Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD
DE
COLIMA
DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLOGICAS
ESTUDIO DE LOS EFECTOS VOLTAJE DEPENDIENTES Y VOLTAJE
INDEPENDIENTES DE DIFERENTES AGONISTAS MUSCARINICOS SOBRE LA
CORRIENTE DE POTASIO ACTIVADA POR ACETILCOLINA. RELACION
ESTRUCTURA ACTIVIDAD.
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLOGICAS CON
ESPECIALIDAD EN FISIOLOGIA
PRESENTA
M. en C. DORA ELENA BENAVIDES HARO
ASESOR
Dr. JOSE ANTONIO SANCHEZ CHAPULA
CO-ASESOR
Dr. RICARDO ANTONIO NAVARRO POLANCO
COLIMA, COL., MAYO DE 2001
1
Mi agradecimiento a:
Dr. José Antonio Sánchez Chapula
Dr. Ricardo Antonio Navarro Polanco
Por su paciencia y valiosa enseñanza.
Por compartir conmigo sus conocimientos.
Sin ellos no seria posible este trabajo.
Dr. Alejandro Elizalde Lozano
M. en C. Rafael Madrigal Quiñónez
M. en C. Julián Torres Jacome
Lic. Bioq. Tania Ferrer Villada
Por su ayuda y apoyo cuando los necesité.
Claudia Olivia Mercado Ruiz
Juan Fernando Fernández
Por su ayuda y asistencia técnica.
Mis Padres
Por su apoyo incondicional.
Mis amigos y compañeros
Por su apoyo.
2
INDICE
PAGINA
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
1
RESUMEN
4
ABSTRACT
5
INTRODUCCIÓN
6
I
Canales de potasio
6
II
Corrientes de potasio activadas por voltaje
6
III Rectificadores entrantes
9
IV Caracterización molecular de los canales rectificadores entrantes,
10
Kirx.x
V
Corriente de potasio activada por acetilcolina (IK-ACh )
12
VI
Receptores muscarínicos
13
VII 4-AP y ChCl como agentes farmacológicos
15
VIII Tertiapina, una toxina que bloquea selectivamente IK-ACh
17
HIPOTESIS
18
OBJETIVOS
22
METODOS
23
RESULTADOS
26
I
Corrientes de potasio activadas por colina en miocitos auriculares
26
de diferentes especies de mamífero.
II
Evidencias que sugieren que la corriente activada por colina no es
sino
32
Curso temporal de la activación y la desactivación de la corriente
32
una
corriente
de
rectificación
tardía
“verdadera”,
posiblemente la activación voltaje-dependiente de IK-ACh.
dependiente de tiempo y voltaje inducida por colina.
Efectos de dofetilida e indapamida sobre la corriente activada por
34
colina.
Las corrientes activadas por colina y ACh durante pulsos
despolarizantes pueden tener similares cursos temporales.
3
34
INDICE (continuación)
PAGINA
Interacción de colina y adenosina.
38
La tertiapina bloquea las corrientes activadas por diferentes
40
agonistas muscarínicos.
¿La corriente voltaje -dependiente activada por colina se debe a la
43
activación de receptores M3 o M4?
Interacción de antagonistas específicos de receptores M2 , M3 y
44
M4 con ACh en miocitos auriculares de gato.
Interacción de antagonistas específicos de receptores M2 , M3 y
47
M4 con colina en miocitos auriculares de gato.
Una proteína G sensible a PTX está involucrada en la activación
50
de la corriente por colina.
III Corrientes
de
potasio
activadas
por
diferentes
agonistas
52
muscarínicos en miocitos auriculares de gato.
Corrientes activadas por ACh en miocitos auriculares de gato.
53
Corrientes activadas por tetrametilamonio (TMA) en miocitos
53
auriculares de gato.
Corrientes activadas por 4-AP y 3-AP en miocitos auriculares de
55
gato.
Corrientes activadas por trimetil(p-aminofenil)amonio en miocitos
57
auriculares de gato.
Efectos del ácido p-aminobenzoico y del ácido sulfanílico en
58
miocitos auriculares de gato.
Corrientes activadas por metacolina en miocitos auriculares de
61
gato.
Corrientes de potasio activadas por betanecol en miocitos
62
auriculares de gato.
Efecto de la tertiapina sobre la corriente activada por betanecol
en miocitos auriculares de gato.
4
64
INDICE (continuación)
PAGINA
Interacción de antagonistas específicos de receptores M2 , M3 y
66
M4 con betanecol en miocitos auriculares de gato.
DISCUSION
71
CONCLUSIONES
80
BIBLIOGRAFIA
82
5
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
TABLA ó FIGURA
Tabla No. 1 Corrientes de K + caracterizadas por técnicas
PAGINA
7
electrofisiológicas.
Figura No. 1 Estructuras de algunos agonistas muscarínicos.
21
Figura No. 2 Modelo antiguo del receptor muscarínico
21
Figura No. 3 Corriente activada por colina en miocitos auriculares de
27
perro.
Figura No. 4 Efecto de la colina sobre miocitos auriculares de
28
cobayo.
Figura No. 5 Corriente activada por colina en miocitos auriculares de
29
ratón.
Figura No. 6 Corriente activada por colina en miocitos auriculares de
30
conejo.
Figura No. 7 Corriente activada por colina en miocitos auriculares de
31
rata.
Figura No. 8 Dependencia de la concentración de colina del curso
33
temporal de la activación.
Figura No. 9 Efectos del bloqueador de IKr , dofetilida, y del
bloqueador de IKs , indapamida, sobre la corriente
35
activada por colina.
Figura No. 10 Las corrientes activadas por colina y por acetilcolina
pueden tener cursos temporales similares o diferentes
36
durante la despolarización, dependiendo del protocolo
de estimulo.
Figura No. 11 Efecto de variar la duración del pulso hiperpolarizante
sobre la corriente semejante a un rectificador tardío,
37
activada por colina.
Figura No. 12 Efecto de adenosina sobre la corriente activada por
colina en miocitos auriculares de cobayo.
6
39
TABLA ó FIGURA (continuación)
Figura No. 13 Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina,
PAGINA
40
sobre corrientes activadas por acetilcolina.
Figura No. 14 Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina,
41
sobre corrientes activadas por colina.
Figura No. 15 Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina,
42
sobre corrientes activadas por TMA.
Figura No. 16 Efecto de la methoctramina, antagonista M2
muscarínico, sobre la corriente activada por acetilcolina
44
en miocitos auriculares de gato.
Figura No. 17 Efecto del p-F-HHSiD, antagonista M3 muscarínico,
sobre la corriente activada por acetilcolina e n miocitos
45
auriculares de gato.
Figura No. 18 Efecto de la tropicamida, antagonista M4 muscarínico,
sobre la corriente activada por acetilcolina en miocitos
46
auriculares de gato.
Figura No. 19 Efecto de la methoctramina, antagonista M2
muscarínico, sobre la corriente activada por colina en
47
miocitos auriculares de gato.
Figura No. 20 Efecto del p-F-HHSiD, antagonista M3 muscarínico,
sobre la corriente activada por colina en miocitos
48
auriculares de gato.
Figura No. 21 Efecto de la tropicamida, antagonista M4 muscarínico,
sobre la corriente activada por colina en miocitos
49
auriculares de gato.
Figura No. 22 Efecto de PTX sobre la corriente activada por colina en
51
miocitos auriculares de gato.
Figura No. 23 Corriente activada por acetilcolina en miocitos
auriculares de gato.
54
7
TABLA ó FIGURA (continuación)
Figura No. 24 Corriente activada por tetrametilamonio (TMA) en
PAGINA
55
miocitos auriculares de gato.
Figura No. 25 Corriente activada por 3-AP y 4-AP en miocitos
56
auriculares de gato.
Figura No. 26 Efecto del trimetil(p-aminofenil)amonio sobre miocitos
58
auriculares de gato.
Figura No. 27 Efecto del ácido p–aminobenzoico sobre miocitos
59
auriculares de gato.
Figura No. 28 Efecto del ácido sulfanílico sobre miocitos auriculares
60
de gato.
Figura No. 29 Corriente activada por metacolina en miocitos
61
auriculares de gato.
Figura No. 30 Corriente activada por betanecol en miocitos
63
auriculares de gato.
Figura No. 31 Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh, tertiapina,
65
sobre corrientes activadas por betanecol.
Figura No. 32 Efecto de la methoctramina (30 nM), antagonista M2
muscarínico, sobre la corriente activada por betanecol
66
en miocitos auriculares de gato.
Figura No. 33 Efecto de la methoctramina (100 nM), antagonista M2
muscarínico, sobre la corriente activada por betanecol
67
en miocitos auriculares de gato.
Figura No. 34 Efecto del p-F-HHSiD, antagonista M3 muscarínico,
sobre la corriente activada por betanecol en miocitos
69
auriculares de gato.
Figura No. 35 Efecto de la tropicamida, antagonista M4 muscarínico,
sobre la corriente activada por betanecol en miocitos
auriculares de gato.
8
70
RESUMEN
En el presente trabajo encontramos que colina activa una corriente de potasio
con activación tiempo- y voltaje-dependiente en diferentes especies de mamífero.
Hasta ahora dos hipótesis han sido planteadas para la identificación de esta
corriente. Shi et al. (1999) han sugerido que colina y 4-AP activan rectificadores
tardíos diferentes a través de receptores muscarínicos diferentes, M3 y M4,
respectivamente. Una propuesta alternativa es que, 4-AP, colina, TMA, betanecol, y
otros agonistas muscarínicos activan la corriente IK-ACh en una forma voltajedependiente. Presentamos evidencias de que la corriente activada por colina no
posee características típicas de las corrientes rectificadoras tardías, el curso temporal
de la activación es dependiente de la concentración del agonista, la desactivación de
la corriente es voltaje-independiente y no es bloqueada por dofetilida e indapamida,
bloqueadores específicos de IKr e IKs , respectivamente. La corriente activada por
colina es bloqueada por tertiapina, un bloqueador específico de IK-ACh . El tratamiento
de los miocitos con PTX previene la activación de la corriente por colina, indicando
que una proteína Gi/o esta involucrada en el proceso de activación de la corriente.
Esto descarta la participación de receptores M3 , los cuales se acoplan a proteínas Gq,
insensibles a PTX. En trabajos previos utilizando registro de canal unitario hemos
encontrado que el canal activado por 4-AP y colina tiene una conductancia y cinética
similar al de IK-ACh .
La participación de otros subtipos de receptores muscarínicos además del
receptor M2 no es clara ya que los antagonistas supuestamente específicos para
receptores M3 y M4 no lo son en esta preparación de miocitos auriculares de gato.
Hemos mostrado evidencias de que la modulación por voltaje de la activación de
IK-ACh podría estar a nivel del receptor, y que cuando la interacción del agonista con el
receptor únicamente involucra la interacción del grupo amonio cuaternario del
agonista con el sitio aniónico del receptor, la interacción es voltaje-dependiente.
9
ABSTRACT
In the present study we found that choline activates a voltage- and timedependent potassium current in different mammalian species. To date, two
hypothesis have been established to identify this current. Shi et al. (1999) have
suggested that choline and 4-AP activate different delayed rectifiers through different
muscarinic receptors, M3 and M4 , respectively. An alternative hypothesis propose that
4-AP, choline, TMA, bethanechol and other muscarinic agonists activate the IK-ACh in a
voltage-dependent manner. We show evidence that the choline activated current do
not have the characteristics of a delayed rectifier current, the activation kinetic is
agonist concentration-dependent, the deactivation kinetic is voltage-independent and
the current is not blocked by the specific blockers of IKr and IKs , dofetilide and
indapamide. Tertiapin, a specific blocker of IK-ACh , blocks the choline activated current.
The activation of the choline-induced current is prevented by pretreatment with PTX,
this indicates that a Gi/o protein is involved in the process of the current activation.
This evidence excludes the participation of M3 receptors, which are coupled to a PTXinsensitive Gq protein. In previous studies, we found that 4-AP and choline activate a
single channel with conductance, mean open time and inward rectification properties,
similar to IK-ACh .
It is not clear the participation of other muscarinic receptor subtypes other than
M2 receptors because there are not any of the supposed specific mAChR antagonists
for M3 and M4 receptors, in cat atrial myocytes. We have shown evidences that the
voltage modulation IK-ACh activation could be at the receptor level, and when the
agonist interacts with the receptor it only involves the interaction of the charged amino
head group present in the agonist with the receptor anionic site, this interaction is
voltage-dependent.
10
INTRODUCCIÓN
I CANALES DE POTASIO
Los canales de K+ representan la clase más diversa de canales iónicos en el
corazón. Las corrientes que fluyen a través de canales de K+ son importantes en el
mantenimiento de la actividad eléctrica normal en la mayoría de las células
excitables. La mayoría de corrientes salientes que participan en la repolarización del
potencial de acción son corrientes de K+. Estos canales contribuyen a generar el
potencial de reposo de la célula y modulan la duración del potencial de acción. Las
corrientes de K+ en el miocardio pueden ser clasificadas en una de dos categorías 1)
Corrientes activadas principalmente por voltaje, tal como el rectificador tardío (IKr e
IKs ), la corriente de meseta (IKp) y la corriente transitoria saliente (Ito), y 2) Corrientes
con rectificación entrante, tal como el rectificador anómalo (IK1), la corriente modulada
por ATP (IK-ATP), la corriente activada por Acetilcolina (IK-ACh )
dependiente de
Na +
y
la corriente
intracelular (IK- Na+) (Kass y Freeman, 1993). Algunas de las
corrientes de K+ en miocitos cardiacos y sus características se resumen en la Tabla
1.
II CORRIENTES DE POTASIO ACTIVADAS POR VOLTAJE
Las corrientes de potasio salientes, mas importantes, activadas por voltaje
durante la meseta del potencial de acción de los tejidos cardiacos son: la corriente
transitoria de salida independiente de la concentración de calcio intracelular, Ito1 y las
corrientes de rectificación tardía IKr e IKs (Gintant, Cohen, Datyner y Kline, 1992; Barry
y Nerbonne, 1996). La corriente Ito es responsable principalmente de la fase inicial de
la repolarización (Gintant et al., 1992; Campbell, Rasmusson, Comer y Strauss,
1995). Las corrientes de rectificación tardía determinan la terminación de la meseta y
la duración del potencial de acción (Matsuura, Ehara e Imoto, 1987).
Como ya se mencionó anteriormente, la corriente Ito1 es acarreada por iones
K+ a diferencia de la corriente transitoria de salida activada por [Ca++]i , Ito2 , la cual es
acarreada por Cl- (Campbell et al., 1995). El umbral de activación de Ito1 esta en –30
mV y la activación máxima en +50 mV, la curva de inactivación en estado estable se
11
Tabla 1. Corrientes de K + caracterizadas en tejido cardiaco por técnicas
electrofisiológicas.
Conductancia de
Corriente de
Abreviatura
Características
un solo canal
+
K
(γγ)a.pS
Rectificador
tardío
Corriente
meseta
10-11
IKs
Muy lenta activación, sin inactivación. Activada
por voltaje, catecolaminas, estimulación de
protein-cinasa A o C, endotelina. Bloqueada por
+2
quinidina, tedisamil y Co .
<1-3
de
Corriente
saliente
transitoria
Corriente
sostenida
o
ultrarápida
Rectificador
anómalo
Activada por
Acetilcolina
(ACh).
Dependiente
de [ATP]i
Activada por
ácido
araquidónico
(AA).
Activada por
fosfatidilcolina
Activada por
[Na+ ]i
Retículo Sarcoplásmico
a
IKr
Activación moderadamente rápida, muy rápida
inactivación. Activada por voltaje. Bloqueada por
+3
E-4031, dofetilida, d-sotalol, La .
IKp
Ito1(Ieo)
IKsus (IKur)
IK1
IK-ACh
IK-ATP
IK-AA
Rápida activación, sin inactivación. Activada por
+2
voltaje. Bloqueada por Ba .
Rápida activación y rápida inactivación. Activada
por voltaje. Bloqueada
por
agonistas
α1-adrenérgicos
(fenilefrina,
metoxamina),
tedisamil,
4-Aminopiridina, Ba+2.
14
14-17 (5.4 K)
Activada por voltaje. Más rápida que IKr , sin
inactivación. Bloqueada por 4-aminopiridina.
Independiente de voltaje, presenta rectificación
+2
+
+2
+2
entrante. Bloqueada por Ba , Cs , Mg , Ca .
Similar a IK1, pero encontrada sólo en aurícula y
en fibras de Purkinje. Activada por voltaje; ACh,
CGRP, somatostatina, adenosina, endotelina,
+2
las subunidades βγ de GK. Bloqueada por Ba ,
+
+2
Cs , Mg , quinidina.
Cerrada bajo condiciones “normales”. Activada
por disminución en la [ATP]i, pinacidil,
cromakalim, nicorandil, RP 49356, SR 44866,
inhibidores
metabólicos
(CN-,
2,4-DNP).
Bloqueada por elevada [ATP]i, gliburida,
tolbutamida, 5-hidroxidecanoato.
Activada por AA, 6-ceto
bajo.
PGF1 ,
16.9 (5 K)
32
γα([K +]o)0.22
γ=13.3([K + ]o)0.23
γ=23.6([K + ]o)0.24
35 (5.4 K)
12-HHT, pHi
IK-PC
Activada por fosfatidilcolina, 12-HHT, PGF2
IK-Na+
Activada por [Na+]i > 20 mM; Kd para el Na+ = 66
mM, ouabaina, bajas [K+]e (por inhibición de
Na/K-ATPasa). Bloqueada por R56865
Bloqueada por Ca+2, neomicina.
SRK
medida en la presencia de 150 mM [K+]o .
(Datos tomados de tablas I y III, Sanguinetti, 1994).
12
124
60
210
154
encuentra entre –80 y –10 mV, con un voltaje medio de inactivación entre –40 y –30
mV (Gintant et al., 1992). La base molecular de Ito1 depende de la especie, en
humano, perro y gato este canal esta formado por las subunidad Kv4.3, en rata por
Kv4.2, Kv4.3 y Kv1.4, dependiendo la región ventricular de que se trate, en el conejo
el correlato molecular de Ito1 es la subunidad Kv1.4 (Barry y Nerbonne, 1996).
Noble y Tsien en 1969 propusieron por vez primera que el rectificador tardío
en células cardiacas estaba compuesta por dos componentes de corriente Ix1 e IX2.
La separación de los dos tipos de corrientes fue basada en la cinética de
activación o desactivación, potencial de inversión y grado de rectificación.
Posteriormente Sanguinetti y Jurkiewics (1990a), corroboraron en miocitos aislados
que efectivamente la corriente saliente de K+ llamada rectificador tardío (IK ), es la
suma de dos corrientes de K+ sobrepuestas, IKr e IKs . IKr activa rápidamente y lo hace
a potenciales mas negativos (-40 mV) que IKs (-10 mV). IKr contribuye
significativamente a la repolarización durante la meseta del potencial de acción
(-20 a +10 mV). KI r es bloqueada por el E-4031, un agente antiarrítmico clase III
(Sanguinetti y Jurkiewics, 1990a). Concentraciones relativamente bajas (<0.1 mM) de
La3+ corren la curva de activación de IKr a potenciales mas positivos (SánchezChapula y Sanguinetti, 2000) lo cual anteriormente hacía pensar en un bloqueo de IKr
por La3+ (Sanguinetti y Jurkiewics, 1990b). IKr presenta rectificación entrante la cual
se debe a una rápida inactivación de la corriente (Spector, Curran, Zou, Keating y
Sanguinetti, 1996). La densidad de corriente de IKr en células auriculares es 2.5
veces la medida en células ventriculares en cobayo (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1991).
IKs es una corriente mucho mas grande que activa muy lentamente,
y no es
bloqueada por el E-4031 o por bajas concentraciones de La3+ (Sanguinetti y
Jurkiewics, 1990a y 1990b). IKs es incrementada por la activación de receptores βadrenérgicos, mientras IKr
no es modulada por la activación β-adrenérgica
(Sanguinetti y Jurkiewics, 1991). Las bases moleculares de los canales que acarrean
las corrientes IKr e IKs han sido determinados recientemente. El canal IKr es formado
por la subunidad formadora del poro ERG, la cual pertenece a la famila ether-a-go-go
y la subunidad tipo β Mirp1 (Sanguinetti, Jiang, Curran y Keating, 1995; Abbot, Sesti,
Splawski, Buck, Lehmann, Timothy, Keating y Goldstein, 1999). El canal IKs está
13
formado también por la combinación de la subunidad formadora del poro KvLQT1
(KCNQ1) y la subunidad tipo β minK (Sanguinetti, Curran, Zou, Shen, Spector,
Atkinson y Keating, 1996).
III RECTIFICADORES ENTRANTES
Los canales a través de los cuales ocurre un movimiento iónico entrante o
saliente simétrico, que está limitado sólo por la magnitud de la fuerza electroquímica
son canales lineales u óhmicos es decir, que no rectifican (Kass y Freeman, 1993).
Esta característica es producto de una resistencia constante para un determinado
rango en el potencial de membrana. Por lo cual la corriente es linealmente
dependiente del voltaje y es descrita por la
Ley de Ohm: I = V / R (Katz, 1992).
Los canales que permiten el paso de corriente mas fácilmente en un sentido que en
otro son conocidos como canales rectificadores, es decir, que la relación corrientevoltaje deja de ser lineal (Kass y Freeman, 1993). La rectificación ocurre cuando la
resistencia es alterada por un cambio en el voltaje (Katz, 1992).
Para algunos canales de K+ con marcada rectificación entrante se ha
demostrado que la rectificación puede ser removida al exponer la superficie interna
de la célula a una solución libre de iones divalentes, y la rectificación entrante es
restaurada cuando se adiciona de 0.5 a 1 mM de Mg+2 a la solución (Matsuda,
1991). En la presencia de Mg +2, la conductancia decrece a potenciales positivos a E K
(potencial de equilibrio para el ion potasio), y la relación corriente-voltaje muestra una
pendiente negativa (Vandenberg, 1987; Matsuda, 1990).
El Mg+2 se mueve dentro de la parte interna del canal a través de un campo
eléctrico hacia el lado externo de la membrana. El Mg+2 permanece en un sitio, el
cual tiene una alta afinidad para éste, evitando el eflujo de K+. A voltajes negativos a
EK, en donde el movimiento de K+ es hacia adentro, el Mg+2 es conducido hacia el
interior de la célula, desbloqueando el canal (Matsuda, 1991).
El bloqueo voltaje-dependiente por Mg+2 interno puede explicar la rectificación
entrante en algunos canales, en otros, un bloqueo intrínseco voltaje-dependiente
juega un rol importante. Esta, así llamada, rectificación entrante intrínseca, requiere
factores solubles que no son Mg+2 y que se han encontrado en oocitos de Xenopus y
14
otras células (Lopatin, Makhina y Nichols, 1994). Caracterizaciones bioquímicas y
fisiológicas identifican a esos factores como poliaminas (espermina, espermidina,
putrescina y cadaverina). La rectificación por poliaminas es reversible. La
rectificación resulta del bloqueo voltaje-dependiente del poro del canal por
poliaminas, no de un sensor de voltaje propio de la proteína del canal (Lopatin et al.,
1994).
El Mg+2 causa un rápido bloqueo voltaje-dependiente de los canales Kir2.1
clonados (Kir2.1, canal de potasio clonado que posee características similares a IK1)
y
expresados
en
oocitos
de
Xenopus.
Espermina
y
espermidina
son,
respectivamente, cerca de 100 y 10 veces más potentes bloqueadores de los canales
Kir2.1 que putrescina o Mg+2. Se ha demostrado que el bloqueo voltaje-dependiente
de las poliaminas es directamente proporcional al número de cargas positivas de
éstas moléculas. (Lopatin et al., 1994).
El bloqueo voltaje-dependiente por Mg+2 intracelular se observa en los canales
del rectificador anómalo (IK1) (Matsuda, 1991), en los canales de K+ dependientes de
ATP (IK-ATP) (Findlay, 1987; Horie, Irisawa y Noma, 1987), canales de K+ acivados
por ACh (IK-ACh ) (Horie e Irisawa, 1987 y 1989) y los canales de K+ activados por Na +
intracelular (IK-Na+) (Wang, Kimitsuki y Noma, 1991).
IV CARACTERIZACION MOLECULAR DE LOS CANALES RECTIFICADORES
ENTRANTES, Kirx.x
Desde la clonación del locus del Shaker de Drosophila (Papazian, Timpe, Jan
y Jan, 1987), una gran familia de genes de canales de K+ activados por voltaje (Kv)
se han aislado y expresado. Las subunidades del canal Kv consisten de dos
dominios citoplasmáticos un amino-terminal y otro carboxi-terminal, seis dominios
transmembranales (S1-S6), y una asa hidrofóbica P o H5 entre el quinto y el sexto
dominios transmembranales (Hille, 1992). Las subunidades de canales de K+ con
rectificación entrante (Kir) tienen solo dos dominios transmembranales (M1 y M2) en
cada subunidad, unidos por el asa H5, la cual es la responsable de la selectividad a
K+ en los canales Kv (Heginbotham, Abramson y MacKinno n, 1992). La evidencia a
partir de canales expresados con mutaciones con propiedades de rectificación
15
alteradas, indican que los canales Kir, como los Kv, están formados por tetrámeros
(Yang, J. Jan, Y. N. y Yang L. Y., 1995a). Existen por lo menos seis subfamilias de
canales Kir, llamadas Kir1 a Kir6. La subfamilia Kir1 presenta una rectificación débil,
y es expresada predominantemente en el riñón, aunque también en varias áreas del
cerebro. McNicholas, Wang, Ho, Hebert y Giebisch (1994) han presentado evidencia
que una isoforma es inhibida por ATP citoplasmático. Xu, Yang y Hebert (1996)
demostraron que tres sitios de fosforilación en los cuales actúa la protein cinasa A
(PKA), son esenciales para mantener la actividad de los canales. La subfamilia Kir2
presentan fuerte rectificación entrante, son expresados en el corazón y sistema
nervioso y la rectificación tiempo- y voltaje-dependiente de los canales expresados es
virtualmente indistinguible del canal nativo IK1 en el corazón (Ishihara y Hiraoka,
1994; Ishihara, Mitsuiye, Noma y Takano, 1989; Oliva, Cohen y Pennefather, 1990;
Stanfield et al., 1994a). La subfamilia Kir3 presenta fuerte rectificación entrante y son
activados a través de proteínas G, y hay evidencia de que son expresados en
corazón, cerebro y tejidos endócrinos (Ferrer et al., 1995; Karschin et al., 1994; Kubo,
Reuveny, Slesinger, Jan y Jan, 1993). Krapivinsky et al. (1995) encontraron que las
subunidades Kir3.4 se co-ensamblan con Kir3.1 para formar IK-ACh y que éstas
subunidades no forman el canal funcional KATP. Las subfamilias Kir4 y Kir5 se ha
descubierto que se encuentran en cerebro. Kir4.1 presenta una débil rectificación
cuando son expresados solos, pero Kir5.1 no forma canales en expresión
homomérica en ovocitos (Bond et al., 1994). Algunos trabajos han demostrado que
esas dos subunidades pueden co-expresarse para formar canales (Pessia, Tucker,
Lee, Bond y Adelman, 1996). Se ha encontrado que miembros de la subfamilia Kir6
codifican una subunidad KATP, pero la expresión de canales activos requiere la coexpresión de Kir6.2 o Kir6.1 con el receptor a sulfonilurea (SUR) (Ammala,
Moorhouse, Gribble, Ashfield, Proks, et al., 1996).
Stanfield et al., (1994b) demostraron que un residuo de glutamato en el
segundo dominio transmembranal M2 es en parte responsable del bloqueo por Mg +2.
Yang, Jan Y. N. y Jan L. Y., (1995b) subsecuentemente demostraron que E224 (en la
porción C-terminal de Kir2.1) es el principal determinante de la sensibilidad tanto al
Mg+2 como a las poliaminas, y que la ne utralización de las cargas negativas en
16
M2(D172N) y en la porción C-terminal (E224G) reducen la sensibilidad a poliaminas y
Mg+2 semejante a Kir1.1.
V CORRIENTE DE POTASIO ACTIVADA POR ACETILCOLINA (I K-ACh)
La acetilcolina (ACh) modula las funciones cardiacas activando algunas vías
de regulación celular. Para los canales iónicos las mas prominentes de esas
incluyen, la activación de la corriente de K+ rectificadora entrante IK-ACh y la inhibición
de la corriente de calcio tipo-L (ICa-L), tanto la basal en nodo seno-auricular,
células auriculares (Iijima, Irisawa y Kameyama, 1985; Wang y Lipsius, 1995) y
células de nodo auriculo-ventricular de conejo (Habuchi, Nishio, Tanaka, Yamamoto,
Lu y Yoshimura, 1996), como la aumentada por estimulación β-adrenérgica. Ambos
efectos son bloqueados por atropina y son mediados por la activación de receptores
muscarínicos M2 (Giles y Noble, 1976; Szabo y Otero, 1990). La ACh también inhibe
la corriente de marcapaso, If de células nodales, por un mecanismo que involucra la
inhibición de la adenilato ciclasa, la disminución de la producción de AMPc y un
corrimiento de la curva de activación de If a voltajes mas negativos (DiFrancesco y
Tromba, 1988a y 1988b), mientras que las catecolaminas desplazan la curva de
activación en dirección positiva (DiFrancesco, 1986). La acción de ACh sobre If
también es mediada por receptores muscarínicos y es bloqueada por atropina
(DiFrancesco y Tromba, 1988a).
Estudios de fijación de voltaje registrando corrientes macroscópicas y de canal
único, han confirmado la activación directa de IK-ACh
a través de un receptor
muscarínico M2. En el proceso de activación del canal de K+ activado por acetilcolina
(KACh) interviene un tipo de proteína G (Gi/o (GK), sensible a toxina pertussis). Las
proteínas G son heterotrímeros que constan de las subunidades α, β y γ las cuales
traducen la información del receptor (muscarínico M2) hacia las moléculas efectoras
(p. ejem. canal iónico). En la ausencia de un agonista, el GDP ocupa el sitio catalítico
de GTPasa localizado en Gα. El cambio conformacional en la molécula del receptor,
producida por la unión del agonista, influye a la proteína G para que libere al GDP
que tiene unido, así el GTP intracelular toma el lugar dejado por el GDP “reacción de
17
intercambio”, hasta ser hidrolizado a GDP. La cinética de esta hidrólisis es
relativamente lenta. Durante la hidrólisis Gα se disocia de Gβγ. Este estado se
conoce como el estado activado de la proteína G (Spiegel, 1996). La activación
desaparece cuando el GDP proveniente de la hidrólisis del GTP, ocupa el sitio
catalítico en Gα, entonces Gα se reasocia con Gβγ para formar la configuración
estable de la proteína G. Esta serie de eventos de la proteína GK relacionados con la
activación del canal KACh, se ha demostrado que es un proceso delimitado a la
membrana plasmática (Kurachi, 1995). Se ha demostrado que las subunidades Gβγ
son las que activan el canal KACh (Logothetis, Kurachi, Galper, Neer y Clapham,
1987; Clapham y Neer, 1993; Wickman, Iñiguez-Lluhi, Davenport, Taussig,
Krapivinski, et al., 1994). Se ha reportado que en los canales Kir3 (familia a la que
pertenecen las subunidades que forman IK-ACh ), existen cuatro sitios a los cuales se
les pueden unir los dímeros βγ, por lo tanto son cuatro subunidades βγ las que se
unen al canal (Corey y Clapham, 2001).
La aplicación de ACh a miocitos auriculares y ventriculares, causa
acortamiento de la duración del potencial de acción. Los efectos de ACh son
mayores en aurícula que en ventrículo, esto se debe a que la densidad del complejo
receptor muscarínico-proteína G-canales KACh es menor en ventrículo (Koumi S-i.,
Sato y Hayakawa, 1995). En la ausencia de estimulación vagal, IK-ACh puede ser
considerada como una corriente saliente de fondo que contribuye al potencial de
marcapasos (Irisawa y Hagiwara, 1991).
VI
RECEPTORES MUSCARINICOS
La evidencia acumulada indica que las respuestas funcionales muscarínicas
de las células a ACh son mediadas por múltiples subtipos de receptores
muscarínicos (Hulme, Birdsall y Buckley, 1990; van Zwieten y Doods, 1995). La
heterogeneidad de los receptores muscarínicos a acetilcolina (mAChRs) fue sugerida
primero sobre las bases de los perfiles farmacológicos (diferente afinidad y estudios
funcionales) de los receptores a agonistas y antagonistas (Goyal, 1989; Hulme et al.,
1990). A la fecha cuatro diferentes subtipos han sido definidos farmacológica y
18
funcionalmente en diferentes tejidos, designados como M1, M2, M3 y M4 (Eglen y
Whiting, 1990; Mutschler, Moser, Wess y Lambrecht, 1995; van Zwieten y Doods,
1995, Eglen, Hegde y Watson, 1996). De acuerdo con la bien documentada
heterogeneidad farmacológica de los receptores muscarínicos, los estudios de
clonación molecular han revelado la existencia de cinco distintos receptores
muscarínicos ( m1 a m5). m1, m3 y m5 se caracterizan por estar acoplados
preferentemente a la vía del fosfatidil inositol bifosfato (PIP 2), y m2 y m4 los cuales
están asociados con la inhibición de la adenilato ciclasa. (Bonner, 1989). Cuatro de
esos subtipos de receptores clonados, m1, m2, m3 y m4, corresponden a los
receptores funcionales M1,M2,M3 y M4. La relevancia fisiológica del receptor m5
permanece aun desconocida.
Estos receptores están conformados por una proteína genérica que consiste
de 7 hélices hidrofóbicas transmembranales (TM I - VII) unidas por asas
intracelulares (i1 - i3) y extracelulares (o2 - o4) alternadas entre sí, un dominio
extracelular amino-terminal (o1) y un dominio intracelular carboxi-terminal (i4).
(Bonner, 1989).
La unión de un ligando a los receptores muscarínicos se ha predicho que
ocurre en un receptáculo formado por las asas extracelulares y los siete dominios TM
teniendo un arreglo parecido a un anillo. La unión del ligando al receptor se inicia por
una interacción iónica entre la carga positiva del grupo amino presente virtualmente
en todos los ligandos de los receptores muscarínicos y un residuo de Asp localizado
en TM III (Asp 147 en el receptor m3 clonado de la rata) (Wess, 1993). Todos
los receptores muscarínicos conservan una serie de residuos de Thr y Tyr, lo cual no
ocurre con otros receptores acoplados a proteínas G. Los grupos hidroxilo presentes
en la cadena lateral de esos aminoácidos (Aa) interactúan específicamente con el
éster de la ACh por medio de puentes de hidrógeno (Wess, 1993). Todos los
residuos de Thr y Tyr que son críticos para la unión de ACh están localizados entre
las dos primeras vueltas de la hélice de la proteína de manera que se encuentran en
la superficie de la membrana sobre TM III, V, VI y VII. Esos Aa junto con el Asp en
TM III definen el dominio de unión de la ACh sobre el receptor muscarínico. En base
a esto se puede especular que el complejo ACh-receptor está caracterizado por un
19
enlace iónico entre el amonio cuaternario de la ACh y un Asp 147 en TM III y, una
complicada red de puentes de hidrógeno mas que por pocos y bien definidos puntos
de contacto. (Wess, 1993).
Como se ha mencionado en párrafos anteriores los receptores muscarínicos
M2 están acoplados a proteínas G. Se ha encontrado que existen múltiples
mecanismos para controlar el señalamiento y densidad de receptores acoplados a
proteínas G (GPRs). Las vías de señalamiento que se activan necesitan
desactivarse para asegurar que el señalamiento pueda llevarse a cabo en una
manera espacio-temporal que permita la regulación precisa de la función celular.
Para remover los agonistas de los receptores, múltiples mecanismos intracelulares
contribuyen a la terminación del señalamiento en los GPRs. Muchos de esos
eventos involucran la regulación de los GPRs (GPRs fosforilados por protein cinasas
y consecuentemente desacoplados de las proteínas G), mientras que otros
disminuyen el número de receptores (GPRs secuestrados de la superficie celular
siendo inaccesibles para su activación por ligandos). Esa terminación de los eventos
de señalamiento es comúnmente referida como desensibilización, la cual se define
como una disminución en el señalamiento del receptor aún en la continua presencia
del estímulo. (Bünemann, Lee, Pals-Rylaarsdam, Roseberry y Hosey, 1999).
VII 4-AP Y ChCl COMO AGENTES FARMACOLOGICOS
Desde el estudio inicial de Pelhate y Pichon (1974) en el cual demostraron el
efecto bloqueador que la 4-aminopiridina (4-AP) tiene sobre la corriente de
rectificación tardía en axones de cucaracha, 4-AP ha sido ampliamente utilizada
como herramienta farmacológica para bloquear distintas corrientes de K+ (Ulbricht y
Wagner, 1976; Meves y Pichon, 1977). Colina (ChCl) también es utilizada como
herramienta farmacológica para discriminar entre corrientes acarreadas por iones
distintos. Colina se usa frecuentemente como sustituto de sodio para mantener las
condiciones equimolares en las soluciones utilizadas para el registro de corrientes de
K+, ya que, además, se sabe que colina no bloquea canales de K+ . Colina es
además un precursor y un metabolito de ACh. Los efectos de colina como agonista
de receptores muscarínicos han sido reportados en corazón, donde disminuye la
20
frecuencia cardiaca y acorta la duración del potencial de acción auricular (Shi et al.,
1999). Por otra parte, estudios realizados en miocitos auriculares de perro sugieren
que colina y 4-AP, además de activar IK-ACh activan rectificadores tardíos diferentes
de IKr e IKs , a los cuales han llamado IKCh e IK4AP respectiva mente (Fermini y Nattel,
1994; Shi, Wang, H. y Wang, Z., 1999). Shi et al. en 1999, además, sugieren la
presencia de múltiples receptores muscarínicos en aurícula de perro y muestran
evidencias que IK4AP es activado a través del receptor M4, y Wang, Shi, Lu, Yang y
Wang, 1999 sugieren que IKCh es activado a través de receptores M3 . Sin embargo,
se han mostrado múltiples evidencias que señalan al receptor M2 como el único
subtipo funcional presente en el corazón (Watson, Yamamura y Roeske, 1983;
Bonner, Buckley, Young y Brann, 1987; Mizushima, Uchida, Zhou, Kagiya y Yoshida,
1987; Peralta, Ashkenazi, Winslow, Smith, Ramachandran, y Capon, 1987) y que
contribuye a la regulación de la frecuencia cardiaca, la contractilidad y la forma y
duración de los potenciales de acción (Jeck, Lindmar, Loffelholz y Wanke, 1988; van
Zwieten y Doods, 1995). Recientemente, Meyer, Wellner-Kienitz, Biewald, Bender,
Eickel y Pott, 2001, encontraron que los receptores muscarínicos M3, no están
presentes en miocitos de aurícula de rata. Al hacer RT-PCR en miocitos aislados y
cultivados, no encontraron el transcripto para el M3AChR, sin embargo, al hacer el
RT-PCR del cultivo de la aurícula completa, sí lo encontraron. Esto es, que lo
reportado por Shi et al. (1999), pudiera ser un artefacto de los M3AChR que se
encuentran en células endoteliales y vasos, presentes en la aurícula completa. Mas
aún, es difícil suponer la existencia de canales que puedan ser específicamente
activados por sustancias exógenas.
En 1997, Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula, encontraron que en células
auriculares de gato, 4-AP activa aparentemente dos componentes de corriente de
K+. Un componente de fondo y un segundo componente activado por pulsos
despolarizantes, con una activación claramente dependiente de tiempo, muy similar
a un rectificador tardío. Sin embargo, encontraron que ambos componentes de
corriente son acarreados por K+, son inhibidos por atropina, por GDPβS (análogo no
hidrolizable del GDP) y por Toxina pertussis (PTX). Lo que hace evidente la
participación de una proteína G en la mediación del efecto activador de 4-AP. Por
21
otra parte, mostraron que bloqueadores específicos para los rectificadores tardíos
(IKs e IKr ) no tienen efecto sobre la corriente activada por 4-AP. Además, mostraron
que 4-AP activa un canal con conductancia y cinética similares al canal IK-ACh . Estos
resultados les permitieron descartar la participación de un rectificador tardío, al
menos, de los descritos hasta ahora en células cardiacas. Otro de los resultados
sorpresivos en este trabajo fue el claro antagonismo dependiente de voltaje que
produce ACh sobre la corriente activada por 4-AP. Estos autores plantearon dos
posibilidades para explicar sus resultados; a) la activación de un nuevo subtipo de
receptor muscarínico en el cual ACh actúa como antagonista y, b) una activación
voltaje y tiempo dependiente de IK-ACh por 4-AP.
Recientemente, en nuestro
laboratorio se encontró que colina es capaz de activar una corriente de K+ con
características semejantes a las descritas para la corriente activada por 4-AP en este
mismo tipo de células. De igual forma encontramos que colina activa al canal IK-ACh
de manera voltaje dependiente. Esto es, que la actividad del canal
(NP 0) se
incrementa conforme el voltaje se hace mas positivo (datos no publicados).
VIII TERTIAPINA UNA TOXINA QUE BLOQUEA SELECTIVAMENTE IK-ACh
Tertiapina es un péptido compuesto por 21 aminoácidos, aislado del veneno
de la abeja. Estudios recientes han mostrado evidencias de que bloquea
selectivamente algunos tipos de canales rectificadores entrantes de K+, Kir (Jin y Lu,
1998). En miocitos aislados de aurícula de conejo y en corazones de conejo
perfundidos por el método de Langendorff, tertiapina ha sido descrito como un
bloqueador selectivo del canal IK-ACh , mostrando un IC 50 de entre 8 y 30 nM,
respectivamente (Kitamura, et al., 2000; Drici, Diochot, Terrenoire, Romey y
Lazdunski, 2000). Estos autores encontraron además que tertiapina aún a una
concentración 1 µM no modifica otros canales iónicos cardiacos como INa, ICa-L, Ito ,
IKr , IK1 e IK-ATP.
22
HIPÓTESIS
I
La activación voltaje y tiempo dependiente de la corriente por colina es
independiente de la especie.
Argumento:
El trabajo de Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula (1997) fue el primero en
reportar que el bloqueador de corrientes de potasio 4-AP, es capaz de activar una
corriente de potasio con características de un rectificador tardío en miocitos
auriculares de gato. Esto plantea la posibilidad de que este efecto es una “rareza”
farmacológica observada únicamente en esa preparación. Resultados similares
obtenidos con el agonista colinérgico colina, en la misma preparación (NavarroPolanco, 1997), plantean la posibilidad de que éste sea un fenómeno mas
generalizado y esté presente en otras especies de mamífero comúnmente utilizadas
en el laboratorio.
II
Las corrientes entrantes y salientes inducidas por los agonistas muscarínicos
colina, 4-AP, betanecol y TMA, se deben a la activación voltaje-dependiente
del canal IK-ACh , a través del recepto r muscarínico M2. Alternativamente, se
deben a la activación de diferentes canales de rectificación tardía no
caracterizados (Shi et al., 1999; Wang, Shi, Lu, Yang y Wang, 1999), a través
de los receptores muscarínicos, colina (M3 ), TMA (M3 ), 4-AP (M4 ), betanecol
(¿?).
Argumento:
En nuestro laboratorio hemos encontrado diferentes evidencias indirectas que
nos sugieren que 4 -AP y colina activan la corriente rectificadora entrante IK-ACh en una
forma voltaje-dependiente. Experimentos estudiando la inhibición de estas corrientes
por el antagonista inespecífico de receptores muscarínicos, atropina, nos sugieren
además que la modulación voltaje-dependiente podría ser a nivel del receptor
muscarínico (Navarro-Polanco, 1997). Atropina a concentraciones relativamente
bajas (< 100 nM) inhibe las corrientes activadas por 4-AP y colina a potenciales
negativos, a los cuales la afinidad del receptor por estos agonistas es baja, cuando
23
se aplican pulsos despolarizantes, y la afinidad del receptor por los agonistas
aumenta, la inhibición inducida por atropina disminuye. Por otro lado, el efecto
inhibidor de atropina a dosis bajas o altas de las corrientes inducidas por ACh es
voltaje -independiente. Otra evidencia que apoya nuestra hipótesis de que 4-AP y
colina activan IK-ACh es la obtenida en experimentos registrando canal único. Los
valores de la conductancia y los tiempos medios de apertura y cierre de los canales
activados por 4-AP y colina es similar a los valores que presentan los canales
activados por ACh (Navarro-Polanco, 1997; Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula,
1997).
En experimentos realizados en miocitos auriculares de perro, Shi et al. (1999)
reportaron que 4-AP activa una corriente similar a la reportada por Navarro-Polanco y
Sánchez-Chapula (1997) en aurícula de gato. Shi et al. (1999) sugieren que 4-AP a
través del receptor muscarínico M4, activa una corriente rectificadora tardía aun no
identificada. En ese mismo trabajo (Shi et al., 1999), se describe que TMA activa a
través del receptor muscarínico M3 otra corriente rectificadora tardía, tampoco
identificada. La conclusión de que las corrientes activadas por 4-AP y TMA son
diferentes, las basa principalmente en el hecho de que aparentemente las cinéticas
de ambas corrientes son diferentes. La conclusión de que 4-AP y TMA activan
diferentes tipos de receptores muscarínicos, fueron obtenidos de experimentos
estudiando antagonistas supuestamente específicos para los diferentes tipos de
receptores (M2, M3 y M4).
III La corriente de potasio voltaje- y tiempo-dependiente acoplada a receptores
muscarínicos es capaz de activarse por agonistas muscarínicos que guardan
cierta similitud estructural. El grupo amonio cuaternario es indispensable para
activar al receptor muscarínico. En cambio, la presencia del grupo éster es lo
que determina el que exista o no, una dependencia de voltaje de la unión del
ligando al receptor y la activación de IK-ACh .
Argumento:
Los receptores muscarínicos pertenecen a una superfamilia de receptores
llamados receptores metabotrópicos y que se caracterizan por estar acoplados a
24
proteínas
G.
A
los
receptores
metabotrópicos
se
unen
la
mayoría
de
neurotransmisores como por ejemplo: ACh, glutamato, serotonina y GABA. Este tipo
de receptores también son los responsables de la transducción del olor y el gusto y
tienen la peculiaridad de ser estimulados por una gran variedad de moléculas.
Residuos específicos dentro del receptáculo formado por las asas extracelulares y
los siete dominios transmembranales, parecen conferir a un receptor dado la
disponibilidad para unirse con relativa y variable afinidad a un amplio rango de
diferentes ligandos. Por ejemplo, ésta es la base para la disponibilidad del animal
para discriminar entre un sin número de moléculas odoríferas. (Mac Leish, Shepherd,
Kinnamon y Santos-Sacchi, 1999). El alineamiento de las secuencias de aminoácidos
de este tipo de receptores, reveló que existe un residuo Asp en el TM III, cuya
posición equivale a la del Asp 147 del receptor muscarínico m3, en aquellos
receptores a los que se unen aminas biógenas (endógenas) y, en cambio, no estaba
presente en otros receptores acoplados a proteínas G.
Partiendo de que la estructura de la ACh (Fig. 1), posee un amonio cuaternario
el cual se une a la parte aniónica del receptor (Asp en TM III) y una porción éster que
forma puentes de hidrógeno con los residuos de Thr y Tyr que se encuentran en TM
III, V, VI y VII (Wess, 1993) y las características de activación de IK-ACh , proponemos
que:
La red formada por los puentes de hidrógeno entre la porción éster de la ACh
y el receptor muscarínico son importantes para una alta afinidad y unión
independiente de voltaje. Moléculas como la colina y 4-AP que no tienen la parte
éster de la ACh (Fig. 1) sólo se unen a la parte aniónica del receptor (Fig. 2) con
dependencia de voltaje. Además, suponemos que la despolarización del potencial de
membrana induce a un cambio conformacional facilitando el acceso de los ligandos
(efecto estérico) al sitio aniónico y consecuentemente incrementando la afinidad para
los ligandos como colina y 4-AP. Esto nos hace suponer que moléculas como colina,
tetrametilamonio (TMA), 4-aminopiridina (4-AP), 3-aminopiridina (3-AP), ác. paminobenzoico (PABA), ác. sulfanílico y trimetil(p-aminofenil)amonio (Fig. 1),
que
carecen de la porción éster, se unen al receptor muscarínico y activan IK-ACh de una
manera dependiente de voltaje. Mientras que, moléculas como la metacolina y el
25
betanecol (Fig. 1), forman una red de puentes de hidrógeno debido a que poseen la
porción éster, activando IK-ACh de una manera voltaje independiente. Esto es, el grupo
amonio cuaternario es indispensable para activar al receptor muscarínico, en cambio,
la presencia del grupo éster es lo que determina el que exista o no una dependencia
de voltaje de la unión del ligando al receptor y la activación de IK-ACh .
O
CH3
+
H3 C
N
CH2
CH2
O
CH3
+
N
CH2
CH
O
CH3
N
C
CH3
CH2
CH
O
CH3
C
N
N
CH3
COOH
SO3
-
Betanecol
CH2
CH2
Ac. Sulfanílico
OH
Colina
H3 C
CH3
H3 C
NH2
Ac. p-aminobenzoico
CH3
+
NH2
NH2
CH3
+
N
3-aminopiridina
O
CH3
H3 C
N
4-aminopiridina
Metacolina
CH3
+
NH2
O
CH3
H3 C
NH2
CH3
Acetilcolina
CH3
H3 C
C
H3 C
+
N
H3 C
CH3
NH2
Trimetil(p-aminofenil)amonio
Tetrametilamonio
Figura 1. Estructuras químicas de compuestos cuya acción fue probada sobre el
receptor muscarínico.
Figura 2. Modelo del receptor muscarínico (tomado de Wess, 1993).
26
OBJETIVOS
1.-
Determinar si el agonista muscarínico colina induce en miocitos auriculares de
diferentes especies de mamífero (perro, cobayo, conejo, ratón y rata) una
corriente de potasio voltaje- y tiempo-dependiente similar a la observada en
miocitos auriculares de gato.
2.- Realizar diferentes maniobras experimentales utilizando diferentes protocolos de
pulsos, uso de antagonistas considerados específicos de los subtipos de
receptores muscarínicos (M2 , M3 y/o M4), uso del bloqueador específico de
IK-ACh , tertiapina, que nos permitan discernir entre las dos hipótesis planteadas
(hipótesis II). Que las corrientes activadas por 4-AP, colina, TMA y betanecol se
deben a la activación voltaje -dependiente de IK-ACh , a través de la activación del
receptor M2, o que estos agonistas muscarínicos a través de diferentes subtipos
de receptores (M3 y/o M4) activan canales de rectificación tardía aun no
identificados. Diferentes explicaciones a las alternativas arriba enunciadas
podrían también surgir de estos experimentos.
3.-
Estudiar la posible activación de corrientes de potasio por diferentes agonistas
muscarínicos ya descritos como metacolina y betanecol (Figura 1) y de
compuestos químicos con ciertas similitudes estructurales con colina como el
TMA,
o con 4-AP como 3-AP, trimetil(p-aminofenil)amonio (Figura 1) en
miocitos auriculares de gato.
27
METODOS
Miocitos aislados. Los animales utilizados (perro, gato, conejo, cobayo, rata y
ratón) se heparinizaron previamente (1000 U/kg) (30 min. antes de ser sacrificados) y
se anestesiaron con pentobarbital sódico (35 mg/kg, ip), después de esto se les
extrajo rápidamente el corazón mediante una toracotomía bilateral y se colocó en
solución Tyrode oxigenada. Los miocitos se aislaron utilizando un método de
separación enzimática descrito inicialmente por Isenberg y Klöckner
(1982) y
modificado por Sánchez-Chapula (1988). Los corazones se montaron de la aorta a
un aparato de Langendorff para la perfusión retrógrada de la circulación coronaria.
Los corazones se perfundieron inicialmente con una solución Tyrode lo que permite
lavar el remanente de sangre del corazón y mantener la contracción a un ritmo
constante. Después de 5 minutos se perfundió una solución Tyrode cero Ca++
durante 7 min, esta solución detiene las contracciones del corazón y hace que la
matriz extracelular se afloje, lo que permite que sea mas eficaz el proceso de
separación enzimática. A continuación se perfundió una solución cero Ca++
conteniendo colagenasa (0.24 mg/ml, tipo I, Sigma Chemical) y proteasa (0.033
mg/ml, tipo XIV, Sigma Chemical) de 6-40 minutos, dependiendo de la especie en
cuestión. Las enzimas se lavaron perfundiendo una solución conteniendo alto K+,
bajo Na + y bajo Cl- (solución Kraft-Bruhe, KB) durante 5 minutos. Se disecó la
aurícula izquierda. Se obtuvieron las células aisladas por agitación mecánica con una
pipeta Pasteur con punta flameada. Las células se guardaron en una solución de alto
K+, bajo Na + y bajo Cl- a 4 ºC hasta el momento del experimento dejándolas por lo
menos 2 horas en reposo para que se recuperen.
La solución Tyrode tiene la siguiente composición (mM): NaCl 118, KCl 5.4,
MgCl2 1.05, NaCO3 24, NaH2PO4 0.42, dextrosa 11, CaCl2 1.8, taurina 20, la solución
es gasificada con 95% de O2 y 5% de CO2 (pH 7.4). La solución libre de Ca++ (cero
Ca++) se preparó omitiendo CaCl2 de la solución Tyrode. La solución alto K+, bajo Na +
y bajo Cl- tiene la siguiente composición (mM): ác. glutámico 70, KCl 20, taurina 10,
KH2PO4 10, creatina 0.5, ác. succínico 5, dextrosa 10, HEPES-K 10, y EGTA-K 0.2,
el pH se ajustó a 7.4 con KOH.
28
Técnica de Fijación de Voltaje “Whole cell” en células aisladas. Los miocitos
aislados se colocaron en una cámara de registro de pequeño volumen (0.2 ml) sobre
la platina de un microscopio invertido (Nikon TMS) dejándo 5 min para que las
células se coloquen en el fondo de la cámara. Después de esto se lavaron con
solución Ca++-Co++ a flujo constante (2 a 3 ml/min) para quitar restos de organelos y
células, antes de empezar los registros electrofisiológicos. La solución Ca++-Co++
contiene cobalto para bloquear las corrientes de calcio. Todos los experimentos se
realizaron a 35 ± 0.5ºC, utilizando para precalentar la solución de prueba un
calentador de platina (Biowarmer MT-1). Los registros de corrientes macroscópicas
se obtuvieron con el método de fijación de voltaje Whole cell originalmente descrita
por Hamil, Marty, Neher, Sakman y Sigworth (1981), usando un amplificador
(Axopatch 200A, Axon Instruments). Las pipetas de vidrio se construyeron con tubos
capilares de borosilicato con diámetro externo de 1.5 mm e interno de 0.8 mm (WPI
Inc.) utilizando un estirador horizontal modelo P-87 (Sutter Instrument), se llenaron
con solución interna, teniendo una resistencia de 1-3 MΩ. La resistencia en serie con
la membrana celular se compensó para obtener un transiente capacitivo lo mas
rápido posible sin oscilaciones. El potencial de unión líquida (-9 mV) entre la pipeta
y la solución del baño, se corrigió. Las corrientes se filtraron con un filtro pasa bajas a
1 kHz, se digitalizaron a 4 kHz, y se guardaron en una computadora Acer mate 433
vía un convertidor analógico-digital (TL -1, Axon Instruments Co.) y el programa de
adquisición y análisis pClamp 6.0.4 (Axon Instruments, Co.), por medio del cual
también se aplicaron los protocolos de fijación de voltaje. La capacitancia de la
membrana (Cm) se calculó utilizando la ecuación Cm = Q / V donde Q es el
movimiento de carga total y fue determinada integrando el área del transiente
capacitivo en respuesta a un cambio en el voltaje de –10 mV desde un potencial de 0
mV. La resistencia en serie con la membrana (resistencia de acceso) fue
compensada en un 80%. La resistencia de acceso antes de la compensación fue de
5.4 MΩ, de manera que después de su compensación esta resistencia fue de 0.66
MΩ. Si tomamos en consideración que la máxima corriente registrada fue menor a 2
nA, el máximo error posible en nuestra medida de voltaje fue de 2 mV.
29
Una vez que se registraron las corrientes macroscópicas en condiciones
control (solución Ca++-Co++), las células se siguieron perfundiendo con la solución
Ca++-Co++ pero ahora conteniendo la(s) droga(s) en cuestión. Después de 10 min se
tomaron los registros de las corrientes macroscópicas. Las flechas indican el cero de
corriente y las medidas de las corrientes se hicieron al final del pulso, a menos que
se indique lo contrario.
La solución externa Ca++ -Co++ tiene la siguiente composición (mM): NaCl 136,
KCl 4, CaCl2 0.5, MgCl2 1, HEPES-Na 10, CoCl2 2 y dextrosa 11; el pH se ajustó a
7.4 con NaOH. La solución interna tiene la siguiente composición (mM): ác. aspártico
80, KCl 50, KH2PO4 10, MgSO4 1, Na 2ATP 3, HEPES-K 5, GTP 0.2 y EGTA 10; el
pH se ajustó a 7.4 con KOH.
Drogas. Las drogas utilizadas 4-aminopiridina (4-AP), 3-aminopiridina (3-AP),
Cloruro de acetilcolina (ACh), Cloruro de colina (ChCl), Tetrametilamonio (TMA),
Trimetil(p-aminofenil)amonio,
Metacolina,
Betanecol,
Ac. p-aminobenzoico, Ac.
sulfanílico y Tropicamida (Sigma Chemicals), Methoctramina y p-F-HHSiD (Research
Biochemicals
International),
Tertiapina
(Alamone
Labs,
Jerusalén):
fueron
directamente disueltas en la solución externa según se requirió. Después que se
disolvió la 4-AP o la 3-AP se ajustó el pH a 7.4 con HCl. Con las demás drogas no
fue necesario volver a ajustar el pH.
Los datos fueron expresados como la media ± ES. La significancia estadística
fue evaluada por la prueba t de Student’s. Las comparaciones múltiples fueron
evaluadas usando ANOVA y la prueba de Dunnett’s. Las diferencias se consideraron
significativas a P < 0.05.
30
RESULTADOS
I. CORRIENTES DE POTASIO ACTIVADAS POR COLINA EN MIOCITOS
AURICULARES DE DIFERENTES ESPECIES DE MAMÍFERO
El primer objetivo que nos plantemos fue demostrar que el efecto de la colina
activando una corriente dependiente de tiempo y voltaje, es independiente de la
especie. Para este objetivo se estudió el efecto de colina en miocitos auriculares de
las especies mas frecuentemente utilizadas en el laboratorio, para experimentos de
electrofisiología cardiaca.
En la Figura 3 se muestran trazos de corriente (restas digitales, trazos de
corriente en la presencia del agonista menos los trazos de corriente en condiciones
control) activada por 1,10 y 30 mM de colina en miocitos auriculares de perro
(Figuras 3 A, 3 B y 3 C, respectivamente). La corriente activada por colina tiene las
mismas características que cuando es activada en miocitos de gato: activa una
corriente dependiente de tiempo a potenciales negativos a EK, la cual se caracteriza
por un rápido aumento en la amplitud de la corriente, seguido de una disminución
lenta, también dependiente de tiempo. A potenciales positivos a EK, colina activa una
corriente instantánea, seguida de una corriente dependiente de tiempo, la cual activa
mas rápido mientras mas alta es la concentración del agonista y mas positivo el
voltaje. A potenciales positivos, esta misma corriente después de alcanzar un
máximo disminuye con el tiempo durante el pulso, ésta disminución también es
dependiente de la concentración, siendo mas marcada cuanto mas alta es ésta.
Además, mientras mas alta es la concentración del agonista, la saturación en las
corrientes se presenta a potenciales menos positivos. El registro de las corrientes de
cola se hizo a -100 mV, pudiendo observarse que mientras más positivo es el
potencial que se aplica durante el pulso previo, la corriente de cola es mayor. Esta
corriente de cola muestra un rápido aumento seguida de una disminución
dependiente de tiempo.
31
•
<
B
4 pA/pF
A
1 s
D
C
Colina
I (pA/pF) 8
1 mM
Colina 10 mM
6
4
Colina 30 mM
2
0
-120
-80
-40
0
-2
40
80
Vm (mV)
Figura 3. Corriente activada (restas digitales) por colina en miocitos auriculares de
perro. Trazos de corriente activada por 1 mM (A), por 10 mM (B) y por 30
mM (C) de colina, aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -100 hasta +80 mV,
regresando a -100 mV. D, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso para 1 mM (•), 10 mM (n ) y 30 mM ( ) de colina (n=6).
Cada punto representa la media ± ES.
El cobayo es otra especie que es muy utilizada en experimentación en
electrofisiología cardiaca. En la Figura 4 se muestran trazos de corriente en
condiciones control (Figura 4 A), en presencia de 1 mM de colina (Figura 4 B) y la
resta digital de las Figuras 4 A y 4 B, es decir, la corriente activada por colina (Figura
4 C). Las características de la corriente activada por colina en miocitos auriculares de
cobayo, son muy semejantes a las de la corriente activada por colina en gato o perro.
Colina activa una corriente de fondo, a potenciales negativos a EK hay un rápido
aumento seguido de una disminución dependiente de tiempo de la corriente.
32
A
•
<
B
20 pA/pF
A
1 s
C
D
♦
I (pA/pF)
60
50
Control
40
Colina 1 mM
Colina 1 mM - Control
30
20
10
0
-120
-80
-40
0
-10
40
80
Vm (mV)
-20
Figura 4. Efecto de la colina sobre miocitos auriculares de cobayo. Trazos de
corriente en condiciones control (A), en la presencia de 1 mM de colina (B) y
la corriente activada por 1 mM de colina (resta digital de B-C) (C); aplicando
pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento
de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV, regresando a -40 mV. D, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para condiciones
control (•), en la presencia de 1 mM (n) y la corriente activada por 1 mM (♦)
de colina (n=6). Cada punto representa la media ± ES.
potenciales positivos a EK activa una corriente instantánea seguida de una corriente
dependiente de tiempo. La corriente
es activada con dependencia de tiempo,
voltaje y concentración. Las corrientes de cola en este caso se registraron a –40 mV,
en las cuales, de igual manera, se puede observar la dependencia de voltaje de la
activación de la corriente. En la Figura 4 D, se muestran las curvas corriente -voltaje
correspondientes.
La colina también se probó sobre células cardiacas de ratón. En la Figura 5 se
muestran trazos de corriente (restas digitales) activada por 1 mM (Figura 5 A), 3 mM
(Figura 5 B) y 30 mM (Figura 5 C) de colina en miocitos auriculares de ratón. La
33
colina activa la corriente de una manera muy semejante a como lo hace colina en
miocitos auriculares de gato, perro y cobayo. Colina activa una corriente de fondo, a
potenciales negativos al potencial de inversión de la corriente, se presenta un rápido
aumento seguido de una disminución dependiente de tiempo de la corriente. A
potenciales positivos a EK activa una corriente de fondo seguida de una corriente
dependiente de tiempo. La amplitud de la corriente de fondo es dependiente de la
concentración. El curso temporal de la corriente dependiente de tiempo es mas
rápido conforme la concentración es mayor. El registro de las corrientes de cola se
hizo a -110 mV, pudiendo observarse que mientras mas positivo es el potencial que
se aplica en el pulso previo, la corriente de cola es mayor, mostrando dependencia
•
<
B
10 pA/pF
A
1 s
C
♦
D
I (pA/pF)
20
16
Colina
Colina
1 mM
3 mM
12
8
Colina 30 mM
4
0
-120
-80
-40
0
-4
40
80
Vm (mV)
-8
Figura 5. Corriente activada por colina (restas digitales) en miocitos auriculares de
ratón. Trazos de corriente activada por 1 mM (A), por 3 mM (B) y por 30 mM
(C) de colina, aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -110 mV. D, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso para 1 mM (•), 3 mM (n) y 30mM (♦)de colina (n=6). Cada
punto representa la media ± ES.
34
de voltaje en la activación de la corriente. Esta corriente de cola muestra un rápido
aumento seguida de una disminución dependiente de tiempo.
Las curvas corriente-voltaje correspondientes se muestran en la Figura 5 D.
Las corrientes muestran una saturación a potenciales positivos dependiente de la
concentración de colina, a mayor concentración la saturación se presenta a
potenciales menos positivos.
En la Figura 6 se muestran trazos de corriente (restas digitales)
correspondientes a la activación de 1 mM (Figura 6 A), 3 mM (Figura 6 B) y 30 mM
(Figura 6 C) de colina en miocitos auriculares de conejo.
La colina activa una
corriente de fondo que a potenciales negativos a E K presenta una disminución
<
B
4 pA/pF
A
•
1 s
D
C
I (pA/pF)
10
8
Colina 1 mM
Colina 3 mM
6
4
Colina 30 mM
2
0
-120
-80
-40
0
-2
40
80
Vm (mV)
Figura 6. Corriente activada por colina (restas digitales) en miocitos auriculares de
conejo. Trazos de corriente activada por 1 mM (A), por 3 mM (B) y por 30
mM (C) de colina, aplicando pulsos de 2 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. D, relación corriente -voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso para 1 mM (•), 3 mM (n) y 30mM ( ) de colina (n=4). Cada
punto representa la media ± ES.
35
dependiente de tiempo. A potenciales positivos a EK, la activación de la corriente es
dependiente de tiempo, no mostrando un pico máximo o disminución de corriente.
Las corrientes de cola registradas a -40 mV no son muy grandes, pero muestran
dependencia de voltaje. Las curvas corriente-voltaje se muestran en la Figura 6 D.
La última especie en la que probamos colina es la rata. En la Figura 7 se
muestran trazos de corriente en condiciones control (Figura 7 A) y en la presencia de
3 mM de colina (Figura 7 B). Las corrientes activadas por colina son muy semejantes
•
B
10 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF)
50
40
Control
30
Colina 3 mM
20
10
0
-80
-40
0
40
80
Vm (mV)
-10
Figura 7. Corriente activada por colina en miocitos auriculares de rata. Trazos de
corriente en condiciones control (A), en la presencia de 3 mM (B) de colina
aplicando pulsos de 2 segundos de duración a partir de un potencial de
mantenimiento de -40 mV, desde -90 hasta +70 mV, regresando a -40 mV. C,
relación corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para
condiciones control (•) y en la presencia de 3 mM de colina ( ) (n=6). Cada
punto representa la media ± ES.
36
a las activadas por colina en conejo. Colina activan una corriente de fondo y a
potenciales positivos a -40 mV se activa una corriente dependiente de tiempo que no
muestra un pico máximo de corriente y su activación es voltaje dependiente, como se
puede observar en las colas, las cuales fueron registradas a -40 mV.
Cabe hacer notar que en algunos de los protocolos se registraron las
corrientes de cola a –100 o –110 mV y en otros a –40 mV, sin afectar las mediciones
hechas, ya que éstas se hicieron al final de los pulsos de prueba. En ambos casos se
puede observar la dependencia de voltaje de la activación de la corriente por colina.
Los resultados anteriores nos permiten concluir que la o las
corrientes
activadas por el agonista muscarínico colina, en miocitos auriculares de diferentes
especies
de
mamífero,
posee
características
similares
voltaje-
y
tiempo-
dependientes.
II. EVIDENCIAS QUE SUGIEREN QUE LA CORRIENTE ACTIVADA POR COLINA
NO ES UNA CORRIENTE DE RECTIFICACIÓN TARDIA “VERDADERA”, SINO
POSIBLEMENTE LA ACTIVACION VOLTAJE-DEPENDIENTE DE IK-ACh
Curso temporal de la activación y la desactivación de la corriente dependiente
de tiempo y voltaje inducida por colina. En la Figura 8 A y 8 C, se presenta la
corriente dependiente de tiempo y voltaje registrada en presencia de colina a dos
diferentes concentraciones (1 y 3 mM). La corriente activada por pulsos
despolarizantes a 0, +20, +40 y +60 mV es mostrada. Como se puede observar, el
curso temporal de la activación de la corriente fue dependiente del voltaje y de la
concentración de colina, cuanto mas positivo el voltaje y mayor la concentración de
colina mas rápida la activación de la corriente. En los paneles B y D de la Figura 8 se
muestran las corrientes de cola registradas a potenciales de 0, -40, -80 y -120 mV,
después de aplicar desde un potencial de mantenimiento de -40 mV pulsos
despolarizantes a +50 mV. Los resultados muestran que el curso temporal de la
corriente de cola es independiente del voltaje y de la concentración de colina. El
curso temporal de la activación fue ajustada con la siguiente ecuación:
37
<
B
500 ms
750 pA
500 ms
•
C
F
Colina 1 mM
Colina 3 mM
Colina 10 mM
1000
800
800
τ (ms)
τ (ms)
•
D
E
1200
600
400
200
0
1 nA
<
A
600
400
200
0
10
20
30
40
50
60
-120 -100 -80 -60 -40 -20
Vm (mV)
0
20
Vm (mV)
Figura 8. Dependencia de la concentración del curso temporal de la activación.
Corrientes activadas por colina aplicando pulsos despolarizantes a diferentes
potenciales de membrana (0, +20, +40 y +60 mV) desde un potencial de
mantenimiento de -120 mV. Trazos de corrientes activadas por 1 mM (A) y 3
mM (C) de colina. El curso temporal de la activación se ajustó a una
exponencial. Las τ de activación de la corriente activada por tres diferentes
concentraciones de colina fueron graficadas en función del voltaje (n=5) (E).
Corrientes de cola activadas por 1 mM (B) y 3 mM (D) de colina aplicando
desde un potencial de mantenimiento de -40 mV, pulsos despolarizantes a
+50 mV seguidos por pulsos repolarizantes
a potenciales de membrana
entre 0 y -120 mV. El curso temporal de la desactivación fue ajustada por una
exponencial. Las τ de desactivación fueron graficadas en función del voltaje,
a tres diferentes concentraciones de colina (n=5) (F). Cada punto representa
la media ± ES.
38
I = A0 + A1 (1-e-t/τ) n
(1)
El decaimiento de la corriente de cola fue ajustado por la ecuación:
I = A0 + A1 e-t/τ
(2)
Donde Ao es el nivel basal de activación, A1 es una constante , τ es la constante de
tiempo de activación y t es tiempo. En la Figura 8 E se muestra la τact de activación
como función del potencial de membrana (Vm) a tres diferentes concentraciones de
colina (1, 3, y 10 mM). Las constantes de tiempo de decaimiento de la corriente de
cola, registrada a diferentes potenciales y en presencia de las tres diferentes
concentraciones de colina se muestran en la Figura 8 F. El potencial de inversión de
la corriente activada por colina fue de -86.4 ± 2.3 mV, valor muy cercano al predicho
por la ecuación de Nernst para una corriente de potasio.
Efectos de dofetilida e indapamida sobre la corriente activada por colina. Como
se mencionó anteriormente en la introducción y en los objetivos, ha sido sugerido
que colina, 4-AP y TMA podrían activar una corriente rectificadora tardía (Fermini y
Nattel, 1994; Shi et al., 1999). Con el fin de probar la posibilidad de que colina
estuviera activando uno o los dos componentes de rectificación tardía hasta ahora
caracterizados en los tejidos cardiacos (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990a), se
observaron los efectos del bloqueador selectivo de IKr dofetilida (5 µM), mas el
bloqueador selectivo de IKs indapamida (300 µM) sobre las corrientes activadas por
colina. La administración de ambos bloqueadores no afectó la activación de las
corrientes activadas por colina (Figura 9), sugiriendo que colina no activa IKr ni IKs .
Las corrientes activadas por colina y ACh durante pulsos despolarizantes
pueden tener similares cursos temporales. Uno de los argumentos de que colina y
acetilcolina no estuvieran activando el mismo canal es la diferencia en la morfología
de las corrientes. La corriente activada por colina en miocitos auriculares de gato
tiene un curso temporal diferente al de la corriente activada por ACh (Figura 22). Sin
embargo, cuando las corrientes activadas por colina y ACh fueron obtenidas usando
un protocolo en el cual los canales fueron activados primero por pulsos
39
300 pA
1 s
Figura 9. Efectos del bloqueador de IKr , dofetilida, y del bloqueador de IKs ,
indapamida, sobre la corriente activada por colina. Se aplicaron pulsos de 3
s de duración a +60 mV desde un potencial de mantenimiento de -40 mV.
Los trazos de corriente antes (=), en la presencia de 5 µM de dofetilida mas
300 µM de indapamida ( ), y en la presencia de dofetilida + indapamida + 3
mM de colina (c) son presentados.
despolarizantes a +50 mV, la rectificación fue removida por pulsos cortos
hiperpolarizantes a -120 mV, y el pulso despolarizante de prueba fue aplicado a
diferentes potenciales de membrana (Figura 10 A y 10 C). Bajo estas condiciones
las corrientes obtenidas por los pulsos de prueba positivos al potencial de
inversión son similares en presencia de los dos agonistas (Figura 10 A y 10 C). Las
corrientes salientes mostraron un rápido incremento transitorio, seguido por un rápido
decaimiento debido a una marcada rectificación entrante. El pico máximo de
corriente saliente (Ipico) con ambos agonistas tuvieron similares amplitudes (Figura
10 E). Cuando en presencia de colina la duración del pulso hiperpolarizante fue de 3
s (ver protocolo Figura
10), la corriente registrada a –120 mV muestra un
decaimiento claramente dependiente de tiempo. Así mismo, las corrientes salientes
activadas por los pulsos de prueba muestran una lenta activación, sin el componente
inicial transitorio observado con el pulso hiperpolarizante corto (Figura 10 B). Sin
embargo, en presencia de ACh el curso temporal de las corrientes obtenidas con los
pulsos de prueba son similares, independientemente de la duración del pulso
40
+ 50
+10
-30
-70
-110
-40
B
A
-120
<
1 s
E
D
♦
1 s
F
I final ( p A / p F ) 4 0
I pico ( p A / p F ) 4 0
Colina 3 mM
30
Acetilcolina 1 µM
20
A c e t i l c o l i n a 1 µ M 20
10
10
-120
10 pA/pF
C
10 pA/pF
•
-90
-60
-30
0
-10
30
Colina 3 mM
0
30
60
Vm (mV)
-20
-120
-90
-60
-30
0
-10
0
30
60
Vm (mV)
-20
Figura 10. Las corrientes activadas por colina y ACh pueden tener cursos temporales similares o
diferentes durante la despolarización, dependiendo del protocolo de estimulo. A, corrientes
activadas por 3 mM de colina. Los canales fueron primeramente activados por pulsos
despolarizantes de 500 ms de duración a +50 mV, seguido de un pulso hiperpolarizante a
-120 mV por 200 ms para remover la rectificación sin permitir una significante desactivación
de los canales; los pulsos de prueba se aplicaron desde este potencial. B, corrientes
activadas por 3 mM de colina, obtenidas en la misma célula que en A. En este protocolo la
duración del pulso hiperpolarizante a –120 mV es de 4 s. Desde este potencial se aplicaron
los pulsos de prueba a diferentes potenciales de membrana. C, Corrientes activadas por 1
µM de ACh obtenidas en la misma célula que A y B, utilizando el mismo protocolo que en A.
D, Corrientes activadas por 1 µM de ACh obtenidas en la misma célula, utilizando el mismo
protocolo que en B. Las relaciones corriente-voltaje de las corrientes activadas por colina y
ACh en A y C medidas al pico (E) y en B y D medidas al final del pulso (F) son mostradas,
(n=5). Cada punto representa la media ± ES.
41
300 pA
1 s
Figura 11. Efecto de variar la duración del pulso hiperpolarizante sobre la corriente
semejante a un rectificador tardío, activada por colina. La corriente activada
por 3 mM de colina fue registrada aplicando pulsos desde un potencial de
mantenimiento de -40 mV, a +50 mV por 1 s, seguidos de un pulso
hiperpolarizante a -120 mV de duración variable, aplicando después un
pulso posthiperpolarizante a +50 mV. Un breve pulso hiperpolariza nte resultó
en un gran aumento de la corriente activada, la cual disminuyó rápidamente,
siendo similar al proceso de rectificación presente en IK-ACh (Figura 10 C).
Con una gran hiperpolarización, la corriente rápida registrada con los pulsos
posthiperpolarizantes disminuyó (las flechas indican el pico) y una corriente
con activación lenta simultáneamente se hace mas evidente.
hiperpolarizante (Figuras 10 C y 10 D). Las corrientes medidas al final de los pulsos
a +50 mV con ambos agonistas tienen amplitudes similares (Figura 10 F).
En la Figura 11, se muestra el curso temporal del cambio de una corriente
activada por colina con características de un rectificador entrante, utilizando pulsos
hiperpolarizantes cortos, a una corriente con características de rectificador tardío con
pulsos hiperpolarizantes largos. Desde un potencial de membrana de -40 mV, se
aplicaron pulsos a +50 mV, seguidos por pulsos hiperpolarizantes a -120 mV de
duración variable, después de los cuales se aplicó el pulso de prueba a +50 mV. El
42
pulso despolarizante inicial activó la corriente, y el pulso hiperpolarizante que le
siguió removió la rectificación, cuando el pulso hiperpolarizante fue corto, la corriente
saliente inducida por el pulso despolarizante de prueba mostró un aumento rápido
transitorio debido a la rectificación de la corriente. Cuando la duración del pulso
hiperpolarizante
fue
incrementado
progresivamente,
lo
cual
indujo
mayor
desactivación, la morfología de la corriente de prueba fue progresivamente
cambiando hacia una corriente similar a un rectificador tardío.
Interacción de colina y adenosina. Adenosina actuando como un agonista de los
receptores purinérgicos A1 activa IK-ACh de una forma voltaje-independiente, a través
de una proteína Gi/o, similar a como lo hace ACh (Belardinelli e Isenberg, 1983). Si la
colina activara una corriente rectificadora tardía mediante un receptor muscarínico,
entonces cuando adenosina (a una concentración máxima) y colina sean aplicados
conjuntamente, nosotros deberíamos observar la activación de IK-ACh por adenosina a
través de la activación del receptor A1 mas la activación del rectificador tardío por
colina a través de la activación del receptor muscarínico. Si colina activara IK-ACh de
una manera voltaje-dependiente, la aplicación simultánea de adenosina (a una
concentración máxima) induciría competición al nivel del efector (canal IK-ACh ) y, se
observaría una disminución en la corriente similar al rectificador tardío, como se ha
observado cuando colina y ACh son administrados juntos (Fermini y Nattel, 1994), ó
ACh y 4-AP (Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula, 1977). Desafortunadamente
encontramos que adenosina no activa IK-ACh en miocitos auriculares de gato
(resultados no mostrados). Una probable explicación a esto es que los receptores
purinérgicos A1 no se encuentren presentes en miocitos auriculares de gato. Hasta la
fecha no se ha publicado nada al respecto. Por lo tanto, la interacción entre colina y
adenosina se estudió en miocitos auriculares de cobayo.
Colina 1 mM indujo la corriente tiempo- y voltaje-dependiente ya descrita
anteriormente (Figura 12 A). Adenosina 100 µM indujo una corriente rectificadora
entrante (Figura 12 C), ya previamente descrita (Belardinelli e Isenberg, 1983).
Cuando
adenosina
y
colina
fueron
administradas
juntas
a
las
mismas
concentraciones descritas antes, la morfología de la corriente fue similar a la de un
43
B
<
•
500 pA
A
1 s
C
D
ChCl 3 mM
20
♦
C h C l + A d o 1 0 0 µM
Ado
∆ I (pA)
15
10
5
0
-40
-20
0
20
40
60
80
Vm (mV)
Figura 12. Efecto de adenosina sobre las corrientes activadas por colina en miocitos
auriculares de cobayo. Resta digital de los trazos de corriente (condición
menos el control), en la presencia de 3 mM de colina (A), 3 mM de colina +
100 µM de adenosina (B) y 100 µM adenosina (C). Las corrientes fueron
registradas aplicando pulsos hiperpolarizantes y despolarizantes desde un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 y +70 mV, seguidos por
un pulso a -40 mV. La flecha indica el cero de corriente. D, relación corrientevoltaje para la corriente dependiente de tiempo ( I) medidas como la
corriente al final menos la corriente medida al inicio del pulso despolarizante
(n=4). Cada punto representa la media ± ES.
rectificador entrante, la corriente rectificadora tardía activada por los pulsos a
potenciales positivos y la corriente de cola observada al regresar a -40 mV en
presencia de colina sola, fueron significativamente mas pequeñas cuando se
administraron los dos fármacos juntos (Figura 12 B), sugiriendo que el efecto de
colina y adenosina no fue aditivo sino competitivo.
44
•
<
B
5 pA/pF
A
1 s
C
♦
D
Control
Acetilcolina 300 nM
I (pA/pF)
30
25
20
15
Acetilcolina 300 nM +
Tertiapina 200 nM
10
5
0
-120
-90
-60
-30
-5
-10
0
30
60
Vm (mV)
-15
-20
Figura 13. Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina, sobre corrientes
activadas por ACh. Los trazos de corriente en condiciones control (A), en la
presencia de 300 nM de ACh (B) y de 300 nM de ACh + 200 nM de tertiapina
(C), se registraron aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. D, relación corriente -voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso, en condiciones control (•), en la presencia de 300 nM de
ACh (n) y 300 nM de ACh + 200 nM de tertiapina (♦ ) (n=4). Cada punto
representa la media ± ES.
La tertiapina bloquea las corrientes activadas por diferentes agonistas
muscarínicos. Como ya fue mencionado, la tertiapina es una toxina obtenida del
veneno de la abeja, la cual bloquea selectivamente canales rectificadores entrantes.
En tejidos cardiacos ha sido descrito que la tertiapina bloquea selectivamente la
corriente IK-ACh , a concentraciones nanomolares (Kitamura et al., 2000). En la
presente tesis, se estudió el efecto de tertiapina a una concentración 200 nM, sobre
las corrientes activadas por los agonistas muscarínicos ACh (Figura 13), colina
45
•
B
<
♦
C
5 pA/pF
A
1 s
D
E
F
♦
28
I (pA/pF)
21
Control
Colina 3 mM
14
Colina 3 mM +
Tertiapina 200 nM
Tertiapina 200 nM
7
0
-120
-80
-40
0
-7
40
Vm (mV)
Figura 14. Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina, sobre corrientes
activadas por colina. Los trazos de corriente mostrados corresponden a: En
una primera serie de experimentos, en condiciones control (A), en la
presencia de 3 mM de colina (B) y de 3 mM de colina + 200 nM de tertiapina
(C). En otra serie de experimentos, en la presencia de 200 nM de tertiapina
(D) y en la presencia de tertiapina + 3 mM de colina (E). Las corrientes se
registraron aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. F, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso, en condiciones control (•), en la presencia de 3 mM de
colina (n), 3 mM de colina + 200 nM de tertiapina ( ) y 200 nM de tertiapina
( ) (n=4). Cada punto representa la media ± ES.
(Figura 14),TMA (Figura 15) y betanecol (Figura 31). En la Figura 13 se muestran los
registros obtenidos en condiciones control (Figura 13 A), después de administrar 300
nM de ACh (Figura 13 B) y, en presencia de ACh mas 200 nM de tertiapina. Lo que
se puede observar es que la tertiapina bloquea la corriente activada por ACh, en
46
•
B
<
5 pA/pF
A
1 s
C
D
21
I (pA/pF)
18
15
Control
TMA 1 mM
TMA 1 mM +
12
9
6
Tertiapina 200 nM
3
0
-120
-80
-40
-3
-6
0
40
Vm (mV)
Figura 15. Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina, sobre corrientes
activadas por TMA. Los trazos de corriente en condiciones control (A), en la
presencia de 1 mM de TMA (B) y de 1 mM de TMA + 200 nM de tertiapina
(C), se registraron aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. D, relación corriente -voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso, en condiciones control (•), en la presencia de 1 mM de
TMA (n) y 1 mM de TMA + 200 nM de tertiapina ( ) (n=4). Cada punto
representa la media ± ES.
otras células se pudo observar un bloqueo parcial. En la gráfica de la Figura 13 se
muestran las curvas corriente-voltaje de los resultados resumidos de cuatro
experimentos. El efecto de tertiapina sobre las corrientes ind ucidas por colina 3 mM
son mostradas en la Figura 14. Dos diferentes tipos de protocolo fueron utilizados, en
el primero, se tomaron primeramente los registros control (Figura 14 A), después en
presencia de colina (Figura 14 B) y en la continua presencia del agonista se agregó
la tertiapina (Figura 14 C). El bloqueo inducido por tertiapina tanto de las corrientes
47
entrantes y salientes inducidas por colina es claro. Con este tipo de experimentos y
tomando en cuenta la desensibilización parcial de los receptores muscarínicos que
se presenta en la continua presencia de agonistas, se realizó una segunda serie de
experimentos. En estos experimentos, se tomaron los registros control, en la
presencia de tertiapina 200 nM (Figura 14 D). En la continua presencia de la toxina
se agregó colina 3 mM (Figura 14 E), se puede observar que en presencia de la
tertiapina, la colina no activa la corriente ni para pulsos hiperpolarizantes ni
despolarizantes. En la gráfica de la Figura 14 F, se muestran las curvas corrientevoltaje de los resultados resumidos de cuatro experimentos. En la Figura 15, el efecto
de la tertiapina sobre las corrientes inducidas en miocitos auriculares de gato por el
agonista muscarínico TMA es mostrado. Tertiapina bloquea tanto las corrientes
entrantes como salientes inducidas por el TMA.
¿La corriente voltaje-dependiente activada por colina se debe a la activación de
receptores M3 o M4 ?. Como ya se ha mencionado, Shi et al. (1999) han planteado
que las corrientes con características de rectificador tardío, inducidas por 4-AP y
TMA, se deben a la activación de receptores M3 por TMA y M4 por colina. En el
presente proyecto nos hemos planteado el objetivo de investigar la posible
interacción de antagonistas “específicos” de receptores M2 methoctramina,
M3
p-F-HHSiD y M4 , tropicamida y, el agonista muscarínico, colina. Debido a una de las
características importante de los mAChRs, que es la desensibilización que presentan
en la continua presencia del agonista, en el presente trabajo, para evitar errores
experimentales causados por la desensibilización de los receptores, los experimentos
se realizaron primeramente administrando el antagonista, luego el antagonista mas el
agonista juntos, después se lavaron ambos fármacos, para luego administrar solo el
agonista.
Así, el receptor esta poco tiempo en contacto con el agonista y
disminuyendo la desensibilización del receptor. Las corrientes mostradas de los
siguientes experimentos son la resta digital de las corrientes en presencia del
agonista o del agonista mas el antagonista, menos los trazos de corriente en la
presencia del antagonista solo.
48
B
10 pA/pF
A
<
•
1 s
C
I (pA/pF)
Acetilcolina 300 nM
30
20
Acetilcolina 300 nM +
10
Methoctramina 30 nM
0
-120
-80
-40
0
-10
40
80
Vm (mV)
-20
-30
Figura 16.
Efecto de la methoctramina, antagonista M2 muscarínico, sobre la
corriente activada (restas digitales) por acetilcolina en miocitos auriculares de
gato. Las corrientes mostradas son las restas digitales. A, Trazos de
corriente activada por 300 nM de acetilcolina. B corriente activada por 300
nM de acetilcolina en la presencia de 30 nM de methoctramina. Aplicando
pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento
de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV. C, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para acetilcolina
(n) y acetilcolina mas methoctramina (•) (n=4). Cada punto representa la
media ± ES.
Interacción de antagonistas específicos de receptores M2 , M3 , y M4 con ACh en
miocitos auriculares de gato. En la Figura 16 se presenta el efecto de la ACh y de
la methoctramina (antagonista M2 ). En la Figura 16 A se presentan trazos de
corriente activada por 300 nM de ACh y en la Figura 16 B se puede observar el
efecto de 300 nM ACh y 30 nM de methoctramina. Las curvas corriente-voltaje se
muestran en la Figura 16 C. La methoctramina disminuye la corriente activada por
ACh a todos los potenciales explorados, siendo estas diferencias significativas.
49
10 pA/pF
A
<
B
•
1 s
C
I (pA/pF)
Acetilcolina 300 nM
15
10
Acetilcolina 300 nM +
5
p-F-HHSiD 30 nM
0
-120
-80
-40
0
-5
40
80
Vm (mV)
-10
-15
-20
Figura 17. Efecto del p-F-HHSiD, antagonista M3 muscarínico, sobre la corriente
activada (restas digitales) por acetilcolina en miocitos auriculares de gato.
A, Trazos de corriente activada por 300 nM de acetilcolina. B corriente
activada por 300 nM de acetilcolina en la presencia de 30 nM de p-F-HHSiD.
Aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de
mantenimiento de -40 mV, desde -100 hasta +70 mV , regresando a -40 mV.
C, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para
acetilcolina (n) y acetilcolina mas p-F-HHSiD (•) (n=5). Cada punto
representa la media ± ES.
En la Figura 17 se muestra el efecto de la ACh y el p-F-HHSiD (antagonista
M3). En la Figura 17 A se presenta la corriente activada por 300 nM de ACh y en la
Figura 17 B se puede observar el efecto 300 nM de ACh mas 30 nM de p-F-HHSiD.
En la Figura 17 C se muestran las curvas corriente - voltaje correspondientes. Los
resultados nos muestran que p-F-HHSiD disminuye la corriente activada por ACh.
En la Figura 18 A se presenta la corriente activada por 300 nM de ACh. En la
Figura 18 B se presentan trazos de corriente de la corriente activada por ACh en la
presencia de 200 nM de tropicamida (antagonista M4 ). Las curvas corriente-voltaje
50
10 pA/pF
A
<
•
B
1 s
C
Acetilcolina 300 nM
I (pA/pF)
30
20
Acetilcolina 300 nM +
10
Tropicamida 200 nM
0
-120
-80
-40
0
-10
40
80
Vm (mV)
-20
-30
-40
Figura 18. Efecto de la tropicamida, antagonista M4 muscarínico, sobre la corriente
activada (restas digitales) por acetilcolina en miocitos auriculares de gato.
A, Trazos de corriente activada por 300 nM de acetilcolina. B, corriente
activada por 300 nM de acetilcolina en la presencia de 200 nM de
tropicamida. Aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -100 hasta +70 mV ,
regresando a -40 mV. C, relación corriente -voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso para acetilcolina (n ) y acetilcolina mas tropicamida (•) (n=4).
Cada punto representa la media ± ES.
correspondientes se presentan en la Figura 18 C. La corriente activada por ACh
disminuye muy poco a todos los potenciales de prueba. Los resultados anteriores nos
muestran que los tres fármacos supuestamente específicos para los diferentes tipos
de receptores muscarínicos, producen un bloqueo parcial de la corriente activada por
ACh, la cual ha sido identificada por diferentes autores como mediada a través de
receptores M2 .
51
<
•
B
10 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF)
30
Colina 1 mM
20
Colina 1 mM +
Methoctramina 30 nM
10
0
-120
-80
-40
0
40
80
Vm (mV)
-10
Figura 19.
Efecto de la methoctramina, antagonista M2 muscarínico, sobre la
corriente activada (restas digitales) por colina en miocitos auriculares de
gato. A, Trazos de corriente activada por 1 mM de colina. B, corriente
activada por 1 mM de colina en la presencia de 30 nM de methoctramina.
Aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de
mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV.
C, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para
colina (n) y colina mas methoctramina (•) (n=5). Cada punto representa la
media ± ES.
Interacción de antagonistas específicos de receptores M2, M3, y M4 con colina
en miocitos auriculares de gato. En la siguiente serie de experimentos el efecto de
los diferentes antagonistas sobre las corrientes activadas por colina fueron
estudiadas. En la Figura 19 A se presenta la corriente activada por 1 mM de colina,
los trazos de corriente muestran las características cinéticas ya descritas para la
corriente activada por colina. En la Figura 19 B se presentan trazos de la corriente
activada por 1 mM de colina en la presencia de 30 nM de methoctramina. En la
52
<
B
•
5 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF)
12
10
Colina 1 mM
Colina 1 mM +
p-F-HHSiD 30 nM
8
6
4
2
0
-120
-80
-40
0
-2
40
80
Vm (mV)
Figura 20. Efecto del p-F-HHSiD, antagonista M3 muscarínico, sobre la corriente
activada (restas digitales) por colina en miocitos auriculares de gato. A,
Trazos de corriente activada por 1 mM de colina. B, corriente activada por 1
mM de colina en la presencia de 30 nM de p-F-HHSiD. Aplicando pulsos de 3
segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento de -40 mV,
desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV. C, relación corriente-voltaje
de las corrientes medidas al final del pulso para colina (n) y colina mas p-FHHSiD (•) (n=5). Cada punto representa la media ± ES.
Figura 19 C se presentan las curvas corriente-voltaje correspondientes. El efecto de
methoctramina sobre la corriente activada por colina, presenta características
similares al bloqueo inducido por el antagonista de receptores muscarínicos atropina
(Navarro Polanco, 1997). El antagonismo es mas marcado a potenciales negativos.
En la Figura 20 A se muestran las corrientes activadas por colina 1mM, y en la
Figura 20 B se muestran trazos de corriente activada por 1 mM de colina en la
presencia de 30 nM de p -F-HHSiD. Las curvas corriente-voltaje se muestran en la
53
<
•
B
10 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF)
32
24
Colina 1 mM
16
Colina 1 mM +
Tropicamida 200 nM
8
0
-120
-80
-40
0
-8
40
80
Vm (mV)
Figura 21. Efecto de la tropicamida, antagonista M4 muscarínico, sobre la corriente
activada (restas digitales) por colina en miocitos auriculares de gato. A,
Trazos de corriente activada por 1 mM de colina. B, corriente activada por 1
mM de colina en la presencia de 200 nM de tropicamida. Aplicando pulsos de
3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento de -40
mV, desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV. C, relación corrientevoltaje de las corrientes medidas al final del pulso para colina (n) y colina
mas tropicamida (•) (n=5). Cada punto representa la media ± ES.
Figura 20 C. El p-F-HHSiD disminuye la corriente activada por colina a todos los
potenciales entre -110 hasta +70 mV, siendo estas diferencias significativas.
En la Figura 21 A se presentan trazos de la corriente activada por 1 mM de
colina. La corriente activada por 1 mM
de colina en presencia de
200 nM de
tropicamida se presenta en la Figura 21 B. Las curvas corriente -voltaje se muestran
en la Figura 21 C. La corriente activada por colina también es disminuida por
tropicamida
a
todos
los
potenciales
estudiados,
siendo
estas
diferencias
significativas, sin embargo, al igual que el antagonismo de methoctramina, el
antagonismo de tropicamida es mayor a potenciales negativos. Similar a lo
54
observado con la corriente activada por ACh, los tres antagonistas “específicos” de
receptores muscarínicos, producen un bloqueo parcial de la corriente activada por
colina. Debo hacer notar que el efecto de methoctramina y tropicamida presenta
características voltaje-dependientes, el bloqueo es mayor para potenciales negativos,
mientras que el bloqueo de p-F-HHSiD es voltaje-independiente.
Una proteína G sensible a PTX está involucrada en la activación de la corriente
por colina. En otra serie de experimentos se probó el efecto de la PTX (toxina
pertussis) sobre la corriente activada por colina. La PTX se une irreversiblemente a
las proteínas G que son sensibles a ella, impidiendo que la proteína G active al
efector correspondiente (Kurachi, 1995). Las células dispersadas en un mismo día
se dividieron en dos grupos, una parte de ellas se trataron con PTX y la otra parte no.
Las células tratadas se incubaron con el PTX 2 horas antes de ser utilizadas. Los
resultados obtenidos se pueden observar en la Figura 22. En la Figura 22 A, se
muestran trazos de corriente que pertenecen a una célula no tratada con PTX a +50
mV en condiciones control (Figura 22 Aa) y en la presencia de 3 mM de colina
(Figura 22 Ab). En la Figura 22 B, se muestran trazos de corriente a +50 mV de una
célula tratada con PTX, en condiciones control (Figura 22 Bc) y en la presencia de 3
mM de colina (Figura 22 Bd). Los resultados se sumarizan en la Figura 22 C, en
donde se muestra el curso temporal del efecto de la colina y el lavado de la misma,
en una célula no tratada y en otra tratada con PTX. Como se puede observar el
incubar la célula con PTX previene la activación de la corriente por colina. Por lo que,
en la activación de la corriente por colina están involucradas proteínas G, las cuales
son sensibles a PTX.
55
A
b
C
500 ms
20 pA/pF
a
Tratada con PTX
No Tratada con PTX
Colina
30
Lavado
b
I (pA/pF)
25
B
20
15
10
c
d
5
d
c
Figura 22.
500 ms
8 pA/pF
a
0
0
2
4
6
8
10
12
tiempo (min)
Efecto de PTX sobre la corriente activada por colina en miocitos
auriculares de gato. A, Trazos de corriente de una célula no tratada con PTX,
en condiciones control (Aa) y en la presencia de 3 mM de colina (Ab). B,
trazos de corriente de una célula tratada con PTX, en condiciones control
(Bc) y en la presencia de 3 mM de colina (Bd). Aplicando pulsos de 2
segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento de -40 mV a
+50 mV, regresando a -40 mV. C, curso temporal de la aplicación de colina y
el lavado de la misma, en una célula tratada (n) y en otra célula no tratada
( ) con PTX.
56
III. CORRIENTES DE POTASIO ACTIVADAS POR DIFERENTES AGONISTAS
MUSCARINICOS EN MIOCITOS AURICULARES DE GATO
A partir de las diferencias encontradas en las corrientes activadas por ACh,
colina y 4-AP, se han propuesto dos diferentes hipótesis para explicarlas. Que colina
y 4-AP actúan a través de un receptor diferente que ACh, M3 y M4 , respectivamente,
y que esto activa dos diferentes canales rectificadores tardíos (Shi et al., 1999). La
otra hipótesis sugiere que colina y 4-AP a través del M2 como ACh activan IK-ACh , pero
la activación de la corriente es voltaje dependiente. Se han presentado algunas
evidencias que sugieren que la dependencia de voltaje se presenta a nivel de la
interacción del agonista con el receptor muscarínico (Navarro-Polanco y SánchezChapula, 1997; Navarro-Polanco, 1997). Se ha propuesto que la ACh interacciona
con el receptor muscarínico en cuando menos dos sitios diferentes, el amonio
cuaternario interacciona con un grupo aniónico del recepto r y la fracción éster de la
ACh establece interacciones con grupos catiónicos del receptor. En esta hipótesis
proponemos que cuando el agonista interacciona únicamente con el grupo aniónico
del receptor, esta interacción tiene una baja afinidad (requiere concentraciones
mayores del agonista) y es voltaje-dependiente, siendo mayor la afinidad a
potenciales más positivos. Los resultados con colina, la cual posee el amonio
cuaternario de ACh pero no el grupo éster apoya nuestra hipótesis, ya que la afinidad
de colina por el receptor es mucho mas baja que la de ACh (requiere
concentraciones en el rango milimolar). Además, la corriente activada por colina es
voltaje -dependiente. En el presente proyecto, otro de nuestros objetivos fue estudiar
el efecto de dos grupos de compuestos, uno de ellos son fármacos no descritos
anteriormente como agonistas de receptores muscarínicos, que tuvieran un grupo
amino (4-AP) o amonio cuaternario que pudieran interaccionar únicamente con el
grupo aniónico del receptor. Se estudiaron también otro grupo de fármacos que ya
han sido descritos como agonistas muscarínicos, para determinar cuales de ellos
activan IK-ACh en una forma voltaje -independiente como ACh y cuales pudieran activar
la corriente en forma voltaje-dependiente como colina y 4-AP.
57
Como ya se mencionó en publicaciones previas de nuestro laboratorio, la
corriente activada por ACh presenta características cinéticas muy diferentes a las
observadas en la corriente inducida por colina y 4-AP. A continuación presentamos
resultados experimentales en los que podemos observar la corriente activada por
ACh en miocitos auriculares de gato.
Corrientes activadas por ACh en miocitos auriculares de gato. En la Figura 23 A
se muestra la corriente macroscópica activada por ACh, los trazos de corriente se
obtuvieron mediante la sustracción digital de los trazos de corriente en la presencia
de ACh menos los trazos de corriente en condiciones control. Se aplicaron pulsos
hiperpolarizantes y despolarizantes desde un potencial de mantenimiento de -40 mV,
entre -110 y +70 mV con incrementos de 20 mV con una duración del pulso de 3 s,
regresando a -40 mV durante 3 s. La ACh induce una corriente que presenta una
clara rectificación entrante. Cuando se aplican pulsos a potenciales negativos al
potencial de equilibrio del potasio (E K) desde un potencial de mantenimiento de -40
mV, se observa un incremento rápido de la corriente entrante.
Cuando el potencial
de membrana se regresa a -40 mV, la corriente aumenta rápidamente, siendo ésta
mas grande que la corriente al pico correspondiente a +70 mV, presentando
inmediatamente después una disminución dependiente de tiempo de la corriente
saliente. Los pulsos despolarizantes inducen una corriente saliente que exhibe
rectificación entrante, lo que se puede corroborar en la curva corriente -voltaje de la
Figura 23 B. Quiero puntualizar que aun cuando es obvio que el curso temporal de la
corriente activada por ACh durante la aplicación de pulsos despolarizantes es
completamente diferente que la corriente activada por colina durante la aplicación de
los mismos pulsos despolarizantes, las amplitudes de las corrientes máximas
activada a +50 mV, medida al final del pulso, no son significativamente diferentes
(Figura 10 F).
Corrientes activadas por tetrametilamonio (TMA) en miocitos auriculares de
gato. El TMA es un amonio cuaternario que posee cuatro grupos metilo. Al igual que
colina, la diferencia con la ACh es que el TMA no posee el grupo éster (Figura 1). En
58
A
B
I (pA/pF)
10 pA/pF
<
15
10
5
0
-120
1 s
-80
-40
0
-5
40
80
Vm (mV)
-10
-15
-20
Figura 23 Corriente activada por acetilcolina en miocitos auriculares de gato. A,
trazos de corriente activada (resta digital) por 300 nM de ACh (resta digital de
ACh menos el control), aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir
de un pote ncial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. B, relación corriente -voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso (n) (n=6). Cada punto representa la media ± ES.
la Figura 24 A, 24 B y 24 C se muestran trazos de corriente activada por 0.1, 0.3 y 3
mM de TMA (restas digitales), respectivamente. El TMA aumenta la corriente al
potencial de mantenimiento (-40 mV), este aumento es mayor conforme aumenta la
concentración de la droga. Los trazos de corriente también muestran que a
potenciales negativos al potencial de mantenimiento (-40 mV), se observa una lenta
disminución después de un rápido aumento de la corriente. A potenciales positivos a
-40 mV, las corrientes mostraron un aumento tiempo dependiente, inmediatamente
después se observa una disminución de la corriente, el curso temporal de ésta
es mas lento que el aumento. Las corrientes de cola registradas a -100 mV inducidas
por pulsos positivos a este potencial, muestran un incremento inicial seguido por un
decremento tiempo-dependiente. Las corrientes de cola a –100 mV son mas grandes
conforme el pulso anterior es mas positivo. En la Figura 24 D se muestran las curvas
corriente -voltaje de la corriente activada por 0.1, 0.3 y 3 mM de TMA, medida al final
59
<
B
•
10 pA/pF
A
1 s
C
♦
D
I (pA/pF) 20
16
TMA 0.1 mM
12
TMA 0.3 mM
TMA 3
mM
8
4
0
-120
-80
-40
0
-4
40
80
Vm (mV)
Figura 24. Corriente activada por TMA en miocitos auriculares de gato. A, trazos de
corriente activada (restas digitales) por 0.1 mM de TMA aplicando pulsos de
3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento de -40
mV, desde -100 hasta +80 mV, regresando a -100 mV. B, corriente activada
por 0.3 mM de TMA. C, corriente activada por 3 mM de TMA. D, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para 0.1 mM (•),
0.3 mM (n) y 3mM (♦)de TMA (n=6). Cada punto representa la media ± ES.
del pulso. Estos resultados nos muestran que el TMA activa la corriente de una
manera muy semejante a colina.
Corrientes activadas por 4-AP y 3-AP en miocitos auriculares de gato. NavarroPolanco y Sánchez-Chapula en 1997, encontraron que la 4-AP activa a través de
receptores muscarínicos una corriente dependiente de voltaje. La estructura de la 4AP es una amina unida en la posición cuatro a un anillo de piridina, lo cual hace
pensar que la interacción de la 4-AP con el receptor muscarínico sería el de la amina
cargada con el sitio aniónico del receptor. En la Figura 25 se muestran trazos de
60
•
B
5 pA/pF
A
E
1 s
16
I (pA/pF)
12
Control
3-AP
C
<
D
8
1 mM
3-AP 10 mM
♦
4-AP
4
1 mM
0
-120
-80
-40
0
-4
40
80
Vm (mV)
Figura 25. Corriente activada por 3-AP y 4-AP en miocitos auriculares de gato.
Trazos de corriente en condiciones control (A), en la presencia de 1 mM de
4-AP (B), en la presencia de 1 mM de 3-AP (C) y 10 mM de 3-AP (D),
aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de
mantenimiento de -40 mV, a potenciales desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. E, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso para condiciones control (•), en la presencia de 1 mM (n ) y
10 mM(♦) de 3-AP y en la presencia de 1 mM de 4-AP ( ) (n=6). Cada punto
representa la media ± ES.
corriente en condiciones control (Figura 25 A) y en la presencia de 1 mM de 4-AP
(Figura 25 B). A potenciales negativos a -40 mV la 4-AP activa una corriente de
fondo que presenta rectificación entrante y a potenciales positivos a -40 mV activa
una corriente instantánea seguida de una corriente que activa lentamente. Las
corrientes de cola registradas al regresar a -120 mV después de aplicar los pulsos,
aumentan rápidamente para luego disminuir lentamente. Las corrientes de cola son
mayores conforme el pulso previo es mas positivo. La corriente activada durante el
61
pulso y la corriente de cola tienen características semejantes a las características de
la corriente que activa colina.
Existe otra molécula que es muy semejante a la 4-AP, solo que la amina
cambia de posición a la posición 3,
este compuesto es llamado 3-aminopiridina
(3-AP). El cambio en la posición del grupo amino, modifica el PKa de la molécula de
9.2 a 6.0. Este cambio en el PKa significa que a un pH de 7.4 la fracción de moléculas
de 4-AP que tienen el grupo amino cargado (amonio cuaternario) es de 63.1 y que a
ese mismo pH la fracción de moléculas de 3-AP cargadas es de 0.04. Si nosotros
estamos proponiendo que solo las moléculas con carga positiva (amonio cuaternario)
son capaces de interaccionar con el receptor, 4-AP seria mas potente para activar el
receptor muscarínico que 3-AP.
En la Figura 25 C y 25 D se muestran trazos de
corriente en la presencia de 3-AP 1 y 10 mM respectivamente. La 3-AP activa la
corriente muy semejante que la 4-AP, solo que es una orden de magnitud menos
potente. Las curvas corriente-voltaje tanto de 4-AP como de 3-AP se muestran en la
Figura 25 E, mostrando que la activación de la corriente es voltaje-dependiente.
Corrientes
activadas
por
el
trimetil(p-aminofenil)amonio
en
miocitos
auriculares de gato. El trimetil(p-aminofenil)amonio, como su nombre lo indica es un
benceno al cual están unidos una amina y un grupo amonio en posición para (Figura
1). La característica por la cual fue escogida esta molécula para estudiarla es que el
grupo amonio cuaternario predice que podría interaccionar con el receptor
muscarínico. En la Figura 26 se muestran trazos de corriente en condiciones control
(Figura 26 A), en la presencia de 0.3 µM (Figura 26 B) y 3 µM (Figura 26 C) de
trimetil(p-aminofenil)amonio. El trimetil(p-aminofenil)amonio activa una corriente con
características similares a un rectificador tardío. La corriente es activada durante el
pulso, dependiente tanto de tiempo como de voltaje. La activación de la corriente es
dependiente de la concentración de trimetil(p-aminofenil)amonio siendo el curso
temporal de la activación mas rápido a la concentración mas alta. Las corrientes de
cola se registraron a -120 mV, pudiendo observarse un aumento inicial rápido en
la corriente seguido de una disminución de la misma dependiente de tiempo. Las
corrientes de cola son mayores conforme el pulso previo es mas positivo a los
62
•
<
B
10 pA/pF
A
1 s
C
♦
D
I (pA/pF)
24
20
Control
Trimetil(p-aminofenil)
16
12
-amonio 30 µM
Trimetil(p-aminofenil)
-amonio 300 µM
8
4
0
-120
-80
-40
0
-4
40
80
Vm (mV)
Figura 26. Efecto del trimetil(p-aminofenil)amonio sobre miocitos auriculares de gato.
Trazos de corriente en condiciones control (A), en la presencia de 0.3 µM (B)
y en la presencia de 3 µM (C) de trimetil(p-aminofenil)amonio aplicando
pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento
de -40 mV, desde -100 hasta +60 mV, regresando a -120 mV. D, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para condiciones
control (•), en la presencia de 0.3 µM (n) y 3 µM (♦) de trimetil(paminofenil)amonio (n=5). Cada punto representa la media ± ES.
valores del potencial de membrana explorados. En la Figura 26 D se muestran las
curvas corriente-voltaje correspondientes. Estos resultados nos muestran claramente
que diferentes compuestos que poseen un amonio cuaternario son capaces de
activar esta corriente voltaje -dependiente.
Efectos del ácido p-aminobenzoico y del ácido sulfanílico en miocitos
auriculares de gato. La estructura del Ac. p-aminobenzoico (PABA), es como su
nombre lo indica una amina en posición para unida a un ác. benzoico (Figura 1). En
63
<
B
•
5 pA/pF
A
1 s
C
♦
D
I (pA/pF)
12
8
Control
PABA 1 mM
4
PABA 3 mM
0
-120
-80
-40
0
-4
40
80
Vm (mV)
Figura 27. Efecto de PABA sobre miocitos auriculares de gato. Trazos de corriente
en condiciones control (A), en la presencia de 1 mM (B) y en la presencia de
3 mM (C) de PABA aplicando pulsos de 2 segundos de duración a partir de
un potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. D, relación corriente -voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso para condiciones control (•), en la presencia de 1 mM (n) y 3
mM (♦) de PABA (n=4). Cada punto representa la media ± ES.
la Figura 27 se muestran trazos de corriente en condiciones control (Figura 27 A),
en la presencia de 1 mM (Figura 27 B) y 3 mM de PABA (Figura 27 C). En la Figura
27 D se muestran las curvas corriente-voltaje correspondientes.
El PABA no es
capaz de activar la corriente a ninguna de las concentraciones probadas. El ác.
sulfanílico en su estructura tiene un grupo amino unido en la posición para a un ác.
benzensulfónico. En la Figura 28 se muestran trazos de corriente en condiciones
control (Figura 28 A), en la presencia de 1 mM (Figura 28 B) y 3 mM (Figura 28 C) de
ác. sulfanílico. Las curvas corriente-voltaje respectivas se muestran en la Figura 28
64
•
B
<
5 pA/pF
A
1 s
D
C
I (pA/pF)
16
12
Control
Ac. sulfanílico 1 mM
Ac. sulfanílico 3 mM
8
4
0
-120
-80
-40
0
-4
40
80
Vm (mV)
Figura 28. Efecto del ác. Sulfanílico sobre miocitos auriculares de gato. Trazos de
corriente en condiciones control (A), en la presencia de 1 mM (B) y en la
presencia de 3 mM (C) de ác. sulfanílico aplicando pulsos de 2 segundos de
duración a partir de un potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110
hasta +70 mV , regresando a -40 mV. D, relación corriente-voltaje de las
corrientes medidas al final del pulso para condiciones control (•), en la
presencia de 1 mM (n) y 3 mM ( ) de ác. sulfanílico (n=4). Cada punto
representa la media ± ES.
D. El ác. sulfanílico no activa la corriente a ninguna concentración probada. Los
ácidos p-aminobenzoico y sulfanílico aun cuando tienen el grupo amino en su
estructura, la presencia en la molécula de los grupos benzoico y benzensulfónico,
respectivamente hacen que por el PKa del grupo amino, a un pH de 7.4, éste se
encuentre en su forma neutra, la cual de acuerdo a nuestra hipótesis no
interaccionaría con el grupo aniónico del receptor.
65
A
B
<
10 pA/pA
•
1 s
C
I (pA/pF)
20
15
Metacolina 1 µM
10
Metacolina 3 µM
5
0
-120
-80
-40
0
-5
40
80
Vm (mV)
-10
-15
-20
Figura 29. Corriente activada (restas digitales) por metacolina en miocitos
auriculares de gato. A, trazos de corriente activada por 1 µM de metacolina
aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de
mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV, regresando a -40 mV.
B, corriente activada por 3 µM de metacoli na. C, relación corriente-voltaje de
las corrientes medidas al final del pulso para 1 µM (•) y 3 µM (<) de
metacolina (n=6). Cada punto representa la media ± ES.
Corrientes activadas por metacolina en miocitos auriculares de gato. La
metacolina es un agente colinérgico que mimetiza a la ACh. La estructura de la
metacolina
es
muy semejante a la ACh, a excepción que posee un grupo
metilo unido al carbono en la posición tres. En la Figura 29 A y 29 B se muestran
trazos de corriente (resta digital) activada por 1 y 3 µM de metacolina
respectivamente, en miocitos auriculares de gato. La corriente activada por la
metacolina tiene características similares a la activada por la ACh. La metacolina
induce una corriente de fondo que presenta rectificación entrante (Figura 29 C).
66
A potenciales negativos al potencial de equilibrio del potasio (E K), se observa un
incremento dependiente de tiempo en la corriente entrante. Cuando el potencial de
membrana se regresa a -40 mV, se observa una disminución dependiente de tiempo
en la corriente saliente. Los pulsos despolarizantes inducen una corriente saliente
instantánea que exhibe marcada rectificación entrante. En la Figura 29 C se
muestran curvas corriente-voltaje de la corriente activada por metacolina. La
activación de la corriente es concentración-dependiente, mientras mas alta la
concentración de metacolina, mas corriente activada. Estos resultados sugieren que
la metacolina activa la corriente IK-ACh de igual manera que la ACh.
Corrientes de potasio activadas por betanecol en miocitos auriculares de gato.
Existe otro compuesto que presenta similitudes estructurales con ACh y metacolina,
el cual posee una amina terminal en lugar de un metilo, llamado betanecol (Figura 1)
el cual es un agonista muscarínico. En la Figura 30 se muestran trazos de corriente
activada (restas digitales) por betanecol en miocitos auriculares de gato. En la Figura
30 A se presentan los trazos de corriente activada por 3 µM de betanecol y en la
Figura 30 B por 10 µM de betanecol. El betanecol activa la corriente de dos
diferentes maneras. Cuando se aplican pulsos hiperpolarizantes desde un potencial
de mantenimiento de -40 mV, el betanecol activa la corriente muy semejante a la
activada por ACh (Figura 30 Ab y 30 Bb). El betanecol activa una corriente de fondo
que presenta un aumento de las corrientes entrantes con dependencia de tiempo y
una rectificación de las corrientes salientes a potenciales mas negativos que -40 mV.
Cuando el potencial de membrana se regresa a -40 mV después de aplicar los pulsos
previos a diferentes potenciales de membrana, se observa una disminución rápida
dependiente de tiempo en la corriente saliente. Los pulsos despolarizantes inducen
una corriente saliente instantánea que exhibe rectificación entrante y un aumento en
la corriente, el cual es tiempo y voltaje dependiente. El curso temporal de este
aumento dependiente de tiempo de la corriente es mas rápido conforme la
concentración es mayor (Figura 30 Aa y 30 Ba). Al regresar al potencial de -40 mV
después de aplicar los pulsos despolarizantes, las corrientes de cola,
67
•
<
B
a
6 pA/pF
A
a
1 s
b
b
C
Betanecol
I (pA/pF) 15
3 µM
10
Betanecol 10 µM
5
0
-120
-80
-40
0
-5
40
80
Vm (mV)
Figura 30. Corriente activada (restas digitales) por betanecol en miocitos auriculares
de gato. Trazos de corriente activada por 3 µM (A) y por 10 µM (B) de
betanecol
aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta -50 (Ab y Bb) y
desde -30 hasta +70 mV (Aa y Ba), regresando a -40 mV. C, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para 3 µM (•) y
10 µM (<) de betanecol (n=6). Cada punto representa la media ± ES.
muestran un incremento inicial seguido por una disminución dependiente de tiempo.
Las corrientes de cola son mas grandes conforme el potencial del pulso previo es
mas positivo. En la Figura 30 C se muestran las curvas corriente-voltaje de la
corriente activada por betanecol a 3 y 10 µM. La activación de la corriente por
betanecol, como se puede observar es concentración dependiente, a mayor
concentración de betanecol mayor corriente activada.
Hasta aquí los resultados de probar 10 diferentes compuestos (algunos
agonistas muscarínicos), de los cuales 8 de ellos activan la corriente que nosotros
suponemos es IK-ACh . Dos de ellos (ACh y metacolina) la activan sin dependencia de
68
tiempo y voltaje y con una alta afinidad, a concentraciones en el rango micromolar,
cinco (colina, TMA, 4-AP, 3-AP y trimetil(p-aminofenil)amonio) la activan con
dependencia de tiempo y voltaje pero con una baja afinidad (concentraciones en el
rango milimolar), y uno, betanecol, la activa de las dos diferentes maneras. Estos
resultados nos sugieren que la interacción de un amonio cuaternario es
indispensable para activar IK-ACh con
dependencia de tiempo y voltaje; pero si
además la molécula contiene un grupo éster el cual interacciona con otros grupos del
receptor, la activación de la corriente es independiente de tiempo y voltaje y la
afinidad aumenta significativamente.
Efecto de la tertiapina sobre la corriente activada por betanecol en miocitos
auriculares de gato. Como ya se describió previamente, la corriente activada por
betanecol muestra características de una corriente rectificadora entrante cuando se
aplican pulsos hiperpolarizantes, desde el potencial de mantenimiento de -40 mV, y
características de un rectificador tardío cuando se aplican pulsos despolarizantes.
Una posibilidad para explicar este hallazgo es el de que betanecol podría estar
activando dos corrientes diferentes, un rectificador entrante y un rectificador tardío.
Como ya se comentó anteriormente, tertiapina bloquea selectivamente corrientes
rectificadoras entrantes de potasio, en tejidos cardiacos, mas específicamente IK-ACh ,
sin afectar corrientes dependientes de voltaje como corrientes transitorias de salida o
de rectificación tardía. Por lo tanto es una buena herramienta farmacológica para
determinar si la corriente activada por betanecol consta de dos corrientes de potasio
diferentes o se debe a la activación de IK-ACh . En la Figura 31 se muestran los
registros obtenidos en condiciones control (Figura 31 A), en presencia de betanecol 3
mM (Figura 31 B), al agregar tertiapina 200 nM en la continua presencia de betanecol
(Figura 31 C), y la lavar la tertiapina, en presencia del betanecol (Figura 31 D). Como
se puede observar betanecol activó la corriente con la cinética ya previamente
descrita, tertiapina bloquea casi en su totalidad tanto las corrientes entrantes como
las corrientes salientes, y el efecto es parcialmente reversible. Estos resultados
sugieren que la corriente activada por
69
A
•
B <
E
C
D
Control
I (pA/pF)
Betanecol 10 µM
Betanecol 10 µM +
Tertiapina 200 nM
Betanecol 10 µM
(Después lavado Terti.)
♦
8
6
4
2
0
-120
-80
-40
0
-2
40
Vm (mV)
-4
-6
Figura 31. Efecto del bloqueador selectivo de IK-ACh , tertiapina, sobre corrientes
activadas por betanecol. Los trazos de corriente en condiciones control (A),
en la presencia de 10 µM de betanecol (B), de 10 µM de betanecol + 200 nM
de tertiapina (C) y el lavado de tertiapina con betanecol 10 µM (D), se
registraron aplicando pulsos de 3 segundos de duración a partir de un
potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV,
regresando a -40 mV. E, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas
al final del pulso, en condiciones control (•), en la presencia de 10 µM de
betanecol (<), 10 µM de betanecol + 200 nM de tertiapina ( ) y betanecol
10µM después del lavado de teriapina ( ) (n=4). Cada punto representa la
media ± ES.
betanecol tanto para potenciales positivos como negativos es IK-ACh . Una posibilidad
poco probable, pero que no se puede descartar por completo con estos experimentos
es que la corriente activada por betanecol sea una corriente rectificadora tardía
sensible a tertiapina.
70
Interacción de antagonistas específicos de receptores M2 , M3, y M4 con
betanecol en miocitos auriculares de gato. La interacción de los relativamente
específicos antagonistas methoctramina, p-F-HHSiD y tropicamida con el agonista
muscarínico betanecol fueron las últimas combinaciones que se estudiaron. La
cinética de la corriente activada por betanecol muestra características que parecen
ser intermedias entre las activadas por ACh y colina. Ya que se ha planteado la
posibilidad de que ACh estuviera activando la corriente rectificadora entrante, IK-ACh
<
B
•
10 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF)
40
30
Betanecol 3 µM
Betanecol 3 µM +
20
Methoctramina 30 nM
10
0
-120
-80
-40
0
-10
Figura 32.
40
80
Vm (mV)
Efecto de la methoctramina, antagonista M2 muscarínico, sobre la
corriente activada (restas digitales) por betanecol en miocitos auriculares de
gato. A, Trazos de corriente activada por 3 µM de betanecol. B, corriente
activada por 3 µM de betanecol en la presencia de 30 nM de methoctramina.
Se aplicaron pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de
mantenimiento de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV.
C, relación corriente-voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para
betanecol (<) y betanecol mas methoctramina (•) (n=5). Cada punto
representa la media ± ES.
71
<
B
•
15 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF) 40
Betanecol 3 µM
30
Betanecol 3 µM +
20
Methoctramina 100 nM
10
0
-120
-80
-40
0
-10
40
80
Vm (mV)
-20
Figura 33.
Efecto de la methoctramina, antagonista M2 muscarínico, sobre la
corriente activada (restas digitales) por betanecol en miocitos auriculares de
gato. A, Trazos de corriente activada por 3 µM de betanecol. B, corriente
activada por 3 µM de betanecol en la presencia de 100 nM de
methoctramina. Las corrientes se registraron aplicando pulsos de 3 segundos
de duración a partir de un potencial de mantenimiento de -40 mV, desde -110
hasta +70 mV , regresando a -40 mV. C, relación corriente-voltaje de las
corrientes medidas al final del pulso para betanecol (<) y betanecol mas
methoctramina (•) (n=5). Cada punto representa la media ± ES.
mediante receptores M2 y otros agonistas muscarínicos como TMA, colina y 4-AP
estuvieran activando un rectificador tardío mediante otros receptores muscarínicos
M3 o M4 (Shi et al., 1999), betanecol podría ser un agonista que estuviera activando
simultáneamente IK-ACh mediante receptores M2 y un rectificador tardío mediante
receptores M3 o M4 .
En la Figura 32 A se presenta la corriente activada por 3 µM de betanecol
(restas digitales). La cual muestra las características ya descritas previamente, a
72
potenciales negativos al potencial de mantenimiento de -40 mV, la corriente activada
presenta características típicas de un rectificador entrante, sin embargo, para
potenciales positivos a -40 mV, betanecol activa una corriente con características de
un rectificador tardío. En la Figura 32 B se presentan trazos de la corriente activada
por 3 µM de betanecol en la presencia de 30 nM de methoctramina. En la Figura 32
C se presentan
las curvas corriente-voltaje correspondientes. La methoctramina
disminuyó la corriente de fondo (corriente entrante) activada por betanecol a todos
los potenciales estudiados. Sin embargo, también disminuyó la corriente dependiente
de tiempo activada durante los pulsos a potenciales positivos a -40 mV, siendo éstas
diferencias significativas. La corriente activada por 3 µM de betanecol en otra célula
se presenta en la Figura 33 A, y en la Figura 33 B se muestra la corriente activada
por 3 µM de betanecol en la presencia de una concentración mayor de
methoctramina, 100 nM. Las curvas corriente -voltaje se presentan en la Figura 33 C.
El betanecol en presencia de la methoctramina a esta concentración solo logró
activar una pequeña corriente dependiente de tiempo a potenciales positivos a +30
mV. Es claro al observar los registros, que el efecto bloqueador de methoctramina de
la corriente activada por betanecol, presenta una dependencia de voltaje similar al
bloqueo de la corriente activada por colina por el antogonista inespecífico de
receptores muscarínicos atropina, como por el bloqueador específico de receptores
muscarínicos M2, methoctramina.
En la Figura 34 A se muestra la corriente activada por 3 µM de betanecol en
una célula diferente. En la Figura 34 B se muestran los trazos de corriente activada
por 3 µM de betanecol en la presencia de 30 nM del antagonista de receptores M3,
p-F-HHSiD. En la Figura 34 C se muestran las curvas corriente -voltaje
correspondientes. El p-F-HHSiD produce una discreta disminución de las corrientes
entrantes y salientes inducidas por el betanecol. El efecto bloqueador del p-F-HHSiD
de la corriente activada por betanecol es claramente voltaje-independiente.
La corriente activada por 3 µM de betanecol, la cual presenta las
características ya antes descritas se muestra en la Figura 35 A. La corriente activada
por 3 µM de betanecol en la presencia de 200 nM de tropicamida se
73
<
B
20 pA/pF
A
•
1 s
C
I (pA/pF)
Betanecol 3 µM
30
20
Betanecol 3 µM +
10
p-F-HHSiD 30 nM
0
-120
-80
-40
0
-10
40
80
Vm (mV)
-20
-30
Figura 34. Efecto del p-F-HHSiD, antagonista M3 muscarínico, sobre la corriente
activada (restas digitales) por betanecol en miocitos auriculares de gato. A,
Trazos de corriente activada por 3 µM de betanecol. B, corriente activada por
3 µM de betanecol en la presencia de 30 nM de p-F-HHSiD. Aplicando pulsos
de 3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento de 40 mV, desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV. C, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para betanecol
(<) y betanecol mas p-F-HHSiD (•) (n=5). Cada punto representa la media ±
ES.
muestra en la Figura 35 B. En la Figura 35 C se presentan las curvas corrientevoltaje correspondientes. La corriente activada por betanecol es disminuida por
tropicamida a todos los potenciales probados, siendo estas diferencias significativas.
La corriente de fondo prácticamente es bloqueada por completo.
A potenciales positivos a -40 mV, la corriente activada durante el pulso es
disminuida y enlentecida en la presencia de tropicamida. Como se puede observar el
antagonismo inducido por el agonista “específico” de receptores M4 tropicamida,
74
<
B
•
10 pA/pF
A
1 s
C
I (pA/pF)
Betanecol 3 µM
30
20
Betanecol 3 µM +
Tropicamida 200 nM
10
0
-120
-80
-40
0
-10
40
80
Vm (mV)
Figura 35. Efecto de la tropicamida, antagonista M4 muscarínico, sobre la corriente
activada (restas digitales) por betanecol en miocitos auriculares de gato. A,
Trazos de corriente activada por 3 µM de betanecol. B, corriente activada por
3 µM de betanecol en la presencia de 200 nM de tropicamida. Aplicando
pulsos de 3 segundos de duración a partir de un potencial de mantenimiento
de -40 mV, desde -110 hasta +70 mV , regresando a -40 mV. C, relación
corriente -voltaje de las corrientes medidas al final del pulso para betanecol
(<) y betanecol mas tropicamida (•) (n=5). Cada punto representa la media ±
ES.
es muy similar al antagonismo inducido por el antagonista “específico” de receptores
M2, methoctramina, esto es voltaje -dependiente.
75
DISCUSIÓN
En experimentos realizados en nuestro laboratorio se encontró que en
miocitos auriculares de gato, la 4-AP y la colina inducen una corriente de potasio
tiempo- y voltaje-dependiente mediante la estimulación de receptores muscarínicos
(Navarro-Polanco, 1997; Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula, 1997; Fermini y
Nattel, 1994). Fermini y Nattel (1994), describieron en miocitos auriculares de perro
una corriente de potasio dependiente de tiempo con características de un rectificador
tardío activada por colina. Ellos sugirieron que esta supuesta corriente rectificadora
tardía era activada probablemente por un receptor no determinado. Posteriormente
Shi et al. (1999) describieron que en esta misma preparación de miocitos auriculares
de perro, 4-AP activaba otra corriente de rectificación tardía a través de receptores
muscarínicos M3, y que tetrametilamonio (TMA) activaba otra corriente rectificadora
tardía diferente, pero a través de receptores M4.
En trabajos previos (Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula, 1997; Navarro
Polanco, 1997) de nuestro laboratorio, se ha caracterizado cinéticamente la corriente
activada por 4-AP, y se ha encontrado que la cinética de activación e inactivación de
la corriente no corresponden a la de una corriente de rectificación tardía. El curso
temporal de la activación es no solamente voltaje-dependiente, sino también
dependiente de la concentración de 4-AP, siendo mas rápida la activación, cuanto
mayor es la concentración del agonista. Además, se ha encontrado que el
decaimiento de la corriente de cola (supuesta desactivación de la corriente) es
voltaje -independiente. Estas características cinéticas de la corriente activada por 4AP abren serias dudas de que el canal activado por 4-AP sea un rectificador tardío
“verdadero”. Por otro lado, en experimentos registrando canal unitario, se encontró
que la conductancia y el tiempo medio de apertura de los canales activados por 4-AP
son similares a los canales activados por ACh, en la misma preparación.
En el presente trabajo hemos caracterizado cinéticamente la corriente activada
por colina. Al igual que la corriente activada por 4-AP, el curso temporal de la
activación además de ser dependiente del voltaje, es dependiente de la
concentración de colina. Además, la desactivación de la corriente es independiente
76
del voltaje. Los bloqueadores de IKr e IKs , dofetilida e indapamida respectivamente,
no afectan la corriente activada por colina semejante a un rectificador tardío,
sugiriendo que ninguna de esas corrientes estan involucradas. Hemos sugerido que
la colina puede estar activando IK-ACh de una manera dependiente de tiempo y voltaje,
esto es, la despolarización incrementa la activación de la corriente. Uno de los
argumentos que surgen en contra de la posibilidad de que ACh y colina estuvieran
activando el mismo canal, es la diferente morfología que presentan ambas corrientes
cuando se aplican pulsos hiperpolarizantes y despolarizantes, desde un potencial de
mantenimiento de -40 mV (Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula, 1997; NavarroPolanco, 1997). Sin embargo, cuando los canales son activados primeramente por un
pulso despolarizante a +50 mV, seguido por un corto pulso hiperpolarizante a -120
mV, las corrientes salientes activadas por ACh y colina durante la subsecuente
despolarización tienen cursos temporales similares, sugiriendo que ACh y colina
podrían estar activando la misma corriente.
La corriente IK-ACh ha sido demostrada de ser activada por adenosina, a través
de la estimulación del receptor purinérgico A1. El mecanismo de activación del canal
es el mismo que el sugerido para la activación del canal por ACh. La ocupación del
receptor por el agonista activa una proteína GK, y el dímero formado por las
subunidades βγ a su vez activa el canal (Logothetis et al., 1987; Clapham y Neer,
1993; Wickman et al., 1994). En la presente tesis estudiamos la interacción de
adenosina y colina. El razonamiento de nuestro experimento fue de que si adenosina
a una concentración máxima, a través de los receptores A1 activa IK-ACh, una corriente
rectificadora entrante, en una forma voltaje-independiente y si colina activa a través
de un receptor diferente (muscarínico) un canal diferente (un rectificador tardío), la
administración de los dos fármacos juntos, induciría la suma de las dos corrientes.
Por otro lado, si adenosina a una concentración máxima activa IK-ACh en una forma
voltaje independiente y colina a una concentración sub-máxima activa la misma
corriente, en forma voltaje-dependiente, la aplicación de los dos fármacos al mismo
tiempo, produciría la competencia de los mismos por el mismo efector. Si la
adenosina es aplicada a una concentración máxima y colina a una concentración
sub-máxima, la morfología de la corriente registrada sería mas la de un rectificador
77
entrante. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente que la segunda opción es la
correcta, es decir, ambos agonistas están compitiendo por el mismo efector. Otra
posible explicación de que los efectos de adenosina sean mas marcados que los de
colina, es que el acople entre el receptor muscarínico y la proteína Gi/o , es menos
eficiente cuando el receptor es activado por colina. Entonces, cuando se aplican la
adenosina y la colina juntas, la adenosina podría activar un mayor número de
proteínas Gi/o, utilizando la mayoría de subunidades βγ y por lo tanto la relación de
corriente activada por colina es menor con respecto a la corriente activada por
adenosina.
Una evidencia adicional que sugiere que colina, betanecol y ACh podrían estar
activando IK-ACh es que la toxina tertiapina, bloquea tanto la corriente con
características de rectificador entrante activada por ACh, IK-ACh , como la corriente con
características de rectificador tardío, activada por colina, TMA o betanecol, y que
nosotros sugerimos es IK-ACh , activada de una forma voltaje dependiente. Tertiapina
es un péptido de 21 residuos obtenido del veneno de la abeja, se ha demostrado que
ésta toxina bloquea selectivamente IK-ACh en miocitos auriculares de conejo, sin
afectar otros canales de potasio como el rectificador entrante, IK1, el canal modulado
por ATP, IK-ATP, los rectificadores tardíos IKr e IKs , y el canal que acarrea la corriente
transitoria de salida, Ito (Kitamura et al., 2000; Drici et al., 2000).
Los resultados obtenidos al estudiar el efecto de colina en miocitos auriculares
de las especies mas frecuentemente utilizadas en el laboratorio para experimentos
de electrofisiología cardiaca, nos permiten concluir que la corriente activada por el
agonista muscarínico colina, posee características similares voltaje- y tiempodependientes en todas ellas. Las diferencias en la activación de la corriente por
colina en las diferentes especies se deben probablemente a que en cada una de
ellas existe diferente densidad, tanto de receptores como de canales. Nuestro
razonamiento en estos experimentos fue probar si el efecto activador voltajedependiente de la colina se presentaba solo en miocitos auriculares de gato o era un
fenómeno mas generalizado que se presentaba en las diferentes especies de
mamífero. Además, se sabe que existe una gran variedad de canales dependientes
de voltaje en las diferentes especies, sin embargo, el canal IK-ACh se encuentra
78
presente en todos los mamíferos. Las densidades de corriente para IK-ACh que
encontramos en experimentos realizados en el laboratorio y resultados publicados
(Horie e Irisawa, 1987; Koumi et al., 1995) fueron en este orden: conejo < rata <
cobayo < gato. Mientras que las densidades para la corriente activada por colina que
encontramos a +40 mV en pA/pF son: conejo 4.38, perro 5.96, rata 11.3, ratón 12.1,
cobayo 22.23 y gato 27.33. Como se puede observar el orden de las densidades de
corriente activada tanto por ACh como por colina, en diferentes especies siguen un
orden similar, para algunas especies no encontramos en la literatura datos obtenidos
bajo condiciones experimentales similares a las nuestras. Así, nuestros resultados
podrían sugerir indirectamente que la corriente que esta siendo activada por
colina es IK-ACh . Por otra parte, las τ (ms) de desactivación encontradas en las
diferentes especies para la corriente activada por colina a –100 mV son: perro
579.48, gato 620 y ratón 907.56; y a –40 mV son: perro 571.12, conejo 483.33,
cobayo 545.49, rata 391.08, gato 580 y ratón 890.92.
Como se puede notar a
l
desactivación de la corriente es independiente de voltaje y encontramos que también
es independiente de la concentración en las diferentes especies estudiadas. Los
valores de las τ de desactivación en las diferentes especies son muy semejantes
entre
ellas,
a
diferencia
solo
con
el
ratón
que
la
desactivación
es
mas lenta e incluso no llega a desactivarse completamente en 3 s. Sin embargo,
estas diferencias en las τ de desactivación es algo muy interesante que podría ser
estudiado en futuros proyectos de investigación, por lo pronto con los resultados
obtenidos en este trabajo no podemos sugerir cual sea la causa.
Durante mucho tiempo se ha sostenido que el receptor muscarínico M2 es el
único subtipo funcional de mAChR que se encuentra en el corazón de mamíferos
(Bonner et al., 1987) y contribuye a la regulación de la frecuencia cardiaca y a la
forma del potencial de acción. Sin embargo, algunos estudios han mostrado la
expresión de otros subtipos de mAChR en tejidos cardiacos. Por ejemplo, se ha
mostrado que los mRNAs que codifican para M2, M3 y M4 son expresadas en el
corazón de pollo (McKinnon y Nathanson, 1995). Mas recientemente, Shi et al.
(1999) han sugerido que 4-AP activa un corriente de rectificación tardía a través de
receptores M4 y que TMA y colina activan otro rectificador tardío a través de
79
receptores M3 . En gran medida estas conclusiones de Shi et al. (1999) han estado
basadas en el supuesto de que los antagonistas de los diferentes subtipos de
receptores utilizados son específicos. En la presente tesis presentamos evidencias
de que en la preparación que hemos utilizado, miocitos auriculares de gato, la
supuesta especificidad de éstos antagonistas no lo es. Los tres antagonistas,
methoctramina, p-F-HHSiD y tropicamida, bloquean la corriente rectificadora entrante
activada por ACh, IK-ACh . Abundantes evidencias experimentales han demostrado
claramente que la activación de esta corriente es mediada por receptores M2 (Koumi
S-i. et al., 1995; Kurachi, 1995). Además, en la presente tesis hemos mostrado
evidencias de que los tres antagonistas también bloquean las corrientes activadas
por colina y betanecol. En el caso de la colina, encontramos que el antagonismo de
la corriente por la methoctramina, la tropicamida y el p-F-HHSiD, es similar. Cuando
el betanecol fue el agonista se observa un antagonismo mas marcado cuando el
antagonista es el bloqueador de receptores muscarínicos M4. Un experimento a
realizar sería el utilizar antagonistas mucho mas específicos para los diferentes
receptores, como la MT-3 (toxina mamba tipo 3), un antagonista que ha sido
encontrado altamente específico para los receptores M4 , con una EC50 de 5 nM
(D’Agostino et al., 2000). La falta de especificidad mostrada por los antagonistas
supuestamente específicos de los subtipos de receptores M2, M3 y M4 no nos
permiten responder a la pregunta de si colina, betanecol y otros agonistas
muscarínicos que activan corrientes de potasio que presentan dependencia de
voltaje lo hacen a través de receptores M2 y/u otro subtipo de receptor.
Los receptores muscarínicos están acoplados a proteínas G. En el caso de los
receptores M2 , activan a una proteína Gi/o que activa al canal KACh, de una manera
delimitada a la membrana (Kurachi, 1995). Los receptores M2 y M4 activan a la
proteína Gi/o (sensible a PTX), que también inhibe a la adenilato ciclasa,
disminuyendo el AMPc y la activación de PKA (Picatoste, Sarri y Claro, 1996a). Se
ha reportado que los receptores M3 están acoplados a proteínas Gq/11 (no sensibles a
PTX) (Wess, 1993) que a su vez activa una fosfolipasa C, PLC, que promue ve la
hidrólisis
del
fosfatidilinositol
4,5
difosfato,
en
diacilglicerol
(DAG)
y
en
inositol(1,4,5)trifosfato (InsP3), los cuales modulan diversas isoenzimas de la familia
80
de las PKC y son responsables de la movilización del Ca++ i (Picatoste, Sarri y Claro,
1996b). Al parecer, por lo anterior, el canal KACh podría estar siendo modulado a
través de los receptores muscarínicos M2 (de una manera delimitada a la
membrana), ya que otros tipos de receptores muscarínicos, M3 y M4 , activan
cascadas de segundos mensajeros diferentes que son responsables de la
movilización del calcio intracelular y, de la inhibición o activación de corrientes de
calcio. Por otra parte, Heath y Terrar en el 2000, reportaron que la activación de PKA
por isoprenalina o forskolin, fosforila los canales de Ca++ tipo L, conduciendo a un
incremento en la concentración de Ca++i . Este incremento de Ca++ puede entonces
conducir a la activación de PKC sensible a Ca++ , aun sin la producción de derivados
de fosfolípidos tal como el DAG, causando un incremento en el componente del
rectificador tardío IKr , en células cardiacas de cobayo (Heath y Terrar, 2000). Por lo
anterior, la activación de proteínas Gi/o inducida por agonistas muscarínicos, a través
de los receptores M2 y M4, inhibirían la activación de la PKA, por lo que la PKC, no
incrementaría un rectificador tardío por ésta vía. Además, Meyer et al. en el 2001,
encontraron que los receptores muscarínicos M3, no están presentes en miocitos
aislados, pero sí se encuentran en la suspensión de células producto de la dispersión
de aurícula de rata. Lo que pone en evidencia que, lo reportado por Shi y col. (1999),
pudiera ser un artefacto de los M3AChR que se encuentran en células endoteliales y
vasos, presentes en la aurícula completa. Otra evidencia que obtuvimos es que la
proteína G que está involucrada en la activación de la corriente por colina es sensible
a PTX, indicándonos que esta proteína G es del tipo Gi/o . Lo anterior nos sugiere que
los receptores muscarínicos que pueden estar involucrados en la activación de la
corriente por colina son el M2 y el M4.
Los receptores muscarínicos pueden activar varias proteínas G (Gi2 , Gi3 y Go)
con subunidades α sensibles a PTX, las cuales están involucradas en el
señalamiento para la activación de canales de K+ en el corazón (Sowell et al. 1997).
Estos autores también demostraron que la activación de IK-ACh requiere la expresión
de dos proteínas G, Gi2 y Gi3, y que en su ausencia otras proteínas G no son capaces
de sustituirlas en la activación de IK-ACh. Mostraron que la expresión de dos
subunidades α, α i2 y α i3, son requeridas para la activación normal por agonistas de
81
IK-ACh . Lei et al. (2000) reportaron que de las cinco subunidades β que hasta la fecha
se han identificado por biología molecular, se ha reportado que β 1, β 2, β3 y β 4 se unen
con múltiples subunidades γ, especialmente β 3 y β4 con subunidades γ2 y γ11, para
activar los canales Kir3 (familia a la que pertenecen las subunidades que forman
IK-ACh ). Los dímeros βγ que contienen β 5 se asocian preferentemente a α q, activando
la PLC-β, resultando en la movilización del Ca++i . También reportaron que los
dímeros que contienen β 5 inhiben los canales Kir3, y sugieren que éstos dímeros
podrían estar actuando como antagonistas competitivos de otros dímeros βγ . Dadas
las diferentes vías divergentes que se pueden activar no podemos descartar
inequívocamente que algunos agonistas muscarínicos pudieran estar activando
además de IK-ACh un canal rectificador tardío. Sin embargo, las evidencias cinéticas y
la dependencia de voltaje de la corriente activada por estos agonistas, no
corresponden a los de un rectificador tardío. Además, evidencias farmacológicas
como son el bloqueo que induce el bloqueador altamente específico de IK-ACh ,
tertiapina, sobre este supuesto rectificador tardío.
La modulación por voltaje de la activación de IK-ACh por colina, TMA y 4-AP ha
sido sugerida de depender de la interacción del agonista con el receptor (Navarro
Polanco, 1997). Las evidencias que han permitido sugerirlo son que la interacción de
4-AP y colina con el antagonista de receptores muscarínicos atropina es modulado
por el voltaje. A los potenciales mas negativos, el efecto antagónico es mayor, y
conforme el potencial es menos negativo el efecto antagónico es revertido. Por otro
lado, el efecto antagónico de atropina de la corriente activada por ACh es voltajeindependiente, lo cual nos sugiere que la interacción de atropina con el receptor M2
es voltaje-independiente. Todo lo anterior nos permite suponer que en la interacción
atropina- colina o 4-AP, la afinidad del receptor por los agonistas colina o 4-AP es
modulada por el voltaje, siendo mayor la afinidad a potenciales positivos.
En el modelo original desarrollado para explicar la interacción de la ACh con el
receptor muscarínico, se plantea la interacción del amonio cuaternario de la ACh con
un grupo aniónico del receptor, y de interacciones de los oxígenos del grupo éster y
del grupo carbonilo de la ACh con sitios catiónicos del receptor. Información reciente
obtenida mediante estudios de biología molecular de los receptores muscarínicos,
82
han determinado la presencia de un Asp en el segmento transmembranal III, el cual
es esencial para la interacción de los agonistas con el receptor y ha sido identificado
como el probable sitio de unión del amonio cuaternario de los agonistas (Wess,
1993). Asimismo, se ha identificado en el receptor muscarínico varios residuos de Thr
y Tyr, los cuales serían importantes en la formación de puentes de hidrógeno con la
ACh (Wess, 1993). Nuestra hipótesis propone que la interacción entre el amonio
cuaternario del agonista y el Asp del receptor son esenciales para la interacción, sin
embargo, la interacción del resto de la molécula de ACh con las Thr y Tyr del
receptor le proporciona a la interacción una mayor afinidad y una independencia del
voltaje. En el caso de la colina, la cual no posee el grupo éster de la ACh, la
interacción del agonista con el receptor depende esencialmente de la interacción del
amonio cuaternario con el Asp del receptor, lo cual provocaría que la interacción
sería de baja afinidad y voltaje-dependiente. Si nuestra hipótesis es correcta, una
primera suposición sería que el compuesto TMA, el cual solamente consta del
amonio cuaternario, unido a cuatro metilos, debería inducir un efecto similar al de la
colina. Nuestros resultados y los de otros (Shi et al., 1999) demuestran que TMA
activa una corriente voltaje-dependiente. Esta hipótesis también explicaría el efecto
agonista de la 4-AP, la cual en su forma cargada interaccionaría con el grupo
aniónico del receptor en una forma voltaje-dependiente. Esta evidencia se ve
reforzada por los resultados con la 3-AP, la cual con PKa de 6.0 en contra de un PKa
de 9.2 de la 4-AP, es menos potente que la 4-AP, lo cual podría ser explicado por el
hecho que a un pH de 7.4, la relación droga cargada / droga es de 0.04 para 3-AP y
63.1 para 4-AP. Esta evidencia se ve aun mas reforzada por los experimentos con el
trimetil(p-aminofenil)amonio, el cual consta de un amonio cuaternario unido a un
p-amonifenil. Esta molécula se encuentra totalmente cargada a un pH de 7.4, y como
nos muestran los resultados, activa la corriente de potasio en forma voltajedependiente y con una potencia aproximadamente diez veces mayor que la 4-AP.
Los compuestos ácido p-aminobenzoico y ácido sulfanílico, aun cuando poseen el
grupo amino en su estructura, éste es incapaz de interaccionar con el grupo aniónico
del receptor por la presencia de los grupos benzoico y benzensulfónico,
respectivamente.
83
La metacolina y el betanecol son agonistas muscarínicos que poseen tanto el
amonio cuaternario como los oxígenos éster y carbonilo en su molécula, de tal
manera que se esperaba que IK-ACh se activara con las características voltajeindependientes con que lo hace la ACh. La metacolina, posee una estructura similar
a la ACh solo tiene un grupo metilo en la posición 3. La corriente activada por
metacolina tiene características de un rectificador entrante, similar a la corriente
activada por la ACh (Figura 29), es decir, el grupo metilo en la posición 3 no interfiere
en la forma de activación de la corriente. La diferencia de las moléculas de
metacolina y ACh con el betanecol es que esta última posee un grupo amino
terminal. El betanecol activa IK-ACh de una manera tiempo- y voltaje-independiente
cuando se aplican pulsos hiperpolarizantes a partir del potencial de mantenimiento de
-40
mV.
Mientras
que
aplicando
pulsos
despolarizantes
al
potencial
de
mantenimiento -40 mV, el betanecol activa KI -ACh tiempo- y voltaje-dependiente. Es
decir, el betanecol puede activar la corriente en forma independiente y dependiente
del voltaje. Los resultados hasta ahora obtenidos no nos permiten tener una
explicación razonable para estos resultados.
La diferencia observada en la activación de los diferentes agonistas
muscarínicos o compuestos con cierta similitud estructural a colina o 4-AP, se deben
a las diferentes relaciones del número de moléculas cargadas con las moléculas no
cargadas, que al pH con el que se trabaja (7.4) se encuentran. Esto debido a que en
cada compuesto el pK de los respectivos grupos aminos es diferente. Y como lo
estamos proponiendo es necesario la presencia del amonio cuaternario (grupo amino
cargado) para la activación del receptor.
84
CONCLUSIONES
1. La activación de una corriente de potasio dependiente de voltaje por 4-AP y
colina en miocitos auriculares de gato no es una “rareza farmacológica” de
esta especie, los experimentos realizados en diferentes especies de mamífero
nos muestran que esta corriente es activada en todas ellas.
2.
Hasta ahora dos hipótesis han sido planteadas para la identificación de esta
corriente o corrientes. Shi et al. (1999) han sugerido que 4-AP induce una
corriente rectificadora tardía a través de la activación de receptores
muscarínicos M4. Mientras que TMA y colina activan otro rectificador tardío
diferente a través de receptores muscarínicos M3. Nuestra propuesta es que
4-AP, colina, TMA, betanecol y otros agonistas muscarínicos activan la
corriente KI -ACh en una forma vo ltaje-dependiente. Sin embargo, no podemos
descartar completamente la activación de un canal rectificador tardío.
3. En el presente trabajo y en previos trabajos hemos presentado evidencias de
que la o las corrientes activadas por estos agonistas muscarínicos no poseen
características típicas de las corrientes rectificadoras tardías, el curso temporal
de la activación es dependiente de la concentración del agonista, la
desactivación de la corriente es voltaje -independiente. En trabajos previos
utilizando registro de canal unitario hemos encontrado que el canal activado
por 4-AP y colina tiene una conductancia y tiempo de apertura similar al de
IK-ACh .
4. La participación de otros subtipos de receptores muscarínicos además del
receptor M2 no es clara ya que los antagonistas supuestamente específicos
para receptores M3 y M4 no lo son en esta preparación de miocitos auriculares
de gato.
85
5. Hemos mostrado evidencias de que la modulación por voltaje de la activación
de IK-ACh podría estar a nivel del receptor, y que cuando la interacción del
agonista con el receptor únicamente involucra la interacción del grupo amonio
cuaternario del agonista con el sitio aniónico del receptor, la interacción es
voltaje -dependiente.
86
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