Manual de laboratorio de microbiología para el

Manual de laboratorio de
microbiología para el diagnostico
de infecciones genitales
Manual clí nico y tecnico de ayuda al diagno stico
microbiolo gico de las infecciones genitales, alteraciones
de la flora comensal y estado de portadoras
Mª José López García, Marta Cárdenas Povedano,
Antonia Osuna Molina
Revisado por: José Miguel Aguilar Benítez
1ª edición © 2012 OmniaScience (Omnia Publisher SL)
www.omniascience.com
DOI: http://dx.doi.org/10.3926/oss.1
ISBN versión on-line: 978-84-694-9599-5
ISBN versión impresa: 978-84-940234-1-5
DL: B-17470-2012
Diseño portada y contraportada: OmniaScience
Fotografía portada: © Kts | Dreamstime.com
Índice
PRESENTACIÓN
CAPÍTULO 1
FLORA GENITAL NORMAL
1.1
FLORA NORMAL DE LA VAGINA
1.2
FLORA NORMAL DE LA URETRA
CAPÍTULO 2
INFECCIONES GENITALES Y AGENTES ETIOLÓGICOS
2.1
ESTADO DE PORTADORA
2.2
PATOLOGÍAS
2.2.1 Uretritis
2.2.2 Cervicitis
2.2.3 Enfermedad inflamatoria pélvica (EIP)
2.2.4 Prostatitis, orquitis, epididimitis
2.2.5 Vaginitis y vaginosis
2.2.6 Úlceras
2.2.7 Verrugas genitales: Condilomas acuminados
2.2.8 Balanitis
CAPÍTULO 3
TOMA DE MUESTRAS
CAPÍTULO 4
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRECTO
4.1
VISUALIZACIÓN DIRECTA
4.1.1 Fresco
4.1.2 Sedimento urinario
4.1.3 Tinción de Gram
4.1.4 Microscopio campo oscuro
4.1.5 Tinción de Giemsa
4.2
CULTIVO
4.2.1 Siembra
4.2.2 Evaluación del crecimiento
4.2.3 Pruebas complementarias
4.2.4 Antibiogramas
4.2.5 Cultivo de trichomonas
4.2.6 Cultivo mycoplasmas y ureaplasmas
4.3
PRUEBAS DE DETECCIÓN RÁPIDA DE ANTÍGENO
4.3.1 Frascos con orina y torundas de alginato cálcico o dacrón sin medio de transporte
con exudados genitales
4.3.2 Torunda de dacrón con medio de transporte específico
4.4
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
4.4.1 Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado líquido de órganos
internos
4.4.2 Frascos con orina y torundas de alginato cálcico o dacrón sin medio de transporte
con exudados genitales y/o ETS
4.4.3 Torunda de alginato cálcico o dracón en tubo affirm VPIII
4.4.4 Torunda de dacrón con medio de transporte específico
CAPÍTULO 5
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRECTO: SEROLOGÍA
5.1
HERPES
5.2
TREPONEMA PALLIDUM
CAPÍTULO 6
INFORME DE LOS RESULTADOS
CAPÍTULO 7
BIBLIOGRAFÍA
SOBRE LOS AUTORES DEL LIBRO
SOBRE EL REVISOR DEL LIBRO
Índice de tablas
Tabla 1. Diagnóstico diferencial de Vaginitis y Vaginosis. Test de Amsel
Tabla 2. Resumen de los Procedimientos microbiológicos de Toma de muestra y Transporte en
infecciones genitales y/o ETS
Tabla 3. Cálculo de Nugent Score
Tabla 4. Api 20 A
Tabla 5. Api NH
Tabla 6. Interpretación de Sensibilidades para N. gonorrheae
Tabla 7. Interpretación de Sensibilidades para Haemophilus
Tabla 8. Galería de Mycoplasma y Ureaplasma
Tabla 9. Recuento en placa de Mycoplasma y Ureaplasma
Tabla 10. Sensibilidad de las pruebas serológicas frente al T. pallidum en función de las etapas de
evolución de la sífilis
Tabla 11. Resumen de los procedimientos específicos del Laboratorio de Microbiología para las
muestras de infecciones genitales y/o ETS
Tabla 12. Interpretación de Nugent Score
Tabla 13. Interpretación de los resultados serológicos de la Sífilis: Diagnóstico y seguimiento del
tratamiento
Índice de ilustraciones
Ilustración 1. Toma de muestras genitales con torunda: A) del fondo del saco vaginal; B) de la
uretra masculina)
Ilustración 2. Siembra para aislamiento en placa
Ilustración 3. Siembra semicuantitativa en placa
Ilustración 4. Fundamento de la técnica Inmunocromatografía directa
Presentación
Presentación
Las enfermedades microbiológicas que afectan a las áreas genitales son de gran importancia por
su implicación en la transmisión materno-fetal y en las enfermedades infecciosas de transmisión
sexual. Se estima que en España un 3‰ de los recién nacidos podrían infectarse por el
Streptococcus agalactiae si no se adoptaran medidas preventivas y se sabe que las infecciones
de sífilis y gonococia han incrementado su incidencia en los últimos años. Es por ello que se ha
incorporado de forma sistemática en el seguimiento del embarazo el despistaje de la
colonización vagino-rectal y ha aumentado notablemente la demanda en el diagnóstico de
infecciones de transmisión sexual.
En cuanto al Laboratorio de Microbiología, el hecho de que la gran mayoría de los
procedimientos sean manuales hace que se requieran habilidades técnicas y estén siempre
sujetos a la interpretación subjetiva del facultativo. Por otra parte, los métodos de diagnóstico
directo en microbiología están experimentando un gran avance hacia una mayor rapidez, y
eficiencia.
El objetivo de este manual es actualizar los conocimientos clínicos, analíticos y técnicos, y
adiestrar en los procedimientos de diagnóstico microbiológico de las enfermedades genitales
infecciosas o relativas a la flora comensal (por colonización o alteración), con el fin último de
ayudar a la prevención, diagnóstico y seguimiento de las enfermedades infecciosas de trasmisión
materno-fetal y sexual, y con ello disminuir la morbilidad y mortalidad asociadas y los costes
derivados de ellas.
Va dirigido al personal en formación y a profesionales del ámbito sanitario, principalmente del
laboratorio (técnicos y facultativos) pero también a los clínicos (médicos y enfermeros). Recorre
por tanto las áreas asistenciales de atención primaria y especializada (ginecólogos, urólogos,
dermatólogos…), toma de muestras, y las distintas áreas del laboratorio de microbiología.
Para la elaboración del manual nuestro grupo de trabajo ha realizado una revisión completa y
actualizada de las enfermedades microbiológicas genitales sobre la que ha desarrollado unos
Procedimientos de Laboratorio de Microbiología de forma detallada y esquematizada, de cada
uno de los pasos del proceso analítico: toma de muestras y recepción, procesamiento e informe
de laboratorio.
Abril de 2012
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Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Capítulo 1
Flora genital normal
La uretra posterior, los testículos y los ovarios, están habitualmente libres de microrganismos,
pero la uretra anterior, la vagina y la vulva en el adulto, están colonizados por una gran cantidad
de microrganismos.
El tracto urogenital del recién nacido es estéril, pero en las primeras 24 horas posteriores al
nacimiento es colonizado por una flora compuesta por difteroides, estafilococos y estreptococos
no hemolíticos.
1.1 Flora normal de la vagina
Fue una de las primeras en ser reconocida en 1892 por Döderlein quien describió el patrón
biológico normal que se observa en la mujer en edad genital activa. La composición de la flora
normal depende del contenido estrogénico. El estímulo hormonal determina la proliferación de
las células epiteliales que aumentan su contenido de glucógeno. Este es utilizado por
Lactobacillus spp., siendo el ácido láctico el producto final del metabolismo, el cual provoca un
descenso importante del pH. La acidez resultante inhibe el crecimiento de muchas bacterias.
En la mujer en edad genital activa predominan distintas especies de Lactobacillus, otros bacilos
grampositivos y en menor cantidad cocos grampositivos (Streptococcus spp., Enterococcus spp.,
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Flora genital normal
etc.). También pueden encontrarse algunos Actinomyces, bacilos gramnegativos anaerobios
como Bacteroides y distintas especies de enterobacterias. El Streptococcus agalactiae (grupo B)
se aísla en un porcentaje variable a esta edad, que aunque no suele producir enfermedad en la
mujer, su presencia implica riesgo para el recién nacido en el que puede causar una enfermedad
severa.
Durante la gestación, a medida que progresa el embarazo, aumenta la densidad de bacillus y
disminuye la de bacilos gramnegativos anaerobios y facultativos; el resultado es un mecanismo
que reduce el riesgo de bacteriemia grave durante el parto y el puerperio. Algunas levaduras,
como Candida albicans y otras especies, pueden formar parte de la flora vaginal normal. Estos
hongos eventualmente, por alteraciones del ecosistema pueden llegar a proliferar y causar
síntomas. La flora vaginal protege frente a la infección vaginal, especialmente durante el
embarazo y suministra la flora normal al recién nacido.
En la etapa prepuberal predominan los microrganismos de origen cutáneo y perineal: S.
epidermidis, Propionibacterium spp. y pueden aislarse levaduras en escaso número, al igual que
enterobacterias y bacilos gramnegativos anaerobios.
En la mujer postmenopáusica, gracias al cese del estímulo hormonal, la flora de la vagina retorna
al patrón que tenía en la infancia.
El exudado vaginal es la muestra indicada para el diagnóstico de la infección genital y
comprende el estudio directo y el cultivo de los fluidos vaginales. En la mujer sana en edad
genital activa, el examen directo mostrará células epiteliales planas acompañadas de
Lactobacillus: bacilos grampositivos grandes. En condiciones patológicas esta imagen se pierde y
es reemplazada por la presencia de abundantes leucocitos polimorfonucleares, levaduras con
pseudofilamentos, G.Vaginalis, flora de tipo anaerobia, etc.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/repro1.htm
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/repro2.htm
1.2 Flora normal de la uretra
Staphyloccus epidermidis, estreptococos no hemolíticos y difteroides, son los microrganismos
que predominan en la porción distal de la uretra femenina y masculina. Micobacterium
smegmatis se encuentra frecuentemente en las secreciones uretrales de las mujeres y hombres
no circuncisos.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/repro3.htm
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/ssvv/repro4.htm
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Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Capítulo 2
Infecciones genitales y agentes etiológicos
2.1 Estado de portadora
El Streptococcus agalactiae beta hemolítico del grupo B (EGB) se encuentra en la vagina o área
anorectal en el momento del parto en un 15 – 20% de las embarazadas de nuestro país, siendo
la tasa de transmisión vertical madre / RN del orden del 50%. En ausencia de medidas de
prevención un 3 por cada mil RN pueden ser infectados por EGB a su paso por el canal del parto
desarrollando una infección neonatal severa (sepsis precoz). Actualmente la única medida de
eficacia probada para prevenir el desarrollo de sepsis neonatal precoz por EGB es la aplicación
en el momento del parto de profilaxis antibiótica a las madres portadoras.
Se recomienda estudiar la colonización vagino-rectal de forma universal como screening entre la
35 y 37 semana de gestación, preferentemente en la 35 semana y siempre que exista sospecha
de corioamnionitis.
2.2 Patologías
Las vulvovaginitis constituyen las infecciones genitales más frecuentes, de las cuales el 90% son
de etiología candidiásica, vaginosis bacteriana, tricomoniasis y etiología mixta (candidiasis y
tricomoniansis o vaginosis bacteriana o ambas). Las causas no infecciosas incluyen vaginitis
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Infecciones genitales y agentes etiológicos
atrófica, alérgica o irritación química (productos de higiene íntima, compresas, condones de
látex, tintes, etc.) cuerpos extraños, liquen escleroatrófico o cáncer de vulva.
La importancia de determinar el agente infeccioso causal radica en que cuando se trata de una
vaginitis por Trichomonas debe tenerse en cuenta la posibilidad de una infección de transmisión
sexual concurrente en la paciente y en sus contactos, y si se trata de una vaginosis bacteriana en
una gestante se asocia a la rotura prematura de membranas, prematuridad, aborto espontáneo
y endometritis puerperal. La vaginosis bacteriana también se relaciona con patología
ginecológica como la endometriosis y enfermedad inflamatoria pélvica después de prácticas de
procedimientos ginecológicos invasivos.
Las Infecciones de Transmisión Sexual (ITS) constituyen un grupo de enfermedades infecciosas
muy frecuentes, siendo su distribución no uniforme en el mundo, variando la incidencia de los
diferentes patógenos dependiendo del área geográfica, del nivel socioeconómico, hábitos
sexuales, etc. La importancia de dichas infecciones no radica solamente en sí mismas, sino
también en los efectos deletéreos que pueden ocasionar, como la infertilidad femenina
secundaria, embarazo ectópico, cáncer de cérvix y las infecciones neonatales graves.
La Organización Mundial de la Salud estimó que en 1999 se produjeron en el mundo 340
millones de casos nuevos de sífilis, gonorrea, clamidiasis y tricomoniasis.
Según el Centro Nacional de Epidemiología los resultados en el periodo 1995-2009 muestran un
cambio de tendencia claro de las ITS sometidas a vigilancia epidemiológica, las cuales aumentan
a partir del inicio de la década de los 2000. Destaca en particular el importante incremento en la
incidencia de sífilis, que a partir de 2004 supera las cifras del año 1995 así como también a los
casos notificados de infección gonocócica.
En 2008 la información epidemiológica de los países de la Unión Europea muestra que la
infección por Chlamydia trachomatis, que afecta principalmente a mujeres jóvenes, es la ITS
bacteriana más frecuentemente notificada, a pesar de que no todos los países tienen implantada
su vigilancia. La infección gonocócica ha aumentado con respecto a años previos, aunque no de
forma consistente en todos los países, y, al igual que la sífilis que también ha experimentado un
crecimiento, es más común entre hombres que tienen relaciones sexuales con otros hombres.
La co-infección entre distintas ITS y las infecciones asintomáticas de trasmisión sexual son muy
frecuentes. Por ello, en cualquier persona que presente una de ellas debe descartase la
presencia de otras, en particular la infección por VIH y la infección por clamidia (en la que la
ausencia de síntomas es la norma).
Las ITS son un grupo de infecciones producidas por más de 25 microrganismos, que se
transmiten fundamentalmente a través de las relaciones sexuales, bien mediante sexo vaginal,
anal y oral. La transmisión vertical, bien durante el embarazo bien en el momento del parto,
sería la otra vía de transmisión de ITS.
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Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Las más graves se suelen clasificar en base a su aparición, así se define como:
o
De primera generación a la sífilis, gonorrea y chancro blando.
o
De segunda generación (1970) a las producidas por C. trachomatis, Mycoplasma spp.
y Herpesvirus genital.
o
De tercera generación a las producidas por Papilomavirus humano, virus de la
hepatitis y virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
Otros agentes de ITS son el poxvirus causante del molluscum contagiosum, y algunos
ectoparásitos (sarna y ladillas). De todas ellas tan sólo nos vamos a ocupar en este manual de
aquellas más frecuentes y que afectan a los órganos genitales.
2.2.1 Uretritis
Concepto
Se define como el síndrome caracterizado por aparición de corrimiento uretral, en general
mucopurulento, con disuria o prurito en el meato urinario, como respuesta de la uretra a una
inflamación de cualquier etiología. Las causas de este síndrome en general son infecciosas y de
transmisión sexual, existiendo, sin embargo, también otras: químicas, microtraumatismos,
hipersecreción glandular que puede dar lugar a dificultades diagnósticas. En base a su evolución
se pueden clasificar en aguda, persistente o recurrente. En base a su etiología en gonocócica,
postgonocócica, no gonocócica (C. trachomatis, U. urealyticum, M. genitalium, Trichomonas
vaginalis, Herpes, etc.) y de etiología desconocida. La incidencia de las diferentes etiologías
variará en nuestro medio de acuerdo al nivel sociocultural, existiendo predominio en población
de bajos recursos de uretritis gonocócica. Es importante resaltar la frecuente asociación de N.
gonorrhoeae y C. trachomatis (20%).
Uretritis gonocócica
Es causada por Neisseria gonorrhoeae. Destacamos que es una bacteria extremadamente
exigente, tanto desde el punto de vista nutricional como atmosférico, y en su labilidad frente al
ambiente, características fundamentales a tener en cuenta para su diagnóstico.
Clínica
Después un período de incubación de dos a siete días aparece secreción mucopurulenta con
disuria, que evoluciona a la resolución en seis meses, pero con elevada incidencia de
complicaciones y de portadores asintomáticos prolongados. La prevalencia de estos últimos es
del orden del 1%, siendo fundamentales en la transmisión de la infección. Sus cepas
corresponden generalmente a los auxotipos AXU.
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Infecciones genitales y agentes etiológicos
Uretritis no gonocócica
Este síndrome es producto de infecciones por diferentes patógenos como Chlamydia
trachomatis, Ureaplasma urealyticum, M. genitalium, Trichomonas vaginalis, Herpes genital,
Gardnerella vaginalis, Candida albicans, E. coli, Staphylococcus saprophyticus, H. influenzae, H.
parainfluenzae, Pasteurella bettyae, S. agalactiae, raro: N. meningitidis, Adenovirus. Por
frecuencia destacaremos los dos primeros.
Etiología
Chlamydia trachomatis
Es una bacteria de pequeño tamaño de pared similar a las bacterias gramnegativas, que contiene
antígenos útiles para su diagnóstico. Son parásitos intracelulares estrictos que necesitan células
huéspedes para su multiplicación. Pertenece a la familia Chlamydiaceae, junto con C. psittaci y C.
pneumoniae, dos especies causantes de otras patologías. Se clasifica en diferentes serotipos
antigénicos según sus proteínas de membrana. Los que se denominan de la D a la K son los
causantes de uretritis y cervicitis; los L1, L2 y L3 del linfogranuloma venéreo (otra rara patología
de transmisión sexual).
Ureaplasma urealyticum
Es una bacteria pequeña sin pared celular, muy exigente nutricionalmente (esteroles, etc.), lo
que dificulta su cultivo. Pertenece al género Ureaplasma integrante de la familia
Mycoplasmaceae.
Clínica
La uretritis no gonocócica se caracteriza por la presencia de una secreción mucopurulenta o
serosa, clara, matinal, en general sin ardor miccional, con un período de incubación de 4 a 15
días. Pueden presentarse infecciones asintomáticas, complicaciones como prostatitis,
epididimitis y localizaciones extragenitales, principalmente en el caso de C. trachomatis.
Uretritis postgonocócica
Se denomina uretritis postgonocócica a aquellas que observamos luego del tratamiento con
antibióticos que cubren exclusivamente a N. gonorrhoeae. Es generalmente causada por C.
trachomatis y U. urealyticum, siendo producto de una infección originalmente mixta por N.
gonorrhoeae y alguno de estos gérmenes. La terapéutica es similar a la mencionada
anteriormente.
Uretritis recurrente o persistente
Se observa postratamiento de uretritis no gonocócica, fundamentalmente cuando en un inicio
no se evidenció germen causal alguno (uretritis de origen desconocido), también en casos de
uretritis por Ureaplasmas resistentes a tetraciclinas (10%). Se debe plantear la posibilidad de
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Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
encontrarnos frente a una prostatitis. El tratamiento se realiza repitiendo el inicial pero durante
15 a 21 días; si el cuadro persiste debe investigarse prostatitis o infección por Trichomonas.
2.2.2 Cervicitis
Concepto
Al ser el cérvix un órgano que responde a los cambios hormonales, sus características varían con
la edad, embarazo, toma de anticonceptivos orales (ACO), etc. Estos cambios afectan su
anatomía y su susceptibilidad a la infección por patógenos cervicales. La cervicitis
mucopurulenta es el equivalente de la uretritis masculina, y ocupa un lugar importante en las
infecciones de transmisión sexual en la mujer. Su diagnóstico y tratamiento no solo importan
para el control de las ITS, sino también para prevenir complicaciones frecuentes como
enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), parto prematuro, infección puerperal y neonatal y
neoplasia cervical.
Etiología
Los gérmenes más frecuentemente involucrados en infecciones del endocérvix son C.
trachomatis, N. gonorrhoeae, planteándose también como probable patógeno Mycoplasma
genitalium. Dentro de las etiologías raras se encuentran el Herpes genital y Trichomonas
vaginalis, afectando esta última principalmente al exocérvix. Aún menos frecuentes son las
causadas por Capnocytophaga spp., Pasteurella bettyae, Mycobacterium tuberculosis,
Streptococcus agalactiae. Debemos destacar que gran parte de las cervicitis son de carácter
inflamatorio, no infeccioso, dado por agresión del pH vaginal, displasias, etc.
Clínica
El diagnóstico clínico de cervicitis mucopurulenta se establece por la presencia de un exudado
mucopurulento endocervical, acompañado por edema y eritema de la mucosa, la cual sangra
fácilmente al tacto.
2.2.3 Enfermedad inflamatoria pélvica (EIP)
Concepto
Este término comprende las infecciones que afectan los diferentes órganos pelvianos
(salpingitis, endometritis, peritonitis pélvica).
Etiología
Dentro de los agentes causantes de EIP se encuentran patógenos de transmisión sexual como C.
trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium, solos o asociados, y otros integrantes normales de
la flora vaginal como E. coli, Streptococcus spp., anaerobios como Bacteroides spp. y
Peptostreptococcus spp., en general asociados. Otros microrganismos que también se han
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Infecciones genitales y agentes etiológicos
aislado son Actinomyces spp., Enterococcus spp., H. influenzae, Pasteurella bettyae, Prevotella
bivia, Mycoplasma hominis ,S. aureus, S. epidermidis, y S. agalactiae.
Patogenia
Según el origen de los microrganismos involucrados se dividen en exógenos (en su mayoría de
transmisión sexual) y endógenos (flora vaginal). La vía de diseminación es la ascendente desde el
cérvix (complicación de cervicitis) o la vagina. Existen factores de riesgo para que este síndrome
ocurra: la cervicitis por N. gonorrhoeae o C. trachomatis, múltiples parejas sexuales, uso de DIU y
la edad (los jóvenes constituyen el principal grupo de riesgo).
Clínica
El diagnóstico clínico muchas veces es dificultoso por presentar sintomatología inespecífica. Con
el fin de estandarizar el diagnóstico se manejan criterios primarios (abdomen inferior doloroso,
movilización dolorosa del 9ancro, dolor de anexos) y criterios secundarios (fiebre de 39ºC),
leucocitosis mayor de 10.000, VES mayor de 15mm/hora, aislamiento de N. gonorrhoeae o C.
trachomatis en el cérvix). El diagnóstico se realiza con la presencia de los tres primarios más
alguno de los secundarios.
2.2.4 Prostatitis, orquitis, epididimitis
Etiología
La prostatitis por lo regular es causada por una infección bacteriana de la glándula prostática. El
agente causal generalmente es cualquiera que pueda producir una infección urinaria:
enterococos, E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P aeruginosa, S. aureus…También pueden
producir prostatitis aguda, epididimitis y orquitis la Chlamydia, N. gonorrheae, trichomonas, U.
urealyticum.
Clínica
Lo más probable es que los síntomas de la prostatitis aguda comiencen rápidamente y que
causen mayor molestia: dolor abdominal, disuria, fiebre, retención urinaria, lumbago, dolor en la
eyaculación y perineal. Durante el examen físico, el médico puede encontrar los siguientes
signos: secreción de la uretra, agrandamiento o sensibilidad en los ganglios linfáticos inguinales,
inflamación o sensibilidad en el escroto, y la próstata inflamada, dura, caliente o sensible.
2.2.5 Vaginitis y vaginosis
Dentro de las infecciones vaginales destacamos que la única que constituye ITS es la vaginitis por
Trichomonas vaginalis.
El flujo vaginal constituye uno de los motivos de consulta más frecuente de las mujeres en edad
reproductiva. Entendemos por flujo al aumento permanente de los trasudados y exudados de
causa fisiológica o patológica, que se objetivan por la paciente o por el examinador. El flujo
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Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
fisiológico es producto de los cambios hormonales del ciclo, y contiene escasa cantidad de
leucocitos. La leucorrea puede deberse a infección vaginal o cervical.
Vaginitis
Concepto y etiología
Denominamos vaginitis a la infección vaginal con respuesta inflamatoria caracterizada por la
presencia de abundantes polimorfonucleares en el extendido teñido con tinción de Gram.
Dentro de los agentes más frecuentes se encuentra Candida albicans (levadura que integra la
flora vaginal normal). Trichomonas vaginalis (protozoario flagelado), también es un agente
causal, pero menos frecuente. Más raras son las infecciones por Actinomyces spp.,
Capnocytophaga spp., Bacteroides spp., enterobacterias, Eubacterium nodatum, M. tuberculosis,
N. meningitidis, Pasteurella bettyae, Prevotella bivia, P. disiens, Prevotella spp.,
Peptostreptococcus spp., S. aureus, S. pyogenes, VHS, C. diphtheriae. (ver Tabla 1)
La vulvoganitis sin sangrado en la niñas, puede ser causada por bacterias implicadas en
infecciones respiratorias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Staphyloccus aureus, Branhamella (Moraxella) catharralis, Haemophilus
influenzae…) o por enterobacterias (Shigella, Yersinia). En caso de haber sufrido abuso sexual
habría que descartar los patógenos de vulvovaginitis en mujeres.
Clínica
o
El flujo causado por Candida sp. es de color blanquecino, grumoso (leche cortada), no
oloroso, se manifiesta en conjunto con prurito vaginal y tiene pH ácido. Puede
presentarse conjuntamente con la flora habitual (lactobacilos).
o
El flujo por Trichomonas vaginalis es de color amarillo verdoso, puede ocasionar
prurito, presenta olor a aminas volátiles, producto del metabolismo de las bacterias
anaerobias asociadas; determina pH vaginal alcalino y disminución o ausencia de la
flora vaginal, con presencia de flora mixta anaerobia asociada.
Vaginosis
Concepto y etiología
La bacteriana vaginosis constituye una entidad caracterizada por un cambio en la microecología
de la vagina caracterizada por la disminución o ausencia de lactobacilos con presencia de
Gardnerella vaginalis (cocobacilo Gram negativo) asociada a bacterias anaerobias como
Mobiluncus sp., Peptococcus sp. , Bacteroides sp. M. hominis, Prevotella spp., Atopium vaginae…
Se diferencia de la vaginitis en la ausencia de respuesta inflamatoria, o sea en la ausencia de
polimorfonucleares. (Tabla 1)
Clínica
o
El flujo de la vaginosis es oloroso por la liberación de aminas volátiles, no ocasiona
prurito, se acompaña de pH vaginal alcalino y se caracteriza por la presencia de flora
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Infecciones genitales y agentes etiológicos
bacteriana mixta dispuesta en la periferia de las células epiteliales, formando las
células guía o clue cells.
Dada la poca correlación entre los síntomas y signos de las vaginitis y vaginosis y su etiología, y la
importancia de tener un diagnóstico etiológico, el clínico debe tener unas habilidades técnicas
de diagnóstico analítico inmediato: valoración del flujo, medida del pH, test de aminas y
realización de un extensión en un portaobjeto para remitirlo al laboratorio de Microbiología,
donde se hará la tinción de Gram.
A nivel de cabecera de paciente, el médico se podrá guiar por los Criterios de Amsel, según los
cuales, la vaginosis bacteriana tiene que cumplir tres de los cuatro criterios. Basándonos en
ellos, el 90% de las mujeres con vaginosis bacteriana pueden ser diagnosticadas correctamente.
Criterio
diagnóstico
Ph Vaginal
Normal
Flujo vaginal
Test aminas (olor)
3,8 – 4,2
Blanco, fino,
friable
Ausente
Lactobacillus
Células
epiteliales
Observación
microscópica
Vaginosis
Garnerella
>4.5
Blanco grisáceo,
cremoso, fino
Pescado
Células guía,
cocobacilos
Gram variable.
No leucocitos
Vaginitis
Trichomonas
4.5
Amarillo, verdoso
espumoso
Pescado
Vulvovaginitis
Cándida
<4.5
Blanco cortado,
requesón
Ausente
Trichomonas.
Levaduras,hifas y
Leucocitos>10/campo pseudohifa.
Leucocitos>4/campo
Animaciones recomendadas:
http://emprocedures.com/obgyn/wetprep/procedure.htm
http://emprocedures.com/obgyn/wetprep/analysis.htm
Tabla 1. Diagnóstico diferencial de Vaginitis y Vaginosis. Test de Amsel
2.2.6 Úlceras
Concepto
Las úlceras genitales son lesiones que se caracterizan por la pérdida de continuidad en el
epitelio, en el que se observa una necrosis previa. La lesión inicial puede ser una pápula, pústula
o vesícula. Constituyen un motivo de consulta frecuente, lo cual plantea la necesidad de una
orientación diagnóstica etiológica adecuada. Las úlceras que aparecen en los genitales no son
exclusivamente de transmisión sexual, existiendo otras etiologías como traumatismos,
reacciones a medicamentos, alergia, lesiones químicas o evolución de una infección previa no
ulcerativa (balanitis). Las etiologías infecciosas de transmisión sexual de estas lesiones son
variadas y, dependiendo de la región considerada, su frecuencia relativa también varía.
En nuestro medio el herpes genital (Herpes simplex tipo II y en ocasiones I) y la sífilis (Treponema
pallidum) son los procesos más frecuentes. El 11ancroide (Haemophilus ducreyi), el
linfogranuloma venéreo (C. trachomatis L1, L2, L3) y el granuloma inguinal o Donovanosis
(Klebsiella granulomatis, antes llamado Calymatobacterium), son muy poco frecuentes. Las
manifestaciones clínicas de cada patología son orientadoras, pero por su asociación y muchas
veces por la presentación poco específica, el diagnóstico microbiológico resulta fundamental.
Dada la importancia de la sífilis y el herpes genital, nos referiremos exclusivamente a éstas.
11
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Sífilis
Etiología
Es una infección sistémica de evolución crónica producida por Treponema pallidum. Esta
bacteria forma parte del género Treponema, familia Spirochaetaceae; es una bacteria larga, de
forma helicoidal, que se visualiza en microscopio con campo oscuro. Esta bacteria se incurva
formando 4 a 14 espirales, y posee un movimiento en sacacorchos. Es anaerobia estricta, y hasta
ahora no ha podido ser cultivada.
Patogenia
Esta enfermedad presenta un período de incubación de 9 a 90 días con una media de 21 días,
seguido de una lesión primaria o chancro con linfadenopatía regional y un período secundario
bacteriémico asociado a lesiones maculopapulares y linfadenopatías generalizadas.
Posteriormente existe un período de latencia de varios años y, finalmente, un 30% a 50% de los
casos no tratados presentan un período terciario caracterizado por destrucción mucocutánea,
lesiones parenquimatosas, aortitis y enfermedades del sistema nervioso central. T. pallidum se
une a las células en la puerta de entrada dando una lesión primaria y se disemina por la sangre.
La lesión primaria se produce por la enzima mucopolisacaridasa que degrada el espacio
intercelular del endotelio capilar, generando una endarteritis obliterante con necrosis y
ulceración. El huésped responde con un infiltrado linfocitario y de células plasmáticas. La mayor
parte del daño se debería a inmunocomplejos, que determinarían la respuesta inflamatoria
lesiva.
Inmunidad humoral
Se estimula precozmente y se mantiene con las lesiones del secundarismo.
o
Anticuerpos inespecíficos o reaginas: se forman frente a lípidos de los tejidos
destruídos por T. pallidum que actúan como haptenos al unirse con la espiroqueta. No
son específicos, pero se producen en la totalidad de los infectados. Aparecen una a
tres semanas después del chancro y su título aumenta hasta un máximo en el período
secundario. En el período terciario se encuentran en un 90% de los pacientes. La
presencia de estos anticuerpos indica lesión activa, pudiendo existir falsos positivos
que deberán confirmarse con técnicas de detección de anticuerpos específicos. Las
reaginas descienden con el tratamiento, utilizándose como control del mismo.
o
Anticuerpos específicos: aparecen inmediatamente después de las reaginas y
persisten toda la vida si el paciente no es tratado o lo es tardíamente. La
negativización postratamiento es muy lenta, pudiendo demorar años, por lo cual no
resultan útiles como control terapéutico sino como confirmación diagnóstica en un
paciente con reaginas positivas. Estos anticuerpos pueden ser del tipo IgG o IgM.
Estos últimos se encuentran en la sífilis primaria o en la sífilis congénita.
12
Infecciones genitales y agentes etiológicos
Inmunidad celular
Se encuentra deprimida en la primoinfección y el período secundario, recuperándose
postratamiento.
Clínica
Se puede dividir en dos etapas: la llamada sífilis precoz, hasta los dos años postinfección, y la
sífilis tardía, a partir de los dos años. La primera se caracteriza por curarse fácilmente, ser
contagiosa por transmisión sexual y por vía trasplacentaria. La sífilis tardía presenta lesiones
crónicas, difíciles de curar y, en general, no se transmite por contagio sexual.
Sífilis precoz
o
Presenta un primer período llamado de incubación de tres a cuatro semanas, donde
existe bacteriemia treponémica.
o
Le sigue un período primario donde aparece el chancro de inoculación. Se trata de
una lesión ulcerada con base edematosa indurada, indolora, en general única, con
localización genital y oral y duración entre cuatro y seis semanas. Esta lesión
desaparece luego de este período, independientemente de la realización de un
tratamiento. Es de gran utilidad para el diagnóstico, sin embargo, sus características
no siempre son típicas y se plantean problemas de diagnóstico diferencial. En este
período también se presentan adenopatías regionales concomitantes con el chancro.
Aparecen una semana después que este, son indoloras y bilaterales. Completa esta
etapa la bacteriemia treponémica causante de astenia y cefaleas. Este período
primario puede no existir cuando el contagio es postransfusión, cuando el chancro no
es visible, o cuando es decapitado por el uso de antibióticos a dosis insuficientes.
o
El período secundario se caracteriza por manifestaciones generales tales como
hepatoesplenomegalia, cefaleas, poliadenopatías y manifestaciones cutaneomucosas
como la roséola (exantema), condilomas planos (placas en mesetas de ingles y axilas),
sifílides (lesiones planas en plantas y palmas).
o
Luego del período secundario aparece el período de latencia precoz, que se
caracteriza por la desaparición espontánea de las manifestaciones del período
anterior.
Sífilis tardía
Corresponde al periodo terciario o final. Se caracteriza por la aparición de lesiones
cutaneomucosas, llamadas gomas (nódulos de piel que se ulceran), lesiones óseas (periosteítis),
lesiones cardiovasculares (aortitis) y lesiones neurológicas como tabes dorsal y meningitis
meningovascular (más frecuentes en VIH (+).
13
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Herpes genital
Etiología
Es una de las ITS de etiología viral más frecuente, con aumento de su incidencia en los últimos
tiempos. La imposibilidad de su erradicación por tratarse de una infección persistente con
frecuentes recidivas y el riesgo de contagio fetal en el canal de parto, justifican su importancia y
la preocupación por su control.
El agente Herpes Virus simplex tipo II y tipo I (agente del herpes labial) pertenece a la familia
Herpesviridae y a la subfamilia Alphaherpesvirinae; es un virus que contiene ADN.
Patogenia
Presenta cinco fases: infección primaria mucocutánea, infección ganglionar aguda, latencia,
reactivación e infección recurrente.
La infección se inicia con la exposición al virus, la inoculación con participación de células
epiteliales, la replicación viral con lisis celular, la rápida respuesta inflamatoria y la posterior
diseminación del virus por nervios sensitivos o autónomos hasta los ganglios regionales (sacros).
También se puede diseminar por contigüidad, extendiéndose las lesiones cutáneas. En los
ganglios se produce una etapa de latencia que persiste toda la vida, con reactivaciones por
estímulos de piel (sol, traumatismos, químicos) y centrales (coito, menstruación, estrés,
infecciones).
Clínica
Se plantean dos situaciones:
o
La infección asintomática en la que no existe lesión ni antecedentes de la misma, solo
están presentes los anticuerpos contra el virus;
o
La infección sintomática que se clasifica en:
-
Primoinfección herpética con lesiones de piel, sin antecedentes del mismo tipo y
sin anticuerpos contra el virus.
-
Infección inicial no primaria donde existen lesiones actuales sin antecedentes de
las mismas, pero con anticuerpos positivos por primoinfección asintomática
anterior. Las lesiones se caracterizan por múltiples vesículas dolorosas seguidas
de ulceración y adenopatías inguinales de 10 días aproximadamente de
evolución, pudiéndose acompañar de fiebre y cefaleas, principalmente en las
primoinfecciones.
14
Infecciones genitales y agentes etiológicos
2.2.7 Verrugas genitales: Condilomas acuminados
Concepto y etiología
Son formaciones verrugosas, vegetantes, de tamaño variable, que se localizan en la región
genital y perianal, cuya etiología es viral: Papilomavirus humano (HPV), un subgrupo de la familia
Papovaviridae.
Papilomavirus humano es una de las causas más frecuentes de ITS, tanto en hombres como en
mujeres en todo el mundo. El genoma consiste en una única molécula de ADN doble circular que
contiene dos proteínas de la cápside, L1 y L2 .El genoma se divide funcionalmente en tres
sectores: región reguladora no codificante; región temprana E1, E2, E4, E5, E6, y E7, que tienen
que ver con la replicación viral y con la oncogénesis; región que codifica para las proteínas de la
cápside.
Patogenia
La infección se produce por contacto piel con piel, o piel con mucosa. En principio la forma más
importante de contagio es por vía sexual, no descartándose la vía por fómites. El potencial
oncogénico del virus radicaría en principio en que es un virus ADN, cuyo genoma se integra al
genoma de las células eucariotas del estrato basal del epitelio, produciendo una infección
productiva o de lo contrario quedando latente y produciendo una infección persistente. De ahí la
importancia de las zonas tempranas E6 y E7 que codificarían para proteínas multifunción que se
unirían a las proteínas celulares p53 y pRB, alterando sus funciones, alterando la regulación del
ciclo celular, llevando a la célula a la transformación y malignización.
Dado que se asocian con lesiones precursoras del cáncer de cuello uterino y con cáncer de cuello
uterino invasor, se han agrupado en grupos de bajo y alto riesgo (de acuerdo al potencial
oncogénico):
o
Los tipos de bajo riesgo serían 6, 11, 42, 43 y 44.
o
Los tipos de alto riesgo serían 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y 70.
o
Dentro de los de alto riesgo existen algunos tipos que se asocian más frecuentemente
con lesiones precursoras (lesiones intraepiteliales escamosas) que con cáncer,
algunos autores se refieren a ellos como de riesgo intermedio. Se asocia a una
variedad de condiciones clínicas, que van desde lesiones inocuas cutáneas como
pueden ser las verrugas, hasta el cáncer.
La relación entre HPV y cáncer de cuello uterino fue puesta de manifiesto a principio de los años
80 por Harold zur Hausen, sabiendo desde entonces que su asociación era más fuerte aún que la
del tabaco con el cáncer de pulmón. Actualmente se sabe que 99% de los cánceres escamosos
de cuello uterino vienen determinados por HPV, está presente en un 89% de las pacientes
menores de 40 años con adenocarcima de cuello uterino y en un 43% de las mujeres mayores de
60 años con igual diagnóstico.
15
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Clínica
Infección asintomática: piel y mucosas sanas.
Lesión: aparecen masas carnosas y vegetantes en forma de crestas localizadas en zonas
húmedas genitales, pudiendo aparecer como papilas sésiles. Aumenta su tamaño con el
embarazo y la disminución de la inmunidad celular (VIH +).
Infección subclínica: no existe lesión macroscópica, el diagnóstico se plantea por colposcopia con
ácido acético al 3% y penescopia con el mismo método y posterior biopsia de los sectores
afectados.
2.2.8 Balanitis
Concepto
La balanitis es definida como una inflamación del pene, que involucra al prepucio
(balanopostitis). Hay una amplia variedad de causas, pero la infección es la etiología más común.
Etiología
Cándida albicans y otras levaduras son las responsables de cerca del 35% de todos los casos de
balanitis infecciosa, la mayoría de las veces adquirida por vía sexual. Los factores predisponentes
a la candidiosis genital masculina incluyen a la diabetes mellitus, inmunosupresión y la no
circuncisión. El último factor parece ser uno de los factores predisponentes mayores para
balanopostitis.
Las bacterias representan la segunda causa más frecuente de balanitis infecciosa: Streptococcus
agalactiae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Gardnerella vaginalis, anaerobios, Treponema
pallidum, Chlamydia tracomatis y Micoplasma han sido causas de balanitis. Causas menos
comunes de balanitis son las virales y parasitarias.
Clínica
El diagnóstico de balanitis se establece en base a la presencia de eritema en parches o
generalizado con o sin erosiones en el pene o debajo del prepucio, con o sin exudado
subprepucial.
16
Toma de muestras
Capítulo 3
Toma de muestras
Respecto a la transmisión materno fetal, para detectar las madres portadoras del EGB debe
efectuarse un cultivo tomando un escobillón vaginal y otro ano-rectal (o un escobillón vaginorectal).
En las ITS se deben siempre tener presentes los principios generales de la recogida de muestras
y específicamente los que se aplican a las muestras genitales:
o
Empleo de torundas y medios específicos especialmente en el caso de Chlamydia
(torundas de dacrón o alginato cálcico), micoplasma (dacrón o poliéster) o virus
(dacrón).
o
Realizar un agotamiento de la muestra (es decir, utilizar varias torundas, insertarlas
en los medios de transporte y rotarlas completamente) para evitar la posibilidad de
falsos negativos.
o
Inoculación directa de las muestras en los medios de cultivo, método muy
recomendable directamente en la consulta, inoculando medios de transporte para
Mycoplasma, medios de cultivo para trichomonas o incluso cultivo in situ de
gonococo en placas de Agar chocolate o en medios selectivos (Thayer-Martin, New
York City) previamente atemperados a 37ºC.
o
En las infecciones por anaerobios en cavidades cerradas las muestras se deben tomar,
si es posible, por punción percutánea-aspiración, empleando las medidas de
17
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
desinfección preconizadas para los hemocultivos, o en el transcurso de prácticas
quirúrgicas. En las infecciones abiertas deben ser de la parte profunda, tomadas
quirúrgicamente por aspiración percutánea o tras la eliminación de los tejidos
necróticos superficiales por curetaje o por aspiración; en su defecto, se puede tomar
la muestra con un hisopo de la base de la lesión e introducirlo inmediatamente en un
medio de transporte para anaerobios, donde se introduce la torunda hasta
aproximadamente 5 mm del fondo, se rompe el palillo a la altura de la tapa del tubo y
se cierra rápidamente.
o
Ante la sospecha de una ITS, se deben examinar todas las posibles vías de contagio
(genital, oral y anal) y en el caso de que existan zonas afectadas o posibilidad, tomar
muestras de dichas zonas. Además, dependiendo de la enfermedad de la que se
sospeche, rastrear otros órganos a los que pueda afectar la enfermedad; así, en el
caso de neurosífilis, tomar muestra del líquido cefalorraquídeo.
A continuación se detalla de forma esquemática el método de la toma de muestra, el recipiente
donde se han de mantener hasta su procesamiento y la temperatura idónea, según el tipo de
muestra que se vaya a tomar, en relación a las patologías que hemos visto.
Ilustración 1. Toma de muestras genitales con torunda: A) del fondo del saco vaginal; B) de la
uretra masculina
Animación recomendada:
http://emprocedures.com/obgyn/wetprep/procedure.htm
En la siguiente tabla (tabla 2) se resumen los procedimientos microbiológicos de toma de
muestras y transporte en infecciones genitales y/o ETS.
18
Toma de muestras
Origen de
muestra
Uretra:
exudado
Método
Recipiente
Limpiar con gasa estéril o torunda seca
en mujeres
Exprimir la uretra, si no es posible, 2 h
después de orinar
Torundas alginato cálcico o dacrón, finas
y flexibles; 2cm y rotar
Limpiar con torunda seca.
Con el espéculo no lubrificado
Cérvix: exudado comprimir
Torundas alginato
cálcico o dacrón, finas y flexibles
2 torundas con medio de
transporte Stuart-Amies:
porta/cultivo, de Gonococo
2ºC-8ºC
1 torunda
en 10B o SP-4
para Ureaplasma –
Mycoplasma
2ºC-8ºC
Orina de primer chorro
2ºC-8ºC
Vial en anaerobiosis
2 torundas con Stuart-Amies:
porta/cultivo Gonococo
Quirúrgico
35 ºC
1 torunda sin medio de
transporte para C.trachomatis
Frascos de anaerobio/aerobio
EPI: líquido o
exudado
Epidídimo y
testículo
Temperatura
37ºC
Tª ambiente
35ºC
1 torunda sin medio para
C.trachomatis
2ºC-8ºC
1 torunda en 10B o SP-4:
Ureapl-Mycopl
2ºC-8ºC
1º) Masaje prostático por vía rectal
Próstata:
Orina
Secreción
prostática
Vagino-rectal:
exudado
2º) Opción A: Meares-Stamey: orina
4 frascos estériles con cierre a
inicial,
chorro
medio,
secreción
rosca
prostática orina postmasaje
2ºC-8ºC
2º) Opción B: Curtis-Nickel: orina pre y 2 frascos estériles con cierre a
postmasaje
rosca
2ºC-8ºC
2 torundas con medio de
Arrastrar por el canal del parto con transporte Stuart-Amies:
torundas (algodón o alginato cálcico)
porta/cultivo, de Estreptococo
gr. B
35ºC
Tabla 2. Resumen de los Procedimientos microbiológicos de Toma de muestra y Transporte en
infecciones genitales y/o ETS
19
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Origen de
muestra
Vagina:
exudado
Vulva
(labios y
glándulas De
Bartolino y
Skene)
Rectal: exudado
Faringeo:
exudado,
úlceras.
Método
Recipiente
2 Torundas con medio de
transporte Stuart-Amies: Porta
pH y test aminas
/ Cultivo
Caldo de Roiron y de Diamond
Espéculo sinLubrificante
para Trichomonas
Aspirar con torunda (alginato cálcico o
Tubo Affirm VP III*:
dacrón) del fondo del saco vaginal
Gardnerella, Cándida y
Trichomonas
Temperatura
35ºC
37ºC
Tª ambiente
Torunda (alginato cálcico o dacrón) de Torunda sin medio de
las paredes de la vagina
transporte para C.trachomatis
2ºC-8ºC
1 Vial en atmósfera anaerobia
o 2 torundas con medio
transporte anaerobios: porta /
cultivo
Tª ambiente
Preparar piel con solución de NaCl 0,85%
(no utilizar alcohol en mucosas).Torunda
alginato cálcico o dacrón o aspirado
(absceso glándula Bartolino)
2 torundas con Stuart-Amies:
porta/cultivos
1 torunda sin medio de
transporte para C.trachomatis
Caldo de Roiron y de Diamond
para Trichomonas
1 torunda en 10B o SP-4:
Ureaplasma/Mycoplasma
Torunda de alginato cálcico o dacrón por 2 Torundas con medio de
esfínter anal, no heces, 3 cm, 20” y rotar transporte Stuart-Amies: Porta
Depresor lingual. Frotar con la torunda / Cultivo de Gonococo
alginato cálcico o dacrón sobre las zonas 1 torunda sin medio de
afectadas.
transporte para C.trachomatis
Torunda con medio transporte
Stuart-Amies: Cándida,
Surco
Frotar con torunda de algodón o
Estreptococo gr. B
balanoprepucial:
alginato cálcico por el surco
exudado
Torunda con medio transporte
anaerobios
Tubo con gel para Treponema
Extracción sangre
pallidum, VHS, Chlamydia
Empapar en solución salina estéril con Portaobjetos o Tubo capilar
gasa
para
Ulceras:
Preparar portas o aspirar líquido en tubo T. pallidum y K. granulomatis
secreciones
Torundas con medio de
Frotar con torunda de alginato cálcico transporte para VHS, H.
(no para virus) o dacrón
ducrey, y sin medio para
C.trachomatis
Verrugas: tejido
Torunda con medio de
Frotar con torunda de dacrón, con
y líquido
transporte específico PCR para
raspado previo
interno
HPV
35 ºC
2ºC-8ºC
37ºC
2ºC-8ºC
35ºC
2-8ºC
35ºC
Tª ambiente
2ºC-8ºC
Tª ambiente
2ºC-8ºC
2ºC-8ºC
Tabla 2 continuación. Resumen de los Procedimientos microbiológicos de Toma de muestra y
Transporte en infecciones genitales y/o ETS
20
Diagnóstico microbiológico directo
Capítulo 4
Diagnóstico microbiológico directo
4.1 Visualización directa
4.1.1 Fresco
Técnica
El examen en fresco es de fácil realización, rapidez y bajo coste, tiene una alta especificidad pero
escasa sensibilidad, dependiendo del observador. Para su realización se mezcla en un
portaobjetos una gota de secreción uretral o vaginal con una gota de suero fisiológico o salino al
0,5% atemperado a 37ºC, se pone un cubreobjetos y se observa al microscopio a x40.
Se realiza directamente del aspirado del fondo de saco de la vagina, o en su defecto de una de
las dos torundas que llegan al laboratorio con el flujo.
Valoración
Además de observar la presencia de leucocitos polimorfonucleares, levaduras y células clue, se
procederá a buscar la presencia de Trichomonas vaginalis: célula algo más grande que un
21
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
leucocito y con presencia de flagelos, con forma de pera, y con el característico movimiento
rotatorio sobre su eje, vacilante, y a veces en espasmos.
Video recomendado:
http://www.microbiologybytes.com/video/Trichomonas.html
4.1.2 Sedimento urinario
Técnica
Es preferible centrifugar la muestra recogida con el fin de obtener el sedimento urinario para el
examen e identificación microscópicos.
Se describe aquí de forma abreviada el procedimiento:
o
Preferiblemente la primera orina de la mañana, obtenida por la técnica de la recogida
de la porción media del chorro tras lavado de los genitales con agua y jabón, o
cualquier otro método que no contenga antisépticos.
o
Homogenizar y atemperar la muestra.
o
Verter 10 ml en tubo cónico, inerte y de plástico.
o
Centrifugación: 5 minutos, a 450 fuerza centrífuga relativa FCR, que viene a equivaler
a unos 1500 r.p.m., dependiendo del radio de cada centrífuga.
o
Esto equivale a un factor de concentración de 1/20, es decir, 0.5 ml.
o
La decantación puede conducir a pérdidas, por lo que se recomienda aspirar el
sobrenadante por vacío o aspirado con pipetas.
o
Resuspender el sedimento suavemente, evitando agitaciones fuertes.
o
Colocar 20 microlitros sobre el porta y colocar encima un cubre de 24x24 mm.
o
Examinar primero con el objetivo de 10x para los elementos formes grandes, vg:
cilindros y células renales.
o
Con el objetivo de 40x se observan los elementos formes pequeños, que es donde se
ha de hacer el recuento: leucocitos, hematíes, células descamativas y cristales. Bajo
este aumento es donde se ha de valorar también la bacteruria y parásitos.
o
Para el estudio de rutina utilizar luz central, amortiguada, lo que se logra con facilidad
descendiendo el condensador de la mayoría de los microscopios. La iluminación
oblicua, producida al hacer oscilar ligeramente el espejo fuera del eje óptico, se
puede utilizar para la identificación de elementos delicados, por ejemplo, cilindros
hialinos. (La iluminación adecuada es crucial para obtener resultados exactos).
Valoración
En caso de Uretritis y Prostatitis la presencia de más 10 PMN por campo, (x40), en el sedimento
de la orina, será indicativo de probable infección bacteriana.
22
Diagnóstico microbiológico directo
La presencia de Trichomonas se determina por centrifugado del primer chorro de orina matinal,
observando su movilidad en el sedimento. Esta técnica es poco sensible, con muchos falsos
negativos.
4.1.3 Tinción de Gram
Técnica
Primero se ha de hacer una impronta sobre un portaobjetos, utilizando: si es para anerobios,
una gota del aspirado o una de las torundas con medio de anaerobios; y si es para aerobios, una
de las dos torundas de alginato cálcico o dacrón con el medio de transporte Amies, que se haya
enviado al laboratorio, con el exudado correspondiente. Dejar secar.
A posteriori se procederá a la tinción, con la siguiente secuencia:
1.
El frotis fijado con calor se tiñe un minuto con cristal violeta, se lava con agua.
2.
Se cubre con solución yodada durante un minuto y se lava de nuevo con agua .
3.
Decolorar con mezcla de alcohol etílico/ acetona. Escurrir.
4.
Cubrir con safranina (color de contraste) durante veinte segundos. Lavar y secar.
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del
Laboratorio de microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos,
positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tinción de Gram.
Esta tinción se llama así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844.
Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que
ver con carga eléctrica, sino simplemente designa dos grupos morfológicos distintos de
bacterias).
Las bacterias Gram-positivas y Gram negativas se tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere la rigidez es el peptidoglicano.
La pared de la célula Gram -positiva es gruesa y consiste en varias capas interconcectadas de
peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula
Gram-positiva es peptidoglicano. La pared celular de la célula Gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una
membrana exterior compuesta de fosfolipidos, lipopolisacaridos y lipoproteinas. Sólo un 10% 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.
23
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de
la pared celular de las distintas bacterias, describimos aquí con algún detalle la tinción de Gram y
las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento.
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal
violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el
exceso de colorante. En este caso, todas las células, tanto las Gram-positivas como las Gramnegativas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente
activo es aquí I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma
un complejo insoluble con agua con el cristal violeta. De nuevo tantas las células Gram positivas
como las Gram negativas se encuentran en las misma situación.
Después de la decoloración, usando una mezcla de alcohol- acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta, algunos organismos (grampositivos) no se decoloran,
mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia entre esos dos tipos de células está
por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla alcohol-acetona es un solvente lipídico
y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplasmática a la que se une el peptidoglicano). La delgada capa de petidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a
causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son
permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el complejo cristal violetayodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células
grampositivas son todavía azules pero las gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo como la safranina o la fucsina básica. Después de la
decoloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las Gram positivas
son azules.
Por último deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:
1.
El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo
por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2.
La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción
las células grampositivas. El proceso de decoloración debe ser corto y es esencial
un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3.
Cultivos mas viejos de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo
cristal violeta-yodo.
4.
Las bacterias anaerobias pueden aparecer como Gram-variables debido a
encontrarse en condiciones adversas.
24
Diagnóstico microbiológico directo
Valoración
Se debe observar con el objetivo de x100 con aceite de inmersión, durante al menos 2 minutos.
o
Exudado uretral: valoraremos la presencia de uretritis microscópica definida por la
observación de más de 4 PMN por campo microscópico (1.000 aumentos). Esta
coloración también permite la observación de Neisseria gonorrhoeae, diplococos
gramnegativos intrapolimorfonucleares, ovales, arriñonados y en parejas intra y
extracelularmente. La tinción de Gram es una técnica rápida y tan sensible como el
cultivo en la uretritis sintomática en hombres, pero es poco sensible en otras
localizaciones.
o
Exudado cervical: se visualiza la presencia de PMN, tomando como criterio de
cervicitis microscópica la existencia de más de 20 PMN por campo microscópico de
1.000 aumentos. También podemos observar la presencia de N. gonorrhoeae
(diplococos gramnegativos intracelulares).
Imagen recomendada:
http://www.microbelibrary.org/library/Gram-stain/2593-Gram-stain-from-neisseriagonorrheae-infection
o
Exudado vaginal:
-
Vaginosis bacteriana: su diagnóstico se realiza mediante tinción de Gram del
exudado vaginal, determinando la cantidad relativa de los morfotipos
característicos de la microbiota vaginal alterada (bacilos grampositivos,
gramnegativos y bacterias curvas), la presencia de células clave (células
epiteliales tapizadas de morfotipos grampositivos y gramnegativos que pierden
los contornos) y el recuento de leucocitos por campo. Valorar según el cálculo de
Nugent Score (tabla 3).
-
Vaginitis infecciosa: la presencia de abundantes levaduras, en gemación o
pseudohifas, así como de tricomonas, junto con el recuento de leucocitos, nos
diagnostica una vaginitis por Cándidas o por Trichomonas.
Ilustraciones recomendadas:
http://pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplines/sti/biotechn/frottisvaginal.htm
-
Secreción de úlcera: sería patognomónica del chancroide la presencia de la
típica imagen en "banco de peces" con bacilos gramnegativos pequeños
pleomórfico (H. ducreyi, sin embargo presenta muy baja sensibilidad.
-
Aspirado de EPI o bartholinitis: buscar la presencia de cualquier microrganismo.
25
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Lactobacilli,
Bacilo
grampositivo
≥ 30
5-30
1-4
<1
0
SCORE
Gardnerella,
Bacteroides
cocobacilo Gram variable
SCORE
0
1
2
3
4
0
<1
1-4
5-30
≥ 30
0
1
2
3
4
Mobiluncus sp
Bacilos
gramnegativos
curvados
0
<1
1-4
5-30
≥ 30
SCORE
SUMA
SCORE
0
1
1
2
2
0
3
5
8
10
Ilustraciones recomendadas: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2010/11/bacterial-vaginosis.html
Tabla 3. Cálculo de Nugent Score
4.1.4 Microscopio campo oscuro
Técnica
Se le llama también ultramicroscopio y es un microscopio óptico ordinario cuyo sistema
condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados, de tal modo
que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta
disposición, la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro.
La microscopía de campo oscuro hace posible la observación en estado vivo de partículas y
células que de otra manera estarían por debajo de los límites de resolución del microscopio
óptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha
sido ampliamente usada en el estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema
pallidum.
Valoración
A partir del exudado de la lesión del chancro se observa al microscopio de campo oscuro bajo
porta y cubreobjetos, en la que se podrán apreciar las espirales con movimiento en sacacorchos,
siempre y cuando no hayan transcurrido más de 20 minutos desde su recogida. Este
procedimiento es sólo válido para lesiones genitales, ya que no diferencia treponemas
patógenos de saprófitos en muestras de boca y ano.
4.1.5 Tinción de Giemsa
Técnica
La tinción de Giemsa es un método habitual para al examen de frotis sanguíneos, cortes
histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Se puede emplear para parásitos sanguíneos y
bacterias intracelulares. Estos organismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro
del citoplasma de la célula huésped.
La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: Los tintes neutros utilizados combinan
el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de
26
Diagnóstico microbiológico directo
colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se
tiñan de purpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar
idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe de estar entre 6.4 y 6.9.
Siempre que sea posible la impronta en el portaobjetos se hará en la misma consulta, si no, se
realizará en el laboratorio de Microbiología a partir del aspirado de las úlceras genitales. Una
vez que esté totalmente seco se procederá a la tinción:
o
Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10 minutos.
o
Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios.
o
Aclarar con xilol, 3 cambios.
Valoración
Una buena tinción permitirá observar las células de los siguientes colores: Citoplasma-rosa;
Núcleos-azul; Eritrocitos-rosa-naranja; Gránulos de PMN: púrpura; Bacterias y Parásitos-azul.
Buscaremos la presencia de los Cuerpos de Donovan, que son inclusiones de la Klebsiella
granulomatis con localización intracitoplasmática en las grandes células mononucleares e
histiocitos. Las células mononucleares tienen un diámetro entre 25-90 µm, mientras que las
dimensiones de los cuerpos de Donovan son de 0,5-0,7 por 1-1,5 µm y pueden estar
encapsulados o carecer de cápsula.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.infocompu.com/adolfo_arthur/granuloma_venereo.htm
4.2 Cultivo
En la sección de siembra del Laboratorio de Microbiología se procede al cultivo de las muestras
en función del contenedor y origen de la muestra.
Cultivos convencionales
4.2.1 Siembra
A) Vial en atmósfera anaerobia o torunda con medio transporte de anaerobios, con aspirado
de glándulas genitales y/o ETS
Método de siembra
La muestra se procesa antes de 15 minutos desde su recepción y si es posible, en una cámara de
anaerobiosis.
o
Aspirado: El material purulento se mezcla bien con la ayuda del agitador Vortex.
27
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
o
Torunda: se exprime en un pequeño volumen de caldo mediante movimientos
rotatorios sobre las paredes del tubo y este caldo se procesa como una muestra
líquida.
Una vez homogeneizada la muestra, depositar 1 gota del pus, o 2-3 gotas si es líquido, en cada
uno de los medios de cultivo (para extender con estrías por agotamiento), una gota en un
portaobjetos para la tinción de Gram y el resto en el medio de enriquecimiento.
Medios de cultivo
La mayoría de estas bacterias requieren para su crecimiento vitamina K1 y hemina. Para su
aislamiento e identificación presuntiva se aconseja utilizar una combinación:
Medios enriquecidos: agar Brucella o agar Schaedler, y caldo de tioglicolato.
Medios selectivos: Agar con alcohol fenil-etílico (PEA), agar Brucella o agar Schaedler con
antibióticos.
Medios selectivos y diferenciales: Agar Bacteroides bilis esculina con amicacina (BBE).
Las placas se han de incubar en atmósfera anaerobia, a 35-37º C, hasta las 24h (cámaras) o 48h
(jarras o bolsas), mientras que el medio líquido de enriquecimiento entre 7 y 10 días.
B) Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado líquido de órganos internos
Los líquidos corporales habitualmente estériles, como ascítico, amniótico, etc. se inoculan en
frascos de hemocultivo para aerobios y anaerobios, reservando un pequeño volumen para hacer
una tinción de Gram. A diferencia de otros líquidos, el amniótico y los líquidos obtenidos por
culdocentesis no necesitan centrifugarse antes de realizar esta tinción.
Se recomienda incubar los frascos durante un período de 5 a 7 días. La temperatura óptima de
incubación es de 35 a 37ºC.
C) Torunda alginato cálcico o dacrón en medio Stuart-Amies con exudados genitales y/o de ETS
Método de siembra
Con estrías por agotamiento, para aislamiento (ilustración 2):
o
Paso 1: Hacer rotar la torunda varias veces en uno de los cuadrantes de la placa, cerca
del borde de la placa.
o
Paso 2, 3, 4: Con un asa estéril realizar estrías desde la zona de la descarga por el
resto de los cuadrantes de las placas, cada vez cogiendo una porción del inoculo
menos denso.
o
Paso 5: Algunos laboratorios recomiendan pinchar el agar sangre con el asa después
de haber rayado la placa, para favorecer la producción de hemólisis.
28
Diagnóstico microbiológico directo
Ilustración 2. Siembra para aislamiento en placa
Los medios de cultivo
Se deben inocular comenzando por el medio más general hasta el más selectivo:
o
Agar chocolate y Agar Sangre.
o
Thayer-Martin, agar Sabouraud, agar CNA o Granada, Mc Conkey.
Agar Sangre: es un medio general enriquecido con 5% sangre, para el crecimiento y aislamiento
de la mayoría de las bacterias patógenas y de algunos hongos. Sirve de ayuda para definir las
propiedades hemolíticas de los Streptococos. Se ha de incubar a 35ºC± 2ºC hasta las 24h.
Agar Chocolate: como el agar sangre pero enriquecido con sustancias nutritivas y calentado
hasta liberar el grupo hemo. Promueve el crecimiento de algunas bacterias de desarrollo difícil,
vg: Neisseria o Haemophilus. Incubar a 35ºC ± 2ºC en atmósfera enriquecida al 5% de CO 2, y
examinar cada 24h hasta las 48 horas.
Agar Thayer Martin, Martin Lewis o New York City: medios selectivos por la adición de
antibióticos, para el crecimiento y aislamiento del gonococo. Se ha de incubar en ambiente
húmedo y con 5% de CO2 a 35ºC ± 2ºC. Ha de examinarse cada 24h hasta las 72 horas.
Agar Sabouraud: medio selectivo por su mínima cantidad en nutrientes y pH bajo, adecuado
para el crecimiento y aislamiento de levaduras y hongos superiores. Incubar a 30ªC ± 2ºC
examinarse cada 24h, hasta las 48h.
Agar CNA: medio selectivo por la adición de antibióticos para el crecimiento de los grampositivos
y al igual que el agar sangre sirve para definir las propiedades hemolíticas de los estreptococos.
A 35ºC ± 2ºC durante 24h.
29
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Agar Granada: medio diferencial y selectivo, mediante antibiótico y colorante, para el
Streptococo agalactiae grupo B. En anaerobiosis a 35ºC± 2ºC hasta 24h. También puede
incubarse en aerobiosis colocando un cubreobjetos sobre la zona de la siembra. Si se desea
maximizar la detección de portadoras puede utilizarse además de la siembra directa en Granada
un caldo de enriquecimiento selectivo, y efectuar subcultivo en agar sangre o medio Granada, si
la placa directa fue negativa.
Agar Mac Conkey o Levine: medios diferenciales y selectivos con colorantes, para los bacilos
entéricos y otras bacterias gramnegativas. A 35ºC ± 2ºC durante 24h.
D) Frasco con Orina
Método de siembra
Por estrías en colchón, semicuantitativo:
Homogenizar la orina. Usar un asa calibrada (0.01 o 0.001ml) y estéril (desechable, de níquelcromo o platino). Introducir el asa inmediatamente por debajo de la superficie líquida y
ascenderla verticalmente.
o
Una vez tomada la muestra se lleva en todo su volumen a la superficie del agar CLED
haciendo una estría a través del centro.
o
El inoculo se disemina en ángulos rectos respecto a al estría primaria.
o
Luego la placa se gira 90º y se disemina el inoculo hasta cubrir toda la superficie.
Ilustración 3. Siembra semicuantitativa en placa
Medios de cultivo
Generalmente se suelen utilizar un medio no selectivo como el Agar sangre y otro selectivo,
como el Agar Mac Conkey o CLED.
Agar CLED: es medio diferencial con cistina y lactosa, para la recuperación de los principales
patógenos de las infecciones urinarias, además proporciona una buena discriminación entre
bacterias gramnegativas sobre la base de la fermentación de la lactosa y morfología, y debido a
30
Diagnóstico microbiológico directo
su baja concentración de electrolitos inhibe el swarming del Proteus spp. Ha de ser incubado a
35-37ºC en atmósfera aeróbica y leerse a las 18-24 horas.
Agar Sangre: ya hemos descrito sus características en la siembra de los hisopos. En las orinas se
siembra en estrías por agotamiento, para aislar las colonias.
4.2.2 Evaluación del crecimiento
A) Placas de agar en anaerobiosis de aspirado de glándulas genitales y/o de ETS
Los medios con crecimiento deben observarse cuidadosamente para detectar todas las colonias
diferentes, independientemente de su tamaño, y proceder a su subcultivo, cada una de ellas se
ha de reaislar en: agar Brucella (anaerobiosis), agar chocolate y agar sangre (ambas en
aerobiosis con 10% de CO2). Las colonias subcultivadas que no crezcan en agar chocolate ni agar
sangre se consideraran en principio anaerobios estrictos y se procede a su estudio. Igualmente
del tioglicolato se deben realizar subcultivos si se aprecia turbidez u otro signo de crecimiento.
B) Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado líquido de órganos internos
La lectura se realiza diariamente durante 7 días. En el caso de que haya crecimiento, se extrae
una muestra del frasco aerobio mediante jeringa y aguja para realizar tinción de Gram y
subcultivos en medios sólidos para aerobios y facultativos (agar sangre, agar chocolate, agar CNA
y agar MacConkey, por ejemplo). Del frasco anaerobio se hacen subcultivos en agar sangre, agar
chocolate y agar sangre para anaerobios.
C) Placas de agar en aerobiosis con exudados genitales y/o de ETS
Neisseria: N. gonorrhoeae es nutricionalmente mucho más exigente que N. meningitidis, de
manera tal que puede crecer únicamente en medios enriquecidos como agar chocolate, pero no
puede crecer en agar sangre, mientras que N. meningitidis puede crecer tanto en agar sangre
como en agar chocolate. Forman colonias pequeñas, bordes lisos e irregulares, grisáceasblanquecinas, traslúcidas y brillantes.
Haemophilus: En Agar sange no crece a no ser que sea a modo de satélite alrededor de
Staphylococcus aureus que hemoliza la sangre. Crece en Agar chocolate formando colonias
pequeñas, convexas de borde regular, grisáceas-transparentes y aspecto brillante. H. ducreyi es
de difícil crecimiento y por tanto este no es su método de diagnóstico (PCR). Cuando se observen
colonias sospechosas se reaislan en Agar sangre y chocolate simultáneamente, para observar el
no crecimiento en Agar sangre característico de este grupo de cocos Gram-negativos.
Levaduras: Puede crecer en Agar sangre y chocolate como colonias pequeñas blanquecinas
secas, con bordes estrellados (C. albicans). Donde mejor crecen es en Sabouraud, con aspecto
blanco cremoso volviéndose más pastosas a medida que envejecen, superficie lisa o rugosa,
generalmente elevadas, tamaño pequeño y olor dulzón agradable.
Estreptococos: crecen en Agar sangre, CNA y Chocolate como colonias pequeñas y diminutas,
grisáceas a blanquecinas. En Agar sangre y CNA se distingue la capacidad hemolítica. El
31
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Streptococcus pyogenes (Grupo A) y el Streptococcus agalactiae (Grupo B) son beta hemolíticos
aunque no los únicos y no siempre. En Agar Granada el EGB produce colonias naranjas o rojas
diagnósticas.
Estafilococos: crecen en Agar sangre y Chocolate, donde forman colonias entre pequeñas y
moderadas, circulares, opacas y lisas, que pueden ser blanquecinas, cremosas o doradas. La
actividad hemolítica es variable.
Enterobacterias: en Agar sangre forma colonias grandes y medianas, mucosas y grises y
brillantes prácticamente indistinguibles. En los medios Agar Mac Conkey o Levine dan lugar a
colonias diferenciables por el color (según fermenten la lactosa) y olor. Klebsiella granulomatis
es de difícil crecimiento y por tanto esta no es su vía de diagnóstico (Gram).
Ilustraciones recomendadas:
http://www.microbiologyinpictures.com/index.html
http://www.biomerieux.es/upload/CATALOGO_MEDIOS_DE_CULTIVO_2010_ES.pdf
D) Placas de Agar de Orina
Para la valoración semicuantitativa de la placa de CLED, hay que tener en cuenta el factor del
inóculo: si se sembró con asas de 0.001 ml, cada colonia equivale a 103 UFC/ml; si se usaron asas
de 0.01 ml, cada colonia equivale a 102 UFC/ml.
En la placa de Agar sangre podremos observar mejor la morfología de las colonias por estar más
aisladas, distinguiendo si son: cocos grampositivos (colonias pequeñas, grises blanquecinas),
bacilos gramnegativos (colonias grandes, grises y mucosas), levaduras (colonias pequeñas, secas)
o corinebacterias (colonias diminutas, dejar incubando 48-72 horas).
4.2.3 Pruebas complementarias
Aquí se incluyen también el estudio en Fresco para confirmar las colonias de levaduras, y la
tinción de Gram para las colonias presuntamente anaerobias, gonococos y haemophilus.
A) Prueba de la oxidasa
Se la realizamos a aquellas colonias que sólo han crecido en Agar chocolate y Thayer Martin o
similares, para orientarnos hacia una Neisseria, que daría positiva.
La citocromo oxidasa es una enzima de la cadena de transporte de electrones en la ruta
metabólica de obtención de energía de algunas bacterias.
Consiste en añadir sobre las colonias de la placa de agar nutritivo unas gotas de reactivo oxidasa
(clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 11% en agua), si aparece una coloración azulvioleta el microrganismo es oxidasa positivo, si no aparece esta coloración es oxidasa negativo.
Ilustración recomendada:
http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/oxi.html
32
Diagnóstico microbiológico directo
B) Prueba de la catalasa
La catalasa es una enzima bacteriana que desdobla el agua oxigenada en oxigeno y agua.
Constituye un sistema de defensa bacteriano frente a agentes hiperoxidantes como el peróxido
de hidrógeno (agua oxigenada).
Consiste en añadir sobre las colonias problema unas gotas de H2O2 10 vol. Si aparecen burbujas
de O2 gas el microrganismo es catalasa positiva, y si no aparecen las burbujas seria catalasa
negativo. Nunca debe realizarse esta prueba en colonias sobre medios con sangre porque los
eritrocitos también poseen esta actividad enzimática y podrían producirse resultados falsamente
positivos. Vg: (+) Sthaylococus aureus, (-) Streptococus spp.
Ilustración recomendada:
http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cat.html
C) Prueba de la coagulasa
Objetivo
Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que
genéricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos.
Fundamento
S. aureus posee dos tipos de coagulasa:
o
Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que está unida a la pared
celular. Esta actúa directamen te sobre el fibrinógeno provocando la formación de
coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado
(test en lámina).
o
Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor
sérico (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el
fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).
Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lámina nos sirve como una rápida y económica
técnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarán
negativas en el test en lámina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en
tubo.
Test en lámina
Procedimiento
Se emulsionan sobre un portaobjetos una o más colonias en una gota de suero fisiológico hasta
formar una suspensión lechosa. Luego se agrega, al lado, una gota de plasma citratado de conejo
y se mezclan.
33
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Interpretación de resultados
Debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la
formación de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo.
Test en tubo
Procedimiento
Se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a
35ºC y se chequea la formación del coágulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la
noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en
alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el coágulo luego de 18
horas de incubación y de esta manera se produzcan un test falso negativo.
Interpretación de resultados
Se observa la formación de un coágulo total o parcial si el test es positivo.
Ilustración recomendada:
http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/coag.html
Aglutinación con partículas de látex
Objetivo
Permite separar S. aureus de otras especies de estafilococos. Es un test alternativo para detectar
la presencia de la coagulasa y la proteína A.
Fundamento
Se utilizan partículas de látex cubiertas con plasma. El fibrinógeno se une al látex y detecta el
clumping factor. Además, las inmunoglobulinas presentes en las partículas detectan la proteína
A, capaz de unirse a la porción Fc de la IgG.
La pared celular de S. aureus posee una proteína característica llamada proteína A. Esta tiene la
habilidad de unirse a la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulina G (IgG), y por tanto
funciona como factor de virulencia, ya que interfiere con la opsonización y la ingestión de los
microorganismos por los PMN, activando el complemento y dando lugar a reacciones de
hipersensibilidad inmediata y tardía.
Procedimiento
Se trata de test comerciales por lo cual cada formulación tiene su procedimiento específico.
Generalmente se mezcla el reactivo del test con una porción de la colonia.
34
Diagnóstico microbiológico directo
Interpretación de resultados
La formación de grumos indica un test positivo.
D) Aglutinación estreptococos
Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas poseen antígenos específicos de
naturaleza polisacárida (polisacárido C o ácidos teicoicos) que se encuentran en la pared celular.
La extracción del polisacárido C por diferentes técnicas y su posterior enfrentamiento con
antisueros específicos definen una serie de grupos que se denominan con letras mayúsculas a
partir de la A. La utilidad de la extracción antigénica dependerá del tipo de hemólisis:
o
En los estreptococos ß-hemolíticos se ha confirmado como el mejor método para su
clasificación.
o
En los no ß-hemolíticos, la extracción antigénica sólo es útil para la identificación de
los grupos D y B.
Existen diferentes métodos para la extracción enzimática. Actualmente se utilizan métodos de
extracción rápida por medio de enzimas de extracción. Luego se procede a la identificación del
polisacárido por medio de técnicas de aglutinación con partículas de látex que tienen absorbido
el antisuero específico. También existen en el mercado kits comerciales que utilizan técnicas de
coaglutinación, como la que a continuación se describe.
Coaglutinación
Pueden usarse tres diferentes procedimientos para la preparación de muestras con Phadebact®
Streptococcus Test.
o
Cultivos primarios: a partir de 1-5 colonias hemolíticas cogidas directamente de la
placa, se les hace reaccionar con una gota de cada reactivo.
o
Procedimiento opcional de extracción directa de colonias: debe considerarse en
ocasiones cuando hay un número insuficiente de colonias o se han obtenido
resultados inconclusos por el test de Cultivos Primarios. El método de extracción no
debe usarse con Strep D y Strep F (se recomienda inoculación en caldo).
Se seleccionan 1-3 colonias de estreptococo ß-hemolítico del cultivo primario y se
suspende en una mezcla de extractiva. Se incuba a temperatura ambiente 10-15
minutos o a 100°C un minuto. Enfrentar una gota de la solución con cada reactivo.
o
Inoculación en caldo: se toman una o más colonias de estreptococos ß-hemolíticos de
la placa de cultivo, se inoculan en 2 ml de caldo de enriquecimiento y se incuban a 3537ºC durante la noche o hasta que la turbidez sea igual a Mac-Farland 3.2 densidad
estándar.
35
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Lectura
Debe realizarse dentro de un minuto.
o
Resultado positivo: presencia de grumos visibles.
o
Resultado Negativo: la ausencia de reacción con cualquiera de los reactivos indica que
la bacteria ensayada no pertenece a los microorganismos ensayados.
Ilustración recomendada:
http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/labimage/phadeb.jpg
E) Test de filamentación
Se realiza en aquellas colonias que han crecido en Agar Sabouraud, para identificar si se trata de
Candida albicans, que tienen la facultad de producir tubos germinativos.
Procedimiento
o
Emulsionar una porción de la colonia aislada en 0.5 ml de suero humano.
o
Incubar a 35ºC durante 2h.
o
Depositar una gota de la emulsión sobre un portaobjetos limpio y desengrasado,
colocar un cubreobjetos y visualizar a x400.
Lectura
La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales. Se trata de una extensión filamentosa de
la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la célula
progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre.
Ilustración recomendada:
http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/09/candida_merckmedicus.jpg
Falsos negativos:
o
Aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans son negativas para tubos
germinales.
o
Si se utiliza un inóculo demasiado abundante de levaduras, también pueden
obtenerse falsos resultados negativos.
F) Api 20 A
Esta prueba nos permite la identificación definitiva de las colonias que sólo han crecido en los
medios de cultivo anaerobios.
La prueba está compuesta por 20 microtubos que contienen sustratos deshidratados. Estos se
inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los sustratos. Las reacciones que se
producen durante la incubación se traducen en cambios de color, espontáneos o provocados
mediante la adición de reactivos.
36
Diagnóstico microbiológico directo
IND
URE
ESC
GEL
Azúcares
CAT
La triptofanasa hidroliza y desamina el triptófano con producción del indol, acido
piruvico y amoniaco. El reactivo de Kovacs reacciona con el indol
La ureasa hidroliza la urea liberando amoníaco que forma carbonato de amonio
La esculina es hidrolizada por la  Glucosidasa
La gelatina es hidrolizada por una proteasa
De la fermenetación de los azúcares se liberan ácidos
La catalasa hidroliza el H2O2 en H2O y O2 gas
Procedimiento
o
Abrir la ampolla de Api 20A Medium.
o
Inocular las colonias puras obtenidas en el Agar Brucella, con una torunda, en la
ampolla de Api 20A Medium. Alcanzar una turbidez ≥3 McFarland.
o
Para mantener cierta anaerobiosis conviene evitar la introducción de aire durante la
homogenización del inoculo.
o
Con una pipeta Pasterur estéril, inocular la galería con la suspensión obtenida
(evitando la formación de burbujas al inclinar ligeramente la galería).
o
Para la prueba GEL, llene completamente toda la cúpula.
o
Para la prueba IND, terminar de llenar la cúpula en aceite mineral para evitar la
evaporación. Incubar en anaerobiosis a 36ªC, hasta 48.
Lectura (ver tabla 4)
+
-
o
El púrpura bromocresol (BCP) de cada una de las cúpulas puede resultar asimilado por
la bacteria en algunos pocos casos. Si es así agregue una gota de BCP a los tubos que
contengan carbohidratos y estén incoloros.
o
Prueba de IND. Agregar gota de xilol. Mezclar y esperar 3 minutos. Luego agregar una
gota de reactivo de EHR. Leer 5 minutos después.
o
De acuerdo con los resultados obtenidos, obtenga el perfil numérico y proceda a
identificar la bacteria.
IND
Rojo
Amarillo
URE
Rojo
Amarillo
AZUCARES
Amarillo
Rojo
GEL
Difusión
No
Difusión
ESC
Marrón
Amarillo
AZUCARES
Amarillo
Rojo
CAT
Burbujas
No
Burbujas
Tabla 4. Api 20 A
G) Api NH
Esta prueba nos permite la identificación definitiva de las colonias que han crecido en Agar
Chocolate, Thayer Martin o similares y que en la tinción de Gram presentan aspecto de
diplococo o cocobacilo gramnegativo.
37
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
El Api NH banda consta de 10 microtubos que contienen sustratos deshidratados que permiten
el desempeño de las 12 pruebas de identificación (reacciones enzimáticas o de fermentación de
azúcar), así como la detección de una penicilinasa (especial interés en Haemophilus influenzae,
Haemophilus parainfluenzae, Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) y Neisseria
gonorrhoeae). Las reacciones se producen durante la incubación dando lugar a cambios de color
espontáneos o bien tras la adición de reactivos. Después de un período de incubación de 2 horas
a una temperatura de 35-37ºC, la lectura de las reacciones ese realiza visualmente y la
identificación se obtiene mediante la consulta de la lista de perfiles.
PEN
ODC
URE
La Penicilasa actúa sobre la Penicilina G
La Ornitina descarboxilasa actúa sobre la ornitina y se forman CO2 y aminas
La ureasa hidroliza la urea liberando amoníaco que forma carbonato de
amonio
La lipasa actúa sobre al 5-bromo-3-indoxilocaprato
La fosfatasa alcalina actúa sobre la para-nitrofenil fosfato de 2CHA
La ß galactosidasa actúa sobre la para-nitro-fenil BD-galactopiranósido
La arilmidasa prolina hidroliza la prolina-4-metoxinaftilamida ß
La ɣglutamil transferasa actúa sobre la ɣ-glutamil-4-metoxi-naftilamida ß
La triptofanasa hidroliza y desamina el triptófano con producción del indol,
acido piruvico y amoniaco. El reactivo de Kovacs reacciona con el indol
De la fermentación de los azúares se liberan ácidos
LIP
PAL
ß-GAL
ProA
GGT
IND
Azúcares
Procedimiento
o
Abrir una ampolla de Medio NaCl 0,85% (2 ml) con el protector de ampolla.
o
Con el uso de un hisopo, recoger algunas colonias bien aisladas y preparar una
suspensión con una turbidez equivalente a 4 McFarland, asegurándose de que esté
bien mezclado.
o
Distribuir la suspensión bacteriana preparada en las cúpulas, evitando la formación de
burbujas (inclinar la tira ligeramente hacia delante y coloque la punta de la pipeta en
el lado de la cúpula).
-
Llene el tubo de la parte de los primeros 7 microtubos (PEN a URE): alrededor de
50 microlitros.
-
Llene el tubo y la cúpula de los últimos 3 microtubos LIP / Proa, PAL / GGT, βGAL
/ IND: cerca de 150 l, evitando la formación de un menisco convexo.
o
Cubra las primeros 7 pruebas (PEN a URE) con aceite mineral (pruebas subrayadas). La
calidad de la obturación es muy importante: los tubos que no están suficientemente o
excesivamente llenos pueden causar que los resultados sean falsos positivos o falsos
negativos. Cierre la caja de incubación.
o
Se incuba durante 2 horas a 35-37ºC en condiciones aerobias.
38
Diagnóstico microbiológico directo
Lectura (ver tabla 5)
o
Tenga en cuenta todas las reacciones espontáneas (PEN a βGAL).
o
Añada 1 gota de reactivo B ZYM para microtubos 8 y 9: LIP / Proa y PAL / GGT.
o
Añada 1 gota de reactivo a JAMES microtubo 10: βGAL / IND.
o
Espere 2 minutos y luego leer las reacciones y registrarlo en la hoja de resultados.
-
Si la reacción es positiva LIP (pigmento azul), interpretar la reacción de ProA
como negativas, si el reactivo B ZYM se ha añadido o no.
-
Si, después de un período de incubación de 2 horas, varias reacciones
(fermentación, penicilinasa) están en duda, volver a incubar la banda durante 2
horas y leer las reacciones de nuevo (Las pruebas enzimáticas no se deben volver
a leer en este caso).
amarillo
incoloro
rojo
(-)
incoloro
amarillo
incoloro
(+)
amarillo
azul pp.
incoloro
IND
incoloro
rosa
amarillo
GGT
amarillo
azul
amarillo
Proa
incoloro
amarillo
βGAL
rojo
PAL
amarillo
LIP
rojo
URE
amarillo
ODC
rojo
SAC
amarillo
MAL
rojo
(-)
FRU
azul
(+)
GLU
amarillo
PEN
Tabla 5. Api NH
H) API C AUX
Se trata del sistema de identificación definitivo de levaduras a través de un auxonograma. Se
realiza en aquellas colonias que han crecido en la placa de sabouraud y el test de fermentación
ha resultado negativo.
Procedimiento
La galería Api 20 C AUX se compone de 20 cúpulas que contienen substratos deshidratados y
permiten realizar 19 ensayos de asimilación. Las cúpulas se inoculan con un medio semi agar y
las levaduras crecen solamente si son capaces de utilizar el substrato correspondiente. Las
lecturas se efectúan por comparación con los testigos de crecimiento.
39
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
Se reúne fondo y tapa de la galería y humedecer el fondo con 5ml de agua destilada para crear
una atmosfera húmeda se introduce la galería en la cámara de incubación y procedemos a
preparar el inoculo. Se abre una ampolla de api NaCl 0.85% médium, y se prepara una
suspensión de levaduras con una turbidez 2 de Mcfarland (esta suspensión debe ser preparada
justo después de su preparación), a continuación se llenan las cúpulas evitando la formación de
burbujas, volver a cerrar la cámara de incubación e incubar de 48 a 72 a 30ºC.
Lectura
Pasado el tiempo de incubación, observar el crecimiento, de forma que con una mayor turbidez
que la del control nos indicaría una reacción positiva que se anota en la hoja de resultados. La
identificación se obtiene a partir de un perfil numérico.
4.2.4 Antibiogramas
A) Antibiograma: anaerobios
No se recomienda realizar, de una forma rutinaria, ensayos de sensibilidad a todos los
aislamientos de bacterias anaerobias.
Método
El de dilución en agar es el de referencia para bacterias anaerobias.
Inoculación
A partir de un cultivo en placas de agar Brucella enriquecido para anaerobios, se suspenden de 3
a 5 colonias en un caldo de tioglicolato, que se incuba entre 6 y 24 horas o hasta que alcance una
turbidez adecuada. La turbidez se ajusta a 0,5 McFarland mediante la adición de caldo Brucella.
La inoculación en la superficie del agar se hace con la ayuda de un replicador de Steers. El
5
inóculo final debe ser, aproximadamente, de 10 UFC por punto de inoculación. Se recomienda,
tanto al principio como al final de cada serie, inocular dos placas control sin antibiótico, una se
incuba en una atmósfera con un 5% de CO2 y la otra en anaerobiosis, durante 42-48 h, con el fin
de comprobar la viabilidad y pureza del inóculo. Se debe empezar a inocular siempre por la
concentración más pequeña de cada antibiótico. Incubar 42-48 h en anaerobiosis a 35-37ºC.
Lectura
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se considera como aquella concentración de
antibiótico en la que se observa una reducción marcada en el crecimiento de la bacteria al
compararlo con el crecimiento de la placa control, como es el cambio a una fina película, o a
numerosas colonias pequeñas, o bien a una o varias colonias de tamaño normal.
La interpretación de los valores de CMI obtenidos para cada antibiótico se realiza según los
criterios del documento del NCCLS.
40
Diagnóstico microbiológico directo
B) Antibiograma: gonococo
Método
De difusión con discos en agar.
Inoculación
Se prepara una suspensión 0.5 Mc farland con un escobillón estéril mojamos el escobillón y se
procede a sembrar el inoculo en masivo en placa de agar chocolate, al que se le colocan los
antibióticos seleccionados en cada laboratorio de Microbiología, no más de 5 por placa. Se
incuban las placas en atmosfera CO2 de 16- 20h.
Lectura (ver tabla 6)
Medir los halos de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de antibióticos en
milímetros, y compararlos con las sensibilidades establecidas en las Normas CLSI - NCCLS.
ANTIBIOTICO
Penicilina G
Ceftriaxona
Tetraciclina
Ciprofloxacino
CARGA
10 U
30
microgr
30
microgr
5 microgr
RESISTENTE
≤ mm
26
13
INTERMEDIO
mm
27-46
14-34
SENSIBLE
≥ mm
47
35
30
31-37
38
27
28-40
41
Tabla 6. Interpretación de Sensibilidades para N. gonorrheae
C) Antibiograma: Haemophilus
Método y procedimiento
Procedemos igual que para las neiserias, pero en el medio Haemophilus test medium (HTM), que
es un Mueller Hinton suplementado con factor X, factor V y extracto de levadura. Seleccionamos
los antibióticos específicos del género a los que enfrentar la cepa.
Lectura (ver tabla 7)
Igualmente hacer la lectura según las Normas CLSI - NCCLS.
41
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
ANTIBIOTICO
Ampicilina
Amox+Clav
Cefuroxima
Cefpodoxime
Claritromicina
Aztreonam
Cloranfenicol
Ciprofloxacino
CARGA
microgramos
10
20/10
30
10
15
30
30
5
RESISTENTE
≤ mm
18
19
16
17
10
15
25
15
INTERMEDIO
mm
19-21
17-19
18-20
11-12
16-21
26-28
16-20
SENSIBLE
≥ mm
22
20
20
21
13
22
29
21
Tabla 7. Interpretación de Sensibilidades para Haemophilus
D) Panel de Gramnegativos
Los paneles Gram negativos están diseñados para determinar la sensibilidad a antimicrobianos
y/o la identificación a nivel de especie de bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos.
Después de la inoculación y rehidratación con una suspensión estandarizada del microrganismo
e incubación a 35ºC un mínimo de 16 horas, la concentración mínima inhibitoria (CIM) para el
microrganismo se determina observando la concentración más baja de antimicrobiano que
muestra inhibición del crecimiento.
Método
Turbidez del inoculo estandarizada 0.5 Mc Farland.
Preparación del inoculo
La técnica de turbidez estandarizada se recomienda para la inoculación directa de todos los
bacilos aerobios Gram negativos.
o
Usando una torunda esterilizada o asa bacteriológica, tocar superficie de colonias 4-5
grandes ó 5-10 pequeñas, morfológicamente similares, bien aisladas y procedente de
una placa de agar no selectivo de 18-24 horas.
o
Mezclar con 3ml de agua para inoculo debe de ser esterilizada y destilada, la turbidez
debe ser equivalente a 0.5 Mc Farland. Agitar la suspensión.
o
Con la ayuda de una pipeta se transfiere 0.1 ml de esta suspensión en 25ml de agua
para inoculo con PLURONIC y mezclar.
Inoculación del panel
La inoculación del panel se realiza usando el sistema RENOK, debiendo lograrse una
concentración final de 3-7 x 10 CFU/ml, para verificar la integridad del microrganismo, puede
hacer la prueba de pureza en placa agar Mac Conkey y se deja incubar hasta el día siguiente, si
en la placa crecen dos o más colonias habría que repetir el proceso.
42
Diagnóstico microbiológico directo
Antes de incubar el panel cubrir los pocillos que están subrayados con 3 gotas de aceite mineral.
Incubar el panel de 16-20 horas a 35ºC sin CO2.
Revelado panel después de la incubación
o
Se añade una gota pocillo NIT (REACTIVO NIT 1 Y NIT 2), la reducción de Nitrato a
Nitrito se detecta por la formación de un color rojo, de forma de los estreptococos
son nitrato negativos mientras que la mayoría de los estafilococos son nitrato
positivos.
o
Igualmente se añade 1 gota en el pocillo VP (REATIVO VP1 Y VP2) VOGESPROSKAUER, la reacción daría como resultado color rojo. Las especies que llevan a
cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa aumentan la acetoína en el medio.
Cuando se añade alfanaftol en medio alcalino (KOH), la acetoína se convierte en
diacetilo que reacciona formándose un color rojo.
o Se añade al pocillo TDA 1 gota. Si la bacteria tiene la triptófanodesaminasa,
transformará el triptófano en indolpirúvico y amoniaco. El cloruro férrico, en caso de
que haya ácido indolpirúvico originará una coloración pardo-rojiza.
o
Se añade al pocillo IND 1 gota. Existen bacterias que producen triptofanasa que
convierte el triptófano en indol. La presencia de indol se ensaya añadiendo
dimetilaminobenzaldehído.
Lectura
Se realiza de forma automática en el equipo autoSCAN®-4 System.
E) Panel de Grampositivos
Los paneles positivos microScan están diseñados para determinar la sensibilidad a agentes
antimicrobianos y/o la identificación a nivel de especie de aerobios facultativos de crecimiento
rápido y de cocos Gram positivos, algunos cocos aerobios exigentes Gram positivos y Listeria
monocytogenes.
Método, preparación del inoculo e inoculación del panel
Igual que para los Gramnegativos. Únicamente, en la inoculación del panel, la prueba de pureza
se ha de hacer en placa de agar sangre.
Revelado panel después de la incubación
o
Se añade una gota pocillo NIT (REACTIVO NIT 1 Y NIT 2), la reducción de Nitrato a
Nitrito se detecta por la formación de un color rojo.
o
Igualmente se añade 1 gota en el pocillo VP (REATIVO VP1 Y VP2)
PROSKAUER, la reacción daría como resultado color rojo.
43
VOGES-
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
o
Se añade una gota de reactivo PYR la reacción de la peptidasa daría lugar a una
reacción de color rojo. S.pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el
substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil
aminopeptidasa.
Lectura
Se realiza de forma automática en el equipo.
Cultivos especiales
4.2.5 Cultivo de trichomonas
Actualmente, el cultivo en los caldos de Roiron y de Diamond se considera el método de
referencia para el diagnóstico de la tricomoniasis. Es fácil de realizar, de bajo coste y requiere un
inóculo de tan solo 300 a 500 tricomonas/ml. Su principal inconveniente es el tiempo de
incubación ya que se requieren de dos a siete días para identificar el parásito.
Los cultivos, incubados a 37ºC, se deben observar al microscopio un mínimo de 1 minuto en los
días 2 y 5 tras la inoculación.
Frasco con Orina o Secreción prostática
o
Orina: se recogen 10 ml, se centrifugan a 1500xg durante 10 minutos y se inoculan 50
µl del sedimento en el caldo de cultivo.
o
Semen: se deja licuar a temperatura ambiente durante 1 hora antes de procesar, se
centrifuga a 2000xg durante 10 minutos y se inoculan 50 µL del sedimento en el
caldo.
Torunda alginato cálcico o dacrón en Caldo de Roiron o de Diamond con exudades genitales
Los exudados de la uretra y de la vagina recogidos con la torunda, se inoculan directamente
sobre el caldo. Si esto no se ha realizado en la consulta y solicitan expresamente búsqueda de
Trichomonas, se procederá a la inoculación en el laboratorio de forma inmediata.
4.2.6 Cultivo mycoplasmas y ureaplasmas
Torunda alginato cálcico o dacrón en caldo 10B o SP-4 para Mycoplasmas y Ureaplasmas con
exudados genitales y/o ETS.
A) El sistema Mycoplasma IST 2 contiene unos viales R1 con el caldo de transporte (tipo 10B o
SP-4), otros viales R2 con un caldo selectivo de urea-arginina y una galería con medio específico
y distintas concentraciones de antibiótico. Permite determinar la presencia de Ureaplasma
urealyticum y de Mycoplasma hominis, aproximar su concentración, y estudiar la sensibilidad
frente a nueve antibióticos. La distribución de las 22 cúpulas de la galería es la siguiente (ver
tabla 8).
44
Diagnóstico microbiológico directo
Procedimiento
1.
Después de la toma de la muestra, desprender el contenido de la torunda o la muestra
líquida (200 µl) en el vial R1. Si esto no se ha realizado en la consulta y en el laboratorio se
recibe la muestra, se procederá a la inoculación en el laboratorio de forma inmediata.
2.
Homogeneizar
3.
Transferir 3 ml de R1 al vial R2 (caldo urea-arginina).
4.
Homogeneizar con vortex hasta conseguir que el liofilizado de R2 se disuelva
completamente.
5.
Dispensar 55 µl del caldo R2 en las cúpulas de la galería (R3). En el vial R2 quedará caldo
urea-arginina sobrante que se incuba .
6.
Añadir dos gotas de aceite de parafina a cada cúpula de la galería.
7.
Colocar la tapa de la galería.
8.
Incubar el resto del caldo urea-arginina y la galería durante 48 horas a 36ºC ± 2ºC.
Controles
o
La cepa recomendada para el control de calidad es Ureaplasma urealyticum ATCC
27813.
o
Realizar dos subcultivos en el caldo R2 urea-arginina con incubación intermedia antes
de inocular la galería con 15-30 µl de R2.
Obtención y expresión de resultados
Al crecer los microrganismos liberan iones amonio de sus respectivos sustratos y producen
cambio del color del medio, gracias al indicador Rojo Fenol.
o
o
Caldo R2 urea-arginina: leer a las 24 horas. Si es negativo, reincubar 24 horas más.
-
Color amarillo: resultado negativo
-
Color rojo: resultado positivo
-
Si el caldo permanece limpio: Ureaplasma urealyticum
-
Si el caldo muestra opalescencia: Mycoplasma hominis.
- Galería:
-
4
A las 24 horas: leer solamente la cúpula 4 (U. urealyticum > 10 ucc/ml).
-
4
Resultado positivo (color rojo) indica U. urealyticum en recuento >10
ucc/ml.
45
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
-
-
Resultado negativo (color amarillo). Indicaría que en el caso de que la galería
fuese a las 48 horas positiva para U. urealyticum, el recuento sería ≤ 104
ucc/ml.
Leer a las 48 horas el resto de cúpulas. El cambio de color de naranja a rojo,
significa crecimiento.
-
La cúpula 1 debe virar si algún resultado es positivo
-
Cambios de color en las cúpulas 2 y 4, indican presencia de U.urealyticum, en
recuento superior o inferior a 104 ucc/ml en función del crecimiento en la
cuarta cúpula en la lectura de 24 horas.
-
Las cúpulas 3 y 5 se interpretan para Mycoplasma hominis. La cúpula del
recuento, se lee a las 48 horas exclusivamente.
-
Cada antibiótico está depositado a dos concentraciones críticas distintas en
dos pocillos:
Nº
Lectura
1
48 h
0
(-)
(+)
Naranja
Rojo

Crecimiento en los dos indica resistencia

Ausencia de crecimiento en los dos indica sensibilidad

Crecimiento en el de concentración más baja y ausencia de
crecimiento en el de concentración más elevada, se interpreta como
un resultado intermedio.
2
48 h
Ureaplasma
urealyticum
Naranja
Rojo
3
48 h
Micoplasma
hominis
Naranja
Rojo
4
24h / 48h
U.urealyticum
≥104ucc/ml
Naranja
Rojo
5
48 h
M.hominis
≥104ucc/ml
Naranja
Rojo
(-)
(+)
6-22
48 h
[Atb] baja
Naranja
Rojo
[Atb] alta
Naranja
Rojo
1. Indicador de crecimiento
2. Contiene lincomicina. Selectiva para U. urealyticum
3. Contiene eritromicina. Selectiva para M. hominis
4
4 y 5. Efecto dilución. Permiten el recuento (>10 ucc/ml)
6 a 22. Ensayan la sensibilidad a 9 antibióticos: doxiciclina, josamicina, ofloxacino, eritromicina, tetraciclina,
ciprofloxacino, azitromicina, claritromicina y pristinamicina
Tabla 8. Galería de Mycoplasma y Ureaplasma
B) El agar diferencial A7 y varias modificaciones del mismo, (A7B, A8) son particularmente útiles
porque permiten el crecimiento de M. hominis y U. urealyticum y diferencian una especie de
otra por la morfología de la colonia. Combina una base nutritiva a base de peptonas, suero de
caballo y factores de crecimiento (cisteina, PolyVitex, arginina, urea) que favorecen el desarrollo
de las colonias de micoplasma. La mezcla antibiótica del medio, inhibe el crecimiento de
bacterias grampositivas y gramnegativas.
El subcultivo en placa de agar se hará a partir del caldo R2 urea-arginina. Debe ser realizado
rápidamente una vez que se produce el cambio de color, para evitar la pérdida de viabilidad.
46
Diagnóstico microbiológico directo
Este problema se evita en parte con el uso de diluciones seriadas. Los subcultivos aumentan las
posibilidades de aislamiento, ya que algunas cepas no crecen en el agar inoculado inicialmente.
Dispensar en cada placa 3 gotas (1 gota=10 µl) del caldo, sin estriar y sin que confluyan las gotas.
Dejar secar las placas 5 minutos a temperatura ambiente. Deben incubarse en 5-10% CO2 a 37ºC,
hasta 3-4 días.
La lectura de las placas se puede hacer con microscopio invertido orientando la superficie del
agar hacia arriba, o con microscopio estereoscópico de epiiluminación orientando la superficie
hacia abajo, con el objetivo de 10x, un mínimo de tres campos de cada gota depositada.
o
Las colonias de Ureaplasma spp. presentan un aspecto característico de "erizo de
mar". Se manifiestan a los 1-2 días, con el desarrollo del color marrón oscuro por a la
deposición de sales de manganeso (agar A7) o de CaCl2 (agar A8) sobre la colonia, y
son del tamaño de 15-50 µm de diámetro.
o
Las colonias de M. hominis aparecen con su aspecto característico de "huevo frito". A
los 2-3 días presentan un tamaño entre 100-300 µm de diámetro.
o
El título de la muestra se estima a partir del número de colonias presentes por campo,
teniendo en cuenta si se ha realizado una dilución y el volumen inicial de la muestra.
(Ver tabla 9)
Colonias por campo
(objetivo 10x)
UFC en el inóculo
<1
1-5
5-15
>15
103 UFC
4
10 UFC
105 UFC
106 UFC
Tabla 9. Recuento en placa de Mycoplasma y Ureaplasma
Ilustración recomendada:
http://www.biomerieux.es/upload/CATALOGO_MEDIOS_DE_CULTIVO_2010_ES.pdf
4.3 Pruebas de detección rápida de antígeno
4.3.1 Frascos con orina y torundas de alginato cálcico o dacrón sin medio de
transporte con exudados genitales
A) Chlamydia trachomatis
Existen dos tipos de procedimientos para la detección de antígenos de C. trachomatis: la
inmunofluorescencia directa (IFD) con anticuerpos monoclonales y los enzimoinmunoanálisis
(EIA). En esta segunda categoría se incluye una gran variedad de formatos como son los ensayos
clásicos en microplaca, los ensayos automatizados y las pruebas rápidas.
47
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
La IFD se basa en el empleo de anticuerpos monoclonales (AcMo), y sólo se recomiendan los
dirigidos a la proteína principal de la membrana externa de C. trachomatis, Omp1.
Los EIA son métodos de diagnóstico apropiados para laboratorios que reciben una gran cantidad
de muestras, ya que son procedimientos automatizados o semi-automatizados.
Las pruebas rápidas no constituyen procedimientos de laboratorio sino que son técnicas
diseñadas para emplear en la consulta de atención primaria, como apoyo al diagnóstico clínico y
son buenas herramientas para tamizaje a nivel de consulta primaria. Proporcionan además resultados inmediatos lo que a su vez permite tratamiento inmediato, disminuyendo la pérdida de
pacientes. Sin embargo, su especificidad es inferior a la de los ensayos convencionales y dado
que la prevalencia en laboratorios es baja o moderada, tienen bajo valor predictor positivo.
Describimos a continuación el test Clearview Chlamydia MF por su facilidad de uso y estar
ampliamente extendido.
Clearview Chlamydia MF (Unipath)
Se trata de una técnica rápida de inmunocromatografía directa para la detección cualitativa de
antígenos de Chlamydia trachomatis. Esta prueba permite detectar antígeno de Chlamydia en la
orina (varones) o en el exudado endocervical de pacientes infectadas por este microrganismo.
Los antígenos de Chlamydia se extraen con un reactivo de específico para este fin a partir de la
muestra tomada con un hisopo o del sedimento de orina por calentamiento a 80ºC. Una vez
extraídos los antígenos, se añade este extracto sobre la tira absorbente en la ventana diseñada
para poner la muestra. La tira absorbente contiene microesferas de color marcadas con
anticuerpos monoclonales frente al lipopolisacárido género-específico de Chlamydia.
El extracto moviliza las microesferas que se desplazan hacia la cinta de prueba fijada en el
soporte (Ilustración 4). Dicha cinta contiene una zona de anticuerpos monoclonales antiChlamydia inmovilizados en la ventana de resultados. En el caso de que el extracto contenga
antígenos de Chlamydia, éstos se mezclarán con los anticuerpos unidos a las microesferas de
color y los anticuerpos inmovilizados en la ventana de resultados. Se observará la aparición de
una línea bajo la ventana de resultados que indica la presencia de antígenos de Chlamydia en el
extracto. Si no hay antígenos presentes, la ventana de resultados permanecerá vacía.
48
Diagnóstico microbiológico directo
Ilustración 4. Fundamento de la técnica Inmunocromatografía directa
Procedimiento de extracción
Ilustración recomendada:
http://www.biolinker.com.ar/productos/PDF_ALERE/Clearview/Clearview%20Chlamydia%20MF.pdf
Muestras endocervicales
o
Reactivo de extracción 1 a un tubo limpio, hasta la línea que figura en el mismo.
Sumergir la torunda en el reactivo 1 y agitar al menos durante 5 segundos. Colocar el
tubo de extracción que contiene la torunda en la fuente de calor a 80ºC y dejar de 10
a 12 minutos.
o
Retirar el tubo de extracción de la fuente de calor. Rotar la torunda en el tubo de
extracción durante al menos 5 segundos. Escurrir el líquido de la torunda
presionándola contra el borde del tubo de extracción, y posteriormente sacar la
torunda con suavidad. Desechar la torunda. Dejar enfriar el extracto durante al menos
5 minutos a temperatura entre 18 y 30ºC.
o
El extracto puede conservarse a temperatura entre 18 y 30ºC durante un máximo de
3 horas.
Muestra de orina masculina
o
Mezclar por inversión la muestra de orina. Transferir 10 ml de la muestra de orina a
un tubo de centrifugación y añadir 10 ml de agua destilada. Centrifugar la muestra a
3000xg durante 15 minutos. Recoger cuidadosamente el líquido sobrenadante y
desechar. Mantener invertido el tubo y quitar los residuos de líquido sobrenadante
del borde del tubo con papel secante.
o
Con una pipeta, tomar 0,6 ml del reactivo de extracción en el tubo de centrifugación.
Mezclar en "vortex" durante un tiempo mínimo de 30 segundos. Transferir el
sedimento resuspendido a un tubo de extracción limpio. Colocar en la fuente de calor
y calentar a 80ºC durante 10-12 minutos.
49
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
o
Retirar el tubo de extracción del calefactor. Dejar enfriar la muestra durante, al
menos, 5 minutos a una temperatura entre 18 y 30ºC.
o
El extracto puede conservarse a temperatura entre 18 y 30ºC durante un máximo de
3 horas sin que ello afecte los resultados de la prueba.
Realización de la prueba (para ambas muestras)
Sacar el dispositivo de Clearview Chlamydia MF de su envase y colocar sobre una superficie
plana. Tapar el tubo de extracción con el gotero adjunto y aplicar 5 gotas de extracto a la
ventana de la muestra. Debe aparecer una línea en la ventana de control 15 minutos después de
añadir el extracto, lo que indica que la prueba se ha realizado correctamente.
Obtención y expresión de los resultados
Se debe leer la prueba 15 minutos después de añadir el extracto a la ventana de la muestra. La
aparición de una línea en la ventana de control transcurridos 15 minutos indica que la prueba ha
funcionado correctamente. En caso de que no aparezca línea alguna se deberá repetir la prueba
utilizando una nueva unidad de Clearview Chlamydia MF. El extracto sobrante puede utilizarse
para este propósito si lleva preparado menos de 3 horas. Alternativamente, se puede obtener
una nueva muestra siguiendo el procedimiento de toma de muestras descrito anteriormente.
o
El resultado positivo se indica con la aparición de una línea en la ventana de
resultados transcurridos 15 minutos. Puede producirse una diferencia de intensidad
entre las líneas de las ventanas de resultados y control, pero esto no afectará a la
interpretación de los resultados.
o
El resultado negativo se indica cuando no aparece línea alguna en la ventana de
resultados transcurridos 15 minutos del tiempo de lectura.
Controles
El sistema Clearview Chlamydia MF proporciona un sistema de control integral. La aparición de
una línea en la ventana de control nos indica que la prueba se ha desarrollado correctamente y
por tanto se pueden interpretar los resultados obtenidos.
4.3.2 Torunda de dacrón con medio de transporte específico
A) Herpes
En la actualidad, el abordaje diagnóstico de la infección genital por VHS se basa principalmente
en las técnicas de cultivo (generalmente shell-vial) y en el diagnóstico molecular por PCR a
tiempo real o captura de híbridos, quedando la serología para situaciones especiales y para
estudios epidemiológicos.
o
IFD o EIA. La detección de antígenos del VHS se puede realizar mediante
inmunofluorescencia directa o por técnicas inmunoenzimáticas. Son técnicas rápidas
con una sensibilidad y especificidad en pacientes sintomáticos que oscilan entre el 70
y el 90%. Sobre muestra directa la sensibilidad disminuye a medida que evoluciona la
50
Diagnóstico microbiológico directo
lesión en el tiempo. El empleo de anticuerpos monoclonales aporta una buena
especificidad y permite diferenciar VSH-1 y 2. Actualmente se emplea más como
complemento para la identificación vírica en los cultivos celulares.
o
Cultivo celular. Se considera el método de referencia. Su especificidad es virtualmente
del 100%, pero los niveles de excreción de virus, la calidad de la muestra y las
condiciones de transporte influyen en su sensibilidad. Para el aislamiento del virus
pueden emplearse células Hep-2 o VERO pero es posible su recuperación en casi
cualquier línea diploide o heterodiploide. La agitación durante la incubación puede
aumentar el número de aislamientos y disminuir el tiempo de aparición de efecto
citopático. El efecto citopático es típico afectando a la totalidad de la monocapa en el
caso del VHS-1, siendo más focal en el caso del VHS-2 y caracterizándose por la
aparición de células refráctiles de mayor tamaño, que tienen tendencia a fusionar sus
núcleos. El tiempo medio de aparición del efecto citopático es de tres días, aunque en
muestras de líquido vesicular el efecto puede aparecer en 24 horas. La identificación
del virus se realiza generalmente por inmunofluorescencia directa con anticuerpos
monoclonales frente al VHS-1 y 2. Dependiendo de la calidad del anticuerpo
empleado pueden existir reacciones cruzadas, sin embargo el tipo de virus
responsable de la infección mostrará una fluorescencia más intensa. La fluorescencia
aparece principalmente en el citoplasma de las células infectadas, pero puede llegar a
expresarse en el núcleo.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.imagenmed.com/especiales/ie9/img/If013.jpg
http://www.imagenmed.com/especiales/ie9/img/If014.jpg
La muestra también se puede cultivar por inoculación y centrifugación en monocapas
celulares (shell-vial), y las inclusiones víricas se pueden detectar por
inmunofluorescencia directa. La mayor ventaja es la posibilidad de tener resultados
positivos en 24-48 horas con una buena sensibilidad y especificidad.
B) Treponema pallidum
Inmunofluorescencia directa, en extensiones secas: se recomienda el uso de anticuerpos
monoclonales, ya que los policlonales pueden reaccionar con otros treponemas que son flora
normal de la cavidad oral y el tracto gastrointestinal.
4.4 Técnicas de biología molecular
4.4.1 Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado líquido de órganos
internos
La Espectrofotometría de Masas (EM) ha demostrado ser capaz de identificar microrganismos
causantes de bacteriemia directamente desde los frascos de cultivo (con sangre o líquidos
orgánicos), en el momento en que este es identificado como positivo por el sistema
automatizado correspondiente con una alta fiabilidad.
51
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
La espectrometría de masas MALDIT-TOF, acrónimo de Matrix-assisted Laser Desorption
Ionization Time-Of-Flight, se trata de un método que, mediante la aplicación de energía laser a
una muestra embebida en una matriz, consigue vaporizar e ionizar esa matriz, que
eventualmente puede arrastrar en esa vaporización e ionizar a su vez a una muestra
representativa de las proteínas contenidas en la muestra. Esas proteínas ionizadas son
sometidas a aceleración en un campo eléctrico y a una migración a través de un tubo de vacío
hasta un detector. El tiempo que transcurra desde su vaporización/ionización hasta su detección
dependerá del cociente masa/carga (m/z) de esa proteína, y ese cociente m/z permitirá
determinar la masa exacta de la proteína de manera extremadamente fiable. En el caso de los
microrganismos, se genera de esta forma un perfil de proteínas con diferentes cocientes m/z,
que se comporta como una huella dactilar, permitiendo identificar con gran fiabilidad al
microrganismo a partir de dicho perfil.
Desde el punto de vista técnico, la incorporación de esta tecnología a la identificación rutinaria
supone en muchos casos un aumento en la fiabilidad y en la rapidez de la misma,
fundamentalmente cuando la identificación convencional depende de sistemas que requieren
crecimiento del microrganismo, ya que este sistema permite la identificación en unos minutos.
Aunque la sensibilidad es todavía mejorable para la identificación de algunas especies en estas
circunstancias, la especificidad es excelente, de modo que cuando el sistema informa de la
presencia de un determinado microrganismo con una puntuación suficiente, este dato es
extremadamente fiable.
En cuanto a la relación coste/beneficio, uno de los extremos más controvertidos ha sido el
precio por identificación. Los equipos de EM tienen un coste de adquisición alto, pero en
contrapartida el gasto en fungible es muy reducido.
La EM, por sus características de rapidez y fiabilidad, está llamada a convertirse en una técnica
básica de identificación bacteriana y micológica en los laboratorios de Microbiología Clínica,
desplazando en una parte muy importante a las técnicas rutinarias actuales
Aunque se ha discutido mucho sobre la capacidad de esta técnica para identificar determinados
grupos de microrganismos (bacterias anaerobias, hongos filamentosos), cada vez existen menos
dudas respecto a que el problema principal, en estos casos, deriva fundamentalmente de
carencias en las bases de datos, y no se debe a limitaciones de la EM para generar espectros
proteicos característicos.
4.4.2 Frascos con orina y torundas de alginato cálcico o dacrón sin medio de
transporte con exudados genitales y/o ETS
A) Chlamydia trachomatis
Las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos (TAAN) son los procedimientos de elección
para el diagnóstico de C. trachomatis en virtud de su sensibilidad y especificidad y porque no
requieren de la toma de muestras invasoras para su ejecución. Se ha demostrado que las TAAN
detectan entre 17 y 28% más infecciones que otros procedimientos de diagnóstico. Existen
varias tecnologías comerciales de TAAN, siendo los más conocidos la reacción de polimerasa en
52
Diagnóstico microbiológico directo
cadena (RPC), la reacción de ligasa en cadena (RLC) y la amplificación por desplazamiento de
hebra (SDA).
Las recomendaciones del Center for Disease Control (CDC) para diagnóstico de infección cervical,
efectuado por un procedimiento de TAAN, incluían en el año 2002 solamente las muestras de
secreción endo-cervical u orina de primer chorro. Con posterioridad, la FDA aprobó la muestra
vaginal. La toma de muestra vaginal tiene muy buena aceptación entre las adolescentes y es
menos invasora que la muestra cervical por lo que cuando no es necesario efectuar examen
pélvico, constituiría la toma de muestra de elección. Para el diagnóstico de infección uretral en
hombres, el CDC recomienda las muestras de secreción endo-uretral u orina de primer chorro
para diagnóstico por TAAN.
4.4.3 Torunda de alginato cálcico o dracón en tubo affirm VPIII
A) Candida, Gardnerella vaginalis y Trichomonas: Affirm VPIII
Es una prueba que utiliza una sonda de ADN indicado para la detección e identificación del ácido
nucleído del género Candida, Gardnerella vaginalis y Trichomonas vaginales en muestras de
fluido vaginal de pacientes con síntomas de vaginitis/vaginosis. Está basado en los principios de
hibridación del ácido nucleído.
El análisis utiliza dos sondas diferentes de ácido nucleído monocatenario para cada organismo,
una sonda de captura y una sonda para desarrollo de color, complementarias a las secuencias
genéticas exclusivas de los organismos seleccionados. Las sondas de captura son inmovilizadas
en una perla incrustada en una tarjeta de análisis de sonda, que contiene una perla
independiente para cada organismo seleccionado.
Ilustración recomendada:
http://www.bd.com/ds/technicalCenter/charts/ch_0_2776.pdf
4.4.4 Torunda de dacrón con medio de transporte específico
A) Virus del papiloma humano: HC2 HPV
La investigación del ADN del VPH se realiza mediante un ensayo de captura de anticuerpos con
hibridación y amplificación de la señal, y posterior detección por quimioluminiscencia en
microplaca. Las muestras que contienen el ADN diana se hibridan con una sonda específica de
ARN del VPH. Los híbridos ADN-ARN resultantes se capturan en la superficie de los pocillos de
una microplaca recubiertos con anticuerpos específicos para los híbridos ADN-ARN. Los híbridos
inmovilizados reaccionan con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina y se detectan con un
sustrato quimioluminiscente. La luz emitida por el sustrato sensible a la enzima se mide en
unidades relativas de luz (RLU) y se detectan en un luminómetro. La intensidad de luz emitida
indica la presencia o ausencia de ADN diana en la muestra.
Ilustración recomendada:
http://www.pruebaparalavida.com/laboratorio/labor.htm
53
Manual de laboratorio de Microbiología para el diagnóstico de Infecciones Genitales
B) Herpes
La PCR incrementa el porcentaje de detección de VHS de muestras mucocutáneas obtenidas con
torunda en un 11-41% comparado con el cultivo. Actualmente las nuevas técnicas de PCR a
tiempo real totalmente automatizadas permiten la detección del VHS en un sistema cerrado con
bajos tiempos de respuesta y bajo riesgo de contaminación. Además, permiten simultáneamente
la detección y el tipado del VHS-1 y 2 en un sólo paso en base al análisis de las diferentes
temperaturas de fusión de los amplicones específicos de VHS -1 y 2. Las técnicas de captura de
híbridos se han utilizado para el diagnóstico de la infección por VHS en muestras cervicales. En
ellas el ADN hibrida con sondas de ARN y los híbridos son inmovilizados mediante un sistema de
captura en placas de microtiter.
C) Treponema pallidum
PCR: detección por técnicas de amplificación genética del genoma treponémico, aunque son
generalmente ensayos no comercializados sino preparados y desarrollados en centros de
referencia.
54
Diagnóstico microbiológico indirecto: Serología
Capítulo 5
Diagnóstico microbiológico indirecto: Serología
Tubo de suero
5.1 Herpes
Este diagnóstico serológico está basado en el empleo de enzimoensayos que emplean como antígenos
una proteína de superficie del VHS, glucoproteína (gG), y que detectan una respuesta tipo-específica de
anticuerpos: las gG1 del VHS-1 y las gG2 del VHS-2.
También se pueden utilizar el Western blot y el inmunoblot para detectar anticuerpos tipo-específicos,
generalmente se emplean como confirmatorios de los resultados positivos de IgG.
5.2 Treponema pallidum
Existen dos tipos de reacciones serológicas: pruebas no treponémicas y pruebas treponémicas. Tabla
10.
Pruebas no treponémicas: utilizan cardiolipina, lecitina y colesterol como antígeno, y detectan
anticuerpos IgG e IgM producidos frente a lipídos de las células dañadas por la infección, y frente a
lipoproteínas y cardiolipina del propio treponema.
55
Manuales de Diagnóstico Microbiológico para Infecciones Genitales
o
Las principales pruebas no treponémicas son el VDRL (requiere pretratamiento del suero y
un microscopio para su lectura) y el RPR (emplea partículas de carbón para visualizar la
reacción sin microscopía).
o
Son baratas, se pueden emplear en situaciones con elevado número de muestras y no
requieren instrumental sofisticado.
o
Otra característica muy importante es su posibilidad de cuantificación, lo que permite
establecer niveles base de reactividad sobre los que estudiar la evolución de la enfermedad,
tanto en la eficacia del tratamiento (disminución significativa del título) como posibles
reinfecciones (aumento significativo del título). Si el tratamiento es eficaz durante una sífilis
temprana, los títulos disminuyen y llegan a desaparecer en 1 año o a ser muy bajos. En los
pacientes tratados en el periodo tardío, o con múltiples episodios de reinfecciones, la caída
de los títulos es más gradual. Pueden persistir títulos bajos en el 50% de estos pacientes
después de 2 años, sin que esto signifique fracaso terapéutico (reacción serofast).
o
La sensibilidad de estas técnicas es buena, pero en estadíos tempranos de la sífilis primaria y
en la sífilis tardía pueden ser negativas, y pueden existir también falsos negativos debidos al
efecto prozona.
o
Existen falsos positivos producidos por anticuerpos anti-cardiolipina en ausencia de infección
treponémica. Estos pueden dividirse en dos grupos: los que permanecen menos de 6 meses
(reacciones falsamente positivas agudas), y más de 6 meses (falsos positivos crónicos). El
título puede ayudar a distinguir los verdaderos positivos (>8) de los falsos positivos (<8),
aunque esta regla puede variar, ya que los usuarios de drogas por vía parenteral, pueden
presentan falsos positivos con título >8.
o
Todas las pruebas no treponémicas tienen la misma sensibilidad y especificidad, pero el nivel
de reactividad entre ellas puede ser diferente: el RPR suele ser positivo a una dilución mayor
que el VDRL. Se recomienda que el seguimiento serológico secuencial de los pacientes se
realice siempre con la misma prueba, y preferiblemente, en el mismo laboratorio.
Pruebas treponémicas. Las pruebas treponémicas emplean antígenos procedentes de técnicas de
clonación o del propio treponema y detectan anticuerpos específicos.
o
Las principales pruebas treponémicas son el TPHA, el FTA-ABS, los enzimoinmunoanálisis
(EIA), el inmunoblot y el Western blot. Los dos primeros se usaron clásicamente como
confirmación de las pruebas no treponémicas, puesto que su especificidad y sensibilidad son
superiores.
o
No se utilizan como cribado debido a su mayor complejidad de realización y difícil aplicación
en situaciones con elevado número de peticiones. También se usan en situaciones clínicas
con alta sospecha de infección y con pruebas no treponémicas negativas, principalmente
ante una posible sífilis tardía.
o
Al contrario que las pruebas no treponémicas, las pruebas treponémicas no sirven para
monitorizar el tratamiento, ya que en el 85% de los pacientes correctamente tratados, estas
pruebas permanecen positivas, incluso de por vida. Solamente un 15-25% de los pacientes
tratados correctamente durante los primeros estadíos de la enfermedad, negativizan las
pruebas treponémicas pasados 2-3 años. Se han descrito falsos positivos, aunque son muy
poco frecuentes.
56
Diagnóstico microbiológico indirecto: Serología
o
Cada vez se utilizan más las técnicas de EIA, ya que sus formatos automatizados permiten
ensayos sobre gran número de muestras, por lo que se están convirtiendo en la prueba de
cribado de muchos laboratorios. Su sensibilidad y especificidad es similar a la de otras
pruebas treponémicas. Si se utilizan como cribado, el resultado positivo debe al menos
ensayarse con una prueba no treponémica, y si el resultado es negativo, debe ensayarse una
segunda prueba treponémica para descartar un falso positivo. Se debe tener presente que
las pruebas treponémicas utilizadas como cribado pueden detectar tanto casos antiguos bien
tratados como casos activos no tratados. Los EIA que sólo detectan IgM tienen su principal
interés en el diagnóstico de la sífilis congénita. El inmunoensayo en línea es una técnica que
emplea una tira de nylon sobre la que se fijan proteínas recombinantes y un péptido
sintético de T. pallidum en forma de bandas independientes. Permite determinar la
reactividad de anticuerpos frente a cada antígeno. La lectura es visual, y el resultado en
función del número de antígenos que son reactivos puede ser negativo (ausencia de bandas),
positivo (presencia de dos a más bandas) o indeterminado (una banda positiva).
Fase
Precoz
Inicial
Primaria
Secundaria
Latencia
temprana
Latencia tardía
o Terciaria
Duración
3 semanas
1-5 semanas
2-6 semanas
1º año
>1 año
Sensibilidad de las pruebas
No treponémicas
Treponémicas
RPR
VDRL
EIA
TPHA
FTAabs
86
78
97
88
84
100
100
97
100
100
98
95
97
100
100
73
71
94
96
Tabla 10. Sensibilidad de las pruebas serológicas frente al T. pallidum en función de las etapas
de evolución de la sífilis
En la tabla 11, se resumen los procedimientos específicos del Laboratorio de Microbiología para las
muestras de infecciones genitales y/o ETS.
57
Manuales de Diagnóstico Microbiológico para Infecciones Genitales
Contenedor-muestra
Porta-cubre o Tubo con
secreción de úlcera de ETS
Vial con aspirado o torunda
con exudado en medio
anaerobio
Frascos de cultivo con
aspirado líquido interno
Torunda alginato cálcico o
dacrón en medio StuartAmies con exudados
genitales y/o de ETS
Microrganismo buscado
Klebsiella granulomatis
Treponema pallidum
Anaerobios
Anaerobios y aerobios
Procedimiento
Giemsa
Campo oscuro, IFD
MICROSCOPIO: Gram
CULTIVO
Agar Brucela, BBE, Tioglicolato
CULTIVO
MALDIT-TOF
MICROSCOPIO
T. vaginalis, Cándida
Gardnerella + Mobilluncus
Neisseria gonorrhoeae
Fresco
Gram
CULTIVO
N. gonorrhoeae, Haemophilus Chocolate, Tayer-Martin
Cándida
Sabouraud
Streptococcus, Staphylococcus Agar sangre
Enterobacterias
Mc Conkey o Levine
Streptococcus agalactiae
Agar CNA o Granada
MICROSCOPIO: Sedimento
Enterobacterias
CULTIVO:
Staphylococcus, Streptococcus
Agar sangre
Cándida
Frasco con Orina o Secreción
Cled
prostática
1º) Centrifugación
2º) CULTIVO: Caldo de Roiron y
Trichomonas vaginalis
de Diamond
3º) MICROSCOPIO: fresco
Torunda alginato cálcico o
1º) CULTIVO: Caldo de Roiron y
dacrón en Caldo de Roiron o
Trichomonas vaginalis
de Diamond
de Diamond con exudades
2º) MICROSCOPIO: fresco
genitales
Torunda dacrón o poliéster
CULTIVO:
Mycoplasma hominis
en 10B o SP-4 con exudados
1º) Caldo urea-arginina
Ureaplasma urealyticum
ETS
2º) Agar A7, A7B o A8
Orina
Torunda alginato o dacrón
ICT-Directa
sin medio con exudados
Chlamydia trachomatis
IFD, EIA
genitales y/o de ETS o
NAAT
secreciones de úlceras de
ETS
Tubo Affirm VP III con
exudades genitales
Gardnerella, Cándida y
Trichomonas
Sonda de ADN
Tabla 11. Resumen de los procedimientos específicos del Laboratorio de Microbiología para las
muestras de infecciones genitales y/o ETS
58
Diagnóstico microbiológico indirecto: Serología
Contenedor-muestra
Torunda alginato cálcico (no
para virus) o dacrón en
medio específico con
secreciones de úlceras de
ETS
Microrganismo buscado
Virus Papiloma Humano
Haemophilus ducrey
Virus Herpes Simple 2
Virus Herpes Simple 2
Tubo con gel separador con
suero
Treponema pallidum
Procedimiento
PCR
CULTIVO (1º):
Cél Hep-2, Vero.
IFD, EIA (2º)
PCR
gG1, gG2
Western bolt, Inmunoblot
Métodos indirectos:
IgG e IgM
Métodos no treponémicos:
RPR, VD
Métodos treponémicos:
TPHA, FTA-abs, EIA,
Inmunoblot, Western blot
Tabla 11 continuación. Resumen de los procedimientos específicos del Laboratorio de Microbiología
para las muestras de infecciones genitales y/o ETS
59
Manuales de Diagnóstico Microbiológico para Infecciones Genitales
Capítulo 6
Informe de los resultados
La presencia con significación clínica de gérmenes anaerobios estrictos en una muestra clínica
debe comunicarse al médico peticionario, para que pueda reorientar el tratamiento antibiótico
hacia este tipo de microrganismos.
En el caso de vaginosis bacteriana, la interpretación de la tinción de Gram se realiza según los
criterios de Nugent basados en la cantidad relativa de los distintos morfotipos presentes en la
extensión del flujo vaginal, asignando una puntuación (Tabla 11). Si la puntuación obtenida
oscila entre 0 y 3, se informará como "microbiota habitual". Puntuaciones entre 7 y 10, se
informarán como "Tinción de Gram compatible con vaginosis bacteriana". Estados intermedios
con puntuaciones entre 4 y 6, se informará como "microbiota vaginal alterada".
Independientemente de los criterios de Nugent, se acepta que más de un 20% de células clave
es indicativo de vaginosis bacteriana. (Ver tabla 12) 
N Score
0-3
4-6
4-6
≥7
Interpretación
Microbiota habitual
Células Clue
No
Si
-
Microbiota alterada
Vaginosis bacteriana
Tabla 12. Interpretación de Nugent Score
60
Interpretación
Microbiota habitual
Microbiota alterada
Vaginosis bacteriana
Informe de los resultados
Respecto al estudio de N. gonorrhoeae:
o
Tinción de Gram del exudado: se debe notificar la presencia del número de leucocitos
PMNs por campo de inmersión y si hay o no diplococos gramnegativos intracelulares.
o
Identificación presuntiva: se debe notificar el crecimiento de un microrganismo
compatible con Neisseria gonorrhoeae pendiente de identificación definitiva.
En los urocultivos se siguen los criterios clásicos de interpretación descritos por Kass, en los que
se consideran significativos recuentos de >105 ufc/mL pueden ser aplicados a la mayoría de las
4
muestras en las que se solicita el cultivo; un recuento <10 ufc/ml se considera como no
significativo. Sin embargo, en determinadas circunstancias se admite la existencia de infección
3
urinaria con recuentos muy inferiores (10 ufc/ml): punción suprapúbica (cualquier recuento),
mujeres con síndrome miccional y leucocituria o bien con el síndrome uretral femenino,
hombres, orinas obtenidas por sondaje y pacientes con tratamiento antibiótico.
Cuando se trata de orinas recogidas antes y después del masaje prostático, se ha de valorar
además si el recuento bacteriano es mayor en la orina postmasaje, lo cual sería indicativo de
prostatitis.
El aislamiento de micoplasmas genitales también es significativo en líquidos estériles y en uretra
para U. urealyticum y en muestras vaginales asociado a vaginosis para M. hominis. Los recuentos
son valorables a partir de 104 UCC/ml (unidades cambiadoras de color / ml utilizando métodos
comerciales líquidos) o UFC/ml (unidades formadoras de colonias / ml, para placas de agar).
Para valorar los resultados de las pruebas diagnósticas de un herpes genital se deben tener en
cuenta las siguientes situaciones:
o
Cultivo. Siempre debe realizarse el tipado, los resultados positivos deben ser tipoespecíficos. Si el cultivo es positivo el paciente probablemente tiene un herpes
genital, son raros los falsos positivos. Si el cultivo es negativo no indica
necesariamente que el paciente no esté infectado por el VHS, puede ser un virus no
detectable en la muestra; los falsos negativos son muy comunes.
o
Pruebas moleculares. Si el resultado es positivo indica que el paciente presenta un
herpes genital, los falsos positivos son muy raros. Si el resultado es negativo no se
puede asegurar la ausencia de herpes genital, aunque los falsos negativos son
extremadamente raros.
o
Serología tipo-específica. Un resultado positivo para VHS-2 indica herpes genital
previo o actual, La realización de una nueva determinación varias semanas después
puede confirmar los resultados. Un resultado persistentemente negativo descarta un
herpes genital. Es complicado diferenciar entre primoinfección e infección recurrente
ya que los anticuerpos IgM no son buenos marcadores de primoinfección. Las nuevas
técnicas de avidez de anticuerpos podrían contribuir a solucionar este problema.
En el estudio de la Sífilis si en el examen directo (microscopio de campo oscuro o IFD) hemos
detectado la bacteria, se da por positivo (Sífilis primaria o secundaria).
61
Manuales de Diagnóstico Microbiológico para Infecciones Genitales
En cuanto a la serología, se ha de valorar siempre con una prueba no treponémica y otra
treponémica, y dependiendo de la sensibilidad de ésta última se requerirá otra tercera prueba
treponémica para confirmar los positivos y los resultados no coincidentes entre las dos primeras.
Tabla 12. El establecimiento del estadio se ha de hacer de forma conjunta con la aparición de los
síntomas y el tiempo transcurrido.
o
En los falsos positivos, ante la sospecha de sífilis inicial (primaria muy precoz), se ha
recomendar repetir la serología en 4 semanas para evaluar seroconversión.
o
Para valorar la eficacia tras tratamiento se dosifican la serología no treponémica. Se
necesita un cambio de dos diluciones (4 veces) en el título para poder demostrar una
diferencia clínicamente significativa entre dos pruebas no-treponémicas consecutivas:
o
Primaria y secundaria: serología a los 6 y 12 meses
o
-
Disminución de RPR 4 veces a los 6 meses
-
Disminución de PRR 8 veces a los 12 meses
Latente precoz: serología a los 6 ,12 y 24 meses
-
o
Disminución RPR 4 veces a los 12 meses
Latente tardía: cambios serológicos menos predecibles
-
Disminución RPR 4 veces en 12 a 24 meses
o
En el caso de neurosífilis, además de los controles serológicos, el estudio del LCR debe
repetirse cada 6 meses. Continuar los controles hasta que todos los parámetros
alterados se normalicen. Si el número de células no decreció en 6 meses o el líquido
no se normalizó en 2 años, hay que considerar el retratamiento.
o
Si no hay disminución o aparecen síntomas atribuibles a sífilis se considera fracaso
terapéutico, siempre que se descarte la reinfección. Esta última se sospecha si los
títulos ascienden, los compañeros sexuales no fueron tratados, o existe promiscuidad
sexual.
62
Informe de los resultados
En la tabla 13 se interpretan los resultados serológicos de la Sífilis, su diagnóstico y seguimiento
del tratamiento.
RPR
EIA
FTA-ABS o TPHA
Negativa
SÍFILIS
Seroconversión
4 semanas
6
meses
DESPUES DEL
TRATAMIENTO
-
12
meses
24
meses
+
Falso +
o inicial
+
Inicial
+
+
+
1ª o
latente
Falso +
o inicial
+
+
2ª o 1ª
+
Inicial
RPR/4
Eficaz
1ª:RPR/8
LtP:RPR/4
Eficaz
LtT:RPR/4
Eficaz
Falso +
o inicial
+
3ª o
tratada
+
Inicial
RPR/4
Eficaz
RPR/8
LCR
Eficaz
Tabla 13. Interpretación de los resultados serológicos de la Sífilis: Diagnóstico y seguimiento del
tratamiento
Por último, las enfermedades que se transmiten por vía sexual son de tal gravedad que hacen
que su seguimiento sea semanal y su declaración obligatoria a la Red Nacional de Vigilancia
Epidemiológica, según el RD 2210/1995. El microbiólogo o el responsable de Prevención del
centro han de enviar por escrito una encuesta epidemiológica de la infección a declarar.
63
Manuales de Diagnóstico Microbiológico para Infecciones Genitales
Capítulo 7
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World Health Organization. (2001). Global prevalence and incidence of selected curable sexually
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Ilustraciones recomendadas
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http://emprocedures.com/index.htm
http://www.microbiologybytes.com/blog/
http://www.microbelibrary.org/
http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/
http://pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplines/sti/biotechn/microbio.html
http://www.infocompu.com/adolfo_arthur/default.htm
http://www.biomerieux.es/upload/CATALOGO_MEDIOS_DE_CULTIVO_2010_ES.pdf
http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools.html
http://www.telmeds.org/
http://www.microbiologyinpictures.com/index.html
http://www.imagenmed.com/
http://www.pruebaparalavida.com/laboratorio/labor.htm
66
Sobre los autores
Sobre los autores del libro
Mª José López García
Doctora en Farmacia
Facultativa especialista en Análisis Clínicos
Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir
[email protected]
Marta Cárdenas Povedano
Técnico Especialista de Laboratorio
Hospital de Montilla
Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir
[email protected]
Antonia Osuna Molina
Técnico Especialista de Laboratorio
Hospital Virgen del Rocío. Sevilla
Servicio Andaluz de Salud
[email protected]
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Sobre el revisor
Sobre el revisor del libro
José Miguel Aguilar Bénitez
Licenciado en Ciencias Biológicas.
Facultativo especialista en Microbiología y Parasitología clínica.
Facultativo especialista en Análisis Clínicos.
FEA análisis clínicos y responsable de los laboratorios de los hospitales de alta resolución de
Alcalá la Real y Alcaudete.
Agencia sanitaria Alto Guadalquivir.
[email protected]
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Sobre el revisor