universidad veracruzana facultad de ciencias químicas

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
TESIS
“ISOELECTROENFOQUE PREPARATIVO EN FASE
LÍQUIDA PARA EL ENRIQUECIMIENTO DE PROTEÍNAS
DE PLANTAS DE SORGO SOMETIDAS A ESTRÉS
HÍDRICO”
PRESENTA
XENIA AURORA SALMERÓN PAREDES
DIRECTOR DEL TRABAJO RECEPCIONAL
DRA. MARÍA TERESA GONZÁLEZ ARNAO
ORIZABA, VER.
DICIEMBRE, 2010
El presente trabajo se realizó en el marco de la colaboración científica entre el
Laboratorio de Biotecnología y Criobiología Vegetal, Facultad de Ciencias
Químicas UV, Orizaba, Ver. y el Laboratorio de Bioquímica y Biología
Molecular de Proteínas, del Departamento de Biotecnología y Bioquímica del
CINVESTAV-Irapuato, Guanajuato.
Las investigaciones fueron auspiciadas a través de un proyecto de Ciencias
Básicas financiado por CONACYT (proyecto 102625) y otorgado al
CINVESTAV, Unidad Irapuato, donde el responsable técnico es la Dra. Silvia
E. Valdés Rodríguez que a su vez funge como Directora externa de la presente
tesis.
Agradecimientos
A Dios
Por brindarme la oportunidad de vivir con plenitud esta etapa de mi vida y por estar a mi
lado siempre, guiando y cuidando.
A mis abuelos
Porque a pesar de la usencia física siempre serán mi mayor guía y apoyo, gracias a su
recuerdo y enseñanzas me hacen estar orgullosa de pertenecer a esta familia. Este triunfo es
dedicado a ustedes.
A mi familia
A mi mamá Rosa María Salmerón Paredes y hermana Ekatherine Salmerón Paredes por ser
mi fuerza y motivación para seguir cada día. Gracias por su apoyo y compresión; este logro
no sólo es mío si no de ustedes también, las quiero.
Gracias a cada uno por su apoyo y por la confianza que siempre tuvieron en mí;
especialmente a mi tía María Eugenia y mi primo Hugo, sin ustedes no podría disfrutar de
este logro.
Dra. María Teresa González Arnao
Su apoyo y guía fueron fundamentales para lograr culminar satisfactoriamente esta meta.
Gracias por estar siempre disponible con una sonrisa sin importar las circunstancias o lo
ocupado de su tiempo, es una motivación y ejemplo que marcara mi vida.
Dra. Silvia E. Valdés Rodríguez
Por su apreciable apoyo y colaboración en la realización de este trabajo. Gracias por
brindarme la oportunidad de vivir una experiencia invaluable, por compartir sus
conocimientos y aclarar siempre mis dudas.
LI Armando Guerrero Rangel
Gracias por la guía, los conocimientos y el apoyo brindado durante toda mi estancia.
Asimismo por la disposición siempre otorgada.
A mis maestros
A cada uno de ellos por fomentar mi enseñanza y compartir sus experiencias y
conocimientos para poder ser una profesional y estar orgullosa de mi carrera.
A mis amigos y compañeros
A mis amigos de toda la vida; Lizeth, Yarin y Daniel, porque me alentaron durante mi
carrera sin importar la lejanía y me apoyaron en los momentos indecisos.
Gracias a Eli C., Ely O. e Isidro por cada sonrisa otorgada, a Raqui por todo el apoyo
brindado y las risas compartidas.
A mis demás amigos y compañeros que siempre formarán parte de los recuerdos de esta
inolvidable etapa de mi vida, gracias a todos.
Manuel Rodríguez Hernández
Gracias por compartir conmigo los momentos difíciles y los satisfactorios, por la paciencia,
y estar a mi lado siempre siendo mi apoyo. Te quiero.
A esa pequeña persona por estar a mi lado, motivarme y hacerme sonreír, gracias.
A cada uno de los que me han apoyado y acompañado en mi camino…
Muchas Gracias
ÍNDICE GENERAL
Página
ÍNDICE DE FIGURA
i
ÍNDICE DE TABLAS
iii
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
v
I
INTRODUCCIÓN
1
II
OBJETIVOS
4
2.1
Objetivo general
2.2
Objetivos particulares
III
HIPÓTESIS
5
IV
MARCO TEÓRICO
6
4.1
Generalidades del Sorgo
7
4.2
Contexto internacional y nacional del sorgo
8
4.3
Estrés hídrico en plantas
9
4.3.1
Mecanismos de tolerancia
10
4.4
Proteómica
11
4.5
Electroforesis
12
4.5.1
Electroforesis 2D
13
4.5.2
Primera dimensión o isoelectroenfoque
13
4.5.3
Segunda dimensión (SDS-PAGE)
14
4.6
Isoelectroenfoque preparativo en fase líquida
15
4.6.1
Fraccionador ZOOM® IEF
16
V
MATERIALES Y MÉTODOS
18
5.1
Material biológico
19
5.2
Metodología para la obtención de perfiles electroforéticos en geles 2D
19
5.2.1
Extracción de proteínas de sorgo
19
5.2.2
Isoelectroenfoque preparativo en fase líquida
21
5.2.3
Precipitación y cuantificación de proteínas
22
5.2.4
Electroforesis bidimensional
22
5.2.5
Tinción con PhastGel Blue R
25
VI
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
28
6.1
Evaluación de la extracción de proteínas de hojas de sorgo
29
6.2
Enriquecimiento
de
proteínas
Isoelectroenfoque preparativo
6.3
Optimización de la carga de proteína en geles de IEF de 13 cm y 18 cm
40
VII
CONCLUSIONES
47
VIII
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
50
IX
ANEXOS
54
9.1
Preparación del gel SDS-PAGE
55
9.1.1
Preparación de solución APS 10%
56
9.2
Preparación de solución de equilibrio
56
9.3
Preparación de solución IEF Denaturant 1.1 x ZOOM
57
9.4
Preparación de tampón ánodo y cátodo ZOOM
57
9.5
Preparación de la muestra para el isoelectroenfoque (Primera dimensión)
58
de
hojas
de
sorgo
por
32
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1
Estructura morfológica del sorgo (Sorghum vulgare)
7
2
Componentes del Fraccionador ZOOM IEF
17
3
Equipo Ethan IPG Phor 3 para el isoelectroenfoque de proteínas de sorgo
24
4
Cámara de electroforesis Hoefer
25
5
Diseño experimental para la selección y aplicación del método de
27
extracción de proteínas de sorgo
6
Perfil Electroforético de proteínas de hojas de sorgo. A) Gel 2D
31
obtenido por extracción con el método de fenol/acetato de amoniometanol.
B) Gel 2D obtenido por extracción con el método de
TCA/Acetona. En el gel A se observa una mejor resolución, con menos
fondo y con manchas mejor enfocadas como se observa en el área
señalada
7
Perfiles electroforéticos 2D de proteínas de hojas de sorgo extraídas con
34
fenol/acetato de amonio y fraccionadas con el Fraccionador ZOOM® IEF.
A) Gel 2D de proteínas ácidas cargado con 1.2 mg de proteína. B) Gel 2D
de proteínas básicas cargado con 560 g de proteínas
8
Gel bidimensional de proteínas ácidas de hojas de sorgo sin
37
estrés hídrico con una carga de 1.2 mg de proteínas extraídas con el
método de fenol/acetato de amonio-metanol. Muestra proteica tratado con
isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
9
Gel bidimensional de proteínas ácidas de hojas de sorgo con
37
estrés hídrico con una carga de 1.2 mg de proteínas extraídas con el
método de fenol/acetato de amonio-metanol. Muestra proteica tratado con
isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
i
10
Gel bidimensional de proteínas básicas de hojas de sorgo sin
39
estrés hídrico con una carga de 550g de proteínas extraídas con el
método de fenol/acetato de amonio-metanol. Muestra proteica tratado con
isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
11
Gel bidimensional de proteínas básicas de hojas de sorgo con
39
estrés hídrico con una carga de 550g de proteínas extraídas con el
método de fenol/acetato de amonio-metanol. Muestra proteica tratado con
isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
12
Perfiles proteicos realizados para optimizar la carga de proteínas
44
de hojas de Sorgo en geles de IEF, todos obtenidos por el método de
fenol/ acetato de amonio-metanol. A) Enfoque de 480 µg de proteínas
totales con barrido y fondo. B) Enfoque de 1.2 mg de proteínas ácidas con
buena resolución y abundantes manchas de alta intensidad. C) Enfoque de
510 µg de proteínas básicas sin fondo y manchas bien definidas
ii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
1
Pagina
Programa
de
isoelectroenfoque
preparativo
en
fase
líquida.
21
para
23
Comparación del rendimiento del protocolo para la extracción
29
®
Fraccionador ZOOM IEF
2
Programa
de
isoelectroenfoque
(Primera
dimensión)
proteínas ácidas y básicas
3
de proteínas de sorgo cultivadas en condiciones normales
4
Determinación de spots por análisis de imagen en geles 2D
35
de hojas de sorgo con isoelectroenfoque preparativo en fase líquida
5
Comparación de la cantidad de proteínas básicas cargadas en
41
el gel de IEF de 13 cm (pH 6-11) y la cantidad de proteínas detectadas en
geles 2D
6
Comparación de la cantidad de proteínas ácidas cargadas en
41
el gel de IEF de 18 cm (pH 4-7) y la cantidad de proteínas detectadas en
geles 2D
7
Carga
proteica
y
tiempo
de
isoelectroenfoque
para
geles
de
42
IEF de 13 y 18 cm
8
Preparación de gel de poliacrilamida de 14 cm
55
9
Preparación de gel de poliacrilamida de 18 cm
56
10
Reactivos para la preparación de solución de equilibrio
56
11
Reactivos
para
la
preparación
de
solución
IEF
Denaturant
57
tampón ánodo
57
1.1 x ZOOM
12
Reactivos para la preparación de 18 mL de
iii
y cátodo ZOOM
13
Reactivos para el isoelectroenfoque de proteínas ácidas y básicas
58
iv
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
Abreviatura
APS
Persulfato de amonio
CHAPS
3-(cloroamino propil)-dimetilamonio-1-propanosulfato
2D
Segunda dimensión
DMSO
Dimetil sulfóxido
DTT
Ditiotreitol
EDTA
Ácido etilendiaminotetraacético
IEF
Isoelectroenfoque
M
Molar
mM
milimolar
mL
mililitro
min
minuto
NL
Nitrógeno líquido
pI
Punto isoeléctrico
PHC
Potencial hídrico celular
SDS
Dodecilsulfato de sodio
SDS-PAGE
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes
TCA
Ácido tricloroacético
TEMED
N,N,N´,N´-tretametilendiamina
VH
Volts hora Total
xg
Gravedades
v
I. INTRODUCCIÓN
1
Entre los cultivos de mayor importancia de la región del Bajío, y en general para el país,
están las gramíneas; maíz, trigo y sorgo. El sorgo representa una excelente planta modelo
debido a que es la gramínea menos estudiada, es tolerante a la sequía y puede ser utilizado
para lograr un mejor entendimiento sobre los mecanismos moleculares que le confieren
tolerancia frente a este tipo de estrés abiótico.
La mayor parte (75%) del sorgo se cultiva bajo condiciones de temporal o seca, siendo el
Bajío la región donde se obtienen los mejores rendimientos (6.3 ton/ha), específicamente en
el estado de Guanajuato. A pesar de esto, en los últimos años la superficie cultivada ha
disminuido de 245,000 ha. en el 2003 a 199,000 ha en el 2006, debido entre otras causas a
la falta de agua ya que en la región del Bajío existe un importante problema con respecto a
la sequia causada por la distribución errática de lluvias y el escaso uso de prácticas de
conservación y aprovechamiento de la humedad; lo cual tiene un gran impacto, ya que
México depende en un 65 por ciento de las importaciones mundiales para completar la
demanda nacional de este grano, lo que cuesta al país más de 400 millones de pesos
(Williams-Alanís et al., 2005). Aunado a lo anterior, existe un creciente interés en utilizar
sorgo y maíz para la producción de etanol, lo cual ha creado la imperiosa necesidad de
incrementar la producción de este cultivo (Takuji y Baltazar, 2009).
La deficiencia de agua es el principal factor que limita el crecimiento y desarrollo de las
plantas, en este sentido, la sequía es la causa principal de la reducción de la producción
agrícola. Las respuestas de las plantas a la sequía son múltiples y están interconectadas.
Entender los procesos moleculares que la planta desarrolla durante estos eventos es
fundamental para el mejoramiento genético de las plantas y el desarrollo de nuevos cultivos
con mejores características de resistencia. La similitud entre las especies de cereales
también implica que cuando se trasladan genes de una especie de cereales a otra, tenderán a
funcionar bien y en la misma forma con una mínima manipulación genética (Takuji y
Baltazar, 2009).
2
El uso de la electroforesis bidimensional resulta una herramienta muy útil para poder
determinar los cambios de expresión de proteínas que ocurren en las plantas, ya que
permite el análisis simultáneo de miles de proteínas en una sólo gel. La identificación de
las proteínas permitirá a futuro asignarles una función y determinar su participación en la
respuesta de las plantas al estrés hídrico.
Para ser más eficiente el análisis de proteínas en geles 2D el incremento de la concentración
de proteínas contenidas en la muestra, es decir su enriquecimiento, permite incluir mayor
número de proteínas en el análisis, sobretodo de aquellas que se expresan en bajos niveles.
Un método simple, conveniente y reproducible para lograr este enriquecimiento es el
isoelectroenfoque preparativo en fase líquida, en el cual se obtienes fracciones de proteínas
separadas en base a su punto isoeléctrico (pI). La obtención de fracciones enriquecidas de
proteínas de cierto rango de pH permite incrementar la cantidad de proteína analizada en un
gel 2D, debido a que se eliminan las proteínas que se enfocan en otros rangos de pH y que
limitan la capacidad de carga en el gel de isoelectroenfoque, obteniendo así geles 2D con
mayor cantidad de proteínas y con una mayor resolución en su separación. (Invitrogen,
2003).
En el presente trabajo se pretende preparar fracciones de proteínas ácidas (pI 4-7) y básicas
(pI 6-10) de hojas de sorgo y determinar las condiciones óptimas para su análisis en geles
2D. Contar con esta metodología permitirá a futuro
realizar estudios de proteómica
diferencial que contribuyan al conocimiento de los mecanismos celulares potencialmente
involucrados en la respuesta de plantas de sorgo frente al estrés por deficiencia de agua.
3
II. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Obtención de fracciones enriquecidas de proteínas ácidas y básicas de hojas de sorgo
sometidas a estrés hídrico para su análisis en geles 2D.
2.2 Objetivos particulares
Optimizar el protocolo de extracción de proteínas totales de plantas de sorgo con y sin
estrés hídrico.
Obtener una fracción enriquecida de proteínas ácidas y básicas de hojas de sorgo por
isoelectroenfoque preparativo en fase líquida.
Obtener perfiles electroforéticos reproducibles en geles 2D.
4
III. HIPÓTESIS
El enriquecimiento de proteínas de hojas de sorgo por isoelectroenfoque preparativo en fase
líquida mejora las condiciones para su análisis en geles 2D.
5
IV. MARCO TEÓRICO
6
ZXZ4.1 Generalidades del sorgo
Sorgo (Sorghum vulgare) es el nombre común de una gramínea parecida al maíz nativa de
África y Asia, donde se cultiva desde la antigüedad [1]. Las plantas de sorgo presentan
cañas de un metro y medio de altura, llenas de un tejido blanco y algo dulce y vellosas en
los nudos; hojas lampiñas, ásperas en los bordes; flores en panoja floja, grande y derecha, o
espesa, arracimada y colgante, y granos mayores que los cañamones, algo rojizos,
blanquecinos o amarillos (Figura 1) [2].
Se sabe que el sorgo tiene un genoma diploide pequeño que consta de 750 Mb, y que está
estrechamente relacionado con el maíz (Zea mays) y la caña de azúcar (Saccharum spp.)
que poseen genomas poliploides más grandes, está inusualmente adaptado a condiciones
adversas, resiste altas temperaturas, la sequía y la baja disponibilidad de nutrientes, mejor
que el maíz, y sus rendimientos también son superiores. El sorgo es capaz de soportar
periodos prolongados de sequía y reemprender su crecimiento cuando ésta cesa. Además,
necesita menos cantidad de agua que el maíz para formar un kilogramo de materia seca
(Takuji y Baltazar, 2009).
Figura 1. Estructura morfológica del sorgo (Sorghum vulgare) [9]
7
4.2 Contexto internacional y nacional del sorgo
El sorgo forma parte de la dieta básica de millones de personas en China, la India y África;
en los países industrializados se cultiva sobre todo como planta forrajera. El sorgo
azucarado contiene en el tallo un jugo dulce, y se cultiva además para obtener jarabes. Una
de las variedades más importantes del sorgo forrajero es Pampa Verde, desarrollada en
Texas, y que produce pacas de paja seca con 16% de proteína, igual a la de la alfalfa y el
mejor forraje de amaranto [1].
El sorgo tiene la ventaja (en comparación con otros cereales importantes) de ser resistente a
la sequía y muchos agricultores cultivan sorgo como parte de los alimentos básicos para el
consumo en el hogar y como medio de subsistencia (Murty y Kumar, 1995). Por lo tanto, el
sorgo es una fuente muy valiosa de energía, proteínas, vitaminas y minerales para millones
de personas, sobre todo de bajos recursos (Klopfenstein y Hoseney, 1995). De esta manera,
el sorgo tiene un papel crucial en la economía mundial de alimentos, ya que contribuye en
los hogares rurales a la seguridad alimentaria (Duodua et al., 2003).
En México el sorgo es uno de los principales granos, su importancia radica en que nutre de
materia prima a la industria generadora de alimentos balanceados para animales, la cual, a
su vez, permite que en el mercado alimentario se disponga de proteínas de origen animal,
además es utilizado para la elaboración de alimentos balanceados para el consumo humano,
ya que se puede hacer la harina de sorgo sola o en composición de harinas compuestas para
la fabricación de galletitas, alfajores, bizcochos, pan, etc. En la industria de extracción se
emplea fundamentalmente para la obtención de almidón, alcohol y glucosa, además, en la
fermentación aceto-butílica donde se producen tres solventes importantes: alcohol, acetona
y butanol.
Tamaulipas y Guanajuato son los principales estados en producción de sorgo a nivel
nacional. En conjunto aportan el 61% de la producción total del país, lo que equivale a 3.8
millones de toneladas. La producción nacional de Sorgo para el año 2007 fue de 6.20
8
millones de toneladas, cifra superior en 12% al alcanzado en el ciclo anterior 2006 (5.52
millones de toneladas) [2].
El sorgo al ser tolerante a ambientes de sequía, lo convierte en un modelo potencial de
estudio para entender los complejos mecanismos de tolerancia al estrés hídrico que este
cereal desarrolla para su sobrevivencia (Rosenow, et al. 1983).
4.3 Estrés hídrico en plantas
En el campo, las plantas están frecuentemente expuestas a varios tipos de estrés
ocasionados por factores del ambiente. La sequía constituye el principal factor abiótico que
reduce el rendimiento de la mayoría de los cultivos. Por otro lado, desde un punto de vista
ecológico, la disponibilidad de agua determina la distribución geográfica de las especies
vegetales (Guiamet, 2002).
El agua es el componente químico más abundante en las plantas y en los tejidos activos
alcanza valores entre el 80 y 95 % en peso fresco. El estrés hídrico es el factor ambiental
que mayormente limita la producción vegetal a nivel mundial, afecta a la mayoría de los
aspectos del crecimiento de las plantas: anatomía, morfología y fisiología [3], provoca la
inhibición del crecimiento, el ajuste osmótico (acumulación de osmolitos en las células
vegetales) y el cierre estomático con las consecuentes alteraciones del intercambio gaseoso
e inhibición de la fotosíntesis. El ritmo de emisión de hojas también se ve afectado al igual
que el tamaño de las mismas, lo que conlleva una reducción del área foliar total de la planta
(Guiamet, 2002).
9
El estrés por déficit hídrico puede describirse utilizando el potencial hídrico celular (PHC)
como un índice, según el cual se distingue:

Estrés ligero: cuando el PHC disminuye ligeramente, provocando una pérdida ligera
de turgencia.

Estrés moderado: el PHC disminuye de -10 a -15 bar, y provoca una pérdida de
turgencia suficiente para provocar la marchitez de las hojas.

Estrés severo: ocurre por debajo de -15 bar y da lugar a un fuente deshidratación
acompañada de estrés mecánico (Olalla-Mañas, et al 2005).
4.3.1 Mecanismos de tolerancia
Los mecanismos que permiten que la planta siga siendo funcional cuando disminuye la
disponibilidad de agua y se produce un déficit hídrico se reconocen como tolerancia. Entre
los mecanismos de tolerancia podemos distinguir los destinados al mantenimiento de la
turgencia celular (ajuste osmótico y ajuste elástico) y los que permiten la resistencia a la
deshidratación (tolerancia proto-plasmática).
Ajuste osmótico: Es el mecanismo que permite mantener la turgencia celular en
condiciones de sequía, y con ello, los procesos relacionados. Se consigue mediante la
acumulación activa de solutos, fundamentalmente azúcares solubles, aminoácidos (prolina
y glicín-betaína) y en algunos casos, potasio.
Ajuste elástico: La elasticidad de los tejidos está relacionada con los componentes de la
pared celular y con su especialización. El incremento de la elasticidad tisular permite el
mantenimiento de la turgencia hasta valores muy bajos del potencial hídrico mediante el
aumento del contenido de celulosa y la reducción de los porcentajes de polisacáridos
matriciales, sobre todo pectinas. Esto produce el endurecimiento de las paredes celulares y
un aumento de su rigidez lo que puede considerarse un mecanismo de tolerancia.
10
Tolerancia protoplasmática: Es el mecanismo que permite mantener las células vivas a
valores muy bajos de potencial hídrico. La capacidad del protoplasma para soportar elevada
pérdida de agua es una característica adaptativa propia de cada especie (Olalla-Mañas, et al
2005).
4.4 Proteómica
La proteómica, que puede definirse como el estudio del proteoma o conjunto de proteínas
expresadas en la célula, es un área de investigación en fuerte crecimiento en la era
postgenómica, y tiene como objetivo fundamental la identificación de todas las proteínas
que se expresan en un organismo, el estudio de interacciones entre proteínas y la
determinación de posibles modificaciones post-traduccionales. El proteoma de una célula
varía según el estado en el que se encuentre la célula, si se encuentra en una situación de
estrés, bajo el efecto de fármacos o de una hormona. Así, en cada momento y en cada tipo
celular el perfil de proteínas expresadas y sus niveles de expresión será diferente y la
proteómica es útil para estudiar estas diferencias.
Existen tres ramas en la proteómica que tratan de caracterizar el proteoma estudiando
distintos aspectos del mismo:
 Proteómica de expresión, encargada del estudio de la abundancia relativa de las
proteínas y de sus modificaciones postranscripcionales.
 Proteómica estructural, encargada de la caracterización de la estructura
tridimensional de las proteínas.
 Proteómica funcional, encargada de la localización y distribución subcelular de
proteínas y de las interacciones que se producen entre las proteínas y otras
moléculas con el fin de determinar su función.
11
La proteómica se basa en técnicas de separación, identificación y caracterización de
proteínas, que permiten analizar un gran número de proteínas en los diferentes procesos
implicados. El conjunto de proteínas se puede separar utilizando geles de SDS-PAGE,
electroforesis 2D o cromatografía líquida multidimensional. La identificación de proteínas
se hace básicamente utilizando la espectrometría de masas. Lo que se suele hacer es
determinar la masa de los productos generados por las digestiones enzimáticas de las
proteínas en gel y la identificación de las proteínas se hace comparándolas con
los
productos de digestión generados in silico con las proteínas reportadas en las bases de
datos. El análisis proteómico permite a los investigadores estudiar el contenido proteico
global de un compartimiento subcelular, célula, tejido u organismo en un momento dado y
bajo ciertas condiciones ambientales [4].
La proteómica también se aplica para caracterizar las proteínas de plantas que presenten
una mayor resistencia a bacterias, calor, frío, sequía y otras resistencias; y determinar su
contribución en la resistencia. De esta manera se pretende utilizar esta información para
aumentar el rendimiento de otros cultivos de plantas, transfiriendo las características
génicas de una especie determinada a otra. Para esta finalidad se emplea una estrategia
combinada con la biología molecular (Westermeier et al, 2002).
4.5 Electroforesis
La electroforesis es un método analítico, en el que se separan biomoléculas, en dependencia
entre otros factores de su carga y bajo la acción de un campo eléctrico. La electroforesis es
la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico, estas partículas
migran hacia el cátodo o ánodo (electrones – y +), en dependencia de una combinación de
su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
Los métodos electroforéticos presentan alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad,
y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y
12
otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Mediante estas técnicas
también se puede conocer las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un
extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación
cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros
parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de
las proteínas (Meimoun et al., 2007).
4.5.1 Electroforesis 2D
La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus
dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa
en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque, cada proteína
avanza en el campo eléctrico hasta alcanzar un valor de pH igual a su punto isoeléctrico. La
segunda dimensión se basa en la separación por peso molecular mediante la electroforesis
en geles de poliacrilamida-SDS. Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar gran
cantidad de proteínas
4.5.2 Primera dimensión o isoelectroenfoque
Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de
las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se
separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La
región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente
de pH tal, que las moléculas que se han de separar siempre y cuando tengan su punto
isoeléctrico dentro de este rango.
Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto
isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas
que se encuentran en medios con pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga
negativa y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH
13
coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta
forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto
isoeléctrico con el pH [5].
4.5.3 Segunda dimensión (SDS-PAGE)
La electroforesis con SDS (dodecilsulfato de sodio) se emplea para la determinación del
peso molecular de las subunidades de proteínas. El anión se une a las proteínas por
adsorción no específica (aproximadamente una molécula de SDS por cada dos residuos de
aminoácidos). El SDS desnaturaliza por completo las proteínas y rompe las interacciones
no covalentes que determinan la estructura terciaria y cuaternaria. Todos los complejos
SDS-proteína toman carga neta negativa, que excede la carga intrínseca de las cadenas de
aminoácidos [6].
La segunda dimensión es la separación en función del tamaño o masa molecular de las
proteínas. Se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente geles de poliacrilamida
(PAGE) y es de tipo desnaturalizante, ya que se utilizan agentes desnaturalizantes de
proteínas como pueden ser, detergentes (SDS), caótropos (urea) y agentes reductores (2mercaptoetanol, DTT).
La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
fue originalmente descrito por Laemmli en 1970 y consiste en aplicar un gel llamado
concentrado con un tamaño de poro grande (no restrictivo), que se forma sobre un segundo
gel llamado separador; cada gel se prepara con tampones de diferente pH y fuerza iónica,
además del tampón de electroforesis (Görg et al., 2007).
14
4.6 Isoelectroenfoque preparativo en fase líquida
El análisis de un proteoma es a menudo limitado por la gran cantidad de proteínas presentes
en la muestra a analizar. La gran abundancia de ciertas proteínas limita la detección de las
proteínas que se expresan en bajos niveles, las cuales a menudo son las de mayor interés.
Los investigadores superan este problema mediante el enriquecimiento de proteínas de
ciertas características a través de diferentes medios. El isoelectroenfoque en fase líquida
representa una alternativa para enriquecer cierto tipo de proteínas. Consiste en separar las
proteínas totales presentes en la muestra en diversas fracciones, según la naturaleza ácida o
básica de las proteínas; y de esta manera se logra concentrar la cantidad de proteínas de la
muestra, sin importar que se encuentren en menor proporción en el proteoma de la planta.
A este fraccionamiento de la muestra para alcanzar una mayor concentración de proteínas
se le denomina enriquecimiento.
Dentro del proteoma de las plantas, como el sorgo, la cantidad de proteínas básicas es
relativamente baja en comparación a la cantidad de proteínas ácidas por lo que su análisis
se torna complicado. El enriquecimiento de las proteínas por medio del fraccionamiento en
el zoom IPG (Fraccionador ZOOM® IEF) permite seleccionar fracciones de proteínas de
diferentes pI. Con el uso de este sistema se pueden obtener fracciones de proteínas ácidas y
básicas; de manera que se puede aumentar la carga de proteínas de cierto tipo, lo cual
facilita su análisis en geles 2D.
El isoelectroenfoque preparativo en fase líquida consiste en el fraccionamiento de muestras
complejas en una matriz líquida, generalmente en solución IEF de isoelectroenfoque, en sus
componentes más pequeños, con la finalidad de enriquecer la muestra a estudiar. Este
fraccionamiento tiene base en el punto isoeléctrico (pI) de las proteínas presentes en la
mezcla. El isoelectroenfoque preparativo proporciona diferentes ventajas para el análisis de
proteínas, como:

Permite la carga de mayores cantidades de proteína para aplicaciones posteriores.
15

Reduce la complejidad de la muestra.

Se obtienen resultados en alta resolución

Se logran identificar proteínas de baja abundancia.

Aumenta el rango dinámico de detección mediante el aumento de la concentración
de proteínas.

Reduce la precipitación / agregación de artefactos de las muestras en las cargas de
alto valor proteico en geles electroforéticos 2D (Invitrogen, 2003).
4.6.1 Fraccionador ZOOM® IEF
El fraccionador ZOOM® IEF ofrece un método rápido y fiable para reducir la complejidad
de la muestra, enriquecer las proteínas de baja abundancia, y aumentar el rango dinámico
de detección en fase líquida. Las muestras fraccionada están listas para su posterior análisis
por electroforesis en geles unidimensionales (1D), de dos dimensiones (2D), o
cromatografía líquida multidimensional acoplada a espectrometría de masas (2D LC / MS)
[7].
El fraccionamiento en el fraccionador ZOOM® IEF se realiza mediante una serie de
cámaras conectadas en paralelo y separadas por una membrana fina (discos ZOOM®) que
contiene amortiguadores covalentes adjunto a un pH determinado. La muestra de la
proteína se carga en cinco cámaras contenedoras y es sometida a un campo eléctrico con
solución IEF, como se ilustra en la Figura 2. Al final del isoelectroenfoque la muestra de
proteína se divide en cinco fracciones bien resueltas sobre la base del pI de cada proteína
(Invitrogen, 2003).
16
Figura 2. Componentes del Fraccionador ZOOM IEF ® [10]
17
V. MATERIALES Y MÉTODOS
18
5.1 Material biológico
El presente trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de Bioquímica y Biología
Molecular de Proteínas, del Departamento de Biotecnología y Bioquímica del
CINVESTAV-Irapuato, Guanajuato.
Se utilizaron hojas de plantas de sorgo de dos grupos diferentes, un grupo de plantas se
creció en condiciones normales, y otras fueron sometidas a estrés por deficiencia de agua,
las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio de Bioquímica Ecológica del Cinvestav,
Unidad Irapuato. A las plantas crecidas en condiciones normales le suministraron agua
equivalente al 100% de la capacidad de campo del sustrato en el que se crecieron, mientras
que a las plantas estresadas se les suministro el 70% de agua de la capacidad de campo
durante 5 días. Las plantas se cosecharon, se separaron las hojas y se guardaron a -70°C
hasta su uso.
Las plantas de ambos grupos se mantuvieron en cultivo en los invernaderos del
CINVESTAV, Unidad Irapuato.
5.2 Metodología para la obtención de perfiles electroforéticos en geles 2D
5.2.1 Extracción de proteínas de sorgo
Se evaluaron dos protocolos de extracción de proteínas para hojas de sorgo: Fenol/acetato
de amonio-metanol (Issacson, et al. 2006) y TCA/Acetona (Santoni, et al. 1994), con
finalidad de seleccionar el método más efectivo, acorde a los criterios de rendimiento;
muestra libre de contaminantes como ácidos nucleicos, lípidos y residuos de solvente, y
bajo fondo en los perfiles electroforéticos.
19
Las proteínas de hojas de sorgo se extrajeron con el método de fenol y se precipitaron con
acetato de amonio-metanol. Se pesaron 0.9 g de hojas de sorgo, con estrés y sin estrés
respectivamente, y se molieron en un mortero frío con nitrógeno líquido (NL) hasta obtener
un polvo fino. La muestra se trasladó a un vaso de precipitado previamente enfriado con 3
mL de tampón de extracción compuesto por 0.7M sacarosa, 0.1M KCl, 0.5M Trsi-HCl pH
7.5, 50 mM EDTA, -mercaptoetanol (26 /mL) e inhibidores de proteasas (20 /mL). Una
vez mezclada la muestra se repartió en 6 tubos eppendorf y se adicionó 600 L de fenol
saturado con Tris pH 8.0, se agitaron en vórtex por 20 min a 4 °C y posteriormente se
centrifugaron a 6000xg durante 30 min a 4 °C.
Se colectó la fase fenólica y se repartió en 3 tubos eppendorf. A la fase fenólica recuperada
se le realizó dos veces más la extracción con 550 y 600 L de tampón de extracción
respectivamente, agitando por 15 min a 4 °C y centrifugando a 6000xg durante 30 min a 4
°C. Una vez obtenida la fase fenólica de las tres extracciones previas se repartió en 5 tubos
eppendorf y se adicionó 1.2 mL de 0.1M acetato de amonio en metanol absoluto (-20 °C)
cada tubo y se almacenó durante 1 hora a -20 °C.
Después de la precipitación de las proteínas se centrifugó 30 min a 6000xg en frío y se
eliminó el sobrenadante. La pastilla obtenida se lavó tres veces con 600 L de metanol
absoluto a centrifugando por 10 min a 9400xg, posteriormente se lavó dos veces más con
650 L de acetona absoluta.
Se secó la pastilla para eliminar restos de solventes hasta no percibir olor a acetona,
teniendo la precaución de evitar un secado excesivo que pudiera afectar la estabilidad y
solubilidad de la pastilla y posteriormente se resuspendió en 350 L de tampón de IEF (7M
urea, 2M tiourea).
Se redujo la muestra adicionando Destreak 1.2%, IPG buffer pH 3-10 al 0.5% y DTT 2M y
dejando reposar por 30 min a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo se adicionó 1.4
20
L de N.N-dimetil acrilamida para alquilar la muestra y se dejó reposar por 30 min a
temperatura ambiente.
5.2.2 Isoelectroenfoque preparativo en fase líquida
Se ensambló el Fraccionador ZOOM® IEF como indica el procedimiento establecido en el
manual del equipo utilizando cinco cámara conectadas en paralelo y separadas por unas
membranas fina (discos) que contienen amortiguadores unidos covalentemente a un pH
determinado: pH 3, 7 y 10, para obtener la fracción ácida y básica de las proteínas totales
de sorgo. Se adicionó la solución cátodo (-) y ánodo (+) en cada extremo respectivamente
del fraccionador.
Se preparó la muestra, previamente reducida y alquilada, para el fraccionamiento
adicionando 3.15 mL de Buffer Desnaturant 1.1 x, 30 L de anfolinas ZOOM pH 3-10 y 35
L de DTT 2M y se agitó en vórtex.
La muestra preparada se cargó en las cámaras contenedoras aplicando 670 l en cada pozo
y fue sometida a un campo eléctrico con solución IEF siguiendo el protocolo que se
muestra en la Tabla 1. Este campo eléctrico produce que las proteínas se desplacen entre
las cámaras hasta que su carga es nula y se estabilizan, por lo tanto se separan en base a su
pI. De esta manera se recuperó la fracción de proteínas ácidas, pH 3-7, y la fracción de
proteínas básicas, pH 7-10.
Tabla 1. Programa de isoelectroenfoque preparativo en fase líquida. Fraccionador ZOOM® IEF
Paso
Voltaje (V)
Tiempo (min)
1
100
20
2
212
80
3
500 (10 mA, 2 W)
140
21
5.2.3 Precipitación y cuantificación de proteínas
Se colectaron las fracciones de proteínas de pI 3-7 que representa la fracción ácida y las de
pI 7-10 que corresponden a la fracción básica.
La precipitación de la fracción proteica ácida y básica se realizó mediante el sistema
comercial 2-D Clean-Up Kit (GE Healthcare), se utilizaron 600 L de precipitante y coprecipitante en el caso de la fracción ácida y 500 L de precipitante y co-precipitante para
la fracción básica. Las proteínas básicas precipitadas se solubilizaron en 130 L de buffer
IEF y las proteínas ácidas en 200 L de buffer IEF.
La cuantificación de proteínas se realizó con el sistema comercial 2-D Quant Kit
(Amersham Biosciences).
5.2.4 Electroforesis bidimensional
Después de la cuantificación se prepararon las muestras para el isoelectroenfoque (primera
dimensión) adicionando 510-550 g de proteína básica y 1.2 mg de proteína ácida en el
buffer de rehidratación hasta obtener un volumen final de 250 L en el caso de las
proteínas básicas y 340 L en las proteínas ácidas. Ambas muestras se solubilizaron
durante 1 hora con agitación constante.
Transcurrido el tiempo, las muestras se centrifugaron por 1 min a 9400xg, posteriormente
las proteínas ácida y básicas se transfirieron a un sarcófago y charola respectivamente,
donde se colocó el gel de IEF de 13 cm pH 6-11 para las proteínas básicas y el gel de IEF
de 18 cm pH 4-7 para las proteínas ácidas, para su rehidratación durante 11 horas.
22
La primera dimensión basada en la separación de proteínas de acuerdo a su punto
isoeléctrico se realizó en el equipo Ethan IPG Phor 3 (Figura 3), para las proteínas ácidas y
en el quipo IPG Phor II para las proteínas básicas.
A continuación en la Tabla 2 se muestra el programa de isoelectroenfoque utilizado para la
separación por punto isoeléctrico de las proteínas ácidas y básicas:
Tabla 2. Programa de isoelectroenfoque (Primera dimensión) para proteínas ácidas y básicas.
Proteínas
Paso
ácidas
básicas
Voltaje (V)
Tiempo (min)
Voltaje (V)
Tiempo (min)
1
100
15
50
30
2
250
30
150
60
3
500
60
300
60
4
1000
60
600
60
5
9500
Hasta
alcanzar 8000
60
93500 VH*
6
6500
Hasta
alcanzar
125000 VH*
* VH: Volts hora Total
23
Figura 3. Equipo Ethan IPG Phor 3 para el isoelectroenfoque de proteínas de sorgo.
El voltaje aplicado debe ser constante y se debe elevar paulatinamente para no producir una
sobre carga en el sistema, ya que este fenómeno puede generar que las proteínas no se
enfoquen bien o se presente estrías y fondo en el gel.
Una vez finalizado el isoelectroenfoque se realizó el equilibrio de los geles de IEF agitando
durante 18 min con 5 mL de buffer de equilibrio (Tris 50 mM pH 8.0, urea 6M, glicerol
30%, SDS 2%, pizca de azul de bromofenol) conteniendo 5 mg mL-1 de DTT. Se retiró el
exceso de esta solución y se realizó un segundo equilibrio adicionando un volumen igual de
buffer de equilibrio conteniendo 12.25 mg mL-1 de Iodoacetamida.
La segunda dimensión se realizó en geles de poliacrilamida compuestos por dos fases: gel
concentrador (4%) polimerizado sobre un gel separador (12.5%), sobre el cual se colocó el
gel de IEF previamente equilibrado en una cámara de electroforesis. El protocolo de corrida
que se empleó para las proteínas ácidas fue de 70 V para el gel concentrador y 100 V para
el gel separador. En el caso de las proteínas básicas el protocolo empleado fue de 120 V
para el gel concentrador y 150 V para el gel separador hasta que el azul de bromofenol,
colorante utilizado como rastreador de la corrida migró al final del gel. Se utilizó tampón de
corrida Laemmli con la siguiente composición: Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0.1%, y
una cámara de electroforesis (Figura 4).
24
Figura 4. Cámara de electroforesis Hoefer
5.2.5 Tinción con PhastGel Blue R-350
Para la detección de las proteínas en el gel se utilizó PhastGel Blue R-350 (Amersham
Biosciences). Primeramente se elaboró el colorante de la siguiente manera:
1. Disolver una tableta de PhastGel Blue R-350 en 80 ml agua destilada, agitar por 5 ó
10 minutos.
2. Agregar 120 mL de metanol y agitar hasta que toda la tableta se disuelva,
posteriormente se filtró la solución.
Para la tinción, el gel se colocó inicialmente en una solución fijadora (ácido acético 10%,
etanol 40%) durante 30 min en agitación constante. Se retiró esta solución y se adicionó la
solución teñidora de PhastGel Blue R-350 por 1-2 horas en agitación contante.
Posteriormente se destiñó el gel con solución de ácido acético al 10% hasta obtener una
visibilidad clara de las manchas de las proteínas, para lo cual se deben realizar los lavados
las veces que sean necesarios.
25
Finalmente los geles se enjuagan con agua desionizada hasta eliminar los residuos de ácido
acético.
La digitalización de los geles se realizó con el escáner ImageSacnner II (Amersham. Cat:
18117084), estableciendo una profundidad de 150DPI y la extensión .mel para el archivo.
La detección de proteínas en el gel se realizó con el programa Melanie v.7.0, el cual está
diseñado para analizar las proteína presentes en geles 2D. Se ajustaron los valores de
smooth y saliencia en cada caso, para descartar manchas que no correspondieran a proteínas
en el gel. Una vez hecho, esto el programa arroja el dato del número de manchas detectadas
en el gel y que corresponden a proteínas.
En la Figura 5 se representa el diseño experimental utilizado para la selección y aplicación
del método de extracción de proteínas de hojas de sorgo.
26
ETAPA 1
Colecta de hojas de
plantas de sorgo
Extracción de
proteínas
Método TCA/ Acetona
Método fenol/acetato de
amonio-metanol
Electroforesis bidimensional
Comparación de los perfiles
electroforéticos obtenidos
Selección del método de
extracción
Colecta de hojas de
plantas de sorgo
ETAPA 2
Plantas sin estrés
hídrico
Plantas con estrés
hídrico
Extracción de
proteínas
Enriquecimiento de proteínas por
isoelectroenfoque preparativo
Obtención de perfiles
electroforesis
Figura 5. Diseño experimental para la selección y aplicación del método de extracción de proteínas
de sorgo
27
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
28
6.1 Evaluación de la extracción de proteínas de hojas de sorgo
Mediante la comparación de perfiles electroforéticos se logró determinar que el método de
fenol/acetato de amonio-metanol fue el que mayor rendimiento reportó (Tabla 3).
Tabla 3. Comparación del rendimiento del protocolo para la extracción de proteínas de sorgo
cultivadas en condiciones normales.
Fenol/Acetato de AmonioMetanol
Peso del tejido
Concentración de
proteína en la muestra
Concentración de
TCA/Acetona
0.5 g
1.5 g
2.0 µg/ µl
1.86 µg/ µl
900 µg
480.018 µg
proteína total
Los resultados obtenidos (Tabla 3) confirman que el método de fenol/acetato de amoniometanol es el que proporciona un mejor rendimiento, ya que a pesar de que se partió de una
cantidad menor de tejido (0.5 g) en comparación con el otro método (1.5 g) se obtuvo una
mayor cantidad de proteína total, 900 µg mediante el método de fenol/ acetato de amoniometanol contra 480.018 µg que se obtuvo con el método de TCA/Acetona, es decir que se
logró extraer el doble de proteínas.
29
Al observar estos parámetros se determinó que el método de fenol/ acetato de amoniometanol favoreció la precipitación de una mayor cantidad de proteínas lo que incrementó al
doble la cantidad de proteínas obtenidas.
En los perfiles electroforéticos obtenidos por el método de fenol/ acetato de amoniometanol se logró observar un mayor número de manchas, mejor definidas y con menos
fondo (Figura 6 A).
En comparación, en los perfiles electroforéticos obtenidos por el método de TCA /acetona
se observó una menor resolución en la separación de las proteínas, manchas muy difusas y
un fondo obscuro, lo cual limita la visibilidad de las proteínas (Figura 6 B). Además la
cantidad de manchas observadas fue menor a pesar de que se partió de una cantidad mayor
de tejido en comparación con el otro método.
30
pH
4
S
D
S
7
AA
kDa
100
50
P
A
G
E
30
20
10
4
S
D
S
P
A
G
E
pH
B
7
kDa
100
50
30
20
10
Figura 6. Perfil Electroforético de proteínas de hojas de sorgo. A) Gel 2D obtenido por extracción
con el método de fenol/acetato de amonio-metanol. B) Gel 2D obtenido por extracción
con el método de TCA/Acetona. En el gel A se observa una mejor resolución, con menos
fondo y con manchas mejor enfocadas como se observa en el área señalada
31
La extracción de proteínas es un factor determinante en la obtención de perfiles
electroforéticos reproducible y con buena resolución. Dentro del protocolo de extracción
existen diversos pasos críticos que pueden afectar el rendimiento del método, como el
control de la temperatura para evitar la degradación de las proteínas debido a la actividad
de las proteasas que se activan a temperatura ambiente, la recolección de las fases fenólicas
debido a la presencia de ciertos metabolitos pueden crear artefactos que pueden interferir en
el análisis como lo son ácidos nucleícos, lípidos, residuos de solvente y tejido vegetal. La
precipitación también se considera un paso relevante y se debe hacer una agitación previa
vigorosa para facilitar la precipitar y respetar el tiempos y temperatura que requiere el
proceso.
El método de fenol/acetato de amonio-metanol ha reportado en trabajos realizados
anteriormente resultados favorables para la extracción de proteínas de diversos tejidos,
como en el tomate (Lycopersicon esculentum) y en la vainilla (V. planifolia), por lo que se
determinó que es un método eficaz y con buenos rendimientos para la obtención de
extractos proteicos (Núñez-López, 2008).
6.2 Enriquecimiento de proteínas de hojas de sorgo por isoelectroenfoque
preparativo
El enfoque isoeléctrico en fase líquida representa una herramienta muy útil para enriquecer
fracciones proteínas con determinadas características de carga. En nuestro caso nos
permitió obtener fracciones enriquecidas de proteínas ácidas (pI 4-7) y proteínas básicas (pI
7-10).
Para evidenciar que el isoelectroenfoque preparativo es un método eficaz para el
enriquecimiento de la muestra proteica se comparó la cantidad de proteínas obtenidas sin el
fraccionamiento con la cantidad de proteínas obtenidas después del fraccionamiento. La
muestra proteica que no fue fraccionada por isoelectroenfoque preparativo se cuantifico
32
mediante el sistema comercial 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences) dando como
resultado una concentración de 900 g partiendo de una cantidad de 0.5 g de tejido. Esta
cantidad de proteína representa la cantidad de proteína total que corresponde tanto a
proteínas ácidas y básicas. La muestra proteica que fue fraccionada por isoelectroenfoque
preparativo presentó una concentración total de 2518 g de proteína, de los cuales 1987 g
representan la fracción de proteínas ácidas y 531 g de proteínas básicas; partiendo de 0.9 g
de tejido.
El tejido empleado para la obtención de la muestra proteica fraccionada era mayor (0.9 g) a
la cantidad de tejido empleado para obtener de la muestra proteica no fraccionada (0.5 g),
sin embargo, los resultados de la cuantificación de proteínas muestra que la cantidad de
proteína obtenida utilizando el enriquecimiento por fraccionamiento (isoelectroenfoque
preparativo) casi triplica la cantidad de proteína obtenida en comparación a la muestra no
tratada con el isoelectroenfoque preparativo.
El analizar proteínas fraccionadas de una muestra en geles 2D permite obtener perfiles
electroforéticos con mayor número de proteínas, separadas con mayor resolución y carga
proteica (Figura 7), los cuales son más viables de analizar ya que presentan una
visualización mayor de las proteínas, lo cual permitirá un mejor análisis de imagen para
detectar con mayor certeza y confiabilidad los cambios de expresión de proteínas en
respuesta a los tratamientos de estrés a que se sometan las plantas de sorgo.
Analizar las proteínas en dos geles, uno de proteínas ácidas y otro de proteínas básicas,
evita la aglomeración de las proteínas en un solo gel favoreciendo de esta manera la
visualización de proteínas, ya que las proteínas de mayor abundancia interfieren con la
visualización de proteínas que se encuentran en baja concentración o poco representadas.
33
4
pH
7
pH
11
SDS-PAGE
A
6
SDS-PAGE
B
Figura 7. Perfiles electroforéticos 2D de proteínas de hojas de sorgo extraídas con fenol/acetato de
amonio y fraccionadas con el Fraccionador ZOOM® IEF. A) Gel 2D de proteínas ácidas
cargado con 1.2 mg de proteína. B) Gel 2D de proteínas básicas cargado con 560 g de
proteínas.
34
Los perfiles electroforéticos enriquecidos con el fraccionamiento presentan una cantidad
mayor y constante de manchas (Tabla 4), indicando de esta manera que el
isoelectroenfoque preparativo es una herramienta eficaz y reproducible para enriquecer las
muestras proteicas. Las manchas observadas pueden ser analizadas por medio del análisis
de imagen (Melanie).
Tabla 4. Determinación de manchas por análisis de imagen en geles 2D de hojas de sorgo con
isoelectroenfoque preparativo en fase líquida
Proteínas
ácidas
básicas
Con estrés
Sin estrés hídrico
1
595
656
210
167
2
620
591
163
157
3
585
635
160
130
4
530
505
163
240
hídrico
Sin estrés hídrico
Con estrés
Gel
hídrico
Como se logra observar en la Tabla 4, las manchas determinadas por análisis de imagen son
constantes y comparativas. Es decir que en las cuatro replicas que se realizaron, tanto de
geles 2D de proteínas ácidas como básicas, el número de manchas determinadas fue muy
semejante entre sí lo cual indica que los resultados obtenidos de las muestras sometidas al
fraccionamiento preparativo son reproducibles.
35
Esta condición de reproducibilidad que presenta este método de enriquecimiento es
importante ya que permite comparar de manera segura las proteínas presentes en
condiciones normales y de estrés hídrico, y de esta manera tener la certeza de identificar
proteínas expresadas diferencialmente.
Otra característica importante que presenta este método es la obtención de dos fracciones
importantes de proteínas, una fracción ácida y otra básica, lo cual permite estudiar de
manera independiente las proteínas según su naturaleza. Las proteínas básicas se
encuentran en una concentración inferior en el proteoma de la planta de sorgo, por lo cual
poder aumentar su concentración permitirá incluir en el análisis proteínas básicas que se
encuentran en muy baja concentración.
En la Figura 8 se ilustra un gel 2D de proteínas ácidas de hojas de sorgo sin estrés hídrico,
mientras que en la Figura 9 se señala un gel 2D de proteínas ácidas de hojas de sorgo con
estrés hídrico. Como se puede observar, comparando ambas Figuras, se presenta una mejor
visualización de las manchas y una disminución de la aglomeración de las mismas.
El proceso de fraccionamiento permitió obtener una mayor resolución de las proteínas tanto
ácidas como básicas y permitirá una excelente comparación de la expresión diferencial en
los estratos proteicos de hojas de sorgo sometidas o no a las condiciones de estrés hídrico.
36
pH
7
SDS-PAGE
4
Figura 8. Gel bidimensional de proteínas ácidas de hojas de sorgo sin estrés hídrico con una carga
de 1.2 mg de proteínas extraídas con el método de fenol/acetato de amonio-metanol.
Muestra proteica tratado con isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
pH
7
SDS-PAGE
4
Figura 9. Gel bidimensional de proteínas ácidas de hojas de sorgo con estrés hídrico con una carga
de 1.2 mg de proteínas extraídas con el método de fenol/acetato de amonio-metanol.
Muestra proteica tratado con isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
37
El gel 2D de proteínas básicas de hojas de sorgo sin estrés hídrico presenta una buena
resolución e intensidad de las manchas y no se percibe fondo (Figura 10). El gel 2D de
proteínas básicas de hojas de sorgo
sin estrés hídrico también presenta una buena
resolución e intensidad de las manchas (Figura 11), sin embargo comparando ambos
perfiles electroforéticos se puede observar un aumento de las manchas visualizadas en el
gel 2D de proteínas básicas de hojas de sorgo con estrés hídrico, por lo que se puede
especular que existe una mayor expresión de estas proteínas básicas por parte de la planta
como respuesta al estrés hídrico.
Las proteínas básicas que se expresaron en condiciones de estrés hídrico se denominan
proteínas diferenciales y su posterior análisis e identificación es trascendental para
determinar qué mecanismos de defensa utiliza la planta ante el estrés al cual es sometida.
38
pH
11
SDS-PAGE
6
Figura 10. Gel bidimensional de proteínas básicas de hojas de sorgo sin estrés hídrico con una
carga de 550g de proteínas extraídas con el método de fenol/acetato de amonio-metanol.
Muestra proteica tratado con isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
pH
11
SDS-PAGE
6
Figura 11. Gel bidimensional de proteínas básicas de hojas de sorgo con estrés hídrico con una
carga de 550g de proteínas extraídas con el método de fenol/acetato de amonio-metanol.
Muestra proteica tratado con isoelectroefoque preparativo por el sistema ZOOM® IEF
39
El isoelectroenfoque preparativo en fase líquida es un método eficaz, simple y rápido para
lograr un enriquecimiento de proteínas, es decir que con el isoelectroenfoque preparativo se
logra obtener una mayor concentración de proteínas mediante su fraccionamiento en
proteínas ácidas y básicas. Este enriquecimiento permite un análisis más completo de la
expresión diferencial de proteínas para su posterior identificación, por espectrometría de
masas. La identificación de las proteínas diferenciales que se presentan en respuesta al
estrés hídrico, permitirá comprender mejor los mecanismos celulares involucrados en la
respuesta de las plantas al déficit de agua.
La finalidad de entender estos mecanismos es poder manipular mediante técnicas de
genómica el material genético de las plantas para predisponerlas a una resistencia mayor a
las sequias o cualquier otro tipo de estrés. Por esta razón es de vital importancia obtener
muestras que contengan una importante cantidad de proteínas que permitan una mejor
visualización de cuales están directamente o indirectamente asociadas al comportamiento
de tolerancia de las plantas frente a condiciones adversas propias del ambiente.
6.3 Optimización de la carga de proteína en geles de IEF de 13 cm y 18
cm
Para obtener perfiles electroforéticos bien resueltos y con una gran cantidad de manchas se
optimizó la carga de proteínas básicas en geles de IEF de 13 cm (pH 6-11) utilizando un
sistema Hoefer y evaluando diferentes cantidades como se observa en la Tabla 5. Esta
evaluación de las manchas se realizó mediante un programa llamado Melanie el cual ofrece
una interfaz única y flexible que permite la visualización completa de geles 2D para una
exploración y análisis de datos más profundo.
40
Tabla 5. Comparación de la cantidad de proteínas básicas cargadas en el gel de IEF de 13 cm (pH
6-11) y la cantidad de proteínas detectadas en geles 2D.
Gel
No. de manchas
Proteína cargada
VH*
1
229
600 g
102918
2
184
585 g
125395
3
217
500 g
123825
4
180
550 g
123401
* VH: Volts hora Total
Se optimizó la carga de proteínas ácidas en geles de IEF de 18 cm (pH 4-7) utilizando un
sistema BioRad y evaluando cantidades de carga a diferentes enfoques, como se observa en
la Tabla 6, analizando las manchas obtenidas mediante el programa Melanie.
Tabla 6. Comparación de la cantidad de proteínas ácidas cargadas en el gel de IEF de 18 cm (pH
4-7) y la cantidad de proteínas detectadas en geles 2D.
Gel
No. de manchas
Proteína cargada
VH*
1
548
1.85 mg
97000
2
568
1.41 mg
110102
3
774
1.3 mg
92000
4
654
1.1 mg
92578
* VH: Volts hora Total
41
De los diversos enfoques realizados con diferentes cantidades de proteínas cargadas en los
geles de IEF tanto de 13 cm como de 18 cm, y con base a las manchas observadas en los
perfiles electroforético se determinó que la cantidad de carga de proteína y el tiempo de
isoelectroenfoque (VH) óptimos eran los que se muestran en la Tabla 7:
Tabla 7. Carga proteica y tiempo de isoelectroenfoque para geles de IEF de 13 y 18 cm
Gel
Proteína cargada
VH*
13 cm pH 6-11
510-550 g
125000
18 cm pH 4-7
1.2 mg
92500
* VH: Volts hora Total
Como se observa en la Tabla 7 los geles de 13 cm pH 6-11 utilizados para el análisis de
proteínas básicas requieren una menor cantidad de proteína pero un tiempo de
isoelectroenfoque (VH) superior. En comparación los geles de 18 cm pH 4-7 utilizados para
el análisis de proteínas ácidas requieren una cantidad de proteínas mayor, el doble de la
cantidad requerida en los geles de 13 cm pH 6-11, pero el tiempo de isoelectroenfoque
(VH) aplicado es menor.
La cantidad y tiempo de isoelectroenfoque óptimos (VH) se determinó después de observar
una serie de perfiles obtenidos a diferentes enfoques, lográndose definir qué tiempo de
enfoque es requerido para obtener una buena resolución tanto de las proteínas ácidas como
42
básicas, y que a su vez evitara un excedente en el isoelectroenfoque que puede generar un
barrido de las proteínas o fondo en el gel de IEF impidiendo una buena visualización.
Comparando los perfiles electroforéticos se logró observar que es mejor tener un previo
enriquecimiento de la muestra, es decir fraccionar la muestra por isoelectroenfoque
preparativo para obtener dos fracciones concentradas, una de proteínas ácidas y otra de
proteínas básicas; con la finalidad de cargar una cantidad superior de proteína en dos geles,
un gel 2D de proteínas ácida y otro de proteínas básicas, a los cuales se les proporciona el
tiempo de isoelectroenfoque indicados pudiéndose de esta manera obtener perfiles más
resueltos, con un mejor enfoque y sin fondo (Figura 12).
43
4
pH
kDa
7
200
A
SDS-PAGE
50
30
20
10
4
pH
7
SDS-PAGE
B
6
pH
11
SDS-PAGE
C
Figura 12. Perfiles proteicos realizados para optimizar la carga de proteínas de hojas de Sorgo en
geles de IEF, todos obtenidos por el método de fenol/ acetato de amonio-metanol. A)
Enfoque de 480 µg de proteínas totales con barrido y fondo. B) Enfoque de 1.2 mg de
proteínas ácidas con buena resolución y abundantes manchas de alta intensidad. C)
Enfoque de 510 µg de proteínas básicas sin fondo y manchas bien definidas.
44
Como se puede observar en la Figura 12, los perfiles enfocados con 480 g de proteínas
totales (Figura 12 A) presentan una buena intensidad de las manchas pero no bien
enfocadas, además se observa barrido de las bandas. Cabe señalar que la cantidad cargada
(480 g) es de proteínas totales, es decir que en su composición existe tanto proteínas
ácidas como básicas y debido al rango de pH (4-7) es posible lograr observar la distribución
en el gel de dichas proteínas pero no con una buena visualización debido a que las proteínas
ácidas se aglomeran en el extremo ácido del gel y las proteínas básicas actúan de la misma
manera aglomerándose en el extremo básico del gel.
De esta forma, se entorpece el análisis de proteínas en geles de 2D ya que se dificulta
determinar de qué tipo de proteína se trata, así como la naturaleza de la misma, debido a
que no están bien definidas y se acumulan en una parte del gel. Al presentarse este
fenómeno resulta complicado determinar la presencia de proteínas diferenciales que se
puedan presentar en respuesta al estrés en las plantas. También el análisis de dichas
proteínas diferenciadas por espectrometría de masas se vuelve más complejo debido a la
cercanía de las mismas y a la dificultad de recuperar la muestra a analizar.
En la imagen 12 B se ilustra un perfil de proteínas ácidas con una carga de 1.2 mg donde se
observa una buena resolución con poco fondo y con una alta intensidad. El gel de IEF de 18
cm que se emplea para la electroforesis de proteínas ácidas tiene un rango de pH 4-7 lo cual
proporciona un área mayor de esparcimiento de las proteínas y permite una mayor
visualización de las mismas. Por consiguiente, se puede asumir que se mejorará la
recolección de las proteínas diferenciales y también su análisis por espectrometría de
masas.
Dentro de las proteínas totales presentes en las hojas de sorgo la cantidad de proteínas
básicas es reducida, más en comparación a la cantidad de proteínas ácidas, por lo tanto
como se observar en la Figura 12 C la cantidad de proteínas básica que se logra enfocar en
los perfiles proteicos es menor, sin embargo al optimizar la cantidad cargada de proteína
45
(510 g) se logró tener una buena resolución en los geles de IEF, sin fondo y con proteínas
bien enfocadas.
46
VII. CONCLUSIONES
47
Se comprobó que el fraccionamiento de las proteínas totales por el sistema de
isoelectroenfoque preparativo (Fraccionador ZOOM-IEF INVITROGEN) en fracciones
enriquecidas tanto ácidas y básicas proporciona mejores perfiles electroforéticos en geles
2D, con una mayor cantidad de manchas que permiten un mejor análisis y facilitará su
caracterización por espectrometría de masas.
Igualmente se estableció que el método que proporciona mejores rendimientos para la
extracción de proteínas de sorgo es el de Fenol/Acetato de amonio en metanol absoluto, ya
que se obtienen patrones electroforéticos en geles 2D bien resueltos, con menos fondo y
mayor cantidad de proteínas (900 g).
La metodología optimizada para la obtención de patrones electroforéticos de proteínas de
sorgo es:

Extracción de proteínas con fenol y precipitación con acetato de amonio 0.1M en
metanol absoluto.

Sonicación de la muestra en buffer IEF durante 10 min.

Reducción y alquilinización de la muestra durante 30 min respectivamente.

Enriquecimiento de la muestra por medio del sistema de isoelectroenfoque
preparativo (ZOOM-IEF Fractionator INVITROGEN).

Precipitación por el sistema 2D Clean-Up Kit

Cuantificación por el sistema 2D Quant-kit

Solubilización de la muestra en buffer de rehidratación por 1 hora a temperatura
ambiente. Cargar 1.1 a 1.2 mg de proteínas ácidas en geles de IEF de 18 cm (pH 448
7) y 510-560 g de proteína básica en geles de IEF de 13 cm (pH 6-11) y rehidratar
por 11 horas.

Realización del Isoelectroenfoque (Primera dimensión) a 22°C, 50 A y siguiendo
el protocolo correspondiente dependiendo de la fracción a tratar; ácida o básica.

Realización de SDS-PAGE (Segunda dimensión) en geles de poliacrilamida
concentrador 4% y separador 12.5%.

Tinción de los geles con PhastGel Blue R. Digitalización de los geles con el equipo
Lab Scan (Image Scanner-Amersham Biosciences).
La optimización de esta metodología establece una contribución significativa para el
estudio diferencial de proteínas de hojas de sorgo sometidas a estrés hídrico.
49
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
50
Duodua K.G., Taylora J.R.N., Beltonb P.S., Hamakerc B.R., (2003). Factors affecting
sorghum protein digestibility, 2-4.
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Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales.
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Cereal Chemists, St Paul, MN, 185–221.
51
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REFERENCIAS ELECTRÓNICAS
Fecha de consulta: marzo-junio de 2010
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[2] http://www.financierarural.gob.mx/informacionsectorrural/Documents/Sorgo.pdf.
[3] http://www.icia.es/icia/download/suelosyriegos/Fin%20de%20carrera%201J.pdf
52
[4] http://www.upf.edu/sct/es/proteomica/presentacio/
[5] www.cultek.com/index.asp?p=Soluciones-Electroforesis-Principal
[6] http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm#Introducciónytécnicabásica.
[7] http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/
[8] http://www.ehu.es/biomoleculas/1b/pdf/proteinas.pdf
[9] http://www.infoceliaquia.org/olga_martinez/el_sorgo.html
[10] http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/zoomieffractionator_man.pdf
53
IX. ANEXOS
54
9.1 Preparación del gel SDS-PAGE
El gel de poliacrilamida está compuesto por dos fases: un gel concentrado el cual presenta
menor concentración de acrilamida y por lo tanto poros de menor tamaño, y un gel
separados con una concentración mayor y poros de menor tamaño.
Para la polimerización del gel, se mezclan los reactivos en las cantidades indicadas,
primero para el separador dejando que polimerice, terminada la polimerización preparar el
gel concentrador. El persulfato de amonio (APS) dona los radicales necesarios para la
polimerización de la acrilamida-bis-acrilamida, reacción que es acelerada por el TEMED.
Es de vital importancia adicionar el TEMED al final de la mezcla teniendo montada la
cámara, esto debido a que la polimerización puede empezar antes de llenar la cámara de
electroforesis para la formación del gel.
Tabla 8. Preparación de gel de poliacrilamida de 14 cm
Reactivo
Gel concentrado (4%)
Gel separador (12.5%)
525 L
13.2 mL
Tampón pH 6.8
1 mL
----
Tampón pH 8.8
----
8.2 mL
SDS 10%
40 L
330 L
Agua
2.44 mL
11 mL
APS 10%
36 L
192.5 L
TEMED
1 L
13.85 L
Acrilamida Bisacrilamida 30%
55
Tabla 9. Preparación de gel de poliacrilamida de 18 cm
Reactivo
Gel concentrado (4%)
Gel separador (12.5%)
327.5 L
21 mL
Tampón pH 6.8
625 L
----
Tampón pH 8.8
----
13 mL
SDS 10%
25 L
500 L
Agua
1.525 mL
17.5 mL
APS 10%
22.5 L
306.5 L
TEMED
0.625 L
22 L
Acrilamida Bisacrilamida 30%
9.1.1 Preparación de solución APS 10%
Se pesan 1 g de persulfato de amonio (APS), y se disuelve en 8 mL de agua desionizada,
aforar a 10 mL y guardar en tubos a -20°C, cubiertos con papel aluminio.
9.2 Preparación de solución de equilibrio
Tabla 10. Reactivos para la preparación de solución de equilibrio
Para preparar 100 mL de solución
Medir
Tris 50 mM pH 8.0
3.3 mL (Stock 1.5 M)
Urea 6M
66.6 mL (Stock 9 M)
Glicerol 30%
30.15 mL (99.5%)
SDS 2%
2.0 g
glicerol, Tris y Urea en una probeta graduada, añadir con cuidado el SDS
previamente pesado y disolver. Guardar en alícuotas a -20°C, cubierto con papel aluminio.
56
9.3 Preparación de solución IEF Denaturant 1.1 x ZOOM
Tabla 11. Reactivos para la preparación de solución IEF Denaturant 1.1 x ZOOM
Para preparar 50 mL de solución
Urea 7.7M
23.12 g
Tiourea 2.2M
8.37 g
CHAPS 4.4 %
2.2 g
Antes de pesar la urea y tiourea deben desionizarce con amberlita, posteriormente se pesan
las cantidades correspondientes de cada reactivo, disolver en 40 mL de agua desionizada y
aforar a 50 mL. Guardar en alícuotas a -20°C.
9.4 Preparación de tampón ánodo y cátodo ZOOM
Tabla 12. Reactivos para la preparación de 18 mL de tampón ánodo y cátodo ZOOM
Relativo
Ánodo
Cátodo
Urea ZOOM
7.56 g
7.56 g
Tiourea ZOMM
2.7 g
2.7 g
Anode buffer 50x
2.97 mL
----
Cathode buffer 10x
----
1.8 mL
Agua
6 mL
6 mL
Pesar Urea y Tiourea y disolver con el resto de los reactivos, aforar a 18 mL con agua
desionizada. Preparar al momento de utilizar.
57
9.5 Preparación de la muestra para el isoelectroenfoque (Primera dimensión)
Tabla 13. Reactivos para el isoelectroenfoque de proteínas ácidas y básicas
Proteínas
ácidas
básicas
DeStreack
4.0 L
2.8 L
DTT 2M a 0.3%
3.4 L
2.5 L
IPG Buffer
1.7 L (pH 4-7, 0.5%)
0.6 L (pH 6-11, 0.25%)
En cantidad suficiente para 340
En cantidad suficiente para 250
L
L
Tampón IEF
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