EFECTO DE LA ULTRA ALTA PRESIÓN EN LA VIABILIDAD DE

2º Congreso Nacional AMICA 2015
EFECTO DE LA ULTRA ALTA PRESIÓN EN LA VIABILIDAD DE
DIFERENTES TIPOS DE BACTERIAS PRESENTES EN AGUAS
RESIDUALES.
Vázquez López Monserrat*, Treviño Quintanilla Luis G.*, Sopkin Ramírez René y Moeller
Chávez Gabriela E.*
*Universidad Politécnica del Estado de Morelos. Paseo Cuauhnáhuac 566. Col. Lomas del Texcal, Jiutepec, C.P.
62550
*[email protected]
Resumen
microorganismo patógenos y por ende se minimizan los
impactos negativos a la salud.
En este trabajo se realizaron una serie de experimentos para
conocer la sensibilidad de las bacterias a la ultra alta presión
(UAP). Se trabajó con E. coli ya que se considera un
organismo indicador de contaminación fecal, S. bongori que
es un agente patógeno y B. subtilis debido a que ese
microorganismo esporulado puede presentar una mayor
resistencia a la UAP. También se realizaron experimentos con
agua residual cruda y tratada.
Los experimentos se realizaron con tres presiones diferentes: a
presiones de 20MPa, 59MPa y 98MPa.
Se observó que con la presión baja los microorganismos que
se encuentran en el agua residual y las cepas utilizadas
sufrieron ya un daño apreciado por la disminución en el
número de células viables.
La cepa de E.coli fue más sensible debido a que al someterse a
una presión de 98MPa, se inactiva un 99.97%. La cepa de S.
bongori, que es un agente patógeno, el efecto de la UAP fue
menor ya que a un presión de 98MPa, se logró inactivar solo
un 76.83% y con la cepa B. subtilis se comprobó que este
microorganismo es resistente, ya que no se logró ni el 50% de
inactivación después de aplicarle 98MPa de presión, con el
agua residual al someterse a una presión de 98MPa, se logró
inactivar un 44.75%, finalmente con el agua residual tratada se
inactivó un 78.48%.
Palabras clave: Ultra alta presión, E. coli, S. bongori, B.
subtilis.
Introducción
Debido al alto crecimiento demográfico, a la urbanización y
probablemente, a los cambios climáticos, la escasez de agua
dulce es cada vez mayor, esto ha provocado el uso creciente
de aguas residuales para actividades como la agricultura, la
acuicultura, la recarga de aguas subterráneas y otras áreas
(OMS, 2010).Lo anterior es preocupante ya que el agua
residual sin tratar lleva una peligrosa carga de bacterias
infecciosas, virus y parásitos que causan graves daños a la
salud de los seres humanos, por lo que destaca la importancia
del tratamiento de estas aguas ya que en la última etapa del
mismo involucra una desinfección en la cual muere los
En las plantas de tratamiento de aguas residuales el cloro es el
desinfectante más usado debido a que es un tratamiento
económico en comparación con: la luz ultravioleta y la
ozonización. Desafortunadamente en el proceso de cloración
se genera subproductos tóxicos tales como los metanos
trihalogenados.
Una alternativa para el tratamiento de desinfección es la ultra
alta presión (UAP) que es un proceso mecánico que no
requiere de un agente químico para la destrucción o
inactivación de las bacterias y otros microorganismos
patógenos; debido a esto, la UAP es un proceso en el cual no
se generan subproductos. Inactiva algunas bacterias debido a
que posiblemente dañan la pared celular y las membranas del
microorganismo.
Antecedentes
La ultra alta presión es utilizada principalmente en alimentos
para evitar el crecimiento microbiano en el producto (Briñez,
2006), no existe información de este proceso como una
alternativa de desinfección en aguas residuales. Estudios
previos establecieron la posibilidad de inactivar o destruir los
huevos de Áscaris lumbricoides mediante el uso de un proceso
mecánico como lo es la ultra alta presión.
En ese trabajo se abordaron aspectos relevantes del estudio de
ese organismo, como su morfología, su ciclo de vida, su
presencia dentro de las aguas residuales. También se analiza
como este parásito es un grave problema de salud pública a
nivel internacional y su impacto a nivel nacional. Se
establecieron las condiciones experimentales, el muestreo en
la búsqueda de estas estructuras en distintas zonas de los
estados de Puebla y Tlaxcala; el método para la preparación
del agua modelo en laboratorio y el proceso para la aplicación
de presión en el agua modelos.
Se observaron cambios morfológicos como son la
deformación en los huevos de Áscaris lumbricoides a partir de
presiones de 294MPa, además los huevos dejan de ser viables
a presiones de 294MPa y que el agua residual deja de ser
fétida después de ser sometida a presiones superiores de
9.8Mpa (Sopkin, 2014).
ASOCIACIÓN MEXICANA DE INGENIERÍA CIENCIA Y GESTIÓN AMBIENTAL, A.C. AMICA
Av. Canal de Miramontes 2960 casa 35 Col. Los Girasoles, Del. Coyoacán, México D.F.
55 56 77 38 61
[email protected]
2º Congreso Nacional AMICA 2015
termotolerantes y este microorganismo es de elección para la
vigilancia de la calidad del agua de consumo.
Justificación
Debido a que el agua residual contiene sustancias orgánicas
que al ser cloradas dan origen a la formación de subproductos
como los trihalogenados que son considerados peligrosos para
la salud y el medio ambiente es necesario reducir la
generación de los mismos, para no dañar al cuerpo receptor
donde se descarga el agua residual tratada , una alternativa de
desinfección puede llevarse a cabo mediante la ultra alta
presión ya que se considera como una alternativa viable para
el tratamiento de aguas residuales ya que puede inactivar a los
microorganismo patógenos , dependiendo de su sensibilidad,
esto se logra ya que daña su pared celular sin tener que usar un
agente químico y por ende mejora así la calidad del agua que
se descarga a un cuerpo receptor.
Objetivos
Objetivo general
Inactivar a través de un sistema de ultra alta presión a
diferentes tipos de bacterias a temperatura ambiente.
Objetivo específico


Comprobar la inactivación de las bacterias modelos
E. coli, S. bongori y B. subtilis
Evaluar el efecto desinfectante de la ultra alta
presión sobre muestras de agua residual cruda y
tratada.
Metodología
La metodología seguida para el desarrollo de este trabajo
corresponde a la siguiente descripción:
Para el diseño experimental se utilizó Statgraphics que es un
software estadístico que está diseñado para realizar diseños de
experimentos en los cuales únicamente se requiere una
variable, la variable que se utilizó fue la presión alta, media,
baja 98MPa, 59MPa y 20MPa respectivamente, se tomaron
estas presiones ya que se encontraban en el rango con el cual
se había trabajado con Áscaris lumbricoides. Las pruebas se
realizaron por duplicado para reforzar la confianza de los
resultados.
Se realizó el muestreo de agua residual cruda y tratada la cual
fue obtenida del influente de la planta de tratamiento de la
Universidad Politécnica de Estado de Morelos, Localizada en
Jiutepec, Mor. Esta agua residual es de tipo municipal. La
muestra del agua residual cruda se tomó del cárcamo de
entrada y la muestra de agua residual tratada se tomó después
del tratamiento secundario antes de pasar por el tratamiento de
desinfección.
Las bacterias modelos utilizadas en este trabajo fueron:
E. coli debido a que se considera un organismo indicador de
contaminación fecal en poblaciones de coliformes
S. bongori es una bacteria patógena que pertenece al género
Salmonella y a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos
gram negativos.
B. subtilis es del género Bacillus son bacilos de gran tamaño,
gram positivos, aerobios estrictos o anaerobios facultativos
encapsulados. Una característica importante es que forman
esporas extraordinariamente resistentes a condiciones
desfavorables.
Se utilizaron este tipo de bacterias ya que se encuentran
presentes en agua residual.
Para preparar las muestras de bacterias que será sometida a
presión se realizó el crecimiento de las cepas de E. coli, B.
subtilis, S. bongori se inoculó en un matraz de 50 mL de caldo
nutritivo para cada una de la cepa y se incubaron por 24 h a
300 rpm. Después del tiempo transcurrido en el matraz se
adicionó 95% de caldo nutritivo y 5% de inóculo para tener
una absorbancia de 0.1 a 600 nm y se dejó crecer incubando a
37°C por 14 h.
Después de haber sometidos las muestras a presión para saber
si las células habían sido afectadas por la presión se utilizó la
técnica de dilución y siembra en placa como se menciona en la
Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1- 1994, Bienes y
servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos
para su análisis microbiológico- Para la cuenta en placa, se
consideraron solo las diluciones en las que se puedan contar
de 30 a 300 colonias por caja para conocer las Unidades
Formadora de Colonia (UFC/mL), se realizó esta técnica antes
y después del tratamiento.
Resultados y discusión
En la tabla 1 se observa que la bacteria de E. coli al aplicarle
una presión baja la bacteria se ve afectada ya que no crecen el
mismo número de células con las que se contaba en un
principio. Al aplicar una presión media aumenta el porcentaje
de células no viables, aunque con la presión de 98MPa queda
un 0.02% de células viables pero ese porcentaje equivale a
8x104 UFC/ml y es muy alto.
Tabla 1. Resultados del efecto de la ultra alta presión sobre
cultivos de E. coli a diferentes presiones.
E. coli
Blanco
20MPa
59MPa
98MPa
UFC/mL de células
viables
No viables
33x107
24x106
306x106
14x106
316x106
8x104
32 992x104
% de células
Viables
No viables
7.27
4.24
0.02
92.73
95.76
99.98
En la tabla 2 se observa que la bacteria de S. bongori, a pesar
de que también es un microorganismo gram negativo, no
presenta porcentajes similares de inactivación como los de E.
coli ya que al aplicar una presión de 20MPa la cantidad de
ASOCIACIÓN MEXICANA DE INGENIERÍA CIENCIA Y GESTIÓN AMBIENTAL, A.C. AMICA
Av. Canal de Miramontes 2960 casa 35 Col. Los Girasoles, Del. Coyoacán, México D.F.
55 56 77 38 61
[email protected]
2º Congreso Nacional AMICA 2015
células viables es de un 87.47% con respecto al cultivo no
tratado, al aumentar la presión a 59MPa se logró una
disminución en el porcentaje de células viables a un 59.34%
finalmente la aplicación de una presión de 98MPa ocasiona
que solo un 23.17% de células viables permanezca en la
muestra y que corresponde a 9.8 x 107 UFC/mL
Tabla 2. Resultados del efecto de la ultra alta presión sobre
cultivos de S. bongori a diferentes presiones.
S. bongori
Blanco
20MPa
59MPa
98MPa
UFC/mL de células
viables
No viables
4.23x108
3.7x108
5.3x107
2.51x108
1.72x108
9.8x108
3.25x108
% de células
Viables
No viables
87.47
59.34
23.17
12.53
20.66
76.83
En la tabla 3 se muestra los resultados obtenidos con cultivos
de la bacteria B. subtilis, esta microorganismo presenta una
gran resistencia a la ultra alta presión ya que a presar de
aplicar la presión más alta, que es 98MPa, las muestras
conservan un porcentaje de células viables después del
tratamiento del 63.37%
Pruebas a diferentes
presiones
4.50E+08 C
é
4.00E+08
l
3.50E+08 u
l
3.00E+08 a
s
2.50E+08
V
2.00E+08
i
a
1.50E+08
b
1.00E+08 l
e
5.00E+07 s
0.00E+00
E. coli
Tabla 3. Resultados del efecto de la ultra alta presión sobre
cultivos de B. subtilis a diferentes presiones.
B. subtilis
Blanco
20MPa
59MPa
98MPa
UFC/mL de células
viables
No viables
1.72x108
1.63x108
9x106
8
1.31x10
4.1x107
1.09x108
6.3x107
% de células
Viables
No viables
94.77
76.16
63.37
5.23
23.84
36.63
De acuerdo con los resultados obtenidos se observa que se
puede destruir o inactivar en mayor proporción a las bacterias
gram negativas como son E. coli y S. bongori ya que son
microorganismos más sensible a la ultra alta presión en
comparación con B. subtilis que es una bacteria esporulada y
que presenta una mayor resistencia a varios factores
ambientales por su estructura celular. En las bacterias gram
negativas el peptidoglucano determina la resistencia a la
destrucción de una célula como se observa en la tabla 7 y 8. S.
bongori es más resiste que E. coli probablemente debido a un
mayor número de capas de peptidoglicano. Las bacterias
esporuladas como B. subtilis son muy resistentes al calor,
tensiones físicas y químicas, debido a que estructuralmente
una endospora consiste en un núcleo rodeado por una corteza
de peptidolicano, una capa de la espora de proteínas y en
algunas especies una capa delicadamente delgada llamada
exosporium, por esto es más difícil destruir este tipo de
bacterias y con la UAP no hay excepción (Kai et. al., 2013).
En la Figura 1 se muestran como disminuyen las bacterias al ir
aumentando la presión.
S. bongori
B. subtilis
Control
Presión de 20MPa
Presión de 59MPa
Presión de 98MPa
Figura 1. Pruebas a diferentes presiones.
En la tabla 4 se observan los resultados del tratamiento de
agua residual cruda. Las UFC/mL del control es de 27 150,
esto se debe a que cuando se tomó la muestra el agua residual
cruda estaba diluida. De las 27 150 UFC/mL que se tenían al
inicio se logró disminuirlas a 15 000 con una presión de
98MPa
Tabla 4. Resultados del efecto de la ultra alta presión sobre agua
residual cruda a diferentes presiones.
Agua
residual
cruda
Blanco
20MPa
59MPa
98MPa
UFC/mL de células
viables
No viables
27 150
21 725
19 950
15 000
5 425
7 200
12 150
% de células
Viables
No viables
80.02
73.48
55.25
19.98
26.52
44.75
En la tabla 5 se observa que al aplicarle un presión de 98MPa
se logra disminuir a 21.51% quedando 185 000 UFC/mL de
las 860 000 UFC/mL iniciales. El porcentaje de células no
viables de la muestras de cultivos puros de bacterias es mayor
que el que se obtiene en el agua residual debido a que en las
muestras de cultivos puros de bacterias en el cual no hay
sólidos suspendidos las bacterias no tienen forma de
protegerse, en el agua residual estas partículas si existen en
donde los microorganismos podrían estar embebidos en ellas
para no ser dañados por la UAP.
ASOCIACIÓN MEXICANA DE INGENIERÍA CIENCIA Y GESTIÓN AMBIENTAL, A.C. AMICA
Av. Canal de Miramontes 2960 casa 35 Col. Los Girasoles, Del. Coyoacán, México D.F.
55 56 77 38 61
[email protected]
2º Congreso Nacional AMICA 2015
Tabla 5. Resultados del efecto de la ultra alta presión sobre agua
residual tratada a diferentes presiones.
Agua
residual
tratada
Blanco
20MPa
59MPa
98MPa
UFC/mL de células
viables
No viables
860 000
365 000
220 000
185 000
495 000
640 000
675 000
% de células
Viables
No viables
42.44
25.58
21.51
57.56
74.42
78.49
Estudios relacionados para la conservación de alimentos con
la ultra alta presión (UAP) dice que la UAP reduce la carga
microbiana debido a los mecanismos de caída brusca de
presión, cavitación, choque de ondas, impactos durante el
proceso. Estos mecanismos actúan principalmente sobre la
pared celular de los microorganismos provocando la ruptura
de la membrana celular ocasionando lesiones y la muerte
celular (Cruz et. al., 2010). Con los resultados obtenidos se
puede decir que la ultra alta presión si reduce la carga
microbiana ya que al ir aumentando la presión se nota como
van disminuyendo las células viables pero también dependerá
de la sensibilidad de cada célula.
En estudios realizados por Briñez en el 2006, menciona que el
efecto de la UAP depende del tipo de microorganismos ya que
las levaduras son más sensibles que las bacterias gram
negativas a presiones de 100MPa y las bacterias gram
positivas son más resistentes que las gram negativas.
Asimismo, reportó que con una presión de 100MPa se reducen
tres unidades logarítmicas de E. coli, dicho lo anterior se
afirma que al aplicar una presión de 98MPa hubo una
reducción de 8.3 unidades logarítmicas. También se ha
demostrado que S. lactis es más resistente a la UAP que B.
subtilis, indicando que la morfología de la bacteria (coco o
bacilo) es otro factor que determina la resistencia al
tratamiento UAP en este estudio se comprobó la inactivación
de estas bacterias en una solución de leche (Briñez, 2006). En
este trabajo experimental, se observó que al aplicar presiones
de 98MPa se obtiene una reducción de 8.3 unidades
logarítmicas para E. coli, la cual resulta mayor en
comparación con lo realizado por Briñez en el 2006, aplicando
100MPa. Esto puede deberse a la matriz en la que se
realizaron las pruebas ya que en este trabajo la matriz fue
leche y puede ofrecer algún tipo de protección a los
microorganismo contra el efecto de UAP, Se ha reportado que
tratamiento por UAP de leche con diferentes porcentajes de
grasas (3, 4, y 2%) mostraron diferentes niveles de reducción
de la carga microbiana. Un nivel de inactivación de 2, 3 y 4
unidades logarítmicas de reducción para L. innocua con leche
a una presión de 100MPa con 2, 3 y 4 % de grasa. Los
investigadores atribuyen el bajo nivel de reducción encontrado
en la leche a un efecto protector de la grasa de la leche sobre
los microorganismo (Briñez, 2006), para S. bongori se obtuvo
una reducción de 1.5 unidades logarítmicas y 0.5 unidades
logarítmicas para B. subtilis. En lo que respecta a la aplicación
de la UAP en influente y efluente de una PTAR que trata
aguas residuales municipales. Se obtuvo una reducción
logarítmica de 0.6 unidades para la muestra de agua residual
cruda y 1.5 unidades logarítmicas para la muestra de agua
residual tratada. Un factor importante para la inactivación de
bacterias con UAP es el tipo bacteria ya que se comprobó en
este trabajo que las bacterias gram positivas y esporuladas
fueron más resistentes que las células no esporuladas.
Si las bacterias son capaces de crecer en altas presiones de
hasta 98MPa implica que los procesos celulares esenciales
siguen siendo funcionales a estas condiciones (Follonier et al.,
2012).
En la Figura 2 se podrá observar cuantas unidades
logarítmicas disminuyen cuando se les aplica una presión de
98MPa.
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
U
n
i
d
a
d
e
s
Reducción de unidades
logarítmica con una presión
98MPa
L
o
g
a
r
í
m
i
c
a
s
0.00
E.coli
S. bongori B. subtilis
Control
No remanentes
Agua
residual
cruda
Agua
resudal
tratada
Remanete
Figura 2. Reducción logarítmica con una presión de 98MPa.
Según
la
Norma
Oficial
Mexicana
NOM-003SEMARNAT1997 que establece los límites máximos
permisibles de contaminantes para las aguas residuales
tratadas que se reusen en servicios al público. Estable un
límite máximo de 240 coliformes fecales NMP/100 mL para
Servicios al público con contacto directo y 1,000 coliformes
fecales NMP/100 mL para servicios al público con contacto
indirecto u ocasional. En el agua residual cruda en donde se
aplicó la presión alta 98MPa no se cumple este requerimiento
ya que es necesario inactivar aun 1.4X106 UFC/100 mL para
poder quedar en 1000 NMP/100 mL para poder ser utilizada.
Conclusión
El método mecánico de desinfección con ultra alta presión
(UAP) puede destruir o inactivar las bacterias, en mayor
proporción a las bacterias gram negativas después a las
bacterias esporuladas debido a que por su estructura son más
resistentes a la presión entre muchos otros factores
ASOCIACIÓN MEXICANA DE INGENIERÍA CIENCIA Y GESTIÓN AMBIENTAL, A.C. AMICA
Av. Canal de Miramontes 2960 casa 35 Col. Los Girasoles, Del. Coyoacán, México D.F.
55 56 77 38 61
[email protected]
2º Congreso Nacional AMICA 2015
ambientales. La bacteria E. coli es la más sensible a la UAP,
más que S. bongori. La bacteria más resistente a la aplicación
de UAP es el bacilo esporulado B. subtilis. Por lo anterior se
puede concluir que el contenido de peptidoglucano en la pared
celular, así como la estructura de las membranas y las esporas
determinan la resistencia de una célula a su destrucción
mecánica. En el agua residual tratada se podrá inactivar un
mayor porcentaje de microorganismo ya que no contiene
demasiados sólidos con los cuales la bacteria se pueda
proteger.
Referencias
Briñez Zambrano J. (2006). Estudio de la inactivación por
ultra alta presión de homogenización de microorganismos en
alimentos. Tesis de doctorado. Universitat Autónoma de
Barcelona, España, Barcelona.
Cruz C. Sumay M. y Alanis E. (2010). La ultra alta presión de
homogenización (UHPH): Una nueva tecnología para la
conservación de jugos. Tepic, Nayarit.
Follonier S., Panke S. y Zinn M. (2012) Pressure to kill or
pressure to boost: a review on the various effects and
applications of hydrostatic pressure in bacterial
biotechnology. Gallen, Switzerland.
Kai R., Mathys A., Heinz V. y Knorr D., (2013). Mechanisms
of endospore inactivation under high pressure. Trends in
Microbiology, 21(10), pág. 296-304.
Sopkin Ramírez, R. (2014). Inactivación de huevos de Áscaris
lumbricoides a través de ultra alta presión. Tesis de maestría,
Benemérita Autónoma de Puebla, Puebla, Puebla.
Documentos electrónicos:
Norma Oficial Mexicana (2014) NOM-041-SSA1-1993,
Bienes
y
Servicios
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/041ssa13.html
(Consultado 12 de febrero 2014).
Norma Oficial Mexicana (2014) NOM-003-SEMARNAT1997, Establece los límites máximos permisibles de
contaminantes para las agua residuals tratadas que se reusan
en
servicios.
http://www.conagua.gob.mx/CONAGUA07/Noticias/Normas
OficialesMexicanas.pdf. (Consultado 12 de febrero 2014).
Organización Mundial de la Salud OMS (2010). El uso de
aguas
residuales
http://www.who.int/water_sanation_health/wastewater
(Consultado 25 de mayo 2014).
ASOCIACIÓN MEXICANA DE INGENIERÍA CIENCIA Y GESTIÓN AMBIENTAL, A.C. AMICA
Av. Canal de Miramontes 2960 casa 35 Col. Los Girasoles, Del. Coyoacán, México D.F.
55 56 77 38 61
[email protected]