensayo de validación ante
Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 como cepas
controles (Bauer et al., 1966).
Para la preparación del inóculo, se partió de un cultivo puro en placas de agar
Mueller-Hinton a pH 7,2-7,4 el cual fue inoculado durante 18-24 hrs. a 35ºC. Se tomaron
de 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual morfología y se preparó una suspensión en 3
mL de solución de suero fisiológico, tocando la parte superior de cada colonia. Se
procedió a ajustar directamente la suspensión bacteriana, hasta alcanzar la turbidez del
estándar equivalente al 0,5 de la escala de Mac Farland. Para facilitar este procedimiento
los tubos fueron observados contra un fondo blanco con una línea negra como contraste
(Matsen, 1983; Bauer et al., 1996; Instituto Nacional de Enfermedades infecciosas, 2003;
National Comitte for Clinical Laboratory Standars. 2000)
Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo, se procedió a inocular en
placas de agar Mueller-Hinton con un hisopo estéril, la siembra se realizó en tres
direcciones asegurando una completa y homogénea distribución del inóculo en toda la
superficie del medio de cultivo.
Posteriormente se colocaron los discos sobre la superficie del agar, con una pinza
estéril, conservando la distancia establecida entre los discos, más o menos 24 mm y la
30
distancia del borde de la placa al disco de 14 mm. Se colocaron de 4 a 5 discos de
antimicrobianos por placas (Matsen, 1983; Bauer et al., 1996; Instituto Nacional de
Enfermedades infecciosas, 2003; National Comitte for Clinical Laboratory Standars. 2000).
S (sensible)
Antibiótico
Concentración
de disco
(µg)
Diámetro
(mm)
Ampicilina
10
17 y más
Cefalotina
30
18 y más
Tetraciclina
30
19 y más
Eritromicina
15
23 y más
Estreptomicina
10
15 y más
Acido Nalidixico
30
19 y más
Gentamicina
10
15 y más
Cloramfenicol
30
18 y más
Ciprofloxacino
5
21 y más
Tabla 1: Tabla de criterio de susceptibilidad a antibióticos.
I (Intermedio)
R (Resistente)
Diámetro (mm)
Diámetro (mm)
15 -16
15 - 17
15 - 18
14 - 22
12 - 14
14 -18
13 - 14
13 - 17
16 - 20
14 y menor
14 y menor
14 y menor
13 y menor
11 y menor
13 y menor
12 y menor
12 y menor
15 y menor
Las placas se incubaron invertidas, a 37ºC por 16-20 hrs., a 35ºC y en ambiente
aeróbico. Se examinó y verificó la pureza del inóculo, que el crecimiento fuera confluyente
y que las zonas de inhibición estuvieran uniformemente circulares. Posteriormente se
midieron los diámetros de las zonas de inhibición para cada disco, teniendo en cuenta que
la zona no mostrara desarrollo obvio a ojo desnudo. La interpretación de la lectura fue
llevada a cabo utilizando la Tabla de criterio de susceptibilidad para enterobacterias
(NCCLS) (Tabla 1); comparando los valores de los halos de inhibición obtenidos para
todas las drogas en cada una de las cepas con los valores de la tabla, así se clasificaron
en sensibles, intermedias o resistentes frente a los antimicrobianos (Matsen, 1983; Bauer
et al., 1996; National Comitte for Clinical Laboratory Standard, 2000).
Se consideraron multidrogorresistentes (MDR) a las cepas con resistencia a tres o
más antimicrobianos de diferentes clases (Matsen, 1983; Bauer et al., 1996; National
Comitte for Clinical Laboratory Standard, 2000).
31
5.3.-Detección de plásmidos.
5.3.1.- Extracción y aislamiento de ADN plasmídico.
Para realizar la extracción del ADN plasmídico, se tuvieron en cuenta las 14 cepas
que mostraron alguna actividad antibacteriana contra los A. aceti. Se utilizó el método de
extracción y aislamiento rápido de ADN plasmídico de Voskuil y Chambliss (1993), para el
cual se inocularon las cepas en caldo LB (Luria Bertain) incubándose toda la noche a
37ºC. Luego se tomaron 10 mL de cultivo y se centrifugaron 10000 rpm a 4°C durante 5
minutos, removiendo el sobrenadante por aspiración.
Los pellets se resuspendieron, agitando por Vortex, en 200µL de solución SET
(25% de sacarosa, 50 mM de Tris-HCl (pH 8) y 50 mM de EDTA). Se agregó a esta
solución 25 mg de lisozima por cada mL de SET y se transfirieron a un tubo Eppendorf
incubándolos por 10 minutos a 37°C. Se le adicionó posteriormente 200 µL de solución
NaOH-SDS fresca (0,2 N - 1% SDS) y se invirtió el tubo en repetidas ocasiones hasta que
la suspensión estuviese clara.
A la suspensión aclarada se le agregó 350 µL de una solución de acetato de
potasio (3M K+ - 5M de acetato) y se agitó por Vortex durante 10 segundos a velocidad
media. La suspensión se centrifugó por 5 minutos a 12000 rpm y se tomaron 750 µL de
sobrenadante para traspasarlos a un nuevo tubo Eppendorf.
Este sobrenadante se extrajo con 650 µL de solución fría de Fenol-CloroformoAlcohol Isoamílico (25:24:1) invirtiendo el tubo reiteradamente para que se produjera la
extracción.
La mezcla se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos y después se tomaron
620 µL de la fase acuosa para transferirlos a otro tubo Eppendorf donde se extrajo con
una solución de Cloroformo-Alcohol isoamílico (24:1) a 4°C con un procedimiento similar
al que se describió en la primera extracción. La mezcla final se centrifugó durante 3
minutos y 550 µL de la fase acuosa se transfirieron a un nuevo tubo Eppendorf.
El ADN plasmídico se precipitó agregándole un volumen igual de isopropanol
mantenido a -20°C y mezclándolo por inversión. Esta suspensión se centrifugó a 12000
rpm durante 5 minutos a 4°C y el isopropanol se removió por aspiración. El pellet se lavó
con 1 mL de etanol absoluto frio (-20ºC), se mezcló por inversión manual del tubo y se
centrifugó 5 minutos a 12000 rpm. Luego se eliminó el sobrenadante por aspiración, se
colocó el tubo en posición invertida sobre papel absorbente en la cámara de flujo laminar
32
y se dejó secar el pellet a temperatura ambiente. Finalmente se resuspendió en 40 µL de
solución tampón TE (Tris-HCl 1M, EDTA 1mM pH 8) más RNasa (25µg/mL) para
finalmente conservarlo a -20ºC.
5.3.2.- Electroforesis en gel de agarosa.
La visualización de plásmidos se realizó mediante electroforesis en geles de
agarosa. El gel se preparó con agarosa al 1% en buffer TAE 1X (Tris acetato 0,04M,
EDTA 0,001M). En cada pocillo se aplicaron 20 µL de cada muestra y 4 µL de colorante
Azul de bromofenol (Kado y Liu, 1981; Ausubel et al., 1991; Rickwood y Homes, 1982)
Se usó un marcador de tamaño de 250 bp para aproximar la talla de los plásmidos
y una cepa control de Enterococcus faecalis con tres plásmidos de peso molecular
conocido. El gel se corrió en una solución tamponada, TAE 1X (Tris acetato 0,4M, EDTA
0,001M) a 70 V durante 2,5 hrs. Posteriormente, se depositó el gel en un volumen
suficiente de Bromuro de Etidio al 20% para visualizar el ADN y se observaron los
plásmidos en un transiluminador de luz ultravioleta para luego fotografiarlos. El peso
molecular de los plásmidos fue determinado por el método de la curva logarítmica de
regresión lineal (Kado y Liu, 1981; Ausubel et al., 1991; Puhler y Kenneth, 1984).
5.4.- Identificación de especies de potenciales biocontroles.
La identificación de los biocontroladores se llevó a cabo en dos etapas. La primera
se realizó con anterioridad a este estudio, donde se determinó por características
morfológicas, tinción al Gram y presencia de esporas, se propuso que todos los
controladores biológicos de las bacterias acéticas ensayadas, correspondían a miembros
del género Bacillus.
En la segunda fase se efectuaron pruebas bioquímicas para confirmar la hipótesis
hecha en la primera etapa, como es el caso de la catalasa y la prueba de indol, y para
además tener una orientación acerca de las especies de Bacillus que poseían actividad
bioantagonista (Ballows et.al, 1991; Murray et.al, 1995; Murray et.al, 1999).
Las pruebas que se realizaron fueron las siguientes (Ballows et.al, 1991; Murray
et.al, 1995; Murray et.al, 1999):
1) Prueba de catalasa
2) Prueba de Indol
33
3) Prueba de lecitinasa
4) Movilidad
5) Reducción de nitratos
6) Voges Proskauer modificado
7) Crecimiento en anaerobiosis
8) Crecimiento a 30°C en MYP (Mannitol Yolk Polimixin)
9) Crecimiento a 50°C en MYP
10) Crecimiento a 60°C en MYP
11) Crecimiento en caldo lisozima al 0,001%
12) Hidrólisis de almidón
13) Hidrólisis de gelatina
14) Producción de gas a partir de carbohidratos
15) β-hemólisis
16) Fermentación de glucosa
17) Fermentación de manitol
Además, se utilizaron criterios morfológicos en la distinción por especies al
observar resultados similares en los perfiles bioquímicos, y en los casos que se consideró
necesario se utilizaron 3 pruebas de fermentaciones adicionales: de arabinosa, trealosa e
inulina.
34
6.- RESULTADOS
6.1.- Determinación de actividad antibacteriana de potenciales
cepas biocontroles para Acetobacter aceti.
6.1.1.- Evaluación de actividad antagónica
En la primera etapa del estudio, éste se enfocó en hallar dentro de numerosas
cepas candidatas, aquellas que manifestasen cierta actividad antagónica con alguna o
algunas de las bacterias acéticas (A. aceti) contempladas en la investigación. Esta
actividad antibacteriana se manifestó como halos de inhibición, los que debían tener un
diámetro mayor a 2 mm (1 mm de radio) para considerar como potencial biocontrol a la
cepa que lo produjese.
Los halos de inhibición normalmente se observaban transcurridas 72 hrs. (Figura 3
y 4) desde la incubación de la placa, pero de todas maneras, se dejaba incubando las
placas por 7 días, en caso que apareciese alguna señal de antibiosis tardía.
Figura 3: Formación de halo de inhibición de crecimiento
por parte de cepa potencial biocontrol N° 25 contra bacteria
acética Ac 148-1, luego de 72 hrs.
35
Figura 4: Formación de halo de inhibición de crecimiento
por parte de cepas potenciales biocontroles N°19 y 20
contra bacteria acética Ac 102-5, luego de 72 hrs.
Durante el estudio se probaron 42 cepas potenciales biocontroles versus 5 cepas
A. aceti, todas contra todas, sin excepción, en un total de 210 ensayos in vitro. De estas
42 cepas, hubo 14 que produjeron alguna inhibición al crecimiento de las bacterias
blanco, siendo consideradas por lo tanto como biocontroladores probables.
Tabla 2: Resumen de actividades antagónicas manifestadas por
biocontroles probables. En amarillo, las cepas blanco inhibidas
por cada cepa biocontrol.
Dentro de las 14 cepas bacterianas con actividad antagónica, existieron 2 cepas
(Ac 5-7 y Ac 55-5) que mostraron tener efecto inhibitorio en la totalidad de las cepas
36
blanco testeadas, es decir, tuvieron un porcentaje de inhibición de un 100% de las cepas.
Además, estas dos cepas fueron las que produjeron los halos de inhibición más grandes
en cuanto a tamaño. Entre las 14 cepas positivas, existieron 8 cepas que manifestaron
alguna inhibición contra 2 o más bacterias acéticas. En los siguientes pasos del estudio,
se consideraron las 14 cepas que manifestaron alguna actividad antibacteriana en los
ensayos realizados en esta etapa.
6.1.2.- Ensayos en sobrenadante libre de células.
Este ensayo se realizó en duplicado, con agua peptonada y caldo nutritivo
como medios de cultivo y mediante el método de Kirby-Bauer modificado y el
método de pozos. A diferencia del screening inicial, en esta ocasión se tomó un
sobrenadante del caldo de cultivo, filtrado con membrana y absolutamente libre de
células para determinar si algún metabolito difusible, que se liberara por la bacteria
biocontrol al medio de crecimiento, fuere el agente que provocase la antibiosis.
Los resultados se encuentran en la Tabla 3 y arrojaron como dato que
ninguno de los sobrenadantes de los biocontroles testeados, bajo ninguna condición
de cultivo y mediante ninguno de los dos métodos ensayados, desarrolló alguna
mínima inhibición.
Biocontrol Nº cepa Bacteria acética 1 Bacteria acética 2
1
Ac 5-7
(-)
(-)
2
Ac 55 - 5
(-)
(-)
5
Ac 16-3a
(-)
(-)
15
Ac 38-6
(-)
(-)
17
Ac 53-1
(-)
(-)
18
Ac 54-5
(-)
(-)
19
Ac 57-3
(-)
(-)
20
Ac 59-5
(-)
(-)
21
Ac 60-4
(-)
(-)
22
Ac 60-5
(-)
(-)
25
Ac 62-5
(-)
(-)
26
Ac 63-1
(-)
(-)
37
Ac 140-2
(-)
(-)
42
Ac 305-4
(-)
(-)
Tabla 3: Resultados de pruebas de inhibición de sobrenadantes
filtrados de biocontroles contra dos bacterias blanco (A. aceti)
sobre las cuales hayan tenido algún efecto inhibitorio.
37
6.2.- Prueba de susceptibilidad antibiótica.
Las pruebas de susceptibilidad antibiótica se llevaron a cabo para determinar si
existían o nó, resistencia a antibióticos de uso común, y asi poder evaluar el impacto
ambiental que podría provocar el diseminar estas cepas en la naturaleza.
Los resultados de las 14 cepas ensayadas contra ampicilina, cefalotina,
tetraciclina, eritromicina, estreptomicina, ácido nalidixico, gentamicina, cloramfenicol y
ciprofloxacino se resumen en la Tabla 4 donde se muestran los diámetros de las zonas de
inhibición del crecimiento presentadas en el testeo.
Biocontroles
1
2
5
15
17
18
19
20
21
22
25
26
37
42
nº cepa
Ac 5-7
Ac 55 - 5
Ac 16-3a
Ac 38-6
Ac 53-1
Ac 54-5
Ac 57-3
Ac 59-5
Ac 60-4
Ac 60-5
Ac 62-5
Ac 63-1
Ac 140-2
Ac 305-4
Antibióticos
Amp
Cef
33
23
32
46
33
33
40
35
34
43
32
26
36
24
20
24
25
19
8
26
8
25
20
45
26
36
8
26
Tet
23
29
26
25
27
25
24
22
25
25
22
27
24
23
Erit
30
30
21
24
30
31
27
23
21
11
12
24
24
13
Estrep
17
17
21
19
22
18
17
22
24
18
20
17
13
16
Ac. N
26
22
19
28
25
27
18
21
21
18
20
21
17
24
Gent
23
26
25
25
26
22
20
21
26
22
24
22
23
21
Clor
21
27
28
20
26
19
25
22
22
20
20
25
22
20
Cip
36
27
29
30
28
40
40
33
31
35
34
26
30
31
Tabla 4: Diámetros (en mm) de inhibición del crecimiento de las cepas potenciales biocontroles
contra los distintos antibióticos ensayados.
38
Biocontroles
1
2
5
15
17
18
19
20
21
22
25
26
37
42
nº cepa
Ac 5-7
Ac 55 - 5
Ac 16-3a
Ac 38-6
Ac 53-1
Ac 54-5
Ac 57-3
Ac 59-5
Ac 60-4
Ac 60-5
Ac 62-5
Ac 63-1
Ac 140-2
Ac 305-4
Amp
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
S
S
R
Cef
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Tet
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Erit
S
S
I
S
S
R
S
S
I
R
R
S
S
R
Estrep
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
Ac. N
S
S
S
S
S
S
I
S
S
I
S
S
I
S
Gent
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Clor
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Cip
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Tabla 5: Resultados de susceptibilidad para las cepas potenciales biocontroles ensayadas.S:
Sensible; I: Intermedio; R: Resistente.
En la Tabla 5, se muestra el resultado al analizar los diámetros según Tabla de
criterio de susceptibilidad para Enterobacterias (NCCLS, Tabla 1) y así poder clasificarlos
en sensibles, intermedias o resistentes frente a los antimicrobianos.
Se pudo apreciar como se muestra en la Tabla 6, que del número de 14
biocontroles estudiados existió el siguiente número de cepas resistentes y porcentaje de
resistencias:
Cantidad de
Porcentaje
N° cepas
resistencias
de cepas
Ninguna resistencia
10
71,43
Una resistencia
1
7,14
Dos resistencias
3
21,43
Tres o más resistencias
0
0,00
(MDR)
Tabla 6: Cantidad y porcentajes de cepas potenciales
biocontroles con diferentes niveles de resitencia a
antibióticos.
En la Tabla 7 se puede observar el porcentaje de cepas biocontroles que
resultaron resistentes a los diferentes antibióticos ensayados:
Porcentajes
Resistentes
Intermedios
Sensibles
Amp
21,43
0
78,57
Cef
0
0
100
Tet
0
0
100
Erit
28,57
14,29
57,14
Estrep
0
7,14
92,86
Ac. N
0
21,43
78,57
Gent
0
0
100
Clor
0
0
100
Cip
0
0
100
Tabla 7: Porcentajes de resistencia de los potenciales biocontroles a cada uno de los
antibióticos testeados.
39
De la tabla anterior se puede desprender que solamente las bacterias
desarrollaron alguna resistencia hacia la ampicilina y la eritromicina, siendo ésta
última la con mayor porcentaje de cepas resistentes. Del resto de los antibióticos,
existieron dos a los cuales los biocontroles mostraron rangos intermedios entre
resistencia y sensibilidad, siendo éstos el ácido nalidíxico y la estreptomicina; con
respecto al resto de los antibióticos testeados (Cefalotina, Tetraciclina,
Gentamicina, Cloramfenicol y Ciprofloxacino), las cepas fueron sensibles en un
100%,.
6.3.- Detección de Plásmidos.
Para determinar la existencia de plásmidos en las cepas biocontroles se utilizó el
método de extracción rápida de Voskuil y Chambliss y observación mediante
electroforesis en geles de agarosa. Esta se llevó a cabo mediante dos corridas en la
cámara de electroforesis. En la primera corrida se contemplaron 9 cepas biocontroles más
el marcador de peso molecular y la cepa de Enterococcus faecalis con los 3 plámidos de
peso molecular conocido. En la segunda, los mismos marcadores más las 5 restantes.
40
La Figura 5 muestra los frentes de corrida de las primeras 9 cepas testeadas:
Figura 5: Gel primera extracción de plásmidos en
potenciales biocontroles. 1° Carril: Marcador de
tamaño molecular (ladder), 2° Carril: Cepa N° 1 (Ac
5-7), 3° Carril: Cepa N° 2 (Ac 55-5), 4° Carril: Cepa
N° 5 (Ac 16-3a), 5° Carril: Cepa N° 15 (Ac 38-6), 6°
Carril: Cepa N° 17 (Ac 53-1), 7° Carril: Cepa N° 20
(Ac 59-5), 8° Carril: Cepa N° 21 (Ac 60-4), 9° Carril:
Cepa N° 26 (Ac 63-1), 10° Carril: Cepa N° 37 (Ac
140-2) y 11° Carril: Enterococcus faecalis V583
Se puede observar en la imagen que existen bandas de ADN plasmidico en
el cuarto frente y en el décimo, es decir en la Cepa N° 5 (Ac 16-3a) y Cepa N° 37
(Ac 140-2).
En la fotografía que viene a continuación, están detallados los frentes de
corrida de las restantes 5 cepas biocontroles.
41
Figura 6: Gel segunda extracción de plásmidos
en potenciales biocontroles. 1° Carril:
Marcador tamaño molecular (ladder), 2° Carril:
Cepa N° 18 (Ac 54-5), 3° Carril: Cepa N° 19
(Ac 57-3), 4° Carril: Cepa N° 22 (Ac 60-5), 5°
Carril: Cepa N° 25 (Ac 62-5), 6° Carril: Cepa
N° 42 (Ac 305-4) y 7° Carril: Enterococcus
faecalis V583
En la Figura 6 es posible apreciar que hay presencia de bandas de ADN plasmidial
en el segundo frente y en el quinto, esto es decir en la Cepa N° 18 (Ac 54-5) y en la Cepa
N° 25 (Ac 62-5).
La estimación del tamaño molecular de los plásmidos encontrados se realizó por
comparación de la movilidad electroforética de estos plásmidos con aquellos de tamaño
molecular conocido y con las bandas del ladder (Anexo 4). En resumen, se encontraron
plásmidos en cuatro cepas siendo la Cepa 5 (Ac 16-3a), la con mayor presencia bandas
plasmidiales (teniendo cuatro en total) como figura en la siguiente tabla:
Cepas
Bandas plasmidiales TM aprox(bp)
Ac 16 3-a
Banda 1
< 66320
Banda 2
46810
Banda 3
40447
Banda 4
15271
Cepas
Ac 140 - 2
Ac 54 - 5
Ac 62 - 5
Bandas plasmidiales TM aprox(bp)
Banda 1
10860
Banda 1
14089
Banda 1
22935
Banda 2
5505
Tabla 8: Resumen de tamaños moleculares aproximados de plásmidos hallados en
cepas biocontroles. TM: Tamaño molecular.
42
6.4.- Identificación de especies.
Los resultados de las pruebas bioquímicas para cada una de las cepas
biocontroles se resumen en las siguientes tablas:
Bioc
1
2
5
15
17
18
19
20
21
22
25
26
37
42
nº cepa
Ac 5-7
Ac 55-5
Ac 16-3a
Ac 38-6
Ac 53-1
Ac 54-5
Ac 57-3
Ac 59-5
Ac 60-4
Ac 60-5
Ac 62-5
Ac 63-1
Ac 140-2
Ac 305-4
CAT LEC MOV NIT
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
VP
+
-+
*-+
-+
***+
-+
-+
GL/
A
+
+
+
+
-+
-+
+
+
+
+
-+
+
+
GL/
AN
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
CRA 30°C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
50º 60º
Bioc nº cepa
C
C
ALM GEL MAN LIS HEM IND
1
Ac 5-7
+
+
+
+
2
Ac 55-5
+
+
+
+
5
Ac 16-3a
+
+
15
Ac 38-6
+
+
+
+
17
Ac 53-1
+
+
+
+
18
Ac 54-5
19
Ac 57-3
+
+
+
+
20
Ac 59-5
+
+
+
21
Ac 60-4
+
+
22
Ac 60-5
+
+
+
25
Ac 62-5
+
+
26
Ac 63-1
+
+
+
37
Ac 140-2
+
+
+
42
Ac 305-4
+
+
+
+
+
Tabla 9: Pruebas bioquimicas realizadas a cepas biocontroles para su
identificación de especie.
43
Los resultados de las pruebas se encuentran con los códigos que se detallan a
continuación:
1) CAT: Prueba de catalasa
2)
LEC: Prueba de lecitinasa
3) MOV: Movilidad
4) NIT: Reducción de nitratos
5) VP: Voges Proskauer modificado
6) GL/A: Fermentación de glucosa en aerobiosis
7) GL/AN: Fermentación de glucosa en anaerobiosis
8) CRA: Crecimiento en anaerobiosis
9) 30°C: Crecimiento a 30°C en MYP
10) 50ºC: Crecimiento a 50°C en MYP
11) 60ºC: Crecimiento a 60°C en MYP
12) ALM: Hidrólisis de almidón
13) GEL: Hidrólisis de gelatina
14) MAN: Fermentación de manitol
15) LIS: Crecimiento en caldo lisozima al 0,001%
16) HEM: β-hemólisis
17) IND: Prueba de Indol
Se utilizaron los siguientes símbolos para los resultados de las pruebas:
+ : Resultado postivo
- : Resultado negativo
-+ : Resultado no aclaratorio
*- : Resultado presumiblemente negativo
+ : Resultado fuertemente positivo (en el caso de la β-hemólisis).
Según el perfil bioquímico de cada una de las cepas y tomando en cuenta
parámetros tales como el tamaño de célula, si formaban cadenas y ubicación de esporas,
se pudo obtener una aproximación por especie que se resume en el recuadro detallado a
continuación (Holt et al., 1994; Ballows et.al, 1991; Murray et.al, 1995; Murray et.al, 1999)
44
% de pruebas
confirmativas
Biocontrol nº cepa
Especie
1
Ac 5-7
95,6%
Bacillus lentus
2
Ac 55-5
86,9%
Bacillus licheniformis
5
Ac 16-3a Bacillus mycoides
78,3%
15
Ac 38-6
82,6%
Bacillus circulans
17
Ac 53-1
86,9%
Bacillus coagulans
18
Ac 54-5
78,3%
Bacillus mycoides
19
Ac 57-3
82,6%
Bacillus licheniformis
20
Ac 59-5
78,3%
Bacillus licheniformis
21
Ac 60-4
80,0%
Bacillus circulans
22
Ac 60-5
80,0%
Bacillus circulans
25
Ac 62-5
90,0%
Bacillus circulans
26
Ac 63-1
80,0%
Bacillus thuringiensis
37
Ac 140-2 Bacillus coagulans
85,0%
42
Ac 305-4 Bacillus amyloliquefaciens
95,0%
Tabla 10: Identificación de especies de cepas biocontroles.
De esta tabla, se puede desprender que la distribución por especies puede
quedar resumida de la siguiente forma:
Especies de Bacillus
Bacillus circulans
Bacillus licheniformis
1
1
4
1
Bacillus coagulans
Bacillus mycoides
2
2
3
Bacillus
amyloliquefaciens
Bacillus lentus
Bacillus thuringiensis
Gráfico 1: Distribución por especie de los potenciales biocontroles.
45
7.- DISCUSIÓN
7.1.- Actividad antibacteriana de potenciales cepas biocontroles
contra A. aceti.
En un estudio realizado con anterioridad en el Laboratorio de Microbiología del
INTA, se encontró la presencia de bacterias acéticas en un 52% de las uvas enfermas con
pudrición ácida (113/216), presentando un importante incremento hacia la etapa de
cosecha, de 101 u.f.c./g hasta llegar a 105 u.f.c./g. En este mismo estudio, se obtuvieron
recuentos bajos de hongos filamentosos fitopatógenos en uvas enfermas, por lo que se
concluyó que la teoría que adjudicaba a la pudrición ácida un origen fundamentalmente
fungoso debía revisarse (Figueroa et al., 2003a).
Posteriormente, se investigó acerca de la asociación de las principales especies
de acetobacterias con la etiología de la pudrición ácida, obteniéndose que predominó A.
aceti,
con un 71% de presencia en uvas enfermas, seguido de Gluconoacetobacter
hanseni, con un 16% (Figueroa et al., 2003b).
Este importante hallazgo sumado a otros estudios (Hewitt, 1974; Oliva et al., 1999)
demuestran que las especies bacterianas del género Acetobacter son uno de los
principales microorganismos vinculados a la pudrición ácida. Por esto, se puede afirmar
que la inhibición mostrada hacia las bacterias acéticas por parte de las cepas ambientales
potenciales biocontroladores,
los constituye en alternativa para
el control de la
fitopatología antes mencionada.
La investigación arrojó como resultado que, de las 42 cepas potenciales
biocontroles que se probaron contra 5 cepas de Acetobacter aceti,
hubo 14 que
mostraron antagonismo contra el crecimiento de las bacterias blanco. Por esta
característica, fueron consideradas como biocontroladores probables de estas bacterias
acéticas.
Esta investigación no tuvo como objetivo dilucidar el mecanismo mediante el cual
se provoca el efecto inhibitorio, sino más bien observar y determinar si se produce algún
tipo de antagonismo desde las cepas con probable efecto biológico de control hacia las
cepas de bacterias acéticas implicadas en la pudrición ácida. Igualmente, se trataron de
buscar pistas que permitieran acercar alguno de los modelos antes expuestos a la forma
de inhibición detectada en las pruebas in vitro.
46
En el presente estudio sobre biocontroles, se pudo demostrar el rol biocontrolador
de éstos sobre bacterias filogenéticamente distantes. Este es el caso de la Escherichia
coli, un bacilo Gram negativo, y el mismo A. aceti, que es Gram negativo o Gram variable.
Este hecho alejaría la posibilidad que la producción de bacteriocinas sea el mecanismo
antagónico. Las bacteriocinas han sido consideradas como un importante agente de
antibiosis en estudios referidos a bacterias del género Bacillus. Estas proteínas
manifiestan casi en todas las cepas que las producen, actividad biológica antagónica
contra miembros de la misma especie o especies muy cercanas filogenéticamente
(Zúñiga y Mota, 1998; Muñoz, 2003).
Los resultados de los experimentos sugieren además, que el medio de
antagonismo entre las cepas biocontroles y las bacterias acéticas podría no deberse a la
liberación decompuestos difusibles al medio, dado que en ninguna de las cepas
analizadas se detectó actividad en el sobrenadante filtrado libre de células (Tagg y Mc
Given, 1971).
En lo que se refiere específicamente a microorganismos del género Bacillus, la
secreción de compuestos antibióticos y su liberación al medio constituye el principal
mecanismo de interacción biocida.
Estas bacterias producen antibióticos y son
ejemplos de estos compuestos, la bacitracina, polimixina, tirocidina, gramicidina,
cereína y circulina entre muchísimas otras más (Oscáriz et al., 2006; Tagg et al., 1976;
Claus y Berkeley, 1986). Han existido numerosos estudios en pos de descubrir el
mecanismo de antagonismo empleado, dado que muchas especies miembros de este
género han sido descritas como biocontroladores de gran potencial y amplio espectro
(Foldes et al., 2000).
De todas maneras, se consideró que la antibiosis podía no llevarse a cabo por una
baja concentración de sustancia antimicrobiana, por lo que se utilizó el método de pozos
donde se dispuso de un volumen de sobrenadante con el que probablemente se
alcanzarían las MIC (Concentraciones Mínimas Inhibitorias) obtenidas en sustancias
similares en cuanto a composición y naturaleza y que provengan de Bacillus (Edwards y
Seedon, 2001; Bais et.al, 2004).
Aún así, existen autores que señalan que debe existir una concentración de los
componentes extracelulares, usualmente con evaporador rotatorio al vacío, para el efecto
de aumentar su actividad inhibitoria en sobrenadantes, por lo que la teoría de secreción
de compuestos antibióticos tendría una probabilidad baja pero no se puede descartar de
plano (Geis et al., 1983; Silva et al., 1987; Schillinger y Lücke, 1989).
47
Por otra parte, la reducción de pH por producción de ácidos orgánicos de cadena
corta, podría ser descartada como posible mecanismo de antibiosis dado que las
bacterias acéticas sobreviven en condiciones más ácidas que los biocontroladores. Pese
a ello, igualmente se midió el pH del cultivo líquido del biocontrolador, teniendo éste un
valor cercano al neutral (pH 7,5) descartando la presencia de ácidos como productos
metábolicos. Cabe recordar que los ácidos orgánicos de cadena corta, como es el caso
del acético, fórmico, láctico y propiónico, son muy tóxicos para los microorganismos
porque atraviesan la membrana bacteriana en la forma no ionizada y se acumulan en la
forma ionizada en el interior (Agarry et al., 2005).
También se consideró el factor tiempo y optimización del medio de cultivo en la
experiencia. En primer lugar, la producción de metabolitos extracelulares se caracteriza
por aparecer en la etapa final de la fase logarítmica alcanzando su máximo en la fase
estacionaria (Yoshida et al., 2001). Por lo tanto, se le dio al crecimiento bacteriano del
biocontrol, un tiempo que según datos bibliográficos, permitiese afirmar que la posible
sustancia secretada se encontrara en el medio líquido al ser colectado éste. Por otra
parte, se hicieron crecer en agua peptonada los biocontroles, para observar si en este
medio enriquecido se pudiese detectar alguna modificación importante en la producción
de bacteriocinas, no encontrándose ninguna diferencia finalmente (Yoshida et al., 2001).
Es deseable que la antibiosis no sea el principal mecanismo de acción de un
antagonista en cualquier tipo de interacción microbiana de este tipo. Esto se debe a que,
al igual que cuando se usan fungicidas sintéticos, existe el riesgo de aparición de cepas
del patógeno resistentes al antibiótico. Uno de los sucesos más notorios y que guardan
antecedentes relacionados a este tema, ha sido el caso de la aparición de cepas de
Agrobacterium tumesfaciens (causante de la agalla de corona de las plantas) resistentes
al Agrosin 84, un antibiótico producido por una cepa de Agrobacterium radiobacter
(Campbell, 1989).
Un posible mecanismo de inhibición de crecimiento descrito en bacterias grampositivas, es la inhibición por formación de peróxidos. Ciertas cepas de bacterias gram
positivas son capaces de tomar oxígeno para formar peróxidos mediante flavoproteínaoxidasa o mediante peroxidasas. El H2O2 producido y liberado al medio resulta
extremadamente tóxico para otras bacterias que comparten el hábitat y que son así
eliminadas.
Estos compuestos se producen únicamente en presencia de oxígeno, condiciones
aeróbicas que se encuentran dadas para los biocontroles según el método de ensayo. En
48
el estudio, todas las bacterias usadas como “blanco”, es decir E. coli, B. subtilis y A. aceti
son catalasa positivos, por lo tanto sería necesario que la cepa produjese cantidades
importantes de peróxidos para poder inhibir el crecimiento de estos microorganismos.
Gilliland y Speck (1974) publicaron los resultados de un estudio sobre estreptococos
lácticos productores de peróxidos en el cual apuntaban la necesidad de la presencia de
las células bacterianas para que se de el efecto bactericida, ya que el peróxido liberado al
sobrenadante del cultivo se disipaba de manera muy rápida.
En la presente investigación, este dato constituye un aporte importante dado que
se ha mostrado que sólo las células bacterianas han producido actividad bactericida, no
presentando actividad inhibitoria en el sobrenadante puro. Esto tendría que confirmarse
en alguna investigación futura referente al mecanismo mediante el cual actúan los Bacillus
sobre las bacterias acéticas específicamente.
7.2.- Susceptibilidad a antibióticos y perfil plasmidial en cepas
biocontroles.
La resistencia bacteriana a los antimicrobianos, constituye un serio y creciente
problema en el ámbito mundial, especialmente para los países en desarrollo donde
muchos factores contribuyen a engendrar, desarrollar y extender esta situación. Las
razones para este rápido incremento de la resistencia antimicrobiana no se conocen con
certeza, pero el extenso e inapropiado uso de antimicrobianos, con la “presión ecológica”
resultante (selección natural), contra cepas susceptibles indudablemente juega un papel
primordial (Bennish y Levy, 1995).
Por su flexibilidad genética las bacterias se han adaptado rápidamente a la presión
antibiótica selectiva. Los elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones,
fagos y secuencias de inserción son los que median esta flexibilidad, permitiéndole a los
microorganismos adquirir los elementos genéticos necesarios para prosperar bajo las
cambiantes condiciones ambientales (Heuer et al., 2002).
La aplicación de agentes agroquímicos en la agricultura intensiva podría tener
influencia en el incremento de los niveles de resistencia en el ecosistema bacteriano
ambiental. Ello constituye un importante riesgo, dado que pudiera diseminarse a especies
fitopatógenas o zoonóticas presentes en el ambiente (López et al., 2004). Desde el punto
de vista ambiental, las especies de Bacillus no patógenas cuentan con muchas ventajas al
compararlas con otras de distintos géneros, ya que forman endoesporas y por lo tanto
49
pueden soportar condiciones osmóticas, de temperatura y de acidez extremas (Basha y
Ulaganathan, 2002).
En el presente trabajo, ninguna de las cepas estudiadas presentó multiresistencia
a las drogas utilizadas en el ensayo, es decir que ninguno de los potenciales biocontroles
presentó simultáneamente resistencia a tres o más antimicrobianos de diferentes clases.
Es más, solamente un 28,57 % de las cepas presentaron resistencia entre 1 y 2
antibióticos, encontrándose resistencias ante la ampicilina y eritromicina exclusivamente.
Esto se explica en el hecho que, tanto la eritromicina como la ampicilina,
pertenecen al grupo de antibióticos que han sido más utilizados. Ambos han tenido un
excesivo consumo dentro de la población mundial y son considerados los más antiguos
dentro de los macrólidos y los beta lactámicos respectivamente, por lo tanto, han visto
incrementado su porcentaje de resistencia en determinadas cepas (Bywater et al., 2004;
Pérez, 1998; Pinto, 2002).
El dato acerca de la resistencia a ciertos antibióticos, constituye información de
gran importancia para la fase de inoculación de las uvas, dado que la propagación y
presencia masiva de genes con resistencia a antibióticos en el ambiente y el suelo, así
como en los alimentos ingeridos por animales y seres humanos, podría transferir dicha
característica rápida y ampliamente..
La resistencia múltiple a los antibióticos con frecuencia reside en los llamados
factores R o plásmidos de resistencia (Foster, 1983; Puhler y Kenneth, 1984). Un reflejo
de la diseminación de estos plásmidos R en la población bacteriana es la aparición de
brotes o epidemias como consecuencia de la presión selectiva ejercida por el uso
indiscriminado de agentes antibacterianos. La transferencia horizontal de estos plásmidos
tiene lugar mediante la conjugación, por la que el plásmido conjugativo es integrado en el
cromosoma de la célula receptora por recombinación homóloga previo paso de material
genético a través de pilis conjugativos (Heinemann, 1991; Brisson-Nöel et al., 1998;
Mayer, 1988; Tompkins, 1992).
Una vez que la bacteria es resistente al antibiótico es capaz de transmitir su
resistencia de forma vertical a su descendencia o de forma horizontal a otras bacterias
que pueden ser de distinta especie e incluso género mediante la transferencia del material
genético que codifica esa resistencia (Marchandin et al., 1999; Brown et al., 1991).
En este caso, se encontró presencia de plásmidos en cuatro de las catorce cepas
estudiadas (28,57%). En la cepa con mayor número de plásmidos (Cepa 5, Ac 16-3a),
cuatro en total, no se registró resistencia a ningún antibiótico, por lo que estos plásmidos
50
no serían factores de resistencia. Algo similar ocurre con la cepa N°37 (Ac 140-2) la que
tampoco presentó resistencia a ningún antibiótico. Las otras dos cepas restantes (Ac 54-5
y Ac 62-5) muestran algún tipo de resistencia a ampicilina y eritromicina. Existen datos
bibliográficos que señalan haberse encontrado para ambos tipos de antibióticos,
resistencias donde se ven involucrados genes asociados a plásmidos conjugativos.
(Espigares y Alvarez, 2002; Prescott et al., 1999).
La resistencia a dichos fármacos pudiese o no ser mediada por plásmidos, porque
existen otros mecanismos de transmisión de genes de resistencia a antibióticos en que
dichos elementos genéticos móviles no están involucrados, y porque generalmente estos
elementos llevan determinantes multirresistentes. En el ADN cromosomal y en el ADN
extracromosomal (plásmidos) se encuentra codificada la información genética que
controla la resistencia bacteriana hacia los agentes antimicrobianos (Valdés-Da Pena,
2000; Livermore, 2000).
Además, cabe recordar también que existen plásmidos que no son factores R, es
decir, que no transmiten resistencias y que cumplen otras funciones, tales como los
factores F, plasmidos de metabolismo o plásmidos de virulencia, entre otros, que también
aparecerían en el perfil plasmídico (Ramírez et al., 1999).
El que las cepas con características de biocontroles presenten bajos porcentajes
de resistencias a fármacos y que no estén relacionadas con prersencias de plásmidos,
constituye un hecho bastante favorable para la investigación, dado que el objetivo final es
la liberación de las cepas al ambiente.
7.3.- Análisis de identificación de especies
Debido al gran número de especies y descripciones a menudo incompletas de
especies descubiertas recientemente, la diferenciación e identificación de especies del
género Bacillus sp. es particularmente dificultosa. La identificación se ha basado
tradicionalmente en tinción al Gram, morfología de células y colonias, forma de la espora,
movilidad, y pruebas bioquimicas. Estas consumen bastante tiempo, son algo subjetivas
y necesitan de procedimientos intensivos de trabajo (Holt et.al, 1994; Anderson et. al,
1996; Logan y Berkeley, 1984).
El género Bacillus en la actualidad, contienen más de 60 especies que se
encuentran comúnmente en el ambiente y como contaminantes en laboratorios (Koneman
et al., 1997).Existen muchas clasificaciones de las especies en distintos grupos. La más
51
utilizada es dividir las diferentes cepas en tres grupos grandes que contienen las especies
más relevantes y conocidas, agrupadas principalmente por el tamaño de las células y por
las características de sus esporas. Así, en el grupo I, se encuentran todas las especies
cercanas al Bacillus cereus, en el II todos aquellos con características similares al Bacillus
subtilis y en el grupo III, especies relacionadas taxonómicamente con el Bacillus
Circulans. (Ballows et.al, 1991; Murray et.al, 1995; Murray et.al, 1999)
De acuerdo a las características morfológicas y fisiológicas, las 14 cepas
biocontroles pertenecerían al género Bacillus, lo que coincidiría con todos los datos
obtenidos de las bibliografías antes mencionadas donde se destacan las propiedades
comprobadas como controladores biológicos, de los miembros este género.
De las 14 cepas biocontroles, existirían cuatro que pertenecerían a la especie
Bacillus circulans, tres que pertenecerían a Bacillus licheniformis, dos a Bacillus
coagulans y mycoides, y un representante de cada una de las siguientes especies:
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus y Bacillus thuringiensis.
Las cepas que manifestaron actividad antagónica contra la totalidad de las
bacterias acéticas testeadas, serían Bacillus lentus (95,6% de coincidencia) y Bacillus
licheniformis (86,9%), llamando la atención el primero dado que la especie a la que
pertenecería no cuenta con muchos antecedentes como controlador biológico.
Es necesario mencionar que la metodología empleada tiene un nivel de certeza
limitado, ya que en algunas oportunidades no permite diferenciar adecuadamente
especies fenotípicamente similares (Donabedian et.al, 1995). Por lo tanto, utilizando el
perfil bioquimico de cada una de estas cepas es posible afirmar que éstas se acercan a
las especies anteriormente señaladas, dado que son pruebas de compatibilidad
fenotípica. Para confirmar este criterio de identificación de especies, se debería realizar
algún estudio adicional de tipificación molecular (como el PCR por ejemplo) (Sepúlveda
et.al, 2002).
Además se debe recordar que las cepas seleccionadas fueron tomadas desde el
entorno ambiental de las uvas, por lo que corresponden a cepas silvestres. Esto explicaría
niveles de porcentajes de coincidencia (80% o menor) para algunas cepas, ya que para la
identificación a nivel de especie se emplean manuales clínicos de microbiología, con
criterios basados en cepas de laboratorio sin variabilidad ambiental (Berber y Yenidünya,
2005).
De acuerdo con la tipificación realizada, un 50% de las cepas con actividad
antagónica correspondería a Bacillus circulans o licheniformis. Existen evidencias
52
científicas que relacionan a ambas especies con propiedades de control biológico, pero
estas están principalmente relacionadas con una actividad antifúngica.
Bacillus circulans tiene una reconocida capacidad de producir quitinasa, lo que
explicaría su amplio uso como bioprotector de plantas al actuar degradando la pared
celular de muchos hongos y levaduras, además de la producción de ciertos metabolitos
de origen antibiótico tales como la butirosina, circulina, polipeptina, xilosantina entre otras
(Alam et al., 1996; Watanabe et al., 1990; Watanabe et al., 1994).
Por su parte, Bacillus licheniformis al igual que la mayoría del resto de las especies
del género Bacillus señaladas como biocontroles, ha demostrado ser un potente
antifúngico mediante la secreción de antibióticos, tales como bacillomicina, licheniformina,
proticina y bacitracina principalmente (Katz y Demain, 1977; Bacon et.al., 2006)
Resulta curioso entonces, que las formas más importantes de antagonismo
biológico de estas especies de Bacillus según evidencia científica, se encuentren con una
baja probabilidad de aparecer como el mecanismo para inhibir el crecimiento de las
bacterias acéticas en este estudio. Ya sea, por no hallarse actividad en el sobrenadante
sin células o sencillamente, como es el caso de la actividad quitinolítica, por la carencia de
quitina en la pared celular de las bacterias, microorganismos “blanco” de este estudio.
53
8.- CONCLUSIONES
1. Se estudió la actividad antagónica que pudiese tener un grupo de cepas
provenientes de la microbiota natural de vides, sobre bacterias acéticas de la
especie Acetobacter aceti, la que tendría implicancia directa y gran incidencia
en el desarrollo del cuadro fitopatológico conocido como Pudrición ácida, que
se encuentra afectando en forma progresiva las parras del centro de Chile.
2. De un total de 42 cepas seleccionadas como potenciales biocontroles por tener
actividad inhibitoria contra BGA (Bacillus subtilis) y Escherichia coli, hubo 14
que manifestaron cierta propiedad antágonica sobre las bacterias acéticas.
3. De estas 14 cepas con potencial biocontrol, la totalidad de ellas resultó
pertenecer al género Bacillus.
4. En ninguna de las cepas biocontroles se encontró actividad inhibitoria en el
sobrenadante libre de células, centrifugado y filtrado como se señalaba en las
literaturas consultadas. Este resultado sugiere que el principal mecanismo de
acción de antagonismo podría no ser el de antibiosis o por secreción de algún
metabolito extracelular al medio, contrario a los datos encontrados en la
mayoría de los reportes relacionados a la actividad biocontroladora de
especies de Bacillus, donde se señala como el medio más importante de
inhibición.
5. No se halló en los biocontroles un nivel importante de resistencia a antibióticos,
dado que existió solamente resistencia a 2 de los antibióticos testeados, siendo
éstos la ampicilina y la eritromicina, en 3 de las 14 cepas.
6. Se encontró presencia de plásmidos en 4 cepas, los que en ninguno de los
casos estuvo relacionado con el desarrollo de un cuadro de multidrogoresistencia a los antibióticos ensayados. Este dato combinado con el hallazgo
54
mencionado en el parrafo anterior, aporta una gran información para fases
futuras del proyecto donde se tiene que llevar a cabo la inoculación de uvas, es
decir, la liberación de las cepas al medio ambiente.
7. Según
perfil
bioquimico
y
morfológico
de
los
biocontroles,
estas
corresponderían en un 50% a cepas pertenecientes a las especies Bacillus
circulans y Bacillus licheniformis. También se encontró Bacillus de la especie
mycoides y coagulans con dos miembros cada una, más cepas pertenecientes
a las siguientes especies; Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus y Bacillus
thuringiensis. El método empleado no permite entregar un 100 % de
confirmación, ya que para ello se debería emplear alguna técnica de tipificación
molecular para la identificación de especies.
8. Hubo 2 cepas, Ac 5-7 y Ac 55-5, que mostraron actividad inhibitoria contra
todas las bacterias acéticas ensayadas; además no mostraron presencia de
plásmidos y resistencia bacteriana, lo que las convierte en candidatas ideales
para combatir la pudrición ácida, de acuerdo a los objetivos planteados en el
estudio.
9. Según estos resultados, las cepas ensayadas y especialmente estas dos
últimas, podrían constituir una alternativa viable para el control fitopatólogico de
la pudrición ácida, hipótesis que debe confirmarse en un estudio in vivo.
55
9. - BIBLIOGRAFÍA
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10.- ANEXOS
Anexo1. Superficies de vides de mesa en hectáreas.
CHILE
SUPERFICIE Y PRODUCCIÓN DE VIDES PARA VINIFICACIÓN, DE MESA Y PISQUERAS
PERÍODO 1990 - 2005
Producción
Producción de vinos para consumo
(Miles de
Litros)
Viníferas
De mesa
Total 1_/
Superficie de Vides
(hectáreas)
AÑOS
Viníferas
De mesa
1990
65.202
48.218
Pisqueras
6.506
Total
Vino
Pisquero
2_/
119.926
-
-
-
-
44.835
282.239
73.102
1991
64.850
47.900
7.423
120.173
237.404
1992
63.106
49.840
7.795
120.741
212.757
103.777
316.535
95.024
1993
62.192
49.333
8.226
119.751
223.981
106.264
330.246
108.278
111.512
276.648
83.190
359.838
121.622
113.581
290.904
25.833
316.737
129.598
116.165
337.273
45.097
382.369
143.592
123.200
381.667
49.091
430.758
131.769
82.544
526.550
159.502
1994
1995
1996
1997
53.092
54.393
56.004
63.550
49.332
49.803
50.435
49.641
9.087
9.385
9.726
10.009
1998
75.388
50.200
10.187
135.775
444.007
1999
85.357
50.826
10.379
146.562
371.428
56.587
428.015
157.595
164.770
570.431
71.506
641.937
170.842
168.440
504.369
40.810
545.179
143.958
170.726
526.496
35.827
562.323
92.128
27.375
668.222
135.164
2000
2001
2002
103.876
106.971
108.569
50.818
51.669
52.366
10.076
9.800
9.791
2003
110.097
52.685
9.853
172.635
640.848
2004
112.056
53.426
9.883
175.365
605.206
24.868
630.074
99.649
735.991
53.450
789.441
144.571
2005
FUENTE: Elaborado por ODEPA con información del
SAG
Notas :
-
1_/ No incluye producción de mostos concentrados ni chicha.
2_/ Vino para destilación
CHILE
SUPERFICIE DE VIDES AÑO 1990 y 2004
HECTÁREAS
120.000
112.056
100.000
80.000
65.202
53.426
48.218
60.000
40.000
6.506 9.883
20.000
0
Viníferas
De mesa
1990
Pisqueras
2004
67
Anexo 2. Producción nacional de huertos industriales.
68
Anexo 3. Cálculo del tamaño molecular de los plásmidos encontrados en cepas
potenciales biocontroles.
Para el cálculo se hizo necesaro construir un gráfico que mostrara una relación
lineal entre los Rf obtenidos de las bandas patrón versus el logaritmo de los pesos
moleculares expresados en pares de bases (bp).
El resultado de los gráficos fueron los siguientes:
- Para la primera corrida:
Distancia x
Distancia F
PM (bp)
Log PM
(Dx)
(Df)
Rf (Dx/Df)
66320
4,8216
3,3
16
0,2063
57660
4,7609
3,4
16
0,2125
17963
4,2544
5,2
16
0,3250
8000
3,9031
7,6
16
0,4750
6000
3,7782
8,35
16
0,5219
5000
3,6990
8,95
16
0,5594
4000
3,6021
9,7
16
0,6063
3000
3,4771
10,7
16
0,6688
2750
3,4393
11,5
16
0,7188
2500
3,3979
11,65
16
0,7281
2250
3,3522
11,95
16
0,7469
2000
3,3010
12,45
16
0,7781
1750
3,2430
13,1
16
0,8188
1500
3,1761
14,15
16
0,8844
Tabla: Datos obtenidos de electroforesis para cálculo de peso plasmidial de
cepas de primera corrida.
Siendo:
PM = Peso molecular expresado en pares de bases
Log PM = Logaritmo del peso molecular
Dx = Distancia recorrida por el marcador de peso molecular conocida (en cms)
Df = Distancia total recorrida por el frente de corrida (en cms)
Rf = Coeficiente de movilidad relativa, es el cociente entre Dx y Df
69
Se obtuvo el siguiente gráfico:
Aproximación Peso Molecular Plásmidos
1
Rf = -0,4015 log PM + 2,0865
R = 0,982
0,8
Rf
0,6
0,4
0,2
0
3
3,5
4
4,5
5
Log PM
Gráfico: Relación entre el logaritmo del Peso molecular de marcadores
con peso conocido de la Primera corrida con los coeficientes de movilidad
relativa respectivos.
Con las distancias medidas para cada plásmido de peso desconocido, se puede
calcular por interpolación en la curva del gráfico anterior el valor del Log de Peso
molecular y mediante el antilogaritmo de éste se puede obtener el Peso molecular
expresado en pares de bases. La única excepción la constituye el primer plásmido de la
Cepa 5 dado que queda milimetros fuera de la curva, por lo que sólo se puede decir que
su peso es un poco mayor que el marcador de peso molecular más alto.
Esto se resume en la tabla siguiente:
Distancia bandas de peso
molecular desconocidas
(D*)
Rf*
Log PM*
Plásmido 1
3,25
0,2031
------------Plásmido 2
3,85
0,2406
4,6703
Plásmido 3
4,3
0,2688
4,6069
Plásmido 4
7,3
0,4563
4,1839
Plásmido 1
8,35
0,5219
4,0358
Cepa 37
Tabla: Cálculo de Peso molecular de plásmidos de cepas de primera corrida.
Cepa 5
PM aprox
(bp)
Mayor que
66320
46810,2
40447,3
15271,7
10860,2
70
De la misma forma se calcula para los plásmidos encontrados en la segunda
corrida, donde los datos obtenidos fueron los siguientes:
Distancia x
PM (bp)
Log PM
(Dx)
66320
4,8216
2,85
57660
4,7609
3,05
17963
4,2544
4,5
8000
3,9031
7,25
6000
3,7782
8
5000
3,6990
8,7
4000
3,6021
9,5
3000
3,4771
10,5
2750
3,4393
10,9
2500
3,3979
11,4
2250
3,3522
11,85
2000
3,3010
12,4
1750
3,2430
13,05
1500
3,1761
13,85
Tabla: Datos obtenidos de electroforesis para
cepas de segunda corrida.
Distancia F
(Df)
Rf
15,6
0,1827
15,6
0,1955
15,6
0,2885
15,6
0,4647
15,6
0,5128
15,6
0,5577
15,6
0,6090
15,6
0,6731
15,6
0,6987
15,6
0,7308
15,6
0,7596
15,6
0,7949
15,6
0,8365
15,6
0,8878
cálculo de peso plasmidial de
Siendo, al igual que para el caso anterior:
PM = Peso molecular expresado en pares de bases
Log PM = Logaritmo del peso molecular
Dx = Distancia recorrida por el marcador de peso molecular conocida (en cms)
Df = Distancia total recorrida por el frente de corrida (en cms)
Rf = Coeficiente de movilidad relativa, es el cociente entre Dx y Df
El gráfico de la segunda corrida fue el siguiente:
71
Aproximación Peso molecular Plásmidos
1
Rf = -0,4241 log PM + 2,1666
R = 0,98
Rf
0,8
0,6
0,4
0,2
0
3
3,5
4
4,5
5
Log PM
Gráfico: Relación entre el logaritmo del Peso molecular de marcadores con peso
conocido de la Segunda corrida con sus coeficientes de movilidad relativa respectivos.
De la misma forma descrita arriba, se calculó el Peso molecular para los plásmidos
de las cepas de la segunda corrida, dándose los siguientes resultados:
Distancia bandas de peso
molecular desconocidas (D*)
Cepa 18
Cepa 25
Rf*
Log PM*
Plasmido 1
4,95
0,3173
4,3605
Plasmido 1
6,35
0,4071
4,1489
Plasmido 2
9,05
0,5801
3,7408
Tabla: Cálculo de Peso molecular de plásmidos de cepas de segunda corrida.
PM
aprox
(bp)
22935,6
14089,7
5505,5
72