Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Lorenzo Villa Z.
FACULTAD: Farmacia
UNIVERSIDAD: Concepción
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Karin Jürgens Sch.
INSTITUTO: Farmacia
FACULTAD: Ciencias
“EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS ANSIOLÍTICO Y ANTIDEPRESIVO DEL
EXTRACTO METANÓLICO DE Modiola caroliniana EN RATONES”
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar
al Título de Químico Farmaceútico
RAMIRO ANDRÉS COFRÉ COFRÉ
VALDIVIA – CHILE
2009
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos:
A mi profesor patrocinante Q.F Lorenzo Villa Zapata, por todo el apoyo brindado en la
realización de este trabajo. Gracias por su profesionalismo y constante preocupación.
A mi profesora co-patrocinante Q.F Karin Jürgens, por su profesionalismo y apoyo
constante durante la realización del presente trabajo.
A mi profesora informante Dra. Eliana Sánchez, por aceptar formar parte de la presente
comisión.
Al Sr. Joel Pardo, por la valiosa ayuda prestada durante la realización experimental del
presente trabajo.
A mis compañeros de la promoción 2002, especialmente a Samuel, Carlos, Pako,
Rodrigo Aguilar, Sergio y Pato por todos los buenos momentos compartidos durante
estos años.
Finalmente, quiero agradecer a mi abuela Prosperina, a mi tía Bernardita y a mi mamá
Elizabeth, por el apoyo incondiconal y constante que he recibido de ustedes durante
toda mi vida; sin lugar a dudas son pilares fundamentales en la realización de este
logro.
ÍNDICE GENERAL
1. RESUMEN
1
1. ABSTRACT
3
2. INTRODUCCIÓN
5
2.1 Carga global de los trastornos mentales y conductuales…………………………...5
2.2 Ansiedad y Depresión: Generalidades………………………………………………..6
2.2.1 Ansiedad………………………………………………………………………………..6
2.2.2 Depresión………………………………………………………………………………7
2.2.3 Relación ansiedad / depresión……………………………………………………….7
2.2.4 Necesidad de desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento………………...8
2.3 Modiola caroliniana……………………………………………………………………...9
2.3.1 Aspectos taxonómicos………………………………………………………………11
2.3.2 Nombres comunes…………………………………………………………………..11
2.3.3 Información botánica………………………………………………………………...11
2.3.4 Composición química………………………………………………………………..11
2.3.5 Hábitat…………………………………………………………………………………11
2.3.6 Usos en medicina tradicional……………………………………………………….12
2.3.7 Partes utilizadas de la planta……………………………………………………….12
2.4 Hipótesis………………………………………………………………………………..13
2.5 Objetivos………………………………………………………………………………..13
2.5.1 Objetivo General……………………………………………………………………. 13
2.5.2 Objetivos Específicos………………………………………………………………. 14
3. MATERIALES Y MÉTODOS
16
3.1 MATERIALES………………………………………………………………………….16
3.1.1 Material vegetal………………………………………………………………………16
3.1.2 Reactivos……………………………………………………………………………..16
3.1.2.1 Preparación del extracto………………………………………………………….16
3.1.2.2 Pruebas conductuales…………………………………………………………….16
3.1.2.3 Análisis fitoquímico………………………………………………………………..16
3.1.2.4 Material cromatográfico…………………………………………………………...18
3.1.2.5 Equipos……………………………………………………………………………..18
3.1.2.6 Instrumentos estudios conductuales…………………………………………….19
3.1.2.7 Material de laboratorio…………………………………………………………….19
3.2 MÉTODOS…………………………………………………………………………...…20
3.2.1 Planta………………………………………………………………………………….20
3.2.2 Preparación del extracto…………………………………………………………….20
3.2.3 Análisis fitoquímico…………………..………………………………………………20
3.2.4 Análisis cromatográfico…………………………..………………………………….22
3.2.5 Animales………………………….…………………………………………………..24
3.2.6 Determinación de la dosis de extracto a utilizar….………………………………24
3.2.7 Condiciones de experimentación………………………...……………………….. 25
3.2.8 Modelos experimentales de ansiedad y depresión………………………………26
3.2.8.1 Laberinto elevado en cruz……………………………………...…………………26
3.2.8.2 Prueba de campo abierto con agujeros…………………………………………29
3.2.8.3 Prueba nado forzado………………………………………………………………31
3.2.9 Análisis estadístico…………………………………………………………………..33
4. RESULTADOS
34
4.1 Análisis fitoquímico…………………………….………………………………………34
4.2 Análisis cromatográfico de los extractos…………………..………………………...37
4.3 Determinación de dosis del extracto a utilizar………..……………………………..47
4.4 Pruebas conductuales………………………………………………………………....49
4.4.1 Laberinto elevado en cruz…………………………………………………………..49
4.4.2 Prueba de campo abierto con agujeros…………………………………………...51
4.4.3 Prueba nado forzado………………….……………………………………………. 54
5. DISCUSIÓN
55
6. CONCLUSIONES
64
7. LITERATURA CITADA
65
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modiola caroliniana………………………………………………………………..10
Figura 2. Prueba modificación de la conducta exploratoria………………………………25
Figura 3. Laberinto elevado en cruz..............................................................................28
Figura 4. Aparato de campo abierto con agujeros……………………………………….. 30
Figura 5. Nado forzado……………………………………………………………………….32
Figura 6. Reacciones de identificación.…………………………………………………….35
Figura 7. Reconocimiento de compuestos con núcleo esteroídeo. Reacción de
Liebermann……………………………………………………………………………………..36
Figura 8. Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico (C y D)
observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente acetato de etilo – metanol - agua
(100:13,5:10)……………………………………………………………………………………38
Figura 9. Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico (C y D)
observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente tolueno - acetato de etilo (93:7)…..40
Figura 10. Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el
reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-Visible……………………………42
Figura 11. Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el
reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-365 nm…………………………..43
Figura 12. Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados con el
reactivo de Kedde y observados al UV-Visible……………………………………………..45
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Investigación de constituyentes solubles en agua……………………………..21
Tabla 2. Investigación de constituyentes insolubles en agua……………………….......21
Tabla 3. Reacciones de indentificación de alcaloides……………………………………22
Tabla 4. Disolventes utilizados sobre los dos extractos en estudio para la identificación
de compuestos químicos…………………………………………………….........................23
Tabla
5. Resultado de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes solubles en
agua……………………………………………………..……………….……………………..34
Tabla 6. Resultado de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes insolubles en
agua…………………………………………………………………………...........................36
Tabla 7. Resultado de los ensayos fitoquímicos realizados para determinar presencia
de alcaloides……………………………………………………………………………………37
Tabla 8. Determinación de compuestos polares presentes en los extractos clorofórmico
y metanólico de Modiola caroliniana…………………………………………………………39
Tabla 9. Determinación de compuestos lipofílicos presentes en los extractos
clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana………………………………………….41
Tabla 10. Investigación de compuestos con núcleo esteroideo…………………….......44
Tabla 11. Determinación de heterósidos cardiotónicos (genina con 23 átomos de
carbono)…………………………………………………………………………………………46
.
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el número
de empinamientos……………………………………………………………………………...47
Gráfico 2. Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el Nº de
cruces del círculo central………………………………………………………………………48
Gráfico 3.
Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el porcentaje de tiempo de permanencia de los ratones en las ramas
abiertas del Laberinto elevado en cruz……………………………………………………....49
Gráfico 4.
Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre la actividad motora de ratones, en el Laberinto elevado en cruz……..50
Gráfico 5.
Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el Nº de exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto
con agujeros……………………………………………………………………………………51
Gráfico 6.
Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el tiempo de exploración subterránea en la prueba de campo abierto
con agujeros……………………………………………………………………………………52
Gráfico 7. Efecto del cloruro de sodio,
extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre la actividad motora de ratones en la prueba de campo abierto con
agujeros…………………………………………………………………………………………53
Gráfico 8. Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de
M.caroliniana y
diazepam sobre el tiempo de inmovilidad, en la prueba de Natación forzada………….54
1
1. RESUMEN
Modiola caroliniana (“pila-pila”) es una planta herbácea y rastrera de 15 a 45 cm de
tamaño, perteneciente al orden de las malváceas. En Chile es posible encontrar esta
especie desde Coquimbo hasta Chiloé. El extracto de esta planta, es utilizado en
medicina tradicional mapuche para tratar depresiones, cuadros de ansiedad, fatiga por
trabajo intelectual excesivo y agotamiento nervioso.
Se evaluaron los efectos ansiolítico y antidepresivo atribuidos popularmente al extracto
de Modiola caroliniana utilizando modelos de conducta animal. El efecto ansiolítico se
evaluó usando las pruebas de laberinto elevado en cruz y campo abierto con agujeros
y el efecto antidepresivo se evaluó con la prueba de nado forzado. Previo a la
realización de las pruebas, ratones machos de la especie Mus musculus cepa
Rockefeller fueron divididos en tres grupos experimentales (A, B y C) y posteriormente
recibieron vía intraperitoneal 30 minutos antes de ser sometidos a los test: cloruro de
sodio (control negativo, grupo A), extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg
(grupo B) o una droga de referencia (control positivo, grupo C) según corresponda.
El extracto metanólico de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg no modifica la
actividad motora ni el porcentaje de permanencia de los ratones en las ramas abiertas
del laberinto. Tampoco modifica la actividad motora, frecuencia y duración de las
exploraciones subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros. En la prueba
de natación forzada no presentó efecto anti-inmovilidad. El análisis fitoquímico y
cromatográfico (capa fina) permitió determinar en la planta, la presencia de mucílagos,
azúcares no reductores y a lo menos un compuesto con núcleo esteroídeo.
2
El extracto metanólico de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg administrado vía
intraperitoneal carece de los efectos ansiolítico y antidepresivo que popularmente se le
atribuyen en medicina tradicional mapuche.
3
1. ABSTRACT
Modiola caroliniana is an herbaceous creeper plant 15 to 45 cm in size belonging to the
malvaceas order. In Chile, it is possible to find this species from Coquimbo to Chiloé.
The extract of this plant is used in traditional Mapuche medicine to treat depression,
anxiety, and fatigue due to excessive intellectual effort.
In the study, anxiolytic and anti-depressive effects, traditionally attributed to the extract
of Modiola caroliniana, were assessed by employing animal behaviour models. The
anxiolytic effect was assessed by the Elevated Plus-Maze Test and by and the HoleBoard Test, while the anti-depressive effect was assessed by the Forced Swimming
Test. Before carrying out the tests, Mus musculus male mice from the Rockefeller strain
were separated into three experimental groups (A, B and C). Thirty minutes before the
mice were exposed to the tests, they received through intraperitoneal injection: sodium
chloride (negative control, group A); M. Caroliniana extract in a dose of 150 mg/kg
(group B) or a reference drug (positive control, group C) as applicable.
The methanolic extract of the Modiola Caroliniana did not modify the physical activity nor
the percentage of permanence of the mice in the open branches of the maze. The
extract also did not modify the physical activity, frequency, or duration of the
underground explorations in the Hole-Board Test. During the Forced Swimming Test the
extract did not cause any anti-immobility effect. The presence of mucilages, non
reducers sugars and at least one compound steoideo nucleus was identified using
phytochemical analysis and thin later chromatography (TLC).
4
The methanolic extract of Modiola caroliniana in dose of 150 mg/kg delivered through
intraperitoneal injection lacks the anxiolytic and anti-depressive effects that described by
traditional Mapuche medicine.
5
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Carga global de los trastornos mentales y conductuales
Los trastornos mentales y del comportamiento afectan aproximadamente a 450 millones
de personas en todo el mundo. Este tipo de trastornos se caracterizan por su
frecuencia, más del 25% de la población los padece en algún momento de su vida. Son
también universales, afectan a personas de todas las edades, países y sociedades.
Traen consigo un impacto emocional y también económico que repercute directamente
sobre la calidad de vida de los individuos, familias y sociedades que los padecen (OMS,
2001). Se calcula que el gasto ocasionado por estos trastornos puede equivaler a 3-4%
del producto interno bruto de los países desarrollados (Minoletti y Zaccaria, 2005).
El informe sobre Salud en el Mundo 2001 ha estimado que en 1990, el 10% de los Años
de Vida Ajustados por Discapacidad (AVAD), eran consecuencia de los trastornos
mentales y del comportamiento. Para el año 2000 ese porcentaje había aumentado al
12%, y se estima que llegará hasta el 15% en 2020, siendo los trastornos
frecuentes las depresiones, cuadros de
más
ansiedad, uso de sustancias psicoactivas,
esquizofrenia, epilepsia y enfermedad de Alzheimer (OMS, 2001; Cañoles, 2007). En
Chile, los trastornos de la salud mental y del comportamiento constituyen un problema
de salud pública de primera importancia, como lo demuestran los datos sobre
prevalencia de trastornos mentales graves en atención primaria que sitúan a Santiago
de Chile en el primer lugar en incidencia de depresión (29,5%), en el segundo lugar
(18,7%) en incidencia de ansiedad y en el sexto lugar en dependencia de alcohol (2,5%)
entre distintas ciudades del mundo (OMS, 2001).
6
2.2 Ansiedad y Depresión: Generalidades
El estado de ánimo y las emociones son dos facetas de la conducta. Según Nestler et
al. (2001), las emociones son respuestas adaptativas transitorias a estímulos externos,
internos y cognoscitivos. Por su parte, el estado de ánimo se refiere a una conducta
persistente en el individuo, por ejemplo, de ansiedad, depresión o euforia (Vera, 2005).
2.2.1 Ansiedad
La ansiedad puede ser una emoción normal y un trastorno psiquiátrico, dependiendo de
su intensidad y de su repercusión sobre la actividad de la persona. En condiciones
normales constituye uno de los impulsos vitales que motiva al individuo a realizar sus
funciones y a enfrentarse a situaciones nuevas. La ansiedad se convierte en patológica
cuando adquiere tal protagonismo que el individuo desplaza hacia ella toda su atención,
interfiriendo de forma negativa en su rendimiento y funcionamiento psicosocial.
Las manifestaciones de ansiedad consisten en una respuesta vivencial, fisiológica,
conductual y cognitiva, caracterizada por un estado generalizado de alerta y activación.
En términos patológicos la ansiedad puede describirse como la vivencia de un
sentimiento de amenaza, de expectación tensa hacia el futuro y de alteración del
equilibrio psicosomático en ausencia de un peligro real o, por lo menos,
desproporcionada en relación con el estímulo desencadenante (Gastó y Vallejo, 2000;
Flórez, 2003).
7
2.2.2 Depresión
La sociedad Americana de Psiquiatría define la depresión como un trastorno
heterogéneo que se manifiesta con síntomas a nivel psicológico, conductual y fisiológico
que provocan en el paciente una pérdida de interés y placer por realizar casi todas las
actividades que le son cotidianas, para su diagnóstico estos síntomas deben persistir a
lo menos por dos semanas (Cryan et al, 2002; Borsini y McArthur, 2006). El Ministerio
de Salud (Minsal, 2006) define la depresión como una alteración patológica del estado
de ánimo con descenso del humor que termina en tristeza, acompañada de diversos
síntomas
y
signos
de
tipo
vegetativo,
emocionales,
comportamiento y de los ritmos vitales que persisten por un
del
pensamiento,
del
tiempo habitualmente
prolongado (a lo menos de dos semanas). Wei et al. (2008), define la depresión como
un cuadro clínico complejo, caracterizado por una serie de manifestaciones ideativas,
de la conducta y afectivas, que provocan en el paciente angustia, tristeza, inhibición
psicomotora y de la función cognitiva, como síntomas predominantes.
2.2.3 Relación ansiedad / depresión
Por muchos años la depresión y la ansiedad fueron consideradas
enfermedades
mentales diferentes, siendo las benzodiazepinas las drogas de elección utilizadas para
tratar los estados agudos de ansiedad y los inhibidores de la recaptación de
monoaminas e inhibidores de la monoamino oxidasa las drogas de elección para tratar
la depresión (Mora et al, 2005a). Sin embargo en la actualidad, los datos clínicos sobre
patrones sindrómicos, curso evolutivo y respuesta terapéutica, muestran una asociación
cada vez mayor entre ansiedad y depresión, en muchos casos con solapamiento entre
ambos cuadros, lo que hace que hoy en día los márgenes entre ambos síndromes sean
8
cada vez más imprecisos (Elliott et al, 1992; Gastó y Vallejo, 2000). En el tratamiento de
los trastornos de ansiedad, las benzodiazepinas están siendo lentamente sustituidas
por los antidepresivos, los cuales no sólo son eficaces en la depresión sino también en
el tratamiento de los cuadros agudos y crónicos de los trastornos ansiosos (Buller y
Legrand, 2001). La indicación clínica para muchos de los nuevos compuestos
antidepresivos incluye tanto los trastornos depresivos como los cuadros de ansiedad.
2.2.4 Necesidad de desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento
A la fecha se han desarrollado un gran número medicamentos para tratar los cuadros
depresivos y los trastornos de ansiedad (Mora et al, 2006). Pese a ello, el actual arsenal
farmacológico sigue siendo insuficiente, ya que un tercio de los pacientes que sufren
este tipo de trastornos son intolerantes o refractarios a los tratamientos actualmente
disponibles (Bhattamisra et al, 2008). Este escenario, exige el desarrollo de nuevas
drogas que permitan ofrecer tratamientos más eficaces y mejor tolerados a los
pacientes que sufren este tipo de patologías. El desarrollo de terapias en base a plantas
medicinales podría ser considerado una alternativa o complemento a los tratamientos
actualmente disponibles. La investigación de plantas medicinales para el tratamiento de
enfermedades psiquiátricas ha avanzado considerablemente en el último decenio. Así lo
refleja el creciente número plantas medicinales cuyo potencial psicoterapéutico ha sido
evaluado en una gran variedad de modelos animales de conducta. Estos estudios han
proporcionado valiosa información para el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas
basadas en plantas medicinales para su uso en psiquiatría clínica. Productos naturales
como el Hipericum perforatum, Panax ginseng, Piper methysticum y Ginkgo biloba
fueron introducidos en la práctica psiquiátrica durante la década pasada (Zhang, 2004).
9
2.3 Modiola caroliniana
El hombre desde el principio de los tiempos, ha utilizado las plantas para vestirse,
alimentarse, construir sus viviendas y recuperar su salud. Según relata la historia, los
vegetales fueron los primeros medicamentos utilizados por el hombre para satisfacer
sus necesidades de salud, aliviando síntomas, previniendo o curando enfermedades.
Por este motivo, no es de extrañar que muchas de las medicinas de hoy tengan su
origen directo o indirecto en las investigaciones de plantas a las cuales popularmente se
le atribuyen propiedades medicinales (Lewis, 1997).
Según la OMS, las plantas medicinales son todos aquellos vegetales que poseen en
uno o más de sus órganos sustancias que puedan
ser utilizadas con finalidad
terapéutica o que son precursoras para la semisíntesis químico-farmacéutica (Montes et
al, 1992).
En la actualidad, se estima que sólo el 5-10% del total de plantas presentes en nuestro
planeta han sido investigadas respecto a su composición química o actividad biológica
(Montes et al, 1992), constituyendo un recurso excepcionalmente vasto de productos
biológicamente activos, que pueden ser útiles por si mismos o bien pueden servir como
fuente natural de nuevos prototipos químicos para el desarrollo de derivados
modificados con actividades farmacológicas incrementadas y/o toxicidad reducida.
Ante la imposibilidad de estudiar las sustancias biológicamente activas de las más de
500.000 especies de plantas que se encuentran en la tierra y el mar, la medicina
tradicional se presenta como un punto de partida razonable en la búsqueda de
principios activos con potencial terapéutico (Medina et al, 1997).
10
Modiola caroliniana (Fig. 1) es una planta herbácea y rastrera de 15 a 45 cm de tamaño,
perteneciente al orden de las Malváceas. En Chile esta especie es conocida
popularmente como “pila-pila” y es utilizada en medicina tradicional mapuche para
tratar ciertos trastornos mentales y conductuales (Houghton y Manby, 1985; Farmacia
Makelawen, comunicación verbal). No se ha encontrado información en la literatura
publicada en la que se hayan evaluado científicamente los efectos farmacológicos
popularmente descritos.
Figura 1: Modiola caroliniana
11
2.3.1 Aspectos taxonómicos
Taxonómicamente Modiola caroliniana es una planta perteneciente al Reino Plantae;
Sub-reino Traqueobionta; Superdivisión Spermatophyta; División Magnoliophyta; Clase
Magnoliopsida; Sub-clase Dillenidae; Orden Malváceas (Heike et al, 2005).
2.3.2 Nombres comunes
Entre los nombres comunes de esta especie destaca pila-pila, sana todo, escobillo,
hiedra y babosilla (Montes et al, 1992; Del Vitto et al, 1996; Heike et al, 2005).
2.3.3 Información botánica
Modiola caroliniana es una planta herbácea y rastrera de 15 a 45 centímetros de
tamaño, tiene un tallo ascendente con raíces que presentan nudos, posee hojas
alternas de 1,5 a 4 centímetros de longitud y en periodo de inflorescencia produce flores
axilares, pequeñas y solitarias (Rzedowski et al, 2001).
2.3.4 Composición química
Sólo se ha descrito la presencia de mucílagos en la planta (Montes et al, 1992).
2.3.5 Hábitat
Esta planta crece en suelos bajos, húmedos y fértiles. Es común encontrarla a orillas de
los caminos y en medio de siembras. En Chile es posible encontrarla desde Coquimbo
hasta Chiloé (Montes et al, 1992; Farmacia Makelawen, comunicación personal).
12
2.3.6 Usos en medicina tradicional
Montes et al. (1992) describe que esta planta es utilizada en forma externa sobre la
piel, por sus propiedades emolientes y de forma interna se utiliza para tratar dolores de
garganta. En Argentina, se utiliza tradicionalmente por sus propiedades refrescantes,
calmantes y emolientes (Del Vitto et al, 1996). En México, la infusión de las hojas se
utiliza como calmante y refrescante (Heike et al, 2005). Los mapuches utilizan el jugo de
las hojas para tratar cuadros infecciosos y enfermedades cardiovasculares y atribuyen
al jugo de la planta propiedades refrescantes, vigorizantes y antidepresivas (Houghton y
Manby, 1985).
En Chile, la farmacia mapuche Makelawen comercializa a través de su red de locales
ubicados en distintas ciudades de país, y también por Internet, el extracto de esta planta
para tratar depresiones, neurosis con humor cambiante, fatiga por trabajo intelectual
excesivo y agotamiento nervioso.
2.3.7 Partes utilizadas de la planta
La medicina tradicional mapuche utiliza tanto las partes aéreas de la planta como las
raíces, recolectadas preferentemente en primavera durante el periodo de inflorescencia
(Farmacia Makelawen, comunicación personal).
13
Considerando la prevalencia y comorbilidad de las enfermedades mentales a nivel
mundial, sumado ésto a la necesidad de desarrollar nuevas terapias más eficaces y con
una menor incidencia de efectos segundarios, se propone en la presente tesis la
realización de un estudio psicofarmacológico con el fin de evaluar el potencial ansiolítico
y antidepresivo atribuido en
medicina tradicional mapuche al extracto de Modiola
caroliniana.
2.4 Hipótesis de trabajo
•
Modiola caroliniana (pila-pila) presenta propiedades ansiolíticas, que modifican
conducta en ratones.
•
Modiola caroliniana
(pila-pila) presenta propiedades
antidepresivas, que
modifican conducta en ratones.
2.5 Objetivos
2.5.1 Objetivo General
Evaluar los posibles efectos antidepresivos y ansiolíticos del extracto metanólico de
Modiola caroliniana en ratones.
14
2.5.2 Objetivos Específicos
•
Recolectar material vegetal en periodo de inflorescencia, correspondiente a
hojas, ramas y raíces de Modiola caroliniana.
•
Obtener un extracto metanólico de las hojas, ramas y raíces secas y molidas de
Modiola caroliniana.
•
Realizar
una
cualitativamente
caracterización
fitoquímica
de
la
especie
y
evaluar
mediante cromatografía en capa fina (c.c.f) el extracto
metánolico y clorofórmico de Modiola caroliniana.
•
Determinar una dosis de extracto metanólico a utilizar para su posterior
administración a los animales de experimentación.
•
Evaluar y relacionar la acción ansiolítica y actividad motora de un extracto
metanólico de Modiola caroliniana administrado intraperitonealmente en ratones,
por medio del laberinto elevado en cruz.
•
Evaluar y relacionar la acción ansiolítica y actividad motora de un extracto
metanólico de Modiola caroliniana administrado intraperitonealmente en ratones,
por medio de la prueba de campo abierto con agujeros.
15
•
Evaluar el efecto antidepresivo de un extracto metanólico de Modiola caroliniana
inyectado intraperitonealmente en ratones, midiendo los tiempo de inmovilidad
en la prueba del nado forzado.
•
Relacionar los efectos farmacológicos evaluados con el uso empírico y
tradicional de Modiola caroliniana.
16
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Material vegetal
Hojas, ramas y raíces secas y molidas de Modiola caroliniana.
3.1.2 Reactivos
3.1.2.1 Preparación del extracto:
•
Metanol (Merck)
•
Agua destilada
3.1.2.2 Pruebas conductuales
Como fármaco ansiolítico de referencia: Diazepam (Laboratorio Mintlab).
•
Nombre IUPAC: 7-Cloro-1,3-dihidro-1-metil-5-fenil-2-H-1,4-benzodiazepin-2-ona.
Como fármaco antidepresivo de referencia: Imipramina (Laboratorio Chile).
•
Nombre
IUPAC:
3-(5,6-dihidrobenzo[b][1]benzazepina-11-il)-N,N-dimetilpropano-1-
amina.
•
Controles: Suero Fisiológico del Laboratorio Braun.
Solución de NaCl 0,9%.
3.1.2.3 Análisis fitoquímico
•
Acetato de plomo
•
Sulfato de sodio: Na2SO4 (Merck)
•
Antrona en medio sulfúrico
•
Reactivo de Molisch
17
•
Ácido sulfúrico: H2SO4 (Merck)
•
Licor de Fehling
•
Etanol: CH3CH2OH (Merck)
•
S.R Tricloruro de fierro
•
Metanol: CH3OH (Merck)
•
Ácido clorhídrico: HCl (Merck)
•
Magnesio metálico
•
Cloroformo: CHCl3 (Merck)
•
Sulfato de sodio anhidro
•
Anhídrido acético
•
Etanol de 70º
•
S.R acetato básico de plomo
•
Ácido acético con trazas de FeCl3
•
Ácido sulfúrico con trazas de FeCl3
•
Solución al 2% de ácido 3,5-dinitrobenzoico en alcohol
•
NaOH 2N
•
Ácido pícrico al 1% en etanol
•
NaOH al 10% en agua
•
Amoniaco
•
Ácido nítrico: HNO3
•
S.R Dragendorff
•
S.R Silicotúngstico
18
•
S.R Bouchardat
3.1.2.4 Material cromatográfico
Placas cromatográficas de sílica gel tipo 60 con indicador de fluorescencia
(Alugram ®).
Cámara cromatográfica de vidrio, dimensiones: 22 cm de alto; 11,5 cm de ancho;
23,5 cm de largo.
Eluyentes:
•
Acetato de etilo : metanol : agua (100 : 13,5 : 10)
•
Tolueno : Acetato de etilo (93 : 7)
Reactivos de coloración:
•
Reactivo de Kedde:
5 mL de ácido 3,5-dinitrobenzoico al 3% en etanol.
5 mL de NaOH 2M
•
Reactivo de Liebermann-Burchard:
5 mL anhídrido acético
5 mL de H2SO4 concentrado
50 mL de etanol absoluto
3.1.2.5 Equipos
•
Rotavapor (Büchi)
•
Balanza electrónica (Sensotronic)
•
Balanza analítica (Shimadzu)
•
Baño termorregulado (SW22)
•
Baño de ultrasonido (Ney Ultrasonik 208 H)
19
•
Estufa de secado (Binder)
•
Lámpara de luz UV a longitud de onda de 254 y 366 nm
•
Agitador Vortex (Velp Scientífica)
3.1.2.6 Instrumentos estudios conductuales
•
Caja de acrílico
•
Cilindro de acrílico
•
Laberinto en cruz elevado
•
Aparato de campo abierto con agujeros
3.1.2.7 Material de laboratorio
•
Matraces aforados y Erlenmeyer de diferente graduación
•
Pipetas
•
Pizeta
•
Embudo de vidrio
•
Tubos de ensayo
•
Probetas de vidrio de diferente graduación
•
Espátula
•
Frascos de diferentes volúmenes
•
Papel filtro, Advantec MFS, Inc. Diámetro 11 cm, Nº2
•
Crisoles de porcelana
•
Mortero de vidrio
•
Jeringas de tuberculina de 1 mL.
20
3.2 MÉTODO
3.2.1 Planta
La planta en estudio, Modiola caroliniana, fue recolectada durante el mes de Diciembre
de 2007 en los faldeos cordilleranos de la comuna de Curarrehue, provincia de Cautín,
región de la Araucanía (39º 22´ latitud Sur – 71º 35´ longitud Oeste).
3.2.2 Preparación del extracto
Se pesó 1,5 kg de hojas, ramas y raíces, secas y molidas y se dejó macerar por
48 horas en 5 litros de metanol, se filtró por gasa y posteriormente en papel filtro
Advantec Nº2. Este procedimiento se realizó tres veces para agotar la extracción. El
extracto metanólico obtenido, se concentró en un rotavapor hasta la obtención de una
solución pastosa. Con la finalidad de extraer los restos de agua de la solución, ésta fue
colocada en una estufa de secado a 75ºC
por 24 horas, hasta la obtención de
121,90 gramos de extracto seco (8,13 % de rendimiento).
3.2.3 Análisis Fitoquímico
El análisis fitoquímico tiene como objetivo analizar una droga vegetal utilizando técnicas
simples y rápidas que permitan detectar la presencia de determinados grupos de
compuestos o constituyentes específicos, aportando información al conocimiento de las
drogas vegetales (Jürgens, 2007).
21
Tabla 1: Investigación de constituyentes solubles en agua
Ensayos
Metabolitos
Reacción positiva
Antrona en medio sulfúrico
Todo tipo de azúcares
Anillo color verde en la
interfase
Reactivo de Molish
Azúcares reductores y no
Anillo color violeta en la
reductores
interfase
Licor de Fehling
Azúcares reductores
Precipitado rojizo
Prueba de etanol
Gomas y mucílagos
Precipitado blanco
gelatinoso
Prueba de Espuma
Saponinas
Espuma abundante y
persistente
S.R. FeCl3
Reacción de la cianidina
Taninos pirogálicos
Coloración azul negro
Taninos catéquicos
Coloración verde
Flavonas
Coloración anaranjada
Flavonoles
Coloración rojo cereza
Flavanonas
Coloración rojo violáceo
Tabla 2: Investigación de constituyentes insolubles en agua
Ensayos
Metabolitos
Reacción positiva
Reacción de Liebermann
Núcleo Esteroideo
Coloración verde
Reacción de
Heterósidos cardiotónicos
Anillo color rojo pardo en
Keller-Kiliani
(con 2-desoxiazúcares)
la interfase
Reacción de Kedde
Heterósidos cardiotónicos
Color rojo violeta
(genina de 23 átomos de C)
Reacción de Baljet
Heterósidos cardiotónicos
Coloración anaranjada
(genina de 23 átomos de C)
Reacción de Bornträger
Heterósidos antraquinónicos
Coloración roja o rosada
en fase acuosa
22
Tabla 3: Reacciones de identificación de alcaloides
Ensayos
Metabolitos
Reacción positiva
S.R Dragendorff
Alcaloides
Precipitado pardoanaranjado
S.R Bouchardat
Alcaloides
Precipitado pardoanaranjado
S.R Lugol
Alcaloides
Precipitado pardoanaranjado
S.R Silicotúngstico
Alcaloides
Precipitado blanco
3.2.4 Análisis cromatográfico de los extractos
El análisis cualitativo de los extractos metanólico y clorofórmico se realizó por medio de
la técnica de cromatografía en capa fina (c.c.f). Se utilizaron como adsorbente
cromatoláminas de gel sílice tipo 60 con indicador de fluorescencia (fase estacionaria).
Las fases móviles utilizadas fueron mezclas de disolventes orgánicos con polaridades
definidas, que actuaban como eluyentes sobre las cromatoláminas, permitiendo la
partición diferencial de las moléculas entre el adsorbente y el disolvente procediéndose
así a la separación.
Las cromatoláminas fueron observadas tanto al UV-Visible como bajo una lámpara de
luz UV a 254 y 365 nm y reveladas posteriormente con el reactivo de Kedde y
Liebermann-Burchard con la finalidad de poner de manifiesto la presencia de
determinados grupos de compuestos químicos en la planta.
Ambos reactivos fueron preparados en el momento de su utilización y luego se
aplicaron en forma de spray sobre los cromatogramas. Una vez aplicado el reactivo de
23
Liebermann-Burchard sobre los cromatogramas, estos fueron calentados a 100ºC por 5
minutos y posteriormente observados al UV-Visible y UV-365 nm con la finalidad de
determinar la presencia de compuestos con núcleo esteroideo. Luego de la aplicación
del reactivo de Kedde sobre los cromatogramas, estos fueron observados al UV-Visible
(temperatura ambiente) con la finalidad de determinar la presencia de cardenólidos.
En la siguiente tabla, se describen las fases móviles utilizadas sobre los dos extractos
en estudio, para la identificación de los principales metabolitos secundarios
(Hildebert y Sabine, 1996).
Tabla 4: Disolventes utilizados sobre los dos extractos en estudio para la
identificación de compuestos químicos
Metabolitos Secundarios
Flavonoides,
amargos,
saponinas,
glicósidos
Mezcla de disolventes
principios Acetato de etilo : metanol : agua
cardiacos, (100 : 13,5 : 10)
alcaloides, antraglicósidos y arbutina
Aceites
esenciales,
cumarinas, naftoquinonas,
terpenos, Tolueno
ácidos (93 : 7)
lipofílicos en plantas y valpotriatos
:
Acetato
de
etilo
24
3.2.5 Animales
En el estudio se emplearon ratones machos de la especie Mus musculus, cepa
Rockefeller, de dos meses y medio de edad con pesos entre 30 y 45 gramos,
provenientes del bioterio del Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile.
Los animales permanecieron en grupos de 8 por jaula y fueron trasladados 24 horas
antes de cada sesión experimental al bioterio del Instituto de Histología, adyacente al
lugar de experimentación, y permanecieron allí bajo un fotoperiodo de luz-oscuridad de
12 horas (encendido de la luz a las 9ºº a.m), temperatura de 21 ºC con agua y alimento
a libre disposición. Todos los experimentos fueron realizados en el Laboratorio de
Farmacognosia y Toxicología del Instituto de Farmacia de la Universidad Austral de
Chile, hasta donde se trasladaron los animales inmediatamente antes de realizar cada
experimento. Todos los experimentos fueron realizados entre las 12 y 17 horas; periodo
del día en el cual la actividad diurna de los animales es la máxima (Paeile y Saavedra,
1990).
3.2.6 Determinación de la dosis de extracto a utilizar
La dosis de extracto a administrar, se determinó mediante una curva de dosis respuesta
frente a la modificación de la conducta exploratoria de los animales al ser colocados en
una caja de acrílico de 20 cm de ancho, 30 cm de largo y 7 cm de alto (Fig. 2). En el
piso se dibujó un círculo concéntrico de 10 cm de diámetro, la observación comenzó
con la colocación del animal en el círculo central y a partir de ese momento se midieron
los siguientes parámetros: número de empinamientos y número de veces que el animal
atraviesa el círculo central (conducta diagonal).
25
Figura 2: Prueba modificación de la conducta exploratoria
Se utilizó un cronómetro manual y el tiempo de observación fue de 6 minutos
(Buznego et al, 1998). La prueba fue video- grabada para su posterior análisis. La
determinación se realizó con un total de 24 ratones, separados en 8 grupos de 3
ratones cada uno. A estos se les administraron las siguientes dosis de extracto: 12,5;
25; 50; 100; 150; 200 y 300 mg/kg de extracto. Las comparaciones fueron hechas frente
a un grupo que recibió solución salina 12,5 ml/kg (Buznego et al, 1998; Reyes, 2000).
3.2.7 Condiciones de experimentación
Las pruebas conductuales se realizaron en sesiones diferentes y en cada una de ellas
se trabajó de manera simultánea con un grupo al cual se le administró solución salina
(control negativo), un grupo inyectado con el extracto de Modiola caroliniana
(resuspendido en solución salina) y otro grupo inyectado con una droga de referencia
(control positivo). En las pruebas de nado forzado y laberinto en cruz elevado, se
utilizaron 10 ratones por grupo y en la prueba de campo abierto con agujeros, se
utilizaron 8 ratones por grupo, asignados en forma aleatoria a cada grupo experimental.
26
La unidad experimental y observacional en todos los experimentos correspondió al
animal íntegro y cada uno fue testeado sólo una vez.
3.2.8 Modelos Experimentales de Ansiedad y Depresión
Modelar un fenómeno biológico significa reducirlo a sus características más relevantes,
con una consistencia estadística adecuada de manera que sea fácilmente abordable
con la metodología de investigación disponible (Yannielli, 1999). A pesar de sus
limitaciones obvias, como la imposibilidad de reproducir los
síntomas subjetivos
comunicados por los pacientes en la práctica clínica, los modelos animales en
psiquiatría han contribuido significativamente al conocimiento de los mecanismos
neuroquímicos y sustratos neuronales implicados en las enfermedades mentales y
conductuales, por esta razón constituyen una interfase de utilidad con las neurociencias
(Alguacil et al, 1996; Yannielli, 1999). Por una parte, son el canal más importante para
que los desarrollos terapéuticos farmacológicos se incorporen dentro de la perspectiva
clínica y por otra, estos modelos animales aportan información sobre el fundamento
psicobiológico de las patologías psiquiátricas (Rosenwasser y Wirz-Justice, 1997). Un
ejemplo de lo anterior lo proveen los estudios experimentales sobre ansiedad y
depresión que permiten inferir si los componentes de un extracto vegetal tienen
propiedades ansiolíticas y/o antidepresivas.
3.2.8.1 Laberinto elevado en cruz
El laberinto elevado en cruz es una de las pruebas más utilizadas para evaluar
ansiedad en ratones y es el modelo mejor validado desde el punto de vista conductual,
farmacológico y fisiológico para este fin (Pellow et al, 1985).
27
El fundamento del test se basa en la preferencia de los roedores por los espacios
cerrados del laberinto (ramas cerradas del laberinto) en relación a las abiertas. La
interpretación más aceptada es que la exposición a un ambiente novedoso promueve
tanto la exploración como el miedo, generando un conflicto de aproximación-evitación
(Yanielli, 1999), de esta forma se asume que cuando el ratón está en las ramas abiertas
experimenta sensaciones de vértigo, agorafobia y xenofobia que refuerzan el miedo y la
evitación, en relación a las ramas cerradas (Lister, 1987; Dawson y Tricklebank, 1995).
Se demostró así que el estado de ansiedad de un ratón es mayor en las ramas abiertas
y que las drogas ansiolíticas como las benzodiazepinas, aumentan la exploración de las
ramas abiertas y las ansiogénicas como las carbolinas la disminuían (Pellow y File,
1986). Adicionalmente, el laberinto nos permite obtener información de la actividad
motora de los animales, medida por el número total de entradas a ambas ramas
(Decker et al, 1994).
El laberinto (Fig. 3) consiste en una cruz
de acrílico formada por cuatro ramas
perpendiculares (dos abiertas y dos cerradas) de iguales dimensiones (30 x 5 cm)
unidas por una plataforma central opaca de 8 x 8 cm. Las ramas abiertas corresponden
a superficies planas fabricadas en acrílico transparentes y las
ramas cerradas
corresponden a superficies opacas flanqueadas por paredes de 15 cm de altura. Tanto
las ramas abiertas como las cerradas se encuentran opuestas y perfectamente
alineadas entre sí. Todo este aparato se encuentra elevado a 40 cm de altura sobre una
plataforma de madera (Maruyama et al, 1998).
28
Figura 3: Laberinto elevado en cruz
El laberinto fue ubicado al interior de un biombo de paredes oscuras en el lugar de
experimentación y la iluminación estuvo dada por tubos fluorescentes de 40 W que
iluminaban con igual intensidad tanto las ramas abiertas como cerradas del laberinto.
Previo a la realización de la prueba los animales fueron divididos en tres grupos de diez
ratones cada uno (Grupos: A, B y C) y recibieron el siguiente tratamiento vía
intraperitoneal 30 minutos antes de sometidos al test:
a. Diazepam: Como fármaco ansiolítico de referencia, en dosis de 0,3 mg/kg (Grupo A)
b. Extracto de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg (Grupo B)
c. NaCl 0,9% como Control 12,5 ml/kg (Grupo C)
La prueba comienza colocando individualmente cada ratón en la plataforma central del
laberinto mirando hacia una de las ramas cerradas y desde ese momento se le deja
explorar libremente durante 5 minutos. Los parámetros que se miden son el número de
29
veces que el animal ingresa a las ramas abiertas y cerradas del laberinto y el tiempo de
permanencia en las ramas abiertas. Se considera que un animal ha entrado o salido de
una rama, cuando apoyó las cuatro patas al interior o al exterior respectivamente. Una
cámara de video en posición vertical sobre el laberinto permitió registrar la conducta de
los animales mientras eran sometidos a la prueba. Después de completada la prueba, el
laberinto fue limpiado con alcohol de 70º para remover los signos de territorialidad
dejados por cada animal (Mora et al, 2005a).
3.2.8.2 Prueba de Campo Abierto con Agujeros
Esta prueba desarrollada por Boissier y Simon (1962, 1964) y modificada por Takeda y
colaboradores (1998), permite medir de manera simple y objetiva los cambios en el
estado emocional de un ratón al ser expuesto a un ambiente novedoso (Tsuji et al,
2000). El fundamento del test se basa en la modificación del
comportamiento
exploratorio de los animales, evaluado en términos de cambios en la actividad motora
(Nº de cruces) y en la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas (Kamei
et al, 2001). Se demostró que las benzodiazepinas ansiogénicas como las carbolinas y
las ansiolíticas como el diazepam, de manera selectiva, son capaces de disminuir y
aumentar respectivamente la frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas
(Takeda et al, 1998). Bajo estas condiciones, una disminución en el estado de ansiedad
de un ratón se refleja en un aumento de la frecuencia y duración de las exploraciones
subterráneas, mientras que un estado ansiogénico disminuye dichos parámetros (Kamei
et al, 2001).
30
Para la realización de la prueba se utiliza una caja de aluminio (35 cm x 35 cm x 15 cm)
cuyas paredes son fabricadas de vidrio de 3 mm de espesor y el piso (que también es
de aluminio) es de color gris oscuro (Mora et al, 2005b) (Fig. 4). El piso se encuentra
dividido en 16 cuadrados de iguales dimensiones y en cada uno de ellos hay un agujero
concéntrico de 2,5 cm de diámetro. Bajo la superficie del piso, un sistema de sensores
de movimiento conectados a una computadora permiten medir y registrar de manera
simple y objetiva la interrupción de los haces por un ratón explorando. El número de
interrupciones y la duración de las mismas son analizados por medio de un software
desarrollado por la empresa Cold Power Technologies especialmente para esta prueba.
Figura 4: Aparto de Campo Abierto con Agujeros
Previo a la realización de la prueba se forman tres grupos de diez ratones cada uno
(Grupos: A, B y C) y reciben el siguiente tratamiento vía intraperitoneal 30 minutos
antes de ser sometidos al test:
31
a. Diazepam: Como fármaco ansiolítico de referencia, en dosis de 0,3 mg/kg (Grupo A)
b. Extracto de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg (Grupo B)
c. NaCl 0,9% como Control 12,5 ml/kg (Grupo C)
Al momento de llevar a cabo el experimento, cada animal es individualmente colocado
en el centro de la plataforma con
agujeros y se registra su actividad exploratoria
durante 5 minutos.
Los parámetros que medimos automáticamente son:
•
Nº de veces que introduce la cabeza en los agujeros
•
Tiempo total de exploración de los agujeros (segundos)
y por observación directa (video-cámara):
•
Nº de veces que cruza los cuadrados
Después de completada la prueba, el laberinto fue limpiado con alcohol de 70º para
remover los signos de territorialidad dejados por cada animal (Mora et al, 2005a)
3.2.8.3 Prueba Nado Forzado
Esta prueba desarrollada por Porsolt y colaboradores utilizando ratas y posteriormente
validada por el mismo grupo empleando ratones, es el modelo más ampliamente
utilizado en la actualidad para la evaluación preclínica de compuestos con potencial
antidepresivo (Cryan, 2002). El uso generalizado de esta prueba se debe entre otros
factores a su facilidad de implementación y a su capacidad para detectar un amplio
espectro de sustancias de conocida acción antidepresiva en clínica (Borsini y Meli,
1988). La base teórica de este experimento se relaciona con el principio en el cual, el
animal sometido a un estímulo estresante del que no puede escapar, experimenta al
32
inicio un periodo de intensa actividad y luego permanece suspendido inmóvil en el agua
(Reyes, 2000). La inmovilidad generada en esta prueba se interpreta como una pérdida
de motivación por escapar del estímulo estresante y se considera análoga a los
comportamientos de desesperanza observados en los pacientes depresivos (Alguacil et
al, 1996). Muchos de los antidepresivos clínicamente eficaces como amitriptilina,
imipramina y desipramina son capaces de reducir los tiempos de inmovilidad.
El instrumento utilizado para realizar el ensayo (Fig. 5), consiste en un cilindro de
acrílico transparente de 25 cm de alto y 10 cm de diámetro, conteniendo agua a
25 ± 2 ºC hasta una altura de 10 cm desde el fondo (Wei et al, 2008; Reyes 2000).
Figura 5: Nado Forzado
Para realizar el ensayo se formaron tres grupos de diez ratones cada uno (Grupos: A, B
y C) los cuales fueron sometidos al siguiente tratamiento vía intraperitoneal 30 minutos
antes de ser sometidos a la prueba:
33
a. Imipramina: Como fármaco antidepresivo de referencia, en dosis de 12,5 mg/kg
(Grupo A)
b. Extracto de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg (Grupo B)
c. NaCl 0,9% como Control 12,5 ml/kg (Grupo C)
Una vez trascurrido este intervalo de tiempo, comienza a desarrollarse la prueba.
Los ratones son colocados al interior del cilindro con agua y son forzados a nadar
durante 6 minutos. Los parámetros que se registran son: el nado, definido como todos
aquellos movimientos escapatorios, es decir, desplazamiento circular, trepado o buceo,
y la inmovilidad definida como los movimientos mínimos que debe realizar el animal
necesarios para mantener su cabeza fuera del agua y poder respirar (Borsini y Meli,
1998; Wei et al, 2008). Se realizó un pre-test de 2 minutos y durante los últimos 240
segundos se midieron los tiempos de inmovilidad (Porsolt et al, 1978). Con la finalidad
de facilitar el registro de los tiempos de inmovilidad la sesión experimental fue grabada
usando una video-cámara.
3.2.9 Análisis estadístico
Las comparaciones para discriminar los tratamientos responsables de las diferencias
significativas en todas las pruebas, fueron hechas usando un análisis simple de
varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tuckey). Se
utilizaron los programas Excel® y SPSS® versión 15.0 para el procesamiento de los
datos. El valor de la significancia estadística a partir de la diferencia del control es de
*p<0,05.
34
4. RESULTADOS
Los resultados se presentan divididos en dos partes, la primera corresponde a los
análisis fitoquímicos y cromatográficos que tienen como objetivo demostrar la presencia
de determinados grupos de compuestos químicos en la planta. La segunda parte
corresponde a las pruebas conductuales, realizadas con el objeto de corroborar los
efectos psicoactivos atribuidos al extracto de Modiola caroliniana.
4.1 Análisis fitoquímico
Los resultados del análisis fitoquímico realizado a las hojas, ramas y raíces secas y
molidas de Modiola caroliniana se encuentran resumidos en las siguientes tablas:
Tabla 5: Resultados de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes solubles
en agua.
Ensayos
Metabolitos
Resultado
Antrona en medio
Todo tipo de azúcares
Positivo
sulfúrico
Reactivo de Molish
Licor de Fehling
(Fig. 6 A)
Azúcares reductores y
Positivo
no reductores
(Fig. 6 B)
Azúcares reductores
Negativo
(Fig. 6 C)
Prueba de etanol
Gomas y mucílagos
Positivo
(Fig. 6 D)
Prueba de Espuma
Saponinas
Negativo
S.R. FeCl3
Taninos
Negativo
Flavonoides
Negativo
Reacción de la
cianidina
35
Figura 6: Reacciones de Identificación
A). Antrona en medio sulfúrico
(Positiva)
C). Licor de Fehling (Negativa)
B). Reactivo de Molish
(Positiva)
D). Prueba de etanol (Positiva)
36
Tabla 6: Resultado de los ensayos fitoquímicos de los constituyentes insolubles
en agua
Ensayos
Metabolitos
Resultado
Reacción de Liebermann
Núcleo Esteroideo
Positivo
(Fig. 7)
Reacción de
Heterósidos cardiotónicos
Keller-Kiliani
(con 2-desoxiazúcares)
Reacción de Kedde
Heterósidos cardiotónicos
Negativo
Negativo
(genina de 23 átomos de C)
Reacción de Baljet
Heterósidos cardiotónicos
Negativo
(genina de 23 átomos de C)
Reacción de Bornträger
Heterósidos antraquinónicos
Negativo
Figura 7: Reconocimiento de compuestos con núcleo esteroídeo. Reacción
de Liebermann.
37
Tabla 7: Resultado de los ensayos fitoquímicos realizados para determinar
presencia de alcaloides
Ensayos
Metabolitos
Resultado
S.R Dragendorff
Alcaloides
Negativo
S.R Bouchardat
Alcaloides
Negativo
S.R Lugol
Alcaloides
Negativo
S.R Silicotúngstico
Alcaloides
Negativo
4.2 Análisis cromatográfico de los extractos
La figura 8 muestra el resultado de los análisis cromatográficos realizados a los
extractos metanólico y clorofórmico de Modiola caroliniana, utilizando como adsorbente
cromatoláminas de gel sílice tipo 60 con indicador de fluorescencia y una mezcla de
acetato de etilo-metanol-agua (100 : 13,5 : 10) como fase móvil. Frente de solvente
10 cm.
38
Figura 8: Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico
(C y D) observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente acetato
de etilo - metanol - agua (100:13,5:10)
UV-254 nm
A y B
UV-365 nm
C y D
A y B
C y D
Se observa la aparición de una mancha con Rf 1,0 tanto en el extracto metanólico
como clorofórmico de Modiola caroliniana que observada bajo luz UV a 254 y 365 nm
revela un color verde oscuro y rojo fluorescente respectivamente.
Estos resultados se encuentran resumidos en la tabla 8.
39
Tabla 8: Determinación de compuestos polares presentes en los extractos
clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana.
Extracto metanólico
Detección
Rf
1,0
Extracto clorofórmico
Color observado
Rf
Color observado
Verde oscuro
1,0
Verde oscuro
UV-254 nm
1,0
Rojo fluorescente 1,0
Rojo fluorescente
UV-365 nm
La figura 9
muestra el resultado de los análisis cromatográficos realizado a los
extractos metanólico y clorofórmico de Modiola caroliniana, utilizando como adsorbente
las mismas cromatoláminas que en el caso anterior y una mezcla de tolueno-acetato de
etilo (93:7) como fase móvil. Frente de solvente 10 cm.
40
Figura 9: Cromatografía de los extractos metanólico (A y B) y clorofórmico
(C y D) observados bajo luz UV a 254 y 365 nm. Eluyente toluenoacetato de etilo (97:3)
UV-365 nm
UV- 254 nm
A y B
C y D
A y B
C y D
En el cromatograma del extracto clorofórmico se observa la aparición de una mancha
con Rf 0,47 que inspeccionada bajo luz ultravioleta a 254 y 365 nm revela un color
amarillo y rojo fluorescente respectivamente. El cromatograma del extracto metanólico
no revela la presencia de manchas.
Estos resultados se encuentran resumidos en la tabla 9.
41
Tabla 9: Determinación de compuestos lipofílicos presentes en los extractos
clorofórmico y metanólico de Modiola caroliniana.
Extracto metanólico
Detección
Rf
Color observado
----
--------
-----
----------
Extracto clorofórmico
Rf
Color observado
0,47 Amarillo
UV-254 nm
0,47 Rojo fluorescente
UV-365 nm
Después de realizada la inspección preliminar de los extractos metanólico y
clorofórmico bajo luz ultravioleta a 254 y 365 nm, los cromatogramas fueron revelados
con los reactivos de Kedde y Liebermann-Burchard con la finalidad de tener una
orientación respecto a los tipos de compuestos presentes en la planta en estudio.
La figura 10 muestra los cromatogramas de los extractos metanólico y clorofórmico
revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados al UV-Visible.
El cromatograma del extracto metanólico reveló la presencia de tres manchas de
Rf 0,13 – 0,19 y 0,38 todas de color verde esmeralda. El cromatograma del extracto
clorofórmico reveló igualmente la aparición de tres manchas a valores de Rf: 0,05 0,29 y 0,36 de colores verde esmeralda, amarilla y verde esmeralda respectivamente.
42
Figura 10: Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico
revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados
al UV-Visible.
Extracto metanólico
Extracto clorofórmico
La figura 11 muestra los mismos cromatogramas que el caso anterior pero esta vez
observados bajo luz UV- 365 nm.
En el cromatograma del extracto metanólico se observa la aparición de una serie de
manchas a valores de Rf 0,13 – 0,19 – 0,38 – 0,63 todas de color rojo fluorescente y
0,75 – 0,88 – 0,94 todas de color blanco.
43
En el cromatograma del extracto clorofórmico se observa la aparición de manchas a
valores de Rf 0,05 – 0,18 – 0,29 – 0,36 de color rojo fluorescentes y 1,00 de color
blanco.
Figura 11: Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico
revelados con el reactivo de Liebermann-Burchard y observados
bajo luz UV a 365 nm.
Extracto metanólico
Extracto clorofórmico
44
Los resultados anteriormente mencionados se encuentran resumidos en la tabla 10.
Tabla 10: Investigación de compuestos con núcleo esteroideo
Fase estacionaria: Sílica gel
Fase móvil: Tolueno-acetato de etilo (93:7)
Revelador: Liebermann-Burchard Temperatura: 100 ºC
Extracto metanólico
Detección
Rf
Color observado
Extracto clorofórmico
Rf
Color observado
0,13
Verde esmeralda 0,05 Verde esmeralda
UV-Visible
0,19
Verde esmeralda 0,29 Mancha amarilla
(Fig. 10)
0,38
Verde esmeralda 0,36 Verde esmeralda
0,13
Rojo fluorescente 0,05 Rojo fluorescente
0,19
Rojo fluorescente 0,18 Rojo fluorescente
UV-365 nm
0,38
Rojo fluorescente 0,29 Rojo fluorescente
(Fig. 11)
0,63
Rojo fluorescente 0,36 Rojo fluorescente
0,75
Blanco
0,88
Blanco
0,94
Blanco
1,00 Blanco
45
La figura 12 muestra los cromatogramas de los extractos metanólico y clorofórmico
observados al UV-Visible después de haber sido revelados con el reactivo de Kedde.
En el cromatograma del extracto metanólico se observa la aparición de manchas a
valores de Rf 0,13 – 0,19 – 0,25 – 0,63 de colores café pálido, café, verde pálido, café y
amarillo pálido respectivamente.
En el cromatograma del extracto clorofórmico aparecen dos manchas a valores de
Rf 0,31 y 0,36 de colores verde pálido y café pálido respectivamente.
Figura 12: Cromatografía de los extractos metanólico y clorofórmico revelados
con el reactivo de Kedde y observados al UV-Visible
Extracto metanólico
Extracto clorofórmico
46
Los resultados anteriormente presentados se encuentran resumidos en la tabla 11.
Tabla 11: Determinación de heterósidos cardiotónicos (genina con 23 átomos de
carbono)
Fase estacionaria: Sílica gel
Fase móvil: Acetato de etilo-metanol-agua
(100:13,5: 10)
Temperatura: Ambiente
Revelador: Kedde
Extracto metanólico
Detección
Rf
Color observado
Extracto clorofórmico
Rf
Color observado
0,13
Café pálido
0,31 Verde pálido
0,19
Café
0,36 Café pálido
UV-Visible
0,25
Verde pálido
(Fig. 12)
0,63
Café
1,00
Amarillo pálido
47
4.3 Determinación de dosis del extracto a utilizar
La prueba realizada para determinar la dosis de extracto a utilizar en el estudio, entregó
los siguientes resultados:
Gráfico 1: Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis
sobre el Nº de empinamientos
Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el Nº de empinamientos de los
ratones (n=3) en la prueba de campo abierto. Los resultados están expresados como valor de la
media y las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA)
seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística
a partir del control fue de *p <0.05
48
Gráfico 2: Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis
sobre el Nº de cruces del círculo central
Efecto del extracto de Modiola caroliniana en distintas dosis sobre el número de cruces del círculo
central en la prueba de campo abierto. Los resultados están expresados como valor de la media y
las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un
análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir del
control fue de *p <0.05.
En los gráficos anteriores se observa que la dosis de extracto de Modiola caroliniana
capaz de aumentar significativamente la conducta exploratoria de los ratones respecto
al control, medida en términos de número de empinamientos y número de cruces del
círculo central, fue de 150 mg/kg, utilizándose esta dosis para realizar el estudio.
49
4.4 Pruebas conductuales
4.4.1 Laberinto elevado en cruz
El gráfico 3 muestra el porcentaje de tiempo de permanencia de los ratones en las
ramas abiertas del laberinto en relación al tiempo total de exploración del aparato. Los
resultados obtenidos para los tres grupos experimentales son los siguientes: Control
2,94%; Extracto 4,43% y Diazepam 18,83%. El grupo tratado con diazepam presenta
diferencias estadísticamente significativas respecto del control (*p<0,05), no así el
grupo tratado con el extracto.
Gráfico 3: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el porcentaje de tiempo de permanencia de los ratones en las
ramas abiertas del Laberinto elevado en cruz.
Efecto del extracto metanólico de Modiola caroliniana (150 mg/kg i.p) y Diazepam (0,3 mg/kg i.p)
sobre el porcentaje de permanencia de los ratones (n=10) en las ramas abiertas en relación con el
tiempo total de permanencia en el laberinto. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis
simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor
de la significancia estadística a partir del control fue de *p<0,05.
50
El gráfico 4 muestra los resultados de la actividad motora de los ratones en el laberinto,
expresados como el número total de entradas a ambas ramas ± el error estándar. Para
el control se obtuvo 102 ±4,87; para el extracto 135 ±9,25 y para diazepam 244 ±5,44.
Sólo presentó diferencias estadísticamente significativas respecto del control el grupo
tratado con diazepam (*p<0,05), no así el grupo tratado con el extracto.
Gráfico 4: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre la actividad motora de ratones, en el Laberinto elevado en cruz.
Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana
(150 mg/kg i.p) y Diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre la actividad motora de ratones en el Laberinto
elevado en cruz. Los resultados están expresados como el número total de entradas de los
ratones (n=10) a ambas ramas del laberinto +/- el error estándar. Las comparaciones fueron
hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones
múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística a partir de control fue de *p< 0,05.
51
4.4.2 Prueba de campo abierto con agujeros
El gráfico 5 muestra el efecto de los distintos tratamientos sobre el número de
exploraciones subterráneas durante los 5 minutos de duración de la prueba de campo
abierto con agujeros. El número de exploraciones
para el control, tratado con
NaCl 0,9% fue de 13,13± 6,47; para extracto fue 20,00 ± 8,88 y para el grupo tratado
con diazepam fue 29,25 ± 3,45. El análisis de los resultados muestra que el grupo
tratado con diazepam presenta diferencias estadísticamente significativas respecto al
control (*p<0,05), no así el grupo tratado con el extracto.
Gráfico 5: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el Nº de exploraciones subterráneas en la prueba de campo
abierto con agujeros.
Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana
(150 mg/kg i.p) y diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre el número de exploraciones subterráneas en la
prueba de campo abierto con agujeros. Los resultados están expresados como valor de la media ±
el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza
(ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia
estadística a partir de control fue de *p< 0,05.
52
El gráfico 6 muestra el tiempo de duración de las exploraciones subterráneas, según
tratamiento
en
la
prueba.
Los
resultados
obtenidos
para
el
control
son
8,56 ± 7,23 segundos ; para el extracto 12,56 ± 7,75 segundos y para el grupo tratado
con diazepam 18,48 ± 3,49 segundos. Estos resultados muestran diferencias
estadísticamente significativas (*p<0,05) respecto al control para el grupo tratado con
diazepam, no así para el grupo tratado con el extracto.
Gráfico 6: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el tiempo de exploración subterránea en la prueba de campo
abierto con agujeros.
Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana
(150 mg/kg i.p) y diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre el tiempo de duración de las exploraciones
subterráneas en la prueba de campo abierto con agujeros. Los resultados están expresados como
valor de la media ± el error estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple
de varianza (ANOVA) seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la
significancia estadística a partir de control fue de *p< 0,05.
53
El gráfico 7 muestra los resultados de la actividad motora de los ratones, medida en
términos del número de cruces de los cuadrados dibujados en la superficie del piso, en
la prueba de campo abierto con agujeros, según tratamiento. Para el grupo control se
obtuvo 88,63 ± 28,04 cruces; para el extracto 81,75 ± 33,95 cruces y para diazepam
119,38 ± 46,19 cruces. El análisis de los datos no muestra diferencias estadísticamente
significativas entre los distintos tratamientos, *p>0,05.
Gráfico 7: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre la actividad motora de ratones en la prueba de campo abierto con
agujeros.
Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana
(150 mg/kg i.p) y diazepam (0,3 mg/kg i.p) sobre la actividad motora de ratones en la prueba de
campo abierto con agujeros. Los resultados están expresados como valor de la media ± el error
estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA). No
hay diferencias estadísticamente significativas entre los distintos tratamientos, p>0,05.
54
4.4.3 Prueba de nado forzado
Los resultados de la prueba de natación forzada se muestran en el gráfico 8,
expresados como valor de la media ± el error estándar de los tiempos de inmovilidad.
Los valores obtenidos para el grupo control fueron 248,63 ± 10,99 segundos; para el
grupo tratado con el extracto 264,16 ± 33,57 segundos y para el grupo tratado con
imipramina 195,60 ± 48,59 segundos. Estos resultados muestran diferencias
estadísticamente significativas respecto del control para el grupo tratado con diazepam
(*p<0,05), no así para el grupo tratado con el extracto.
Gráfico 8: Efecto del cloruro de sodio, extracto metanólico de M.caroliniana y
diazepam sobre el tiempo de inmovilidad, en la prueba de Natación forzada.
Efecto del cloruro de sodio (12,5 ml/kg i.p), extracto metanólico de Modiola caroliniana
(150 mg/kg i.p) e imipramina (12,5 mg/kg i.p) sobre el tiempo de inmovilidad en la Prueba del Nado
Forzado en ratones. Cada valor corresponde al promedio de 10 ratones por grupo ± el error
estándar. Las comparaciones fueron hechas usando un análisis simple de varianza (ANOVA)
seguido de un análisis de comparaciones múltiples (Tukey). El valor de la significancia estadística
a partir de la diferencia del control fue * p<0,05.
55
5. DISCUSIÓN
En Chile, el uso de plantas medicinales con fines terapéuticos es una costumbre muy
arraigada en la cultura popular, que persiste hasta nuestros días con diversos grados de
influencia, especialmente indígena (Hoffmann, 2003). Los mapuches, principal pueblo
originario de nuestro país, a través de la observación del medio que los rodeaba y
mediante el error y el acierto, desarrollaron un gran conocimiento empírico respecto al
uso de las plantas medicinales, que se fue transmitiendo de una generación a otra por
vía oral y que hoy en día esta siendo gradualmente traspasado al resto de la población
(Evans, 1991; Alonso, 1998; Errázuriz, 2006). En los últimos años, una visión más
holística de la salud y la enfermedad ha incrementado la información y publicidad
respecto al uso de plantas medicinales. Sin embargo, el fomento en la utilización de
principios activos de origen vegetal, puede tornarse peligroso para el paciente, toda vez
que se carezcan de estudios químicos, toxicológicos y farmacológicos que garanticen la
seguridad y eficacia de una determinada especie a la que popularmente se le atribuyen
ciertas propiedades medicinales.
En el presente estudio, se evaluaron las propiedades ansiolíticas y antidepresivas
atribuidas popularmente en medina tradicional mapuche al extracto de Modiola
caroliniana. Adicionalmente, este estudio se complementó con una caracterización
fitoquímica y cromatográfica (c.c.f) de la especie.
En las pruebas de laberinto en cruz elevado y campo abierto con agujeros se evaluó el
potencial ansiolítico del extracto, mientras que en la prueba de nado forzado se evaluó
potencial antidepresivo.
56
El test de laberinto elevado en cruz considera como medida de ansiedad el porcentaje
de permanencia de los ratones, en las ramas abiertas del laberinto. Una sustancia con
propiedades ansiolíticas es capaz de aumentar el tiempo de exploración de dichas
ramas situadas en alturas (Handley y McBlane, 1993; Rodgers et al, 1997). En este test,
el grupo tratado con el extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no produjo
diferencias estadísticamente significativas respecto al control sobre el porcentaje de
permanencia de los ratones en las ramas abiertas del laberinto, esto nos indica que M.
caroliniana en esta dosis carece de los efectos ansiolíticos que popularmente se le
atribuyen. En cambio, bajo las mismas condiciones experimentales, el grupo de
referencia tratado con diazepam muestra diferencias estadísticamente significativas
respecto al control en cuanto al porcentaje de permanencia en las ramas abiertas del
laberinto, esto corrobora la propiedades ansiolítica del fármaco y coincide con otros
trabajos que previamente han demostrado que la administración aguda de una dosis de
diazepam, aumenta el tiempo de exploración y el porcentaje de permanencia en las
ramas abiertas del laberinto (Ariza et al, 2006; Ariza et al, 2007).
El extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no modificó de manera significativa
la actividad motora de los ratones en el laberinto respecto al control, medida por el
número total de entradas a ambas ramas. Por el contrario, el grupo tratado con
diazepam (0,3 mg/kg i.p.) aumentó de manera estadísticamente significativa respecto al
control la actividad motora, lo cual coincide con lo demostrado por Kuribara et al. (1998)
quien menciona que el diazepam en dosis menores a 5 mg/kg produce un aumento de
la actividad motora, no así en la coordinación.
57
El efecto ansiolítico del extracto en estudio también fue evaluado en la prueba de
campo abierto con agujeros. En esta prueba, un estado ansiolítico en ratones se refleja
por el aumento en la frecuencia y tiempo de duración de las exploraciones subterráneas
(Redolat et al, 2005). El extracto metanólico de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg
respecto al control, no produjo modificaciones estadísticamente significativas en la
frecuencia y duración de las exploraciones subterráneas. Estos resultados confirman los
obtenidos en la prueba de laberinto en cruz elevado en cuanto a que Modiola
caroliniana en dosis de 150 mg/kg carece de los efectos ansiolíticos que popularmente
se le atribuyen. Bajo las mismas condiciones experimentales en las cuales se evaluó el
potencial ansiolítico del extracto, el grupo tratado con diazepam respecto al control,
aumentó de manera estadísticamente significativa la frecuencia y duración de las
exploraciones subterráneas, lo que se interpreta como un efecto ansiolítico y coincide
con lo demostrado por Kamei et al. (2001) y Takeda et al. (1998) quienes en sus
trabajos han publicado que la administración de dosis no sedativas de diazepam (0,3 –
0,5 mg/kg) producen un aumento estadísticamente significativo
en la frecuencia y
tiempo de duración de las exploraciones subterráneas, interpretándose esto como
efecto ansiolítico.
Tanto el grupo tratado con el extracto (150 mg/kg i.p) como el grupo tratado diazepam
(0,3 mg/kg i.p.) respecto al control, no modificaron la actividad motora en la prueba. Los
resultados aquí obtenidos para el grupo tratado con diazepam coinciden con lo
demostrado por Kamei et al. (2001) quien describe que diazepam en dosis de 0,1 – 0.56
mg/kg administrado vía intraperitoneal no modifica la actividad motora en la prueba.
58
En ambas pruebas el extracto de M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg no modificó de
manera significativa respecto al control la actividad motora, sin embargo si lo hizo en la
prueba de campo abierto con la cual se determinó la dosis de extracto a utilizar en el
estudio. Estos resultados aparentemente contradictorios, podrían explicarse en el
sentido que si bien las tres pruebas tienen en común el hecho de poder evaluar el
comportamiento de un animal al ser expuesto a un ambiente novedoso, las pruebas de
laberinto en cruz elevado y campo abierto con agujeros exponen al animal a un mayor
número de estímulos ansiogénicos, por este motivo la ausencia de diferencias
significativas respecto al control en estas pruebas podría asociarse a la incapacidad del
extracto en esta dosis de revertir los niveles de ansiedad de los animales y no a un
deterioro de la actividad motora.
El efecto antidepresivo del extracto fue evaluado en la prueba de natación forzada. Aquí
los animales son forzados a nadar en un cilindro lleno de agua del que no pueden
escapar, después de un cierto tiempo, los animales adoptan una postura inmóvil ante la
imposibilidad de escapar del estímulo estresante que se interpreta como un sensación
de desesperanza similar a la presentada en la patología de la depresión (Reyes, 2000;
Porsolt et al, 1977). En estas condiciones experimentales, las drogas antidepresivas
como los tricíclicos, reducen el tiempo de inmovilidad produciendo en el animal un
aumento en sus conductas activas, mientras que los ansiolíticos y neurolépticos son
inactivos (Borsini y Meli, 1988). Entre los falsos positivos, se encuentran diversos
anticolinérgicos
y antihistamínicos,
sin embargo,
el
hecho
que la actividad
antihistamínica y/o anticolinérgica pueda jugar un papel en la reversión de la depresión
no puede descartarse, y de hecho se ha sugerido que pueden contribuir al efecto
59
antidepresivo de los tricíclicos (Onodera, 1991). M. caroliniana en dosis de 150 mg/kg
no presenta, respecto al control negativo, un efecto anti-inmovilidad estadísticamente
significativo, esto nos indica que el extracto en estudio en esta dosis, carece de los
efectos antidepresivos que popularmente se le atribuyen. Bajo las mismas condiciones
experimentales, el grupo tratado con imipramina como droga de referencia, redujo de
manera significativa respecto al control los tiempos de inmovilidad. Estos resultados
coinciden con lo demostrado por Bhattamisra et al. (2008), Mora et al. (2005a) y Wei et
al. (2008) respecto a que imipramina efectivamente produce un aumento de las
conductas activas de los animales al ser sometidos a la prueba.
El análisis fitoquímico de los componentes hidrosolubles en la droga permite descartar
la presencia de saponinas, taninos y flavonoides, y confirmar la presencia de mucílagos,
constituyentes frecuentes en la familia de las malváceas, que se utilizan como
protectores en tejidos inflamados, especialmente en la mucosa intestinal, gástrica o
bronquial por sus capacidades de formar soluciones viscosas de consistencia espesa
(Montes, 1992). Además, las reacciones de identificación de hidratos de carbono
revelaron la presencia de azúcares no reductores en la planta. Las reacciones de
reconocimiento de alcaloides resultaron todas negativas, esto nos indica la ausencia de
este tipo de metabolitos secundarios en la planta. Las reacciones de reconocimiento de
heterósidos antraquinónicos y cardiotónicos (genina de 23 átomos de Carbono)
resultaron igualmente negativas, lo que permite descartar la presencia de este tipo de
compuestos en la droga en estudio. La reacción de Liebermann permitió evidenciar la
presencia de, a lo menos, un compuesto con núcleo esteroideo en la droga en estudio,
cuya presencia, en base a la bibliografía consultada, no había sido descrito en esta
60
especie. El núcleo esteroideo forma parte estructural de una gran variedad de
compuestos, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y
vegetal. En las plantas superiores se hallan principalmente fitosteroles: β-Sitosterol,
Campesterol y Estigmasterol, en las algas pardas el Fucosterol y en los hongos y
levaduras se encuentra principalmente el Ergosterol. Debido a su gran diversidad
estructural, no se le conocen a los esteroles naturales actividades biológicas
específicas, debido a que varían dependiendo del tipo de sustituyentes que posea el
núcleo base. Sin embargo
asterosterol presente en
se ha reportado en conejos la acción antipirética del
Artemisia absinthium, se han reportado también esteroles
citotóxicos como los encontrados en el alga roja Galaxaura marginata (Sheu et al,
1996). Menos estudiados son los esteroides diméricos y oligoméricos como las
cefalostatinas altamente citotóxicas y por ende potenciales agentes antitumorales (Li y
Dias, 1997).
5,7
En
el
caso
de
esteroles
con
núcleo
−3−hidroxiandrostadieno como el ergosterol, estos son convertidos en vitamina D
la cual desempeña un papel importante en el metabolismo de minerales como el calcio
y fósforo y puede ser convertida en otros análogos hidróxilados que son activos contra
la psoriasis y cáncer epitelial (Zhu y Okamura, 1995). Algunos compuestos esteroideos
con grupos funcionales peróxido y epóxidos como los aislados del micelio del hongo
Cordyceps sinensis presentan comprobadas propiedades antitumorales (Bok et al,
1999).
El análisis cromatográfico (c.c.f) del extracto metanólico y clorofórmico de la droga
utilizando como fase móvil una mezcla de acetato de etilo: metanol: agua (100:13,5:10)
muestra una mancha de Rf 1,0 en ambos extractos, que observada bajo luz UV a 254 y
61
365 nm revela un color verde oscuro y rojo fluorescente respectivamente, que nos
indica la presencia de compuestos con características polares en ambos extractos, que
podrían corresponder a antraglicósidos, arbutina u otro tipo de compuestos afines
(Hildebert y Sabine, 1996). El hecho de obtener en ambos extractos sólo una mancha
de Rf 1,0 indica la presencia de compuestos con una marcada polaridad, pero también
al no lograrse una separación es necesario valorar si la mezcla de disolventes
orgánicos utilizados o la proporcionalidad entre ellos es la correcta a utilizar.
El análisis cromatográfico (c.c.f) del extracto metanólico utilizando como eluyente una
mezcla de tolueno: acetato de etilo (93:7) y observado bajo luz UV a 254 y 365 nm no
muestra
manchas en el cromatográma, en base a esto podemos inferir que este
extracto carece de compuestos con propiedades lipofílicas o estos se encuentran en
muy baja concentración. Utilizando la misma mezcla de solventes como fase móvil, se
estudio el extracto clorofórmico de la planta, este mostró una mancha de Rf 0,47 que
observada al UV a 254 y 365 nm se aprecia de color amarilla y rojo fluorescente,
respectivamente, esta podría corresponder a cumarinas (Hildebert y Sabine, 1996).
La diferencia creciente de polaridad entre el cloroformo y el metanol, junto al resultado
obtenido al utilizar como eluyente una mezcla de solventes afines a compuestos
apolares, permite deducir que en la planta existen uno o más compuestos con estas
características, que están presentes en el extracto clorofórmico y ausentes o en muy
bajas concentraciones en el extracto metanólico. Este hecho puede relacionarse con la
ausencia de los efectos ansiolíticos y antidepresivos observados al evaluar el extracto
de Modiola caroliniana y se explicaría por la no presencia en el extracto metanólico de
la planta en estudio, de compuestos con características lipofílicas, requisito esencial
62
para que una molécula logre atravesar la barrera hemato-encefálica y pueda ejercer sus
efectos en el sistema nervioso central (von Bernhardi, 2004).
La identificación de compuestos con núcleo esteroideo en los extractos metanólico y
clorofórmico se realizó también por medio de la separación por c.c.f seguido de la
aplicación del reactivo de coloración de Liebermann-Burchard. Como muestra la
tabla 10 al observar las placas al UV-Visible aparecen una serie de manchas a valores
de Rf: 0,13 – 0,19 – 0,38 en el extracto metanólico y de 0,05 y 0,36 en el extracto
clorofórmico de coloración verde esmeralda, que confirma la presencia de compuestos
esteroideos (Hildebert y Sabine, 1992). Al observar las placas al UV-365 nm
se
aprecian tanto en el extracto metanólico como clorofórmico una serie de manchas rojo
fluorescentes características de este tipo de compuestos a valores de Rf: 0,13 – 0,19 –
0,38 y 0,63 en el extracto metanólico y de 0,05 – 0,18 – 0,29 y 0,36 en el extracto
clorofórmico. Por medio de esta técnica se confirma la presencia de compuestos
esteroideos en la droga en estudio y se puede inferir que dos de estas manchas, que
aparecen en ambos extractos, por la similitud en sus Rf podrían corresponder a los
mismos compuestos. En el extracto metanólico aparecieron además otras manchas
blancas no fluorescentes a valores de Rf: 0,75 – 0,88 y 0,94 y en el extracto
clorofórmico a valores de Rf: 1,0. Estos podrían corresponder a principios amargos,
terpenos, valpotriatos u otros compuestos afines (Hildebert y Sabine, 1996).
Los extractos clorofórmico y metanólico también fueron revelados con el reactivo de
Kedde como muestra la tabla 11 y observados al UV-visible. Ambos extractos una vez
aplicado el reactivo sobre la cromatoplaca revelaron manchas de colores característicos
a valores de Rf: 0,13 – 0,19 – 0,25 – 0,63 y 1,00 en el extracto metanólico y 0,31 – 0,36
63
en el extracto clorofórmico. Pero ninguna de estas manchas presentó un color rosado o
azul-violeta lo que permite descartar la presencia de cardenólidos en ambos extractos y
coincide con lo demostrado en el ensayo fitoquímico.
64
6. CONCLUSIONES
•
En base a los resultados obtenidos en los test conductuales, realizados bajo las
condiciones experimentales anteriormente detalladas, podemos concluir que el
extracto metanólico de Modiola caroliniana en dosis de 150 mg/kg, carece de los
efectos ansiolíticos y antidepresivos que popularmente se le atribuyen en
medicina tradicional mapuche. Se rechazan las hipótesis planteadas.
•
El análisis fitoquímico de Modiola caroliniana indica la presencia de azúcares no
reductores, mucílagos y a lo menos un compuesto con núcleo esteroídeo.
•
El análisis cromatográfico permitió determinar la presencia de compuestos con
características polares y lipofílicas en M. caroliniana. Mediante la aplicación del
reactivo de coloración de Liebermann-Burchard sobre las cromatoplacas, se
confirma la presencia de un compuesto esteroídeo en la planta en estudio,
siendo necesarios la realización de otros ensayos químicos que permitan la
caracterización detallada de este tipo de compuesto.
.
65
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