Tesis - Universidad de Colima

CENTRO UNIVERSITARIO
DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
“Modulación de la Corriente de Potasio Activada por ACh
(IKACh) por el Potencial de Membrana en Células Marcapaso
de Corazón de Gato”
TÉSIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD
EN FARMACOLOGÍA
PRESENTA:
Q.F.B. José Alberto Rodríguez Paredes
DIRECTOR:
Dr. Ricardo Antonio Navarro Polanco
COASESOR:
Dr. Eloy Gerardo Moreno Galindo
Colima, Colima, Febrero de 2010.
1
DEDICATORIA
A mi mamá Martha, a mi papá José, a mis hermanos Miguel, Nely y Nalleli, al
resto de mi familia, especialmente y con mucho cariño a los que radican en E.U.A. y a
mis amigos.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a las personas que me brindaron su ayuda en la realización de este
trabajo, que no hubiese sido posible sin su participación. Agradezco al Dr. Eloy Moreno
por su cuantiosa ayuda en la parte experimental y su colaboración en la parte del
escrito, por todas las buenas ideas que me compartió, por enseñarme la técnica de patchclamp, la preparación de soluciones, la toracotomía bilateral en gato, uso del sistema
Langendorff y el uso del software para registrar corrientes y análisis de los datos.
Gracias al Dr. Ricardo Navarro por permitirme trabajar en su laboratorio, por toda su
ayuda en la realización de este trabajo en la parte de la escritura, su colaboración en la
parte experimental y por las cátedras que me impartió todos los días. Gracias al Dr.
Arael Arechiga por su ardua colaboración y enseñarme a realizar la disección de
aurícula izquierda y NSA de corazón de gato. Especialmente quiero agradecer al Dr.
José Antonio Sánchez por permitirme trabajar y utilizar el equipo de disección y el
sistema Langendorff montado en su laboratorio.
También agradezco a las personas que me ayudaron en el día a día durante el
transcurso de las clases y del tiempo en que estuve en el CUIB cursando la maestría.
Gracias totales a Daniel, Nayere, Elizabeth, Ana María y Dimas por haber compartido
sus conocimientos y por su amistad, ustedes son para mí más que excompañeros de
estudios. Además, quiero agradecer al personal del CUIB, a las bibliotecarias Chayito y
Lety por su ayuda en la adquisición de libros y artículos científicos y por el excelente
trato hacia mi persona, al equipo de secretarias particularmente a Rosy, encargada del
posgrado, al personal del bioterio comandados por Don Chucho por la ayuda con los
animales. A los sinodales, Dra. Tania Ferrer y Dr. Alejandro Elizalde. Al Dr. Jesús
“carnaval” Lara, gracias por su muy valioso aporte, también al CONACyT por la beca
de manutención otorgada. Final y muy especialmente quiero agradecer a mi hermana
Martha Nalleli por facilitarme la computadora para escribir este trabajo.
ÍNDICE
Contenido
Página
DEDICATORIA
i
AGRADECIMIENTOS
ii
ÍNDICE
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
v
RESUMEN
vi
I. INTRODUCCIÓN
1
El corazón, características mecánicas y fenómeno eléctrico
1
El potencial de acción de NSA
4
Modulación nerviosa del corazón: Sistema nervioso autónomo
8
Regulación simpática de la actividad marcapaso
10
Regulación parasimpática de la actividad marcapaso
11
If: Modulación de los canales-f en la regulación autónoma del
NSA
Canales KACh y corriente de K+ activada por agonistas
muscarínicos (IKACh) en la regulación parasimpática del
marcapaso
II. ANTECEDENTES
12
Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) y proteínas G;
papel fisiológico
Los receptores acoplados a proteínas G son modulados por
voltaje
III. HIPÓTESIS
14
IV. OBJETIVO GENERAL
18
V. MATERIAL Y MÉTODOS
19
12
14
15
18
Registro en miocitos aislados de nodo senoauricular (NSA) y
aurícula izquierda (AI) de corazón de gato.
Registros electrofisiológicos de miocitos aislados
19
Sistema de perfusión rápida
21
Curvas concentración-respuesta
21
Análisis estadístico de los datos
22
VI. RESULTADOS
Corriente marcapaso
20
23
23
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por agonistas
muscarínicos en miocitos marcapaso cardiacos.
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por agonistas
muscarínicos en miocitos de aurícula
Densidad de corriente (pA/pF) de cardiomiocitos de NSA y AI
24
27
30
VII. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
31
VIII.
35
REFERENCIAS
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1
Sistema de conducción cardiaco
3
2
Componentes del miocardio y su potencial de acción
4
3
Potencial de acción de NSA y corrientes que contribuyen (If, ICa,L, ICa,T,
IKr e IKs)
8
4
Modulación directa del canal KACh a través del dímero Gβγ de las
proteínas Gi/o por activación del receptor muscarínico M2.
10
5
Registro de la corriente marcapaso, If.
23
6
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos
marcapaso de gato
24-25
7
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos
marcapaso de gato
26
8
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos
auriculares de gato
27-28
9
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos
auriculares de gato
29
10
Densidad de corriente en cardiomiocitos marcapaso y auriculares de
corazón de gato
30
RESUMEN
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) comprenden una gran familia
de proteínas de siete dominios transmembranales que están involucrados en una amplia
variedad de procesos fisiológicos y en casi todos los aspectos de la biología
cardiovascular. En tiempos recientes se ha mostrado una nueva propiedad de
modulación para este tipo de receptores. Su capacidad de percibir el potencial de
membrana. En el corazón la automaticidad del nodo senoauricular (NSA) es modulada
por el sistema nervioso autónomo a través de GPCRs. La regulación negativa vista
como una disminución en la frecuencia de disparo del marcapaso (tono vagal) en NSA
es mediada por los receptores muscarínicos colinérgicos del subtipo 2 (M2), los cuales
activan una corriente de K+ rectificadora entrante (IKACh) a través de la proteína Gi/o.
Recientemente Ben-Chaim y colaboradores (2003) mostraron en un sistema de
expresión heterólogo, que el voltaje modifica la afinidad de acetilcolina (ACh) por el
receptor M2. Actualmente, en nuestro laboratorio se mostro que en miocitos auriculares
aislados el potencial de membrana también modifica la EC50 de ACh (Moreno-Galindo.,
2008; Navarro-Polanco et al., 2008). En este trabajo nos propusimos conocer si este
fenómeno también ocurre en el sistema responsable de la actividad automática en el
corazón, el NSA. Para lo cual registramos IKACh utilizando la técnica de patch-clamp en
miocitos aislados de NSA de corazón de gato, utilizando al agonista fisiológico ACh y
el agonista parcial pilocarpina (PILO). Al igual que en células auriculares la interacción
de ACh y PILO con los receptores M2 de NSA es modulada por el potencial de
membrana. Conjuntamente, esta modulación dependiente de voltaje es opuesta; EC50
para ACh es menor a potenciales más positivos mientras para PILO este parámetro es
mayor a estos mismos potenciales. Así mismo, nuestros resultados muestran que en
presencia de concentraciones fisiológicas de K+ en células nodales, el voltaje
transmembrana modula la interacción agonista-receptor de forma similar que en las
células auriculares. Sin embargo, la densidad de corriente activada por los agonistas en
miocitos marcapaso es significativamente menor que en células auriculares.
I.
INTRODUCCIÓN
El corazón, características mecánicas y fenómeno eléctrico
El corazón es una bomba formada de 4 cavidades anatómica y funcionalmente
separadas por los tabiques y válvulas aurículo ventriculares (AV). Cada mitad está
formada por una aurícula y un ventrículo. Las células que forman el miocardio no son
uniformes; se distinguen dos tipos fundamentales de ellas: las que generan tensión y
constituyen la mayor parte del tejido cardiaco y las células especializadas en la
conducción. Estas células están unidas entre sí por discos intercalares que permiten la
comunicación entre ellas (Muñoz-Martínez y García., 1997). El corazón es responsable
de bombear la sangre a través de los vasos sanguíneos con una presión (que varía según
la fase del ciclo cardiaco) y ritmo constante mediante la contracción (sístole) y
relajación (diástole) alternada del tejido que constituye las paredes de las aurículas y los
ventrículos conocido como miocardio (James., 2004).
Los eventos que conducen a la contracción de esta bomba se deben y son
disparados en respuesta a un fenómeno electroquímico responsable de la excitación del
miocardio (James., 2004). Este fenómeno excitatorio conocido como potencial de
acción se propaga a través de las células cardiacas, adoptando características especificas
en cada región del corazón debido a la variedad celular del miocardio (James., 2004;
Mangoni y Nargeot., 2008; Dobrev., 2009).
La estructura del corazón responsable del disparo de dicha actividad eléctrica es
el nodo seno auricular (NSA), el cual es una pequeña región de tejido constituido de
células especializadas con actividad automática. En el humano adulto el NSA tiene un
área de aproximadamente 15 mm2 con un grosor de 5 mm y se encuentra ubicado en el
subepicardio antero-lateral en los dos tercios superiores del surco terminal en la unión
de la aurícula derecha (AD), bajo la desembocadura de la vena cava superior. El NSA
está delimitado por un tejido en forma de cresta vertical que se encuentra en la pared
interior de la AD que yace a la izquierda de la vena cava superior conocido como crista
terminalis. El NSA está constituido por miocitos pequeños de 25-30µM de largo y un
diámetro menor a 8 µM en promedio (Satoh., 2003).
1
La morfología celular ha sido estudiada en preparaciones aisladas de distintas
especies de mamíferos (conejo, cobayo, rata, ratón y otros) y se han clasificado
empíricamente en 3 tipos: miocitos de forma de huso, miocitos de forma elongada y
miocitos de forma de araña. Bajo microscopia Nomarsky el citoplasma de los miocitos
de forma de huso es transparente, con capacitancia de 15 a 30 pF y son pobres en
miofilamentos. Los elongados tienen un eje longitudinal más largo y capacitancia entre
35 a 50 pF. Además, los miocitos elongados poseen un citoplasma más oscuro debido a
una alta densidad en miofilamentos. Los miocitos en forma de araña tienen un
citoplasma ramificado y no se conoce aun la significancia funcional de dicha
característica, estas células tienen un potencial diastólico máximo menos negativo en
comparación con los otros dos tipos, característica por la que se les denomina los
miocitos marcapaso primarios (Mangoni y Nargeot., 2008). La distribución de los
diferentes tipos de miocitos varía según la zona del NSA, desde el centro hasta la
periferia. De esta forma se considera que los miocitos en forma de araña conforman la
parte central del NSA y a medida que se aproxime a la periferia se pueden encontrar los
miocitos en forma de huso y elongados, aunque esto no es una regla general ya que han
sido encontrados pequeños grupos de miocitos en forma de huso y elongados en la parte
central del NSA de ratón (Gernot et al., 2002; Mangoni y Nargeot, 2008). También se
han reportado diferencias funcionales entre estos tipos celulares nodales, las células
periféricas tienen un potencial diastólico máximo más negativo y un potencial de acción
con una fase 0 (despolarización) más rápida lo que repercute en una mayor velocidad de
propagación en comparación con las células centrales (Kodama et al., 1999).
Conjuntamente al NSA, existen otras dos estructuras en el corazón que también
poseen automatismo: el nodo aurículo ventricular (NAV) y las fibras de Purkinje. Estas
3 estructuras trabajan en armonía para brindar las características eléctricas y mecánicas
al tejido cardiaco. La frecuencia de disparo intrínseca del NSA es mayor que la del
resto de tejidos cardiacos con actividad automática, lo que permite a este tejido
comandar la actividad eléctrica del corazón. En ciertas disfunciones que provocan
disminución en la frecuencia de disparo del NSA, se generan focos ectópicos en
distintas regiones del corazón (Mangoni y Nargeot., 2008).
En respuesta a la actividad eléctrica y mecánica se han clasificado 5 propiedades
fundamentales de la acción del corazón.
2
El batmotropismo (excitabilidad) describe la capacidad de este órgano para
responder
al
estimulo
eléctrico
(potencial
de
acción),
el
dromotropismo
(conductibilidad) se refiere a su capacidad de conducir el potencial de acción, el
cronotropismo (automatismo) se define como su capacidad de generar el potencial de
acción, el inotropismo (contractilidad) es la capacidad de contracción o sístole y el
lusitropismo ó relajación muscular del corazón (el efecto opuesto al inotropismo o
diástole).
La conducción eléctrica a partir del NSA (Figura 1) se produce a una velocidad
de 1 a 1.2 m/s e incluye inicialmente a las paredes auriculares y continua hacia el NAV
donde se produce un retardo de 0.10 s debido a su baja velocidad de conducción que es
de 0.02 a 0.05 m/s. Este retardo producido por el NAV permite el llenado ventricular
después de la contracción auricular antes de iniciar la propagación ventricular vía el
sistema de conducción rápida constituido por las ramas derecha e izquierda del haz de
His y las fibras de Purkinje y terminando con la excitación en las células de los
ventrículos (Schmidt et al., 1987; Barbuti y DiFrancesco., 2008; Mangoni y Nargeot,
2008).
Figura
1.
Sistema
de
conducción cardiaco:
La línea de color morado indica
la ruta de propagación del
impulso (potencial de acción),
los círculos rojos indican zonas
con
automatismo.
Entre
paréntesis se muestra el tiempo
(en segundos)
en que el
impulso es propagado. Las
líneas negras alrededor indican
la
zona
de
propagación.
Iniciando en el NSA el impulso
se transmite hacia el NAV en
30
ms
aproximadamente.
Existe un retraso aproximado
de 130 ms en el NAV y en las
vías posteriores, tiempo durante el cual la aurícula se contrae completando el llenando los ventrículos. A
continuación la propagación del impulso continúa hacia las células de Purkinje y finalmente se transmite
hacia las células de la pared ventricular. Modificado de Robbins et al., 2000.
3
El potencial de acción de NSA
Los potenciales de acción son diferentes para cada uno de los tipos celulares que
conforman el miocardio. Dicho contraste se debe a las diferencias que existen en la
expresión de canales iónicos membranales de estos tipos celulares. Para fines prácticos
se ha divido el potencial de acción cardiaco en 5 fases (0-4), aunque no todos los
potenciales de acción cardiacos las poseen todas (Figura 2).
Figura 2. Componentes del miocardio y su potencial de acción: En la parte inferior izquierda
se representan las 5 fases de un potencial de acción esquemático no a escala. Las letras en mayúscula
señalan los diferentes potenciales de acción en los tejidos del corazón, la barra vertical representa la
escala temporal ajustada a 1s y las flechas la ruta de propagación de este impulso eléctrico. A. Potencial
de acción de NSA, se dispara en un umbral de ~-40 y se repolariza en 0 mV. Los potenciales de acción
espontáneos en miocitos de NSA poseen un potencial diastólico máximo (PDM) que es de -50 a -60 mV,
menos negativo que el de los otros tejidos que conforman el miocardio y no cuentan con un potencial de
reposo estable. (Satoh., 2003; Dobrev., 2009).B. En aurícula la repolarización ocurre a +30 mV y el
potencial de reposo se encuentra a -75mV. C. Potencial de acción de NAV. D. Sistema His-Purkinje. E.
Ventrículo. Modificado de Gernot et al., 2002.
4
La fase 0 esta representada por la despolarización que procede al umbral (Figura
3). Esta fase es consecuencia de la apertura de canales de Ca2+ y/o de Na+. La fase 0 en
miocitos centrales del NSA se debe fundamentalmente a la apertura de canales de Ca2+
tipo L, cuya subunidad α1 (Cav1.3) es responsable de esta despolarización. En los
miocitos nodales periféricos se ha mostrado que además de los canales de Ca2+ tipo L
existe una contribución inicialmente pequeña de canales de Na+ para los miocitos más
cercanos a la región central, que progresivamente se incrementa hasta ser la corriente
dominante en las células nodales ubicadas mas periféricamente (Satoh., 2003; Dobrev.,
2009).
La fase 1 también conocida como la repolarización rápida ocurre después que
los canales de Na+ se han inactivado y la corriente transitoria de K+ (Ito) se activa. Esto
se refleja como una repolarización inicial que antecede a la gran meseta característica de
los potenciales de acción ventriculares. En algunas especies se ha encontrado que en
esta fase puede contribuir una corriente de Cl- dependiente de Ca2+ conocida como Ito2
(Sánchez-Chapula et al., 1994). La fase 1 no está presente en los potenciales de acción
de NSA. La fase 2 o de meseta ocurre por una disminución de la conductancia, producto
del equilibrio que se genera por la entada de Ca2+ a través de los canales tipo T y las
corrientes de K+ con rectificación tardía IKr e IKs. La meseta también está ausente en el
potencial de acción de NSA (Satoh., 2003; Dobrev., 2009).
La fase 3 es conocida como la fase de repolarización tardía. Esta repolarización que
marca el final de la meseta se debe al incremento de la corriente acarreada por los
rectificadores tardíos y a la reducción de la corriente entrante resultado de la progresiva
inactivación de los canales de Ca2+ tipo L. Adicionalmente, la contribución de una
tercera corriente de K+ (IK1) conducida por uno de los miembros de la familia de los
rectificadores entrantes (Kir) permiten alcanzar el potencial de reposo que corresponde a
la fase 4 del potencial de acción cardiaco. En células nodales IK1 está prácticamente
ausente, razón por la cual el potencial diastólico máximo esta desplazado hacia
potenciales más positivos respecto a los miocitos ventriculares. En estas células las
corrientes repolarizantes más importantes son IKr e IKs. Ito1 por su parte juega un papel
importante en la repolarización de las células nodales periféricas pero su participación
parece ser menos importante en los miocitos centrales (Mangoni y Nargeot., 2008).
5
Típicamente en las células marcapaso la fase 4 se caracteriza por presentar un
proceso despolarizante conocido como despolarización diastólica espontanea (DDE).
Dicho proceso despolariza la membrana de estos miocitos hasta alcanzar el umbral,
generando el disparo de los potenciales del NSA (Dobrev., 2009). Se sabe que son
varios los mecanismos involucrados en la modulación de esta fase y también varios
canales iónicos que participan en ella. Los canales de Ca2+ tipo L generan la corriente
activada por alto voltaje (ICa,L) que participa en dicha despolarización. Esta corriente se
activa en la fase inicial de la DDE aumentando su contribución a medida que se
aproxima al potencial umbral, alcanzando su máxima activación en la fase final de la
DDE. Se ha encontrado que la actividad de estos canales en las células nodales centrales
es mucho más importante que en las células periféricas de NSA, ya que la inhibición de
esta corriente por bloqueadores específicos suprime por completo o
enlentece la
actividad marcapaso en las células centrales y periféricas respectivamente. Otra
evidencia de su importancia en la actividad marcapaso se ha obtenido a partir de los
ratones knockout para Cav1.3. Estos roedores tienen bradicardia pronunciada y arritmias
del NSA. Lo que pone de manifiesto la relevante implicación funcional de este canal en
el desarrollo de la actividad marcapaso (Satoh., 2003; Mangoni y Nargeot., 2008).
La corriente de Ca2+ tipo T (ICa,T) también presente en las células marcapaso no
parece tener un papel tan importante como la corriente de Ca2+ tipo L y su contribución
en la fase 4 es controversial. Se ha reportado que inhibidores específicos de esta
corriente enlentecen la actividad marcapaso del NSA, sin embargo los ratones knockout
para las subunidades Cav3.1 y Cav3.2 formadoras de los canales de Ca2+ tipo T,
presentan la respectiva corriente de Ca2+ producto por estos canales y además no
muestran alteraciones aparentes en el ECG. Lo que pone de manifiesto que la carencia
de estas subunidades no tiene una implicación funcional significativa en la generación y
conducción del impulso cardiaco (Mangoni y Nargeot., 2008).
Un rasgo distintivo de los miocitos con actividad marcapaso es la expresión del
canal HCN (por su descripción en ingles; hyperpolarization-activated cyclic nucleotide
gated channels). Los canales HCN generan corrientes activadas por hiperpolarización y
son modulados por nucleótidos cíclicos intracelulares como el adenosin monofosfato
cíclico (AMPc). Esta corriente fue inicialmente reportada como la corriente chistosa o If
(funny) por Brown y colaboradores (1979).
6
Hoy se sabe que la principal subunidad que se expresa en células nodales cardiacas
es HCN4, aunque HCN1 y HCN2 también se expresan, lo hacen con muy bajos niveles.
La apertura de estos canales sucede en la parte tardía de la DDE (la fase más cercana al
PDM), después que se alcanza el umbral de activación de los canales Ca2+ T y L. La
contribución de If en la DDE se ha demostrado por distintas aproximaciones
experimentales. El bloqueo de esta corriente produce un cambio significativo en la
pendiente de la DDE, además los ratones knockout para HCN4 presentan una frecuencia
cardiaca lenta y muerte a edad temprana. La presencia de If en las células cardiacas es el
criterio más importante para considerarla con actividad marcapaso (Satoh., 2003;
Mangoni y Nargeot., 2008). Una última corriente que participa en la modulación de la
frecuencia de disparo del potencial de acción durante la fase 4 es la corriente
rectificadora
entrante activada por ACh (IKACh). La unión de ACh a receptores
muscarínicos de la membrana plasmática de las células nodales activa a los canales
KACh vía proteínas G del tipo Gi/o. Estos canales se encuentran distribuidos ampliamente
en los miocitos del NSA y de las células auriculares. La estimulación vagal disminuye
la frecuencia de disparo en el NSA produciendo el característico efecto cronotrópico
negativo en el corazón. El sistema nervioso autónomo modula la actividad cardiaca vía
la inervación simpática y parasimpática. Esta modulación neural se ejerce modulando
canales iónicos vía receptores metabotropicos, If e IKACh son dos de los más importantes
efectores que intervienen en esta regulación en las células cardiacas.
7
Figura 3. Potencial de acción de NSA y corrientes que contribuyen (If, ICa,L, ICa,T, IKr e IKs): El
potencial de acción de NSA, se encuentra dividido en 3 fases (números rojos 0,3 y 4), la fase 4 es la
de despolarización espontanea y es en la que se dispara el potencial de acción, una vez que el
potencial de membrana alcanza el umbral entre -40 y -30mV. La fase 0 es la fase de despolarización
del potencial de acción y esta seguida de la fase 3 o de repolarización, una vez que la célula está
completamente repolarizada alrededor de -60mV, el ciclo se repite espontáneamente. Modificado de
Klabunde R.E., 2009 en www.cvphysiology.com.
Modulación nerviosa del corazón: Sistema nervioso autónomo
El rango de actividad del marcapaso es regulado por el sistema nervioso autónomo,
la estimulación β adrenérgica provoca un efecto cronotrópico positivo debido al
aumento en la activación de las corrientes iónicas ICaL, If, e IKs
Por otro lado la estimulación colinérgica ocasiona la apertura de los canales
colinérgicos muscarínicos de K+ (KACh) (Figura 4), causando un efecto cronotrópico
negativo. Simultáneamente, dicha activación de los canales KACh reduce ICaL e If
(Gernot et al., 2002; Satoh., 2003; Dobrev., 2009).
El sistema nervioso autónomo es el mayor determinante extra-cardiaco de la
frecuencia y fuerza de contracción cardiaca. El sistema nervioso autónomo simpático
incrementa la frecuencia cardiaca, mientras que el sistema nervioso autónomo
parasimpático ocasiona lo opuesto (Mangoni y Nargeot., 2008).
8
La parte terminal del sistema nervioso autónomo cardiaco está constituida por el
plexo cardiaco intrínseco neuronal que emite proyecciones fibrosas autónomas en
abundancia hacia los centros ritmogénicos del corazón (Ardell., 1994). La distribución
de las fibras simpáticas y parasimpáticas en el NSA es heterogénea y puede variar de
manera ligera, entre individuos o por la edad. La activación simpática y vagal induce
un cambio en el sitio donde se lleva a cabo el marcapaso dentro de la estructura del
NSA. Comparado con el miocardio auricular el NSA es rico en receptores adrenérgicos
y muscarínicos. La densidad de dichos receptores y de los canales iónicos que lo
conforman varía regionalmente dentro de su estructura y pueden contribuir al cambio en
el marcapaso durante la modulación autónoma. El control in vivo del marcapaso es
llevado a cabo por el sistema nervioso autónomo y se basa en la entrada concomitante
de las vías simpática y parasimpática, sin embargo, el rango de estas entradas varía
según la especie (Mangoni y Nargeot., 2008).
En mamíferos la frecuencia cardiaca esta correlacionada con el peso corporal, los
mamíferos pequeños tienen un promedio aproximado de 500 latidos/min. Los
mamíferos de tamaño medio incluido el humano de 60 a 70 latidos/min (Opthof., 2000).
Las dos vías del sistema nervioso autónomo interactúan para generar un equilibrio
adaptable, de tal manera que la automaticidad del NSA puede estar bajo el dominio de
alguna de las dos. Aunque se ha observado que el efecto del parasimpático se potencia
si el NSA se ha estimulado previamente con adrenalina (simpático). A esta interacción
simpática - parasimpática se le ha llamado “antagonismo acentuado” (Mangoni y
Nargeot, 2008).
9
M2
KACh
Figura 4. Modulación directa del canal KACh a través del dímero Gβγ de las proteínas Gi/o por
activación del receptor muscarínico M2. Mecanismo de transducción en el que se ven involucrados los
GPCRs (receptores muscarínicos de acetilcolina, mAChR) y una proteína G trimérica (i/o), al unirse el
ligando (ACh) provoca el intercambio del guanidildifosfato (GDP) por guanidiltrifosfato (GTP) en la
subunidad α dejando las subunidades βγ actuar en el sitio de unión de los canales KACh que en repuesta
liberan K+ (modificado de Nicholls et al., 2001).
Regulación simpática de la actividad marcapaso
La activación del receptor β adrenérgico por las catecolaminas produce un efecto
cronotrópico positivo. Dichos ligandos fisiológicos aumentan la actividad de los canales
iónicos así como la liberación intracelular de Ca2+. Las corrientes propuestas de mayor
importancia para el mecanismo del incremento de la frecuencia cardiaca por las
catecolaminas son If e ICa,L (DiFrancesco., 1993; Mangoni y Nargeot., 2008). Hasta el
presente se han identificado 3 receptores adrenérgicos en mamíferos β1, β2 y β3-AR. En
el corazón humano β1 y β2 coexisten, siendo el primero el que predomina en una
proporción β1: β2 70% - 30% en aurícula y 80% - 20% en ventrículo, en NSA se conoce
también el predomino de β2 sobre β1 (DiFrancesco et al., 1993), mientras que el total de
receptores adrenérgicos se encuentran equitativamente distribuidos en la aurícula y el
ventrículo. Ambos subtipos, β1 y β2 se encuentran acoplados a la proteína Gs por lo que
al activarse elevan los niveles intracelulares de AMPc causando el efecto inotrópico y
cronotrópico positivos.
10
En aurícula la estimulación de β1 y β2 provocan incrementos máximos en la
fuerza de contracción y frecuencia cardiaca, mientras que en ventrículo solo la
estimulación de β1 causa dichos incrementos máximos y la estimulación de β2
incrementos submáximos. Se ha postulado que el efecto de β1 también pudiese
promover la apoptosis, además de que también se ha propuesto de que pudiesen ser
capaces de activar la vía Gi de manera agonista especifica, ambas hipótesis aun están en
discusión (Brodde et al., 1999,2006).
Regulación parasimpática de la actividad marcapaso
Como señalamos anteriormente, la regulación parasimpática del automatismo
cardiaco es mediado por la liberación de ACh de las terminales nerviosas vágales
activando a los receptores muscarínicos. Los agonistas colinérgicos inducen un potente
efecto cronotrópico negativo sobre la automaticidad cardiaca y la conducción AV in
vivo y en preparaciones aisladas. La señalización y los mecanismos iónicos que
subyacen a la regulación muscarínica de la frecuencia cardiaca se han estudiado por más
de 30 años. Aunque todavía no se establece por completo cuales mecanismos
determinan la respuesta de la frecuencia cardiaca (Mangoni y Nargeot., 2008). Un
número importante de evidencias soportan la idea de que la forma predominante de los
receptores muscarínicos presentes en corazón de varias especies de mamíferos
incluyendo al humano es el receptor muscarínico del subtipo 2 (M2) (KREJČÍ et al.,
2004). La estimulación de estos receptores provoca los efectos cronotrópico e inotrópico
negativos. En aurícula su estimulación causa un efecto cronotrópico negativo y en tejido
aislado un efecto inotrópico negativo. En ventrículo el efecto cronotrópico negativo solo
puede ser demostrado experimentalmente cuando la fuerza de contracción basal ha
aumentado por la aplicación de agentes que aumentan la concentración intracelular de
AMPc (Bucchi et al., 2003; Brodde et al., 1999,2006).
11
If: Modulación de los canales-f en la regulación autónoma del NSA
Las propiedades de If, descritas hasta ahora, permiten suponer un papel crucial
en los mecanismos que subyacen a la modulación de la frecuencia cardiaca. Tanto la
estimulación simpática como la parasimpática modulan los niveles de AMPc
citoplasmico mediante la activación de los receptores β1 y los muscarínicos M2
respectivamente. La estimulación adrenérgica incrementa los niveles de AMPc a través
de las proteínas GS que activan a la adenilato ciclasa resultando ulteriormente, en la
producción de AMPc. En cambio la estimulación muscarínica reduce la concentración
citoplasmica de AMPc al inhibir la adenilato ciclasa por la activación de una proteína
Gi/o. La unión de las moléculas de AMPc al C-terminal de los canales-f incrementa su
probabilidad de apertura, lo cual se puede observar en un corrimiento de su curva de
activación hacia potenciales positivos. La reducción en la concentración del AMPc da
lugar al efecto contrario, un corrimiento hacia potenciales negativos en la curva de
activación de los canales-f, reduciendo su probabilidad de apertura. Estos efectos
impactan directamente en la pendiente de la DDE en la fase 4 del potencial de acción de
NSA, aumentándola o disminuyéndola respectivamente (Barbuti y DiFrancesco., 2008).
Canales KACh y corriente de K+ activada por agonistas muscarínicos (IKACh) en la
regulación parasimpática del marcapaso
Los canales
KACh son heterotetrámeros formados con subunidades de la
subfamilia Kir 3.0. En los tejidos cardiacos el canal KACh está formado por subunidades
Kir 3.1 y 3.4 con en una estequiometria 2:2 (Kubo et al., 2005). Se ha reportado que
cada subunidad posee un sitio de unión para las subunidades βγ de la proteína G en los
extremos amino y carboxilo terminal del canal. Además, una característica distintiva de
estos canales es su mecanismo de rectificación, el cual corresponde a un bloqueo rápido
por Mg2+ y poliaminas intracelulares, bloqueo que además es dependiente de voltaje.
12
En los primeros estudios realizados por Hutter y Trautwein (1955) acerca de
esta regulación, se observó que la estimulación parasimpática detenía el marcapaso en la
vena sinusal de rana y que este efecto era debido al aumento en la conductancia
membranal de K+.
En células aisladas de NSA de conejo se observó que altas dosis de ACh (1µΜ)
producen un desplazamiento en el PDM hacia potenciales mas negativos
(hiperpolarización) y eventualmente suprimen la actividad del marcapaso debido a la
activación máxima de IKACh, en contraste bajas dosis de ACh (1-10nM) enlentecen la
actividad marcapaso al reducir la pendiente en la DDE en ausencia de otros cambios en
los parámetros del potencial de acción o del PDM (Shibata et al., 1985). Estudios
recientes sobre la importancia de IKACh en la regulación de la frecuencia cardiaca se han
obtenido utilizando ratones modificados genéticamente que carecen de los canales
Kir3.4 (Kir3.4-/-). Los ratones Kir3.4-/- no poseen de IKACh en la aurícula, además de
mostrar una reducción prominente de la regulación autónoma de la frecuencia cardiaca
(Wickman et al., 1998).
13
II.
ANTECEDENTES
Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) y proteínas G; papel fisiológico
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) o receptores de 7 dominios
transmembranales (7TM), constituyen una gran superfamilia de proteínas transductoras
de señales que pueden ser activadas por estímulos externos y al hacerlo activan la
transducción de señales intracelulares mediante proteínas G (Marinissen, et al., 2001).
Los GPCR se encuentran en prácticamente todos los organismos vivos,
incluyendo bacterias, levaduras, plantas y animales (King et al., 2003). Los ligandos
que se unen y activan estos receptores incluyen compuestos sensibles a la luz, olores,
feromonas, hormonas y neurotransmisores, además varían de tamaño desde moléculas
pequeñas pasando por péptidos a grandes proteínas. Los GPCR también median señales
de algunas enfermedades y son el blanco molecular de alrededor de la mitad de los
fármacos actuales (Filmore., 2004).
Las proteínas G heterotriméricas forman una familia de proteínas caracterizadas
por poseer 3 subunidades (á, â y ã) y por su capacidad para fijar GTP (Guanosín
trifosfato) e hidrolizarlo a GDP (Guanosín difosfato) durante su ciclo funcional, a lo
cual deben su nombre (Alberts et al., 2002).
Existen principalmente dos vías de señalización en las que participan los GPCR:
la del AMPc (Adenosín monofosfato cíclico) y la del fosfatidil inositol (PI). Su
mecanismo de transducción en el caso de las GPCR y proteínas G heterotriméricas es el
siguiente; la unión del ligando a su receptor genera cambios conformacionales que
involucran cambios en la posición relativa de las siete á hélices transmembranales,
además de cambios en las asas intracelulares. Estos cambios conformacionales que
ocurren en los receptores activados impactan a las proteínas G que se encuentran
ancladas a la membrana mediante estructuras hidrofóbicas, acopladas a estos en la
región intracelular. Dicha interacción receptor-proteína G promueve el intercambio de
GDP por GTP en la subunidad Gá. Generalmente se asume que la forma activa Gá-GTP
disminuye su afinidad por el dímero Gâã, de tal forma que la proteína G se disocia en
Gá-GTP y en el dímero Gâã. Por otro lado, tanto Gá-GTP como Gâã que pueden regular a
diversos efectores tales como a la adenilato ciclasa y fosfolipasa C y los canales KACh
14
respectivamente, estos eventos siempre están delimitados a la membrana celular
(Bunemmann, et al. 2003).
Los receptores acoplados a proteínas G son modulados por voltaje
El potencial de reposo a través de las membranas celulares se establece a través
de una bicapa lipídica de 3 nm de espesor, por la diferencia del gradiente
electroquímico, generando como resultado un campo eléctrico susceptible de influir
sobre cualquier elemento cargado en su interior (Hille., 2001).
Estudios recientes sobre algunos GPCRs han expuesto que su función es
afectada por el voltaje. Evidencias obtenidas en diferentes preparaciones, han mostrado
que los receptores 7TM son modulados por el potencial de membrana celular. Los
trabajos pioneros acerca de esta propiedad de los GPCRs mostraron que los receptores
colinérgicos muscarínicos de células acinares pancreáticas y de musculo liso modulan
su actividad en función del potencial de membrana al cual se mantengan (Marty et al.,
1989; Ganitkevich e Isenberg., 1993). En este mismo contexto estudios mas recientes
han demostrado que los receptores purinergicos (P2Y1), los receptores a tromboxano
(A2) y los receptores a serotonina (Martínez-Pinna et al., 2003, 2005), el receptor M1
(Ben-Chaim et al., 2003) y los receptores a glutamato mGlur1a (Ohana et al., 2006)
aumentan su actividad cuando se despolariza la preparación. Por otro lado también se ha
reportado que la actividad de los receptores M2 (Ben-Chaim et al., 2003) y los
receptores mGluR3 (para el transmisor excitatorio glutamato) (Ohana et al., 2006) se
reduce con potenciales despolarizantes. Estas evidencias apoyan la idea de la
modulación del potencial transmembrana sobre la actividad de los GPCRs.
Esta propiedad de “sentir el voltaje” demostrada anteriormente en distintas vías
de señalización de distintos GPCRs, implica que esta sensibilidad se pudiese estar
dando en alguno de los componentes de la vía (receptor, proteína G u otro elemento de
la vía).
Algunas proteínas como los canales iónicos activados por voltaje poseen
estructuras sensibles a estos cambios en el potencial de membrana. El sensor de voltaje
de este tipo de canales lo constituyen varios aminoácidos cargados positiva o
negativamente ubicados entre los segmentos transmembrana S1 al S4. Siendo el S4 la
región donde se ubica la mayoría de las cargas positivas del sensor.
15
Los cambios en el potencial de membrana inducen movimientos de un sensor de
voltaje que a su vez produce los cambios conformacionales que permiten o limitan el
flujo iónico en los canales (Jiang et al., 2003). El movimiento de estos residuos
cargados (carga asociada a la proteína del canal) genera corrientes capacitivas a las que
se han llamado “corrientes de compuerta” (gating currents) y representan el rasgo más
distintivo de este tipo de proteínas sensores del potencial de membrana (Armstrong y
Bezanilla., 1973).
Ben-Chaim y colaboradores (2006) lograron registrar en un sistema de expresión
heterólogo corrientes asociadas con movimientos de cargas análogas a las “corrientes de
compuerta” de los canales iónicos sensibles a voltaje en el receptor M2. Estas evidencias
reportadas en específico por este grupo sugieren que la sensibilidad al voltaje reside en
la estructura del receptor y no en su cascada de señalización o vía posterior a la
activación del receptor.
En nuestro laboratorio encontramos que en miocitos aislados de corazón de
mamífero el potencial de membrana modula el efecto de ACh en el proceso de
activación de la corriente IKACh. Además, mostramos que esta modulación por voltaje es
dependiente de agonista. Colina un agonista muscarínico parcial activa al canal KACh
con una dependencia de voltaje opuesta a la reportada para ACh (Moreno-Galindo.,
2006). Posteriormente, se mostro que Pilocarpina, otro agonista parcial también posee
dependencia de voltaje similar al mostrado por colina (mayor potencia a potenciales
más positivos) (Moreno-Galindo., 2008). Interesantemente, esta modulación opuesta del
voltaje para varios agonistas también se refleja en los efectos que estos producen sobre
el movimiento de carga asociado a la proteína del receptor M2. ACh reduce el
movimiento de carga del receptor M2 sugiriendo que el cambio conformacional
inducido por este agonista hace más rígido al receptor. Contrariamente, pilocarpina
incrementa el movimiento de carga en el receptor lo que supone una conformación con
mayor flexibilidad (Navarro-Polanco et al., 2008).
Otro grupo ha reportado la modulación dependiente de agonista para otro
GPCRs, Sahlholm y colaboradores (2008), mostraron que el receptor a Dopamina
humano D2s tiene una dependencia de voltaje específica para Dopamina, Fenetilamina y
varios análogos de esta última.
16
El NSA es la estructura encargada de generar el impulso eléctrico (a manera de
potenciales de acción) que se propaga por el sistema de conducción del miocardio y
que le brindan a su vez las características mecánicas de contracción, es por esto, que el
NSA es considerado como el tejido marcapaso en el corazón de mamífero. La función
normal de las células del NSA da origen al latido cardiaco, las alteraciones en su
función están asociadas a patologías que pueden generar arritmias y síncopes cardiacos.
La actividad marcapaso del NSA esta regulada “negativamente” por el sistema nervioso
autónomo parasimpático. La liberación de ACh de las terminales nerviosas vágales
activan a los receptores muscarínicos. Específicamente a M2 que es el subtipo de
receptor muscarínico predominantemente en el NSA de mamífero. A pesar de la
relevancia funcional de M2 en la regulación de la actividad nodal, no se han reportado
estudios acerca de que la modulación sea dependiente de voltaje y que está a su vez
modula la interacción agonista- receptor en este tejido. Por tal razón en este trabajo
caracterizamos el efecto modulador del voltaje sobre la interacción agonista-receptor
muscarínico en células nodales con actividad marcapaso en corazón de gato.
17
III.
HIPÓTESIS
El potencial de membrana modula la interacción agonista-receptor muscarínico
M2 influyendo en el nivel de activación del canal KACh en miocitos de nodo
senoauricular de corazón de mamífero.
IV.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar la modulación dependiente de voltaje de la interacción agonistareceptor de la vía de señalización muscarínica (M2-Gi/o-KACh) en cardiomiocitos
aislados de nodo seno auricular.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
a) Evaluar la modulación voltaje dependiente de IKACh en cardiomiocitos
marcapaso nodales, usando concentraciones fisiológicas de K+, activando la
corriente con el agonista fisiológico y el agonista parcial pilocarpina.
b) Realizar un estudio comparativo entre las corrientes macroscópicas activadas
por los agonistas muscarínicos en células aisladas de nodo senoauricular y de
aurícula.
18
V.
MATERIAL Y MÉTODOS
Registro en miocitos aislados de nodo senoauricular (NSA) y aurícula izquierda
(AI) de corazón de gato.
Los miocitos cardiacos fueron aislados utilizando el método de perfusión
retrógrada tipo Langendorff descrito a continuación:
Gatos adultos (hembra o macho, 2 – 3 Kg de peso) fueron heparinizados (1000
U/kg, i.p.) y anestesiados con pentobarbital sódico (35 mg/kg, i.p.). Una vez que el
felino se mantuvo en anestesia profunda se le extirpó el corazón mediante una
toracotomía bilateral. Inmediatamente después de ser extirpado, el corazón fue colocado
en un vaso de precipitados con solución Tyrode (80mL, en mM: NaCl 118, KCl 5.4,
MgCl2 1.05, NaHCO3 24, NaH2PO4 0.42, dextrosa 11, CaCl2 1.8, taurina 20, ajustada a
pH 7.4 con gas carbógeno; 95% O2 y 5% O2) fría (2 - 6 °C). Una vez colocado en el
vaso de precipitados con dicha solución se disecó el corazón y se desechó el pericardio
junto con el exceso de tejido adiposo que recubre la aorta. Posteriormente, el corazón
fue colgado vía arteria aorta en la punta de una jeringa acoplada al sistema Langendorff.
El corazón fue perfundido mediante este sistema con solución Tyrode (37°C) 5-7 min,
seguido de solución Tyrode 0 Ca2+ (37°C) por otros 5-7 min. A continuación, se
agregaron enzimas para digestión en la misma solución Tyrode 0 Ca2+: primero se
agregó colagenasa (0.33 mg/mL, tipo I, Sigma, USA) 4-7 min, después se agregó
elastasa (0.044 mg/mL, porcina pancreática, Worthington, USA) 4-6 min
y
posteriormente se agregó proteasa (0.033 mg/mL, tipo XIV, Sigma, USA) 5-10min. El
tiempo total de perfusión enzimática fue de 16 - 20 min. Finalmente, se perfundió por 5
min una solución alta en K+, baja en Na+ y baja en Cl- (para el lavado de las enzimas),
nombrada solución medio Kraft-Bruhe a 37°C (KB; en mM: ácido glutámico 80, KCl
40, taurina 20, KH2PO4 10, creatina 0.5, ácido succínico 10, MgSO4 5, dextrosa 10,
HEPES-K 10, EGTA-K 0.2, ajustada a pH 7.4 con KOH y burbujeada con O2 100%).
En seguida, se descolgó el corazón de la punta de la jeringa del sistema Lagendorff y se
colocó en una cámara de disección llena de medio KB. Con el propósito de descubrir la
vena cava, se disecaron los ventrículos mediante un corte transversal en el septum
auriculoventricular. El NSA fue expuesto mediante un corte transversal sobre la vena
cava superior y la vena cava inferior y fue disecado mediante un corte longitudinal
sobre el tejido adyacente a la AD y la crista terminalis.
19
La AI fue localizada directamente y disecada con un corte transversal. Los
tejidos disecados (NSA y AI) fueron colocados en un vaso de precipitados con medio
KB (5 mL, 25 °C) y se dispersaron por agitación mecánica. Los células obtenidas
mediante este proceso se mantuvieron en reposo a baja temperatura (2 - 6 °C) por 2 h
previas a la experimentación.
Registros electrofisiológicos de miocitos aislados
Todos los registros fueron llevados a cabo a temperatura ambiente (23-25 °C).
Las micropipetas se prepararon a partir de capilares de borosilicato TW150F-6 (WPI
Inc., USA) con un estirador P-97 (Sutter Instruments, USA) y una microforja MF-83
(Narishige, Japón) y tuvieron una resistencia de 1.5-3 MΩ cuando eran llenadas con
solución intracelular (en mM: L-aspartato 80, KH2PO4 10, MgSO4 1, KCl 40, HEPES 5,
BAPTA K+4 5, GTP-Na 0.2 y ATP-Na2 3, pH 7.25 KOH). Las corrientes macroscópicas
activadas por la perfusión de los agonistas muscarínicos acetilcolina (ACh) y
pilocarpina (PILO) fueron registradas en la configuración de célula completa. Dichos
agonistas se disolvieron en solución Ca-Co (en mM: NaCl 136, KCl 4, MgCl2 1, HepesNa 10, CaCl2 0.5, CoCl2 2, y Glucosa 11, pH 7.4) y se aplicaron a través de un sistema
de perfusión rápida (descrito más adelante). Las pipetas se colocaron en un sujetador
conectado a un preamplificador que estaba montado en un micromanipulador MWO-3
(Narishige, Japón) y a su vez conectado a la entrada de un amplificador Axopatch 200B
(Axon Instruments, USA). La capacidad de la membrana y la resistencia en serie fueron
compensadas al menos en un 70%. El baño se puso a tierra utilizando un puente
agar/KCl. Para el registro de las corrientes se empleó un filtro Bessel pasabajas a 1
kHz. La generación de pulsos y la adquisición y procesamiento de datos
fueron
realizados utilizando una computadora HP Compaq, conectada a un convertidor A/D
(Digidata 1440A, Axon Instruments) y utilizando el programa pClamp (v. 10, Axon
Instruments). La frecuencia de adquisición fue de 4 kHz.
20
Sistema de perfusión rápida
Las células en la cámara de registros inicialmente fueron bañadas con solución
Ca-Co en un flujo establecido por gravedad con un sistema de perfusión convencional a
razón de 1mL/min. Una vez realizada la configuración de célula adherida, se activó el
sistema de perfusión rápida a través de un sistema multipipetas (SF-77B, Warner
Instruments, USA) y se perfundió la célula con solución Ca-Co. Posteriormente ya en la
configuración de célula completa, se fijó cada célula a un potencial de mantenimiento
(PM) de +20 o -50 mV. La fijación del PM se realizó de manera aleatoria, es decir, para
una célula dada primero se experimentó con el PM de +20mV seguido del PM de 50mV y de manera opuesta para la siguiente célula. Entre la fijación de cada PM se dejó
reposar la célula por 1-2min a -40mV. Los tiempos de aplicación y lavado del agonista
sobre la célula se programaron digitalmente utilizando el programa pClamp (v. 10,
Axon Instruments) en la modalidad de Clampex.
Curvas concentración- respuesta
Se realizaron curvas concentración respuesta (CR) para los dos agonistas
muscarínicos probados (ACh y PILO), a los voltajes de -50 y a +20 mV para cada uno.
Se utilizó el sistema de perfusión rápida para perfundir concentraciones crecientes del
agonista durante el tiempo mínimo requerido para alcanzar la activación máxima de la
corriente. Después de cada aplicación de agonista este fue lavado con solución Ca-Co
(de 20 a 60s) hasta recuperar la corriente basal. Para construir las curvas CR se midió la
activación máxima de la corriente activada por las distintas concentraciones de agonista
muscarínico y se dividió entre la corriente activada por la concentración del agonista
fisiológico previamente determinada como supramáxima para ambos voltajes (10 µM
de ACh) (Navarro-Polanco et al., 2006; Moreno-Galindo., 2008).
Los miocitos de NSA se identificaron con la presencia de la corriente marcapaso
o If, esta corriente se registró aplicando un pulso hiperpolarizante con duración de 3
segundos a -100mV, partiendo de un potencial de mantenimiento de -35 mV.
21
Análisis estadístico de los datos
Las curvas CR se ajustaron a la ecuación de Hill que describe la relación entre la
concentración y el efecto, donde la acción de un fármaco se expresa en términos del
efecto, E, del agonista, A y de su concentración, [A]. Esta relación entre E y [A] tiene la
siguiente forma:
Donde Emax es la acción máxima de A, nH es el coeficiente de Hill y [A]50 es la
concentración que produce un efecto del 50% de Emax. Para conocer el nivel de
significancia de los datos obtenidos con los voltajes de prueba, se ajustaron los datos de
cada célula con la ecuación de Hill y se obtuvieron los parámetros EC50, Emáx y n, con
los cuales posteriormente se obtuvo la media ± el error para cada parámetro. Para
conocer el nivel de significancia de los datos se realizó una prueba estadística t de
Student pareada.
22
VI.
RESULTADOS
Corriente marcapaso
Previo al registro de IKACh en cada célula nodal se intento registrar If.
Típicamente, If es una corriente entrante de lenta activación que se genera con pulsos
hiperpolarizantes. En la figura 5 se muestra un registro representativo de esta corriente
donde se puede observar la cinética de activación y desactivación de estos canales en
células de NSA.
-40mV
-35mV
-100mV
Figura 5. Registro de la corriente marcapaso, If: El registro se realizó en respuesta a un pulso de
voltaje a -100mV por 3 s partiendo de un potencial de mantenimiento de -35mV y regresando a un
potencial de -40mV para registrar la corriente de cola. Esta corriente es característica de células con
actividad marcapaso en corazón de mamíferos como el NSA.
23
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por agonistas muscarínicos en
miocitos marcapaso cardiacos.
En la figura 6 se muestran registros representativos de IKACh obtenidos a los
potenciales de membrana de -50 mV y +20 mV en un mismo miocito (figura 6A). Para
los dos potenciales de membrana la aplicación de concentraciones crecientes de ACh
activan corrientes con amplitud progresiva. También, se puede observar que la amplitud
relativa de las corrientes, generadas con los pulsos de ACh, es mayor al potencial de
membrana negativo (-50 mV) respecto al positivo (+20 mV). Nótese, que los registros
obtenidos a -50 mV generan corriente saliente, sin embargo en la figura se muestran
invertidos para hacer más clara la comparación a ambos voltajes. Las curvas
concentración-respuesta generadas a -50 mV y + 20 mV muestran que el potencial de
membrana modifica la potencia de activación significativamente (p < 0.001) (figura
6B). Los valores de EC50 obtenidos a -50 mV y + 20 mV fueron 47±6 nM y 136±28
nM respectivamente (figura 6B). Estos resultados muestran que en células marcapaso
del NSA el potencial de membrana modula la activación de IKACh con el agonista
fisiológico.
A
+20mV
-50mV
24
B
Figura 6. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos marcapaso de gato:
A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de +20mV y -50mV,
indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. Las concentraciones de ACh se aplicaron
como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la
curva los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar de la media, en
círculos negros se muestra el potencial de mantenimiento de -50 mV y más hacia la derecha en círculos
rojos el de +20 mV.
PILO es un agonista colinérgico muscarínico parcial, es decir; un fármaco que
se une al receptor M2 pero que produce respuestas submáximas respecto al agonista
fisiológico. Cuando IKACh es activada por concentraciones crecientes del agonista
parcial PILO la fracción de corriente generada es mayor para el potencial de membrana
positivo que para el negativo (figura 7A). Lo anterior muestra que PILO activa a la
corriente con una dependencia de voltaje opuesta a como lo hace ACh. Esta modulación
voltaje dependiente de IKACh se ve reflejada en la mayor potencia de activación
obtenida en la curva concentración-respuesta a +20 mV (EC50 = 4.5±1 µM) respecto a
la obtenida a -50 mV (8.9±0.1 µM) (figura 7B). También, se puede observar que la
activación máxima (EMAX) de corriente activada por PILO es modulada por el potencial
de membrana. La EMAX obtenida a +20 y -50 mV fue de 0.40± 0 y de 0.27 ± 0
respectivamente.
25
A
+20mV
-50mV
B
Figura 7. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos marcapaso de
gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de -50 mV) y +20 mV,
indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. En el PM de -50mV se representa IKACh
como corriente entrante para fines comparativos, Las concentraciones de PILO y la de ACh se aplicaron
como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la
curva los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar, en círculos
rojos se muestra el potencial de mantenimiento de +20 mV y más hacia la derecha en cuadros negros el
de -50 mV. Este corrimiento de las curvas a dos diferentes voltajes es significativamente diferente, p<
0.05 (*).
26
Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por el agonistas muscarínicos en
miocitos de aurícula
Anteriormente en nuestro laboratorio se evalúo la modulación voltaje
dependiente de la vía del receptor M2 activada por agonistas muscarínicos en miocitos
auriculares con una concentración alta de K+ y potenciales de mantenimiento no
fisiológicos (Moreno-Galindo., 2008). Aquí de igual forma que en NSA y a manera
comparativa, se evalúo la dependencia de voltaje en concentraciones fisiológicas de K+.
En la figura 8 se muestran los registros representativos de IKACh activada por
ACh en concentraciones crecientes que activan corrientes cada vez mayores.
Similarmente a nuestros resultados en NSA (mismas condiciones experimentales) y en
los estudios anteriores (Moreno-Galindo., 2008), se encontró que los potenciales
negativos favorecen a la generación de corriente por el agonista fisiológico, lo cual se
ve reflejado en la amplitud relativa de la corriente que es mayor a -50mV (figura 8A).
De igual forma que los resultados preliminares, en la curva CR se observa que el voltaje
modifica la potencia de activación significativamente (p< 0.001), lo cual se ve reflejado
en la EC50 que fue de 48±12 nM a -50 mV y 116±33 nM a +20 mV (figura 8B).
A
+20mV
-50mV
27
B
Figura 8. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por ACh en miocitos auriculares de
gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de +20 mV y -50 mV,
indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. En el PM de -50mV se representa IKACh
como corriente entrante para fines comparativos. Las concentraciones de ACh se aplicaron como indican
las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la curva CR los
símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar de la media, en círculos
negros se muestra el potencial de mantenimiento de -50 mV y más hacia la derecha en círculos rojos el de
+20 mV.
Tras la aplicación de PILO en AI (figura 9), se observa una mayor amplitud
relativa de las corrientes generadas al PM de +20mV, lo cual concuerda con los
resultados preliminares y aquellos obtenidos en NSA. Similarmente a dichos resultados,
PILO en AI con concentraciones fisiológicas de K+, activa IKACh con una dependencia
de voltaje opuesta que la mostrada por ACh. La EC50 fue de 9±4 µM a -50 mV y 21±5
µM a +20 mV. Lo que refleja una mayor potencia de activación para a potenciales
positivos. La EMAX fue de 0.47 ± 0 para el voltaje negativo y de 0.55 ± 0 para el
positivo, indicativo de una activación máxima de la corriente que también es modulada
por el voltaje al ser un valor menor para potenciales positivos.
28
A
La parte de imagen con el identificador de relación rId28 no se encontró en el archiv o.
+20mV
-50mV
B
Figura 9. Dependencia de voltaje en la activación de IKACh por PILO en miocitos auriculares de
gato: A, Registros de corriente representativos a los potenciales de mantenimiento de -50 mV y +20 mV,
indicados en los cuadros de color rojo y negro respectivamente. En el PM de -50mV se representa IKACh
como corriente entrante para fines comparativos. Las concentraciones de PILO y la de ACh se aplicaron
como indican las barras negras horizontales (el tamaño indica el tiempo de activación de IKACh) B, en la
curva respuesta, los símbolos representan la media del grupo y las líneas verticales el error estándar, en
círculos rojos se muestra el potencial de mantenimiento de +20 mV y más hacia la derecha en cuadros
negros el de -50 mV. Este corrimiento de la s curvas es significativamente diferente (p< 0.01**).
29
Densidad de corriente (pA/pF) de cardiomiocitos de NSA y AI.
En los resultados obtenidos por la activación de IKACh por agonistas
muscarínicos, se puede observar una mayor amplitud relativa de corriente para las
células aurículares en comparación con las células del nodo senoauricular. Con el
objetivo de obtener un parámetro para hacer la comparación, se obtuvo la densidad de
corriente, al dividir la IKACh (pA) que se activo con la concentración supramáxima de
ACh (10µM) entre la capacitancia (pF) de cada célula registrada y se construyo un
grafico de barras (Figura 10). En el se puede observar que la densidad de corriente es
significativamente mayor (p > 0.001) para AI (barras negras) que para NSA (barras
rayadas) en el voltaje de -50 mV (figura 10A), de igual forma la densidad de corriente
es significativamente mayor (p > 0.001) para AI que para NSA en el P.M. de +20mV
(figura 10B) y además, el parámetro es significativamente mayor (p > 0.001) para
ambos tejidos en el voltaje positivo comparado con el negativo (figura 10C).
La parte de imagen con el identificador de relación rId30 no se encontró en el archiv o.
C
B
A
Figura 10. Densidad de corriente en cardiomicitos marcapaso y auriculares de corazón de gato:
Densidad de corriente representativa de cada una de las células registradas en los dos tejidos a prueba, la
diferencia entre cada tejido y potencial de mantenimiento es significativamente diferente, p > 0.001 (* *
*, ###). En el eje vertical se representan las barras con las unidades de densidad de corriente (pA/pF). En
el eje horizontal los PM en mV.
30
VII. DISCUCION Y CONCLUSIONES
Los resultados en nuestro estudio muestran que en células marcapaso del NSA,
el potencial de membrana modula la activación de IKACh con el agonista fisiológico y
con el agonista parcial PILO. Sin embargo, en presencia de PILO el potencial de
membrana modula opuestamente la activación de la vía de señalización comparada con
aquella inducida por ACh. Además nuestros resultados muestran que en células
auriculares la dependencia de voltaje y agonista se sigue presentando aun con
concentraciones fisiológicas de K+ en la solución extracelular. Finalmente encontramos
que la densidad IKACh es significativamente diferente para las células auriculares
respecto a la encontrada en células de NSA. Esta diferencia en densidad de corriente
también es significativa entre ambos potenciales de membrana probados.
El cambio en la potencia inducido por el voltaje y reflejado en el valor de EC50,
pueden ser explicado por alteraciones en la afinidad y/o en la eficacia. El incremento de
la potencia inducido por la hiperpolarización en presencia de ACh en miocitos del NSA
concuerda con evidencias previamente reportadas en sistemas de expresión heterólogos
y en células auriculares cardiacas (Ben-Chaim et al., 2003; Moreno-Galindo., 2008).
Evidencias adicionales obtenidas con radioligandos mostraron que los cambios en el
potencial de membrana modulan la afinidad de ACh por el receptor M2 (Ben-Chaim.,
2003). Otros resultados mostraron que la sensibilidad al voltaje radica en al receptor M2
y no en otros elementos de la vía de señalización (proteína G y canal KACh) (Ben-Chaim
et al., 2003; Moreno-Galindo., 2008). La evidencia más importante en este sentido fue
el registro de corrientes asociadas a la proteína del receptor M2. Estas corrientes son
análogas a las “corrientes de compuerta” (corriente de gating) de los canales iónicos
sensibles a voltaje y su presencia implica la capacidad de una estructura proteica para
sensar los cambios en el potencial de membrana (Ben-Chaim et al., 2006; NavarroPolanco et al., 2008).
Los modelos clásicos que explican la activación de los receptores acoplados a
proteínas G, proponen que estos receptores existen en equilibrio entre dos estados, un
estado de alta afinidad y otro de baja afinidad. Se ha propuesto que la asociación de los
receptores con las proteínas G triméricas favorece al estado de alta afinidad y la
desunión el de baja afinidad (Ben-Chaim et al., 2006; Parnas y Parnas., 2007).
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En base a esto se postulo que la despolarización favorece el desacoplamiento
entre los receptores M2 y la proteína Gi/o induciendo un estado de baja afinidad mientras
que ocurre lo contrario con la hiperpolarización (Moreno-Galindo., 2008). Por lo que en
los trabajos además del nuestro, donde se observa una disminución de la potencia para
ACh en despolarización, se concluye que; la despolarización induce cambios
conformacionales en el receptor que reducen el acople con las proteínas G, lo que
promueve el estado de baja afinidad (Navarro-Polanco et al., 2008). No obstante, esta
hipótesis no permite explicar nuestros resultados con el agonista parcial PILO. Ya que
uno esperaría que la despolarización, al inducir un estado de baja afinidad produjera una
disminución en la afinidad de cualesquier agonista por el receptor. PILO por el
contrario incrementa la potencia de activación con el voltaje positivo.
Una explicación adicional a este fenómeno sugerida por nuestro laboratorio es
que el voltaje induce cambios conformacionales que son transmitidos directamente al
sitio de unión del agonista en los receptores que favorecen o no la interacción ligandoreceptor, en función de la estructura molecular del agonista. Evidencias recientes
muestran que la substitución de varios aminoácidos en el sitio ortoestático del receptor
M2, identificados como importantes en la interacción ligando-receptor producen
cambios drásticos en la curva carga-voltaje construida a partir de las corrientes
asociadas a la proteína del receptor.
Además, se ha reportado que ACh reduce el desplazamiento de la carga asociada
a la proteína del receptor mientras que PILO la incrementa, lo que sugiere que el voltaje
también modula los cambios conformacionales posteriores a la unión del agonista. Esto
puede explicar la modulación de la eficacia inducida por el voltaje que observamos en
presencia de PILO.
Los resultados reportados inicialmente en nuestro laboratorio por MorenoGalindo (2008) fueron obtenidos con una concentración alta de K+ en la solución
extracelular (20 mM), al respecto se conoce que las concentraciones catiónicas modulan
la actividad de los receptores y de los canales. Nuestros resultados muestran que en
miocitos auriculares la dependencia de agonista y voltaje se sigue presentando
utilizando concentración fisiológica de K+ (4 mM). Esto sugiere que no es la condición
iónica la que establece la dependencia de voltaje sino las características intrínsecas del
receptor M2. Bajo estas condiciones experimentales se puede observar que la amplitud
de IKACh es claramente de mayor amplitud en los miocitos auriculares respecto a los de
NSA.
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Estas observaciones las corroboramos midiendo la densidad de corriente
expresada como pA/pF. Este último resultado sugiere diferencias en la expresión de uno
o varios de los componentes que integran esta vía de señalización (M2-Gi/o-KACh).
También puede implicar alguna regulación metabólica de alguno de estos componentes
que puedan hacer menos sensible esta vía en NSA y que ulteriormente esto se vea
reflejado en la disminución de la actividad del canal KACh. Hasta ahora no se tienen
evidencias que señalen diferencias en el nivel de expresión de los receptores M2, la
proteína Gi/o o las subunidades que forman el canal KACh entre estos dos tejidos. Los
pocos reportes que existen al respecto señalan que la expresión de los genes que
codifican para el receptor M2 mayor en NSA y aurícula, no así para ventrículo (Gernot
et al., 2002).
Se conoce que el canal KACh es un heterotetrámero que se compone de las
subunidades Kir3.1 y Kir3.4. Referente a esto existen reportes en los que se hace notar
una amplia diferencia en la expresión de los genes que codifican para las subunidades
de estos canales en las diferentes especies de mamíferos. En NSA de ratón se ha
encontrado una baja expresión de la subunidad Kir3.1 (Marionneau et al., 2004),
mientras que en NSA de rata, cobayo y hurón se ha encontrado una alta expresión de
Kir3.1 (Dobrzynski et al., 2001).
En aurícula y NSA de hurón se ha encontrado que la subunidad Kir3.1 esta colocalizada
con el receptor M2 (la colocalización es importante debido a que durante la actividad de
la vía de dicho receptor es más probable encontrar a estos elementos contiguos). La
expresión de Kir3.4 ha sido encontrada abundante en aurícula y en NSA de rata y se
desconoce para otras especies (Gernot et al., 2002). Esta evidencia experimental no
permite dar una explicación acertada del porque existe una mayor densidad de corriente
en AI que en NSA de corazón de gato, se ha reportado que existe una mayor densidad
de corriente en aurícula que en ventrículo de rata (McMorn et al., 1993) lo cual puede
ser correlacionado con la pobre expresión de ambas subunidades del canal KACh en
ventrículo, diferencias que fueron encontradas además, para el corazón de las diferentes
especies de mamífero. Pero ante la falta de una evidencia directa de la expresión y
colocalización del receptor M2 de las subunidades del canal que relacione una diferencia
significativa para corazón de gato, no se puede inferir que la mayor densidad de
corriente en AI se debe a una expresión mayor de alguno de los componentes de la vía
en estos tejidos.
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Adicionalmente, una probable explicación de la mayor densidad de corriente encontrada
al potencial de +20mV en comparación con el de -50mV, es la mayor contribución de la
fuerza electromotriz que opera sobre la corriente registrada al potencial positivo. Dado
que el potencial de equilibrio teórico para una conductancia de potasio con las
concentraciones internas y externas utilizadas en nuestros experimentos es de ~-90mV.
Por lo que el ∆V a -50 mV es de 40 mV mientras este mismo parámetro a +20 mV es de
110 mV, lo cual constituye un poco más del doble entre un potencial de membrana y
otro.
Finalmente, es importante señalar que esta propiedad de los GPCRs para sensar
el voltaje y modular la interacción ligando-receptor puede tener importantes
implicaciones funcionales en el tejido rector de la actividad eléctrica cardiaca, mismas
que tendrán que dilucidarse en experimentos futuros. Además, esta nueva propiedad
también puede tener implicaciones terapéuticas importantes ya que abre una nueva
perspectiva en la regulación de la señalización celular dependiente de la estructura
molecular de los ligandos.
34
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