ES 1 EPSTEIN-BARR VIRUS (VCA) IFA IgM PVCAM10: Kit de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la determinación de anticuerpos IgM frente a virus de Epstein-Barr en suero humano. INTRODUCCIÓN: Los anticuerpos a antígenos de la cápside viral (VCA) del virus de EpsteinBarr (VEB) aparecen los primeros al producirse la infección. La técnica más utilizada por su sencillez, precocidad y ausencia de reacciones cruzadas es la inmunofluorescencia indirecta. La mononucleosis infecciosa es la enfermedad más común provocada por VEB y puede producir fiebre, adenopatías, esplenomegalia y faringitis. Algunos de estos casos pueden ser provocados por citomegalovirus, Toxoplasma gondii, adenovirus, etc. VEB produce además síndromes proliferativos en inmunodeprimidos y la infección se asocia a la patogénesis del linfoma de Burkitt y del carcinoma de nasofaringe. FUNDAMENTO DEL MÉTODO: El método de inmunofluorescencia indirecta está basado en la reacción de los anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la superficie del portaobjetos. Los anticuerpos específicos presentes en la muestra reaccionan con el antígeno, y las inmunoglobulinas no unidas por reacción con el antígeno son eliminadas en el proceso de lavado. En un paso posterior el complejo antígeno-anticuerpo es revelado mediante globulina antihumana marcada con fluoresceína, resultando visualizable mediante microscopio de fluorescencia. fluoresceína en tampón fosfatos con estabilizante de proteínas, azul de Evans y azida sódica. 6 VIRCELL MOUNTING MEDIUM: 3 ml de medio de montaje: glicerol tamponado (contiene azida sódica). 7 VIRCELL ANTI HUMAN IgG GLOBULIN (SORBENT): 2 viales de 1,5 ml de sorbente (suero de cabra anti-IgG humana, contiene azida sódica). Conservar entre 2 y 8ºC y comprobar la fecha de caducidad. Material necesario no contenido en el kit: Pipetas de precisión adecuadas. Incubador termostatizado. Agua destilada. Cubreobjetos de 24x60 mm. Microscopio de fluorescencia y filtros apropiados según recomendaciones del fabricante. Cámara húmeda. CONSERVACIÓN: Conservar entre 2 y 8ºC. No utilizar los componentes del kit después de la fecha de caducidad. Los kits son estables hasta el final del mes indicado en la fecha de caducidad, siempre que los componentes se mantengan cerrados y conservados entre 2 y 8ºC. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES UNA VEZ ABIERTOS: COMPONENTE PBS reconstituido Resto de componentes ESTABILIDAD 4 meses a 2-8ºC, siempre dentro de su fecha de caducidad Fecha indicada en envase a 2-8ºC ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS: Luz visible FITC Usar todos los reactivos en condiciones asépticas para evitar contaminaciones microbianas. Utilizar sólo la cantidad de sorbente, controles, PBS y conjugado necesaria para la realización de la prueba. No devolver a los viales el exceso sobrante. Una vez preparado el PBS debe ser conservado a 2-8ºC y no debe emplearse si presenta turbidez. Globulina anti-IgM humana Luz UV VIRCELL, S.L. no se responsabiliza de la inadecuada utilización de los reactivos contenidos en el kit. IgM humana anti-virus de Epstein-Barr Antígeno de virus de Epstein-Barr RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES: 1. CARACTERÍSTICAS: 2. Todos los reactivos a excepción del PBS vienen listos para su uso. Los componentes del equipo se presentan numerados para facilitar su identificación inequívoca. En el Procedimiento del Ensayo se indican los números de los reactivos que han de utilizarse en cada etapa. 3. CONTENIDO DEL KIT: 1 VIRCELL EPSTEIN BARR VIRUS (VCA) SLIDE: 10 portaobjetos de 10 pocillos con células P3HR1 (ATCC HTB-62), tratadas con formaldehido y fijadas con acetona, de las que aproximadamente sólo un 10-20% expresan los antígenos VCA. 2 VIRCELL PBS: 1 vial para preparar 1 l de PBS pH 7,2. 3 VIRCELL EBV IgM POSITIVE CONTROL: 200 µl de suero control positivo (contiene azida sódica). 4 VIRCELL EBV NEGATIVE CONTROL: 200 µl de suero control negativo (contiene azida sódica). 5M VIRCELL ANTI-HUMAN IgM FITC CONJUGATE: 2 viales de 1,1 ml de una solución de globulina anti-IgM humana marcada con 4. 5. 6. Este producto es sólo para diagnóstico in vitro y está destinado al uso por personal sanitario cualificado. Usar sólo componentes del kit. No mezclar los componentes de diferentes kits o fabricantes. Sólo el PBS, el sorbente, los portaobjetos y el medio de montaje son compatibles con los equivalentes en otras referencias y lotes de IFA VIRCELL. El resto de los componentes son compatibles entre distintos equipos cuando coincida el lote. Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del ensayo. Utilizar sólo material limpio y preferentemente desechable. No utilizar en caso de deterioro del envase. No pipetear con la boca. El sorbente, conjugado y controles de este equipo contienen material de origen animal. Los controles contienen además material de origen humano. Aunque los sueros control del equipo son sometidos a controles de ausencia de HBsAg, anticuerpos frente a VIH y Hepatitis C, es necesario manejar los controles y muestras del paciente como potencialmente patógenos. Los pocillos contienen antígeno de virus de Epstein-Barr inactivado, no obstante, deben manejarse con precaución. Ningún método actual puede asegurar por completo la ausencia de estos u otros agentes infecciosos. Todo el material debe ser manipulado y desechado como potencialmente infeccioso. Observe la regulación local en materia de residuos clínicos. PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712 http://www.vircell.com ES 2 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Por contener azida sódica (concentración <0,1%), debe evitarse el contacto del conjugado, sorbente, medio de montaje y controles con ácidos y metales pesados. Por contener glicerol, debe evitarse el contacto del medio de montaje con ácidos. No exponer a temperaturas elevadas. El azul de Evans (concentración <0,1%), es cancerígeno. Evite el contacto con la piel o los ojos. En caso de contacto lavar la superficie afectada con agua y solicitar asistencia médica. Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Si los intervalos o temperaturas de incubación empleados en la prueba no son los especificados, los resultados pueden ser erróneos. La contaminación cruzada por suero de distintos pacientes en un portaobjetos puede causar resultados equívocos. Tome las precauciones necesarias para evitarla. La óptica del microscopio, el mantenimiento y el tipo de fuente de luz pueden afectar la calidad de la fluorescencia. No dejar los reactivos a temperatura ambiente más tiempo del absolutamente necesario. Cada portaobjetos debe ser utilizado una sola vez. No debe ser fraccionado, ni se deben reutilizar los pocillos no usados. El kit contiene elementos de vidrio que en caso de rotura podrían provocar lesiones físicas. Manipular con precaución. Comprobar que la adición de sorbente a la muestra produce un inmunoprecipitado visible a simple vista. TOMA DE MUESTRA: La sangre debe extraerse en condiciones asépticas mediante técnicas de venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de técnicas estériles o asépticas para evitar la contaminación de la muestra. Los sueros deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8ºC si se van a procesar dentro de los 7 días siguientes a la toma. Si el procesamiento se va a prolongar deben congelarse a -20ºC, evitando las congelaciones y descongelaciones innecesarias ya que estas podrían provocar una disminución del título de las inmunoglobulinas, especialmente de IgM. No utilizar sueros hiperlipémicos o contaminados. Los sueros que presenten partículas pueden ser clarificados por centrifugación. CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberación asegurando el cumplimiento del protocolo de validación por el usuario mediante especificaciones más estrictas. Los resultados de control final de cada lote están disponibles. La correlación del material de control se asegura mediante ensayos paralelos frente a paneles de sueros de referencia internamente validados. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR EL USUARIO: En cada ensayo se deben incluir control positivo y negativo. Su utilización permite la validación de la prueba y el equipo. El patrón de fluorescencia que debe observarse será: Control positivo: Fluorescencia periférica, color verde manzana. Control negativo: Patrón celular rojo. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Una reacción positiva será aquella en la que se observe fluorescencia periférica, color verde manzana. Una reacción negativa será aquella en la que se observe un patrón celular rojo. Si en un suero se observara el patrón de fluorescencia positivo sobre más del 50% de las células del pocillo se considerará una reacción inespecífica. Patrones de fluorescencia diferentes a los definidos en el protocolo de validación no deben ser interpretados como positivos. Los anticuerpos IgG e IgM se comportan de diferente manera durante las primoinfecciones y las reinfecciones. En una primoinfección las IgG e IgM aparecen en casi todos los casos (la IgM aparece antes que la IgG). En una reinfección no aparecen anticuerpos de tipo IgM en todos los casos, siendo la detección de IgG el único modo de realizar el diagnóstico. En muchas enfermedades pueden existir títulos altos de IgG durante toda la vida del paciente, mientras que la IgM, en general, sólo se mantiene en suero durante 2 ó 3 meses después de la enfermedad, y por tanto son un marcador efectivo de infección reciente. LIMITACIONES DEL MÉTODO: PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS: El único reactivo que es necesario preparar con antelación a la realización de la prueba es el PBS. Para ello, agregar el contenido del vial 2 a 1 litro de agua destilada y agitar hasta completa disolución. Una vez preparada conservar entre 2 y 8ºC. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO: 1.-Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Permita que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente antes de abrirlos. 2.-Realizar una dilución 1/2 de los sueros, para ello poner 25 µl de suero en 25 µl de PBS 2. Los sueros control 3 y 4 no deben ser diluidos. 3.-Tratar los sueros diluidos con el sorbente de IgG 7, poniendo 5 µl de los sueros a 25 µl de sorbente y agitar vigorosamente. Los sueros control 3 y 4 no deben ser diluidos ni tratados con sorbente. Los sueros tratados se deben centrifugar para aclarar el precipitado del suero, el cual interfiere con la prueba. 4.-Poner 20 µl de suero tratado en cada pocillo del portaobjetos 1. Realizar lo mismo con los controles positivo 3 y negativo 4. 5.-Incubar en cámara húmeda durante 90 minutos a 37ºC. 6.-Enjuagar brevemente el portaobjetos 1 con PBS 2 (evitar verter directamente el PBS sobre los pocillos). Sumergir el portaobjetos durante 10 minutos en PBS. Dar un ligero lavado con agua destilada. 7.-Dejar que los portaobjetos 1 se sequen. 8.-Añadir 20 µl de solución de anti-IgM humana 5M en cada pocillo. (No requiere dilución). 9.-Incubar en cámara húmeda durante 30 minutos a 37ºC. 10.-Repetir los pasos 6 y 7. 11.-Añadir una pequeña gota de medio de montaje 6 a cada pocillo y poner el cubreobjetos. 12.-Examinar en microscopio de fluorescencia a 400x lo más rápidamente posible. De no ser así, mantener a 2-8ºC en oscuridad durante un máximo de 24 horas, hasta la observación. 1.-Este método está diseñado para ser utilizado con suero humano. 2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensión del folleto de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y reactivos, lavados y tiempos de incubación. 3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la sintomatología clínica y otros procedimientos diagnósticos. 4.-El test no indica el lugar de la infección. No pretende sustituir al aislamiento. 5.-La ausencia de un aumento significativo en el nivel de anticuerpos no excluye la posibilidad de infección. 6.-Las muestras recogidas muy pronto en el transcurso de una infección pueden no tener niveles detectables de IgG. En esos casos se recomienda realizar un ensayo para determinación de IgM, u obtener una segunda muestra transcurridos entre 14 y 21 días para ser ensayada en paralelo con la muestra original, con el fin de determinar una seroconversión. 7.-Los resultados obtenidos en la detección de IgG en neonatos deben ser interpretados con precaución, ya que las IgG maternas son transferidas pasivamente de la madre al feto antes del nacimiento. La determinación de IgM es mejor indicador de infección en niños menores de 6 meses. 8.-Los resultados de determinación de anticuerpos de una muestra única no deben ser usados para el diagnóstico de una infección reciente. Se deben recoger muestras pareadas (aguda y convaleciente) para ser ensayadas paralelamente y determinar seroconversión o un incremento significativo en el nivel de anticuerpos. 9.-Los sueros de algunos pacientes con enfermedades autoinmunes dan respuesta inespecífica sobre el sustrato celular empleado en la técnica de inmunofluorescencia. Estos sueros no podrán ser evaluados por esta técnica. PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712 http://www.vircell.com ES 3 RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE TRABAJO: PRESTACIONES SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD: Añadir la dilución del suero y los controles a los pocillos del portaobjetos 1 Se ensayaron 101 muestras de suero con EPSTEIN-BARR VIRUS (VCA) IFA IgM frente a un equipo de inmunofluorescencia indirecta de otra casa comercial, obteniendo los siguientes resultados: IgM Nº MUESTRAS 101 SENSIBILIDAD 97,9% Cámara húmeda ESPECIFICIDAD 100,0% 90 minutos a 37ºC 2 lavados con PBS 2 y un lavado con agua destilada Los sueros que no presentaron reacción específica fueron excluidos de los cálculos finales. Secar PRECISIÓN INTRAENSAYO: Añadir el conjugado con fluoresceína 5M Se titularon 3 sueros, 2 positivos y 1 negativo, pipeteados individualmente en grupos de 5 en un único ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo idénticas. En ningún caso se observaron oscilaciones superiores a 1 título. Cámara húmeda 30 minutos a 37ºC 2 lavados con PBS 2 y un lavado con agua destilada PRECISIÓN INTERENSAYO: Se titularon 3 sueros, 2 positivos y 1 negativo, pipeteados individualmente en 5 condiciones diferentes en las que variaron el operador o el día de realización. En ningún caso se observaron oscilaciones superiores a 1 título. Secar Una gota de medio de montaje 6 Depositar cubreobjetos REACCIÓN CRUZADA E INTERFERENCIAS: Se ensayaron 9 muestras caracterizadas positivas frente a otros virus o microorganismos del grupo taxonómico (citomegalovirus, herpes simplex 1 y 2, varicella-zoster) y grupo sindrómico (Brucella melitensis). Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la reacción específica del ensayo sin reacción cruzada o interferencias ocasionadas por los agentes descritos. Examinar al microscopio de fluorescencia 400x OTROS ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS: Se realizó un ensayo IFI a 25 sueros con factor reumatoide para determinación de anticuerpos IgM e IgG frente a 2 antígenos bacterianos y 2 antígenos virales. Además se realizó un ensayo IFI para determinación de anticuerpos IgG e IgM a otros 2 sueros caracterizados para cada uno de los antígenos. Para determinación IgM los sueros fueron tratados con sorbente anti-IgG. Se demostró la eficacia del tratamiento con sorbente para evitar interferencias en IgM ocasionadas por factor reumatoide. Se ha comprobado la eficacia del sorbente recomendado para evitar la aparición de falsos negativos por exceso de IgG. SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO: Producto para el diagnóstico in vitro Fecha de caducidad 8ºC Conservar entre 2-8ºC 2ºC ∑ x Contiene suficiente para <X> pruebas Lote Referencia (catálogo) Consultar instrucciones de uso BIBLIOGRAFÍA: 1. Bruu, A. L., R. Hjetland, E. Holter, L. Mortensen, O. Natas, W. Petterson, A. G. Skar, T. Skarpaas, T. Tjade, and B. Asjo. 2000. Evaluation of 12 commercial tests for detection of Epstein-Barr virus- specific and heterophile antibodies. Clin Diagn Lab Immunol 7:451-6. 2. de Ory, F., J. Antolaya, M. V. Fernández, J. M. Echevarría, and A. de la Loma. 1993. Comparison of diagnosis criteria for Epstein-Barr virus infection in children. Serodiagn Immunother Infect Dis 6:46-48. 3. Henle, W. and G. Henle. 1981. Epstein-Barr virus-specific serology in immunologically compromised individuals. Cancer Res 41:4222-5. 4. Niederman, J. C. 1985. Chronicity of Epstein-Barr virus infection. Ann Intern Med 102:119-21. 5. Okano, M., G. M. Thiele, J. R. Davis, H. L. Grierson, and D. T. Purtilo. 1988. Epstein-Barr virus and human diseases: recent advances in diagnosis. Clin Microbiol Rev 1:300-12. 6. Pearson, G. R., L. H. Weiland, H. B. Neel 3rd, W. Taylor, J. Earle, S. E. Mulroney, H. Goepfert, A. Lanier, M. L. Talvot, B. Pilch, M. Goodman, A. Huang, P. H. Levine, V. Hyams, E. Moran, G. Henle, and W. Henle. 1983. Application of Epstein-Barr virus (EBV) serology to the diagnosis of North American nasopharyngeal carcinoma. Cancer 51:260-8. 7. Sumaya, C. V., and H. B. Jenson. 1992. Epstein-Barr virus. p. 568-575. In N. R. Rose, E. Conway de Macario, J. L. Fahey, H. Friedman, G. M. Penn (ed). Manual of Clinical Laboratory Immunology. American Society for Microbiology. 8. Swanston, W., J. Mahony, B. McLaughlin, and M. Chernesky. 1986. Assessment of serologic markers for Epstein-Barr virus. Diagn Microbiol Infect Dis 5:235-44. Para cualquier aclaración o consulta, contactar con: [email protected] <X> pocillos REVISADO: Octubre-09 PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712 http://www.vircell.com ES 4 PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712 http://www.vircell.com