universidad veracruzana

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICO FARMACÉUTICO Y BIÓLOGO
TESIS
DETERMINACIÓN DE IONES Ca++ MEDIANTE EL
MÉTODO DE ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN
ATÓMICA (EAA) EN CÁPSULAS DE ALGINATO
PRESENTA
OSCAR FLORES CASTAÑOS
DIRECTOR DEL TRABAJO RECEPCIONAL
DRA. MA. TERESA GONZÁLEZ ARNAO
ORIZABA, VER.
DICIEMBRE, 2010
AGRADECIMIENTOS
"Hoy es un gran día, porque se avanza un peldaño más en esta escalera que es la vida, pero no sin pensar que todo
termina aquí al contrario la vida continua y tal vez vengan tiempos muy difíciles, con aciertos y desaciertos, pero
esperando saber campear esos temporales con sabiduría, paciencia e inteligencia. Este nuevo paso que se da, brindara
las armas necesarias para poder aprovechar las oportunidades que proporcione la vida y además, seguirse superando
como persona. Teniendo siempre presente que: "EL CONOCIMIENTO SE APRENDE POR MEDIO DEL ESTUDIO, Y LA
SABIDURIA POR MEDIO DE LA OBSERVACION".
A mis padres:
Quienes con ilusiones, sueños y esperanzas, lo dejaron todo, para dar a sus hijos lo necesario para poder crecer como
personas de bien, a quienes a pesar de los problemas supieron mantener a la familia unida, por eso y muchas cosas más,
hago más suyo que mío este triunfo, porque son ellos los que me brindaron las herramientas y la inspiración para
continuar.
A mis hermanos:
Quienes compartieron conmigo un largo camino, con aciertos y desaciertos que nos proporciona la vida, pero siempre
sonriendo y proporcionándome el apoyo que aunque no se los pedía, ellos me brindaban sabiendo que lo necesitaba.
A mis tíos:
Quienes sin mencionar nombres, saben quiénes son, a ellos quienes con su apoyo, logro demostrarles que la confianza
que depositaron en mí, me encuentro escribiendo esto para ellos.
A la Dra. Tere
Quien sin conocerme me brindo la confianza que de alguna forma trate de no perder, a ella que me brinda todo su
apoyo hasta altas horas de la tarde, a ella que siempre se encontraba trabajando y siempre encontró el momento para
orientarme.
A todos ustedes “GRACIAS”
Índice General
Pagina
INDICE DE FIGURAS
i.
INDICE DE TABLAS
ii.
I.
INTRODUCCION
1
1.1 Planteamiento del problema
5
1.2 Justificación
5
II.
OBJETIVOS
6
III.
HIPÓTESIS
8
IV.
MARCO TEÓRICO
4.1 Proceso de crioconservación
11
4.2 Encapsulamiento
13
4.3 Alginatos
14
4.4 Estructura química de los alginatos.
15
4.5 Propiedades fisicoquímicas de los alginatos
17
4.6 Propiedades mecánico-estructurales de los alginatos
19
4.7 Geles de alginato
21
4.8 Mecanismo de formación de los geles de alginato de calcio
22
4.9 Métodos de liberación
24
4.10
26
Método analítico para la determinación de elementos
metálicos o metaloides
4.11
V.
Espectroscopia de absorción atómica en flama
26
MATERIALES Y METODOS
5.1 Preparación de soluciones para la encapsulación
30
5.1.1
Alginato de sodio
30
5.1.2
Cloruro de calcio
30
5.2 Obtención y estandarización de las cápsulas de alginato de calcio
por peso.
5.3 Tratamientos de las cápsulas en medio líquido con altas
concentraciones de sacarosa.
5.4 Preparación de las muestras de cápsulas de alginato de calcio
para el análisis de absorción atómica.
5.5 Determinación de calcio por espectrofotometría de absorción
atómica (EAA)
5.6 Cuantificación de calcio por espectrofotometría de absorción
atómica (EAA)
5.6.1 Elaboración de curva de calibración
5.6.2
VI.
Condiciones de trabajo en el equipo de absorción atómica
GBC 932 AA
31
32
32
33
34
34
35
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Efecto del tiempo de gelificación en la concentración de calcio de
37
cápsulas de alginato.
6.2 Efecto del tratamiento de precultivo en medio líquido
38
suplementado con sacarosa, en la concentración de calcio de
cápsulas de alginato obtenidas a diferentes tiempos de
gelificación.
6.3 Valoración de la implementación de la técnica de absorción
42
atómica para la determinación de calcio en cápsulas de alginato.
VII.
VIII.
IX.
CONCLUSIONES
44
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
45
ANEXOS
50
Índice de Figuras
Figura
Descripción
Página
1
Modelo de caja de huevos propuesta por Grant
22
2
Representación esquemática de la asociación de las secuencias
23
poliglucorónicas por quelación por calcio
3
Componentes de equipo de espectrofotómetro de absorción
27
atómica
4
Representación gráfica del contenido de Ca++ en cápsulas
38
gelificadas por tiempos diferentes
5
Efecto del tiempo de gelificación de las cápsulas de alginato y de la
41
concentración de sacarosa en el medio de precultivo sobre el peso
seco (Ps).
6
Efecto de la concentración de sacarosa en el medio de precultivo
sobre el contenido de Ca++ de las cápsulas de alginato. ND: No
determinado.
41
Índice de Tablas
Tabla
Descripción
Página
1
Porcentaje de ácido mannurónico (M), glucorónico (G), relación
16
M/G y contenido de alginato (%), para varias especies comerciales
de algas pardas
2
Efecto del tiempo de gelificación en la concentración de calcio en
37
cápsulas de alginato
3
Efecto
del
precultivo
en
medio
líquido
con
diferentes
concentraciones de sacarosa (0.06, 0.5, 0.75 y 1M) , en el contenido
de calcio en cápsulas de alginato a diferentes tiempos de gelificacion
(10, 20, 30 y 60min). ND. No determinado
39
I. INTRODUCCIÓN
Introducción
La tecnología de la semilla sintética, la cual consiste básicamente en el encapsulado de un
explante meristemático para su propagación, nace como respuesta a la urgencia de
establecer métodos que reduzcan costos y tiempo en la etapa de aclimatización a
condiciones in vivo de los materiales provenientes de laboratorio. La semilla sintética
combina por un lado las ventajas de la reproducción asexual tales como: multiplicación de
poblaciones idénticas y crecimiento acelerado, con las ventajas de la reproducción sexual o
por semilla: fácil manipulación, capacidad de almacenaje, protección del explante, entre
otras.
Esta tecnología aumenta la protección del material vegetal y facilita su manipulación, por
otra parte, la tecnología de las semillas sintéticas es utilizada también para la conservación
a largo plazo o crioconservación, debido a que facilita la manipulación y aumenta la
protección de los materiales. La crioconservación consiste en la preservación de cualquier
material vivo a temperaturas ultrabajas, realizado en nitrógeno líquido (-196 ºC). Esta es la
única forma conocida de conservación a largo plazo para las especies vegetales que se
propagan vegetativamente o que producen semillas recalcitrantes (Abdelnour, 2001). Como
procedimiento posee numerosas ventajas tales como: estabilidad genética del material,
implementación en espacio reducido, bajos costos y poca peligrosidad.
Los materiales usados para el encapsulamiento deben de cumplir con la función de
protección física del sistema biológico y pueden además contemplar la existencia de
nutrientes, antibióticos, funguicidas y microorganismos. Redenbaugh y colaboradores a
comienzos de los ochentas, y después de diversos estudios con compuestos prominentes,
determinaron que los hidrogeles de alginato de calcio, llegaban a poseer las mejores
características (Artola, 2002; Nieves, 2000; Rodríguez, 2000). El encapsulamiento con base
en este compuesto químico, suministra una protección adecuada para el tejido vegetal,
gracias a que posee una dureza idónea (Artola, 2002).
La formación de cápsulas sintéticas se logra por gotear la solución de alginato de sodio con
o sin el material vegetal a encapsular, sobre una solución de sal de calcio. La incubación de
2
Introducción
las cápsulas de 20 a 30 minutos, en esta última solución, es necesaria para inducir una
constitución apropiada (Muniswamy, 2000; Redenbaugh, 1990; Rodríguez, 2000).
La técnica criogénica de encapsulación/deshidratación se basa en la tecnología desarrollada
para la producción de semillas sintéticas (Redenbaugh, 1993). La crioconservación de
ápices, embriones somáticos o pequeños embriones cigóticos bajo este procedimiento,
contempla la encapsulación del material vegetal en la matriz de alginato, su tratamiento en
medio líquido con altas concentraciones de sacarosa, la deshidratación parcial bajo la
corriente de aire de una cabina de flujo laminar o utilizando gel de sílice, hasta alcanzar un
contenido de humedad en las cápsulas próximo al 20% y finalmente la congelación en
nitrógeno líquido la cual suele ser por lo regular de forma rápida mediante la inmersión
directa a -196°C (Engelmann, f. 1997). La reactivación del crecimiento del material
crioconservado generalmente es rápida y directa, sin formación de callo.
Sin embargo, el tiempo de gelificación durante el proceso de elaboración de las capsulas de
alginato de calcio, puede influir en los fenómenos de difusión de masas, en la concentración
del ion calcio atrapado en la matriz de alginato y repercute en la consistencia de la cubierta
sintética que los tejidos deben atravesar para su desarrollo posterior durante la etapa de
recuperación.
El estudio por métodos analíticos del efecto del tiempo de gelificación puede brindar
información de utilidad sobre el proceso de encapsulación. La espectroscopia por absorción
atómica (EAA) es una forma modificada de fotometría de llama. La radiación de una fuente
de luz espectral de un elemento específico pasa a través de una muestra que ha sido
disociada térmicamente en átomos y se mide la atenuación de la intensidad de la radiación
debido a la absorción. La atenuación de la intensidad es una medida de la concentración del
metal respectivo en la muestra.
La espectroscopia de absorción atómica se ha usado para analizar trazas de muestras
geológicas, biológicas, metalúrgicas, vítreas, cementos, aceites para maquinaria,
3
Introducción
sedimentos marinos, farmacéuticas y atmosféricas, ya que es posible determinar más de 70
elementos con más exactitud que la fotometría de flama que ha sido desplazada casi
completamente por la implementación de este nuevo método de análisis .
Por esta razón, para poder evaluar la cinética del proceso de encapsulación con respecto a la
concentración de calcio, la EAA presenta la mejor opción para el análisis con respecto al
tiempo de gelificación, ya que es una técnica demasiado sensible detectando mínimas
variaciones con respecto a las concentraciones que se presenten en las capsulas preparadas
con alginato.
4
Planteamiento del problema y justificación
1.1 Planteamiento del problema
Los alginatos son uno de los polímeros más utilizados en la encapsulación, con base en este
compuesto químico, suministra una protección adecuada para el tejido vegetal, gracias a
que posee una dureza idónea dependiendo del tiempo en que permanezca dentro de la
solución de cloruro de calcio que aparentemente es el responsable de la consistencia del
mismo y además, confiere un ambiente adecuado para la transferencia de masas por
osmosis durante su posterior recuperación. Sin embargo, se desconoce si el tiempo de
gelificación influye en este tipo de proceso, es decir, en el tamaño del poro, la rigidez, la
osmosis y las condiciones que se requieren para la recuperación de tejidos encapsulados y
que éstos puedan romper la cubierta sintética y así emerger y desarrollar una nueva planta.
1.2 Justificación
Existen técnicas criogénicas, que ocupan la encapsulación en alginato de calcio como
medio de protección de los tejidos vegetales que se desean almacenar en nitrógeno líquido a
largo plazo, sin embargo, no existen estudios previos, relativos al proceso de gelificación
durante la formación de las capsulas y por consiguiente al evento de la encapsulación de los
tejidos.
Con el desarrollo de esta investigación se pretende aportar información de corte básico,
referente al proceso de gelificación, que tiene lugar durante la encapsulación de tejidos
vegetales sometidos al procedimiento criogénico de encapsulación-deshidratación, en
capsulas de alginato de calcio.
5
II. OBJETIVOS
Objetivos
Objetivo general
Estudiar el proceso de gelificación en capsulas de alginato de calcio utilizando la técnica de
espectroscopia de absorción atómica (EAA) asociado al procedimiento criogénico de
encapsulación/deshidratación.
Objetivos particulares

Evaluar la cinética del proceso de encapsulación por EAA, determinando el
contenido de calcio en capsulas de alginato obtenidas a diferentes tiempos de
gelificación.
 Determinar por EAA el contenido de calcio en capsulas obtenidas a diferentes
tiempos de gelificación y sometidas al tratamiento de precultivo en medio líquido
suplementado con sacarosa a diferentes concentraciones.
7
III. HIPÓTESIS
Hipótesis
El proceso osmótico de penetración de solutos a las cápsulas de alginato sometidas al
precultivo en medio líquido suplementado con sacarosa, reduce el contenido de calcio por
el incremento de los sólidos totales.
9
IV. MARCO TEÓRICO
Marco teórico
4.1 Proceso de crioconservación
El cultivo de tejidos vegetales es una rama más desarrollada de la biotecnología. Esta
disciplina incluye un conjunto de técnicas de cultivo in vitro, donde se le proporciona a un
explante (sección de hoja, raíz, brote, meristema u otras) las condiciones ideales, tanto
nutricionales como físicas, para que alcance un desarrollo óptimo y se pueda establecer
entonces, la multiplicación clonal (Artola, 2002; CIAT, 1991; Dixon, 1991; George y
Sherrington, 1984; Hartmann y Kester, 1987).
La aplicación de las técnicas de cultivo in vitro para la propagación de germoplasma, parte
de la necesidad de introducción de materiales a condiciones asépticas, y luego de la
multiplicación de este material dentro del laboratorio, que termina el ciclo con la
aclimatización a condiciones nuevamente in vivo. Para garantizar la sobrevivencia del
material proveniente de laboratorio, es necesario practicar ciertos cuidados en la etapa de
acondicionamiento a condiciones de invernadero o in vivo, además, esta etapa del cultivo
de tejidos requiere de un tiempo considerable de adaptación a las nuevas condiciones
ambientales.
La tecnología de la semilla sintética, consiste básicamente en el encapsulado de un explante
para su propagación, nace como respuesta a la urgencia de establecer métodos que reduzcan
costos y tiempo en la etapa de aclimatización a condiciones in vivo de los materiales
provenientes de laboratorio. La semilla sintética combina por un lado las ventajas de la
reproducción asexual tales como: multiplicación de poblaciones idénticas y crecimiento
acelerado, con las ventajas de la reproducción sexual o por semilla: fácil manipulación,
capacidad de almacenaje, protección del explante, entre otras (Navarro, 2002).
Por otra parte, está tecnología es utilizada también para la conservación a largo plazo o
crioconservación de células y tejidos vegetales, debido a que facilita la manipulación y
aumenta la protección del sistema biológico. La crioconservación consiste en la
preservación
de
cualquier
material
vivo
a
temperaturas
ultrabajas,
realizado
11
Marco teórico
preferentemente en nitrógeno líquido (-196 ºC). Esta es la única forma conocida de
conservación a largo plazo para ciertas especies de plantas que no producen semillas, o
cuyas semillas no pueden ser almacenadas en bancos por presentar un comportamiento
recalcitrantes o de aquellos materiales que usualmente se propagan vegetativamente
(Abdelnour, 2001). Como procedimiento posee numerosas ventajas tales como: estabilidad
genética del material, implementación de un método seguro de almacenamiento en espacios
reducidos, a bajos costos y con poca peligrosidad.
Las semillas naturales tienen, en su mayoría, un contenido de humedad bajo, un
metabolismo a nivel reducido y no presentan actividad aparente de crecimiento sino hasta
la germinación. La semilla sintética mantiene muchas de estas características, pero adquiere
otras nuevas gracias a su naturaleza de propagación vegetativa (Hartmann y Kester, 1987).
Inicialmente los investigadores utilizaron el concepto de semilla sintética desde un punto de
vista estricto, definiendo a esta aplicación, como la ingeniería de los embriones somáticos,
donde es utilizado el encapsulamiento como forma de propagación. No obstante, en la
actualidad esta definición ha sido revolucionada debido a la posibilidad del encapsulado de
otros tejidos con capacidad meristemática (Artola, 2002; Muniswamy et al, 2000).
La tecnología de la semilla sintética (TSS) se define como el revestimiento de cualquier
material vegetal meristemático tal como: embriones somáticos, meristemas, brotes o
microestacas. El revestimiento debe constar de dos partes: una lámina externa la cual
fortalece y protege la semilla y una solución interna con nutrientes requeridos por el
explante para su desarrollo (endospermo artificial). Por lo general esta solución interna
contiene reguladores del crecimiento, pero también pueden ser incorporados otros
componentes como: funguicidas, antibióticos y microorganismos (Gray y Purohit, 1991;
Redenbaugh, 1990; Rodríguez, 2000).
Diversos investigadores plantean que para controlar el crecimiento y facilitar la
germinación del embrión somático, el endosperma sintético puede simular a un endosperma
12
Marco teórico
de origen sexual, conteniendo uno o varios compuestos como: nutrientes, reguladores del
crecimiento,
agentes
protectores
contra
patógenos,
herbicidas,
biocontroladores,
biofertilizantes, entre otros con el fin de asegurar la conversión a planta y el desarrollo en
campo (Castillo et al., 1998; Kumar et al., 2004; Malabadi y Van Staden, 2005). Por otro
lado, la composición de la matriz protectora debe permitir el crecimiento de los embriones
encapsulados otorgando una resistencia mecánica acorde a la energía disponible del
embrión, ya que un endospermo excesivamente duro ocasiona una pérdida de energía y un
crecimiento débil o nulo de los embriones somáticos encapsulados (Jiménez y Quiala,
1998; González et al., 2004). Se señala en la literatura la utilización de diversas sustancias
(agar, gelrite, gomas) para encapsular embriones somáticos, siendo la manipulación de la
concentración de alginato de sodio y los tiempos de exposición al agente gelificante, el
cloruro de calcio, los que reportan mejores resultados de germinación y conversión a planta
en ciertos tipo de especies (Patel et al., 2000; Maruyama et al., 2003; Utomo et al., 2008).
Es por ello que el estudio de la composición del endosperma sintético, variando el
contenido de alginato de sodio y/o regulando el tiempo de exposición al agente
acomplejante, permitirá generar una matriz sintética que garantice la normal germinación
de los embriones encapsulados y/o la recuperación de un tejido después de someterlo a un
proceso de estrés como la crioconservación.
Por las razones anteriormente citadas, la evaluación de la composición de la cubierta en lo
referente a la determinación del ión calcio, el cual se vincula directamente a la consistencia
de la estructura que adquieren las cápsulas sintéticas, es de gran importancia en término de
propagación y de conservación de germoplasma.
4.2 Encapsulamiento
Los materiales usados para el encapsulamiento deben de cumplir con la función de
protección física del material vegetal y además deben permitir la disponibilidad de
nutrientes, antibióticos, funguicidas y microorganismos. Redenbaugh y colaboradores a
comienzos de los ochentas, y después de diversos estudios con compuestos prominentes,
13
Marco teórico
determinaron que los hidrogeles de alginato de calcio, llegaban a poseer las mejores
características (Artola, 2002; Nieves, 2000; Rodríguez, 2000).
El encapsulamiento con base en este compuesto químico, suministra una protección
adecuada para el tejido vegetal, gracias a que posee una dureza idónea. La información que
estos estudios generaron sentó las bases para la búsqueda de nuevas alternativas que hacen
el concepto de "semilla somática " cada vez más cercano (Artola, 2002).
Generalmente la técnica de formación de semillas sintéticas, permite además de servir
como una cubierta protectora, servir como una membrana semipermeable, para que en ella
pueda existir un intercambio osmótico necesario durante la crioconservación de los tejidos
encapsulados.
4.3 Alginatos
Son polisacáridos extraídos de algas marinas pardas (macromoléculas naturales). Los
polisacáridos más importantes extraídos de las algas son: alginatos, agar, laminarina,
fucoidina, galactanos y carragenina que tienen diferentes usos, pero entre estos
polisacáridos destacan los alginatos y el agar por sus múltiples aplicaciones prácticas e
industriales.
Los alginatos de mayor uso comercial son en forma de sales hidrosolubles, libres de
celulosa, blanqueadas y purificadas: alginato de sodio, alginato de potasio, alginato de
amonio y su éster de propilenglicol. También se producen compuestos combinados como
alginato de amonio- calcio, alginato sodio-calcio.
Entre estos compuestos, principalmente el ácido algínico y sus sales de sodio, calcio y
potasio, se comercializan en tres calidades diferentes debido a los procesos de purificación
y blanqueado durante su producción.
14
Marco teórico
Estas calidades son:
Calidad alimentaria. Productos completamente libres de celulosa, de coloración blanca o
ligeramente amarilla.
Calidad farmacéutica. Productos blancos, libres de celulosa.
Calidad técnica. Productos que pueden contener cierta proporción de celulosa, de color
que varía desde el blanco a amarillo marrón.
Estos son empleados en la industria textil, pinturas, papeles, maderas aglomeradas, etc.
Los alginatos son uno de los polímeros más utilizados en la microencapsulación. Ellos son
extraídos primariamente de tres especies de algas marrones. Los alginatos son una familia
de polisacáridos lineales no ramificados, conteniendo cantidades variables de ácido (1,4) βD-mannurónico y de ácido α-L-glucorónico.
La composición y extensión de las secuencias y el peso molecular determinan las
propiedades físicas de los alginatos. Posee la propiedad única de formar un gel en presencia
de acciones divalentes, como el calcio (Oliveira, 2003).
4.4 Estructura química de los alginatos
Los alginatos son sales del ácido algínico. El ácido algínico es un polisacárido complejo
(biopolímero) que se obtiene de las algas pardas especialmente de las divisiones
Phaeophyceae (feofitas) y Rhodophyceae (rodofitas) por reacción alcalina y está compuesto
por el ácido mannurónico y el ácido glucorónico con enlaces β-1,4.
Los alginatos están constituídos por dos unidades monoméricas, el ácidoβ-D-mannurónico
(M) y el ácido unidas por enlaces glucosídicos β (1-4) y secuencias GG, GM, unidas por
enlaces glucosídicos α(1-4).Las proporciones relativas de este tipo de secuencias o bloques
varían con la fuente botánica, con el grado de madurez del alga y con el hábitat del alga.
15
Marco teórico
La cadena polimérica constituyente del ácido algínico y sus sales se componen de tres tipos
de bloques. Los bloques G que contienen sólo unidades derivadas del ácido L-glucorónico,
los bloques M los cuales se componen de ácido D-mannurónico y las regiones MG
compuestas de unidades alternadas de ambos ácidos.
Como se ha mencionado las propiedades de los geles de alginato difieren de acuerdo a la
relación del ácido mannurónico (M) y el ácido glucorónico (G). Si el ácido (M) está en
mayor proporción, el gel es suave, elástico, fuerte pero quebradizo. Esta relación varía en
las distintas especies de algas, tal como el alginato obtenido de por el tipo Laminaria
hyperborea con un alto porcentaje de segmentos GG o ácido glucorónico, que forma geles
rígidos, con baja capacidad de retención de agua y tendencia a la sinéresis. No así con el
alginato obtenido del alga Macrocystis pyrifera con un alto porcentaje de segmentos MM o
ácido mannurónico, el cual forma geles elásticos y tiene una gran capacidad de retención de
agua y baja deformación.
Tabla 1. Porcentaje de ácido mannurónico (M), glucorónico (G), relación M/G y contenido de alginato
(%), para varias especies comerciales de algas pardas.
Especie
Laminaria hyperborea
Laminaria digitata
Macrocystis pyrifera
Ascophyllium nodosum
Lessonia nigrescens
Ecklonia máxima
M
(%)
30
55
60
65
60
55
G
(%)
70
45
40
35
40
45
M:G
0.45
1.20
1.50
1.85
1.50
1.20
Contenido de alginato
(% sobre algas secas)
25-27
20-26
26
26-28
35
40
16
Marco teórico
4.5 Propiedades fisicoquímicas de los alginatos
Estas propiedades están referidas al ácido algínico y a sus sales (Oliveira, 2003).
Estabilidad:
Alginatos sólidos: La estabilidad de los productos algínicos comerciales (ácido algínico y
sus sales) dependen de su grado de polimerización es decir de la cantidad de unidades
monoméricas de ácidos urónicos en la cadena polimérica.
El grado de polimerización de los alginatos tiene una relación directa con su peso molecular
y la viscosidad de sus soluciones. Los alginatos que comercialmente se producen
(primordialmente el alginato de sodio) son de alta, media y baja viscosidad (referida a la
viscosidad de sus soluciones acuosa sal 1%).Generalmente los de alto grado de
polimerización son menos estables y los de menor grado de polimerización son más
estables.
Los alginatos con mayor grado de polimerización con largas cadenas de ácidos urónicos
pueden degradarse a unidades menores (despolimerizarse) en pocos meses a la temperatura
del medio ambiente. Es por ello que todos los compuestos derivados del ácido algínico
deben almacenarse a la temperatura de 25°C y humedad entre 10-13% a fin de evitar la
despolimerización. El proceso de despolimerización afecta las propiedades comercialmente
útiles como la viscosidad y la fuerza de los geles.
Soluciones de alginato: Las sales del ácido algínico que son solubles en agua son las de
los metales como Na+, K+, Mg+2, Fe+2; iones monovalentes como el amonio, también la de
las aminas y bases orgánicas y su éster de propilenglicol.
Las sales del ácido algínico formadas por metales como el Ca, Al, Zn, Cu, Cr, Fe+3 son
insolubles en agua así también el ácido algínico. Las soluciones neutras de alginatos de baja
a media viscosidad es decir de bajo a medio grado de polimerización o de bajo a medio
17
Marco teórico
peso molecular se pueden mantener a 25°C por varios años, sin sufrir pérdida de viscosidad
apreciable y muy bajo ataque microbiano. Las soluciones de alginato con alto grado de
polimerización son inestables aún a temperatura del medio ambiente y a medida que se
incrementa la temperatura el proceso de despolimerización se acelera.
Las soluciones de alginato pueden reaccionar con cationes divalentes formando geles
insolubles. En presencia de álcalis fuertes las cadenas de polisacáridos se rompen y en
presencia de ácidos fuertes se precipita el ácido algínico.
La solubilidad de los alginatos en agua depende del tamaño de partícula, partículas
pequeñas se hidratarán con mayor rapidez pero podrían aglomerarse. Partículas grandes
suelen ser más fáciles de dispersar y suspender pero tienen una baja velocidad de
hidratación. La solubilidad del alginato en agua también depende de la naturaleza física de
las soluciones.
Cuando en el agua que se usa para disolver el alginato se encuentran presentes compuestos
que compiten con las moléculas de alginato por el agua, entonces el proceso de disolver el
alginato será muy difícil. Así por ejemplo la presencia de proteínas, almidón, azúcares en el
agua reducirá la hidratación del alginato.
Las sales de cationes monovalentes como el NaCl ejercen el mismo efecto a
concentraciones cercanas a 0.5%, así que es mejor solubilizar todo el alginato y después
añadir estos compuestos.
También cuando hay pequeñas cantidades de iones polivalentes se inhibe la hidratación de
los alginatos y si estos se encuentran en grandes cantidades se precipitan. Cuando se quiere
disolver alginato de sodio en agua esta no tiene que ser dura pues se formaría el alginato de
calcio insoluble en agua.
18
Marco teórico
En los procesos de disolución de polímeros como el alginato de sodio se observan las
siguientes etapas:
1). Difusión de las moléculas del disolvente hacia la parte interna del polímero que se
encuentra en estado sólido.
2). Separación del polímero por acción de moléculas del disolvente mediante la formación
de la capa de solvatación, lo que da lugar al hinchamiento del polímero. En el caso de
polímeros lineales el fenómeno de hinchamiento puede ser ilimitado es decir que el
polímero pasa hacia el disolvente junto con su capa de solvatación (La entropía total
aumenta y las moléculas son muy flexibles).
3). Si el polímero está formado por estructuras espaciales que forman mallas tal como los
alginatos, el grado de hinchamiento es limitado. En este caso la entropía del disolvente
disminuye debido al ordenamiento de las moléculas del disolvente alrededor de las
moléculas del polímero. Es necesario señalar que cuando las moléculas del polímero se
hinchan la presión aumenta considerablemente debido a la absorción de moléculas de bajo
peso molecular.
4.6 Propiedades mecánico- estructurales de los alginatos
Las propiedades mecánico-estructurales de los alginatos son variables y se describen a
continuación (Oliveira, 2003).
Viscosidad: Como se ha descrito anteriormente la viscosidad es una propiedad
fundamental de las soluciones de alginato así como también su reactividad frente al calcio y
esta propiedad es la que permite que estos compuestos sean usados como espesantes,
estabilizantes, gelificantes, etc.
19
Marco teórico
En las soluciones de alginato, de concentración usada en la mayoría de las aplicaciones, la
viscosidad disminuye con la agitación o bombeo y es reversible de acuerdo al grado de
agitación. Esta propiedad es llamada tixotropía y es propia de las soluciones de polímeros
(la tixotropía es la transición de gel a solución y viceversa).
La viscosidad de los alginatos es variable debido a factores físicos y químicos tales como:
Peso molecular: A mayor grado de polimerización del alginato, mayor será su peso
molecular y la viscosidad de sus soluciones.
Industrialmente se pueden variar las condiciones de extracción y manufactura de los
alginatos a fin de obtenerlos según las condiciones requeridas (grado de polimerización
deseado). Se comercializan productos con grado de polimerización entre 100 y 1000
unidades cuyas viscosidades están en el rango de 10-1000 mPas (solución al 1%).
Concentración: Se comercializan los alginatos en diferentes grados de viscosidad (alta,
media, baja) y esta puede controlarse variando las concentraciones empleadas dentro de un
rango reducido.
Temperatura: A medida que la temperatura aumenta, la viscosidad de las soluciones de
alginato disminuye, este decrecimiento es aproximadamente del 2.5% por grado de
temperatura. Este proceso es reversible y la solución recupera su viscosidad inicial por
enfriamiento. Por otro lado si se mantiene una temperatura elevada (50°C) durante periodos
extensos, la viscosidad disminuye irreversiblemente esto debido a un proceso de des
polimerización.
Es por ello que es muy importante conservar los productos algínicos en condiciones
adecuadas durante el almacenamiento.
20
Marco teórico
pH: La viscosidad de las soluciones de alginato de sodio presenta un valor mayor cerca de
la neutralidad (pH 6-8) debido a que la molécula está extendida por los efectos repulsivos
de los grupos carboxílicos cargados negativamente (COO-). Este rango es óptimo para la
disolución. Por debajo del pH 4-5 la viscosidad tiende a incrementarse por la disminución
de la solubilidad del ácido algínico libre que precipita en forma de gel a un pH en el rango
de 3-3.5.En la industria alimentaria conviene emplear algina con intervalo de pH 4-10.
Fuerza iónica: Al adicionar sales de cationes monovalentes a las soluciones de alginato de
sodio, la viscosidad de éstas decrece. El polímero en solución tiende a contraerse al
aumentar la fuerza iónica de la solución; este efecto se hace máximo a concentraciones
salinas cercanas a 0.1N. Por el contrario, al agregar iones de metales polivalentes a las
soluciones de alginato sodio, como es el caso del ión Ca++, la viscosidad se incrementa al
aumentar la concentración de estos.
4.7 Geles de alginato
Las soluciones de alginato a concentraciones bajas como 0.25% a 0.5% se utilizan para
estabilizar emulsiones, espumas, suspensiones, etc., mientras que las soluciones con mayor
concentración de alginato y en presencia de ciertos cationes (principalmente el calcio)
forman geles de tipo químico, no reversibles al calentarlos, de gran tensión superficial y de
dureza variable según los pesos moleculares de los polisacáridos componentes.
Las soluciones de alginato también forman geles en medio ácidos y condiciones
controladas; mayormente esos son más débiles que los geles de calcio por lo que dan una
sensación de fusión en la boca y tienen muchas aplicaciones en la industria alimentaria.
Estos geles se forman al protonarse un número creciente de grupos carboxílicos en la
cadena del polímero debido a que el pH desciende, esto reduce la repulsión eléctrica entre
las cadenas del polímero y se generan enlaces tipo puente de hidrógeno.
21
Marco teórico
4.8 Mecanismo de formación de los geles de alginato de calcio
Si a una solución de alginato de sodio de concentración definida se le añade una solución
de un metal divalente como el calcio a alta concentración se forma un gel insoluble de
alginato de calcio y por consiguiente, queda constituida una matriz sintética.
Se ha mencionado que las sales del ácido algínico están formadas por tres bloques: bloques
M, bloques G y bloques MG.
Cuando dos cadenas de bloque G se alinean, se forma sitios de coordinación debido a la
forma de bucles de estas cadenas, las cavidades permanecen entre ellas y éstos tienen el
tamaño adecuado para acomodar al ión Ca++ y además están revestidos con grupos
carboxílicos y otros átomos de oxígenos electronegativos los cuales son ligandos favorables
y permiten un alto grado de coordinación de los iones calcio. Por esta razón este modelo es
llamado el modelo de la caja de huevos (Figura 1).
COOH
HO
OX
COOH
HO
O
O
HO
-
2+
-
Ca
-
O OC
O
COO
OX
-
O
O
-
2+
-
O
Ca
O
O
Ca
-
2+
O
-
O
2+
-
OX
-
O
-
-
O
O
COO
O
HO
2+
O
Ca
Ca
2+
-
O OC
O
O
O
-
Ca
-
O
Ca
-
2+
O
O OC
-
O OC
O
O
O
O
O
-
-
O
COO
HO
HO
Ca
2+
O
COO
OX
-
OX
Ca
-
O
2+
-
-
COO
-
O
O OC
-
O
-
O OC
O
O
COOH
-
O OC
O
COO
-
2+
-
-
-
HO
O
O
COO
COOH
HO
O
O
-
HO
O
COOH
-
-
O OC
O OC
COO
HO
O
O
-
Ca
O
-
COO
O
OX
-
O OC
COOH
HO
O
O
-
COO
O
O OC
HO
COO
O
-
COOH
HO
O
O
O
-
O
Ca
2+
-
O OC
-
O
COO
HO
HO
-
OX
-
OX
O
COOH
HO
Figura 1. Modelo de caja de huevos propuesta por Grant.
Este modelo fue propuesto por Grant (1973) para dar explicación a las propiedades
gelificantes de los alginatos al reaccionar con sales cálcicas. Tal es el caso del alginato de
sodio en solución, al reaccionar con el ión Ca++. Se produce un intercambio iónico y la
22
Marco teórico
correspondiente formación de la unidad dimérica entre los iones Ca++ y las cadenas del
polímero en forma de bucles (regiones de bloque GG), estas cadenas ricas en ácidos
glucorónicos generan distancias entre los grupos carboxílicos e hidroxílicos y permiten un
alto grado de coordinación con los iones calcio formándose la estructura de la caja de
huevos, es decir, cambia la estructura original del gel (Figura 2).
Figura 2. Representación esquemática de la asociación de las secuencias poliglucorónicas por quelación
por calcio.
Se puede aseverar que hay enlaces Ca++ con las secuencias poliglucorónicas por los
cambios de dicroísmo circular que son vistos. Un cambio más pequeño se observa en las
secuencias alternadas y ningún efecto en los bloques polimannurónicos.
El cambio ocurre en las regiones de transición n→π del espectro del grupo carboxílico
conforme los orbitales n en las secuencias poliglucorónicas son comprometidos
específicamente en la quelación de los iones Ca++. El modelo de la caja de huevos provee
una base convincente para la explicación de estos cambios porque sitúa al ión en la
posición correcta para la coordinación con los orbitales n carboxílicos y en la misma región
23
Marco teórico
de simetría espacial que el O-4 y O-5 que normalmente determinan la señal de la banda
n→π.
4.9 Método de liberación
Los mecanismos de liberación de las cápsulas se pueden llevar a cabo por una disolución
normal en agua, por esfuerzos de cizalla, por temperatura, por reacciones químicas y
enzimáticas o por cambios en la presión osmótica. La liberación de componentes de una
cápsula puede ser controlada por difusión de la pared de la cápsula o por una membrana
que cubre la pared. La permeabilidad a través de la matriz y la solubilidad del componente
de la pared de la cápsula influyen en la velocidad de difusión.
El compuesto que va a difundir debe ser soluble en la matriz; aunque la presión de vapor de
sustancias volátiles en cada lado de la matriz puede ser la fuerza que determine la difusión.
La selección de una matriz o membrana es importante; la naturaleza química, morfología y
temperatura de transición, el grado de hinchamiento y de entrecruzamiento también
influyen en la difusión de la membrana aunque pueden disminuir la velocidad de
liberación.
El gel de alginato cálcico formado es permeable a moléculas solubles en agua, cuyos pesos
moleculares sean menores a 5000 Dalton. Moléculas mayores también pueden difundir a
través del gel, pero si el peso molecular excede los 10.000 Dalton, la difusión no ocurre. La
excepción a esto, la constituyen los lípidos, que permanecen en la matriz aun cuando sean
de peso molecular bajo.
Es esencial que las cápsulas constituyan una matriz semipermeable que favorezcan los
fenómenos de transporte hacia ambas direcciones (hacia dentro y fuera de la cápsula),
cuando se está considerando que está cubierta sintética protegerá a un material a
crioconservar. En la técnica criogénica de encapsulación/deshidratación, es necesario por
ejemplo realizar una fase de precultivo en medios que contienen concentraciones elevadas
24
Marco teórico
de sacarosa, ya que es importante que esta azúcar penetre y a su vez, remueva alguna
fracción del agua congelable presente. De esta forma, las células y los tejidos se volverán
más tolerantes a las condiciones de estrés generadas por la deshidratación y la congelación.
Esta inducción de resistencia es necesaria lograrla tanto en tejidos encapsulados como no
encapsulados, debido a que en la naturaleza, pocas especies son resistentes al frío y sobre
todo, aquellas que son originarias de climas tropicales, que presentarán por tanto una mayor
sensibilidad.
La inhibición de cristales de hielo en el medio intracelular por medio de la vitrificación, que
es el evento térmico producido por el paso directo de la fase líquida a sólido amorfo (Fahy,
1984), se propicia en presencia de altas concentraciones de sacarosa aun cuando el sistema
biológico puede encontrarse a temperatura ambiente. En materiales desecados como las
semillas biológicas, el estado vítreo actúa principalmente como un estabilizador físico y
asociado a la protección contra las reacciones de deterioro. La ocurrencia de la vitrificación
de los solutos internos y del medio intracelular durante un proceso de congelación evita los
daños provocados por la formación de los cristales de hielo que afectan a los componentes
de la membrana y producen la lisis celular, pero para que ocurra la vitrificación completa,
es necesario igualmente propiciar la ocurrencia de la transición vítrea en el medio o agente
crioprotector. Existen numerosas prácticas de tratamientos con sacarosa según el protocolo
de crioconservación a considerar, pero en todos los casos el precultivo con sacarosa resulta
en una reducción lenta del contenido de humedad (Uragami 1991, Engelmann y Duval
1986) debido a su efecto osmótico y la absorción de sacarosa, reduce a su vez el punto de
congelación y la cantidad de agua a congelar. Estudios histocitológicos realizados con
banano revelan la acumulación o la síntesis de almidón dentro del citoplasma después del
precultivo con esta azúcar (Panis et al. 1996). Los azúcares también mantienen el estado
cristalino líquido de las capas dobles de membranas y estabilizan las proteínas bajo
condiciones de congelación (Kendall et al. 1993).
25
Marco teórico
4.10
Método analítico para la determinación de elementos metálicos o
metaloides
Una de las técnicas analíticas que, debido a su gran sensibilidad, permite hacer un análisis
de metales contenidos en una muestra es la espectroscopia de absorción atómica (EAA. Es
una técnica muy específica debido a que los átomos absorben radiación en un intervalo muy
estrecho de longitudes de onda características; de esta manera se evita la interferencia de
otros elementos.
Por más de cincuenta años esta técnica ha tenido una gran aplicación en el análisis
elemental llegándose a cuantificar alrededor de 60 elementos metálicos y metaloides, con
distinto grado de éxito.
4.11 Espectroscopia de absorción atómica en flama
La espectroscopia de absorción atómica (EAA) en flama, tiene como fundamento la
absorción de radiación de una longitud de onda determinada. Esta radiación es absorbida
selectivamente por átomos que tengan niveles energéticos cuya diferencia en energía
corresponda en valor a la energía de los fotones incidentes. La cantidad de fotones
absorbidos, está determinada por la ley de Beer, que relaciona ésta pérdida de poder
radiante, con la concentración de la especie absorbente y con el espesor de la celda o
recipiente que contiene los átomos absorbedores.
Los componentes instrumentales de un equipo de espectrofotometría de absorción atómica
son los similares a los de un fotómetro o espectrofotómetro de flama, excepto que en EAA
se requiere de una fuente de radiación necesaria para excitar los átomos del analito (Figura
3).
26
Marco teórico
Figura 3. Componentes de equipo de espectrofotómetro de absorción atómica
La funcion de los componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica son muy
especificas para cada funcion, descritas a continuacion:

Una fuente de radiación que emita una línea específica correspondiente a la
necesaria para efectuar una transición en los átomos del elemento analizado.

Un nebulizador, que por aspiración de la muestra líquida, forme pequeñas gotas
para una atomización más eficiente.

Un quemador, en el cual por efecto de la temperatura alcanzada en la combustión y
por la reacción de combustión misma, se favorezca la formación de átomos a partir
de los componentes en solución.

Un sistema óptico que separe la radiación de longitud de onda de interés, de todas
las demás radiaciones que entran a dicho sistema.

Un detector o transductor, que sea capaz de transformar, en relación proporcional,
las señales de intensidad de radiación electromagnética, en señales eléctricas o de
intensidad de corriente.
27
Marco teórico

Una amplificador o sistema electrónico, que como su nombre lo indica amplifica la
señal eléctrica producida, para que en el siguiente paso pueda ser procesada con
circuitos y sistemas electrónicos comunes.

Por último, se requiere de un sistema de lectura en el cual la señal de intensidad de
corriente, sea convertida a una señal que el operario pueda interpretar (ejemplo:
transmitancia o absorbancia). Este sistema de lectura, puede ser una escala de aguja,
una escala de dígitos, un graficador, una serie de datos que pueden ser procesados a
su vez por una computadora, etc.
La EAA en flama es a la fecha la técnica más ampliamente utilizada (aunque cada vez más
competida por la Espectrofotometria de Emision de Plasma) para determinar elementos
metálicos y metaloides. Esta técnica tienen grandes convenientes y es de costo
relativamente bajo, pudiéndose aplicar tal técnica a una gran variedad de muestras.
Acoplado un instrumento de absorción atómica a un horno de Grafito y a un generador de
hidruros se alcanzan límites de detección hasta de ppb, lo cual lo hace indispensable en
áreas como son: estudios de contaminación ambiental, análisis de alimentos, análisis de
aguas potables y residuales, diagnóstico clínico, etc.
28
V. MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y métodos
5.1 Preparación de soluciones para la encapsulación
El presente trabajo de investigacion se realizo en el Ladiser de Biotecnologia y
Criobiologia de la Facultad de Ciencias Quimicas perteneciente a la Universidad
Veracruzana y en el laboratorio de Quimica Organica y Biotecnologia.
5.1.1 Alginato de sodio
Para estudiar el proceso de encapsulación se preparó inicialmente una solución de medio de
cultivo conteniendo las sales minerales propuestas por Murashige-Skoog (Anexo 1), pero
libre de calcio, la cual se suplementó con alginato de sodio al 3% (SIGMA, baja
viscosidad). Para disolver el alginato sódico, la solución de medio de cultivo se preparó a
temperatura ambiente y se añadió cuidadosamente el alginato bajo agitación constante,
cuidando todo el tiempo de que no llegara a formar demasiados grumos. Con la ayuda de
un agitador de vidrio se retiraron los grumos que se forman al disolver el alginato de sodio,
una vez obtenida una solución homogénea y transparente, se ajustó el pH a 5.7 y se
esterilizó en una autoclave vertical (EVAR) a 121° C durante 15min.
5.1.2 Cloruro de calcio
La solución de cloruro de calcio necesaria para cumplir con el proceso de encapsulación,
fue utilizada en una única concentración (0.1M) en el desarrollo de esta investigación, al
igual que el alginato, se le adicionaron sales minerales y con ayuda de un agitador
magnético se disolvió el calcio, una vez obtenida una solución homogénea y transparente,
se ajustó el pH a 5.7 y se esterilizó en una autoclave vertical (EVAR) a 121°C durante
15min.
30
Materiales y métodos
5.2 Obtención y estandarización de las cápsulas de alginato de calcio por
peso
Para estandarizar el proceso de formación de las cápsulas se ocupó para todos los
experimentos una misma pipeta automática de capacidad de 1000L con una punta que se
cortó en el extremo a un diámetro de 4mm.
La obtención de las cápsulas se llevó a cabo goteando el alginato de sodio sobre la solución
de cloruro de calcio (ambas soluciones preparadas con anterioridad como se describió
previamente), y se produjeron 6 cápsulas por cada 10mL de solución de calcio. Para
homogenizar el tamaño, se elaboraron lotes de aproximadamente 210, de las cuales se
seleccionaron cuidadosamente aproximadamente 200 con tamaños y pesos muy similares.
Para la estandarización del proceso de encapsulación, se utilizó una balanza analítica digital
(Denver Instrument) con la cual se registraron los pesos individuales de las cápsulas.
Siguiendo el procedimiento de estandarización descrito, se obtuvieron cápsulas a seis
tiempos de gelificación diferentes (10, 20, 30, 60, 180 y 1440min), ajustando la
permanencia de las gotas de alginato, en los volúmenes de solución de cloruro de calcio
pre-establecidos (10mL).
Una vez realizada la selección de las muestras a cada tiempo de gelificación y acorde a sus
respectivos pesos frescos (Pfr), las cápsulas se pasaron a una estufa regulada a 90°C por 24
horas y transcurrido este tiempo, se pesaron nuevamente para obtener el valor de peso seco
(Ps) de las mismas.
31
Materiales y métodos
5.3 Tratamientos
de
las
cápsulas
en
medio
líquido
con
altas
concentraciones de sacarosa
Se obtuvieron cápsulas de alginato de calcio a los seis tiempos de gelificación en estudio
(10, 20 y 30, 60, 180 y 1440min), estandarizadas convenientemente por peso acorde a la
metodología descrita en el apartado anterior.
Los lotes con un total de 200 cápsulas por cada tiempo de gelificación, se colocaron en
frascos con 50mL de solución de sacarosa a las concentraciones de 0.06, 0.5, 0.75 ó 1M
preparadas en el medio base de Murashigue-Skoog. Los frascos con las muestras
permanecieron durante 24 horas en precultivo y transcurrido este tiempo, las cápsulas se
secaron superficialmente utilizando papel filtro y se pesaron (Pprec), considerando este valor
representativo del proceso de transferencia de masas durante los tratamientos en sacarosa.
Seguidamente las muestras de cápsulas se transfirieron a una estufa regulada a 90°C
durante 24 horas.
5.4 Preparación de las muestras de cápsulas de alginato de calcio para el
análisis de absorción atómica
Las muestras de cápsulas secas obtenidas a los diferentes tiempos de gelificación (con o sin
tratamiento en sacarosa), se colocaron en matraces micro-Kjeldhal en los cuales se
colocaron pesos similares para cada muestra y se adicionaron 10mL de HNO3 concentrado.
Los matraces se transfirieron al digestor con una temperatura de 120°C en donde
permanecieron el tiempo necesario hasta obtener muestras totalmente digestadas, es decir,
cuando la solución contenida en cada matraz se tornó totalmente transparente. Al finalizar
el proceso de digestión de cada muestra, se prosiguió a aforar cada una de ellas con agua
desionizada, iniciando con un volumen de 25mL y teniendo especial cuidado al ajustar el
volumen, ya que si se presentan errores durante este paso, los resultados obtenidos también
presentaran variación por la alta sensibilidad del equipo de EAA.
32
Materiales y métodos
El aforo inicial de 25mL, solamente se aplicó a la primera muestra, ya que el equipo por si
sólo, condicionará el volumen que deben cubrir las muestras que serán analizadas
posteriormente.
5.5 Determinación de calcio por espectrofotometría por absorción
atómica (EAA)
Para un correcto funcionamiento del equipo de analisis son necesarias tener encuenta las
especificaciones técnicas, al igual que las recomendaciones ya preestablecidas (Anexo 2) en
el LADISER de Quimica Orgánica, ubicado en la Facultad de Ciencias Químicas de
Orizaba, .
Análisis de absorción atómica en el equipo GBC 932 AA
Las determinaciones de calcio en cápsulas de alginato por la técnica analítica de absorción
atómica se realizaron acorde al protocolo establecido en el LADISER de Orgánica y
Biotecnología, ubicado en la Facultad de Ciencias Químicas de Orizaba (Oliver, 2008).
Para la calibración del equipo se construyó una curva tomando como base un estandar de
cobre a una concentración establecida, a partir de la cual se realizaron nuevas diluciones a
varias concentraciones. Las soluciones preparadas se ingresaron en el equipo para
determinar los valores de absorbancia correspondientes a cada una y se graficaron contra la
concentración de cobre expresada en mg/L o ppm. La curva de calibración construida,
permitió, optimizar ademas de estandarizar el equipo y establecer posteriormente las
condiciones de trabajo pero ahora con el elemento a analizar, en este caso el Ca++, con el
que igualmente se elaboró una curva de calibración tal y como la elaborada con el cobre
para iniciar el análisis de las cápsulas de alginato según la variante experimental en estudio.
Para la verificación del estado de funcionamiento del equipo es necesaria la calibración
periódica esto para demostrar que no han cambiado las condiciones del instrumento en una
33
Materiales y métodos
forma significativa. La verificación debe realizarse cada
vez que se utilice el
espectrofotómetro.
Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que este responda
de igual manera a los patrones al igual que la muestra, aunque estas tengan una matriz
relativamente diferente. Si estas diferencias son relativamente grandes, puede llegar a
invalidar el proceso de calibración. Es necesario estar completamente seguro de que el
calibrado es válido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentración especifico para
cada muestra analizada (Anexo 3).
5.6 Cuantificación de calcio por espectrofotometría de absorción atómica
(EAA)
Para el analisis y cuantificación de Ca++ en las cápsulas de alginato fue necesario
estandarizar el equipo de EAA, verificando su funcionamiento elaborando curvas de
calibracion no solo del análito a cuanficar si no tambien del especificado en su manual de
funcionamiento (Cu) para su correcto funcionamiento (Márquez, 2009).
5.6.1 Elaboración de curva de calibración
Para llevar a cabo la estandarización del equipo de EAA, es necesario preparar una curva de
calibración, que se construye a partir de diferentes concentraciones de un elemento a
analizar en este caso el Ca++. El gráfico resultante tiende a ser lineal, mientras progrese
según la ley de Lambert Beer, pero si este no llegara a obtenerse, es necesario realizar una
calibración completa del equipo, con analitos especificados para cada equipo, en este caso
el equipo utilizado fue el modelo GBC 932 AA, el cual se calibra en su totalidad utilizando
una solución de cobre, especificadas en su manual de funcionamiento, y así poder lograr
obtener resultados confiables en el análisis de cualquier analito, que este pueda detectar.
Para la cuantificación de minerales es necesaria la preparación de soluciones a diferentes
34
Materiales y métodos
concentraciones (Anexo 4), con el hecho de construir una curva de calibración que cumpla
con una linealidad (r2 ≥0.98) y una reproducibilidad antes de analizar las muestras.
5.6.2 Condiciones de trabajo en el equipo de absorción atómica GBC 932
AA
Elaborada la curva de calibración se procedió a realizar las mediciones de la concentración
de calcio en las muestras de cápsulas acorde a las condiciones experimentales de este
estudio. Los resultados se expresaron en mg/g de muestra seca para todas las muestras
analizadas. Los resultados se obtuvieron multiplicando: la concentración obtenida en el
equipo (A) expresado en mg/L, por el volumen obtenido (B) expresado en litros, entre el
peso de la muestra (C) expresado en gramos.
  de Ca++=  AB 
C
35
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y discusión
6.1 Efecto del tiempo de gelificación en la concentración de calcio de
cápsulas de alginato
En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos respecto al contenido de calcio en
cápsulas de alginato formadas a diferentes tiempos de gelificación y analizadas por EAA.
Tabla 2. Efecto del tiempo de gelificación en la concentración de calcio en cápsulas de alginato.
Tiempo de gelificación
(min)
10
20
30
60
180
1440
Peso fresco Pfr
(g)
13.33
13.08
12.46
12.23
10.83
11.40
Peso Seco Ps
(g)
0.62
0.67
0.66
0.67
0.59
0.66
mg de Ca++/g de
muestra seca
146.84
186.20
204.56
214.16
218.15
219.92
Como se puede apreciar, se obtuvieron valores de concentración de calcio que oscilaron
desde de 146.84 mg de Ca++ a los 10 min de gelificación, hasta la concentracion máxima de
219 mg a los 1440 min. Esto nos indica que mientras más tiempo continúe en contacto la
gota de alginato de sodio con la solución de cloruro de calcio, se atraparán más los iones
Ca++ que contribuyen a la formación de la matriz sintética de la cápsula, hasta llegar a un
punto en la que se estabiliza el proceso de gelificación y se puede considerar que la
polimerización es completa. Este efecto se hace claro a partir de los 60 min, en el que el
contenido de calcio en las cápsulas permanece prácticamente invariable alrededor de 217
mg de Ca++/g de muestra seca (Figura 4).
37
Resultados y discusión
mg de Ca++/ g de muestra
250
200
150
100
50
0
10
20
30
60
180
1440
Tiempo de gelificación (min)
Figura 4 . Representación gráfica del contenido de Ca++ en cápsulas gelificadas por tiempos diferentes.
6.2 Efecto del tratamiento de precultivo en medio líquido suplementado
con sacarosa, en la concentración de calcio de cápsulas de alginato
obtenidas a diferentes tiempos de gelificación
Cuando las cápsulas de alginato de calcio se sometieron al precultivo en medio liquido con
altas concentraciones de sacarosa, se obtuvieron los resultados que se presentan
individualmente por tiempos de gelificación en la Tabla 3.
38
Resultados y discusión
Tabla 3. Efecto del precultivo en medio líquido con diferentes concentraciones de sacarosa (0.06, 0.5,
0.75 y 1M) , en el contenido de calcio en cápsulas de alginato a diferentes tiempos de gelificacion (10, 20,
30 y 60min). ND. No determinado.
Sacarosa (M)
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1
Peso fresco Pfr
(g)
13.33
18.70
19.17
19.18
19.62
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1
13.08
19.83
18.75
17.77
19.00
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1
12.46
16.55
15.16
14.53
13.22
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1
12.23
14.04
15.17
13.83
13.51
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1
10.83
12.78
13.03
13.22
13.50
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1
11.40
13.81
12.38
17.32
13.91
Cápsulas (10 min)
Peso fresco prec
(g)
17.66
18.72
18.15
18.58
Cápsulas (20 min)
17.60
18.59
17.63
19.58
Cápsulas (30 min)
15.55
14.69
15.09
14.23
Cápsulas (60 min)
13.34
15.29
15.12
15.99
Cápsulas (180 min)
12.93
14.08
15.07
15.76
Cápsulas ( 1440min)
14.35
13.17
18.49
16.36
Peso Seco Ps
(g)
0.62
1.00
2.80
4.17
5.17
mg de Ca++/g de
muestra
146.84
77.20
55.21
41.70
31.07
0.67
1.04
2.85
4.23
5.54
186.20
74.45
45.63
20.99
16.48
0.66
0.90
2.16
3.28
4.32
204.56
172.44
76.06
45.40
40.90
0.67
0.80
2.33
3.64
5.00
214.16
203.75
115.33
63.07
23.39
0.59
0.83
2.31
3.94
4.91
218.15
ND
142.41
69.85
65.93
0.66
0.97
4.56
4.84
5.14
219.92
ND
145.05
108.61
78.62
Al realizar el análisis en cápsulas precultivadas y obtenidas previamente a diferentes
tiempos de gelificación, se observa el efecto del tratamiento con sacarosa sobre el
39
Resultados y discusión
contenido de Ca++, comparado con las muestras no sometidas al precultivo (Tabla 3). Como
se aprecia, al ir incrementando el contenido de sacarosa en el medio de precultivo, el
contenido de Ca++ disminuye gradualmente. Si se toma como ejemplo las cápsulas
gelificadas por 10min sin y con precultivo, se observa que el contenido de calcio inicial se
reduce progresivamente desde 146.84 mg de Ca++/g de muestra seca hasta 77.20mg/g
después del tratamiento con 0.06M de sacarosa y continúa disminuye finalmente hasta
31.07 mg, después del precultivo con la concentración de 1M.
Esto puede estar relacionado con dos eventos:
En un inicio con el lavado del Ca++ superficial que de lo contrario, permanece en las
muestras que no se someten al precultivo, manteniéndose retenido sobre la cubierta
sintética de la matriz (Ca++ superficial). Esta misma dinámica ocurrió con el resto de las
cápsulas gelificadas a los diferentes tiempos en estudio. De esta forma, podemos
igualmente analizar que de un contenido inicial de calcio de 219 mg/g de muestra seca en
cápsulas obtenidas al mayor tiempo de gelificación y no precultivadas, disminuyó el
contenido hasta 78.62 mg después del precultivo en 1 M de sacarosa. Sin embargo, la razón
fundamental que incide en la disminución del calcio total en las muestras, parece estar
relacionado principalmente con el incremento progresivo experimentado en los sólidos
totales de las cápsulas después del tratamiento con sacarosa, asociado directamente, a la
penetración de este azúcar a las cápsulas.
La Figura 5 ilustra como ocurre ese incremento de sólidos en las cápsulas de alginato de
calcio, expresado por el valor de peso seco (Ps), al ir incrementándose la concentración de
sacarosa en el medio de precultivo. También se observa, como se reduce el contenido del
ión Ca++ en las cápsulas en la medida en que aumenta la penetración del azúcar al interior
de la matriz de alginato y consecuentemente, incrementa el contenido de sólidos totales
(Figura 6).
40
Resultados y discusión
Concentración de sacarosa (M)
Sin precultivo
6
0.06
0.5
0.75
1
5
Ps (g)
4
3
2
1
0
10
20
30
60
180
1440
Tiempo de gelificacón (min)
Figura 5. Efecto del tiempo de gelificación de las cápsulas de alginato y de la concentración de sacarosa
en el medio de precultivo sobre el peso seco (Ps).
Concentración de sacarosa (M)
250
Sin precultivo
0.06
0.5
0.75
1
mg de Ca++/g de muestra
200
150
100
50
0
10
20
30
60
180
1440
Tiempo de gelificación (min)
Figura 6. Efecto de la concentración de sacarosa en el medio de precultivo sobre el contenido de Ca ++ de
las cápsulas de alginato. ND: No determinado.
41
Resultados y discusión
Por consiguiente, las Figuras 5 y 6 constituyen una evidencia clara de cómo al
incrementarse el contenido de sólidos en las cápsulas por el efecto osmótico del precultivo,
la concentración de Ca++ disminuye directamente proporcional al aumento de la
concentración de sacarosa en el medio.
Por otro lado, la influencia del tiempo de gelificación se vio reflejada en que cápsulas más
gelificadas tuvieron un poro más pequeño y ofrecieron una mayor resistencia a la
penetración de la sacarosa a las mismas, por lo que el incremento de sólidos fue menor en
las muestras más rígidas, en comparación con las cápsulas menos gelificadas y por
consiguiente, el contenido inicial de calcio se mantuvo a niveles más elevados.
6.3 Valoración de la implementación de la técnica de absorción atómica
para la determinación de calcio en cápsulas de alginato
Los resultados obtenidos con el desarrollo de esta investigación demostraron la factibilidad
de utilizar la técnica de espectrometría de absorción atómica en la determinación de
elementos (metálicos u organometalicos) que forman parte de los compuestos utilizados
dentro de la práctica de un laboratorio de investigación, en este caso de Biotecnología y
Criobiología Vegetal, aportando información de utilidad sobre la composición de
materiales de encapsulación para la conservación de tejidos vegetales.
42
VII. CONCLUSIONES
Conclusiones
En la realización de esta investigación, se obtuvo información de corte básico, acerca del
proceso de gelificación, y las valoraciones del contenido de calcio en las cápsulas de
alginato, asociado a la metodología criogénica de encapsulación/deshidratación.
Hasta el momento no existían estudios previos relativos al proceso de gelificación y su
influencia en la concentración de calcio en las cápsulas de alginato.
Los resultados obtenidos permitieron comprobar:
 Que el método de análisis cuantitativo de EAA, es una herramienta instrumental
útil para determinar el contenido de calcio en cápsulas de alginato.
 Que a mayor tiempo de gelificación, mayor contenido de calcio en las cápsulas.
 Que el proceso de polimerización comienza a estabilizarse a partir de los 30 min de
retención de las gotas de alginato de sodio en la solución de cloruro de calcio y se
completa a los 60 min de gelificación.
 Que el tratamiento de precultivo en medio líquido produjo una reducción del
contenido de calcio en las cápsulas de alginato producto del lavado superficial de
las muestras.
 Que a mayor concentración de sacarosa en el medio de precultivo, menor contenido
de calcio en las cápsulas de alginato debido al incremento progresivo de los solutos
por la penetración de sacarosa al interior de la matriz sintética.
44
VIII. REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
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potential direct delivery system of mass produced somatic embryos in
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Cell Tiss. Organ Cult. 92:281-291.
49
IX. ANEXOS
Anexos
Anexo 1
Composición y preparación del medio Murashige y Skoog
51
Anexos
Anexo 2
Especificaciones técnicas del equipo de espectrofotometría de absorción
atómica (GBC 932 AA)
Equipo
Absorción atómica.
Modelo
932 AA
Software
GBC Avanta Ver. 1.32
Elemento
Calcio
Gases
Aire-acetileno-oxido nitroso.
Tipo de Flama
Oxidante
Temperatura Flama
Alcanza 3200° C.
Longitud de Onda
0 - 422.7 nm
4 - 285.2 nm
52
Anexos
Anexo 3
Calibración del equipo de EAA modelo GBC 932 AA
Objetivo
Que el alumno tenga la seguridad de que el equipo este funcionado correctamente antes
de iniciar el análisis.
Fundamento
Una verificación de calibración periódica es para demostrar de que no han cambiado las
condiciones del instrumento en una forma significativa. La verificación debe realizarse
cada vez que se utilice el espectrofotómetro.
Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que este responda
de igual manera a los patrones al igual que la muestra, aunque estas tengan una matriz
relativamente diferente. Si estas diferencias son relativamente grandes, puede llegar a
invalidar el proceso de calibración. Es necesario estar completamente seguro de que el
calibrado es valido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentración. Importancia
de la calibración.
El envejecimiento de los componentes, los cambios de temperatura y el estrés mecánico
que soporta los equipos deterioran lentamente sus funciones. Cuando esto sucede, los
ensayos y las medidas aumentar su intervalo de incertidumbre y se refleja tanto en el diseño
como en la calidad del producto final ya que durante el proceso de producción es
importante que cada parte sea realizada con calidad para obtener los resultados deseados.
53
Anexos
Material
Limpieza del material.
o Pipeta Volumétrica de 5 mL
o Pipeta graduada de 5 mL 60
o Matraz aforado de 100 mL
o Probeta de 100 mL
o Pizeta
o Perilla
Reactivos
Seguridad (Anexo 5)
•
Solución Estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L
•
Acido Nítrico (HNO3) Concentración.
•
Agua desionizada o tridestilada.
•
Espectrofotométrica de Absorción Atómica
•
Lámpara de Cátodo Hueco de Cobre (Cu)
Equipo
Preparación de soluciones
Para la realización la verificación se debe preparar una solución de cobre (Cu) de 5 mg/L y
preparar un blanco de acido nítrico (HNO3)
Preparación de la Solución de Cobre 5 mg/L
•
Medir una alícuota de 5mL del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L en
pipeta volumétrica y llevarlo a un matraz aforado de 100 mL.
•
Adicionar 2 mL de acido nítrico (HNO3) con pipeta graduada.
54
Anexos
•
Llevar al aforo con agua desionizada o tridestilada.
•
Cuidar el aforo.
Preparación del Blanco
•
Medir una alícuota de acido nítrico (HNO3) conc. Con pipeta graduada,
llevar a la
•
probeta graduada.
•
Aforar a 100 mL con agua desionizada o tridestilada.
•
Cuidar el aforo.
Desarrollo experimental
•
Encender el equipo y conectar la lámpara de Cobre (Cu).
•
Alinear la lámpara hasta obtener la máxima energía.
•
Seleccionar el ancho de banda espectral óptimo, el cual depende de cada
elemento en particular.
•
Seleccionar la longitud de onda para el metal de interés.
•
Optimizar la longitud de onda ajustándola hasta obtener la máxima energía.
•
Esperar de 10 min a 20 min para que se estabilice el equipo, una vez
encendida la lámpara.
•
Encender la flama. Permitir que el sistema alcance el equilibrio de
temperatura.
•
Aspirar un blanco (matriz libre de analitos a la cual se le agregan todos los
reactivos en los mismos volúmenes y proporciones usadas en el
procesamiento de la muestra). El blanco en absorbancia debe de ser 0.0000
•
Aspirar una disolución estándar de Cobre de 5 mg/L,
•
Buscar una absorbancia de 0.6 a 0.7 unidades de absorbancia
•
Si en caso de que no se obtenga la absorbancia mencionada, ajustar la
velocidad de flujo del nebulizador hasta obtener la máxima sensibilidad, así
como ajustar el quemador horizontal y verticalmente hasta obtener la
máxima respuesta.
55
Anexos
Anexo 4
Elaboración de una curva de calibración
Objetivo
Que el alumno aprenda a elaborar una curva de calibración para el desarrollo del análisis en
muestras.
Fundamento
Es una curva que se construye a partir de diferentes concentraciones de un analito y su
respuesta frente a una reacción. Este gráfico tiende a ser lineal, mientras progrese según la
ley de Lambert Beer.
Factores que determinan la calidad de una calibración son:
La precisión de las medidas estimadas através de la repetibilidad y la reproducibilidad de
las medidas. La repetibilidad se evalúa através del calculo de la desviación estándar relativa
(RSD%) de la medida de los patrones de calibrado.
Exactitud de los patrones el valor de la concentración o masa designado a cada patrón trae
aparejado un error pequeño si es preparado a partir de reactivos puros (grado analítico) con
estequiométria bien definida este error en lo general se desprecia, frente al error de las
medidas de las señales producidas por el instrumento.
Material
Limpieza de material
•
Pipeta Volumétrica de 10, 5, 2, 3, 1 mL
•
Pipeta graduada de 10 mL
•
Matraz aforado de 100 mL
•
Pizeta
56
Anexos
•
Perilla
•
Frascos de boca ancha
•
Etiquetas
•
Solución Estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L
•
Acido Nítrico (HNO3) Conc.
•
Agua desionizada o tridestilada.
•
Espectrofotométrica de Absorción Atómica
•
Lámpara de Cátodo Hueco de Cobre (Cu)
Reactivos
Seguridad
Equipo
Desarrollo experimental
Calcular los volúmenes que necesitamos de la solución estándar para la elaboración de la
curva. Para la preparación utilizaremos un estándar de Cobre (Cu) de 1000mg/L de esta
solución tomaremos una alícuota para preparar una concentración de 100mg/L y de esta
partiremos para preparar los demás puntos para la curva.
Nota: Cuidar de no contaminar el estándar de Cobre (Cu) de 1000mg/L
Calculo para la preparación de los puntos de la curva.
Calculo para la preparación de la solución Cobre 100 mg/L:
57
Anexos
Preparación de la solución de Cobre 100 mg/L:
Tomar una alícuota de 10 ml del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un
matraz aforado de 100 mL, igualar la matriz agregándole 2 mL de Acido Nítrico (HNO3)
concentrado y llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.
Calculo para la preparación de la solución de Cobre 6 mg/L:
Preparación de la solución de Cobre 6 mg/L:
Tomar una alícuota de 6 ml del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregándole 2 mL de Acido Nítrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.
Calculo para la preparación de la solución de Cobre 4 mg/L:
Preparación de la solución de Cobre 4 mg/L:
Tomar una alícuota de 4 ml del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregándole 2 mL de Acido Nítrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.
Calculo para la preparación de la solución de Cobre 3 mg/L:
58
Anexos
Preparación de la solución de Cobre 3 mg/L:
Tomar una alícuota de 3 ml del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregándole 2 mL de Acido Nítrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.
Calculo para la preparación de la solución de Cobre 2 mg/L:
Preparación de la solución de Cobre 2 mg/L:
Tomar una alícuota de 2 ml del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregándole 2 mL de Acido Nítrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.
Calculo para la preparación de la solución de Cobre 1 mg/L:
Preparación de la solución de Cobre 1 mg/L:
Tomar una alícuota de 1 ml del estándar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregándole 2 mL de Acido Nítrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.
Después de la preparación de la curva, se analiza o se guarda en refrigeración.
59
Anexos
Anexo 5
Seguridad
Para el muestreo se necesita tener los cuidados que se establecen en la norma mexicana
NMX-AA-003.
No se ha determinado la carcinogenicidad de todos los reactivos con precisión, por lo que
cada sustancia química debe tratarse como potencialmente peligrosa para la salud. La
exposición a estas sustancias debe reducirse al menor nivel posible. Este método puede no
mencionar todas las normas de seguridad asociadas con su uso. El laboratorio es
responsable de mantener un ambiente de trabajo seguro y un archivo de las normas de
seguridad respecto a la exposición y manejo seguro de las substancias químicas
especificadas en éste método.
Debe tenerse un archivo de referencia de las hojas de información de seguridad el cual debe
estar disponible a todo el personal involucrado en estos análisis.
Los gases oxidantes deben separarse de los gases reductores mediante una pared a prueba
de fuego. Seguir cuidadosamente las guías de operación del fabricante del equipo para
optimizar la velocidad del flujo de gas. Si no se emplean las precauciones adecuadas, puede
resultar una combustión peligrosa dentro de la cámara de mezcla de los gases.
Para evitar explosiones en la línea, no permitir que la presión de llegada del acetileno a
instrumento exceda 1,06 kg/cm2.
Cuando se usa óxido nitroso como oxidante, debe utilizarse una cabeza de quemador de
50,8 mm de diámetro, ya que utilizando una cabeza de 101,6 mm (4-in) ocurre un regreso
de la flama. La flama de óxido nitroso debe encenderse usando primero una combinación
de aire-acetileno y luego cambiar a óxido nitroso-acetileno. El óxido nitroso nunca debe
60
Anexos
pasarse a través de líneas que contengan residuos de aceites o grasas, ya que puede causar
una explosión.
Revisar que el tubo del desagüe de la cámara de mezcla de gas esté lleno con agua antes de
comenzar cualquier análisis. Se recomienda el uso de una trampa de seguridad o de
cualquier válvula. Siga las instrucciones del fabricante para mantener una presión positiva
en el sello del líquido.
Dada la alta toxicidad del berilio, plomo, cadmio, níquel, mercurio, antimonio, plata, bario,
cromo, así como todos los pasos de preparación y digestión de las muestras, extremar las
precauciones de manejo de todas las disoluciones y utilizar un cuarto bien ventilado.
61