Argyrosomus regius - Universidad de Granada
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UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Zoología INVESTIGACIONES APLICABLES AL DESARROLLO DE LA PRODUCCIÓN INTENSIVA DE CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS) SERGIO GARCÍA MESA TESIS DOCTORAL GRANADA, 2012 Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Sergio García Mesa D.L.: GR 754-2013 ISBN: 978-84-9028-422-3 INVESTIGACIONES APLICABLES AL DESARROLLO DE LA PRODUCCIÓN INTENSIVA DE CORVINA (Argyrosomus regius) Memoria para optar al grado de Doctor por el Licenciado en Biología D. Sergio García Mesa Prof. D. Manuel García Gallego Prof. D. Mª Dolores Suárez Medina ASPIRANTE Sergio García Mesa Los trabajos de investigación que se rocegen en la presente memoria de Tesis Doctoral han sido realizados en la Unidad de Fisiología Animal del Departamento de Zoología de la Universidad de Granada y el Departamento de Biología Aplicada de la Universidad de Almería, a partir de animales suministrados por una empresa privada, Ceutamar, S.L. y el centro IFAPA “El Toruño”, Puerto de Santa María, Cádiz. Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral se han presentado en diferentes congresos nacinales e internacionales: - 7th Euro Fed Lipid Congress. Lipids, Fats and Oils. Graz, Austria, 1821 octubre 2009. - XII Congreso Nacional de Acuicultura. Madrid, 24-26 noviembre 2009. - 9th International on the Biology of Fish. Barcelona, 5-9 julio 2010. - XIII Foros dos Recursos Mariño e da Acuicultura das Ría Galegas. Pontevedra, 7-8 octube 2010. - XIII Congreso Nacional de Acuicultura. Barcelona, 21-24 nociembre 2011. Indice 0.OBJETIVO………………………………………………………...……1 I. INTRODUCCIÓN. I.1. BIOLOGÍA Y CULTIVO DE LA CORVINA. ......................................... 5 I.1.1. ASPECTOS GENERALES. ..................................................................................... 5 I.1.2. PRODUCCIÓN.................................................................................................. 9 I.1.3. ESTUDIOS Y CRÍA EN CAUTIVIDAD. .................................................................... 10 I.1.4. COMERCIALIZACIÓN Y CONSUMO ..................................................................... 15 I.2. ESTRATEGIAS ALIMENTARIAS. .................................................... 15 I.2.1. DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE RACIÓN ÓPTIMO. ........................................... 16 I.2.2. DETERMINACIÓN DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA ÓPTIMA. ................................. 18 I.3. ASPECTOS DE FISIOLOGÍA DIGESTIVA. ...................................... 21 I.3.1. EL TRACTO DIGESTIVO .................................................................................... 21 I.3.2. ENZIMAS DIGESTIVAS ..................................................................................... 22 I.4. METABOLISMO INTERMEDIARIO EN PECES ............................... 27 I.4.1. METABOLISMO HEPÁTICO ............................................................................... 27 I.4.2. METABOLISMO MUSCULAR ............................................................................. 36 I.5. ESTRÉS OXIDATIVO. ..................................................................... 37 I.5.1. ASPECTOS GENERALES DEL ESTRÉS OXIDATIVO. ................................................... 37 I.5.2. RADICALES LIBRES .......................................................................................... 38 I.5.3. ORIGEN DE LOS RADICALES LIBRES. ................................................................... 40 I.5.4. MECANISMOS DE DEFENSAS ANTIOXIDANTES...................................................... 40 I.5.5. DAÑOS OXIDATIVOS CAUSADOS A BIOMOLÉCULAS. .............................................. 44 I.5.5. IMPLICACIONES DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN EL CULTIVO DE PECES. ........................... 46 I.6. CALIDAD DE MÚSCULO ................................................................. 46 I.6.1. CONCEPTO DE CALIDAD EN PECES. .................................................................... 46 I.6.2. CALIDAD NUTRICIONAL. .................................................................................. 47 I.6.3. TEXTURA. ..................................................................................................... 48 I.6.4. PROTEOLISIS MUSCULAR. ................................................................................ 50 II.1. SEGUIMIENTO TÉCNICO DE LA FASE INICIAL DE UN CULTIVO EXPERIMENTAL DE CRÍA INTENSIVA DE CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801) EN JAULAS FLOTANTES. II.1.1 INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS.................................................... 53 I II.1.2. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................. 54 II.1.2.1. ANIMALES E INSTALACIONES. ....................................................................... 55 II.1.2.2. ALIMENTACIÓN ......................................................................................... 57 II.1.2.3. MUESTREOS. ............................................................................................ 58 II.1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................... 65 II.1.3.1. CRECIMIENTO ........................................................................................... 65 II.1.3.2. OTROS ÍNDICES BIOMÉTRICOS ...................................................................... 74 II.1.3.3. PARÁMETROS HEMÁTICOS. ......................................................................... 85 I.1.3.4. COMPOSICIÓN CORPORAL ............................................................................ 90 II.1.5. RESUMEN ................................................................................... 95 II.2. EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE GRASA Y ÁCIDOS GRASOS EN EL MÚSCULO DE CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801) DURANTE LA FASE INICIAL DE CRÍA EN PISCIFACTORÍA ALIMENTADA CON DIETAS COMERCIALES. II.2.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS................................................... 97 II.2.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................... 99 II.2.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS. .............................. 99 II.2.2.2. ANÁLISIS DE LOS PECES ............................................................................. 100 II.2.2.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ...................................................................... 102 II.2.3. RESULTADOS. .......................................................................... 102 II.2.3.1. CRECIMIENTO E ÍNDICES MORFOMÉTRICOS. ................................................. 102 II.2.4. DISCUSIÓN ............................................................................... 107 II.2.5. RESUMEN ................................................................................. 114 III. CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LA ACTIVIDAD DIGESTIVA DE LA CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801 III.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS................................................... 115 III.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................... 117 III.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS. .............................. 117 III.2.2. PROCESADO DE LAS MUESTRAS Y ANÁLISIS DE LAS ACTIVIDADES DIGESTIVAS......... 118 III.3. RESULTADOS. ............................................................................ 119 III.3.1. INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEASA ....................................... 119 III.3.2. DISTRIBUCIÓN ANATÓMICA DE LAS ACTIVIDADES DIGESTIVAS EN LA CORVINA. ...... 119 II III.3.3. ACTIVIDAD PROTEASA ALCALINA EN DIFERENTES ESPECIES................................. 121 III.4. DISCUSIÓN. ................................................................................ 122 III.5. RESUMEN ................................................................................... 129 IV. EFECTO DEL TAMAÑO DE LA RACIÓN DIARIA SOBRE EL CRECIMIENTO, LA UTILIZACIÓN DE LA DIETA, EL METABOLISMO Y EL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801) IV.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. ................................................. 131 VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................... 133 IV.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS ............................... 133 IV.2.2. PROCESADO DE LAS MUESTRAS. ................................................................... 135 IV.2.3. PARÁMETROS BIOMÉTRICOS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA .................................... 135 IV.2.4. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ........................................................ 136 IV.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................ 136 IV.3. RESULTADOS ............................................................................ 136 IV.3.1. CRECIMIENTO ........................................................................................... 136 IV.3.2. ÍNDICES BIOMÉTRICOS ................................................................................ 138 IV.3.3. COMPOSICIÓN .......................................................................................... 139 IV.3.4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO........................ 139 IV.3.5. ESTRÉS OXIDATIVO .................................................................................... 144 IV.4. DISCUSIÓN ................................................................................. 145 IV.5. RESUMEN. .................................................................................. 158 V. EFECTO DEL AYUNO Y POSTERIOR REALIMENTACIÓN SOBRE EL CRECIMIENTO, METABOLISMO Y ESTRÉS OXIDATIVO EN LA CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801) V.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS ................................................... 159 V.2. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................. 162 V.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS ................................ 162 V.2.2.PROCESADO DE LAS MUESTRAS...................................................................... 163 V.2.3. PARÁMETROS BIOMÉTRICOS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA. .................................... 163 V.2.4. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ......................................................... 163 V.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................. 164 V.3. RESULTADOS ............................................................................. 164 V.3.1. CRECIMIENTO ............................................................................................ 164 V.3.2. ÍNDICES BIOMÉTRICOS ................................................................................. 165 III V.3.3. COMPOSICIÓN ........................................................................................... 166 V.3.4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO......................... 167 V.3.5. ESTRÉS OXIDATIVO ..................................................................................... 172 V.4. DISCUSIÓN .................................................................................. 174 V.4.1. EFECTOS DEL AYUNO ................................................................................... 174 V.4.2. EFECTOS DE LA REALIMENTACIÓN .................................................................. 191 V.5. RESUMEN .................................................................................... 202 VI. ESTUDIO DE DIFERENTES FRECUENCIAS DE ALIMENTACIÓN SEMANAL EN LA CORVINA (ARGYROSOMUS REGIUS, Asso 1801). IMPLICACIONES PRODUCTIVAS, FISIOLÓGICAS Y SOBRE LA CALIDAD. VI.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. ................................................. 203 VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................ 205 VI.2.1. ANIMALES, CONDICIONES EXPERIMENTALES Y MUESTREOS ............................... 205 VI.2.2.PROCESADO DE LA SANGRE Y LOS TEJIDOS ...................................................... 207 VI.2.3. PARÁMETROS BIOMÉTRICOS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA .................................... 207 VI.2.4. ANÁLISIS DE METABOLITOS PLASMÁTICOS Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA................... 207 VI.2.5. ESTUDIO DE LA CALIDAD DEL MÚSCULO ......................................................... 207 VI.2.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................ 208 VI.3. RESULTADOS ............................................................................ 208 VI.3.1. CRECIMIENTO E ÍNDICES MORFOMÉTRICOS .................................................... 208 VI.3.2. COMPOSICIÓN CORPORAL ........................................................................... 209 VI.3.3. METABOLITOS PLASMÁTICOS ...................................................................... 212 VI.3.4. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS EN HÍGADO Y MÚSCULO ........................................ 213 VI.3.4. FIRMEZA, PH Y CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA (CRA) .............................. 216 VI.3.5. CONTENIDO EN PROTEÍNAS ......................................................................... 217 VI.3.6. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE LAS PROTEÍNAS SARCOPLASMÁTICAS (PSP)......... 218 VI.3.7. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE LAS PROTEÍNAS MIOFIBRILARES (PMF) .............. 221 VI.4. DISCUSIÓN ................................................................................. 223 VI.5. RESUMEN ................................................................................... 234 VII. CONCLUSIONES………………………………...………………235 VIII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………..……...237 IV 0. Objetivo La cada vez mayor demanda de productos de origen marino ha dado lugar a un casi agotamiento de los caladeros y recursos acuícolas por la actividad pesquera, lo que ha aumentado el interés por el desarrollo de la acuicultura marina en estos últimos 30 años. En la última década la producción mundial de pesca de captura se ha mantenido relativamente estable en torno a los 80 millones de Tm. La acuicultura es un sector que sigue creciendo a un mayor ritmo superior al crecimiento de la población, situando su producción alrededor de 60 millones de Tm, por lo que se espera que supere a la pesca de captura como fuente de pescado comestible. A nivel nacional, la producción acuícola se situó en 252000 Tm en 2010. En la costa mediterránea, las primeras experiencias piscícolas se realizaron con la dorada y la lubina, cultivos cuyo éxito ha derivado en una cierta saturación de los mercados con la consiguiente caída de precios, que se podría paliar acudiendo a la diversificación, es decir, la ampliación de la lista de especies objeto de producción intensiva. La corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) es un esciénido eurihalino que se presenta como firme candidato a esta diversificación, pues posee unas características fisiológicas, como alta fecundidad, cierta facilidad de cría en cautividad, llegándose a cerrar el ciclo reproductivo, además de un alto porcentaje de músculo con baja adiposidad, aún cuando se alimenta con piensos ricos en grasa, y una buena calidad nutricional y organoléptica general. Unido a lo anterior, el gran tamaño que puede alcanzar la corvina, así como la posibilidad de obtener transformados, ha dado lugar a que esta especie irrumpa con fuerza en la piscicultura mediterránea, pasando a ser la cuarta especie en importancia, tras lubina, dorada y rodaballo. La producción europea de corvina fue de 2178 Tm en 2009, aumentando un 77% el año 2010, siendo España el principal productor. Las posibilidades de expansión de este cultivo deben acompañarse de campañas de promoción, pues el principal freno del mismo es el relativo de esta especie por el consumidor. Para asegurar y ampliar este papel de la corvina como nueva especie en la piscicultura, es conveniente ampliar el conocimiento sobre su fisiología en general y sus necesidades nutricionales en particular, ya que el diseño de una práctica alimentaria saludable y rentable resulta fundamental; no debemos olvidar que su destinatario es el consumidor humano y que el mayor capítulo de gasto de un cultivo intensivo es el correspondiente a la alimentación de los animales. 1 Sergio García Mesa La presente Memoria de Tesis Doctoral recoge datos relacionados con estas cuestiones: biología y fisiología básicas, evolución en cultivo, aspectos de la digestión y alimentación, con la esperanza de que puedan resultar útiles en el futuro del cultivo de esta especie. En primer lugar se exponen los resultados de un seguimiento del desarrollo de un cultivo piloto de corvina en condiciones reales de piscifactoría (apartado 2.1.), para lo que se contó con la colaboración de una empresa privada interesada en el tema. Animales de ese cultivo fueron utilizados para una primera aproximación a la calidad del producto, en concreto en lo que concierne al perfil de ácidos grasos de la parte comestible de la misma y su evolución durante el cultivo basado en piensos comerciales (apartado 2.2.). A continuación se exponen los resultados de una serie de experimentos relacionados con el ámbito de especialización de grupos de investigación “Nutrición y Alimentación de Peces” (Departamento de Zoología) de la Universidad de Granada (UGR) y del Departamento de Producción Animal de la Universidad de Almería (UAL) en colaboración, algunos de ellos con el centro del IFAPA “El Toruño” (Junta de Andalucía). Conocer el equipamiento enzimático digestivo de la corvina podría ayudar a esclarecer el potencial que posee la especie para actuar sobre lípidos, proteínas y carbohidratos del pienso, y cómo una adecuada proporción de éstos en la dieta podría permitir un mejor aprovechamiento. Además, como primera aproximación resulta interesante la comparación con otras especies de interés en la acuicultura. Ambos aspectos se abordan en el apartado 3. En relación con el diseño de una estrategia alimentaria óptima se ensayaron diferentes tamaños de ración a fin de determinar cuál es el más apropiado tanto para su aprovechamiento por los peces como para reducir el impacto ambiental derivado de la emisión de residuos orgánicos. Además de enfocar el tamaño de ración desde el punto de vista de crecimiento y aprovechamiento de la dieta, así como de la de la influencia en la composición corporal de los animales, se ha profundizado en el efecto sobre enzimas clave del metabolismo intermediario e indicadores de estrés oxidativo esperando, además, con estos datos pioneros ampliar el volumen de conocimientos sobre la fisiología de la especie. En este último sentido, se amplió el ensayo a lotes de corvinas que fueron privadas de alimento durante 60 días y luego realimentadas durante otros 60 lo que nos permitió valorar el impacto de una maniobra tan drástica sobre algunos aspectos de la fisiología del animal así como su reversión o no durante la realimentación posterior así como una aproximación al interesante tema del crecimiento compensatorio. Los apartados 4 (tamaño de ración) y 5 (ayuno/realimentación) describen estos ensayos. 2 Objetivo Finalmente, se abordó otro aspecto de la estrategia alimentaria de gran aplicabilidad en las explotaciones acuícolas, como es la frecuencia alimentaria más conveniente a lo largo de una semana de cultivo. No olvidemos que la alimentación con piensos secos, propia de la piscicultura intensiva, supone una sobrecarga de las capacidades digestivas y metabólicas del animal que debería tener una adecuada gestión temporal que permita una utilización óptima de dicho pienso sin olvidar, otro aspecto muy importante desde el punto de vista comercial como es la posible reducción de gastos, sobre todo de personal, derivada de posibles reducciones en la frecuencia alimentaria. En este experimento también se abordó, de forma sencilla, otro tema muy interesante como es el de la hora más apropiada para la distribución del alimento. Aprovechamos este diseño para estudiar los posibles efectos sobre algunos parámetros relativos a la calidad de la fracción comestible (músculo) así como su evolución a lo largo de un periodo post-mortem de varios días. Este experimento se desarrolla en el apartado VI. El conjunto de datos que se exponen en esta Memoria surgen de la colaboración entre la universidad (UGR, UAL), un centro público de investigación (IFAPA) y la empresa privada (Ceutamar, S.L.), que creemos muy interesante y fructífera pues los posibles problemas derivados de diferencias en diseño de los ensayos, modos de trabajo o intereses/especializaciones concretas, son superados con creces por la riqueza que supone la pluralidad de puntos de vista, de la que surge un “mestizaje” muy interesante en lo que concierne a la aplicabilidad de los resultados. 3 I. Introducción. I.1. BIOLOGÍA Y CULTIVO DE LA CORVINA. I.1.1. Aspectos generales. I.1.1.1. ENCUADRE TAXONÓMICO La corvina, Argyrosomus regius (Asso, 1801) pertenece al phylum Chordata. Dentro del cual se encuentra el subphylum Gnathostomata, que por definición son animales cordados que poseen mandíbulas articuladas además de poseer un cráneo que protege al cerebro. Dentro del subphylum Gnathostomata se encuentra la clase Actinopterygii, que se caracteriza por poseer un esqueleto óseo con aletas con radios. La corvina está englobada en la subclase Teleostei ya que posee una cola homocerca, escamas de tipo ctenoideo o ciclodeo y preservación de la vejiga natatoria, en este grupo se incluyen los peces más evolucionados. Quedando incluida en el orden Perciformes, peces que poseen los primeros radios de la aleta anal espinosos y robustos, las aletas pectorales de inserción alta y las abdominales con un radio espinoso y un máximo de seis blandos. Entre las distintas familias, la corvina se incluye en la familia Scianidae que incluye 70 géneros y más de 270 especies, entre los cuales se encuentra el género Argyrosomus. Figura I.1.1.1. Aspecto externo de la corvina (www.peixosdepalamos.es) 5 Sergio García Mesa Phylum Chordata Subphylum Gnathostomata Superclase Tetrapoda Superclase Peces Clase Chondrichthyes Subclase Elasmobranchii Subclase Holocephali Clase Actinopterygii Subclase Chondrostei Subclase Teleostei Superorden Elopomorfa Orden Anguilliformes Suborden Anguilloidei Suborden Congroidei Superorden Neoognathi Orden Cyprinodontiforme Suborden Aplocheiloidei Suborden Cyprinodontoidei Suborden Mugiliformes Orden Perciformes Suborden Blennioidei Suborden Caproidei Suborden Percoidei Familia Scianidae Género Argyrosomus I.1.1.2. DESCRIPCIÓN GENERAL. La corvina es un esciénido que presenta el cuerpo alargado y esbelto, casi fusiforme, ligeramente comprimido, de color gris oscuro plomo, flancos gris plateado levemente pardo con reflejos en forma de espejuelos de bronce, vientre blanco y aletas pardo-rojizas (Riedl, 1986). La cabeza es relativamente grande, con boca terminal, ancha y ligeramente oblicua; las dos mandíbulas son de longitud similar aunque la inferior está levemente adelantada. Presenta unos dientes pequeños dispuestos en varias bandas formando cardas en ambas mandíbulas, los más grandes ocupan la banda externa en la mandíbula superior, mientras que en la mandíbula inferior los dientes mayores se encuentran entre los pequeños o formando una banda interna. Carece de dientes en el paladar. La cavidad bucal es de color amarillo dorado pasando a marrón tras la muerte. Los ojos son de tamaño mediano. No tiene barbillas en el mentón, pero posee varias aberturas o poros que son salidas de tubos mucosos. 6 Introducción El cuerpo está totalmente cubierto por escamas ctenoideas relativamente grandes, excepto en algunas partes de la cabeza en que son cicloideas y pequeñas. Las del cuerpo parecen disponerse en bandas oblicuas en los flancos (de 50 a 55 sobre la línea lateral). El opérculo tiene dos espinas y el preopérculo está finamente dentado. La línea lateral es evidente, completa y se prolonga hasta el extremo de los radios centrales de la aleta caudal. La aleta dorsal es única pero está dividida en dos partes por una marcada hendidura, la parte anterior está formada por 10-11 radios espinosos (el primero poco desarrollado) mientras que la posterior, el doble de larga que la anterior, sólo presenta un radio espinoso y el resto blandos (27-29). El pedúnculo caudal es ancho y potente con la cola truncada o en forma de arco. Como en el resto de los esciénidos, los otolitos están extraordinariamente desarrollados, así como la vejiga natatoria, que ocupa gran parte del abdomen. Estos peces son capaces de emitir sonidos gracias a las contracciones de unos músculos sonicadores que se insertan en las paredes de la vejiga, de ahí que se conozcan como peces roncadores. La emisión de sonidos se circunscribe a la época de reproducción (Lagardère y Mariani, 2006). El tracto digestivo de la corvina es relativamente corto, típico de especies carnívoras. A un esófago corto y de gran diámetro, con paredes musculosas, sigue un estómago en forma de saco, que permite la ingestión de presas grandes, provisto de glándulas y capas musculosas desarrolladas. Tanto el esófago como el intestino se insertan en la porción anterior del estómago. En la porción anterior del intestino existen 7-9 ciegos pilóricos. El intestino es corto y de paredes de grosor variable: más finas en la zona intermedia que en las zonas anterior y anal (Oliva et al., 2005; Gil et al., 2009). Una vez adultos, se manifiesta una diferencia intersexual en la tasa de crecimiento, como en otras especies gonocóricas (Imsland et al., 1997; Gorskov et al., 2003), que se hace patente cuando los machos inician la maduración. Debido a que se trata de una presa fácil de capturar y de localizar en la época de reproducción (por la emisión de sonidos) y que madura tardíamente, las poblaciones salvajes han sufrido un retroceso muy importante. A lo que hay que añadir la alteración de su medio de cría, cerca de las desembocaduras de grandes ríos como el Ebro, el Guadalquivir, el Ródano y la Gironda, ha provocado la disminución de la presencia de esta especie, considerándose prácticamente extinguida en zonas donde era habitual, como las Islas Baleares y la desembocadura del Delta del Ebro. I.1.1.3. DISTRIBUCIÓN La corvina es una especie euriterma y eurihalina (temperatura: 2 a 38°C, salinidad: 5 a 39 ‰), lo que le permite entrar en las desembocaduras de los ríos y estuarios, donde realiza la puesta. Normalmente habita en aguas someras y estuarios, desde la costa litoral hasta profundidades de 200 m en fondos rocosos o praderas de Posidonia 7 Sergio García Mesa La corvina se distribuye a lo largo del mar Mediterráneo pero también en el Atlántico desde el sur de Suecia y Noruega, hasta la bahía de Dakar, en Senegal, incluidas Madeira y Canarias, donde parece estar el límite sur de su distribución (Froese y Pauly, 2007) y donde se suelen localizar los individuos de mayor talla. De toda la familia, Argyrosomus regius, es la especie que mayor tamaño puede alcanzar llegando a medir un metro y pesar 50 kg; por lo general, los ejemplares capturados se hallan en torno a los 50 cm. El pez más grande encontrado medía 203 cm y pesaba 103 kg, según fishbase.org. Figura I.1.1.2. Distribución geográfica de la corvina (A. regius) En el litoral andaluz, es frecuente en las aguas de Cádiz, especialmente en la desembocadura de los ríos Guadiana y Guadalquivir (Sobrino et al., 2005), donde el medio es más salobre. En estas zonas se capturan individuos adultos en todas las épocas del año, aunque con mayor frecuencia en los meses de marzo a junio (Calderón et al., 1997). I.1.1.4. ALIMENTACIÓN Las presas principales de los juveniles de corvina en su medio natural son los míscidos, destacando Mesopodopsis salberii y Neomysis intiger. Tras los míscidos, los copépodos son los que tienen mayor importancia en la alimentación de la corvina. Los míscidos reemplazan progresivamente a los copépodos en las dietas de las postlarvas y juveniles conforme van creciendo (Cabral y Ohmert, 2001; Baldó y Drake, 2002). La alimentación natural de los adultos está formada por mugílidos, clupeidos y algunos crustáceos nadadores, lo que justifica un aparato digestivo típico de especies carnívoras, esófago de amplio diámetro y musculoso, estómago musculoso de luz pequeña e intestino relativamente corto. 8 Introducción I.1.1.5. CICLO DE REPRODUCCIÓN. A. regius se reproduce cuando los machos alcanzan unos 64 cm de talla y 4 kg de peso y las hembras unos 86 cm y 7.5 kg (García-Pacheco y Bruzón, 2009). Durante la época de reproducción, los adultos abandonan la costa a mediados de Abril y penetran en los estuarios a finales de mayo para desovar. Durante la estación de freza, los machos emiten unos ronquidos gracias a unos músculos sónicos que, al contraerse, producen vibraciones de la vejiga natatoria, causando un sonido cíclico que alterna ronquidos largos y cortos. Los ronquidos tienen función de llamada, para que se dé la agregación en el tiempo y en el espacio, facilitando el éxito en el momento del desove (Lagardère y Mariani, 2006). Desde mediados de junio hasta finales de julio abandonan los estuarios para alimentarse en la costa. Las corvinas permanecen en aguas superficiales hasta el inicio del otoño y durante el invierno vuelven a aguas profundas, pudiéndose encontrar hasta los 80 m y, rara vez, hasta los 200 m. Los juveniles abandonan las áreas de nursery (estuarios) al final del verano y emigran a las aguas costeras, entre 20 y 40 m de profundidad, para pasar el invierno. A mediados de mayo vuelven a las zonas estuarias, donde se alimentan. La temperatura del agua es el factor más importante de entre los que determinan la migración de la corvina para alimentarse y para reproducirse. La llegada de los adultos y la salida de los juveniles a y desde los estuarios suceden en mayo y octubre, cuando la temperatura del agua está cerca de 13 - 14 °C. La mejor temperatura para el crecimiento está entre 17 - 21 °C, con un rango de tolerancia entre 14 - 23 °C, fuera del cual disminuye el crecimiento (Quèmener, 2002). Una hembra puede poner hasta 800000 huevos, la puesta ocurre a 17 – 22 °C. La medida de los huevos fertilizados es de unos 990 µm de diámetro. Después de 30 horas tras la eclosión, la gota lipídica se reabsorbe; a las 96 horas el saco vitelino está casi totalmente consumido y se abren la boca y el ano. I.1.2. Producción. La corvina es la especie de pescado que ha irrumpido con más fuerza, en cuanto a producción, en la acuicultura en diversos países europeos, colocándose en el cuarto puesto en importancia en la piscicultura marina. La producción de corvina en Europa pasó de 2178 Tm en 2009 a 3855 Tm en 2010, lo que supuso un aumento del 77% en sólo un año. De la producción de 2010, 3280 Tm correspondieron a España, primer país productor, por encima de Italia, Francia y Grecia, y que duplicó su producción con respecto a 2009. 9 Sergio García Mesa Figura I.1.2.1. Evolución de la producción de corvina en Europa y Mediterráneo (APROMAR, 2011) La captura de corvina por parte de la flota pesquera es prácticamente inexistente. I.1.3. Estudios y cría en cautividad. La historia de la corvina en la acuicultura es bastante corta y reciente. Las primeras pruebas con grupos salvajes se realizaron en el sur de Francia. Desde comienzos de 1996, la producción neta ha sido muy limitada, con una sola instalación de reproducción en Francia. De hecho, el protocolo de crianza de estas especies es relativamente desconocido y todavía no se ha hecho público. La primera producción comercial se hizo en Francia en 1997. Desde entonces la producción se ha extendido lentamente en Italia y, especialmente, España. Las primeras experiencias con corvina en España las desarrollaron Calderón et al., (1997), estableciendo el primer experimento de engorde de un lote de 10 juveniles de corvina salvajes (180 g) en tanques de 10 m3 durante 30 meses hasta alcanzar 4 kg, con una supervivencia del 60%. La empresa Niordeas S.L. ha desarrollado desde 2001 el cultivo de la corvina, consiguiendo cerrar el ciclo reproductivo. Tras finalizar esta experiencia pionera en 2006, la empresa amplió el número de jaulas destinadas a este cultivo, obteniendo casi 1000 Tm en 2007 (Mateos Velasco, 2007). 10 Introducción I.1.3.1. REPRODUCCIÓN EN CAUTIVIDAD. La corvina, al igual que otras especies de peces, presenta disfunciones reproductoras cuando están en cautividad, lo cual hace que la reproducción sea improbable, siendo el tratamiento con hormonas gonadotrofinas el único medio de asegurar la puesta. En España, gracias a la financiación de la Junta Nacional de Cultivos Marinos (JACUMAR) se desarrolló el Plan Nacional de Cría de Corvina (PLANACOR) que nació con el propósito de conseguir la reproducción en cautividad de la corvina en España y en el que participaron distintos centros de investigación, como IFAPA (Andalucía), LIMIA (Baleares), IRTA (Cataluña) e ICCM (Canarias). Para ello, fue necesaria la captura de reproductores salvajes de corvina, concretamente en las costas del Algarve portugués y bajo Guadalquivir, y su posterior transporte hacia los centros de investigación antes mencionados. Este transporte de los reproductores por carretera y/o avión no supuso un riesgo para su supervivencia en las condiciones adecuadas (Correia et al., 2008). Los reproductores, una vez adaptados a las condiciones de cautividad y en un grado óptimo de madurez sexual, actividad del esperma y tamaño de los oocitos (0.5 mm), fueron tratados hormonalmente (Duncan et al., 2007a, 2007b, 2008). Los tratamientos con hormonas liberadoras de gonadotropina o gonadoliberinas actúan a nivel de hipófisis, estimulando la liberación de otras hormonas que modulan muchos aspectos del control gonadal, crecimiento y maduración del ovocito, ovulación y desove. El tratamiento hormonal con hormonas liberadoras, fue tanto con inyecciones intraperitoneales (150 μg/kg), como con implantes (40 μg/kg para hembras y 20 μg/kg para machos), produciéndose la freza a las 60 - 70 horas tras la administración de la hormona. Los resultados fueron un completo éxito en la obtención de huevos fecundados. Los dos modos de administración de hormonas liberadoras de gonadotropinas (inyección e implante), dieron lugar a diferencias significativas en el diámetro de los huevos fecundados (Estévez et al., 2009), teniendo un diámetro de 0.99 ± 0.02 mm los huevos obtenidos por implante, mientras que los huevos obtenidos por inyección midieron 0.93 ± 0.01 mm de diámetro. En ambos casos, la composición bioquímica fue: 17.95 % de lípidos, 31.9 % de proteínas y 5 % de carbohidratos, todos en sustancia seca. La cría larvaria presenta altas tasas de supervivencia, 15-40% a los 30 y del 15% a los 60 días post-eclosión (Cárdenas, 2010). Las larvas de corvina presentan crecimientos superiores a los descritos en larvas de dorada y, a partir de los 20 días tras la eclosión son capaces de alimentarse con una dieta mixta de alimento vivo y pienso artificial. 11 Sergio García Mesa Figura I.1.3.1. Fases de desarrollo y protocolo de alimentación de corvina (PLANACOR, 2009) ) La co-alimetación temprana de las larvas de corvina reduce la dependencia del alimento vivo, haciendo que el destete sea más fácil; siendo posible eliminar completamente el alimento vivo desde el día 20 post-eclosión con una supervivencia bastante alta, 17% según FernándezPalacios et al. (2009) o del 40-45% según Hernández-Cruz et al. (2007). Se ha conseguido desarrollar el protocolo de alimentación de corvina eliminando los nauplios y metanauplios de Artemia sp., cambiando el día 15 después de la eclosión los rotíferos por pienso seco (Fernández-Palacios et al., 2009; Durán et al., 2009). I.1.3.2. PREENGORDE Y ENGORDE. Como consecuencia del éxito del Plan Nacional de Cría de Corvina (PLANACOR) en la reproducción en cautividad de esta especie, se han realizado experimentos de pre-engorde y engorde, en tanques, jaulas y esteros, comparándose cómo crecen en los distintos recintos, en función de parámetros ambientales como la calidad del agua, la temperatura y la salinidad, con el fin de determinar las condiciones óptimas de cultivo de esta especie. Según Lavié et al. (2008), las cargas de alevines de corvina probadas no afectaban al crecimiento tanto como lo hace la temperatura de cultivo, siendo la de 24-25°C la que mejoró su crecimiento e ingesta. Sin embargo Quémener et al, (2002) proponen que el desarrollo óptimo de juveniles de corvina se efectúa dentro del rango 17-21°C, viéndose afectado su crecimiento negativamente a partir de 23°C. Por lo que la corvina, en sus etapas iniciales de preengorde, podría crecer mejor a mayor temperatura, aunque con una mayor demanda de alimento. Al tratarse de una especie eurihalina, es posible su crianza incluso en aguas de baja salinidad. Se ha estudiado el efecto de la salinidad tanto en el preengorde (Tinoco et al., 2009a, b, c) como en el engorde (Muñoz et al., 2008). Durante el preengorde se vio que las mejores 12 Introducción tasas de crecimiento (TCE o SGR) y tasa de conversión del alimento (TCA o FCR) se alcanzaban en salinidades bajas (12-13 g/L). Estudios realizados durante el engorde a distintas salinidades han resultado en un mejor crecimiento en aguas de salinidades más bajas (<37‰) La crianza de corvina se puede llevar a cabo en distintos tipos de instalaciones acuícolas, como son tanques en tierra firme, esteros, jaulas flotantes. Independientemente del modo de engorde, extensivo, intensivo o semiintensivo, el crecimiento de la corvina es prometedor, ya que según Pastor et al. (2007) se cuadriplica el peso de la dorada durante la fase larvaria y en tan sólo 18 meses se alcanza 1 kg. Poli et al. (2002) y Ortega y Gándara (2007) hicieron experimentos de cultivo en tanques, obteniéndose resultados similares entre ellos, con unas tasas de crecimiento altas. Pastor et al. (2002) obtuvieron una tasa de crecimiento mayor que las anteriores, pero en este caso el engorde se hizo en jaulas, aunque este experimento se realizó con individuos nacidos en cautividad a partir de ejemplares silvestres. También Jiménez et al. (2005) obtuvieron mejores resultados en la conversión del alimento de las corvinas cultivadas en jaulas frente a las cultivadas en tanques. Los primeros ensayos sobre alimentación de corvinas se realizaron con presas vivas, así Quero y Vayne (1985) obtuvieron buenos crecimientos con juveniles de corvina alimentados con pequeños crustáceos y adultos de peces pelágicos; posteriormente, Cabral y Ohmert (2001) lo hicieron con sardinas. También El-Shebly et al. (2007) cultivaron alevines de corvina en estanques de agua salobre y las alimentaron con presas vivas de alto contenido proteico obteniendo una ganancia de peso diaria de 2.55 g/pez; por los mismos autores con otras especies cultivadas de forma similar como la dorada (0.73 g/pez, El-Shebly y Siliem, 2003) y la lubina (1.13 g/pez, El-Shebly, 2005). Los estudios realizados sobre alimentación con piensos comerciales son aún escasos y, aunque los resultados obtenidos son diversos, todos muestran unas necesidades altas de proteína (por encima del 45%) y relativamente bajas de lípidos (sobre el 17%). Se ha podido comprobar que, cuando se cultiva en condiciones óptimas, presenta un rápido crecimiento, alcanzando la talla comercial (600-800 gramos) en un año (Cárdenas, 2010), y a los 18 meses puede llegar a alcanzar 1 kg de peso vivo, bastante superior a los 400 g que alcanza la dorada en este periodo (Cárdenas y Meseguer, 2008). Calderón et al., (1997) alimentaron corvinas con piensos comerciales que provocaron un crecimiento de 178 a 410 g en 5 meses, lo que supuso una tasa de crecimiento específico (SGR) de 0.57 %/día. Otros estudios han mostrado que la corvina mediterránea puede alcanzar, desde pocos gramos, los 0.7-1.0 kg después de 12 meses de crianza y 2.0-2-5 kg después de 24 meses con un alto índice de conversión del alimento (entre 0.9 y 1.2 dependiendo del pienso) (Monfort, 2010). 13 Sergio García Mesa A fin de determinar los niveles óptimos de alimentación en esta especie, Velazco et al., (2009) ensayaron 5 raciones diarias diferentes (0, 0.5, 1.75, 3.25 y 4.75 % de la biomasa al día), no encontrando diferencias significativas en el crecimiento de las corvinas alimentadas con tres raciones más altas. Teniendo en cuenta los índices de conversión y los de eficacia proteica, la ración diaria de 1.75 % fue la que mostró los mejores resultados globales. El contenido lipídico corporal de la corvina es muy bajo cuando se compara con otras especies cultivadas, esto significa que tiene una limitada capacidad de almacenar lípidos en el músculo, lo que justifica el hecho de que se use como nombre común para esta especie el de “maigre” en francés o el de “meagre” en inglés. Estudios realizados por Poli et al. (2003) la han mostrado como un pez particularmente esbelto que, incluso cuando se cultiva de forma intensiva, presenta un alto porcentaje de músculo y un alto contenido en ácidos grasos de buena calidad. Además, en una comparación con otras especies cultivadas en el Mediterráneo, realizada por Grigorakis et al. (2011), la corvina mostró el menor contenido lipídico muscular, rico en lípidos polares y en ácidos grasos, con bajos índices aterogénicos y trombogénicos, lo que confirmaba la alta calidad de los lípidos de esta especie. Para evaluar el efecto del contenido lipídico del pienso, Piccolo et al. (2008) ensayaron dos piensos comerciales con un contenido de proteína del 47% y diferente contenido en lípidos (21 y 14%), sobre el crecimiento de corvinas con un peso inicial de 12 g. Tras 15 meses de cultivo en jaulas, los peces alcanzaron un peso medio de 869.1 y 811.8 g, respectivamente. Las corvinas alimentadas con la dieta con menor relación Proteínas/Lípidos (P/L) mostraron mayores porcentajes de grasa mesentérica y mayor rendimiento de filete. El contenido lipídico de los filetes, aunque bajo en relación con la mayoría de los peces cultivados, también fue superior en estas corvinas y presentó un mayor contenido de ácidos grasos saturados y menor de poliinsaturados. Las corvinas alimentadas con la dieta de mayor relación P/L mostraron muy buenos índices de calidad de la grasa. Estudios Posteriores realizados por Chatzifotis et al. (2010) han confirmado las bajas necesidades de lípidos en la dieta de la corvina. Tras alimentar a juveniles de corvina con tres dietas isoproteicas (43%) y diferente contenido en lípidos (13, 17 y 21%), observaron, en primer lugar, una ingesta diaria similar para las tres dietas, pero fueron las corvinas alimentadas con el contenido lipídico intermedio las que exhibieron una mayor tasa de crecimiento específico, un mejor índice de conversión y un mayor coeficiente de eficacia proteica. La dieta con mayor contenido lipídico dio lugar a mayores valores de lípidos corporales y del músculo, no afectándose el resto de los componentes. En un estudio reciente (Martínez-Llorens et al., 2011) se ha evaluado el crecimiento y la eficiencia alimentaria de juveniles de corvina (94 g peso inicial) alimentados con cuatro dietas comerciales de diferentes contenidos porcentuales en proteínas/lípidos (44/25, 43/21, 46/20, 47/20). El crecimiento y los índices de conversión más satisfactorios se obtuvieron con las dietas de mayores niveles proteicos, lo que parece confirmar unas elevadas necesidades proteicas para esta especie, al menos en su fase juvenil. 14 Introducción I.1.4. Comercialización y consumo Como se ha indicado antes, la corvina ha pasado a ser la cuarta especie piscícola en importancia tras la lubina, la dorada y el rodaballo. Sin embargo, el principal freno al completo desarrollo y expansión del cultivo de corvina parece ser su comercialización, ya que se trata de un producto relativamente desconocido para el consumidor, salvo para aquellos que lo han consumido de forma tradicional gracias a la pesca extractiva. Con el propósito de conocer la opinión de los consumidores se desarrollaron pruebas sensoriales para valorar los atributos de la carne de esta especie (García-García et al., 2008). El resultado fue una amplia satisfacción ante el producto, definiéndose la gran mayoría de los catadores como consumidores potenciales de corvina siempre que tuviera un precio razonable. Debido a la creciente demanda de productos transformados en la sociedad actual, la corvina se presenta como un perfecto candidato, debido a la facilidad de su fileteado y a la gran proporción que ocupa éste (Cárdenas, 2010). I.2. ESTRATEGIAS ALIMENTARIAS. La alimentación de los peces no sólo es uno de los principales factores que determinan el éxito o el fracaso de una piscifactoría sino que es el de mayor peso en el capítulo de los costes de producción de estas empresas, tanto por el propio coste del pienso en sí, como por el derivado de su administración. No olvidemos que uno de los principales objetivos de la acuicultura es generar un producto de alta calidad con el mínimo coste (Sveier y Lied, 1998). Pues bien, el peso económico de estos capítulos puede reducirse con un adecuado programa de alimentación que incluya, entre otros factores, una apropiada frecuencia alimentaria, que puede reducir la sobrealimentación y mejorar la eficiencia del cultivo (Riche et al., 2004; Ustaogul y Alagil, 2009). La frecuencia alimentaria puede afectar a la ingesta de alimento (Grayton y Beamish, 1997) e influenciar el crecimiento (Giberson y Litvak, 2003). La temperatura del agua, la tasa de alimentación y el tamaño de los peces son los tres principales factores que afectan al crecimiento y estado energético de los peces (Brett y Groves, 1979; Gardeur et al., 2007). En cautividad los peces tienen restringido su movimiento y su alimentación depende exclusivamente de la aportada por el piscicultor; por lo tanto, el crecimiento va a estar ligado al tipo de alimento recibido, al tamaño de la ración, a la frecuencia de alimentación, a la densidad poblacional, etc. (Thia-Eng y Seng-Keh, 1978) Definir un protocolo de alimentación adecuado es una tarea multidisciplinar ya que exige conocimientos de nutrición, fisiología, conducta de los animales y técnicas de 15 Sergio García Mesa alimentación. Siempre es necesario plantear una estrategia alimentaria previa al inicio del cultivo de peces que debe establecer las pautas acerca de la cantidad de alimento que se distribuirá, la frecuencia con que se hará y la forma más adecuada de administración. Establecer una adecuada estrategia de alimentación es importante, no solo en términos de crecimiento, sino también por razones económicas y medioambientales: minimizar el alimento desechado disminuye la pérdida económica y nutricional y la polución del agua (Langar y Guillaume, 1994; Sumagaysay, 1998; Ng et al., 2000; Mihelakakis et al., 2002). Muchas especies no regulan la ingesta de alimento sobre una base diaria, sino que utilizan períodos mucho más amplios para su regulación. Ello supone que en determinados días su apetito es reducido e ingieren raciones por debajo de lo esperado, mientras que otros días son capaces de ingerir cantidades superiores a las esperadas (Madrid et al., 2001). Esto podría definir una nueva variable a tener en cuenta en las estrategias alimentarias, cómo sería dejar de distribuir alimento un día, redistribuyendo la tasa alimentaria semanal en el resto de días, con el fin de que no se reduzca el crecimiento y empeore el índice de conversión del alimento. Aunque la estimación de las necesidades alimentarias básicas puede ser, en principio, una tarea no muy complicada, la alimentación es una variable que no solamente está sometida a ritmos diarios, lunares y estacionales, sino que además actúa como un factor sincronizador de los ritmos biológicos. El hecho que el pez sea un sistema funcional diferente a lo largo del día, las estaciones o el año justifica que la hora de alimentación influya poderosamente en la ingesta y el rendimiento del alimento ingerido. Muchas especies de peces muestran en su medio natural variaciones en la actividad alimenticia concentrándola en el momento del día en que el balance entre disponibilidad de alimento y riesgo de depredación es el mejor. I.2.1. Determinación del tamaño de ración óptimo. Ajustar la cantidad de alimento suministrado a las necesidades del animal es crítico y puede tener consecuencias biológicas; si es insuficiente los animales no crecen todo lo que podrían, mientras que si es excesiva, contribuye a la eutrofización del medio y a generar otros problemas ambientales. Así pues, la alimentación afecta a la producción y a los resultados económicos del cultivo (Alanärä et al., 2001). Las necesidades nutricionales y energéticas varían con el tamaño y/o edad de los peces (Paul et al., 1994; Haroon y Pitman, 1997). Los animales, al aumentar el peso, necesitan un mayor aporte absoluto de energía aunque, en relación al peso corporal, puede ser menor. También es bien sabido que, con el aumento del peso de los peces, la tasa de conversión de alimento disminuye, al destinarse parte de la energía del mismo a otros objetivos diferentes a los de incrementar su biomasa como sería, por ejemplo, el desarrollo de gónadas. En la mayoría de peces carnívoros y omnívoros, la relación entre tasa de crecimiento y tamaño de ración tiene el perfil de una curva desacelerada (Brett y Groves, 1979). A medida que 16 Introducción aumenta la ración, el crecimiento y la eficiencia de conversión también lo hacen inicialmente. En el caso del crecimiento esto es así hasta que, a partir de un cierto tamaño de ración no se produce una mejora adicional de la tasa de crecimiento, se ha alcanzado lo que se conoce como ración y crecimiento máximos. Sin embargo, en el caso de la eficiencia de conversión de alimento en biomasa, el máximo se suele alcanzar para raciones de aproximadamente 2/3 de la ración máxima y después disminuye (Brett y Shelbourn, 1975; Chua y Teng, 1982, Sun et al., 2006). La ración que promueve el mejor índice de conversión se conoce como ración óptima; el intervalo entre las tasas de alimentación, óptima y máxima, definirá el margen de maniobra del piscicultor. En este margen de racionamiento, es posible maximizar el crecimiento o minimizar el coste alimentario, en función de imperativos económicos o de otro tipo. Es fácil deducir de lo expuesto que la obtención de un crecimiento máximo implica un sobrecoste alimentario. Según Jiwyam (2010), un cultivo de tilapia del Nilo con alimentación restringida a cierto nivel es más rentable que el basado en una alimentación a saciedad. En el período de alimentación restringida, la eficiencia de conversión del alimento descendió con el aumento de la ración, de forma similar a un estudio previo también en tilapia (Xie et al., 1997). Esto ratifica la importancia de definir una adecuada tasa de alimentación con el fin de abaratar los costes de producción. Fontaine et al. (1997) determinaron, en un experimento con Perca fluviatilis, que distinto tamaños de ración no generaban diferencias en cuanto a la tasa de conversión de alimento, pero sí observaron que la tasa de crecimiento fue mucho menor para los peces alimentados con la ración más baja, indicando que los animales alimentados con la misma estaban sólo ligeramente por encima del mantenimiento (Mélard et al., 1995). Por otro lado, un aumento del tamaño de ración diaria al 3% del peso corporal mejoró ligeramente la tasa de crecimiento, pero redujo significativamente su índice de utilización. En un experimento llevado a cabo por Puvanendran et al. (2003) con Limanda ferruginea alimentada con diferentes tamaños de ración, se puso de manifiesto que los animales alimentados con una ración diaria del 3% de su peso corporal, presentaron un mayor peso final que los que se alimentaron al 1, 1.5 o 2%. Sin embargo, los alimentados al 3% mostraron una tasa de conversión del alimento significativamente peor que los alimentados con raciones más pequeñas, lo que indica un mayor desperdicio del alimento en aquellos. Una vez más, la máxima eficiencia de conversión del alimento se produjo con raciones submáximas. Durante el preengorde de alevines de corvina (6-20 gramos) se estableció que la tasa de alimentación óptima a 24-25°C era de 2.5 a 5% peso corporal/día (Bajandas et al., 2009a, b, c). Mientras que para corvinas en engorde (40-100 gramos) esa tasa óptima era de sólo 0.5 y 1% peso corporal/día (Velazco et al., 2009). 17 Sergio García Mesa I.2.2. Determinación de la frecuencia alimentaria óptima. La gestión de la alimentación en términos de la optimización de la tasa y frecuencia alimentaria se ha convertido en una exigencia en el cultivo de peces de agua dulce y salada, y en una de las áreas cruciales de investigación en piscicultura. Controlando la frecuencia alimentaria óptima, los acuicultores pueden reducir el coste del alimento y maximizar el crecimiento y también ser capaces de reducir efectos negativos como la variación del tamaño de los individuos y sobre la calidad del agua. Ya hemos indicado que el crecimiento puede verse afectado significativamente por la frecuencia alimentaria, la cual afecta notablemente a la ingesta y asimilación del alimento. (Marimuthu et al., 2010). El alimento debe ser suministrado con una frecuencia tal que permita su adecuada ingesta para obtener la mejor tasa de crecimiento (Ruohonen et al., 1998; Lee et al., 2000; Dwyer et al., 2002; Wang et al., 2007). Es evidente que la determinación de la frecuencia óptima de alimentación puede ser abordada desde dos diferentes puntos de vista. El primero es el económico, que determina los beneficios de una producción acuícola y el otro es desde el punto de vista de la fisiología del propio pez. I.2.2.1. IMPORTANCIA DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA EN EL CRECIMIENTO. Definir una frecuencia alimentaria semanal óptima persigue que las tasas de crecimiento sean buenas, obteniendo unas altas tasas de eficiencia alimentaria y retención proteica, parámetros que nos indican el buen desarrollo del cultivo y aprovechamiento del alimento. La eficiencia alimentaria valora la proporción de alimento que sería empleada con fines metabólicos y energéticos, tanto para el crecimiento como para el mantenimiento mientras que retención proteica nos informa del aprovechamiento de la proteína suministrada con el alimento con fines de crecimiento. Además, existe otro tipo de índices morfológicos que nos indican rápidamente el estado nutricional, así como la condición fisiológica de los peces, como son el índice de condición, el índice hepatosomático o el índice viscerosomático (Desai y Singh, 2009). Ganancia de peso, eficiencia alimentaria e índice de condición son herramientas útiles que nos podrían ayudar a definir la frecuencia alimentaria más idónea de la corvina sin necesidad de emplear técnicas más específicas y complejas. Según Thia-Eng y Seng-Keh (1978) la mejor frecuencia alimentaria para Ephinephelus tauvina, a juzgar por los datos de crecimiento y eficiencia alimentaria, era de una comida cada 2 días, frente a frecuencias más bajas (una comida cada 5, 4 ó 3 días) o más altas (una comida al día). Resultados similares obtuvieron Lambert y Dutil (2001) con bacalao, que al ser alimentado cada 2 días crecía más que cuando el alimento se administraba cada 3 ó 5 días. Wang et al. (2007) encontraron que Nibea miichthioides necesita alimentarse al menos una vez al día, ya que la ganancia de peso fue mejor en este caso que cuando se les alimentó una vez cada dos días, si bien el aumento de la frecuencia a dos veces por día no significó cambio significativo alguno. 18 Introducción Generalmente, a la hora de decidir el régimen de alimentación adecuado se consideran el crecimiento y la utilización del alimento, pero también los costes derivados de las labores de alimentación ya que la alimentación de los peces es laboriosa pues cuando son criados en jaulas se alimentan generalmente de forma manual; por lo tanto, se recomienda tener en cuenta no sólo crecimiento y conversión sino también coste laboral. El efecto de la frecuencia alimentaria semanal también fue medido por El-Sayed et al. (2005) en tilapia del Nilo. Esto autores no obtuvieron diferencias significativas en el peso final ni en el SGR para grupos de peces alimentados 6 o 7 días a la semana, mientras que grupos que se alimentaron 4 o 5 días presentaron valores significativamente más bajos. Cuando la tilapia se alimenta a saciedad 6 días a la semana parece incrementar su capacidad de ingerir alimento para compensar el día de ayuno y, consecuentemente, el crecimiento fue similar con respecto a grupos alimentados 7 días a la semana. Aunque la ingesta de alimento no presentó diferencias significativas entre tratamientos, la frecuencia 6 días a la semana presentó los mejores índices de conversión de alimento. I.2.2.2. IMPORTANCIA DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA EN LA COMPOSICIÓN CORPORAL. La frecuencia de alimentación también tiene efecto sobre la composición corporal de los animales. Una alimentación poco frecuente en ratas provoca una lipogénesis adaptativa, aumenta la síntesis de lípidos a causa de una mayor actividad de las enzimas del tejido adiposo. La posibilidad de adaptarse a alimentaciones poco frecuentes, de forma similar a lo que se ha observado en ratas, podría producirse en peces y tener importancia en la piscicultura, especialmente en términos de eficiencia y calidad. También se ha observado en truchas alimentadas con frecuencias altas una mayor presencia de depósitos lipídicos (Grayton y Beamish, 1977). Otra respuesta a una alimentación poco frecuente es un descenso en la tasa metabólica e hiperlipogénesis, estas situaciones tienden a desarrollar la hiperfagia de los peces y, por tanto, la explosión de alimento ingerido conduce a que se metabolice y sea almacenado en forma de lípidos de reserva. Se ha descrito en varias especies que el contenido lipídico corporal aumenta con la frecuencia alimentaria (Grayton y Beamish, 1977; Kayano et al., 1993; Yao et al., 1994; Lee et al., 1996). Resultados obtenidos por Lee et al. (2000) indican que la frecuencia alimentaria tiene un notable efecto en la composición corporal en Sebastes schlegeli, sobre todo de la fracción lipídica y proteica en diferentes compartimentos corporales como hígado, músculo y paquete visceral. Una menor frecuencia alimentaria provocó un aumento significativo del contenido de agua en músculo e hígado, sin embargo el paquete visceral no se vio afectado; al aumentar la frecuencia alimentaria aumentó el contenido lipídico de músculo, hígado y paquete visceral. La composición corporal del pez gato africano también se vio afectada por la frecuencia alimentaria (Marimuthu et al., 2010): administrar una ración al día o cada 2 días condujo a un descenso del contenido lipídico, frente a frecuencias de 2 raciones diarias o cada 2 días. Por lo 19 Sergio García Mesa tanto parece constatable que una menor frecuencia alimentaria conlleva un menor contenido lipídico; sin embargo otros autores como Van Ham et al. (2003) y Wang et al. (2009), parecen proponer que el aumento de frecuencia alimentaria conlleva a una disminución de la retención lipídica y proteica. I.2.2.3. IMPORTANCIA DE LA FRECUENCIA ALIMENTARIA EN EL RANGO DE TAMAÑOS. Cuando los peces se están criando en condiciones de cultivo intensivo, a menudo se produce, con el tiempo, un aumento del rango o dispersión de tamaños dentro del grupo, mayor del que se esperaría en la naturaleza. Este aumento extra de la variación del tamaño se ha explicado por el establecimiento de una jerarquía con dominancia social de algunos individuos más fuertes en las condiciones de cría intensiva (Thomassen y Fjaera, 1996). Una estrategia alimentaria apropiada resultaría en una reducción en el rango de tamaños (Fontaine et al., 1997). Kadri et al. (1996) sugieren que, para prevenir la monopolización del alimento por algunos individuos, el mismo debería administrarse de manera impredecible en el tiempo y en el espacio. Con esto también se evitaría el canibalismo normalmente asociado con tamaños heterogéneos de la población, disponibilidad limitada de alimento, refugios escasos, etc. (Marimuthu et al., 2010). Las diferencias en el tamaño corporal, por medio de su impacto sobre la capacidad individual de competir socialmente, podrían generar un menor crecimiento global. A luz de estas palabras, el régimen alimentario debe ofrecer la oportunidad para que todos los peces coman cuando se administra la comida y así reducir el efecto de la jerarquización. Goddard (1996) propuso que si los peces reciben su ración diaria en pocas comidas, los más grandes o agresivos podrían alimentarse a expensas de los más pequeños. Es posible que los más grandes se alimenten a tasas máximas, mientras que otros del mismo grupo tendrían restringido el alimento. Grayton y Beamish (1977) encontraron un patrón de crecimiento similar para peces que recibieron una dieta restringida del 2%, siendo la variabilidad entre individuos menor que cuando se alimentaron a saciedad. Como hemos visto, la frecuencia alimentaria, entendida como número de comidas al día, se ha postulado como un eficaz modulador de la dispersión de tamaños en peces, de modo que se asegura que todos los peces reciben alimento a lo largo del día, los peces más agresivos se alimentarán con las primeras comidas del día, pero una vez saciados van a permitir alimentarse al resto. No hemos encontrado en la literatura trabajos que exploren el efecto de la frecuencia alimentaria semanal sobre la distribución de tamaños o jerarquías en producciones acuícolas. El metabolismo del pez se ve influenciado por multitud de factores, como la temperatura del agua, el tamaño/edad del individuo, la cantidad y calidad del alimento, etc. (Grayton y Beamish, 1977); por lo tanto, la frecuencia con que algunos animales se alimentan puede afectar 20 Introducción substancialmente a su metabolismo (Fabry, 1967; Kekwick y Pawan, 1971). A pesar de que no hay estudios preliminares del efecto de la frecuencia alimentaria semanal sobre el metabolismo en la bibliografía, cabe esperar modificaciones en las principales rutas metabólicas. I.3. ASPECTOS DE FISIOLOGÍA DIGESTIVA. I.3.1. El tracto digestivo El tracto digestivo de los peces presenta una gran diversidad. En general el aparato digestivo es una estructura tubular en la cual se pueden establecer cuatro zonas: cavidad oral (bucal) que se encuentra asociada a la cavidad faríngea o branquial; digestivo anterior compuesto por el esófago, estómago y píloro; digestivo medio, la porción de mayor longitud, que incluye los ciegos pilóricos; y el digestivo posterior, cuya parte final es el ano. El estómago puede presentar formas muy diversas, desde un tubo simple hasta un saco bien diferenciado. En algunas especies está ausente. El tracto intestinal de los peces puede variar desde muy corto y estrecho a largo y dispuesto en espiral o bucle. La longitud generalmente se correlaciona con los hábitos de alimentación: peces herbívoros que consumen alimentos difíciles de digerir poseen a menudo un intestino más largo que los peces carnívoros (Stevens, 1988). Es difícil diferenciar a simple vista las distintas partes del intestino, ya que carece de diferencias anatómicas externas en su trayectoria, si bien las diferencias histológicas y funcionales son patentes. Una particularidad importante es la presencia de apéndices o ciegos pilóricos, divertículos terminales en la parte proximal del intestino, que aumentan la superficie de absorción incrementando la eficacia digestiva, ya que normalmente se trata de un tracto intestinal relativamente corto (Buddington y Diamond, 1987). Los ciegos pueden variar en tamaño y forma, desde pequeñas evaginaciones de la pared intestinal a estructuras tubulares, ramificadas similares a mechones. El número y las formas de los ciegos varían considerablemente entre las especies; van desde unos pocos (2-4) a varias decenas (Stevens, 1988; Jobling, 1995). Las secciones histológicas muestran que el apéndice pilórico se alinea con los enterocitos, que son similares a los de la pared intestinal. Su función es retrasar el paso de los alimentos (Stevens, 1988) mediante el aumento de superficie intestinal sin aumentar la longitud o el grosor del intestino (Buddington y Diamond, 1987). En varias especies de peces se ha encontrado una actividad enzimática muy alta en los ciegos pilóricos (Harpaz y Uni, 1999; Krogdahl et al, 1999; Harpaz et al., 2005a, b), también juega un papel importante en la absorción de los nutrientes digeridos (Bell et al., 1987; Horn, 1998). Más de la mitad de la proteína dietética se digiere y se absorbe en estos divertículos (Krogdahl et al., 1999). 21 Sergio García Mesa I.3.2. Enzimas digestivas La hidrólisis de las proteínas, lípidos y carbohidratos del alimento son procesos enzimáticos y, por lo tanto, específicos que necesitan un cierto número de enzimas digestivas intraluminales extracelulares que son secretadas en las distintas partes del tubo digestivo. Las enzimas digestivas de peces presentan características que las diferencian de sus homólogas en mamíferos. Uno de los factores más importantes que determinan estas diferencias es el carácter poiquilotermo de estos animales, que hace que la temperatura sea el principal factor ambiental que afecta al proceso de adaptación de estos organismos. Las especies que habitan en medios a bajas temperaturas han sufrido una serie de adaptaciones evolutivas con el fin de mantener la actividad fisiológica de sus enzimas a estas temperaturas (Kristjansson y Nielsen, 1992). El equipamiento de enzimas digestivas no es el mismo en todas las especies de peces. Además, la actividad de las enzimas digestivas puede variar con la edad del pez, su estado fisiológico y la estación del año. Cada enzima digestiva presenta un rango de pH y temperatura óptimos para su actividad fuera del cual se produce una rápida y marcada disminución de la misma. Dentro del rango óptimo, la secreción y la actividad enzimática aumentan al hacerlo de la temperatura. En la mayoría de las especies el pH óptimo de las enzimas gástricas se sitúa en torno a 2.0 (Glass et al., 1989). Por otra parte, las enzimas gástricas de animales que habitan medios fríos poseen puntos isoeléctricos relativamente mayores que los de sus homólogas en mamíferos (Arunchalan y Haard, 1985). Por lo que respecta a las enzimas intestinales, presentan el óptimo de actividad a un pH más alcalino, entre 7.0 y 10.0 (Kristjansson y Nielsen, 1992). Las etapas finales de la degradación y la asimilación de los nutrientes se producen gracias a las enzimas y los transportadores que están unidos a la superficie del borde en cepillo (microvellosidades) de las células intestinales. Procesos enzimáticos y celulares transfieren pasiva y activamente nutrientes de todo tipo desde el lumen, a través del borde en cepillo, al interior de los enterocitos. I.3.2.1. PROTEASAS Y PEPTIDASAS De todas las enzimas digestivas, las proteasas son quizá las más importantes ya que catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos que forman la estructura primaria de las proteínas, componente principal de la dieta en animales carnívoros. Además de estar implicadas en los procesos de digestión, las proteasas tienen otras funciones como la activación de proenzimas y prehormonas. La digestión proteica ocurre en el lumen del tracto digestivo de una manera secuencial, donde las proteínas se degradan a polipéptidos por proteasas y los polipéptidos a aminoácidos libres. Las proteasas, al ser hidrolasas específicas de enlaces peptídicos, se agrupan bajo el código EC 3.4. Dentro de ellas, existen dos subgrupos: las exopeptidasas, que hidrolizan enlaces 22 Introducción peptídicos entre aminoácidos terminales (extremo amino o carboxilo de la proteína), se agrupan bajo EC 3.4.11-19 mientras que las endopeptidasas, que hidrolizan enlaces peptídicos internos, pertenecen a la categoría EC 3.4.21-24. Asímismo, se clasifican de acuerdo con su mecanismo de acción, donde se reconocen 4 grupos principales: 1. Serina-proteasas (EC 3.4.21) que poseen un grupo serina en el centro activo, así como histidina y aspártico. 2. Cisteína-proteasas (EC 3.4.22) que se caracterizan por la presencia del grupo cisteína (-SH) en su centro catalítico. 3. Proteasas ácidas o aspárticas (EC 3.4.23) que se definen por la presencia de ácido aspártico en el centro activo y poseen máxima actividad a pH ácido. 4. Metaloproteasas (EC 3.4.24) que poseen un residuo de ácido glutámico en el centro activo y requieren de un catión divalente (Zn, Ca o Mg) para catalizar la hidrólisis del enlace peptídico. Dentro del grupo de las endoproteasas se encuentra la pepsina (EC 3.4.23.1), gastricsina (EC 3.4.23.3) y la quimosina o renina (EC 3.4.23.4) que son proteasas ácidas presentes en el jugo gástrico de muchos organismos. En el intestino de muchas especies se ha detectado otro tipo de enzimas que funcionan a pH alcalino como la tripsina (EC 3.4.21.4) que es una endoproteasa pancreática que hidroliza los enlaces peptídicos entre lisina y arginina. La quimotripsina (EC 3.4.21.1) también es una serina proteasa cuya especificidad de sustrato implica l-isómeros de tirosina, fenilalanina y triptófano; también actúa sobre amidas y ésteres. Las catepsinas son enzimas relacionadas con los procesos de digestión intracelular. En el caso de las exoproteasas se pueden mencionar las aminopeptidasas (EC 3.4.11) las cuales catalizan la hidrólisis de los restos aminoacídicos, concretamente desde el extremo amino de un péptido y las carboxipeptidasas que liberan residuos aminoacídicos del extremo carboxi terminal de los péptidos y proteínas. Se conocen dos familias de carboxipeptidasas: las serina carboxipeptidasas (EC 3.4.16), que contienen un residuo de serina en su centro activo y las metalo carboxipeptidasas (EC 3.4.17) que requieren de iones Zn para ser activas. La proteína ingerida es digerida en primer lugar en el estómago por la pepsina, posteriormente se produce una digestión adicional en el intestino por la acción de peptidasas pancreáticas como la tripsina, quimotripsina y la elastasa (todas endopeptidasas). También actúan carboxipeptidasas y una gran variedad de peptidasas del borde en cepillo de los enterocitos como endopeptidasas (EC 3.4.11.?), aminopeptidasa A (EC 3.4.11.7) y N (EC 3.4.11.2) y dipeptidil aminopeptidasa N (EC 3.4.14.5). En peces agastros, la digestión proteica se lleva a cabo en el intestino proximal y ocurre a pH neutro-básico, el aumento de la longitud intestinal suple la deficiencia de estómago. El páncreas es el principal órgano secretor de proteasas. En algunos peces, como los salmónidos, que carecen de una glándula pancreática bien definida, la síntesis de proteasas pancreáticas se localiza en tejidos localizados en las proximidades de los ciegos pilóricos como hígado, mesenterio intestinal, vesícula biliar e incluso la bilis, que muestran una clara actividad proteolítica (Einarsson y Davies, 1996). Otras fuentes importantes de actividad proteolítica son el intestino y los ciegos pilóricos. Los acinos exocrinos están uniformemente distribuidos a lo largo de los ciegos pilóricos y alrededor de la grasa (Pringle et al., 1992; Einarsson y Davies, 1996) y las proenzimas que sintetizan se transfieren al tejido pilórico a través de un sistema 23 Sergio García Mesa multiductal (Einarsson y Davies, 1997). Como en mamíferos, la secreción enzimática digestiva se activa por la hormona CCK que, a su vez, se libera por la presencia de productos de la digestión, grasas y proteínas (Liddle, 2000). Las proteasas digestivas son secretadas por el páncreas en formas inactivas (zimógenos), que se activan en el interior del intestino mediante la acción de la enteroquinasa, una enzima secretada por la pared intestinal, y tripsina, evitando así que ataquen a tejidos propios antes de su liberación. Esta activación de proteasas pancreáticas por enzimas intestinales es la causa de que la actividad proteolítica de la mezcla de las enzimas pancreáticas con las intestinales sea mayor que la de cada una por separado. Las especies carnívoras suelen tener una alta actividad de pepsina y una menor de las proteasas pancreáticas, tripsina y quimotripsina (Sabapathy y Teo, 1993; Jobling, 1995). Los estudios han demostrado que algunos peces herbívoros presentan actividades de tripsina similares o incluso superiores a las especies carnívoras. Se podría decir que los peces carnívoros se basan principalmente en la pepsina para la digestión de proteínas, ya que puede digerir oligoproteínas e incluso las macromoléculas de proteínas (Sabapathy y Teo, 1993). Por otro lado, los peces herbívoros podrían compensar la reducida presencia de proteína en su dieta natural por el aumento de su actividad enzimática (Sabapathy y Teo, 1993, Hidalgo et al., 1999), posiblemente para maximizar la eficiencia de las proteínas digestivas (Chan et al., 2004). De todas las proteasas pancreáticas, la tripsina es de particular importancia porque activa a las otras proteasas durante los procesos de digestión; el desarrollo de la actividad tripsina en etapas tempranas de la vida de los peces es utilizado comúnmente como indicador de desarrollo del sistema digestivo y actividad alimentaria exógena en larvas (Zambombino Infante y Cahu, 1994; Ueberschär, 1993). La actividad tripsina está influenciada por un amplio rango de factores como la talla de pez, el tiempo después de la alimentación, variaciones estacionales, estado nutricional, temperatura del agua y presencia de inhibidores de la tripsina en el alimento (Sunde, 2006). Las isozimas son proteínas enzimáticas que llevan a cabo la misma función enzimática pero son estructuralmente diferentes (difieren en la secuencia de aminoácidos); suelen mostrar diferentes parámetros cinéticos o propiedades de regulación diferentes. La existencia de las isozimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. Son consecuencia de un mecanismo de adaptación que permite a individuos expuestos a cambios frecuentes en su medio ambiente la necesaria flexibilidad metabólica para afrontarlos. Las proteasas digestivas de los peces permiten esta flexibilidad metabólica dado la variedad de proteasas observadas en un amplio rango de especies. En estos animales se han descrito múltiples formas de tripsina y de quimotripsina (Sunde, 2006). La ventaja de varios tipos de tripsina puede ser proveer de un arsenal de enzimas con propiedades catalíticas diferentes (Outzen et al., 1996) o diferente especificidad por el sustrato. En organismos poiquilotermos como los peces, y particularmente los que viven en ambientes marinos fríos, la tripsina muestra una considerable mayor eficiencia catalítica que las 24 Introducción de mamíferos (Ahsan y Watabe, 2001); posiblemente debido a una respuesta evolutiva dirigida aumentar su afinidad por el sustrato a bajas temperaturas. Varios autores han propuesto que la digestión de las proteínas, en particular la mediada por tripsina, es un potencial factor limitante de la tasa de crecimiento y utilización de la dieta por los peces (Torrissen y Shearer, 1992; Blier et al., 1997; Lemieux et al., 1999; RungruangsakTorrissen et al., 1999; Rungruangsak-Torrissen y Male, 2000; Rungruangsak-Torrissen et al., 2006). Esta hipótesis se basa, en parte, en la estrecha relación observada entre la presencia de determinadas isozimas de la tripsina y el aumento de la tasa de crecimiento y la utilización de la dieta en el salmón (Torrissen, 1987). Se ha comprobado que la presencia de isozimas específicas de la tripsina puede aumentar la utilización del alimento a bajas temperaturas (Torrissen y Shearer, 1992; Rungruangsak-Torrissen et al., 1998) o aumentar la utilización de las proteínas de alimentos de baja digestibilidad (Bassompierre et al., 1998). I.3.2.2. LIPASAS Las lipasas son enzimas que pertenecen a la familia serín-proteínas y llevan a cabo la hidrólisis extracelular de los lípidos (Higgs y Dong, 2000) en estómago, intestino y ciegos pilóricos (Sargent et al., 1989; Smith, 1989). En la mayoría de las especies, la hidrólisis lipídica comienza en los ciegos pilóricos e intestino anterior; sin embargo, en algunas de ellas se ha detectado una lipólisis en el estómago catalizada por una lipasa gástrica (Gisbert et al., 1999). La lipasa pancreática (EC 3.1.1.3), en presencia de un factor llamado colipasa, hidroliza los triglicéridos para formar diacilglicerol, monoacilglicerol y ácidos grasos libres (Murray et al., 2003). La lipasa presente en los fluidos intestinales de los peces no es específica e hidroliza ácidos grasos con igual facilidad para las tres posiciones del glicerol de los triglicéridos (Cowey y Sargent, 1979). Los ácidos grasos y monogliceroles se agregan con las sales biliares en pequeñas micelas. Cuando se unen al borde en cepillo su contenido se libera en el enterocito. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena corta pueden ser absorbidos sin sales biliares (Horn, 1998). Algunas esterasas (EC 3.1.1.1), que preferentemente actúan sobre ésteres simples de ácidos grasos con bajo peso molecular, poseen la capacidad, al igual que las lipasas, de hidrolizar triglicéridos; sin embargo, se distinguen de estas últimas porque hidrolizan sustratos solubles. Las actividades esterasa y lipasa dependen de la presencia de sustancias activadoras tales como las sales biliares o de la temperatura. La actividad lipasa en peces parece ser mayor que en mamíferos. Su acción depende de la presencia de las sales biliares, las cuales son detergentes que emulsionan los lípidos y facilitan la acción de las enzimas lipolíticas. 25 Sergio García Mesa I.3.2.3. CARBOHIDRASAS Las carbohidrasas llevan a cabo la lisis extracelular de los hidratos de carbono complejos en el estómago, intestino y ciegos pilóricos (Sabaphaty y Teo, 1993), estas enzimas están tanto en el lumen del intestino y ciegos como asociadas a la membrana, en el glucocalix. Los productos de esta hidrólisis son polisacáridos y azúcares simples que pueden ser más fácilmente asimilados. La principal carbohidrasa es la α-1-4 glucosidasa o α-amilasa (EC 3.2.1.1.), está presente en el jugo pancreático de gran cantidad de animales ya que hidroliza indistintamente enlaces a lo largo de la cadena del polímero hidrocarbonado α 1-4 de la amilosa o fragmentos lineales de la amilopectina o del glucógeno. Por su parte, la β-amilasa hidroliza los carbohidratos por el extremo no reductor y se restringe exclusivamente al reino vegetal. Finalmente, las fosfatasas ácida y alcalina (EC 3.1.3.2. y 3.1.3.1.) que catalizan la separación de P inorgánico a partir de fosfato orgánico, se encuentran en los epitelios intestinales y en diferentes capas tisulares del estómago. Su papel fisiológico en los vertebrados superiores está relacionado con los procesos de mineralización de los huesos, así como en procesos de transporte a través de membrana. De hecho, ambas fosfatasas se asocian con el transporte activo de glucosa, proteína y lípidos, e incluso de agua e iones en el caso de la fosfatasa alcalina. El pH óptimo de estas enzimas está próximo a la neutralidad (Thoma et al., 1971), sin embargo, resultados reportados por Fernández et al. (2001) indican la existencia de posibles isozimas con máximos de actividad a diferentes pHs. Los peces son generalmente considerados poco aptos para digerir polisacáridos, aunque en todas las especies estudiadas se ha puesto en evidencia una importante actividad amilasa que, en todos los casos, tiene origen pancreático (Sabapathy y Teo, 1993). Se ha comprobado que la relación de actividades amilasa/proteasa de diferentes especies es un buen indicador del régimen alimentario de un pez. Así, los peces carnívoros están caracterizados por valores menores de esta relación que los peces herbívoros u omnívoros (Albertini-Berhaut, 1980), y presentan una peor digestibilidad para los hidratos de carbono. Las especies herbívoras presentan mayor actividad amilasa (Hidalgo et al., 1999). La mayoría de autores sugieren que en el pez carnívoro sólo se secreta una limitada cantidad de amilasa y, por tanto, su actividad está restringida a digerir sólo pequeñas concentraciones de almidón (Furné, 2008). Por el contrario, en algunos peces herbívoros la actividad de lipasas y proteasas es mínima, mientras que en peces carnívoros es alta (Martínez Palacios y Ríos Durán, 2003). 26 Introducción I.4. METABOLISMO INTERMEDIARIO EN PECES La regulación del metabolismo en peces es compleja, y responde, como en mamíferos, a estímulos de origen hormonal y enzimático que se presentan acorde con las condiciones ambientales, nutricionales y reproductivas (Seiliez et al., 2011). Además, el carácter poiquilotermo de los peces implica que la cinética de sus reacciones físicoquímicas internas sea dependiente de las características térmicas del medio que rodea al animal (Cowey y Luquet, 1983). El metabolismo intermediario comprende todas las reacciones que ocurren a nivel celular y del organismo, involucradas con el almacén y generación de energía metabólica con el fin de utilizar esa energía para la biosíntesis. Las rutas centrales del metabolismo intermediario son pocas y están altamente conservadas: a grandes rasgos, la maquinaria metabólica de peces es muy parecida a la de mamíferos. Sin embargo, las necesidades energéticas de los peces dependen de cada especie y, dado en el medio en el que viven, van a presentar unas ciertas ventajas y desventajas frente a mamíferos. La principal ventaja es la posibilidad de excretar los desechos nitrogenados en forma de amonio a través de las branquias. Estas particularidades hacen que el metabolismo intermediario difiera del de mamíferos en cuanto a su regulación, sensibilidad a factores bióticos y abióticos y el papel exacto que juegan los órganos y tejidos (Dabrowski y Guderley, 2002). Generalmente, en los sistemas multienzimáticos sólo unas cuantas enzimas, llamadas enzimas reguladoras, son las que marcan el flujo de la vía. Los mecanismos de regulación de estas enzimas atienden básicamente a dos tipos de control: uno grosero, que se produce de forma lenta y con variación de la cantidad de enzima, y uno fino, regulación alostérica, que es mucho más rápido, variando la actividad por cambios de la Km del enzima. La actividad de estas enzimas se ve modificada por varios factores, además del sustrato, tales como pH, efecto iónico, concentración de nucleótidos y metabolitos que ejercen un control feed-back al igual que en vertebrados superiores (Hall y Cottam, 1978). I.4.1. Metabolismo hepático I.4.1.1. METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO. La importancia de la glucosa en el metabolismo de los peces ha sido estudiada por numerosos investigadores (Shiau, 1997; Moon, 2001; Legate et al., 2001; Hemre et al., 2002; Krogdahl et al., 2005; Seiliez et al., 2011). No obstante, los carbohidratos de la dieta no son el principal recurso de energía y carbono para la mayoría de los peces. Existen estudios que demuestran que la utilización metabólica de la glucosa absorbida puede ser escasa, encontrándose altos niveles de glucemia postprandial en la mayor parte de los teleósteos, con ligeras diferencias entre las especies (Bergot, 1979). Esta glucemia prolongada parece estar relacionada con la tasa de fosforilación de la glucosa debida a la reducida capacidad de las 27 Sergio García Mesa enzimas encargados de realizar este proceso, o bien a la diferente receptividad tisular a la glucosa (Nagayama y Oshima, 1974). Las actividades glucolíticas en peces son más elevadas en el músculo cardíaco y esquelético y más reducidas en el hígado (Knox et al., 1980). A pesar de este mal uso de la glucosa, la inclusión de carbohidratos en la dieta permite un ahorro de proteína al disminuir su uso energético o gluconeogénico, confirmado por la prolongada hiperglucemia postprandial producida por los altos niveles de aminoácidos en la dieta observada en varias especies de peces. Esta elevada ingesta en aminoácidos provoca una persistente síntesis de glucosa hepática por inducción de las enzimas gluconeogénicos (Kirchner et al., 2003). I.4.1.1.A. GLUCOLISIS Es la vía principal del catabolismo de la glucosa en los tejidos de los peces, implica la oxidación gradual de la misma hasta su transformación en piruvato y ATP y se halla estrechamente coordinada con otras rutas metabólicas de generación y utilización de energía como la síntesis y degradación de glucógeno, la gluconeogénesis, la ruta de las pentosas fosfato, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la fosforilación oxidativa. La regulación de esta vía es compleja y responde a una serie de estímulos hormonales y enzimáticos, además de estímulos ambientales como puede ser la temperatura. Podemos enfocar la atención sobre determinadas enzimas que son las que van a marcar verdaderamente el flujo de degradación de la glucosa. Estas enzimas reguladoras de la glucolisis son la Fosfofructoquinasa (PFK, E.C. 27.1.1.11) y la Piruvato quinasa (PK, E.C. 27.1.1.40), aunque también podemos considerar como tal a la Hexoquinasa (HK, E.C. 27.1.1.10) que cataliza la incorporación de glucosa a esta vía, un paso regulado por el producto de dicha reacción, la glucosa 6P. Diferentes autores sugieren un mecanismo de regulación atípico después de una ingesta de hidratos de carbono, como una baja capacidad para la fosforilación de la glucosa por la HK, lo que se ha confirmado por la pobre utilización de glucosa exógena en músculo de trucha (Kam y Milligan, 2006; Kirchner et al., 2003). También se ha comprobado que dietas ricas en carbohidratos no afectan a la actividad o niveles de ARNm de las enzimas claves de la gluconeogénesis hepática de la trucha (Kirchner et al., 2005, Panserat et al., 2000, 2001) en contraste con lo que ocurre en mamíferos (Díaz et al., 2007). Comparada con el resto de las enzimas glucolíticas, la HK hepática muestra poca actividad en trucha arcoíris (Driedzic y Hochachka, 1978), de hecho, es 25 veces menor que la actividad presentada por PFK y 45 veces menor que la de PK (Fideu et al., 1983; Cowey et al., 1977). Su actividad aumenta con una dieta rica en hidratos de carbono y disminuye con una rica en proteínas o durante el ayuno (Fideu et al., 1983; Furné et al., 2011; Pérez-Jiménez et al., 2011). Se ha observado que aquella inducción por hidratos de carbono, tanto a nivel enzimático 28 Introducción como molecular (Panserat et al., 2000) y parece ser que se debe al aumento postprandial de la glucosa (Panserat et al., 2001). La PFK, que cataliza la reacción de segunda fosforilación de la glucosa, se considera como la primera enzima clave en la regulación de esta ruta tanto en mamíferos como en peces y otros animales (Knox et al., 1980) habiendo sido detectada en casi todos los tejidos. Presenta una actividad menor comparada con el resto de las enzimas de la glucolisis, lo que puede confirmar su papel regulador del flujo glucolítico. Se ha observado una mayor actividad de esta enzima en peces omnívoros, como la carpa, que en carnívoros (Shimeno, 1982). La PK cataliza la reacción de conversión del fosfoenolpiruvato (PEP) en piruvato. Esta enzima puede jugar dos papeles importantes, como reguladora del flujo glucolítico y como reguladora de la gluconogénesis de forma indirecta ya que durante periodos de alto flujo gluconeogénico se piensa que podría disminuir su actividad para evitar ciclos innecesarios de carbono a través de PEP, piruvato y oxalacetato (Korsgaard y Mommsem, 1993). La distribución de esta enzima ha sido estudiada en bacalao, platija y trucha por Knox et al. (1980), presentando valores relativamente más altos en músculo esquelético que en hígado, riñón y branquias (Knox et al., 1980). Se ha comprobado que la composición de la dieta, sobre todo por lo que se refiere al contenido de hidratos de carbono, afecta al flujo glucolítico. Así, el incremento de los carbohidratos de la dieta va a producir aumentos de la actividad PK en respuesta a la alta disponibilidad de glucosa. La mayoría de los autores han confirmado este aumento del flujo glucolítico, y por lo tanto de la PK hepática, en distintas especies de peces como la trucha arcoíris (Sánchez-Muros, 1990), anguila europea (Suárez et al., 1995), carpa (Shikata et al., 1994) y dorada (Meton et al., 1999). Las dietas con alto contenido proteico parecen ejercer un efecto parecido sobre esta actividad (Lupiañez et al., 1989), debido a que los aminoácidos estarían a altos niveles y parte de ellos serían oxidados incorporándose a la glucolisis y posteriormente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT), para producir energía. Las dietas altas en grasa proporcionan datos dispares. Así, en hígado de trucha se han registrado niveles aumentados de actividad PK (Hilton y Atkinson, 1982; Sánchez-Muros, 1990). Esta situación nutritiva elevaría la cantidad de ácidos grasos disponibles que se podrían oxidar en el CAT. En anguila, sin embargo, no se han observado diferencias significativas atribuibles a los niveles de grasa de la dieta, incluso se observó una inhibición de esta actividad (Suárez et al., 1995). Hay autores que consideran a la PK como la enzima clave del control del flujo glucolítico en condiciones de privación de alimento (Sheridan y Mommsen, 1991; Borrebaek y Christophersen, 2000), mientras que otros, como Collins y Anderson (1997), se inclinan por la PFK como la reguladora del flujo en estas circunstancias. Así, en situación de ayuno, la actividad PK descendió en dorada (Meton et al., 1999), perca dorada (Collins y Anderson (1997) y dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). Sin embargo, Sánchez-Muros (1990) en la trucha no observó que la PK se afectara por ello, ni tampoco la PFK, aduciendo que esto sería una consecuencia más de la pobre utilización de la glucosa por parte de estos animales. Por su parte, Furné et al. (2011) 29 Sergio García Mesa observaron tendencias opuestas de la actividad de esta enzima después de cinco días de ayuno en esturión y trucha; así, se produjo un aumento de la actividad glucolítica (HK y PK) en esturión mientras que en trucha disminuyó, indicando una menor capacidad de utilización de los carbohidratos por esta especie. La vuelta a la alimentación tras el ayuno tiene también un efecto claro en la actividad glucolítica, en concreto en la de PK, resultando en la mayoría de los casos en un incremento general de la misma (Collins y Anderson, 1997; Meton et al., 1999; Borrebaek y Christophesen, 2000; Pérez-Jiménez et al., 2011). La Lactato deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27) es responsable de la conversión de piruvato a lactato. El piruvato es convertido en acetil-coA y después en citrato en la mitocondria por la Citrato sintasa que es la primera enzima del ciclo de los ATC (Elcock y McCammon, 1996). I.4.1.1.B. VÍA DE LAS PENTOSAS FOSFATO. Otra vía en la que se produje la degradación de la glucosa, aparte de la glucolisis, es la vía de las pentosas fosfato. Esta es una ruta principalmente anabólica ya que produce compuestos muy importantes para los procesos de biosíntesis, como poder reductor (NADPH) para la síntesis lipídica y ribosa 5P para la síntesis de ácidos nucleicos. Las enzimas reguladoras de esta vía son la Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PDH, E.E.1.1.1.49) y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH, E.C.1.1.1.44) que catalizan dos pasos claves en la misma, la deshidrogenación de la glucosa y la hidrólisis del fosfogluconato producido hasta ribulosa 5-P. En las dos reacciones se genera NADPH. El hígado es el órgano donde se registra la mayor actividad G6PDH (Nagayama et al., 1972; Shimeno, 1982), por lo que los estudios en peces se han centrado fundamentalmente en este tejido (Barroso et al., 1994). En general, la actividad G6PDH del hígado de los peces aumenta con la disponibilidad de alimento (Storebakken et al., 1991) y el crecimiento (Walzem et al., 1991). Por el contrario, condiciones como el ayuno reducen claramente esta actividad en el hígado de trucha arcoíris (Barroso et al., 1999), dorada (Meton, 1999) y dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). La realimentación produce el efecto contrario, un aumento de actividad G6PDH en dorada (Bonamusa et al., 1989; Meton et al., 1999), trucha arcoíris (Barroso et al., 1999) y perca (Borrebaek y Christofersen, 2000), siendo este incremento dependiente del nivel de carbohidratos de la dieta (Meton et al., 1999; Borrebaek y Christofersen, 2000). Furné et al. (2011), no observaron cambios en esta actividad durante 60 días de ayuno en trucha y esturión. Sin embargo, con la realimentación aumentó la misma en trucha pero no en esturión. Las dietas ricas en hidratos de carbono activan el flujo de la vía de las pentosas fosfato, aumentando la energía disponible y produciendo así NADPH y esqueletos carbonados necesarios para los procesos de biosíntesis, aunque este hecho no esté muy bien documentado en peces dada su baja capacidad para metabolizar hidratos de carbono (Barroso et al., 2001). Las dietas 30 Introducción con contenido elevado en proteína aumentan la concentración intracelular de la enzima G6PDH (Barroso et al., 1994), mientras dietas con alto contenido en grasa provoca su disminución debido a la inhibición de la síntesis de lípidos en el hígado (Suárez et al., 1995; Shimeno et al., 1996). I.4.1.1.C. METABOLISMO DEL GLUCÓGENO El glucógeno es el principal hidrato de carbono de reserva en peces, se trata de un polímero de almacenamiento de glucosa en los animales y una fuente de ésta en momentos de necesidades metabólicas. La síntesis de glucógeno está catalizada por la enzima glucógeno sintetasa (GS, EC 2.4.1.11 .) que se activa cunado los niveles celulares de energía son altos. La enzima encargada de la glucogenolisis es la glucógeno fosforilasa (GP, EC 2.4.1.1), cuya función en peces es controvertida. A diferencia de mamíferos, donde las condiciones de ayuno estimulan la glucogenolisis para mantener constante la glucemia; en peces, tales como bacalao, carpa y rutilo, si las reserva de lípidos hepáticos son altas, son la primeras en utilizarse durante el ayuno (Black y Love, 1986; Méndez y Wieser, 1993). Los estudios de Machado et al. (1988) en bagre sapo (Rhamdia hilarii), Segner y Braunbeck (1988) en cacho (Leuciscus idus) y Shimeno et al. (1990) en juveniles de carpa establecen una disminución en los niveles de glucógeno y lípidos hepáticos en peces con 30 días de ayuno respecto a los valores registrados al inicio de la experimentación. Estudios posteriores han confirmado que las reservas de glucógeno hepático son el principal sustrato movilizado durante el ayuno en lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007), bagre (Rhamdia quelen, Barcellos et al., 2010) y trucha y esturión (Furné et al., 2011). Si bien estos resultados indicarían que existe una tendencia marcada en el descenso de tales constituyentes hepáticos, la proporción en que lo hacen varía según las especies, debido a una capacidad diferencial para priorizar la utilización de las distintas sustancias de reserva en condiciones de ayuno (Vigliano et al., 2002). I.4.1.1.D. GLUCONEOGÉNESIS Es la vía por la que se sintetiza glucosa a partir de diversos precursores, como piruvato, aminoácidos o glicerol. Se realiza fundamentalmente en hígado y riñón, que trabajarían coordinadamente manteniendo la homeostasis de la glucemia. La capacidad gluconeogénica de ambos órganos es similar, aunque el aporte parece mayor en hígado debido a su mayor tamaño. Esta ruta biosintética es paralela a la glucolisis y varios pasos coinciden ya que son reversibles y catalizados por la misma enzima. Sin embargo, hay tres pasos que son irreversibles, responsables del control de esta ruta: conversión de piruvato a fosfoenolpiruvato (PEP), catalizada por la Piruvato carboxilasa (PC, EC 6.4.1.1), previo paso de oxalacetato (OAA) a PEP catalizada por la Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK, EC 4.1.1.49); defosforilación de la 31 Sergio García Mesa fructosa bifosfato por la Fructosa bisfosfatasa (FBPasa, EC 3.1.3.11) y desfosforilación de glucosa 6 fosfato mediante la Glucosa 6 fosfatasa (G6Pasa, EC 3.1.3.9). La gluconeogénesis se ve afectada por las condiciones nutricionales; el ayuno y la realimentación ejercen un efecto claro sobre esta ruta y, en concreto, sobre la FBPasa. En general su actividad se eleva por condiciones de privación de alimento, descendiendo a los valores de partida con la realimentación (García-Salguero y Lupiáñez, 1988; Bonamusa et al., 1989, Meton, 1999). No obstante, en algunos casos, como en la perca, no se han detectado cambios en la actividad de esta enzima con el ayuno y la realimentación (Borrebaek y Christophersen, 2000); tampoco se han observado estos cambios en lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007), dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011) trucha y esturión (Furné et al., 2011). Dietas con alto contenido en proteínas provocan una elevación de la actividad de esta enzima (Sánchez-Muros, 1990; Metón et al., 1999; Pérez-Jiménez et al., 2009), mientras que dietas con alto contenido en hidratos de carbono ejercen un efecto contrario (Suárez et al., 1995, 2002 en anguila; Metón et al., 1999 en dorada), lo que supone un papel importante de los hidratos de carbono en el ahorro de proteína dietaria. No obstante, esto no se ha observado en algunas especies como dentón (Pérez-Jiménez et al., 2009). Las dietas altas en grasa producen un aumento de ácidos grasos plasmáticos cuya oxidación genera un aumento en el flujo gluconeogénicos hepático (Mommsen y Suárez, 1984), aunque este aumento no ha sido observado en trucha (Sánchez-Muros, 1990) ni en anguila (Suárez et al., 1995). Los precursores gluconeogénicos más frecuentes son el piruvato y el lactato (procedentes del metabolismo de carbohidratos), el glicerol (del metabolismo de ácidos grasos) y los aminoácidos gluconeogénicos: alanina, serina y glicina. La gluconeogénesis a partir de aminoácidos procedentes de la degradación de proteínas de la dieta incrementa las actividades de enzimas gluconeogénicas y disminuye las ligadas a la glucolisis. La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en hígado actúa normalmente en la transformación de lactato (procedente del músculo) a piruvato, que entra en la ruta gluconeogénica. En dentón se ha observado aumento de esta actividad enzimática durante el ayuno (Pérez-Jiménez et al., 2011), mientras que no se han observado modificaciones en trucha ni esturión también en ayunas (Furné et al., 2011). I.4.1.2. METBOLISMO PROTEICO. Las proteínas corporales sufren procesos continuos de síntesis y degradación, aunque este proceso parezca, en principio, un derroche, es fundamental, a largo plazo, para la renovación y reparación de las estructuras proteicas lo que proporciona longevidad a los organismos. Los aminoácidos libres pueden proceder de la absorción intestinal de proteínas, de interconversiones y síntesis de novo o de la degradación de proteínas corporales. Así mismo, pueden ser utilizados en procesos como la síntesis de proteínas corporales o de compuestos nitrogenados, fuente de carbono en el metabolismo intermediario o ser catabolizado con fines 32 Introducción energéticos. La tasa de síntesis proteica va a variar en función del tejido considerado. En peces, la mayor tasa de síntesis es alcanzada por el hígado, seguida de branquias, tubo digestivo, músculo rojo y músculo blanco. Las proteínas corporales no pueden ser almacenadas en grandes cantidades y deben ser renovadas continuamente por procesos de síntesis y degradación. El perfil del pool de aminoácidos libres cambia y su concentración depende del tejido (Carter et al., 1994), frecuencia y tiempo transcurrido tras la alimentación (Tantikitti y March, 1995) y salinidad (Auerswald et al., 1997) En los peces, a diferencia de vertebrados terrestres, la fuente preferencial de energía en condiciones aerobias es la oxidación de aminoácidos. Durante el catabolismo, el esqueleto carbonado de los aminoácidos puede ser empleado para la síntesis de otros compuestos nitrogenados, aunque mayoritariamente es oxidado en el ciclo de Krebs. La capacidad oxidativa más elevada de aminoácidos se da en aquellos tejidos más ricos en mitocondrias, tales como el hígado, branquias y músculo rojo. La primera etapa de la degradación de los aminoácidos es una transaminación que ocurre en el citoplasma celular: el aminoácido se transforma por desaminación en un αcetoácido acoplado a la síntesis concomitante del glutamato a partir de α-cetoglutarato. Las transaminasas más importantes son la Aspartato aminotransferasa, o glutamanto oxal-acetato transaminasa (GOT, EC 2.6.1.1) y la Alanina aminotransferasa (GPT o AAT, EC 2.6.1.2). El glutamato obtenido va a regenerar el α-cetoglutarato liberando ión amonio por acción de la enzima Glutamato deshidrogenasa (GDH, EC 1.4.1.2.) de origen mitocondrial. Estas enzimas se acoplan en lo que se conoce como reacción de transdeaminación, que juega un papel central en el metabolismo de aminoácidos procurando la ruta principal para la excreción del nitrógeno de estos, por lo que se suelen utilizar como indicadores de la utilización proteica. El glutamato es transaminado por numerosos aminoácidos, siendo el hígado el lugar esencial en que se utilizan con fines energéticos. Una vez eliminado el nitrógeno, el esqueleto carbonado puede entrar en la gluconeogénesis vía OAA o bien ser oxidado en el CAT. Los aminoácidos entran en el ciclo a diferentes niveles. El grupo amonio puede participar en las reacciones de transaminación, pero en gran parte es liberado por reacciones de desaminación antes de ser eliminado, siendo por una desaminación directa o transfiriendo el grupo amino a un aceptor común que será desaminado. Esta segunda vía parece ser la dominante, ya que las desaminaciones directas requieren enzimas muy específicas. La regulación nutricional del metabolismo hepático de aminoácidos ha sido estudiada por un amplio número de investigadores (Walton 1985; Cowey y Walton 1989; Dabrowski y Guderley, 2002). 33 Sergio García Mesa Los niveles de proteína dietaria parecen ejercer poco efecto sobre el catabolismo de aminoácidos, mientras que hay una relativamente buena respuesta de las enzimas a la ingesta de aminoácidos. La falta de control por parte de la proteína dietaria contrasta con lo observado en mamíferos y es la principal causa de la adaptación de los teleósteos a dietas con alto contenido en proteína (Kaushik y Seiliez, 2010). Se ha detectado actividad GOT y GPT en varios tejidos de peces, siendo el hígado donde se encuentran en mayor concentración (Cowey y Walton, 1989). El contenido proteico de la dieta y el ayuno son las condiciones nutricionales que más afectan a estas enzimas. Se ha observado un aumento de su actividad con dietas altas en proteínas en truchas (Sánchez-Muros et al., 1998), dorada (Metón et al., 1999), lubina (Pérez- Jiménez et al., 2007) y dentón (PérezJiménez et al., 2009). En situaciones de ayuno se han obtenido resultados dispares; en peces tan diferentes como la trucha y el múgil, se ha comprobado que la situación de ayuno prolongado tras una alimentación rica en proteínas, produce una degradación de las proteínas corporales (Alexis y Papaparaskeva-Papoustsoglou, 1986; Lupiáñez et al., 1989; Pérez-Jiménez et al., 2007). En otros trabajos se ha descrito un incremento o ausencia de cambios de estas actividades durante el ayuno (Moon y Jonhston, 1981; Kim et al., 1992; Fynn-Atkins et al., 1995; Pérez-Jiménez et al., 2007). En dorada, por el contrario, la GPT disminuyó su actividad en situaciones de ayuno, aunque sí se observó un incremento de la GOT, sugiriendo que, en esta especie, esta última enzima posee un papel más importante que la anterior en la movilización proteica y el uso de aminoácidos (Metón et al., 1999). Estos resultados también se observaron en dentón (PérezJiménez et al., 2011) lo que se interpretó como un efecto protector de las proteínas musculares durante el ayuno prolongado. I.4.1.3. METABOLISMO LIPÍDICO Los lípidos juegan un papel fundamental en el suministro de energía para los peces. Así, la adición de lípidos a la dieta contribuye a una mejor utilización de la proteína reflejada en unas mejoras en el crecimiento de los animales y en los índices de utilización proteica (De la Higuera et al., 1977). También se produce una disminución de la tasa de excreción de amoniaco y del consumo de oxígeno (Cho et al., 1982). La síntesis de ácidos grasos en peces tiene lugar esencialmente en el hígado por medio del complejo ácido graso sintasa (AGS) y está regulada por diversos factores como el estado nutricional (Lin et al., 1977a; Álvarez et al., 2000), el contenido en energía de la dieta (Kolditz et al., 2008), la constitución genética (Skiba-Cassy et al., 2009), procesos de migración (Sheridan et al., 1985) y hormonas (Higgs et al., 2009). Otra enzima importante en la síntesis de lípidos es la G6PDH, que proporciona el NADPH necesario para la síntesis de lípidos por la AGS (Richard et al., 2006). 34 Introducción En este sentido, Lin et al., (1977a, b) comprobaron que dietas con alto contenido glucídico incrementaban la actividad de las enzimas implicados en la síntesis de ácidos grasos y de la vía de las pentosas fosfato (AGS ; Citrato sintasa (CS, EC 4.1.3.7); Enzima málico (EM, EC 1.1.1.40), G6PDH, 6PGDH) en hígado de salmón (Oncorhynchus kisutch), mientras que el ayuno y las dietas de alto contenido en ácidos grasos provocaban un descenso de la actividad de estas enzimas lipogénicas. Estos resultados coinciden con los anteriores en especies como seriola (Shimeno et al., 1981), trucha (Jürss et al., 1985), lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007) y dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). La EM disminuyó significativamente en trucha después de 5 días de ayuno mientras que en esturión aumentó durante los primeros días para luego disminuir (Furné et al., 2011). La realimentación provocó un aumento de la actividades de esta enzima en las dos especies y también en dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). También Skiba-Cassy et al., (2009) observaron un aumento en la expresión de las enzimas AGS y G6PDH después de la realimentación en trucha y también que era mayor en truchas seleccionadas para ser gruesas que las seleccionadas para ser delgadas (Skiba-Cassy et al., 2009). También se ha observado un aumento del ARN mensajero de estas dos enzimas cuando los peces se alimentan con dietas suplementadas con carbohidratos (Panserat et al., 2009). La degradación de los lípidos, y especialmente de los ácidos grasos, es una fuente importante de energía metabólica en peces, especialmente marinos. La energía se obtiene en forma de ATP en la mitocondria por el proceso de β-oxidación originando moléculas de acetilCoA que entra a formar parte de del ciclo de Krebs para la obtención de energía. La enzima clave en este proceso es la β-hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa (HOAD, EC 1.1.1.35). Además de como precursor en la síntesis de colesterol y otros esteroides, el acetil-CoA se utiliza para la formación de cuerpos cetónicos en el hígado (acetoacetato, β-hidroxibutirato y acetona). La enzima implicada en la síntesis de estos compuestos es la Acetoacetil-CoA tiolasa (EC 2.3.1.9). Los cuerpos cetónicos sirven como importantes combustibles metabólicos en tejidos periféricos bajo situaciones excepcionales como por ejemplo el ayuno (Soengas et al., 1996a, 1998). Es bien conocido que el uso de lípidos hepáticos como fuente de energía durante el ayuno depende de la especie, los tejidos de reserva lipídica y la estrategia seguida para movilizar otras reservas como los carbohidratos. El incremento sérico de los ácidos grasos libres junto con un descenso de los triglicéridos indicaría un aumento de la lipólisis en los tejidos (Machado et al., 1988; Shimeno et al., 1990). La actividad HOAD mostró una relativamente alta actividad, acompañando a una reducción del contenido de lípidos hepáticos, durante el ayuno en algunas especies como el esturión (Furné et al., 2011) y el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011), reflejando el importante papel que tienen los almacenes lipídicos en el suministro de energía durante el ayuno prolongado para estas especies, como ha sido observado previamente en otras especies como la lubina (Gutiérrez et al., 1991), la dorada (Grigorakis y Alexis, 2005) y la trucha (Furné et al., 2011). 35 Sergio García Mesa Como resultado de la degradación de lípidos también se produce un aumento de los niveles de glicerol, sustrato que puede usarse para la vía gluconeogénica, glucolítica o de síntesis de ácidos grasos en función de la situación nutricional de los peces. En este sentido, el glicerol derivado de la hidrólisis de los triglicéridos parece ser activamente usado como sustrato gluconeogénico. La enzima Glicerol kinasa (GyK, EC 2.7.1.30) es importante en la interfase del metabolismo de carbohidratos y lípidos; cataliza la interconversión de glicerol a glicerol 3fosfato, necesario para la síntesis de triglicéridos (Dipple et al., 2001). La vía alternativa sería el uso del glicerol con fines energéticos. Bajo condiciones de ayuno los ácidos grasos oxidados en el hepatocito no pueden ingresar al ciclo de Krebs para su completa oxidación ya que uno de sus metabolitos intermediarios - el oxalacetato - es utilizado fundamentalmente en el proceso de gluconeogénesis, lo que produce un descenso en la tasa de oxidación de todos los intermediarios del ciclo y también del Acetil-CoA. En ese caso, la producción y exportación de cuerpos cetónicos libera coenzima A, lo que permite continuar la oxidación de ácidos grasos. Esto coincide con los datos aportados por Harmon y Sheridan, (1992) y Soengas et al. (1996b) quienes observaron un aumento en la actividad cetogénica del hígado que frecuentemente se asocia a los procesos gluconeogénicos hepáticos en la mayoría de los vertebrados (Morata et al., 1982). I.4.2. Metabolismo muscular Aunque en el músculo se siguen las mismas vía metabólicas que a nivel hepático, la regulación es diferente. El metabolismo de los carbohidratos en el músculo tiene como objetivo la producción de ATP para llevar a cabo la contracción muscular, la síntesis proteica o el transporte iónico y no tanto para la generación de intermediarios biosintéticos como ocurre a nivel hepático. En músculo blanco, ante una situación de ejercicio repentino las fibras glucolíticas pueden trabajar hasta varios minutos con una aporte mínimo desde las reservas corporales ya que obtienen el ATP, necesario para la contracción muscular, de la fosfocreatina. Cuando los niveles de fosfocreatina disminuyen, comienza la glucolisis anaerobia para producir ATP (Dobson et al., 1987). Esta vía metabólica conlleva la disminución de las reservas de glucógeno muscular lo que conduce a la formación de lactato. La capacidad aeróbica y anaeróbica del tejido puede ser caracterizada determinando la actividad de las enzimas limitantes implicadas en las diferentes rutas metabólicas. La enzima Citrato sintasa es una enzima clave en el CAT y se considera indicadora de la capacidad aeróbica (Rajotte y Couture, 2002; Lemos et al., 2003). Alternativamente, la β-hidroxiacil coenzima A deshidrogenasa puede ser indicativa de la capacidad lipolítica de los tejidos (Londraville y Duvall, 2002; Rajotte y Couture, 2002). Estas enzimas están implicadas en el metabolismo aeróbico, en 36 Introducción cambio algunas actividades anaeróbicas pueden jugar un papel importante en la actividad natatoria de rutina (Moyes et al., 1992; Rajotte y Couture, 2002). Los almacenes lipídicos juegan un papel clave en el crecimiento y la supervivencia de los peces (Pratt y Fox, 2002; Biro et al., 2004). Mientras que los carbohidratos y las proteínas se pueden utilizar durante la actividad mantenida, los lípidos son la fuente principal de combustible durante la natación aeróbica y, por lo tanto, son principalmente oxidados por el músculo rojo. Esta observación se ve apoyada por una gran capacidad oxidativa mitocondrial en el músculo rojo de las especies más activas (Moyes et al., 1992; Moyes y West, 1995). Los triglicéridos se almacenan principalmente en el tejido hepático, muscular y visceral, y se transportan en la circulación como ácidos grasos libres. Los salmónidos metabolizan preferentemente los lípidos durante los recorridos migratorios de forma que el catabolismo de proteínas sólo comienza después de que los almacenes de lípidos se han agotado (Moyes y West, 1995; Mommsen et al., 1999; Guderley, 2004). Esto se ha observado en otras especies de peces cuando se someten a condiciones de ayuno como la dorada (Grigorakis y Alexis, 2005) o el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2011). A diferencia de los animales terrestres, que simplemente pierden peso cuando ayunan, los peces, además de perder peso, aumentan la hidratación de los tejidos, lo que puede ayudar a mantener su forma a un bajo coste energético (Guderley, 2004). En músculo blanco, las enzimas glucolíticas y mitocondriales disminuyen durante el ayuno, mientras que las proteasas lisosomales se mantienen. Los aminoácidos de las proteínas musculares sirven como sustratos para la gluconeogénesis hepática. En esta situación, la hidrólisis de las proteínas musculares causa una acumulación de solutos y retención de agua que contribuye a la hidratación (Lambert y Dutil, 1997), con el consecuente mantenimiento del peso del filete. Hay una especificidad en la respuesta a condiciones nutricionales entre los distintos tipos de fibras musculares, las fibras blancas son más susceptibles que las rojas (Guderley, 2004). En ambos tipos de fibras el ayuno afecta a las actividades de enzimas mitocondriales del bacalao (Martínez et al., 2003), mientras que las proteasas lisosomales y actividades de enzimas antioxidantes cambian poco (Guderley et al., 2003). I.5. ESTRÉS OXIDATIVO. I.5.1. Aspectos generales del estrés oxidativo. La dependencia del oxígeno de la vida aerobia, trae consigo la formación de especies reactivas del oxígeno que pueden interactuar con biomoléculas esenciales como lípidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos, conduciendo a alteraciones en su estructura y 37 Sergio García Mesa función. Para tratar de neutralizar estos efectos tóxicos colaterales, los sistemas biológicos poseen mecanismos de defensa antioxidante, enzimáticos y no enzimáticos, que son capaces de controlar la presencia y los efectos de estos productos. Cuando los agentes oxidantes superan a los mecanismos antioxidantes celulares se genera un situación de estrés oxidativo (Sies, 1986). Esta situación puede estar influenciada por múltiples factores, como el contacto con xenobióticos y agentes contaminantes, factores nutricionales y ambientales. Por otra parte, las situaciones de estrés clásico producen alteraciones en los mecanismos de respuesta antioxidante (Davies, 2000; George et al., 2000), promoviendo la activación de vías catabólicas con fines energéticos, lo que produciría un aumento de la tasa metabólica y de la producción de radicales libres, desembocando en último término en un equilibrio de los sistemas antioxidantes (Ross et al., 2001). I.5.2. Radicales libres Los radicales libres se definen como especies químicas, moléculas o átomos, capaces de existir de forma independiente, que contienen uno o más electrones desapareados en su último orbital electrónico (Halliwell et al., 1992; Cheeseman et al., 1993). Su carga puede ser negativa, positiva o neutra. La existencia de electrones desapareados le proporciona una gran reactividad puesto que tienden a ganar o ceder electrones para alcanzar configuraciones más estables, lo que determina que tengan una vida media muy corta. La presencia de radicales libres genera una cadena de reacciones de transferencia de electrones con moléculas vecinas que, a su vez, se convierten en radicales libres. Por otra parte, existen otras moléculas denominadas especies reactivas que, si bien no presentan electrones desapareados, se caracterizan por poseer un electrón en un orbital de mayor contenido energético que el correspondiente a su estado fundamental, lo que puede llegar a favorecer la aparición de radicales libres. En general, las especies reactivas más importantes son las derivadas del oxígeno, conocidas como especies de oxígeno reactivo (ROS: reactive oxigen species). Junto a éstas, también podemos encontrar las derivadas de compuestos nitrogenados, denominados especies de nitrógeno reactivo (RNS) (Halliwell y Gutteridge, 2000). Las fuentes de radicales libres y especies reactivas son numerosas y variadas, pudiendo diferenciarse en endógenas y exógenas. Entre las primeras, se encuentran la cadena de transporte mitocondrial, la activación catalítica de diversas enzimas del metabolismo intermediario celular, etc.; entre las exógenas destacan los xenobióticos, radiaciones ionizantes, fármacos, ozono e hiperoxia. 38 Introducción Entre las ROS, las mejor caracterizadas son: Radical superóxido (O2 -) Se trata de un radical libre cargado formado como consecuencia de una reducción monovalente o monoeléctrica del oxígeno molecular. O2 + e- O2 - Peróxido de hidrógeno (H2O2) Se origina por una reacción de dismutación del anión superóxido por la actuación del enzima superóxido dismutasa (SOD) o directamente a través de la reducción bivalente del oxígeno. 2 O2 - + 2 H O2 + 2 H2O Su actividad química es limitada, aunque no es un radical libre en sentido estricto, puesto que no presenta electrones desapareados, su importancia se debe a su capacidad para atravesar las membranas biológicas e intervenir en reacciones de síntesis de otros radicales debido a la debilidad de su enlace entre los átomos de oxígeno. Radical hidroxilo (·OH-) Es un radical muy reactivo, presenta un electrón despareado lo que le confiere la capacidad de captar electrones de otras moléculas. Es el principal responsable directo de la oxidación de biomoléculas. Oxígeno singlete (1O2) No se trata exactamente de un radical libre, pero su capacidad para captar dos electrones antiparalelos le confiere un carácter oxidante y de gran reactividad. Ácido hipocloroso / ión hipoclorito (OHCl / OCl-) No se pueden considerar radicales libres en sí, pero tienen una alta capacidad de interacción con otros radicales libres así como para oxidar otras moléculas. 39 Sergio García Mesa I.5.3. Origen de los radicales libres. La aparición de especies de oxígeno reactivo se asocia a diferentes reacciones (Beckman y Ames, 1998; Halliwell y Gutteridge, 2000): - Reacciones electromagnéticas o fotoquímicas que pueden dar lugar a ·OH- y 1O2. - Reacciones endógenas de dismutación (H2O2) - Reacciones enzimáticas como las catalizadas por la xantina oxidasa y la urato oxidasa que intervienen en las vías de degradación de purinas o la acil-CoA oxidasa (asociada a la βoxidación peroxisomal). - Reacciones asociadas a la actividad de células fagocíticas que generan O2- por la acción de la NADPH oxidasa con intervención del NADPH. - En el proceso de unión del O2 a la hemoglobina se forma el intermediario oxihemoglobina que en ocasiones puede liberar O2 -, quedando la hemoglobina como metahemoglobina, estado no funcional reversible. - La cadena de transporte electrónico mitocondrial es la principal fuente de radicales libres generados de forma accidental bajo condiciones fisiológicas normales. La cadena de transporte electrónico nuclear es más nociva debido a su proximidad al material genético. - El citocromo P450 es un sistema localizado en el retículo endoplasmático que tiene como objetivo la detoxificación de compuestos xenobióticos, como medicamentos o etanol, mediante reacciones de oxidación utilizando O2 con la subsiguiente generación de radicales libres. I.5.4. Mecanismos de defensas antioxidantes. Se entiende por antioxidante aquella sustancia que inhibe o retarda significativamente la oxidación de un sustrato (Halliwell y Guteridge, 2000). Los mecanismos de los sistemas antioxidantes actúan suprimiendo la generación de radicales libres, neutralizándolos y reparando los daños producidos (Peña de la A et al., 1997). Se trata de moléculas de origen endógeno o exógeno. I.5.4.1. ENZIMAS ANTIOXIDANTES I.5.4.1.A. Superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1) Se trata un grupo de metaloproteínas que catalizan la dismutación del radical superóxido (O2 ) que inicia la cascada de producción de radicales del oxígeno, produciéndose peróxido de hidrógeno y oxígeno. - Se han identificado tres tipos de SODs, según el metal que forme su centro activo: Cu, Mn o Fe. Para la identificación de las distintas clases de SOD se utilizan inhibidores específicos, la 40 Introducción CuZn-SOD es inhibida por cianuro, H2O2 y dietiltiocarbamato, mientras que la Mn-SOD y Fe-SOD se inhiben por cloroformo y metanol, además de H2O2 para Fe-SOD. Es importante destacar que una elevada actividad SOD, que no se encuentra acompañada de un incremento en las actividades glutation reductasa y catalasa, conlleva un aumento en la producción de H2O2, con los consecuentes posibles efectos tóxicos (PérezJiménez, 2008). I.5.4.1.B. CATALASA (CAT; EC 1.11.1.6) Es una enzima ferriporfirínica constituida por cuatro subunidades, cada una de ellas con un grupo hemo en su centro activo. Posee una doble función: cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno y, por otra parte, produce la oxidación de compuestos reducidos tales como metanol, etanol, ácido fórmico y fenoles. Esta enzima se encuentra prácticamente en todos los tejidos animales, presentando concentraciones y actividades más altas en hígado y eritrocitos. Esta enzima está localizada esencialmente en los peroxisomas. La actividad catalasa se inhibe principalmente por cianuro, azida y aminotriazol. I.5.4.1.C. GLUTATION PEROXIDASA (GPX; EC 1.11.1.9) Juega un papel importante en la eliminación H2O2 en situaciones fisiológicas, además es capaz de reaccionar con hidroperóxidos. Se diferencian dos tipos de GPX, las seleniodependientes y las selenio-independientes. La GPX selenio-dependiente, a diferencia de la catalasa, requiere la presencia de glutation reducido (GSH) para descomponer el H2O2. Se ha determinado su presencia en la mayoría de los tejidos, teniendo más importancia en el hígado y corazón; se localiza fundamentalmente en el citosol, aunque también se ha encontrado, en menor cantidad, en mitocondrias y retículo endoplasmático. La GPX selenio-independiente presenta una menor afinidad por el H2O2, de hecho se ha sugerido como una isoenzima de la glutation transferasa (GST) (Carmagnol et al., 1983); se halla en el citosol, mitocondrias y cualquier fracción celular que contenga membrana. Puesto que tanto la CAT como la GPX actúan sobre el H2O2, el que su actividad varíe va a estar determinado por la localización dentro de la célula: la catalasa se sitúa mayoritariamente en los peroxisomas, mientras que la glutation peroxidasa se ubica fundamentalmente en el citosol (Halliwell y Gutteridge, 2000). Cohen y Hochstein, (1963) demostraron que en condiciones fisiológicas la GPX tiene un papel más importante que la catalasa, mientras que a altas concentraciones de H2O2 la actividad catalasa aumenta considerablemente. 41 Sergio García Mesa I.5.4.1.D. GLUTATION REDUCTASA (GR; E. 1.6.4.2) Es una flavoproteína que presenta como grupo prostético el FAD y que cataliza la reducción del glutation oxidado (GSSG) usando NADPH como donador de H, el cual proviene de la vía de las pentosas fosfato. La GR es responsable de mantener la concentración intracelular de glutation reducido (GSH) (Staal et al., 1969; Beutler, 1969). Tiene una distribución similar a la glutation peroxidasa, es decir, se localiza principalmente en el citosol y, en menor cantidad, en mitocondrias y retículo endoplasmático. Figura I.5.4.1. Principales mecanismos de detoxificación en la célula. I.5.4.1.E. GLUTATION TRANSFERASA (GST; EC 2.5.1.18) La GST es una enzima que juega un importante papel en la detoxificación y excreción de xenobióticos mediante la formación de conjugados con el glutation promoviendo su posterior eliminación del organismo. La forma citosólica se encarga de la eliminación de xenobióticos y la localizada en el retículo endoplasmático de la eliminación de tóxicos endógenos. El proceso de biotransformación de los compuestos xenobióticos, consta de dos fases: la primera es un conjunto de reacciones de oxidación que preparan a los tóxicos para que puedan transformarse por efecto de la segunda que comprende una serie de reacciones de conjugación con metabolitos endógenos. 42 Introducción I.5.4.1.F. DT-DIAFORASA (NAD(P)H-QUINONA OXIDOREDUCTASA) (NQO1; EC 1.6.99.2) También conocida como NAD(P)H:quinona oxido reductasa, es una flavoproteína citosólica, con FSD como grupo prostético. Parece tener múltiples funciones fisiológicas, pues presenta especificidad para un amplio número de sustratos debido a la gran plasticidad del sitio activo (Faig et al., 2001), y así aparece implicada como sistema de detoxificación. La DTdiaforasa juega un papel en el metabolismo endógeno de las quinonas, éstas tienen largas colas hidrofóbicas y en su estado reducido (hidroquinonas) protegen a las membranas celulares frente al daño por peroxidación lipídica, contrarrestando así los efectos prooxidantes del ciclo redox. La DT diaforasa se caracteriza por su capacidad para utilizar NADH y NADPH como donador de electrones (Daniel, 1993). Esto rompe el ciclo redox prooxidante previniendo la formación de radicales superóxido dependiente de la quinonas y que a su vez puede llevar a la formación de peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo. I.5.4.2. SUSTANCIAS ANTIOXIDANTES Son moléculas que ejercen un papel protector frente a la oxidación, siendo consumidas durante esta acción, por lo que deben ser reemplazadas, fundamentalmente a través del aporte dietario (Felton, 1995; Halliwell y Gutteridge, 2000). Estas moléculas antioxidantes pueden clasificarse como hidrosolubles ó liposolubles. I.5.4.2.A. ANTIOXIDANTES HIDROSOLUBLES Glutation: es un tripétido formado por glutamina, cisteína y glicina. El grupo sulfhidrilo (–SH) de la cisteína es el que le confiere la capacidad antioxidante, siendo capaz de pasar de forma reducida (GSH) a forma oxidada (GSSG), transfiriendo el poder reductor a los radicales libres con el fin de detener la cascada de oxidación. Además es sustrato de enzimas antioxidantes como la glutation peroxidasa y dehidroascorbato reductasa, para la conversión de dehidroascorbato a ascorbato (Halliwell y Gutteridge, 2000). Ácido úrico: es un producto de la oxidación de hipoxantina y xantina por acción de la xantina oxidasa y xantina deshidrogenasa (XOD y XDH). Capta especies de oxígeno reactivo del tipo ·OH-, 1O2, RO2· (peroxilo) y OHCl/OCl-, originando productos menos tóxicos. Proteínas captadoras de iones metálicos: entre estas proteínas encontramos las captadoras de hierro, ferritina o transferrina; captadoras de iones cobre como la ceruloplasmina, albúmina e histidina. La metalotioneínas, catecolaminas y glucagón están asociadas al mantenimiento de la homeostasis del cobre y zinc, la detoxificación de metales no esenciales como cadmio y mercurio, y la captación de ·OH- y 1O2. Vitamina C o ácido ascórbico (AA): es capaz de pasar de su forma reducida a su forma oxidada por dos procesos oxidativos monovalentes consecutivos. Actúa como reductor de 43 Sergio García Mesa moléculas como ·OH- , HO2·, O2·-. La enzima dehidroascorbato reductasa recupera el AA con la ayuda del glutation. I.5.4.2.B. ANTIOXIDANTES LIPOSOLUBLES Ubiquinonas y β-carotenos: la ubiquinona o coenzima Q, además de formar parte de la cadena de transporte electrónico, en su forma reducida actúa como un potente antioxidante en las membranas (Cadenas, 1995). Los β-carotenos son derivados del ácido retinoico o vitamina A, los cuales reaccionan con los radicales peroxilo y alcoxilo, interrumpiendo los procesos de peroxidación lipídica y quelan al 1O2 (Halliwell y Gutteridge, 2000). Vitamina E o tocoferol: su estructura química es la de un compuesto constituido por un grupo hidroxicromona al que se le une una cadena de fitilo. Se conocen al menos ocho isoformas, que pueden dividirse en dos grupos diferenciados en el grado de saturación de su cadena fitilo. El α-tocoferol es el biológicamente más activo. Destaca su capacidad para la eliminación del 1O2, entre otros. Su papel evitando la propagación de la peroxidación lipídica es altamente conocida. Existe un efecto sinérgico entre el tocoferol y el ácido ascórbico, puesto que este último interviene en la regeneración del tocoferol oxidado (Halliwell y Gutteridge, 2000). I.5.5. Daños oxidativos causados a biomoléculas. I.5.5.1. HIDRATOS DE CARBONO Los hidratos de carbono son altamente susceptibles a los radicales libres, produciéndose radicales de azúcares por la reacción con el ·OH-. Los monosacáridos, en condiciones normales, son capaces de reducir el O2, autooxidándose y formando cetoaldehídos e intermediarios oxidantes como O2 -, autooxidación catalizada por metales de transición. La glucosa es capaz de unirse a los grupos amino terminal, iniciando su glicación y generando productos que son extremadamente reactivos y alteran la estructura espacial proteica y su funcionalidad. Tanto la autoxidación como la producción de estos productos están íntimamente relacionados a través de la interacción con metales de transición. I.5.5.2. PROTEÍNAS Los radicales libres son capaces de actuar sobre residuos aminoacídicos de proteínas originando entrecruzamientos catalíticos, cambios conformacionales y pérdida de función. Este daño proteico es rápidamente reparado por la actuación de proteasas, las cuales evitan la acumulación de proteínas dañadas, manteniendo el balance entre daño y reparación. 44 Introducción I.5.5.3. ÁCIDOS NUCLEICOS ·OH- y H2O2 son los principales radicales libres implicados en el daño sobre el ADN. La incidencia de estos agentes va a provocar alteraciones en el material genético, como son aumento de mutaciones, entrecruzamientos, roturas de cromátidas o pérdidas de fragmentos cromosómicos. Se ha observado en varias especies, que situaciones de estrés oxidativo da lugar a un acortamiento de la longitud relativa de los telómeros, pudiendo considerarse como un bioindicador del estrés a largo plazo (von Zglinicki, 2002; Monaghan, 2010). Las alteraciones más frecuentes en el material genético son la fragmentación de la cromátidas y las modificaciones oxidativas en las bases nitrogenadas púricas y pirimidínicas. I.5.5.4. LÍPIDOS La peroxidación lipídica es una de las consecuencias del estrés oxidativo, entendiéndose como la oxidación de ácidos grasos en un proceso autocatalítico e incontrolable que da lugar a la formación de hidroperóxidos de estos ácidos grasos y una serie de productos secundarios, incluyendo aldehídos (particularmente malondialdehído) cetonas y alcoholes. Todos los ácidos grasos del organismo son susceptibles a la peroxidación lipídica, pero se van a alterar con más facilidad los insaturados, entre los que encuentran los que son más apreciados en nuestra dieta, n3 y n6 HUFA. La oxidación de los HUFA y PUFA en las biomembranas puede resultar en alteraciones funcionales y patológicas. Los peces, cuyo contenido en n3 HUFA es particularmente alto, son altamente susceptibles al daño oxidativo, por lo tanto resulta fundamental una alta protección antioxidante para el bienestar fisiológico de los animales. El organismo posee dos mecanismos de defensa frente al fenómeno de la peroxidación lipídica: captación de los radicales libres y un sistema enzimático que permite la destrucción de ciertos compuestos intermediarios. Los secuestradores de los radicales libres son antioxidantes como la vitamina A y, sobre todo, los tocoferoles. El ácido ascórbico suele estar unido a este grupo; de hecho es un secuestrador hidrosoluble del O2, mientras que el tocoferol es un donador de protones particularmente activo en medio liposoluble. En el segundo mecanismo de defensa, la primera enzima implicada es la superóxido dismutasa (SOD), que dismuta el anión superóxido en H2O2. Este compuesto, altamente tóxico para la célula, debe ser reducido por la catalasa que los transforma en agua y oxígeno (Corraze, 2004). Los efectos negativos de la peroxidación de los lípidos son múltiples. En los peces puede provocar una disminución de la actividad de enzimas como amilasa, lipasa o tripsina. A nivel metabólico también pueden aparecer alteraciones como esteatosis hepática o inhibición de ciertas enzimas del ciclo de Krebs. Sin embargo, los síntomas que se encuentran con mayor frecuencia son una carencia de vitamina E que puede haberse empleado completamente en las reacciones de destrucción de radicales libres. Entonces en los peces se produce una distrofia muscular y lisis de los hematíes. Para el consumidor, a parte de la distrofia muscular, que hace 45 Sergio García Mesa que la textura de la carne sea inaceptable, es probable una disminución en la coloración de la carne y alteración de su sabor. A todo esto se añade una disminución de la calidad dietética debida a la destrucción parcial de los ácidos grasos más valorados para la salud humana y la de vitamina E (Corraze, 2004). I.5.5. Implicaciones del estrés oxidativo en el cultivo de peces. Estamos asistiendo a un incremento notable del interés por el estudio de los mecanismos implicados en la defensa frente al estrés oxidativo en peces tanto por el interés de los datos que pueden aportar para el estudio de la evolución filogenética de estos importantísimos mecanismos de protección como por su aplicación en la detección de diversas fuentes de contaminación ambiental (Rabie et al., 1972; Smith, 1976; Radi et al., 1985a, b; Roberts et al., 1987; Di Giulio et al., 1989; Nakano et al., 1992; Filho et al., 1993; Filho y Boveris, 1993; Ross et al., 2001; Basha y Rani, 2003; Berntssen et al., 2003; Avci et al., 2005; MartínezÁlvarez et al., 2005). Los tejidos de peces contienen gran cantidad de lípidos insaturados (PUFAs), esenciales para la funcionalidad de las membranas celulares. Una gran cantidad de PUFAs implica un elevado riesgo de estrés oxidativo, ya que los lípidos son las principales dianas de ROS (Abele y Puntarulo, 2004; Martínez-Álvarez et al., 2005). Entre las circunstancias que pueden alterar el equilibrio ataque/defensa frente al estrés oxidativo las relacionadas con la alimentación (composición de la dieta) y/o su restricción (alimentación/ayuno) están recibiendo una amplia atención (Guderley et al, 2003; Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009a; Bayir et al., 2010). I.6. CALIDAD DE MÚSCULO I.6.1. Concepto de calidad en peces. Es difícil definir la “calidad” en peces puesto que existe una amplia variedad de preferencias regionales, actitudes de los consumidores y métodos de consumo, características de la propia especie y otros factores (García-García et al., 2008). Estudios recientes han demostrado que atributos como el sabor, el olor, la apariencia, etc. continúan siendo claves en la decisión del consumidor a la hora de adquirir el pescado. De todos los factores que definen la calidad del pescado, uno de los más valorados son las propiedades nutritivas, ya que la actitud del consumidor se dirige hacia el consumo de pescado sano y seguro (Pieniak et al., 2009). Normalmente el consumidor espera que las características sensoriales y nutritivas de los peces cultivados sean similares a los de vida libre y sin embargo, aquellos suelen ser menos valorados 46 Introducción (Kaiser y Stead, 2002, Rogdakis et al., 2011). Es, por lo tanto, tarea del acuicultor proporcionar un producto lo más parecido posible al obtenido de la pesca tradicional y, en este sentido, existen múltiples estudios que proporcionan información sobre la forma en que la composición de la dieta, por ejemplo, puede influir en los atributos sensoriales de los peces cultivados (Hardy y Lee, 2010). Aspectos como la pérdida de sabor y el aumento en el contenido graso son algunos de los factores que pueden perjudicar la aceptación de los peces cultivados. Una serie de estudios han comparado aspectos sensoriales y nutricionales entre las principales especies cultivadas y sus coespecíficos de origen silvestre (Periago et al., 2005; Grigorakis, 2007; Sveinsdóttir et al., 2009). Estas investigaciones han puesto de manifiesto que los peces cultivados suelen ser más blandos y suaves en cuanto a textura, tener mayores depósitos de grasa perivisceral y menos sabor que los de vida libre (Grigorakis et al., 2003; Grigorakis, 2007). También se ha estudiado la influencia de las condiciones de cultivo (salinidad, temperatura, densidad, tipo de alimentación, procedimiento de sacrificio) y se han relacionado con los criterios de calidad (Calabretti et al., 2003; Eroldogan et al., 2004; Bagni et al., 2007; Le Vay et al., 2007). Otro de los atributos de calidad más apreciado por los consumidores es la “frescura”, determinada por varios parámetros como aroma, sabor, textura y apariencia, valorados a través de métodos sensoriales o instrumentales. Esta frescura comienza a disminuir tan pronto como el pez es sacrificado debido a procesos biológicos, químicos y físicos, haciendo del pescado uno de los alimentos más perecederos, con un tiempo medio de vida en fresco y congelado mucho más corto que el de otros alimentos. Es necesaria, por tanto, una buena coordinación de todos los profesionales implicados en la obtención y comercialización del producto con objeto de llevar al mercado el pescado con la suficiente rapidez y en unas condiciones de almacenamiento que garanticen su calidad. I.6.2. Calidad nutricional. El pescado y los productos derivados ocupan un lugar destacado a la hora de conseguir dietas equilibradas y saludables. En general, los pescados aportan una buena cantidad de proteínas de alto valor biológico, vitaminas tanto hidrosolubles como liposolubles, elementos minerales y un contenido calórico relativamente bajo. Además, constituyen una excelente fuente de ácidos grasos poliinsaturados de la serie n3, cuyo consumo se ha asociado con efectos beneficiosos para la salud. La composición química del pescado varía entre especies y, dentro de una misma especie, depende de aspectos fisiológicos (edad, peso corporal, época reproductora-desove, intensidad de la natación) y ambientales (estación, temperatura, ciclos alimentarios). La composición del alimento, el ambiente, el tamaño y varios rasgos genéticos, afectan la composición y la calidad del pescado de acuicultura. 47 Sergio García Mesa Como se ha indicado antes, los lípidos del pescado se caracterizan por presentar una elevada proporción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, especialmente de la serie n3. Los ácidos eicosapentaenoico (EPA, 20:5n3) y docosahexaenoico (DHA, C22:6n3) son característicos de la grasa del pescado. Estos ácidos abundantes en el plancton marino y en algunas algas y se incorporan a los tejidos de los peces al ser ingeridos por ellos. Se ha demostrado una estrecha relación entre la composición en ácidos grasos de la dieta y la del cuerpo de los peces, tanto de agua dulce como en especies marinas (Yildiz et al., 2007). También se ha observado que la composición de ácidos grasos varía con la temperatura y la época del año (Shirai et al., 2002). Sin embargo, estas diferencias son más intensas en los peces de vida libre que en los cultivados y son debidas a la variabilidad estacional de la dieta (Yildiz et al., 2007). Los ácidos grasos EPA y DHA tienen un papel nutritivo importante en la dieta, en este sentido, diversos estudios han demostrado que entran a formar parte de determinadas rutas metabólicas que dan lugar a prostaglandinas y leucotrienos que desempeñan diferentes funciones en el desarrollo de algunos estados patológicos (Simopoulos, 1996). Estudios recientes han demostrado una tendencia inversa, estadísticamente significativa, entre el riesgo de enfermedad coronaria y la ingesta de EPA y DHA en adultos sanos (Salem et al., 2001, Uauy et al., 2003; Gebauer et al., 2006; Barceló-Coblijn et al., 2009). I.6.3. Textura. La textura del pescado es una característica sensorial que influye decisivamente en la aceptabilidad del producto. Son variados los factores que determinan la textura que, a su vez, dependen del estado nutricional del pez, entre los que cabe mencionar la tasa e intensidad del acortamiento post-mortem del músculo, la magnitud de la disminución del pH y la proteolisis por la rotura de las miofibrillas. Las propiedades de retención de agua en el músculo son también de una gran importancia para el valor comercial y la aceptación del consumidor ya que juegan un papel esencial en la firmeza de la carne y son buenos índices de jugosidad (Olsson et al., 2003). La cantidad de agua inmovilizada dentro del tejido muscular depende de la organización de las proteínas miofibrilares. El ablandamiento de la carne es uno de los principales síntomas de la pérdida de frescura de los peces cultivados. Este ablandamiento (muy rápido en determinadas ocasiones lo que provoca pérdidas económicas importantes en las piscifactorías) no tiene unas causas conocidas del todo; diferentes investigaciones apuntan hacia varios factores estructurales del músculo del pez, sin embargo aún no se ha establecido cuál es el motivo responsable último de esta alteración de la textura. La manipulación del producto en el momento del pre-rigor mortis, cuando los procesos de deterioro aún no han comenzado, permite una ventaja con respecto a los productos obtenidos de la pesca, en los que este tipo de intervención no es posible. No debemos perder de vista que los cambios post-mortem varían claramente dependiendo de la especie considerada, debido a la diferente constitución estructural y 48 Introducción metabólica, que determinan que el proceso de envejecimiento del pez sea muy distinto en cuanto a duración y causas que lo provocan. Por este motivo, los fenómenos post-mortem observados en una especie generalmente no son extrapolables a otras. La firmeza del músculo de los peces disminuye rápidamente durante el almacenamiento en frío después del sacrificio (Mochizuki y Sato, 1996). Debido al ablandamiento se produce un deterioro de la calidad, por lo que es muy importante el conocimiento de los procesos por los que se produce este ablandamiento y el desarrollo de métodos para prevenirlo. Se han realizado gran cantidad de estudios que demuestran que los cambios texturales ocurridos en el músculo del pez durante el almacenamiento post-mortem son resultado de la degradación de los componentes miofibrilares (Ofstad et al., 1996; Delbarre-Ladrat et al., 2006). Sin embargo, otros muchos estudios apuntan a la desintegración de la matriz extracelular y la fracción de colágeno como responsables de estos cambios (Ando et al., 1995; Montero y Borderías, 1990, Espe et al., 2004), siendo el colágeno el mayor componente del tejido conectivo, considerado un importante determinante de las propiedades texturales de los peces (Hatae et al., 1986; Hallett y Bremner, 1988; Toyohara et al., 2000; Bugeon et al., 2004). La importancia relativa de la degradación de los distintos componentes no está aún clara, y depende de la especie y otros factores que influyen sobre los procesos proteolíticos. Como se ha indicado antes, la textura de los peces está influenciada por varios factores, por ejemplo especie, edad, época del año, fotoperiodo (Espe et al., 2004, Hagen et al., 2007), el estrés sufrido antes del sacrificio (Bagni et al., 2007; Lefevre et al., 2008; Roth et al., 2009), el contenido de grasa muscular y su distribución en el músculo (Regost et al., 2001; Poli et al., 2009; Hardy y Lee, 2010; Sándor et al., 2011), los métodos de procesamiento de los filetes y las condiciones de almacenamiento post-mortem (Sigholt et al., 1997, Skjervold et al., 2001, Roth et al., 2009, Veiseth-Kent et al., 2010). La composición y distribución de los lípidos corporales de los peces son los factores más variables estando influenciados por la especie y el ambiente. En general, el pez se vuelve más graso en la parte delantera del cuerpo, habiéndose encontrado así mismo altos niveles de lípidos en los tejidos periviscerales. Thakur et al. (2002) establecieron que los lípidos y el colágeno son los dos constituyentes del músculo de la seriola que tienen una mayor influencia en la textura de su carne si bien se trata de influencias opuestas. Thakur et al. (2003) publicaron una correlación negativa entre el contenido en lípidos del músculo y la resistencia a la rotura de la carne de seriolas de piscicultura. El exceso de deposición de lípidos a lo largo del tejido conectivo pudo haber causado una rotura estructural del músculo y reducido la fuerza mecánica que aporta este tejido. El uso en acuicultura de dietas altamente energéticas ha llevado a la producción de peces excesivamente grasos, lo que repercute negativamente sobre las características texturales de los animales provocando una menor firmeza (Thakur et al., 2002, 2003). Este exceso en la acumulación de grasa hace que, en general, los peces cultivados sean menos apreciados que los salvajes (Grigorakis, 2007). 49 Sergio García Mesa I.6.4. Proteolisis muscular. La electroforesis (sistema SDS-PAGE desnaturalizante, según Laemmli, 1970) es un método ampliamente utilizado en investigación de calidad de productos alimenticios. Así, es una técnica bien establecida para la determinación de especies de peces y de la autenticidad de los alimentos de origen marino. Recientemente se está investigando sobre las posibilidades del uso de esta técnica en el control de la frescura de los peces, para detectar la posible falsificación de productos derivados de proteína animal y vegetal y arrojar luz sobre las condiciones de procesado de los productos. Un método de determinación del grado de proteolisis muscular es el estudio de las alteraciones en el perfil electroforético de sus proteínas y de los productos de dicha proteolisis. Con el conocimiento existente de los mecanismos bioquímicos implicados en el ablandamiento del músculo, se podría intentar seleccionar posibles marcadores de calidad como pudieran ser los fragmentos proteicos obtenidos como consecuencia de la hidrólisis de proteínas musculares durante el almacenamiento y conservación del músculo, que podrían ser de gran valor para el control de calidad en la industria de la producción piscícola. En la separación de las proteínas del músculo de los peces por su solubilidad en soluciones de diferente fuerza iónica se obtienen dos componentes: Proteínas sarcoplásmicas: solubles en soluciones de baja fuerza iónica, normalmente se trata de enzimas intracelulares implicadas en el metabolismo de la energía. Chéret et al. (2006) las describieron para el músculo de lubina. Las principales bandas obtenidas para estas proteínas son: péptido de 97 kDa ha sido identificado en mamíferos con la enzima glucógeno fosforilasa; el de 58 kDa con la piruvato kinasa, el de 46 kDa con la enolasa, el de 43 kDa con la creatina kinasa, el de 39 kDa con la aldolasa, el de 38 kDa con la lactato deshidrogenada, el de 36 kDa con la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y el de 16 kDa con la mioglobina. Otras bandas no identificadas poseen una masa molecular relativa de 34, 27, 25 y 21.5 kDa. Por último se observaron también dos bandas de bajo peso molecular, 13 y 12 kDa. Proteínas miofibrilares: solubles en soluciones de alta fuerza iónica, constituyen el armazón estructural del músculo. Varios autores describen para el músculo de peces una serie de bandas: cadena pesada de la miosina (unos 200 kDa), 180 kDa (proteína M); 148 kDa (proteína C); 110 kDa (-actinina); 55 kDa (desmina); 45 kDa (actina); 40 kDa (-tropomiosina); 38 kDa (troponina T); 35 kDa (-tropomiosina); y una serie de bandas desde 35 a 17,6 kDa que corresponden a la cadena ligera de miosina. El proceso de envejecimiento de la carne de mamíferos se ha asociado a la degradación de una de estas proteínas, la desmina (55 kDa) y proteínas miofibrilares como la troponina T (37 kDa) y la aparición de fragmentos de proteína de 30 y 110 kDa. Estos dos fragmentos se han propuesto como indicadores del grado del proteolisis en la carne. El uso de estos marcadores 50 Introducción podría contribuir de forma rápida y fácil al conocimiento de la frescura del pescado y, sobre todo, sería útil para establecer comparaciones entre las distintas especies. Algunos autores han observado la degradación de moléculas de elevado peso molecular como la distrofina, así como la rotura de la titina y la nebulina. Los procesos degradativos en los peces son tantos y tan complejos que aún no se ha encontrado un indicador único para evaluar la calidad del pescado. Es necesario seguir investigando en esta línea debido a que el uso de estos marcadores en la industria podría suponer un avance en las técnicas de conservación y manipulación del pescado y satisfacer a la cada vez mayor demanda por los consumidores de un producto de calidad. 51 II.1. Seguimiento técnico de la fase inicial de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) en jaulas flotantes. II.1.1 INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS El cultivo intensivo de especies de peces marinos goza ya de una cierta tradición en nuestro país en sus diversas modalidades (tanto en instalaciones en tierra como en mar abierto) aunque se ha concentrado en unas muy pocas especies. Pese a que las pautas básicas de esos cultivos han sido establecidas y validadas por la experiencia repetida, cuando se aborda la consideración de una especie “nueva”, como es la corvina en este caso, se plantean algunos interrogantes y reservas que desaconsejan una pura y directa extrapolación de las prácticas que han funcionado con éxito en esas otras especies. Es por ello por lo que los primeros intentos se suelen hacer a una escala más reducida y con seguimiento más exhaustivo con el fin de poder implementar, si fuera necesario, las medidas correctoras oportunas antes de validar una práctica concreta en aspectos tales como densidad/carga, tipo de jaulas, pautas y tipo de alimentación, monitorización de parámetros ambientales y sus posibles efectos, prácticas sanitarias de prevención, etc. En esta línea, Ceutamar S.L. se planteó incluir entre su actividad industrial la cría intensiva de corvinas a partir de alevines importados y se dirigió a nuestro grupo para solicitarle apoyo técnico de evaluación y control en este intento preliminar. En todo momento, la empresa y su departamento técnico, en base a su experiencia previa en la cría de otras especies, especialmente lubina, establecieron las directrices generales del cultivo y fueron realizando un seguimiento de los parámetros de más interés desde el punto de vista de la producción (supervivencia, crecimiento, alimentación, etc.). Nosotros tuvimos oportunidad de participar y profundizar en los controles correspondientes con un doble objetivo; por una parte, generar información complementaria sobre la marcha de esta experiencia piloto y, por otra, obtener datos sobre la biología de la especie que, además de ampliar el bagaje de conocimientos sobre 53 Sergio García Mesa la misma, pudieran ser utilizados en el diseño ulterior de unas prácticas de cultivo específicas para corvina. En el capítulo de Introducción general a esta Memoria y, más en concreto, en los apartados I.1.3. y I.1.4. se exponen con cierto detalle los resultados más destacables de anteriores intentos de cría intensiva de corvina (reproducción controlada, alimentación, crecimiento, etc.), a los que nos remitimos para completar este apartado de Introducción al objetivo II.1. II.1.2. MATERIAL Y MÉTODOS Para cubrir los objetivos propuestos se procedió a un seguimiento exhaustivo de la evolución de la primera fase de un cultivo industrial de corvinas durante un periodo de algo más de un año. Este seguimiento se realizó sobre dos remesas (R1 y R2) de peces juveniles llegados a la piscifactoría en dos fechas distintas. A su llegada a la granja, cada remesa se subdividió en dos grupos (A y B), totalizando cuatro grupos (R1-A, R1-B, R2-A y R2-B). Los cuatro lotes se alimentaron inicialmente con un pienso común (Alphamar®), pero posteriormente se introdujo un segundo pienso comercial (Regius®) que se suministró a los lotes B de cada remesa. El seguimiento se basó en controles sucesivos de diversos parámetros de interés que incluían: - - evolución de peso y biometría general, tanto sobre muestras amplias con un número elevado de peces y determinaciones a pie de instalaciones, como con muestras más reducidas analizadas en laboratorio, datos sobre composición corporal, datos sobre biometría de diversas fracciones corporales, datos sobre ciertos parámetros sanguíneos. Adicionalmente, animales de los lotes R1-A y R1-B fueron utilizados para el análisis de la evolución temporal del contenido en ácidos grasos del músculo de estos peces, datos en los que se basa el ensayo descrito en el apartado II.2. 54 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. II.1.2.1. Animales e instalaciones. Este seguimiento se basó en juveniles de corvina procedentes de la instalación Les Poissons de Soleil, que la empresa Ferme Marine de Dohuet, tiene en la localidad de Balaruc-les-Bains, próxima a Montpellier (Francia). Todos los peces habían sido vacunados previamente y habían dado negativo para nordavirus. Al ingresar en las instalaciones de Ceutamar, los animales contaban entre 80 y 100 días de edad. La primera remesa (R1) estaba compuesta por unas 120 000 unidades que se distribuyeron entre dos jaulas tipo S (ver más adelante). Una segunda remesa (R2) estaba compuesta por 100 000 animales que se distribuyeron en dos jaulas tipo S, a razón de 60 000 unidades el lote R2-A y 40 000 el lote R2-B. Las instalaciones de Ceutamar S.L. estaban situadas en aguas de la Bahía de Algeciras, dentro del Distrito Marítimo de Algeciras, entre la desembocadura del río Palmones y el muelle de Juan Carlos I. La superficie de ocupación era la de una lámina de agua de unos 48 000 m2 frente a la playa de “El Rinconcillo”. El parque de jaulas se encontraba dentro de un polígono cuyo punto central se correspondía con las coordenadas 36⁰ 0.9600 N y 0.5⁰ 25.900 O, zona en la que la profundidad es, como media, superior a 20 metros. Las jaulas de mantenimiento eran de polietileno de alta densidad, tanto los tubos de flotación como sus apoyos. Como se señalado antes, los animales se recibieron en jaulas de tipo S: 16 m de diámetro, 5 m de profundidad y 8 mm de luz de malla. A lo largo del cultivo y durante la fase de engorde, los animales se trasladaron sucesivamente a jaulas de tipo M: 25 m de diámetro, 5 m de profundidad y 10 mm de luz de malla y jaulas de tipo L: 25 m de diámetro, 10 m de profundidad y 15 mm de luz de malla. Gracias a estos trasvases, la densidad/carga se mantuvo siempre por debajo de 7 kg/m 3. Figura II.1.2.1. Imagen de las instalaciones en la bahía de Algeciras. 55 Sergio García Mesa Los datos, obtenidos en años anteriores, de niveles de oxígeno del agua, indicaban un mínimo en el período estival de 7.2 ppm. El aumento posprandial del consumo por parte de los peces deprimía esos niveles de oxígeno disuelto a mínimos entre 5.5 y 6.5 ppm; niveles que se considera están siempre por encima de las necesidades de la especie, lo que hizo innecesario su control diario en esta ocasión. La temperatura del agua en la zona de cultivo se midió diariamente a dos profundidades (2 y 8 m) con objeto de obtener una información más completa de la existente en la columna de agua donde vivían los peces. Esas determinaciones se hicieron a las 8 a.m., siendo únicas pues la instalación no disponía de infraestructura para un registro más continuado. Las diferencias entre las temperaturas a ambas profundidades nunca llegaron a 1 °C, siendo algo mayores, 0.3-0.9 °C, en los meses más cálidos (abril-octubre) y prácticamente nulas (menores de 0.1 °C) en el resto del año. Por esa razón, a partir de ahora se considerará únicamente el valor promedio de ambas medidas diarias. La figura II.1.2.2. muestra la evolución de dicha temperatura a lo largo periodo experimental considerado durante el cual se registró un máximo de 22.5 y un mínimo de 14.6 °C. La temperatura promedio a lo largo de un año completo, junio 2007-junio 2008 fue de 17.9 ± 0.1 °C. En la tabla II.1.2.1. se muestra la temperatura media registrada en los diferentes intervalos de muestreo. La salinidad se mantuvo constante a lo largo de todo el período experimental, en torno a 37 ‰. Figura II.1.2.2. Evolución de la temperatura a lo largo del periodo controlado. Cada punto representa el día de muestreo amplio 56 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Tabla II.1.2.1.Temperatura media (°C) de los intervalos inter-muestreos (M) de los diferentes lotes. Intervalo M1-M2 Fechas 22jun07/24jul07 22jun07/27jul07 16ago07/09oct07 10ago07/02oct07 R1-A 18.1 ± 0.2 24jul07/22ago07 27jul07/29ago08 09oct07/26nov07 02oct07/13nov07 18.4 ± 0.2 22ago08/18oct07 29ago08/25oct07 26nov0721feb08 13nov07/27feb08 20.5 ± 0.2 18oct07/05dic07 25oct07/05dic07 21feb08/22abr08 27feb08/30abr08 18.5 ± 0.2 05dic07/05mar08 05dic07/11mar08 22abr08/27may08 30abr08/03jun08 16.1 ± 0.1 05mar08/23abr08 11mar08/07may08 27may08/12sep08 03jun08/01jul08 15.4 ± 0.1 23abr08/26may08 07may08/10jun08 16.1 ± 0.1 M8-M9 26may08/04jul08 17.5 ± 0.2 M9-M10 04jul08/26ago08 19.2 ± 0.1 M2-M3 M3-M4 M4-M5 M5-M6 M6-M7 M7-M8 Remesas-Lotes R1-B R2-A R2-B 18.0 ± 0.2 20.4 ± 0.2 20.3 ± 0.2 18.8 ± 0.2 19.0 ± 0.1 19.3 ± 0.1 20.6 ± 0.1 16.1 ± 0.1 16.3 ± 0.1 18.6 ± 0.1 15.7 ± 0.1 15.7 ± 0.1 16.1 ± 0.1 16.1 ± 0.1 15.9 ± 0.1 15.7 ± 0.1 18.8 ± 0.2 17.7 ± 0.2 15.9 ± 0.1 II.1.2. 2. Alimentación Durante todo el cultivo se realizó una distribución manual de alimento, repartiendo la ración diaria entre 3 y 4 tomas, con un intervalo de 3 horas entre ellas. El tamaño de la ración diaria a ofrecer se calculaba a partir de los datos suministrados por el fabricante de piensos y de la carga previsible de cada jaula, una vez determinada la temperatura diaria. 57 Sergio García Mesa Dentro del proyecto a desarrollar, se consideró oportuno diferenciar el tipo de dieta a partir de un punto establecido por el director técnico de la explotación, a fin de observar posibles diferencias entre los resultados de una dieta comercial estándar para lubina (Alphamar®) y una experimental, en diseño, específica para corvina (Regius®). Los lotes A de cada remesa se mantuvieron alimentados con el primer pienso citado durante todo el periodo controlado, mientras que en los B se introdujo, tras un breve periodo de transición con alimentación mixta, el pienso Regius® entre el 7º y el 8º mes de estancia en piscifactoría. Los piensos utilizados fueron suministrados por la casa Dibaq-Diproteg S.A., quien indica que las materias primas utilizadas eran, en proporciones variables según tipo de pienso y lote, las siguientes: harina y aceite de pescado, hemoderivados, aceite vegetal de soja, harina de soja tostada, concentrado de proteína de soja, haba de soja, harina de trigo, harina de avena, harina de trigo, gluten de trigo, harina de guisantes y minerales. Los análisis llevados a cabo en el laboratorio con muestras representativas se indican en las tablas II.1.2.2., II.1.2.3. y II.1.2.4. II.1.2.3. Muestreos. Como se ha indicado antes, los datos que se exponen en esta parte de la Memoria, proceden del seguimiento técnico de un proyecto llevado a cabo en las instalaciones de CeutaMar S.L. Ello significó no sólo el uso de las instalaciones de la empresa para el mantenimiento de los animales, sino que durante el periodo considerado, el cultivo se desarrolló según las pautas técnicas de la misma en cuanto a jaulas utilizadas, alimentación suministrada (tipo, ración, horario y frecuencia de dispensación, etc.) y mantenimiento general de los animales. 58 59 7.44 7.37 Alphamar® Regius® 20.59 23.81 Grasa 42.88 40.03 Proteína 7.90 5.49 Ceniza 21.26 23.24 MELN* 22.23 25.72 Grasa ** Calculada sobre la base de 39.7, 24.3 y 17.2 kJ/g de grasa, proteína y MELN, respectivamente. * Materia extractiva libre de nitrógeno (calculada por diferencia) Humedad Pienso en sustancia fresco (%) 46.29 43.25 Proteína 8.53 5.93 Ceniza 22.95 25.11 MELN* En sustancia seca (%) Tabla II.1.2.2. Composición y contenido energético de los piensos utilizados 21.46 22.32 Energía** bruta (MJ/kg) 19.98 17.94 Relación** proteína/ene rgía (g/MJ) Alphamar® 2.5 17.4 4.7 3.2 22.2 2.3 2.5 2.4 26.2 3.4 0.7 0.5 0.2 3.8 1.0 6.8 24.6 32.6 15.9 26.7 0.60 Regius® 3.0 17.7 4.7 3.8 21.0 2.5 2.6 2.3 25.1 3.1 0.8 0.7 0.0 4.3 1.0 7.5 25.4 32.2 16.7 25.8 0.65 Tabla II.1.2.3. Composición en ácidos grasos de los lípidos de los piensos utilizados (% sobre lípidos totales) 14:0 16:0 18:0 16:1n7 18:1n9 18:1n7 20:1n9 22:1n11 18:2n6 18:3n3 18:4n3 20:4n6 20:4n3 20:5n3 22:5n3 22:6n3 Total saturados Total monoinsaturados Total poliinsaturados n3 Total poliinsaturados n6 Relación n3/n6 Alphamar ® 7.39 6.12 10.68 17.77 6.41 3.99 3.80 11.12 5.94 1.92 5.77 0.57 5.32 4.29 4.16 4.78 1.30 1.76 6.61 7.47 9.42 21.08 6.58 3.29 4.44 8.61 6.58 2.81 4.77 0.60 4.85 4.55 4.18 4.15 1.25 1.69 1 (g / 100 g de proteína) Harina de Regius® pescado1 6.5 6.1 9.0 13.6 6.5 2.0 4.3 7.8 8.1 3.1 4.0 4.2 4.5 4.4 3.2 4.8 2.9 2.6 1.6 2.6 4.3 4.8 2.0 2.6 4.6 Necesidades de lubina2 Tabla II.1.2.4. Perfil aminoacídico de las proteínas de los piensos utilizados. Valoración mediante Índices de aminoácidos esenciales (IAAEE) Aminoácido ALA ARG* ASP GLU GLY HIS* ILE* LEU* LYS* MET* PHE* PRO SER THR* TYR VAL* IAEE HP3 IAAEE Lubina4 *Aminoácidos considerados esenciales en los peces. Según recopilación de Schuchardt, 2 3 2005. Según recopilación de Wilson, 2002. Valor promedio de las relaciones proteína 4 pienso/harina de pescado de los aminoácidos esenciales (excepto triptófano). Valor promedio de las relaciones proteína pienso/necesidades de lubina de los aminoácidos esenciales (excepto triptófano) 60 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. En concreto, las fechas de los distintos muestreos vinieron impuestas por la coincidencia con alguna operación de mantenimiento: cambio de redes, cambio de jaulas…, único momento en que fue dado tomar la muestra correspondiente. A su vez, en algunos momentos, estas maniobras tuvieron también un importante condicionamiento climático, ajeno a los planes de la empresa. Es por ello, por lo que los intervalos entre muestreos son de amplitud diferente para las distintas remesas y, a veces, para los dos lotes de cada remesa. Por otra parte, algunas de las determinaciones se realizaron in situ, por parte del personal técnico de la empresa asesorado por nosotros (biometría de muestras amplias) y otras en nuestro laboratorio (biometría exhaustiva de muestras reducidas, análisis de piensos,…). Finalmente, algunas determinaciones se iniciaron “a pie de jaulas”, en concreto en el barco de apoyo y se continuaron y terminaron en el laboratorio de la UGR (extracción de vísceras y análisis de sangre. La figura II.1.2.3. muestra, esquemáticamente, la secuencia temporal y el tipo de muestreos realizados. Como se ha indicado antes, se realizaron muestreos periódicos por el personal de la piscifactoría para obtener datos de la evolución del cultivo; se trata de lo que denominamos “muestreos amplios”. A estos animales se les midió in situ la longitud total, la longitud cefálica y el peso y se almacenaron en un congelador industrial a -20 °C hasta posterior procesado en el laboratorio donde, con muestras de tamaño más reducido, se procedió a una biometría más exhaustiva. Cada lote fue muestreado dos veces (en torno a los meses 5-6 y 10 de estancia en la piscifactoría), para análisis de sangre. La extracción se realizó se realizó en animales previamente sedados por inmersión en agua con hielo. La sangre se extrajo de la vena caudal con jeringas heparinizadas. Estas muestras se usaron para la determinación de constantes eritrocitarias y análisis bioquímico de plasma. 61 Figura II.1.2.3. Esquema cronológico de los diferentes muestreos realizados. lote jun07 jul07 ago07 sep07 oct07 nov07 dic07 ene08 feb08 mar08 abr08 may08 jun08 22 24 22 18 5 5 23 26 R1-A 0 32 61 118 166 257 306 339 R1-B 22 27 29 25 5 11 7 10 0 35 68 125 166 263 320 354 ago07 sep07 R2-A R2-B 62 ene08 26 378 431 jul08 ago08 sep08 oct07 nov07 9 26 21 22 27 1 12 0 54 102 189 250 285 326 393 10 2 13 27 30 3 1 0 53 95 201 264 298 326 Análisis de músculo Análisis hematológico feb08 mar08 abr08 may08 jun08 ago08 4 16 Biometrías de muestras amplias Biometría exhaustiva en muestras reducidas Análisis de cuerpo entero dic07 jul08 2, 9, 16 …: días del mes en curso 0, 52, 94 …: días del experimento sep08 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. II.1.2.4. Métodos analíticos Aquí se recoge una relación de los parámetros e índices determinados. La forma precisa en que se hicieron esas determinaciones se expone con detalle en el apartado IX: Metodología. 1) Análisis biométrico de muestras amplias. El personal técnico de la piscifactoría midió una serie de parámetros: Longitud total y cefálica. Peso El tamaño del muestreo se determinaba en función de la variabilidad del peso, hasta que la dispersión era muy baja y se consideraba que el muestreo era eficaz. Para determinar la eficacia se utilizó el índice de Maguran, que se basa en la media de los pesos acumulados. Con los datos disponibles se calcularon: - Índice de condición Índice cefálico Tasa específica de crecimiento Coeficiente de crecimiento térmico 2) Análisis biométrico exhaustivo en muestras reducidas. En el laboratorio, se extrajeron al azar 15 individuos de cada muestreo amplio para llevar a cabo una biometría más exhaustiva. - Longitud total, estándar y ágil Longitud cefálica Altura máxima Peso total Tras la oportuna disección: peso de aletas, branquias, paquete visceral o vísceras, tracto digestivo, hígado, riñón, corazón y gónadas (en los individuos en que fue posible) y cabeza. También se separó cuidadosamente el filete de un lado y se pesó. A partir de las anteriores determinaciones se obtuvieron una serie de parámetros morfométricos: Índice de condición Índice de agilidad Índice cefálico Perfil relativo Índice cráneo-somático Índice digestivo-somático 63 Sergio García Mesa Índice víscero-somático Índice hepato-somático Rendimiento del filete 3) Análisis de composición de los piensos y de los peces (cuerpo entero, músculo). Se analizó el contenido en agua, cenizas, proteína, grasa, ácidos grasos y aminoácidos de los piensos. Se calcularon el contenido en material extractivo de nitrógeno (MELN), energía total y relación proteína energía de los mismos. En homogeneizados de cuerpo entero y alícuotas de músculo se determinó el contenido de agua, cenizas, proteína y grasa. La metodología analítica concreta se expone en el apartado IX. 4) Análisis de sangre. Se determinaron recuento (número) de glóbulos rojos, contenido en hemoglobina e índice hematocrito. A partir de ellos se calcularon: Volumen Corpuscular, Hemoglobina Corpuscular Media y Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media Por otra parte, en alícuotas del plasma obtenido como se ha descrito más arriba se determinó el contenido de glucosa, colesterol, triglicéridos y proteínas. 5) Tratamiento estadístico. Se utilizó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) usando el paquete estadístico SPSS 15.0 para Windows. Las diferencias significativas en la evolución temporal para un mismo grupo, en los distintos puntos de muestreo (P < 0.05) y entre tratamientos se determinaron por el test de Duncan (Duncan, 1955). 64 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. II.1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN II.1.3.1. Crecimiento Una vez superadas las fases larvaria y de preengorde, en las que la supervivencia del mayor número posible de peces es la preocupación fundamental de los piscicultores, el interés de éstos se centra, por una parte, en la prevención de las patologías asociadas a un cultivo intensivo y, sobre todo, en la consecución de unos índices de crecimiento y conversión del alimento que hagan viable el negocio a la vez que se ofrece al consumidor un producto sanitaria, organoléptica y nutricionalmente deseable. Por ello, el seguimiento de la evolución del peso de los individuos durante el ciclo de producción es uno de los controles más habituales en piscifactoría, con el fin de obtener datos que, en el caso de una especie relativamente novedosa en los cultivos de engorde cual es la corvina, son aún de más importancia. En el cultivo experimental al que se refiere la presente Memoria, el personal técnico de la empresa realizó muestreos a intervalos predefinidos, normalmente asociados a alguna práctica como cambio de redes para limpieza o cambio de peces de una jaula a otra. Se pretendía que la frecuencia de estos muestreos fuese más alta al principio para irla reduciendo posteriormente. En las tablas II.1.3.1. y II.1.3.2. y en la figura II.1.3.1. se muestra un resumen de dichos datos. Como se observa, las corvinas ingresaron en la piscifactoría con pesos iniciales en torno a los 4 g (Remesa 1) y entre 6 y 9 g (Remesa 2). El peso de los animales fue creciendo de forma sostenida hasta alcanzar (últimos muestreos disponibles) los 130-170 g en la remesa 1 y los 170-210 g en los lotes de la remesa 2, cuando, en ambos casos, se cumplía un año o poco más de estancia en la planta. 65 Sergio García Mesa Tabla II.1.3.1. Evolución de algunos datos biométricos de las corvinas de la Remesa-1. Peso Longitud Longitud Días de Índice de Índice cultivo total total cefálica condición cefálico (fecha) (g) (cm) (mm) R1-A 0 4.10 (196) 7.46 (196) 12.24 (60) 0.98 0.16 R1-B 22/06/07 ± 0.08 ± 0.05 ± 0.16 ± 0.01 ± 0.002 32 12.04 (121) 10.15 (60) 17.04 (60) 1.14 0.17 24/07/07 ± 0.32 ± 0.90 ± 0.23 ± 0.10 ± 0.01 61 18.85 (79) 11.60 (79) 21.03 (62) 1.18 0.18 22/08/07 ± 0.61 ± 0.12 ± 0.31 ± 0.01 ± 0.002 118 62.25 (72) 17.86 (72) 31.64 (62) 1.07 0.18 18/10/07 ± 2.15 ± 0.21 ± 0.38 ± 0.01 ± 0.001 166 84.56 (91) 19.63 (91) 34.59 (60) 1.09 0.18 05/12/07 ± 25.83 ± 1.83 ± 0.45 ± 0.08 ± 0.01 257 89.79 (78) 20.27 (78) 38.11 (64) 1.03 0.19 05/03/08 ± 33.78 ± 2.20 ± 13.28 ± 0.07 ± 0.06 306 107.50 (51) 21.42 (51) 39.15 (20) 1.04 0,18 23/04/08 ± 6.11 ± 0.37 ± 1.15 ± 0.05 ± 0.01 339 128.20 (59) 22.73 (59) 40.33 (59) 1.05 0.18 26/05/08 ± 7.08 ± 0.40 ± 0.65 ± 0.01 ± 0.001 378 140.46 (73) 23.12 (73) 41.20 (20) 1.08 0.18 04/07/08 ± 6.99 ±0.34 ± 0.71 ± 0.01 ± 0.002 431 171.89 (62) 26.84 (62) 44.28 (62) 0.99 0.17 26/08/08 ± 112.23 ± 1.61 ± 0.90 ± 0.03 ± 0.003 0 4.09 (128) 7.40 (128) 11.83 (60) 0.98 0.16 22/06/07 ± 0.11 ± 0.07 ± 0.15 ± 0.01 ± 0.001 35 12.75 (121) 9.71 (121) 17.23 (44) 1.25 0.18 27/07/07 ± 0.28 ± 0.07 ± 0.33 ± 0.01 ± 0.002 68 23.29 (102) 12.62 (102) 22.22 (60) 1.13 0.17 26/08/07 ± 0.79 ± 0.15 ± 0.39 ± 0.01 ± 0.002 125 63.85 (114) 17.93 (114) 31.37 (62) 1.07 0.18 21/10/07 ± 1.90 ± 0.18 ± 0.46 ± 0.01 ± 0.002 166 81.30 (77) 19.27 (77) 33.86 (60) 1.11 0.18 05/12/07 ± 2.50 ± 0.19 ± 0.39 ± 0.01 ± 0.001 263 104.21 (99) 21.31 (99) 38.45 (61) 1.05 0.18 11/03/08 ± 3.19 ± 0.20 ± 0.41 ± 0.01 ± 0.001 320 114.32 (46) 21.74 (46) 38.08 (46) 1.05 0.18 07/05/08 ± 7.91 ± 0.43 ± 0.72 ± 0.01 ± 0.001 354 132.86 (80) 22.83 (80) 40.76 (60) 1.09 0.18 10/06/08 ± 4.19 ± 0.23 ± 0.46 ± 0.01 ± 0.001 Los valores son promedio (N) ± EEM. Los valores de N para Índice de condición son los de Longitud total y los de Índice cefálico los correspondientes a Longitud cefálica. 66 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Tabla II.1.3.2. Evolución de algunos datos biométricos de las corvinas de la Remesa-2. Peso Longitud Longitud Días de Índice de Índice cultivo total total cefálica condición cefálico (fecha) (g) (cm) (mm) R2-A 0 6.35 (80) 8.38 (80) 20.70 (23) 1.06 0.24 16/08/07 ± 1.56 ± 0.80 ± 5.00 ± 0.14 ± 0.29 54 27.71 (72) 13.13 (72) 24.26 (62) 1.20 0.18 09/10/07 ± 0.96 ± 0.17 ± 0.33 ± 0.02 ± 0.002 102 65.66 (74) 17.36 (74) 32.23 (60) 1.24 0.18 26/11/07 ± 2.07 ± 0.20 ± 0.34 ± 0.02 ± 0.002 189 103.91 (71) 20.93 (71) 21/02/08 ± 3.76 ± 0.21 1.10 n.d. ± 0.02 n.d. 250 122.70 (53) 22.00 (53) 40.84 (24) 1.11 0.18 22/04/08 ± 5.56 ± 0.36 ± 0.65 ± 0.01 ± 0.002 285 152.63 (57) 23.20 (57) 41.80 (57) 1.19 0.18 27/05/08 ± 6.78 ± 0.37 ± 0.66 ± 0.02 ± 0.002 393 211.55 (41) 27.30 (41) 47.06 (41) 1.00 0.17 12/09/08 ± 10.73 ± 0.48 ± 0.73 ± 0.01 ± 0.001 R2-B 0 9.24 (80) 9.61 (80) 15.66 (57) 1.04 0.16 10/08/07 ± 0.17 ± 0.06 ± 0.17 ± 0.87 ± 0.01 53 26.20 (90) 13.14 (90) 24.07 (62) 1.11 0.18 02/10/07 ± 0.94 ± 0.15 ± 0.36 ± 0.01 ± 0.002 95 50.08 (91) 16.24 (91) 29.15 (60) 1.15 0.18 13/11/07 ± 1.45 ± 0.16 ± 0.33 ± 0.02 ± 0.001 201 107.64 (93) 21.09 (73) 38.04 (60) 1.12 0.18 27/02/08 ± 3.32 ± 0.22 ± 0.39 ± 0.01 ± 0.001 264 140.85 (73) 22.68 (71) 40.89 (53) 1.18 0.18 30/04/08 ± 4.28 ± 0.23 ± 0.47 ± 0.01 ± 0.002 298 155.47 (71) 23.44 (75) 41.20 (37) 1.16 0.18 03/06/08 ± 6.34 ± 0.29 ± 0.86 ± 0.01 ± 0.002 326 171.01 (75) 24,82 (64) 43.79 (20) 1.09 0.17 01/07/08 ± 6.22 ± 0.28 ± 0.83 ± 0.01 ± 0.002 Los valores son promedio (N) ± EEM. Los valores de N para Índice de condición son los de Longitud total y los de Índice cefálico, los correspondientes a Longitud cefálica. 250 Peso (g) 200 R1-A 150 R1-B R2-A 100 R2-B 50 0 0 100 200 300 400 500 Días de cultivo Figura II.1.3.1. Evolución del peso de las corvinas de cada remesa. 67 Sergio García Mesa Coeficiente de Variación (CV) Es común en las piscifactorías que, al crecer los peces, también lo haga la dispersión de tamaños dentro del grupo lo que, en algunas ocasiones, obliga a proceder a una selección y separación de individuos con el objeto de que la marcha general de la unidad no se resienta. El aumento del coeficiente de variación también se ha detectado en este caso (figura II.1.3.2.) desde unos valores inferiores a 30 al comienzo hasta otros superiores a 40 en los muestreos finales o por encima de 50 en el último del lote R-1A durante el cual se detectaron en la misma jaula animales que apenas llegaban a 50 g junto a otros que superaban los 500 g. Durante el periodo de tiempo controlado en este cultivo experimental, no se ha efectuado, en ningún momento, un proceso de selección por tamaños. No obstante, es previsible que en muestreos posteriores esa elevada dispersión no se manifieste y los datos de los mismos sean más representativos del peso medio real del lote. No sabemos hasta qué punto esa ausencia de selección y, por tanto, de cierta homogeneidad en el peso de los individuos dentro de cada recinto ha podido afectar negativamente al peso medio del conjunto. 60 50 40 R1-A 30 R1-B 20 R2-A 10 R2-B 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Muestreos Figura II.1.3.2. Evolución del Coeficiente de Variación (%) del peso en los diferentes muestreos. Además de en términos absolutos, es común expresar el crecimiento en términos relativos, usándose para ello varios índices de los que la tasa de crecimiento instantáneo, estándar o específico (SGR) es el más utilizado. Dichos índices se exponen en la tabla II.1.3.3. en la que se presentan, tanto los obtenidos en cada intervalo entre muestreos como los acumulados (es decir, entre el día de inicio del cultivo y el de la fecha del muestreo en cuestión). Se observa en todos los casos que la tasa de crecimiento en % por día es más alta en los individuos más jóvenes, circunstancia que era de esperar pues es lo común en cualquier explotación animal incluyendo las piscícolas (Austreng et al., 1987), y luego va cayendo; así se pasa de valores de SGR entre 2 y 3 a valores inferiores a la unidad. 68 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Tabla II.1.3.3. Crecimiento de los distintos lotes: Valores de Tasa de Crecimiento Específico (SGR) y Coeficiente de Creciemiento Térmico (CCT) (para intervalos y acumulado*) Período SGR SGR* CCT CCT* 3.27 3.27 0.0026 0.0026 R1-A M1-M2 1.55 2.46 0.0014 0.0021 M2-M3 2.10 2.29 0.0022 0.0021 M3-M4 0.64 1.81 0.0011 0.0018 M4-M5 0.07 1.20 0.0002 0.0014 M5-M6 0.37 1.06 0.0010 0.0013 M6-M7 0.53 1.01 0.0014 0.0014 M7-M8 0.23 0.93 0.0005 0.0013 M8-M9 0.37 0.61 0.0007 0.0010 M9-M10 3.16 3.16 0.0025 0.0025 R1-B M1-M2 1.82 2.52 0.0018 0.0022 M2-M3 1.77 2.18 0.0019 0.0020 M3-M4 0.59 1.79 0.0010 0.0018 M4-M5 0.26 1.23 0.0006 0.0015 M5-M6 0.16 1.04 0.0004 0.0013 M6-M7 0.44 0.98 0.0013 0.0013 M7-M8 2.68 2.68 0.0021 0.0021 R2-A M1-M2 1.80 2.27 0.0024 0.0022 M2-M3 0.82 1.76 0.0013 0.0019 M3-M4 0.18 1.18 0.0008 0.0017 M4-M5 0.62 1.11 0.0017 0.0017 M5-M6 0.30 0.89 0.0006 0.0014 M6-M7 1.93 1.93 0.0016 0.0016 R2-B M1-M2 1.54 1.76 0.0018 0.0017 M2-M3 0.72 1.21 0.0016 0.0017 M3-M4 0.43 1.03 0.0012 0.0016 M4-M5 0.29 0.94 0.0009 0.0015 M5-M6 0.34 0.89 0.0008 0.0014 M6-M7 Es preciso recordar que los intervalos entre muestreos varían para cada lote y que las fechas de entrada de los animales en las instalaciones y las de los sucesivos muestreos también son diferentes (ver figura II.1.2.3. o, por poner un ejemplo, el intervalo entre M3 y M4 puede ser de duración diferente y transcurrir en distinta época del año para cada lote/remesa), así pues, aunque útiles para seguir la evolución de cada lote, no permiten hacer comparaciones inter-remesas más que en cifras globales. Si acudimos a éstas, la conclusión es que el valor del SGR general, último valor acumulado, es muy similar y próximo a la unidad en todos los casos, salvo en el lote R1-A para el que la afirmación anterior es válida hasta el penúltimo muestreo ya que, en el último intervalo estudiado (M9-M10) el crecimiento se ralentizó notablemente. Estas cifras, aceptables para otras explotaciones de peces marinos, defraudan claramente las expectativas de alto crecimiento para esta especie (Calderón et al., 1997; Pastor et al., 2007, Ortega y Gándara, 2007, Cárdenas, 2010; Monfort, 2010). 69 Sergio García Mesa Esta circunstancia podría atribuirse, al menos en parte, a una relativamente “pobre calidad” de estas remesas pues los pocos datos disponibles sobre una tercera, llegada en fechas posteriores a la planta, mostraron un comportamiento claramente más favorable. Efectivamente, esta tercera remesa, incorporada el 24 de julio de 2008 con 7.3 g de peso medio inicial, superaba los 110 g en un muestreo efectuado del 22 de octubre de ese año, es decir unos 3 meses después, mientras que las dos remesas iniciales seguidas por nosotros, en un periodo de tiempo parecido no llegaban a los 60 g, promediando los valores de los 4 lotes. El SGR acumulado para esta R-3 fue de 2.4, siendo de 3.9 para el primer mes, valores que, en el mejor de los casos de las remesas R-1 y R-2 eran de 2.3 y 3.3 y de 1.9 y 1.8, respectivamente, en el peor de ellos. El crecimiento de los peces está determinado, fundamentalmente, por la cantidad de alimento ingerido y por la temperatura del agua. Los peces son incapaces de regular su temperatura corporal, por lo que su metabolismo únicamente funciona de forma óptima dentro de un rango de temperaturas ambientales adecuadas, dentro del cual la ingestión de alimento y el crecimiento son máximos, pero disminuyen cuando la temperatura está por encima o por debajo del rango óptimo. En cuanto a la cantidad de alimento, el crecimiento suele ser máximo con una alimentación “a saciedad”. En las piscifactorías marinas, debido a la dificultad de determinar la “saciedad” de los peces, la “alimentación restringida” es la opción más razonable. La predicción del crecimiento de los peces resulta imprescindible para establecer las necesidades nutritivas y las tasas de alimentación de una forma científica y rigurosa, pero, además, la determinación de la curva de crecimiento de una especie, en unas condiciones dadas, es fundamental para establecer unas pautas de producción en piscicultura intensiva (Querellou, 1984). Cho (1992) propuso, para ser usado con fines predictivos, un Coeficiente de Crecimiento Térmico (CCT ó TGC, de las iniciales en inglés) que relaciona el incremento de peso en un intervalo de tiempo dado con la temperatura ambiental de ese periodo y así, en vez de hablar en crecimiento por día, se habla de crecimiento por “grados·día”. La determinación, con ciertas condiciones de seguridad, de este coeficiente para una especie dada permitiría al piscicultor realizar una previsión de crecimiento razonable si conoce la evolución térmica del agua en sus instalaciones. En este ensayo hemos empezado a determinar el mencionado coeficiente que se expone, de nuevo tanto para intervalos dados, como en acumulado en la citada tabla II.1.3.3. Aunque en la mayoría de los casos, los valores de CCT calculados son más altos en los periodos iniciales, los acumulados muestran una cierta homogeneidad entre remesas y lotes, situándose en torno a 1.35 · 10-3, algo superiores a los reportados para lubina en el informe de Alamar et al. (2001), donde no llegan a 1.0 · 10-3. De nuevo, estos valores resultaron algo mejores para la que hemos dado en 70 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. llamar remesa 3 a que antes nos hemos referido (un acumulado al tercer mes de 3.0 · 10-3), aunque para ésta, los únicos datos disponibles fueron los del periodo inicial, donde, como en las dos anteriores, los valores son, previsiblemente, los más altos. Varios factores pueden ser invocados como responsables de estos poco favorables datos sobre crecimiento. Aquellos varían desde las características (genéticas y otras) de los juveniles introducidos en la granja desde la hatchery de origen hasta la práctica alimentaria en la piscifactoría, pasando por varios factores ambientales. No disponemos de datos concretos sobre los del primer tipo aunque no parecen haber sido determinantes dado que juveniles de la misma hatchery han sido criados con mejores resultados en otras factorías (comunicación personal). Las principales variables ambientales condicionantes de la tasa de crecimiento de los peces de piscifactoría tales como temperatura, oxígeno disuelto y salinidad fueron monitorizadas antes o durante el ensayo encontrándose, en todos los casos, dentro del rango considerado adecuado para esta especie, aunque los mínimos de temperatura detectados en invierno (14 -16 °C) podrían estar en el origen de los peores datos de crecimiento registrados en los periodos intermuestrales correspondientes (ver tablas II.1.2.1. y II.1.3.3.). Cárdenas et al. (2009) sugieren que 24-25 °C es la temperatura óptima para el crecimiento de la corvina, mientras que Collet et al. (2008) recomendaban la temperatura de 24-26 °C para la cría de Argyrososmus japonicus, en ambos casos por encima del rango 15-23 °C, detectado durante el experimento en el área de la piscifactoría. Por otra parte, debe notarse que la piscifactoría se encuentra en una zona, el Estrecho de Gibraltar, sujeta a fuertes vientos con cierta frecuencia lo que implica el cese en la distribución de la comida durante 3-4 días en cada caso. Una frecuencia más alta de la normal de estos episodios podría ayudar a explicar la reducida productividad encontrada. La extrema sensibilidad del crecimiento de estos peces a la temperatura ambiente se puso de manifiesto en un estudio en laboratorio de Estévez et al. (2011) en el que las mismas dietas que habían producido SGRs de 1.3 a 1.9 durante las primeras semanas del experimento, en las que la temperatura media del agua fue de 20.2 °C, pasaban a generar SGRs negativos (de hasta -0.40) durante las últimas semanas del citado experimento en las que la temperatura del agua cayó a una media de 15.6 °C. En lo que concierne a las prácticas del cultivo, la alimentación es considerada habitualmente como el principal factor determinante de las tasas de crecimiento. En este cultivo piloto se han ensayado dos piensos comerciales, Alphamar® y Regius®. El primero se suministró como único durante todo el periodo controlado a los lotes A de cada remesa, en tanto que el segundo se introdujo, sustituyendo a 71 Sergio García Mesa Alphamar®, en los lotes B de cada remesa entre el 7º y 8º mes de estancia en piscifactoría. La tabla II.1.2.2. muestra la composición en macronutrientes de ambos piensos, resultando Regius® con un nivel proteico algo mayor, un nivel lipídico algo menor y una mayor relación P/E que Alphamar®. La tabla II.1.2.3. se refiere a uno de los principales determinantes de la calidad del componente lipídico de un pienso para peces como es su perfil en ácidos grasos, incluyendo los HUFAn3; como se puede observar en dicha tabla no existen diferencias importantes en los datos correspondientes de ambos piensos lo que nos hace pensar que el componente lipídico de los mismos, aunque diferente cuantitativamente hablando, no lo era en cuanto al tipo (mezcla) de grasas incorporadas. Si contrastamos ese perfil con el de un aceite de pescado comercial, fuente lipídica comúnmente considerada óptima para estos animales (figura II.1.3.3.), podemos apreciar que los piensos ofrecen un contenido sustancialmente menor de HUFAn3 y notablemente mayor de oleico (18:1n9) y linolénico (18:2n6), lo que conlleva una claramente más reducida relación n3/n6 en la grasa de los piensos que en el aceite de pescado comercial. 14:00 30 n3/n6 (x20) 25 16:00 20 15 22:6n-3 18:00 10 5 Aceite de pescado Alphamar® 0 22:5n-3 16:1n-7 20:5n-3 Regius® 18:1n-9 20:4n-6 18:2n-6 Figura II.1.3.3. Perfil de los principales ácidos grasos de las dietas comerciales, frente al aceite de pescado La tabla II.1.2.4. muestra los datos concernientes al perfil de aminoácidos, incluidos la mayoría de los esenciales, de la proteína que incorporaban ambos piensos. Se puede observar que la mezcla de fuentes proteicas usada en los piensos comerciales utilizados rebaja la aportación de algunos aminoácidos esenciales (lisina o metionina por ejemplo) con respecto a una harina de pescado convencional, el “deterioro” que ello podría suponer en su calidad quizá no sea muy importante pues el 72 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. valor promedio de los demás supera incluso al de la mencionada fuente, considerada unánimemente como de muy alta calidad. Pero, aún más importante, todos los aminoácidos esenciales analizados están por encima de las necesitadas establecidas para la lubina de las que, presumiblemente, las de corvina no deben ser muy distintas. Todo ello supone una cierta garantía de calidad del componente proteico de los piensos, al menos en la que a su aporte de aminoácidos esenciales concierne. Dietas con niveles proteicos similares a los usados en este ensayo pero con cantidades variables de lípidos (de 13 a 21%) fueron ensayadas por Chatzifotis et al. (2010) quienes obtuvieron SGRs entre 0.40 y 0.46 con corvinas de 230 g de peso inicial, valores dentro del rango de los obtenidos en este experimento. No obstante, los autores citados informaban de una ingesta diaria de alimento entre 0.75 y 0.80% del peso corporal (peces alimentados hasta saciedad aparente). En nuestro caso, la cantidad de pienso suministrado cada día, obedeciendo indicaciones del departamento técnico de la empresa, varió del 2% al 0.9% el peso corporal a medida que avanzaba el experimento, aunque no puede descartarse que la ingesta real por los peces fuera inferior a la ración ofrecida ya que en esta especie y en las jaulas de cultivo es complicado evaluar de forma visual directa el apetito de los peces. Chatzifotis et al. (2010) encontraron también que la dieta con un 17% de lípidos producía mejores índices de crecimiento, conversión y utilización de la proteína que aquellas otras que, manteniendo el nivel proteico (43%), contenían una proporción más alta (21%) o más baja (13%) de grasa. En nuestro seguimiento, los peces alimentados con el pienso Regius® en la que el contenido de grasa era del 22.2% aumentando el de proteínas hasta el 46.3%, en sustancia seca, con el consiguiente aumento de la relación proteína/energía y una reducción del aporte total de energía crecieron algo menos que los mantenidos con el primer pienso (Alphamar®) (tabla II.1.3.3.), aunque la reducida magnitud de estas diferencias y la elevada dispersión de los pesos individuales dentro de cada grupo, hizo que esas diferencias no resultaran significativas desde un punto de vista estadístico. Por tanto, el “efecto negativo” derivado del aumento de la cantidad de lípidos de la dieta, aunque éste significara un mayor aporte de energía, que detectaron Chatzifotis et al. (2010) no resultó evidente en nuestro ensayo. En un estudio reciente (Martínez-Llorens et al., 2011) se ha evaluado el crecimiento y la eficiencia alimentaria en juveniles de corvina (94 g peso inicial) alimentados con cuatro dietas comerciales de diferentes contenidos porcentuales en proteínas/lípidos. El crecimiento y los índices de conversión más satisfactorios se obtuvieron con las dietas de mayores niveles proteicos, lo que parece confirmar unas elevadas necesidades proteicas para esta especie, al menos en su fase juvenil. Piccolo et al. (2008) realizaron un experimento con corvinas de mayor tamaño a las que alimentaron con dos dietas diferentes en su relación proteína/grasa pero los resultados publicados se centraban en los efectos sobre la composición corporal y 73 Sergio García Mesa otros rasgos biométricos que no incluían los posiblemente ejercidos sobre el crecimiento. Creemos que se requieren más estudios para determinar con precisión los niveles óptimos de proteína, grasa y energía en la dieta para corvina en cada etapa del ciclo de producción. II.1.3.2. Otros índices biométricos En colaboración con el departamento técnico de la empresa realizamos mediciones de longitud total y cefálica de los peces que permitieron, unidos a los datos de peso, la determinación de los correspondientes índices de condición y cefálico (tablas II.1.3.1. y II.1.3.2.), se trataba de determinar si la morfología del pez cambiaba a lo largo del periodo de cultivo. En todos los casos, las corvinas se incorporaron a las jaulas con un índice de condición próximo a la unidad; este índice aumentó ligeramente (el pez creció proporcionalmente algo más en peso que en longitud, esto es, tendía a “redondearse”), a medida que transcurrió el tiempo, pero esa tendencia que se expresó al máximo coincidiendo con los valores iniciales más altos de SGR, no se mantuvo y, de nuevo en todos los casos, una vez alcanzado un máximo en el segundotercer muestreo, el mencionado índice tendía a volver a los valores iniciales cercanos a la unidad. El aumento inicial en el índice de condición coincidió en el tiempo, como veremos más adelante, con el de los índices hepato y digestosmático (IHS e IDS, respectivamente). La transición de una práctica alimentaria propia de una hatchery, en la que muy probablemente se usaron alimentos tipo “alta proteína-baja grasa”, a las dietas comerciales de engorde, más pobres en proteína y más ricas en grasa, pueden estar en la base de estos cambios: engrosamiento del cuerpo y aparente acúmulo de grasa en el hígado y en torno al tubo digestivo. La posterior ralentización de la tasa de crecimiento fue acompañada de un retorno de estos índices hacia los valores iniciales, excepto en lo que respecta al IHS que, al final del período controlado, continuaba siendo más elevado que en los juveniles a su llegada a la piscifactoría. Poli et al. (2003) encontraron, en corvinas de 900 a 1500 g, valores de índice de condición (K) similares a los de este ensayo, sin que detectaran variaciones significativas en el mismo a lo largo de un período experimental de 6 meses. Ese estudio también reportó un elevado “dressing percentage” (peso corporal menos vísceras en relación a peso corporal total) que alcanzaba el 95%, una situación similar a la hallada en este trabajo, como veremos más adelante. En un experimento posterior 74 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. con esta misma especie, pero con animales de 800 g, Piccolo et al. (2008) encontraron valores similares a los nuestros de Índice de Condición (K) e IHS, pero el primero de ellos subió a 1.2 cuando los peces se alimentaban con una dieta de elevados contenidos graso y energético, lo que fue acompañado de un incremento de grasa mesentérica pero no del IHS. Finalmente, Chatzifotis et al. (2010) en un estudio con peces de un tamaño parecido al de los de este trabajo, se encontraron de nuevo con valores de índice de condición muy próximos a la unidad que, en este caso, se revelaron independientes del nivel lipídico de la dieta (de 13 a 21%, experimento de 110 días). En ese estudio, el IHS era inferior al 1% mientras que el viscerosomático se encontraba dentro del rango 2.5-3.5%, de nuevo sin diferencias atribuibles a la composición de la dieta. Martínez-Llorens et al. (2011) y Estévez et al. (2011) también encuentran valores de K muy próximos a la unidad en la mayoría de las situaciones experimentales utilizados en sus laboratorios con esta especie. Existe pues un acuerdo general de que el K de la corvina es muy próximo a 1.0 a edades muy diferentes, una cifra inferior a la encontrada en otros peces acuicultivados como la lubina o la dorada (Poli et al., 2003) y típica de peces “delgados”, un rasgo morfológico normalmente bien considerado por los consumidores de pescado. El índice cefálico también se mantuvo muy estable (la cabeza representa en torno al 18% de la longitud corporal total) a lo largo de todo el periodo de cultivo y para todos los lotes. El único valor que se escapó de esta tendencia general fue el inicial del lote R2-A con un índice cefálico de casi el 24%. La conclusión general deducible del análisis de estos índices es que, a grandes rasgos, la morfología externa de la corvina no se alteró de forma importante durante su primer año de estancia en piscifactoría. Un número más reducido de los animales procedentes de los muestreos anteriormente comentados, fue trasladado al laboratorio para ser sometidos a un análisis biométrico exhaustivo, tanto externo como interno. Las tablas II.1.3.4. a II.1.3.7. resumen los resultados de tales mediciones que pretenden realizar un perfil morfométrico exhaustivo de las corvinas en cultivo, así como detectar posibles alometrías que pudieran resultar indicativas de alguna inadecuación en las prácticas de cultivo. 75 Sergio García Mesa Tabla II.1.3.4. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R1-A Días de cultivo (fecha) 0 32 61 118 166 257 306 339 378 (22/06/07) (24/07/07) (22/08/07) (18/10/07) (05/12/07) (05/03/08) (23/04/08) (26/05/08) (04/07/08) LONGITUD (cm) Total 7.56• ± 0,16 9.91 ± 0.28 11.94+• ± 0.23 18.82+• ± 0.39 18.69 ± 0.71 20.60• ± 0.57 22.47 ± 0.92 24.18 ± 0.77 22.83 ± 0.57 Estándar 6.42• ± 0.14 8.48 ± 0.26 10.13+• ± 0.27 16.33+• ± 0.35 16.85 ± 0.39 17.71• ± 0.50 20.16 ± 0.92 20.76 ± 0.69 20.33 ± 0.54 Cefálica 1.87• ± 0.07 2.50 ± 0.07 2.92+• ± 0.07 4.74+• ± 0.10 4.87 ± 0.10 5.24• ± 0.14 5.90 ± 0.18 6.00 ± 0.18 5.88 ± 0.12 Altura 1.83• ± 0.03 2.50 ± 0.08 2.89+• ± 0.09 4.52+ ± 0.10 4.65 ± 0.12 4.87• ± 0.14 5.24 ± 0.22 5.51 ± 0.15 5.52 ± 0.14 Ágil 3.83• ± 0.11 5.21 ± 0.15 6.35 ± 0.17 9.68+ ± 0.24 9.49 ± 0.72 10.37• ± 0.32 11.73 ± 0.49 12.45 ± 0.37 11.81 ± 0.32 Total 4.28• ± 0.27 12.19 ± 1.18 20.55+• ± 1.58 75.33+ ± 4.64 79.96 ± 5.17 95.73• ± 8.13 131.40 ± 16.16 151.80 ± 15.87 142.60 ± 10.29 Aletas 0.08• ± 0.01 0.18 ± 0.02 0.33+ ± 0.03 1.49+• ± 0.09 1.56 ± 0.08 2.09• ± 0.16 2.96 ± 0.33 3.37 ± 0.31 3.02 ± 0.21 Branquias 0.16 ± 0.06 0.22+ ± 0.02 0.40+ ± 0.03 1.28+ ± 0.07 1.46 ± 0.09 1.73• ± 0.13 2.30 ± 0.29 2.69 ± 0.29 2.51 ± 0.16 Digestivo 0.17• ± 0.01 0.70 ± 0.08 1.02+ ± 0.07 3.31+• ± 0.25 3.87 ± 0.34 3.99+• ± 0.38 6.77• ± 1.13 4.82+ ± 0.56 6.73 ± 0.59 Hígado 0.06 ± 0.01 0.41 ± 0.05 0.71• ± 0.07 1.99+• ± 0.25 2.64 ± 0.31 2.10• ± 0.26 2.90• ± 0.36 4.28 ± 0.49 4.03 ± 0.40 Vísceras 0.36• ± 0.03 1.59 ± 0.17 2.66 ± 0.22 8.89+• ± 0.74 9.68 ± 0.85 9.78+• ± 0.93 14.37• ± 2.08 15.22 ± 1.85 16.40 ± 1.53 Cabeza 1.08• ± 0.06 2.67 ± 0.22 4.28+• ± 0.25 15.76• ± 0.88 16.69 ± 1.06 20.90• ± 1.52 28.15 ± 3.01 31.86 ± 2.80 30.46 ± 1.93 Riñón 0.02• ± 0.01 0.06 ± 0.07 0.09 ± 0.01 0.31+• ± 0.37 0.30 ± 0.03 0.34• ± 0.03 0.50 ± 0.08 0.66 ± 0.10 0.52 ± 0.06 Filete 0.87• ± 0.10 2.45 ± 0.27 4.13• ± 0.36 16.63+ ± 1.07 17.13 ± 1.47 21.23• ± 1.90 30.13 ± 3.85 36.12 ± 3.81 29.32 ± 2.64 Corazón n.d. n.d. n.d. 0.21+• ± 0.02 0.29+ ± 0.03 0.32• ± 0.04 0.39 ± 0.05 0.48 ± 0.06 0.46 ± 0.04 Gónadas n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0.38• ± 0.08 0.68 ± 0.24 1.14 ± 0.25 1.04 ± 0.24 PESO (g) + Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B para una misma medida (P<0.05). • Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado. 76 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Tabla II.1.3.5. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R1-B Días de Cultivo (fecha) 0 35 68 125 166 263 320 354 (22/06/07) (27/07/07) (29/08/07) (25/07/07) (05/12/08) (11/03/08) (07/05/08) (10/06/08) LONGITUD (cm) Total 7.52• ± 0.13 10.35 ± 0.23 13.05+• ± 0.45 16.97+• ± 0.48 19.36 ± 1.24 20.70 ± 0.37 23.27 ± 0.72 23.13 ± 0.42 Estándar 6.42• ± 0.15 8.60 ± 0.10 11.23+• ± 0.39 14.73+• ± 0.42 16.90 ± 0.48 17.89 ± 0.33 19.90 ± 0.68 20.09 ± 0.57 Cefálica 1.84• ± 0.07 2.56 3.20 ± 0.03 ± 0.11 4.36+• ± 0.12 4.87 ± 0.13 5.27 ± 0.11 5.87 ± 0.17 5.88 ± 0.15 Altura 1.82• ± 0.04 2.41 ± 0.04 3.21+• ± 0.13 4.06+ ± 0.13 4.76 ± 0.14 4.88 ± 0.11 5.37 ± 0.22 5.49 ± 0.14 Ágil 3.85• ± 0.08 5.53 ± 0.11 6.88 ± 0.33 8.74+ ± 0.28 10.18 ± 0.33 10.39 ± 0.18 12.1 ± 0.42 11.96 ± 0.28 Total 4.09• ± 0.91 12.07 ± 0.51 27.88+• ± 2.78 58.35+ ± 4.91 86.70 ± 7.19 97.87 ± 6.37 140.33 ± 16.68 145.00 ± 10.41 Aletas 0.07• ± 0.003 0.18 ± 0.01 0.43+ ± 0.04 1.04+• ± 0.08 1.69 ± 0.13 2.02 ± 0.13 2.96 ± 0.28 2.90 ± 0.16 Branquias 0.09 ± 0.01 0.28+ ± 0.02 0.66+ ± 0.06 0.97+ ± 0.06 1.52 ± 0.11 1.67 ± 0.11 2.23 ± 0.24 2.36 ± 0.14 Digestivo 0.17• ± 0.01 0.62 ± 0.04 1.44+ ± 0.12 2.41+• ± 0.21 3.94 ± 0.29 9.67+• ± 0.82 4.73 ± 0.61 6.51+ ± 0.64 Hígado 0.06 ± 0.01 0.40 ± 0.04 0.65• ± 0.08 1.45+• ± 0.18 2.53 ± 0.32 2.06• ± 0.26 3.78 ± 0.58 3.98 ± 0.38 Vísceras 0.35 ± 0.02 1.42 ± 0.09 3.27 ± 0.31 6.39+• ± 0.59 9.65 ± 0.93 4.01+• ± 0.28 14.36 ± 2.17 16.15 ± 1.39 Cabeza 1.08• ± 0.05 2.74 ± 0.10 5.67+• ± 0.49 12.17• ± 0.89 17.04 ± 1.29 20.79 ± 1.28 29.24 ± 2.84 29.18 ± 1.84 Riñón 0.02• ± 0.002 0.05 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.21+• ± 0.02 0.28 ± 0.04 0.30 ± 0.05 0.54 ± 0.07 0.47 ± 0.05 Filete 0.76• ± 0.05 2.36 ± 0.11 5.55• ± 0.63 11.80+ ± 1.38 18.67 ± 1.54 21.97 ± 1.57 33.36 ± 4.13 33.94 ± 2.49 Corazón n.d. n.d. n.d. 0.16+• ± 0.01 0.19+ ± 0.01 0.32 ± 0.03 0.49 ± 0.06 0.43 ± 0.03 Gónadas n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0.51 ± 0.11 5.72 ± 4.24 1.30 ± 0.43 +• PESO (g) + Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B para una misma medida (P<0.05). • Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado. 77 Sergio García Mesa Tabla II.1.3.6. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R2-A Días de Cultivo (fecha) 0 54 102 189 250 285 (16/08/07) (09/10/07) (26/11/07) (21/02/08) (22/04/08) (27/05/08) LONGITUD (cm) Total 8.76+• ± 0.23 13.31• ± 0.38 17.13• ± 0.44 19.65 ± 0.45 22.64• ± 0.56 23.15 ± 0.70 Estándar 7.58+• ± 0.19 11.89• ± 0.29 15.07• ± 0.35 17.22 ± 0.42 19.83+• ± 0.46 20.27 ± 0.64 Cefálica 2.29+• ± 0.06 3.55• ± 0.08 4.46+• ± 0.08 5.09 ± 0.12 5.84• ± 0.09 6.13 ± 0.18 Altura 1.90+• ± 0.09 3.31• ± 0.09 4.20 ± 0.12 4.54 ± 0.10 5.50• ± 0.16 5.64 ± 0.19 Ágil 4.39+• ± 0.12 7.59 ± 0.19 9.17+ ± 0.24 10.11 ± 0.24 11.56• ± 0.30 12.04 ± 0.38 Total 6.59+• ± 0.50 29.79• ± 2.19 63.18+ ± 4.46 81.53 ± 5.35 141.93• ± 10.09 157.13 ± 15.42 Aletas 0.11+• ± 0.01 0.45 ± 0.03 1.11+• ± 0.10 1.55 ± 0.08 2.50+• ± 0.17 2.83 ± 0.25 Branquias 0.13+ ± 0.01 0.68+ ± 0.04 1.04 ± 0.08 1.51 ± 0.07 2.25+• ± 0.14 4.32 ± 1.93 Digestivo 0.20+• ± 0.02 1.52 ± 0.16 3.72+• ± 0.26 3.70 ± 0.26 8.72• ± 0.98 8.43• ± 0.97 Hígado 0.06 ± 0.01 0.44• ± 0.06 1.60+• ± 0.19 1.80 ± 0.18 3.43+• ± 0.37 4.31• ± 0.48 Vísceras 0.46+• ± 0.04 2.96 ± 0.28 7.43+• ± 0.63 8.29 ± 0.67 17.82• ± 1.42 19.14• ± 2.21 Cabeza 1.80+• ± 0.14 6.54• ± 0.44 12.96+• ± 0.79 18.04 ± 0.98 28.50• ± 1.74 30.78 ± 3.02 Riñón 0.05 ± 0.02 0.09 ± 0.01 0.22+ ± 0.02 0.30 ± 0.02 0.51+ ± 0.04 0.60 ± 0.08 Filete 1.28+ ± 0.12 5.86 ± 0.46 13.75 ± 1.03 18.38 ± 1.36 32.23+ ± 2.32 35.85 ± 3.31 Corazón n.d. n.d. 0.20 ± 0.02 0.30 ± 0.05 0.34+ ± 0.02 0.43+ ± 0.03 Gónadas n.d. n.d. n.d. n.d. 1.01 ± 0.19 1.46 ± 0.40 PESO (g) + Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R2-A y R2-B para una misma medida (P<0.05). • Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado. 78 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Tabla II.1.3.7. Biometría exhaustiva de laboratorio de las corvinas de R2-B Días de Cultivo (fecha) 0 53 95 201 264 298 326 (10/08/07) (2/10/07) (13/11/07) (27/02/08) (30/04/08) (03/06/08) (01/07/08) LONGITUD (cm) Total 9.56+• ± 0.16 13.37• ± 0.30 16.09• ± 0.50 21.85 ± 0.48 23.95• ± 0.37 23.44 ± 0.71 25.81 ± 0.59 Estándar 8.41+• ± 0.12 11.82• ± 0.25 14.05• ± 0.45 19.21 ± 0.40 20.99+• ± 0.34 21.09 ± 0.70 22.55 ± 0.53 Cefálica 2.55+• ± 0.04 3.48• ± 0.07 4.17+• ± 0.10 5.55 ± 0.09 6.01• ± 0.08 5.97 ± 0.15 6.74 ± 0.13 Altura 2.19+• ± 0.03 2.93• ± 0.18 3.94 ± 0.10 5.24 ± 0.14 5.80• ± 0.10 5.87 ± 0.23 5.96 ± 0.17 Ágil 5.08 ± 0.06 7.07 ± 0.21 8.52+ ± 0.20 11.22 ± 0.26 12.19• ± 0.18 12.24 ± 0.36 13.03 ± 0.38 Total 9.14+• ± 0.45 27.69• ± 1.92 51.52+ ± 3.58 127.80 ± 9.01 165.93• ± 7.50 166.73 ± 16.83 194.67 ± 14.55 Aletas 0.16+• ± 0.01 0.43 ± 0.03 0.89+• ± 0.06 2.24 ± 0.14 3.19+• ± 0.14 3.05 ± 0.28 3.45 ± 0.21 Branquias 0.20+ ± 0.01 0.50+ ± 0.04 0.97 ± 0.07 2.15 ± 0.15 2.71+• ± 0.12 2.53 ± 0.19 3.16 ± 0.26 Digestivo 0.34+• ± 0.02 1.39 ± 0.11 2.60+• ± 0.20 5.33 ± 0.44 16.06• ± 7.16 8.33 ± 0.98 6.41• ± 0.74 Hígado 0.08 ± 0.01 0.52• ± 0.06 1.11+• ± 0.11 3.66 ± 0.46 5.43+• ± 0.39 5.70 ± 0.95 8.34• ± 2.72 Vísceras 0.66+• ± 0.04 2.70 ± 0.23 5.16+• ± 0.38 14.59 ± 1.50 21.22• ± 1.20 20.53 ± 2.86 19.05• ± 2.22 Cabeza 2.39+• ± 0.11 6.23• ± 0.42 10.76+• ± 0.72 25.60 ± 1.47 32.28• ± 1.35 33.03 ± 2.69 39.11 ± 2.43 Riñón 0.06 ± 0.02 0.09 ± 0.01 0.17+ ± 0.01 0.47 ± 0.05 0.68+ ± 0.04 0.56 ± 0.06 0.77 ± 0.10 Filete 1.75+ ± 0.10 5.84 ± 0.44 11.57 ± 0.85 30.54 ± 2.28 38.27+ ± 1.98 39.16 ± 4.02 46.57 ± 3.45 Corazón n.d. n.d. 0.17 ± 0.02 0.41 ± 0.04 0.53+ ± 0.04 0.55+ ± 0.05 0.69 ± 0.08 Gónadas n.d. n.d. n.d. 1.19 ± 0.37 1.09 ± 0.20 0.77 ± 0.14 1.32 ± 0.34 +• PESO (g) + Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R2-A y R2-B para una misma medida (P<0.05). Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05). n.d.: no determinado • 79 Sergio García Mesa Tabla II.1.3.8. Biometría de las corvinas de R1-A: índices derivados Días de Cultivo (fecha) I. Condición I. Agilidad I. Cefálico Perfil relativo % Aletas % Branquias ICS1 IDS2 IVS3 IHS4 Rendimiento filete 0 32 61 118 166 257 306 339 378 (22/06/07) (24/07/07) (22/08/07) (18/10/07) (05/12/07) 0(5/03/08) (23/04/08) (26/05/08) (04/07/08) 0.98a ± 0.01 2.09ab ± 0.04 0.25ab ± 0.01 0.24bc ± 0.002 1.93b ± 0.06 2.37b ± 0.09 25.29 ± 0.28 3.94b ± 0.17 8.47a ± 0.29 1.47a ± 0.27 38.94 ± 2.18 1.21ab ± 0.04 2.09ab ± 0.03 0.25ab ± 0.003 0.25bc ± 0.004 1.52a ± 0.03 1.83a ± 0.06 22.35 ± 0.51 5.72f ± 0.36 12.92 e ± 0.45 3.43f ± 0.29 39.67 ± 0.76 1.18ab ± 0.04 2.20ab ± 0.04 0.25a ± 0.002 0.24abc ± 0.003 1.62a ± 0.04 1.97a ± 0.09 21.22 ± 0.46 5.03e ± 0.21 12.81de ± 0.28 3.38ef ± 0.21 39.83 ± 0.54 1.11ab ± 0.02 2.14ab ± 0.03 0.25ab ± 0.002 0.24abc ± 0.002 1.99bc ± 0.05 1.72a ± 0.07 21.05 ± 0.39 4.38bcd ± 0.16 11.75de ± 0.48 2.62bcd ± 0.24 44.08 ± 0.50 1.08b ± 0.02 2.05a ± 0.15 0.27b ± 0.02 0.25 c ± 0.01 1.99bc ± 0.06 1.84a ± 0.06 21.06 ± 0.65 4.81 de ± 0.22 11.94cde ± 0.43 3.26 def ± 0.30 42.58 ± 1.76 1.06ab ± 0.02 2.13ab ± 0.03 0.25ab ± 0.003 0.24ab ± 0.03 2.20 de ± 0.05 1.85a ± 0.05 22.15 ± 0.44 4.14bc ± 0.15 10.65bc ± 1.19 2.13b ± 0.17 44.44 ± 1.06 1.08ab ± 0.01 2.24 b ± 0.02 0.26ab ± 0.01 0.23a ± 0.002 2.30 e ± 0.05 1.78a ± 0.05 22.01 ± 0.43 4.93 de ± 0.25 10.57bc ± 0.34 2.24bc ± 0.15 45.57 ± 0.37 1.03a ± 0.02 2.27 b ± 0.04 0.25ab ± 0.003 0.23a ± 0.01 2.26 de ± 0.06 1.77a ± 0.04 21.41 ± 0.40 3.13a ± 0.11 9.83ab ± 0.35 2.80cde ± 0.17 47.62 ± 0.75 1.18ab ± 0.05 2.14ab ± 0.03 0.26ab ± 0.004 0.24abc ± 0.003 2.12cd ± 0.04 1.78a ± 0.04 21.56 ± 0.27 4.71cde ± 0.20 11.27bcd ± 0.49 2.77cd ± 0.14 42.53 ± 2.77 Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05) entre puntos 1 2 3 4 de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. Índice Digestosomático. Índice Viscerosomático. Índice hepatotosomático. En algunos casos, no ha sido posible determinar el peso de alguna víscera en los animales más pequeños, bien por su reducido tamaño, que dificultaba su extracción nítida o impedía su detección (corazón y gónadas, respectivamente). Como se observa en las tablas, en algunos casos se miden o pesan distintos segmentos corporales o porciones del mismo, accesibles desde el exterior, mientras que en otros hubo que proceder a una cuidadosa tarea de disección. Lógicamente, las medidas y pesos absolutos van creciendo a medida que el cuerpo del animal lo hace por lo que son los índices relativos los que nos pueden indicar si dicho crecimiento es isométrico (la víscera o segmento corporal en cuestión lo hace en proporción a la totalidad corporal) o alométrico (lo hace en una proporción distinta). 80 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Tabla II.1.3.9. Biometría de las corvinas de R1-B: índices derivados Días de cultivo (fecha) I. Condición I. Agilidad I. Cefálico Perfil relativo % Aletas % Branquias ICS1 IDS2 IVS3 IHS4 Rendimiento filete 0 35 68 125 166 263 320 354 (22/06/07) (27/07/07) (29/08/07) (25/10/07) (05/12/07) (11/03/08) (07/05/08) (10/06/08) 0.95a ± 0.02 2.12a ± 0.03 0.25 ± 0.01 0.24ab ± 0.003 1.79b ± 0.05 2.14b ± 0.06 24.88a ± 1.88 4.13a ± 0.16 8.45ab ± 0.36 1.43a ± 0.30 37.01 ± 0.70 1.11bc ± 0.05 2.30c ± 0.03 0.25 ± 0.004 0.23a ± 0.01 1.51a ± 0.03 2.30bc ± 0.08 22.83a ± 0.32 5.13a ± 0.24 11.72b ± 0.43 3.21b ± 0.28 39.14 ± 0.75 1.21c ± 0.02 2.15ab ± 0.07 0.25 ± 0.002 0.25b ± 0.01 1.56a ± 0.03 2.37c ± 0.07 20.70a ± 0.44 5.38a ± 0.31 11.79b ± 0.25 2.31ab ± 0.14 39.23 ± 0.99 1.16cd ± 0.04 2.15ab ± 0.03 0.26 ± 0.002 0.24ab ± 0.003 1.82bc ± 0.06 1.73a ± 0.09 21.16b ± 0.46 4.22b ± 0.27 1 0.89c ± 0.27 2.47c ± 0.14 39.78 ± 3.01 1.16cd ± 0.02 2.14ab ± 0.04 0.33 ± 0.03 0.33b ± 0.03 1.97cd ± 0.03 1.79a ± 0.07 19.84a ± 0.37 4.65a ± 0.20 11.01ab ± 0.28 2.82ab ± 0.17 43.09 ± 0.41 1.08bc ± 0.02 2.14ab ± 0.04 0.25 ± 0.003 0.24ab ± 0.004 2.07de ± 0.04 1.72a ± 0.04 21.50a ± 0.69 4.15a ± 0.17 9.75b ± 0.24 2.00ab ± 0.14 44.63 ± 0.44 1.05b ± 0.04 2.26bc ± 0.03 0.25 ± 0.003 0.23a ± 0.004 2.18c ± 0.05 1.64a ± 0.06 21.58a ± 0.57 3.37a ± 0.12 9.82ab ± 0.39 2.58ab ± 0.16 47.21 ± 0.46 1.15cd ± 0.02 2.18abc ± 0.04 0.25 ± 0.002 0.24ab ± 0.004 2.04d ± 0.06 1.66a ± 0.05 20.34a ± 0.36 4.44a ± 0.23 11.00ab ± 0.35 2.71ab ± 0.14 46.76 ± 0.30 Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias significativas (P<0.05) 1 2 3 entre puntos de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. Índice Digestosomático. Índice 4 Viscerosomático. Índice Hepatotosomático. El índice de condición aumentó con la edad de forma más marcada a la detectada en los muestreos amplios antes comentados, de forma que, en todos los lotes, era significativamente mayor al final del periodo controlado (tablas II.1.3.8. a II.1.3.11.). Esto significaría, como ocurre normalmente en los peces sometidos a condiciones de cultivo con alimentación basada en dietas ricas en energía, un cierto “engordamiento” o pérdida de esbeltez del pez. Esa misma imprecisa variable (la “esbeltez”) del animal puede ser evaluada a partir de los dos índices que relacionan altura y longitud corporales, a saber el índice de agilidad (cuya disminución significará un aumento mayor de la altura que de la longitud, es decir, un cierto “redondeo” del cuerpo) y el perfil relativo (que será mayor en los peces más “redondos”). En ambos casos detectamos ciertas oscilaciones, más marcadas en el primero de los índices mencionados, pero sin una tendencia clara ni a lo largo del tiempo ni según lote/remesa y así, si bien el perfil relativo permaneció prácticamente constante en torno a un 25% en todos los casos; el Índice de agilidad aumentó ligeramente con el tiempo en las corvinas de la remesa 1, aunque prácticamente sin significación estadística, pero cayó, algo más pronunciadamente, en las de la remesa 2. A la espera de una serie de datos más larga, no estamos en condiciones de proponer una 81 Sergio García Mesa explicación coherente a estos datos, inclinándonos, por el momento, por no considerar relevantes estas diferencias. Tabla II.1.3.10. Biometría de las corvinas de R2-A: índices derivados Días de Cultivo (fecha) I. Condición I.Agilidad I. Cefálico Perfil relativo % Aletas % Branquias ICS1 IDS2 IVS3 IHS4 Rendimiento filete 0 54 102 189 250 285 (16/08/07) (09/10/07) (26/11/07) (21/02/08) (22/04/08) (27/05/08) 0.96a ± 0.03 2.33b ± 0.06 0.26 ± 0.002 0.22 ± 0.01 1.82b ± 0.08 2.06 ± 0.08 27.54c ± 0.79 3.20a ± 0.13 7.04a ± 0.22 0.96a ± 0.11 38.19 ± 0.78 1.24b ± 0.05 2.29ab ± 0.02 0.27 ± 0.004 0.25a ± 0.003 1.55a ± 0.06 2.40 ± 0.15 22.36b ± 0.77 4.97b ± 0.37 9.73b ± 0.39 1.45b ± 0.19 39.15 ± 0.48 1.24b ± 0.05 2.19ab ± 0.04 0.26 ± 0.004 0.25 ± 0.004 1.76b ± 0.07 1.66 ± 0.04 20.72ab ± 0.29 5.93cd ± 0.21 11.63c ± 0.25 2.44cd ± 0.14 43.32 ± 0.35 1.05a ± 0.01 2.23ab ± 0.02 0.26 ± 0.001 0.23 ± 0.002 1.93b ± 0.05 1.90a ± 0.08 22.41b ± 0.44 4.60b ± 0.21 10.08b ± 0.35 2.18c ± 0.16 44.74 ± 0.81 1.19b ± 0.02 2.11a ± 0.03 0.26 ± 0.01 0.24 ± 0.003 1.79b ± 0.07 1.61 ± 0.04 20.37a ± 0.43 6.14d ± 0.49 12.48c ± 0.35 2.35cd ± 0.15 45.50 ± 0.75 1.22b ± 0.04 2.14a ± 0.03 0.27 ± 0.01 0.24 ± 0.004 1.83b ± 0.05 1.63 ± 0.06 19.64a ± 0.86 5.25bc ± 0.22 11.88c ± 0.33 2.69d ± 0.11 45.82 ± 0.41 Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias 1 significativas (P<0.05) entre puntos de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. 2 3 4 Índice Digestosomático. Índice Viscerosomático. Índice Hepatosomático. El peso de la cabeza parece ser una proporción constante del total (25-27%) algo mayor que la que existe entre las longitudes respectivas. El peso relativo de las aletas parece aumentar algo al crecer el animal, si bien eso no es claramente apreciable en todos los lotes, con una serie de altibajos en la secuencia temporal en otros, por lo que dudamos de que se pueda sostener rotundamente tal afirmación. Es curioso que el peso de las branquias sea relativamente más alto en los primeros muestreos para descender luego hasta valores mínimos, en casi todos los casos, al final del periodo controlado. Si el peso de las branquias es indicativo de su área superficial, lo anterior podría justificarse en base a unas mayores necesidades de oxígeno (directamente relacionadas con las necesidades metabólicas) en peces más jóvenes. No obstante, cualquier aseveración en este sentido debe hacerse con cuidado 82 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. pues, como se ha indicado repetidamente, los muestreos se han realizado a intervalos distintos y en momentos del año diferentes, en los que la temperatura del agua y el oxígeno disuelto en la misma podrían ser tanto o más condicionantes que la edad a la hora de determinar la tasa metabólica del pez. Finalmente, no debemos olvidar que se trata de un índice relativo al peso corporal, por lo que una variación en el mismo puede deberse a cualquiera de los dos, o a los dos, elementos implicados en el cálculo. También como tendencia general, los índices víscerosomático y digestosomático tienen los valores más reducidos al principio y luego crecen aunque no linealmente, siendo en cualquier caso mayores al final del periodo controlado que al comienzo del mismo. Además de un crecimiento/maduración específico de las vísceras consideradas en una proporción mayor que el resto del cuerpo no se puede descartar, aunque no tengamos por el momento datos directos, la posibilidad descrita en otros peces de un cierto acúmulo graso en, por ejemplo, hígado o compartimento peridigestivo cuando los juveniles pasan de una dieta con mayor contenido proteico y uno más reducido de grasas a piensos con menor relación proteína/energía. En el caso concreto del hígado, esta situación parece evidente a juzgar por la evolución del índice hepatosomático que duplica su valor en las corvinas de la remesa 1 y lo triplica en las de la remesa 2. ¿Sirve el hígado y, en menor medida relativa, algún otro componente del paquete visceral, para acumular la grasa que el músculo no almacena? Más adelante comentaremos los datos de evolución de la composición corporal y del músculo de las corvinas, que parecen apuntar en esta dirección. Si fuera así, ¿podría tener eso algún efecto negativo sobre la funcionalidad del hígado y, por extensión, sobre la salud de los animales a largo plazo? (figura II.1.3.4.). Se habrían necesitado los datos de muestreos posteriores para ver si esta tendencia se mantiene y, muy importante, los de composición de vísceras concretas, sólo posibles, con la metodología disponible cuando éstas alcancen un tamaño adecuado, para poder establecer alguna conclusión más definitiva a este respecto. 83 Sergio García Mesa Tabla II.1.3.11. Biometría de las corvinas de R2-B: índices derivados Días de Cultivo (fecha) I. Condición I. Agilidad I. Cefálico Perfil relativo % Aletas % Branquias ICS1 IDS2 IVS3 IHS4 Rendimiento filete 0 53 95 201 264 298 326 (10/08/07) (02/10/07) (13/11/07) (27/02/08) (30/04/08) (03/06/08) (01/07/08) 1.04a ± 0.03 2.32 ± 0.03 0.27c ± 0.003 0.23ab ± 0.003 1.73b ± 0.05 2.19c ± 0.09 26.25d ± 0.23 3.65a ± 0.11 7.18a ± 0.16 0.86a ± 0.10 38.13 ± 0.50 1.14bc ± 0.03 2.31 ± 0.05 0.26b ± 0.002 0.22a ± 0.01 1.57a ± 0.04 1.92b ± 0.14 22.85c ± 0.94 5.02a ± 0.31 9.63b ± 0.45 1.81ab ± 0.15 41.91 ± 0.48 1.24d ± 0.06 2.17 ± 0.02 0.26b ± 0.003 0.25cd ± 0.003 1.74b ± 0.05 1.91b ± 0.08 20.98b ± 0.29 5.13a ± 0.35 10.05bc ± 0.38 2.13ab ± 0.12 44.71 ± 0.62 1.20cd ± 0.03 1.19cd ± 0.01 2.11 ± 0.03 0.25ab ± 0.001 0.24bcd ± 0.002 1.93c ± 0.03 1.64c ± 0.03 19.54a ± 0.27 5.70b ± 0.23 12.75ce ± 0.30 3.23bc ± 0.13 46.01 ± 0.72 1.24d ± 0.02 2.09 ± 0.03 0.26ab ± 0.002 0.25d ± 0.003 1.85bc ± 0.05 1.56c ± 0.05 20.31ab ± 0.46 4.92a ± 0.15 11.88e ± 0.42 3.22bc ± 0.22 46.82 ± 0.53 1.10ab ± 0.02 2.19 ± 0.03 0.26bc ± 0.002 0.23abc ± 0.002 1.81bc ± 0.05 1.62c ± 0.05 20.34ab ± 0.33 3.22a ± 0.14 9.68b ± 0.57 2.87c ± 0.09 47.88 ± 0.50 2.15 ± 0.05 0.25a ± 0.003 0.24bcd ± 0.003 1.77b ± 0.04 1.69c ± 0.04 20.33ab ± 0.39 4.18a ± 0.18 11.10cd ± 0.40 2.73abc ± 0.18 47.61 ± 0.58 Los valores son medias ± EEM. (N=15) Diferentes letras en una misma fila indican diferencias significativas 1 2 (P<0.05) entre puntos de muestreo de los índices morfométricos. Índice Craneosomático. Índice 3 4 Digestosomático. Índice Viscerosomático. Índice Hepatosomático. El rendimiento del filete (RF) y su composición son dos variables altamente valoradas cuando el producto de la piscicultura se ofrece al mercado ya que los compradores y consumidores finales son muy exigentes a este respecto. Obviamente, estos índices adquieren su máxima relevancia en el momento en que el pescado va a ser comercializado, pero un seguimiento previo de los mismos, como el aquí presentado, puede ser útil a la hora de considerar posibles medidas correctoras en las prácticas de la piscifactoría incluyendo la alimentación de los peces (tipo de dieta, racionamiento, etc.). El RF es una aproximación de uso muy común a la hora de valorar la proporción que la parte comestible del pez significa del peso total del mismo. En este seguimiento, este índice se situó siempre cerca o en el rango 37-47% (tablas II.1.3.8. a II.1.3.11., figura II.1.3.5.). Se trata de valores algo inferiores a los reportados por Piccolo et al. (2008) para corvinas de 800 g pero muy cercanos a los hallados por Poli et al. (2003) en peces de 900 a 1500 g. Aunque este índice está sujeto a un cierto grado de variación según la metodología concreta usada para la separación del filete en distintos laboratorios y por diferentes investigadores, podemos considerar estos valores razonablemente representativos de la corvina en condiciones de cría intensiva. 84 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. Índice hepatosmático (IHS) % 4.0 3.5 3.0 2.5 R1-A 2.0 R1-B 1.5 R2-A 1.0 R2-B 0.5 0.0 0 100 200 300 400 Días de cultivo Figura II.1.3.4. Evolución del Índice Hepatosomático (%) en las diferentes remesas. Rendimiento del filete (RF) % 50 45 R1-A 40 R1-B R2-A 35 R2-B 30 0 100 200 300 400 Días de cultivo Figura II.1.3.5. Evolución del rendimiento del filete a lo largo del período experimental. Piccolo et al. (2008) encontraron una relación directa entre el contenido energético de la dieta y el RF. En nuestro estudio no hemos detectado tal efecto (muestreos finales de lotes B (Regius®) frente a lotes A (Alphamar®I) y, sorprendentemente, los peces alimentados con la dieta más rica en lípidos y energía mostraron un valor algo más bajo (de hecho el valor más bajo encontrado en todo el periodo de seguimiento). En cualquier caso, las diferencias en la composición de nuestras dos dietas eran claramente menores que las utilizadas por Piccolo et al. (2008). II.1.3.3. Parámetros hemáticos. La determinación de las constantes eritrocitarias es una práctica habitual en los cultivos de peces, pues proporciona un índice del estado general de la población 85 Sergio García Mesa mediante unos procedimientos no excesivamente laboriosos ni caros. Lógicamente, para que esos índices resulten útiles se debe disponer de una referencia previa, objetivo al que se dirige esta parte del trabajo. Nuestros resultados informan (tabla II.1.3.12.) de que las corvinas de esta edad/peso poseen entre 1.5 y 2 millones de glóbulos rojos por mm3 de sangre, un hematocrito entre el 30 y el 45% y una cantidad de hemoglobina tan variable como 6 a 15 g/dL. Estos datos proceden de sólo dos muestreos por lote, estando previsto ampliarlos con los procedentes de otras edades para disponer de un espectro más amplio y una referencia más sólida; datos de los que nos disponemos por el momento. A partir de los hasta ahora disponibles, calculamos que los glóbulos rojos de esta especie tendrían un volumen de entre 200 y 300 μm3 y un contenido individual de hemoglobina de entre 30 y 70 pg que ocuparía entre el 20 y el 30% de su volumen. Resulta complicado, a partir de los escasos resultados disponibles, adivinar una tendencia o evolución con la edad ya que los valores del primer muestreo (animales más jóvenes) fueron algo mayores que los del segundo, pero esto que ocurre en la remesa-1, no fue evidente en la 2. Sí es una tónica general que los animales que primero ingresaron en la piscifactoría (R-1) poseían, en general, unas constantes eritrocitarias más altas (más hemoglobina en glóbulos rojos de mayor tamaño) que los incorporados en la segunda tanda (R-2). No obstante esta diferencia, no se ha trasladado a otros parámetros como la tasa de crecimiento. La estacionalidad puede significar cambios en la disponibilidad de oxígeno, al disminuir la capacidad del agua para disolver oxígeno cuando su temperatura aumenta. Esta disponibilidad de oxígeno podría determinar de alguna forma la tasa de producción compensatoria de glóbulos rojos y pigmento transportador. No parece ser esta la situación en nuestros controles ya que en casi todos los casos, los valores correspondientes al periodo más frío (diciembre para remesa 1 y febrero para la remesa 2) son más altos que los correspondientes a los de los muestreos en periodo más cálido (abril para la remesa 1 y julio para la remesa 2). Recordamos que las oscilaciones térmicas, en cualquier caso no han sido muy marcadas y que a disponibilidad de oxígeno siempre se mantuvo en valores aceptables a juzgar por mediciones de temporadas anteriores (ver anexo IX. Metodología). 86 87 • ± 2.53 • 29.67 ± 2.48 ± 13.93 32.25 70.67 ± 6.28 ± 10.67 68.50 200.36 ± 31.46 ± 2.75 45.78 ± 1.29 14.72 242.53 ± 0.33 43.66 ± 1.11 14.53 ± 0.15 •* 2.30 ± 0.24 R1-B 1.89 R1-A 166 05/12/0 7Alphamar 166 05/12/0 7Alphamar 306 •* ± 4.59 28.59 • ± 21.87 70.79 • ± 54.20 316.92 ± 5.92 39.33 ± 1.35 10.49 ± 0.31 1.18 R1-A 23/04/0 8Alphamar 306 ± 1.52 19.27 ± 19.18 56.14 ± 114.58 313.72 ± 3.30 37.94 ± 0.72 7.22 ± 0.37 1.75 R1-B 23/04/0 8 Regius 189 • ± 4.69 26.01 ± 22.54 45.52 ± 39.05 200.55 ± 4.16 33.23 ± 0.83 7.51 •* ± 0.57 1.87 R1-A 21/02/0 8Alphamar 189 ± 6.45 18.54 ± 16.21 61.11 ± 61.73 274.77 ± 6.88 32.26 ± 0.98 7.28 ± 0.41 1.56 R1-B 27/02/0 8Alphamar 320 • ± 6.74 23.06 ± 5.02 32.65 • ± 29.98 188.32 ± 1.17 30.16 ± 0.27 5.24 •* ± 0.26 1.63 R1-A 01/07/0 8Alphamar 326 ± 1.77 17.26 ± 2.79 42.33 ± 25.17 255.12 ± 17.68 39.52 ± 0.71 6.81 ± 0.73 1.63 R1-B 01/07/0 8 Regius Los valores son media ± EEM (N=6). Indica diferencias significativas (P<0.05) entre R1 y R2 al mismo periodo. * en la columna de R1 o R2 indican diferencias significativas (P<0.05) entre los dos puntos de muestreo. CHCM (%) 3 HCM 2 (pg) VCM1 (µm3) (%) Hematocrito (g/dL) Hemoglobina (x106 /µL) Recuento Remesa-Lote Pienso Fecha Día de cultivo Tabla II.1.3.12. Constantes eritrocitarias de las corvinas de los distintos lotes en dos muestreos diferentes (antes y después del inicio de alimentación diferenciada). Sergio García Mesa Por otra parte, y hasta cierto punto independientemente de la concentración de oxígeno disponible en el entorno, la densidad de animales en las jaulas podría ser otro determinante de estos parámetros. De los datos que se exponen en el apartado Animales y Mantenimiento de Material y Métodos, se puede deducir que las cargas en los momentos de muestreo, aunque diferentes en función del momento de traslado a jaulas mayores se encontraban en todos los casos por debajo de 7 kg/m 3 (datos de la empresa), insuficientes como para crear problemas de este tipo. En cualquier caso, estos comentarios no pasan de ser algo especulativos pues, como se ha indicado antes, no disponemos de los datos concretos de oxígeno disponible en el período controlado. Finalmente, la alimentación diferenciada, presente en los segundos muestreos de ambas remesas, tampoco parece ejercer efecto claro alguno sobre estas constantes al comparar los datos de los lotes A y B de cada remesa en el segundo muestreo. También con la idea de iniciar una serie más amplia que, una vez concluida, nos permita establecer unos valores de referencia, se han determinado algunos metabolitos sanguíneos clave (tabla II.1.3.13.). Las corvinas, como otros peces (PérezJiménez et al., 2008) muestran unos niveles elevados de triglicéridos en plasma, al menos si consideramos los de mamíferos como referencia. Las cifras de glucosa, colesterol y proteínas están asimismo en línea con las encontradas para otras especies (Pérez-Jiménez et al., 2007; Pérez-Jiménez, 2008). Pero es en estos parámetros en los que el reducido tamaño de las muestras y su elevada dispersión (ver valores de error estándar) nos hace más difícil establecer algún tipo de conclusión. Baste con observar las enormes diferencias detectadas en las dos remesas entre ambos muestreos con valores notablemente más altos para glucosa, triglicéridos y proteínas en el primero de ellos. En tanto no dispongamos de resultados adicionales, no nos consideramos en condiciones de definir una glucemia o proteinemia “típicas” de esta especie. No obstante, conviene recordar que estos parámetros son muy sensibles a la historia nutricional o de manejo (estrés) en el período inmediatamente anterior a la extracción de sangre, factores ambos que, como se ha indicado ya alguna vez anterior, no estamos en condiciones de garantizar que hayan sido homogéneos ni entre lotes de una remesa ni entre remesas. 88 89 ± 10.40 ± 35.97 * 170.77 165.40• 163.67 198.22 * ± 12.68 ± 12.89 ± 7.39 ± 43.70 ± 123.72 ± 107.44 ± 127.50 • 1478.89* 1421.68 1376.10• ± 315.41 355.33 n.d. ± 64.53 * ± 6.59 48.67 R1-A 01/07/0 8Alphamar ± 11.45 ± 11.90 ± 139.01 ± 119.35 ± 141.42 781.86 ± 15.52 ± 139.41 ± 97.23 ± 116.85 ± 97.98 1379.52* 1600.10 1520.03• 1601.16 ± 80.30 ± 2.02 57.71 R1-B 01/07/0 8 Regius 183.99 124.17• 113.14 ± 31.76 97.54 R1-B 27/02/0 8Alphamar 850.66 1116.67 444.67 ± 30.24 191.08 ± 14.48 91.63* R1-A 21/02/0 8Alphamar Los valores son media ± EEM (N=6). n.d. no disponible. Indica diferencias significativas (P<0.05) entre R1 y R2 al mismo periodo. *en la columna de R1 o R2 indican diferencias significativas (P<0.05) entre los dos puntos de muestreo. Proteínas ± 267.26 ± 14.57 ± 8.59 55.67 ± 7.51 60.80 90.43 R1-B 23/04/0 8 Regius 85.41* R1-A 23/04/0 8Alphamar R1-B 05/12/0 7Alphamar R1-A 05/12/0 7Alphamar Triglicéridos 910.86 1005.77 512.20 Colesterol RemesaLote Glucosa Pienso Fecha abla II.1.3.13. Niveles plasmáticos (mg/100mL) de diversos metabolitos en las corvinas de los distintos lotes en dos muestreos diferentes (antes y después del inicio de alimentación diferenciada) Día de cultivo 166 166 306 306 189 189 320 326 Sergio García Mesa II.1.3.4. Composición corporal Los datos de la composición corporal de los peces de piscifactoría resultan de gran importancia no sólo como fuente de información sobre el estado general de los mismos y sus respuestas a posibles modificaciones en las condiciones de cultivo (ambientales, alimentarias, etc.) sino, y fundamentalmente, porque al tratarse de “productos” destinados al consumo humano, tanto el piscicultor como el consumidor deben poseer información lo más exhaustiva posible del contenido nutricional de aquello que pretenden vender o consumir. Obviamente, esta segunda circunstancia debe centrarse en los especímenes de tamaño comercial dirigidos al mercado, circunstancia que está lejos de producirse, temporalmente hablando, en las corvinas usadas en estos ensayos, pero no es menos cierto que los datos sobre composición desde fases tempranas pueden ayudar a anticipar cómo será la futura si no se introducen reformas esenciales en el sistema de cultivo. En esta primera aproximación al tema nos hemos centrado en la determinación del contenido en agua, proteínas, lípidos y minerales tanto del cuerpo entero del pez, tabla II.1.3.14., como de la principal fracción comestible, el músculo, tabla II.1.3.15.; (la zona sombreada de cada tabla corresponde al tramo experimental donde se produjo la alimentación diferenciada, es decir, las corvinas pasaron a consumir Regius®). Así mismo nos hemos interesado en las posibles variaciones en el perfil de ácidos grasos del componente lipídico que resulta especialmente sensible al del pienso que consumen los peces aunque estos datos se exponen y discuten en el apartado II.2 de esta Memoria. El cuerpo entero y molido de las corvinas contiene en torno a un 70% de agua, cifra que desciende ligeramente y con ciertos altibajos a medida que los peces crecen. También el contenido proteico se muestra muy constante dentro del rango 17-19%, estando ausente cualquier influencia clara de la remesa, si bien, en los cuatro lotes considerados hay un ligero decremento (1-2%) dentro de cada lote al avanzar el cultivo. Algo parecido cabría decir para las cenizas totales, aunque al ser componente minoritario, estos descensos son menos marcados. Ahora bien, la acumulación de esos pequeños descensos, parece “dejar hueco” para el contenido graso que aumenta de forma notable con el tiempo hasta duplicarse o más, en todos los lotes. Este aumento del contenido de grasa en el cuerpo es más 90 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. pronunciado, en todos los casos, entre el primer y el segundo muestreo, progresando luego más lentamente o estabilizándose. Tabla II.1.3.14. Composición corporal de la corvina en los distintos tratamientos (% sustancia seca) R1-A R1-B R2-A R2-B Fecha muestreo Día de cultivo Agua Grasa Proteína Ceniza 22/06/07 0 72.37•b ± 0.08 3.17•a ± 0.38 19.62• ± 0.56 3.89•a ± 0.29 5/12/07 166 72.04+b ± 0.37 7.56bc ± 0.30 18.24 ± 0.40 3.88b ± 0.15 5/03/08 257 71.95b ± 0.51 7.64b ± 0.44 17.30 ± 0.11 4.01b ± 0.13 23/04/08 306 72.55b ± 0.46 7.04b ± 0.48 16.62 ± 0.10 3.78b ± 0.09 26/05/08 339 69.70a ± 1.25 9.04c ± 0.54 18.24± 0.28 3.70ab ± 0.36 4/07/08 378 72.00b ± 0.91 7.73b ± 0.38 17.47 ± 0.26 3.86b ± 0.08 22/06/07 0 71.54• ± 0.28 3.36•a ± 0.65 19.62• ± 0.56 4.57• ± 0.07 05/12/07 166 71.21+ ± 0.48 7.89b ± 0.52 17.42 ± 0.13 3.75 ± 0.15 11/03/08 263 71.52 ± 0.95 7.42b ± 0.26 18.01 ± 0.07 4.01 ± 0.15 07/05/08 320 72.01 ± 0.79 7.43ab ± 0.57 17.87 ± 0.11 3.82 ± 0.22 10/06/08 354 70.32 ± 0.92 8.20b ± 0.67 18.18 ± 0.31 4.18 ± 0.21 16/08/07 0 72.12•b ± 1.02 3.29•a ± 0.66 18.62• ± 0.51 4.64•a ± 0.04 21/02/08 189 71.86a ± 0.80 7.13+b ± 0.58 18.27 ± 0.32 3.99b ± 0.14 22/04/08 250 72.77+a ± 0.49 7.87b ± 0.52 16.89± 0.36 3.70b ± 0.14 27/05/08 285 71.63a ± 0.76 8.18ab ± 0.63 17.43 ± 0.22 3.68b ± 0.10 10/08/07 0 72.88•b ± 1.86 3.90•a ± 0.38 18.12• ± 0.50 4.49• ± 0.05 27/02/08 201 70.32a ± 0.51 9.85+c ± 0.44 17.14 ± 0.85 3.89 ± 0.26 30/04/08 264 71.41+a ± 0.34 8.52bc ± 0.50 18.07 ± 0.08 3.66 ± 0.08 03/06/08 298 71.34a ± 0.48 7.46bc ± 0.20 17.98 ± 0.16 3.91 ± 0.12 01/07/08 326 70.94a ± 0.41 7.75ab ± 0.40 17.88 ± 0.40 3.73 ± 0.37 Sin sombrear: muestreos con animales consumiendo pienso Alphamar®; sombreados: muestreos con animales consumiendo pienso Regius®. + Los valores son media ± EEM. (N=5) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B o R2-A y R2-B para una misma • medida (P<0.05) en el mismo período. Diferencias significativas entre R1 y R2 para una misma medida (P<0.05) en el mismo período. Diferentes letras en una misma columna indican diferencias significativas (P< 0.05) entre muestreos para un mismo componente. 91 Sergio García Mesa Parece indudable que la transición inicial de un tipo de pienso con menos grasa (el de la hatchery) a otros de engorde con un mayor contenido lipídico, sin descartar el posible tamaño de la ración diaria, son determinantes de este engrasamiento significativo que experimentan las corvinas durante sus primeros meses de estancia en la piscifactoría que coincidió, como se ha indicado antes, con cambios en la tasa de crecimiento, el perfil corporal y los índices IHS e IDS. En la figura II.1.3.6. se representan los valores de composición corporal de las corvinas justo antes de la separación de las 2 dietas y al final del periodo experimental, cuando los animales se habían alimentado durante bastante tiempo con cada pienso. Mientras que del mismo modo, en la figura II.1.3.7. se esquematizan los valores de composición corporal del músculo de las corvinas. R 1 (Día 166cultivo) R1-A (Día 339cultivo) 13.90 13.77 Cenizas 27.05 Proteina 65.25 Proteina 62.40 Cenizas 27.63 Proteina Grasa 12.83 Cenizas 28.85 Proteina 61.44 Grasa R2-B (Día 326 cultivo) 12.97 Cenizas Proteina 61.25 Grasa R2-A (Día 285 cultivo) 14.17 64.92 14.10 Cenizas 27.61 Grasa R 2 (Día 189 cultivo) 25.32 R1-B (Día 320 cultivo) Grasa Cenizas 26.67 Proteina 61.56 Grasa Figura II.1.3.6. Evolución la composición química (% sustancia seca) del cuerpo entero en corvinas. Si en vez de considerar el pez en su conjunto, nos centramos en el músculo, observamos que éste presenta un mayor contenido hídrico con una variación inversa en el contenido de grasa. Mientras el primero supera ahora claramente el 75%, el de grasa no llega al 2% como norma. También, como era de esperar al no incluir esqueleto, el contenido de minerales es sensiblemente menor y el de proteínas algo mayor que en el pez entero. Así pues, la parte que va a ser comestible del pez, muestra un aporte proteico en línea o ligeramente por encima del de otros peces de piscifactoría pero un contenido lipídico bastante menor, lo que justifica su consideración de pez magro; de hecho se usa como nombre común para esta especie el de “maigre” en francés o el de “meagre” en inglés. Es cierto que, como ocurría con el cuerpo entero, se produce un 92 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. cierto engrasamiento con el paso del tiempo, pero éste es, tanto en términos absolutos como relativos, considerablemente menor y de hecho, en algún lote (R2-B), inapreciable. Si contrastamos con otros peces de piscifactoría, las diferencias son claras con respecto a dorada (entre 4 y 11% de grasa en músculo, según edad) (Grigorakis, 2007); lubina (en torno al 5%, Grigorakis, 2007) o peces dulceacuícolas como la trucha y el esturión (Furné, 2008). Tabla II.1.3.15. Composición muscular de la corvina en los distintos tratamientos (% sustancia seca) R1-A R1-B R2-A R2-B Fecha muestreo Día de cultivo Agua Grasa Proteína Cenizas 05/12/07 166 78.36b ± 0.25 1.18a ± 0.14 19.51 ± 0.32 1.43• ± 0.02 05/03/08 257 77.91b ± 0.23 1.53•bc ± 0.16 20.69 ± 65 1.42 ± 0.04 23/04/08 306 77.88b ± 0.15 1.47b ± 0.14 19.21 ± 0.87 1.32 ± 0.04 26/05/08 339 76.80+a ± 0.20 2.04c ± 0.22 21.04 ± 0.68 1.45 ± 0.02 04/07/08 378 76.97a ± 0.10 1.86bc ± 0.10 20.48 ± 0.16 1.40 ± 0.01 5/12/07 166 78.33b ± 0.50 1.41 ± 0.38 19.38 ± 0.89 1.29•a ± 0.03 11/03/08 263 77.93b ± 0.30 1.34• ± 0.10 19.77 ± 0.50 1.39b ± 0.01 07/05/08 320 76.76b ± 0.31 1.86 ± 0.23 19.48 ± 1.24 1.35ab ± 0.04 10/06/08 354 76.27+a ± 1.15 1.73 ± 0.20 21.38 ± 0.29 1.38ab ± 0.02 21/02/08 189 78.61+b ± 0.38 1.41a ± 0.08 18.75 ± 0.51 1.42• ± 0.05 22/04/08 250 77.46+a ± 0.88 1.78•ab ± 0.22 19.78 ± 0.19 1.34 ± 0.04 27/05/08 285 77.34b ± 0.35 2.03b ± 0.67 19.76 ± 0.14 1.33 ± 0.04 27/02/08 201 77.19+ ± 0.35 1.90 ± 0.30 20.06 ± 0.77 1.36•ab ± 0.03 30/04/08 264 77.51+ ± 0.26 1.93• ± 0.14 19.34 ± 0.21 1.34a ± 0.02 03/06/08 298 76.41 ± 0.69 1.94 ± 0.29 20.68 ± 0.25 1.38ab ± 0.03 01/07/08 326 76.76 ± 0.17 1.70 ± 0.34 20.90 ± 0.25 1.42b ± 0.02 Sin sombrear: muestreos con animales consumiendo pienso Alphamar®; sombreados: muestreos con animales consumiendo pienso Regius®. + Los valores son media ± EEM. (N=15) Diferencias significativas entre R1-A y R1-B o R2-A y R2-B para una misma • medida (P<0.05) en el mismo período. Diferencias significativas entre R1 y R2-para una misma medida (P<0.05) en el mismo período. Diferentes letras en una misma columna indican diferencias significativas (P< 0.05) entre muestreos para un mismo componente. 93 Sergio García Mesa De esta circunstancia surge una conclusión obvia, el engrasamiento del pez en su conjunto debe tener su base en la contribución de otros compartimentos corporales, presumiblemente la masa visceral y, más concretamente, la peridigestiva y/o el hígado. Otra, menos aparente, pero con posible significado comercial sería determinar si esa tendencia, ligera pero evidente en la mayoría de los casos, se va a mantener con el paso del tiempo y/o con el uso de dietas hiperlipídicas (práctica habitual en ciertas explotaciones actuales de peces marinos); estando por demostrar en este caso si el potencial genético de la especie sería capaz de vencer el desafío que podría suponer una ingesta hipercalórica, dirigida a un crecimiento más rápido y, por tanto, seguir mereciendo el apelativo de “maigre” . Un estudio comparado con otras especies de músculo más graso, sobre los procesos metabólicos subyacentes a esta acumulación, resultaría interesante de abordar en un próximo futuro. R 1 (Día 166 cultivo) R1-A (Día 378 cultivo) Ceniza Grasa R 2 (Día 189 cultivo) 87.65 Grasa R2-A (Día 285 cultivo) Ceniza Proteína Proteína 87.19 Proteína 90.10 Grasa R2-B (Día 326 cultivo) 7.32 6.11 Ceniza Grasa Ceniza Proteína 88.92 8.98 5.89 6.60 6.21 5.64 Ceniza Proteína 90.15 7.28 8.08 6.10 5.45 6.59 R1-B (Día 354 cultivo) Grasa Ceniza Proteína 89.33 Grasa Figura II.1.3.7. Evolución la composición química (% sustancia seca) del músculo en corvina. El cambio de pienso (Alphamar® a Regius®) en los totes B de ambas remesas no muestra ningún efecto claro sobre los datos que estamos considerando, pese a que, según los fabricantes, los contenidos lipídicos de ambas dietas era sensiblemente diferentes (25% en sustancia fresca para Alphamar®, 18% para Regius®). Nuestros análisis (tabla II.1.2.2.) muestran que tal diferencia era, en realidad, bastante menor, lo que ayudaría a explicar la ausencia de diferencias significativas en la composición corporal de los lotes correspondientes. Lógicamente, está por ver si a más largo plazo, aparecerían o no diferencias debidas a la composición de las dietas que, como hemos 94 Seguimiento técnico de la fase inical de un cultivo experimental de cría intensiva de corvina (Argyrosomus reguis, Asso 1801) en jaulas flotantes. visto con anterioridad, tampoco parecen haber afectado de forma importante a las velocidades de crecimiento de los animales correspondientes. En el apartado II.2. de esta Memoria se exponen y discuten con detalle los datos iniciales y su evolución del perfil de ácidos grasos del músculo. II.1.5. RESUMEN En este experimento se han obtenido, y hacen públicos por primera vez, numerosos datos referidos a la fisiología y el crecimiento de esta especie durante las primeras etapas de su ciclo de cultivo intensivo en jaulas que serán útiles como referencia para futuros estudios con esta especie. Los índices de crecimiento encontrados no son tan buenos como los reportados por otros autores en condiciones de cultivo, sin embargo, un estudio de los datos publicados referentes a experimentos controlados en laboratorio ya no muestran tantas diferencias. En nuestra opinión, esta discrepancia puede deberse, al menos en parte, a una diferente calidad de las remesas iniciales con las que se ha iniciado cada cultivo o a algunas prácticas concretas del mismo, sin descartar que una cosa es el potencial máximo de crecimiento descrito en algunos casos y otra, a veces muy diferente, el valor de crecimiento promedio de un lote amplio. En este sentido la variedad interindividual detectada en las unidades de cultivo ha sido extremadamente amplia lo que, al no ir acompañado de maniobras de selección y homogenización por tamaños, puede repercutir negativamente en la marcha general. Durante el periodo controlado la morfología del pez no ha cambiado de forma sustancial aunque el uso de dietas comerciales, muy probablemente más ricas en grasa y con una mayor proporción de aceites vegetales que las suministradas en las hatcheries, ha modificado algo el contenido de grasa corporal y el perfil de ácidos grasos (como se expone con más detalle en el apartado II.2.) pese a ello, la corvina se muestra como una especie particularmente magra y con una buena calidad de su grasa, al menos, durante la fase controlada en este ensayo. 95 II.2. Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría alimentada con dietas comerciales. II.2.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. La piscicultura pretende reducir la dependencia que el abastecimiento de pescado para el consumo humano tiene con respecto las pesquerías tradicionales. Para ello, el producto generado no sólo debe utilizar de una tecnología de reducido impacto ambiental sino también resultar económico y palatable al consumidor humano y, finalmente, pero no lo menos importante, debe tener un alto valor nutricional. En este último aspecto, uno de los determinantes más comúnmente considerados es el contenido graso del pescado tanto en cantidad como, y especialmente, en calidad. En efecto, el perfil de ácidos grasos del componente lipídico de la parte comestible del pescado de origen marino es comúnmente considerado un buen índice de la calidad del mismo, especialmente en lo que concierne a su contenido de ácidos grasos insaturados, tanto de la serie n3 como de la n6. Los efectos beneficiosos de tales ácidos grasos en la dieta humana han sido repetidamente corroborados: forman parte de las rutas metabólicas que conducen a la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos que juegan un papel en la prevención de ciertas enfermedades y tienen propiedades antitrombóticas y antiinflamatorias, lo que justifica una menor prevalencia de enfermedades cardiovasculares en las poblaciones que consumen grandes cantidades de pescado. Así mismo varios estudios sugieren un efecto positivo de los n3 en la aparición de artritis reumatoide, así como cáncer y metástasis (Stansby et al., 2000). La información disponible nos indica que variables ambientales/estacionales tales como la temperatura o la salinidad pueden repercutir notablemente en el citado perfil de ácidos grasos pero la dieta habitual de los peces, en concreto su composición en ácidos grasos, es considerado como el determinante esencial, tanto si el pez se alimenta en su medio natural como si lo hace en piscifactoría (Leger et al., 1977; 97 Sergio García Mesa Henderson y Tocher, 1987; Ackman, 1995; Saito et al., 1999; Lie, 2001; Alasalvar et al., 2002; Shirai et al., 2002; Yildiz, 2008). En efecto, a diferencia de lo que ocurre con las proteínas, para las que el patrimonio genético es determinante, de forma que el animal fabrica sus propias proteínas a partir de los elementos unitarios (aminoácidos) que le proporciona la dieta o que el propio pez sea capaz de fabricar; para las grasas, tanto las de reserva como, en menor medida, las estructurales, el peso del componente genético es más reducido de forma que el pez, en cierto sentido “almacena lo que come”. Pero también es cierto que, en mayor o menor medida, los peces, como los demás animales, pueden convertir los ácidos grasos de la dieta en otras formas moleculares, aunque esta capacidad de conversión, normalmente por insaturación y elongación, tiene ciertos límites (déficits de equipamiento enzimático no hacen posibles determinadas conversiones) por lo que algunos ácidos grasos tiene carácter de esenciales o indispensables (deben ser suministrados con la dieta) pues, aunque el pez los necesita y utiliza, no puede fabricarlos en la cantidad apropiada (Rodríguez et al., 2009). La investigación sobre la nutrición lipídica de los peces de piscifactoría ha buscado y continúa buscando respuesta a cuestiones como cuál es el nivel adecuado de grasa en el pienso de cada especie y edad, cuáles son los ácidos grasos que tienen carácter de esenciales y en qué cantidad los demanda el pez, qué fuentes o materias primas pueden ser utilizadas para cubrir esas necesidades cuantitativas y cualitativas de grasa y, más recientemente, cómo se puede controlar la composición de las grasas corporales del pez, actuando sobre las del pienso, con objeto de generar un producto que posea a la vez un alto estándar organoléptico y nutricional (Rodríguez et al., 2009). Así pues, conocer la cantidad de grasa de la parte comestible del pez, su composición en ácidos grasos, su posible evolución a lo largo del ciclo de producción en piscifactoría, las posibles repercusiones sobre la misma de la edad, el ambiente y, sobre todo, la alimentación, son objeto de atención preferente por parte de los investigadores. En esta línea se incluye esta parte del trabajo de seguimiento de una producción intensiva de corvinas que pretende ayudara a caracterizar y valorar este aspecto de la calidad nutricional del producto. 98 Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales. II.2.2. MATERIALES Y MÉTODOS. II.2.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos. Este ensayo se llevó a cabo utilizando peces de los lotes R-1A y R1-B del experimento anterior, esto es, juveniles de corvina (Argyrosomus regius) de un peso medio inicial de 4.1 ± 0.1 g (80 días de edad) criadas en una piscifactoría basada en jaulas (Ceutamar S.L., Bahía de Algeciras, Cádiz). Para los fines específicos de este ensayo se usaron peces procedentes de los muestreos 1 a 8 del lote R-1A de aquel ensayo, pero con el fin de obtener una información más exhaustiva del posible efecto de las variables consideradas (ambiente y dieta) el periodo experimental se prolongó, en este caso, hasta los 503 días momento en que se efectuó el muestreo 9-A de este ensayo. Estas corvinas estuvieron consumiendo el pienso Alphamar® durante todo el periodo controlado. Para contrastar el posible efecto de la composición de la dieta, se incorporaron al estudio corvinas del lote R1-B correspondientes al muestreo 7 de aquel primer ensayo (esto es, cuando hacía unos 4 meses que habían pasado de la dieta Alphamar® a la Regius®, ver apartado II.1.). A este muestreo, por homogenizar, lo designamos ahora como 8-R. Finalmente, se añadió una nueva toma de muestras (muestreo 9-R de este ensayo) unos 6 meses después coincidiendo con la del muestreo 9-A del lote R1-A. Así pues, los muestreos 9-A y 9-R fueron específicos para este ensayo y no figuran en el experimento II.1 (ver tabla II.2.2.1.). Tabla II.2.2.1. Calendario de muestreos Lote R1-A Muestreo (días de cultivo) Pienso 1-A (0) 2-A (32) 3-A(61) 4-A (118) 5-A (166) 6-A (257) 7-A (306) 8-A (339) 9-A (504) Lote R1-B Muestreo (días de cultivo) Pienso (días consumo previo) 8-R (320) 9-R (504) Regius® (120) Regius® (315) Alphamar® En cualquier caso, durante todo el periodo controlado los animales se sometieron a las condiciones de producción operantes en la citada factoría y descritas con más detalle en la sección correspondiente del apartado II.1. Como principales variables ambientales recordamos que la salinidad de la zona se mantiene prácticamente 99 Sergio García Mesa constante (en torno a 37 ‰), el oxígeno disuelto nunca fue menor de 5.5 ppm y, gracias a un control diario, pudimos registrar una temperatura media de 17.9 ± 0.1 °C (rango 14.6-22.5 °C) (figura II.1.2.1.). Aunque también figuran en el mencionado apartado, reproducimos aquí, por cuestiones de proximidad, los datos de composición, más relevantes para este experimento, de los dos piensos utilizados (tabla II.2.2.2.) Como se indica en la tabla II.2.2.1., los muestreos se llevaron a cabo con intervalos de 1-2 meses, excepto los últimos de cada lote que se retrasaron unos 5 meses y medio. Cada muestra se basaba en corvinas obtenidas según lo explicado en el apartado anterior (II.1) sobre las que se efectuaron las medidas expresadas allí. Una submuestra (N=15) tomada al azar de esas muestras amplias se utilizó para el análisis de composición corporal y, finalmente, una nueva submuestra de la anterior (N = 5) se utilizó para determinar la composición del filete incluyendo el perfil de ácidos grasos. II.2.2.2. Análisis de los peces Como se ha indicado, los peces utilizados para el análisis del perfil de ácidos grasos del músculo formaban parte del lote utilizado en el ensayo anterior para determinación de índices tales como el hepatosomático, el digestosomático y de rendimiento del filete. Nos remitimos a los apartados IX.1.1. y IX.1.2. para más detalles del procedimiento. En concreto y en lo que respecta a la obtención del filete, ambos filetes fueron cuidadosamente diseccionados, se les separó la piel antes de pesarlos y, finalmente, fueron molidos y liofilizados para la determinación de contenido graso total y perfil de ácidos grasos. Los ácidos grasos se extrajeron y transesterificaron a partir de muestras, de dieta o músculo, según se describe en Rodríguez-Ruiz et al. (1998) y, con más detalle, en el apartado IX.2.2. de esta Memoria. Para la separación e identificación de los ácidos grasos de la mezcla se usó cromatografía gas-líquido según procedimientos y equipo descritos en el citado apartado IX.2.2. 100 Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales. Tabla II.2.2.2. Algunos datos de composición de las dietas usadas en este ensayo Composición Alphamar® Regius® Proteína (% s/sustancia seca) 43.25 46.29 Grasa (% s/sustancia seca) 25.72 22.23 Energía (MJ/Kg) 22.32 21.46 Relación proteína/energía (g/ MJ) 17.94 19.98 14:0 2.5 3.0 16:0 17.4 17.7 18:0 4.7 4.7 16:1n7 3.2 3.8 18:1n9 22.2 21.0 18:1n7 2.3 2.5 20:1n9 2.5 2.6 22:1n11 2.4 2.3 18:2n6 26.2 25.1 18:3n3 3.4 3.1 18:4n3 0.7 0.8 20:4n6 0.5 0.7 20:4n3 0.1 0.0 20:5n3 3.8 4.3 22:5n3 1.0 1.0 22:6n3 6.8 7.5 Total saturados 24.5 25.4 Total monoinsaturados 32.6 32.2 Total poliinsaturados n3 15.9 16.7 Total poliinsaturados n6 26.7 25.8 Relación n3/n6 0.59 0.65 Perfil de ácidos grasos (% sobre lípidos totales) Saturados Monoinsaturados Poliinsaturados A partir de los datos de composición en ácidos grasos se calcularon el índice de aterogenicidad (IA) y el índice de trombogenicidad (IT) según Ulbricht y Southgate (1991) tal como se describe en IX.2.2. El IA indica la relación entre la suma de los ácidos saturados más representados y la correspondiente de los insaturados, siendo los primeros considerados como pro-aterogénicos y los segundos como anti-aterogénicos. El 101 Sergio García Mesa IT muestra la tendencia a formar coágulos en los vasos sanguíneos y se define como la relación entre los considerados protrombogénicos (los saturados) y los antitrombogénicos (MUFA, PUFAn6, PUFAn3). El valor de la llamada calidad de los lípidos del pescado (FLQ) indica la relación porcentual en que los principales ácidos HUFAn3 (EPA y DHA) aparecen en el músculo con respecto al total de ácidos grasos: cuanto mayor sea este índice mejor se considera la calidad de esos lípidos en la dieta para humanos (Abrami et al., 1992). II.2.2.3. Tratamiento estadístico Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de comparación de medias por el test de Duncan (Duncan, 1955). Se consideró un nivel de significación del 95% como indicativo de diferencias significativas. En los resultados expresados como porcentajes (el caso de los ácidos grasos), estos fueron normalizados previamente usando la transformación arcoseno de acuerdo con Sokal y Rohlf (1981). Todo el tratamiento estadístico se llevó a cabo usando el paquete de software SPSS v15.0 para Windows®. II.2.3. RESULTADOS. II.2.3.1. Crecimiento e índices morfométricos. La tabla II.2.3.1. muestra un resumen recordatorio de algunos parámetros biométricos medidos a lo largo del experimento y que provienen fundamentalmente de los lotes R1-A y R1-B del apartado II.1. Los peces, que iniciaron el experimento con un peso próximo a 4 g, alcanzaron al final del periodo controlado los 211.4 g en el grupo A (Alphamar®, remesa R1-A) pero sólo 184.1 g en el grupo R (Regius®, remesa R1-B), en tanto que su longitud aumentaba de 7.5 a 27.4 cm y 26.5 cm, respectivamente. La tabla II.2.3.2., que muestra la tasa de crecimiento (SGR) de los periodos entre muestreos expone un leve efecto negativo de la dieta Regius® (lote R) sobre este parámetro en el periodo común (8-9) con unos valores de 0.26 frente a 0.30. 102 103 39.9abc±2.10 39.7ab±0.73 3.43 ± 0.28 c 5.72 ± 0.34 e 1.14 ±0.01 39.8abc±0.52 3.38 ±0.20 c 5.03 ± 0.20 de 1.18 ±0.01 d 18.85a±0.57 11.60c±0.11 3 A ±0.16 44.1abcd±0.48 2.6 ± 0.22 bc 4.38 bcd 1.07 ±0.01 bc 62.25b±2.00 17.86d±0.19 4 A ±0.21 42.6abcd±1.69 c 3.26 ±0.29 4.81 cde 1.09 ±0.01 c 84.56c±2.43 19.63e±0.17 5 A ±0.15 44.4bcd±1.03 ab 2.13 ± 0.17 4.14 bcd 1.03 ±0.01 b 89.79c±3.44 20.27e±0.23 6 A 45.6cd±0.035 2.24 ±0.14 ab 4.93 ±0.24 de 1.04 ±0.01 d 107.50d±4.43 21.42f±0.24 7 A 47.6d±0.73 2.80 ±0.17 bc 3.13 *±0.15 a 1.05 ±0.01 b 128.20d±6.49 22.73f±0.36 8 A 46.76±0.29 2.71±0.14 4.44±0.22 1.05±0.01 114.32±6.64 21.74±0.35 8 R 38.6a±2.26 1.98 ±0.19 ab 3.69 ±0.20 ab 0.97 ±0.01 a 211.38e*±9.22 27.42g±0.40 9 A 35.5±2.0 2.86±1.86 4.36±0.93 1.05±0.05 184.01±18.28 26.52±0.61 9 R 3.26 Lote R1-A Alphamar® 1.55 2-3 2.10 3-4 0.64 4-5 *basado en peso medio de cada muestreo e intervalo temporal entre ellos Lote R1-B Regius ® 1-2 Intervalo 0.07 5-6 0.37 6-7 0.53 7-8 Tabla II.2.3.2. Tasa de crecimiento (medido como SGR*) durante los diferentes periodos intermuestreales 0.29 0.30 8-9 Los datos son media ± EEM. Tamaño de las muestras: N ≈ 100 (muestreos # 1-7) and N ≈ 50 (muestreos # 8-9) para peso, longitud total y K. N = 15 en muestreos para biometría exhaustiva para IDS, IHS y RF (para más información ver experimento 2.1.). *A: lote R1-A alimentado con Alphamar®, B: lote R1-B alimentado con Regius® para esos muestreos 1 2 3 4 Índice de condición. Índice digestosomático. Índice hepatosomático. Rendimiento del filete. a, b, c... Valores con diferentes superíndices indican la existencia de diferencias significativas (p<0.05) atribuibles al periodo de muestreo. * indican diferencias atribuibles a las diferentes dietas (p<0.05) RF 4 IHS 1.47 ± 0.26 a 3 3.94 ± 0.16 bc 0.98 ±0.01 12.04a±0.43 4.10a±0.07 d 10.15b±0.10 7.46a±0.05 a 2 A 1 A 2 IDS K 1 Muestreo # Lote/Dieta* Longitud total (cm) Peso total (g) Tabla II.2.3.1. Influencia del periodo de muestreo y del tipo de pienso en algunos parámetros biométricos de la corvina. Sergio García Mesa El Índice de Condición (K), que relaciona peso y longitud, permaneció prácticamente constante y muy próximo a la unidad, sin que el tipo de dieta lo influyera de forma significativa. Ahora bien, durante los dos primeros meses, la ganancia de peso fue algo mayor, proporcionalmente, que la de longitud con lo que este índice aumentó ligeramente pero esta tendencia no se mantuvo en los periodos posteriores. Los índices digestosomático (IDS) y hepatosomático (IHS) (tabla II.2.3.1.) que exhibían valores próximos a 4 y 1.5%, respectivamente, en los peces más jóvenes, aumentaron de forma significativa durante los primeros meses de estancia en la piscifactoría. Posteriormente, el primero de ellos tendía a recuperar los valores iniciales de forma que, al final, no era significativamente diferente del inicial; en cambio esta recuperación no fue completa en el IHS por lo que los valores finales se mantenían por encima de los iniciales. Para estos índices, el tipo de dieta sólo tuvo un efecto moderado en el caso del IDS y el muestreo 8 (339 días en 8-A, 320 días en 8-R), quizá por el valor mínimo que alcanzó dicho índice en el lote A. El rendimiento del filete (RF) no cambió significativamente durante el periodo inicial pero aumentó entre los muestreos 2 y 3 (2-4 meses del cultivo) en el lote A y permaneció en esos valores hasta el final, cuando se detectó una caída que afectó por igual a ambos lotes. En lo que respecta al contenido lipídico de la principal porción comestible del pez, su músculo, la tabla II.2.3.3. muestra que, en el conjunto del periodo controlado, se produjo un aumento sostenido de dicho parámetro, al menos durante el primer año de estancia en las jaulas (muestreos 1 a 8-A), posteriormente la proporción de lípidos en músculo cayó ligeramente, en cualquier caso de forma no significativa. Los perfiles de ácidos grasos de esos lípidos musculares se muestran en las tablas II.2.3.3. y II.2.3.4. En los muestreos iniciales del lote A los ácidos grasos más abundantes eran el palmítico (PA, 16:0) entre los saturados (SFA), el oleico (OA, 18:1n9) entre los monoinsaturados (MUFA) y el docosahexaenoico (DHA, 22:6n3) entre los poliinsaturados (PUFA). Esta situación se mantuvo durante todo el ensayo. Por grupos, los SFA y MUFA estaban en una proporción similar y próxima al 30% mientras que los más abundantes, los PUFA, alcanzaban en torno a un 39%. Sin consideramos las series, había un claro predominio de los n3 con valores casi cuatro veces superiores a los n6. 104 105 ab 1.20 ±0.00 b a 1.03 ±0.01 c 1.39 ±0.13 1.38cd±0.02 c d c bcd 18:3n3 18:4n3 20:4n6 20:4n3 20:5n3 22:5n3 22:6n3 9.50 ±0.50 ab 1.73 ±0.03 b 6.03 ±0.08 c 0.53 ±0.03 b 0.93bc±0.03 1.00 ±0.00 bcd 1.28 ±0.09 b 5.13 ±0.33 cd 0.50 ±0.21 a 1.12cd±0.13 0.61 ±0.14 a 1.18 ±0.11 abc 11.85b±0.50 2.52 ±0.13 d 3.21 ±0.06 bc 3.49± 0.25 20.46 ±0.86 ab 4.82b±0.43 6.49bc±0.39 21.63 ±0.54 cd 2.94bc±0.40 65.31ab±2.37 3 A 0.91a±0.04 a 0.59 ±0.40 a 1.79±1.09 n.d. 0.33a±0.22 ±0.3 8 n.d. 1.51 abcd 14.92c±1.41 3.49 ±0.25 e 2.84 ±0.26 ab n.d. 29.09 ±2.43 d 5.92b±0.50 5.89ab±0.36 23.48 ±1.79 d n.d ±0.12 bc 1.58 ±0.02 b 4.15 ±0.48 ab n.d. 0.78ab±0.05 1.47 abcd 16.77c±1.09 1.65 ±0.27 b 2.71 ±0.23 ab n.d. 24.73 ±1.40 bcd 3.98a±0.10 7.55c±0.50 20.45 ±1.27 bcd 2.22ab±0.11 69.31b±6.59 67.60b ±6.06 3.76c±0.37 5 A 1.18ab ±0.14 4 A 1.38b±0.10 d 1.78 ±0.14 b 4.12 ±0.22 ab n.d. 1.41ab±0.11 1.62 ±0.0 5 n.d. cde 19.24c±0.63 1.48 ±0.03 b 2.33 ±0.01 a 21.00 ±0. 98 n.d. abc 3.08a±0.22 6.62bc±0.22 16.46 ±0.48 a 1.81a±0.10 66.32b±3.39 6 A 1.53c±0.16 ±1.1 cd 1.54 ±0.09 b 3.90 ±0.20 ab n.d. 1.17ab±0.03 n.d. 1.95 ±0.07 d 19.26c±0.83 1.68 ±0.15 b 2.35 ±0.16 a 0 n.d. 23.22 abcd 3.74a±0.13 5.76abc ±0.33 18.16 ±0.37 abc 2.10a±0.05 64.66ab±2.37 7 A 1.47c±0.14 cd 1.64 ±0.04 b 4.18 ±0.14 ab n.d. 1.37ab±0.11 0.68 ±0.09 a 1.83 ±0.11 cd 17.02c±0.35 1.74 ±0.15 bc 2.76 ±0.80 abc 21.84 ±0.6 1 n.d. abc 3.92a±0.30 6.16abc±0.44 17.13 ±0.19 a 2.16ab± 66.81b±4.49 8 A 2.04d ±0.21 1.43*±0.05 4.38±0.12 n.d. 1.26±0.09 0.14*±0.14 22.42*±0.3 8 2.17*±0.08 1.18*±0.14 1.99*±0.03 n.d. 20.57±0.54 3.11*±0.08 5.94±0.18 16.90±0.31 1.86±0.15 66.22 ±4.23 8 R 1.73±0.18 bcd 1.46 ±0.02 b 3.59 ±0.08 ab n.d. 1.52ab±0.07 18.38c± 0.30 1.54abcd±0.0 6 n.d. 1.60 ±0.04 b 2.37 ±0.08 a 26.21 ±0.4 2 n.d. cd 3.27a± 0.13 4.50a±0.13 17.72a±0.26 1.70a±0.13 67.43b±4.64 9 A 1.86d±0.10 1.53±0.05 3.48±0.08 n.d. 1.82*± 0.09 n.d. 1.44±0.06 19.56±0.66 1.61 ± 0.06 2.01*±0.09 n.d. 24.58±0.81 3.04±0.19 5.96*±0.445 17.34±0.34 1.48±0.10 66,60±7.59 9 R 1.73±0.20 13.00 ±0.9 8.54 ±2.20 10.92 ±0.98 17.13 ±1.28 14.04 ±1.14 14.58 ±0.6 14.58±1.55 14.05 ±0.6 14.91±069 9 5 5 ® ® Los datos son medias ± EEM, N=5. •A: lote R1-A alimentado con Alphamar , B: lote R1-B alimentado con Regius para esos muestreo n.d. = no detectado a, b, c... Valores con diferentes superíndices indican la existencia de diferencias significativas (p<0.05) atribuibles al periodo de muestreo. * indican diferencias atribuibles a las diferentes dietas (p<0.05) 13.74 ±0.48 2.94 ±0.12 10.90 ±0.23 0.81 ±0.03 8.13a±0.13 6.74a±0.13 Poliinsaturados 18:2n6 2.08 ±0.10 0.71 ±0.06 cd 3.40 ±0.20 a 2.56 ±0.10 22:1n11 c ab 3.52±0.09 18:1n7 23.40 ±0. 01 n.d. abcd 20:1n9 18.53 ±1.23 18:1n9 7.31c±0.21 Monoinsaturados 16:1n7 a 5.68ab±0.13 5.67abc±0.11 18:0 7.65c±0.05 22.73 ±0.23 d abcd ±0.37 5.05d±0.10 3.74c±0.17 60.70a±5.52 66.23b±7.36 19.40 1 2 A 0.90a±0.04 1 A 0.79a±0.05 16:0 Saturados 14:0 Muestreo # Lote/Dieta* Lípidos totales AGs (% de lípidos totales Tabla II.2.3.1. Influencia del periodo de muestreo y del tipo de pienso en algunos parámetros biométricos de la corvina. ∑PUFA n6 ∑PUFA n3 ∑PUFA ∑MUFA ∑SFA Lote/Dieta• Muestreo # 3.80f±0.19 8.11a±0.30 30.80f±1.01 38.91±1.04 32.63de±1.87 29.22b±0.93 A 1 0.65 f±0.09 2.21e±0.07 9.05a±0.18 19.98c±0.47 29.03±0.51 36.53e±0.32 33.45d±0.77 A 2 0.35 b±0.02 0.49 d±0.13 1.68d±0.15 12.97b±1.11 21.70cd±1.09 34.67±1.72 34.50cd±2.62 31.06c±1.85 A 3 0.50 d±0.05 0.56 e±0.47 0.81a± 0.11 15.56c±1.69 12.43a±1.42 27.99±2.51 41.34f±3.76 33.13d±2.75 A 4 15.07b±1.23 0.37bc±0.06 0.43c±0.43 1.05b±0.21 17.55d±2.46 18.12b±2.93 35.67±4.00 33.07cd±3.07 30.22bc±3.64 A 5 21.25d±1.00 0.25a±0.02 0.32a±0.18 1.20c±0.21 20.65e±1.17 24.65e±3.17 45.30±2.41 27.89a±2.39 24.89a±0.85 A 6 17.94c±0.98 0.29a±0.02 0.36ab±0.20 1.06b±0.16 20.43e±1.79 21.43cd±2.54 41.86±2.97 30.99b±2.64 26.02a±0.97 A 7 18.76c±0.85 0.27a±0.01 0.36ab±0.08 1.25c±0.10 18.39d±0.56 22.91de±1.41 41.30±1.58 30.29ab±2.17 25.45a± 0.98 A 8 18.96±0.78 0.26±0.17 0.33±0.82 0.95±0.32 23.68*±0.07 22.56±1.30 46.24±1.17 26.85±1.22 24.70±0.16 B 8 17.64c±0.95 0.27a±0.20 0.33a±0.15 1.04b±0.10 19.90e± 0.69 20.64 ±1.88 40.54bc±2.12 33.45de± 1.80 23.92a±1.54 B 9 18.39±0.10 0.27 ±0.20 0.31±0.09 1.00±0.12 21.38*±1.23 21.36±1.56 42.74*±1.17 31.24±2.16 24.78±1.50 B 9 Tabla II.2.3.4. Perfil de ácidos grasos de los lípidos de músculo en diversos momentos del ciclo de producción de la corvina (continuación). Los ácidos grasos se expresan como % del total. Relación n3/n6 0.48 d±0.07 0.39 c±0.01 10.33a±0.85 3 c IA 0.25 a±0.01 18.13c±0.96 3 1 2 15.53 b±1.02 IT 24.64 e±1.12 CLP 2 Los datos son medias ± EEM (N=5). •A: lote R1-A alimentado con Alphamar®, B: lote R1-B alimentado con Regius® para esos muestreos 1 Indice de aterogenicidad. Indice de trombogenicidad. Calidad de lípidos de pescado. a, b, c... Valores con diferentes superíndices indican la existencia de diferencias significativas (p<0.05) atribuibles al periodo de muestreo. * indican diferencias atribuibles a las diferentes dietas (p<0.05) 106 Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales. Pues bien, a lo largo del ensayo se produjeron cambios significativos en ese perfil base (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.), aunque muchos de ellos pueden ser considerados como menores e irrelevantes desde un punto de vista fisiológico. Sí que deben ser tenidos en cuenta el aumento significativo de la presencia de ácido linoleico (LA, 18:2n6) entre los PUFA y de ácido oleico (OA, 18:1n9), aunque en menor extensión, entre los MUFA. Entre los saturados los cambios detectados fueron escasos y sin una tendencia clara. Dado que el aumento de OA fue menor que la disminución de otros miembros de este grupo (por ejemplo, el palmitoleico 16:1n7) el total de MUFAs presentó una ligera oscilación con el tiempo, en torno al 30%, con un pico en el muestreo 4 que coincide con el del OA. El contenido total de PUFAs varió sustancialmente en esos primeros muestreos, llegando a superar la cifra del 45% en el muestreo 6 y exhibiendo una tendencia similar hasta el final del experimento. Dentro de este grupo el aumento en la serie n6, debido principalmente al de linoleico, fue acompañado por una disminución de la serie n3 que afectó principalmente al eicosapentaenoico. Estos cambios simultáneos en n3 y n6 condujeron a una caída en la relación n3/n6 de unos valores iniciales de 3.8 a otros próximos, incluso inferiores, a 1.0. En términos relativos, la mayor reducción en esta relación ocurrió entre los muestreos 3 y 4, posteriormente se detectó una cierta recuperación parcial. II.2.4. DISCUSIÓN Los expertos en nutrición humana y salud coinciden en la opinión de que la inclusión de pescado en la dieta diaria puede implicar un efecto preventivo contra ciertas enfermedades incluyendo algunas cardiovasculares (Pirini et al., 2010). En este caso los efectos beneficiosos parecen residir en el componente lipídico del pescado y, más concretamente, en la presencia de ciertos inhibidores de la agregación plaquetaria (Nasopoulou et al., 2007) y de determinados ácidos grasos mono y poliinsaturados, especialmente los de la serie n3. En nuestro seguimiento detectamos que a medida que se prolongaba la estancia de los peces en la piscifactoría el contenido lipídico de su músculo aumentó de 0.65 a 1.7-2.0% en sustancia fresca. El total de ácidos grasos significaba entre el 60 y el 70% de los lípidos, lo que coincide con datos previos de hígado y músculo de peces (Kandemir y Polat, 2007; Guil-Guerrero et al., 2011). Globalmente, los valores de contenido lipídico fueron claramente menores que los encontrados en otros peces marinos acuicultivados como la dorada y la lubina (Grigorakis, 2007) tal y como se ha comentado con anterioridad. 107 Sergio García Mesa El engrasamiento inicial de los peces más jóvenes de este seguimiento puede explicarse como debido a la transición de un pienso del tipo de los usados en hatcheries, rico en proteína y pobre en grasa, a uno de engorde con mayor contenido lipídico del tipo de Alphamar®. Tanto, Piccolo et al. (2008) como Chatzifotis et al. (2010) detectaron una mayor proporción de grasa en el músculo de corvina cuando se le alimentó con dietas ricas en grasa (hasta 21%) pero el valor más alto encontrado de grasa en músculo solo llegó al 3.6% (corvinas de 800 g, dieta con 20.7% de grasa). Poli et al. (2003) habían informado previamente que el contenido de grasa del músculo variaba de 2.06% (peces muestreados en noviembre) a 2.93% (peces muestreados en julio). En una reciente publicación con corvinas de unos 100 g de peso inicial a las que les suministraron dietas con diferentes relaciones proteína/grasa, Martínez-Llorens et al. (2011) encontraron una mejor correlación del contenido graso corporal con la tasa general de crecimiento que con el nivel lipídico de la dieta. En todos los casos, los bajos valores de grasa confirman la capacidad de estos peces para mantener una reducida acumulación de la misma en músculo, pese a ser alimentados con dietas hiperlipídicas lo que podría reflejar una disposición metabólica particular cuyo estudio se plantea como un tema de mucho interés. Para el consumidor humano no solo es importante el contenido graso de la porción comestible del pez sino, también, su perfil de ácidos grasos. A su llegada a la piscifactoría, los peces exhibían un patrón de ácidos grasos en músculo (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.) cuyas características esenciales eran: (a) ácidos palmítico, oleico y docosahexaenoico como los más abundantes dentro de los grupos respectivos de saturados, monoinsaturados y poliinsaturados, respectivamente, (b) cada uno de estos tres grupos representaba, aproximadamente, un tercio del contenido total y (c) entre los HUFA había una clara prevalencia de los de la serie n3 con respecto a los de la serie n6 (relación n3/n6 >>1). Esta situación podría ser considerada representativa de las especies de peces marinos (Lanari et al., 1999; Grigorakis et al., 2002; Orban et al., 2003; Özyurt y Polta, 2005, 2006; Yildiz et al., 2006)) incluyendo a la corvina (Poli et al., 2003; Hernández et al., 2007; Piccolo et al., 2008). La alta proporción de HUFAn3 es comúnmente atribuida al predominio de ésos en la red trófica marina (Sargent et al., 1995). Muy a menudo, factores como la salinidad del agua, la temperatura y la composición de la dieta se consideran como los determinantes principales de posibles cambios en el perfil de ácidos grasos del cuerpo de un pez. En nuestro caso, la salinidad ambiental no varió en un nivel apreciable a lo largo del experimento, en tanto que la temperatura lo hizo sólo ligeramente (ver figura II.2.4.1.). 108 Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales. Un aumento en la proporción de HUFA en los lípidos de los peces suele considerarse parte de la adaptación a temperaturas bajas aunque esta circunstancia tiene una magnitud variable entre especies y entre tipos de lípidos (más patente en los polares que en los neutros) (Greene y Selivonchick, 1987; Henderson y Tocher, 1987). En nuestro caso (tablas II.2.3.2. y II.2.3.3.) cuando se comparan las muestras obtenidas en la estación cálida (muestreos 2-3) con aquellas de la estación más fría no se encontraron diferencias consistentes ni el nivel de HUFA totales ni en los de EPA, AA (araquidónico, 20:4n6) y DHA. Datos de otras especies mediterráneas (Özyurt y Polat, 2005, 2006; Yildiz et al., 2006; Senso et al., 2007) coinciden en que las diferencias estacionales en el perfil de ácidos grasos de los peces de este entorno geográfico son menores o inexistentes, al menos en lo que concierne a los ácidos grasos individuales o a los grupos comentados más arriba. Poli et al. (2003) detectaron algunas diferencia en el perfil de ácidos grasos en corvinas de cultivo recogidas en noviembre con respecto a las muestreadas en juniojulio (aunque los autores informaban de que la temperatura varió, a lo largo de su ensayo, entre 17.2 y 28.6 °C no proporcionaban datos concretos de la operante cuando se tomaron las diferentes muestras). En concreto, los PUFAn3, pero también los saturados, eran más abundantes en la muestra de noviembre en la que los monoinsaturados estaban más reducidos. Las temperaturas relativamente altas, incluso en invierno, en el Mediterráneo y áreas atlánticas adyacentes podrían estar en la base de la ausencia de unos marcados efectos estacionales. De hecho, como se puede observar en la figura II.2.4.2. las oscilaciones térmicas estacionales no fueron muy marcadas y se vieron a veces superadas por la magnitud de ciertos cambios de plazo mucho más corto, muy posiblemente asociados a temporales de viento muy frecuentes en la zona. Por otra parte, resulta complicado definir con precisión los posibles efectos de la temperatura del agua sobre el perfil de ácidos grasos del cuerpo de los peces cuando se pretende determinar ese efecto a partir de muestreos temporales sucesivos de los mismos desde su medio natural o de una piscifactoría ya que otras variables biológicas tales como la edad, el estatus reproductivo, los cambios en la composición de la dieta (presas naturales o alimento artificial) pueden superponer sus efectos a los estrictamente ambientales abióticos. En nuestro ensayo (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.), el cambio más relevante, cuando se considera la totalidad del periodo experimental, es la marcada reducción en la relación n3/n6 desde un valor inicial próximo a 4.0 hasta uno muy cercano a 1.0. Esta caída se debe tanto a una reducción de los niveles de PUFAn3, principalmente, EPA, como a una elevación de los de LA cuya presencia se multiplica por un factor superior a 3. Otros cambios marcados afectan al grupo de los MUFA, incluyendo una reducción del palmitoleico (POA, 16:1n7) y un incremento del oleico. Como una tendencia general, los 109 Sergio García Mesa cambios indicados fueron especialmente notables en la primera parte del experimento, siendo apreciable con posterioridad una tendencia a la estabilización. Una vez más, la transición de una dieta de hatchery basada en aceite de pescado como principal fuente lipídica y muy rica en HUFAn3 a las dietas comerciales aquí utilizadas y que incorporaban altos niveles de aceites vegetales, especialmente ricos en oleico y linoleico fue, con toda probabilidad, la causa principal de los cambios observados (tabla II.2.3.2. y figura II.2.4.1.). Los dos últimos ácidos grasos eran los más abundantes en los lípidos de las dietas usadas en este experimento, superando en mucho su nivel habitual en los aceites de pescado comercializados y representando, entre ambos, casi un 50% del total de ácidos grasos de los piensos resultando una baja relación n3/n6. Los datos de Martínez-Llorens et al. (2011) con corvinas de unos 100 g de peso inicial, muestran ya una reducida relación n3/n6 (inferior a la unidad) en los lípidos del cuerpo entero, también muy probablemente debida al uso previo de piensos ricos en aceites vegetales. Llama la atención que entre las 4 dietas que estos autores ensayan, en las dos que procuran mayor crecimiento, junto con un ligeramente mayor contenido proteico y algo menor de grasa, ésta aporta cifras sustancialmente más elevadas de HUFAn3 y una mayor relación n3/n6 (1.2 frente a sólo 0.3, aproximadamente) aunque los autores no hacen mención a esta circunstancia. En nuestro seguimiento, la dieta suministrada estaba en un valor de 0.6 intermedio entre los dos citados. 14:00 30 n3/n6 (x20) 25 16:00 20 15 22:6n-3 18:00 10 5 Aceite de pescado Alphamar® 0 22:5n-3 16:1n-7 20:5n-3 Regius® 18:1n-9 20:4n-6 18:2n-6 Figura II.2.4.1. Perfil de los principales ácidos grasos de las dietas comerciales, frente al aceite de pescado Se ha publicado repetidamente que la sustitución de aceite de pescado por aceites vegetales en los piensos para peces podría reducir los costes y mejorar la sostenibilidad ambiental de la piscicultura sin efectos negativos sobre el crecimiento de 110 Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales. los animales, siempre y cuando los mencionados piensos cubran las necesidades de ácidos grasos esenciales de estos animales. No obstante, estas manipulaciones de los ingredientes de la dieta implican cambios en la composición de los lípidos corporales del pez o, específicamente, en su músculo que tienden a reflejar la de los lípidos de la dieta. Estos cambios podrían afectar tanto al sabor del pescado y a su aceptación por los consumidores, como a las propiedades saludables de esta fuente de grasa para el consumo humano. De hecho, se están probando diversas estrategias, para un “remodelado” (taylorization) del perfil de ácidos grasos del pez antes de su puesta en venta cuando el mismo ha sido alimentado con esos piensos ricos en aceites vegetales; estas estrategias incluyen el uso de dietas especiales durante unas semanas o meses antes del sacrifico y traslado al mercado (Izquierdo et al., 2005; Grigorakis et al., 2007). Las figuras II.2.4.2. a II.2.4.4., que presentan la relación “pez a dieta” (P/D) de varios ácidos grasos individuales o grupos de ellos, muestran claramente la convergencia entre ambos perfiles de ácidos grasos tanto para el ácido linoleico (el elemento más abundante de muchos aceites vegetales) como para los HUFAn3 (los más abundantes en el aceite de pescado). Ambas circunstancias han reducido el cociente P/D de la relación n3/n6 por un factor próximo a 4 (figura II.2.4.4.); una reducción clara de estas relaciones también ha sido detectada en el músculo de doradas y lubinas alimentadas con una alta proporción de aceites vegetales en su dieta (Grigorakis et al., 2007). En lo que respecta a los HUFAn3 individuales resulta evidente que las corvinas han preservado los niveles de DHA en valores de aproximadamente el doble que los de la dieta (figura II.2.4.2.), mientras que la relación P/D del EPA mostró una notable reducción hasta valores próximos a la unidad. Esta situación podría ser indicativa de una mayor necesidad específica de DHA que podría ir acompañada de una elongación y desaturación de EPA a DHA cuando las aportaciones alimentarias de éste último resulten insuficientes para cubrir las necesidades metabólicas del pez. Es asimismo notable la práctica desaparición de los ya inicialmente reducidos niveles de otros precursores insaturados Δ6 (18:4 n3, 20:4 n3) quizá también utilizados para sintetizar y mantener esos niveles de DHA. El posible estrés metabólico asociado a esta situación debería ser tenido en cuenta a la hora de formular piensos bajos en aceite de pescado/altos en aceites vegetales para el cultivo de peces ya que podrían verse afectados, no sólo la composición de los lípidos del animal sino, también, su salud y crecimiento. Resulta muy interesante considerar la posible inclusión de aceites de algunas semillas de oleaginosas especialmente ricas en los precursores más cortos de los ácidos grasos insaturados Δ6, como posibles ingredientes futuros en los piensos para peces marinos. 111 Sergio García Mesa 2 SFA MUFA 1 PUFAn3 PUFAn6 0 0 33 62 119 167 258 307 340 504 Días de cultivo Figura II.2.4.2. Evolución de la relación “pez/dieta” de los grupos de ácidos grasos de los lípidos musculares de las corvinas en distintos momentos del ciclo de producción 3 16:1n7 2 18:1n9 18:2n6 1 20:5n3 22:6n3 0 0 33 62 119 167 258 307 340 504 Días de cultivo Figura II.2.4.3. Evolución de la relación “pez/dieta” de los principales ácidos grasos de los lípidos musculares de las corvinas en distintos momentos del ciclo de producción. 7 6 5 4 3 n3/n6 2 1 0 0 33 62 119 167 258 307 340 504 Días de cultivo Figura II.2.4.4. Evolución de la relación “pez/dieta de la relación n3/n6 en el músculo de las corvinas a lo largo del ciclo de producción. 112 Evolución del contenido de grasa y ácidos grasos en el músculo de corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) durante la fase inicial de cría en piscifactoría con dietas comerciales. Al considerar la evolución de los índices de calidad de los lípidos del pescado utilizados (tabla II.2.3.4.), la situación no aparece definitivamente clara. Por una parte, el FLQ empeora con el tiempo debido a la reducción de la presencia de EPA, pero cuando el índice utilizado incluye otros ácidos grasos, tal como ocurre para IA e IT, el efecto negativo sobre los mismos de la reducción de la relación n3/n6 y del nivel total de HUFAn3 es parcialmente contrarrestada por los efectos beneficiosos de la reducción de los saturados y del aumento de monoinsaturados y de los poliinsaturados de la serie n6. Poli et al. (2003) y Piccolo et al. (2008) reportaron valores de IA de 0.48 a 0.69 y de IT de 0.09 a 0.39 en sus experimentos con corvina, valores que se sitúan dentro del rango de los encontrados en este seguimiento y para otros peces marinos acuicultivados (Grigorakis et al., 2007). Al contrastar los perfiles de ácidos grasos del músculo de corvinas alimentadas con las dos dietas comerciales utilizadas (Alphamar® y Regius®) las únicas diferencias encontradas son de poca entidad, lo cual no es de extrañar ya que ambos piensos, aunque algo diferentes en su contenido lipídico total, no lo eran prácticamente en su perfil de ácidos grasos (tabla II.2.3.2. y figura II.2.4.1.), muy posiblemente por estar formuladas con las mismas materias primas lipídicas y en proporciones parecidas. Si, como parece deducirse de lo anteriormente comentado, el principal determinante de la composición en ácidos grasos del pez ha sido la correspondiente de la dieta, al no ser éstas diferencias muy importantes tampoco lo serán las de los peces alimentadas con ellas (tablas II.2.3.3. y II.2.3.4.). Un trabajo previo con corvinas de 800 g (Piccolo et al., 2008) prueba los efectos de dos piensos con diferencias sustanciales en su relación proteína/lípidos y el contenido energético total, encontrándose diferencias en crecimiento, ciertos rasgos biométricos y composición general. En cambio las diferencias cualitativas (perfil de ácidos grasos) del filete son menores reflejando otra vez que las dietas, aunque diferentes en el contenido graso total, no lo eran tanto en su perfil de ácidos grasos. En un estudio de más corta duración, algo menos de 6 meses, Martínez-Llorens et al. (2011) usaron dietas comerciales de diferentes proveedores y, aunque informan que estaban basadas en todos los casos en las mismas materias primas, existen diferencias sustanciales en el perfil porcentual de ácidos grasos de su componente lipídico que afectan tanto a LA, como a OA y HUFAn3. Desafortunadamente, no se incluyen datos sobre la composición en ácidos grasos de los peces alimentados con las diferentes dietas. 113 Sergio García Mesa II.2.5. RESUMEN Los datos de nuestro seguimiento confirman la alta proporción de la parte comestible del cuerpo del animal, siendo su contenido en grasa total relativamente bajo, pese al aumento detectado durante el cultivo. Por otra parte, el contenido de ácidos grasos del músculo puede considerarse beneficioso desde el punto de vista de la salud del consumidor humano, similar al encontrado en doradas y lubinas de cultivo, aunque cuando se utilizan piensos con contenido lipídico total elevado y alta proporción de aceites vegetales dentro del mismo, los sustitutos del aceite de pescado deberían ser seleccionados cuidadosamente, no descartando la inclusión aceites ricos en 18:4n3 y 20:4n3, ni el uso de “piensos de acabado” ricos en HUFAn3. 114 III. Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina Argyrosomus regius (Asso, 1801) cultivada. III.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. La capacidad de los peces para utilizar el alimento es, en buena parte, el resultado de la actividad de las enzimas digestivas e influye decisivamente sobre su tasa de crecimiento. Gran cantidad de investigaciones han evaluado esta capacidad de los animales para digerir los principales nutrientes del alimento, caracterizando la actividad de las enzimas digestivas (proteasas totales, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa) (Guzmán et al., 2001), así como los numerosos factores que influyen dicha actividad (por ejemplo, especie, edad, hábitat, temperatura y composición del alimento; Hidalgo et al. (1999). El desarrollo de dietas para peces pretende la obtención de un máximo crecimiento al menor coste posible y esto se puede conseguir, entre otras formas, aumentando el aprovechamiento que el pez hace del alimento. El estudio de la actividad de las enzimas digestivas en una especie de nuevo cultivo puede ayudar al desarrollo de piensos específicos, dado que la diferente capacidad digestiva hace que el aprovechamiento del pienso sea diferente para cada especie (Chakrabarti y Sharma, 2005). También se ha visto que el conocimiento de las condiciones óptimas de funcionamiento de las actividades enzimáticas puede aumentar la comprensión de la digestibilidad de los nutrientes en los peces (Kolkovski, 2001). Las proteasas tienen un especial interés, dado que la proteína es el principal componente de los piensos y su uso es fundamental para el crecimiento de los peces, en tanto que este principio inmediato es fuente tanto de aminoácidos como de energía (Essed et al., 2002; Kaushik y Seiliez, 2010). Los estudios de las enzimas proteolíticas de los peces han proporcionado información importante para mejorar la utilización de la proteína del alimento. Lemieux et al. (1999) mostraron que la actividad proteasa estaba relacionada con un aumento en la eficiencia de la utilización del alimento y, consecuentemente, con el crecimiento en bacalao del Atlántico (Gadus morhua). En peces carnívoros se ha determinado que la tripsina y la quimotripsina son enzimas claves debido a su alta actividad proteolítica, encontrándose una relación directa entre la 115 Sergio García Mesa actividad de éstas y el crecimiento de los peces. En particular la actividad tripsina es un potencial factor limitante de la tasa de crecimiento y de la utilización de los nutrientes del alimento por los peces (Rungruangsak-Torrissen et al., 2006). En trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y salmón atlántico (Salmo salar) se observó una relación lineal entre la actividad de la tripsina y la digestibilidad de la proteína (Krogdahl et al., 1994, Rungruangsak-Torrissen et al., 2006). La tripsina es una enzima que, además, activa a otras proteasas pancreáticas, como la quimotripsina, en mamíferos y peces (Sunde et al., 2001). Su actividad aumenta en condiciones de rápido crecimiento, mientras que la quimotripsina juega un papel más importante cuando el crecimiento del pez está deprimido (Rungruangsak-Torrissen et al., 2006). A pesar de la importancia de las enzimas proteolíticas, no hay que descartar un mucho menos el papel de otras enzimas digestivas como lipasas y amilasas que, aunque han recibido una menor atención por los investigadores, deben ser consideradas porque, entre otras cosas, se está considerando cada vez más ampliamente la posibilidad de aumentar el contenido de hidratos de carbono y grasa como fuente de energía que puede suponer un ahorro de proteína en piensos para peces. Son pocos los estudios realizados sobre las necesidades nutricionales de la corvina (Argyrosomus regius); Turano et al., (2002) hablan de un contenido óptimo de proteína de 44% mientras que Piccolo et al., (2008) establecieron el nivel óptimo de grasa en el 17%. Martínez-Llorens et al. (2011) han determinado porcentajes de proteína/grasa (46/20) en la dieta para el crecimiento óptimo de corvinas de 90 g. Sin embargo, aún existen lagunas importantes relativas a su alimentación. Son pocos los estudios destinados a conocer su fisiología digestiva, aspecto esencial para optimizar la utilización de los nutrientes en especies de peces cultivados. Recientemente, Estévez et al. (2011) han estudiado el efecto de la inclusión de proteínas vegetales en piensos sobre la actividad digestiva del ribete en cepillo en esta especie. El presente trabajo pretende la caracterización preliminar de la capacidad digestiva de la corvina, con objeto de sentar bases para el desarrollo de fórmulas alimenticias específicas para su cultivo. En este sentido, en primer lugar hemos procedido a determinar la distribución de las actividades proteasa total, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa en el tubo digestivo de esta especie y el efecto del pH sobre la actividad proteasa total. En segundo lugar se han valorado y discutido las similitudes y diferencias entre la actividad proteasa de la corvina y las de otras especies de peces cultivados en condiciones similares. 116 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada III.2. MATERIALES Y MÉTODOS. III.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos. Para la primera parte del presente trabajo se han utilizado juveniles de corvina de 194 5 g criados en las instalaciones del Centro del IFAPA de El Toruño, en el Puerto de Santa María (Cádiz). Los ejemplares se mantuvieron en tanques de 4 m3 (40 peces por tanque) con un suministro de agua, previamente filtrada y aireada, de 5-10 L/min con una temperatura de 22.3 ± 0.1°C. Los peces se alimentaron diariamente mediante comedero automático con una ración del 1% del peso corporal. Se utilizó un pienso comercial (SKRETTING, C.V. 6), cuya composición se muestra en la tabla III.2.1. Tabla III.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca) Componente Proteína bruta Grasa bruta (extracto etéreo) Cenizas Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)* Energía** (MJ/Kg) Relación Proteína/Energía (g/MJ) 472.0 204.7 77.2 246.1 238.3 198.0 * calculado como 1000 – (Proteína bruta + extracto etéreo + cenizas) ** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y MELN, respectivamente Al final de un periodo de 2 semanas y tras un ayuno de 24 h para eliminar el contenido del tubo digestivo, se tomaron 14 corvinas, se sacrificaron según la Directiva 010/63/EU (sobredosis de metacaína), y, tras ser pesados, se diseccionaron para la determinación de los índices hepatosomático (IHS) y digestosomático (IDS); el tubo digestivo extraído se dividió en los siguientes tramos: estómago (E), ciegos pilóricos (CP), intestino proximal (IP) e intestino distal (ID) para determinar, en cada uno de ellos , las actividades proteasa ácida y alcalina, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa; además, para las actividades proteasas ácida y alcalina se estudió el efecto del pH en los distintos tramos intestinales. Para la segunda parte del trabajo se utilizaron ejemplares de corvina (Argyrosomus regius), dorada (Sparus aurata) y mero (Epinephelus marginatus) cultivados con las mismas condiciones ambientales y de manejo en jaulas de las instalaciones de Acuisleta S.L. (La Isleta del Moro, Almería). La alimentación se realizó de forma manual una vez al día, seis días a la semana, con pienso comercial (BIOMAR. Ecolife 63 CHS 4.5 mm, 44.0% de proteína bruta y 20.0% de grasa) con una ración diaria 117 Sergio García Mesa equivalente al 1% del peso corporal. Los muestreos se realizaron en el mes de febrero de 2010, cuando la temperatura del agua era de 15 ± 0.1 °C. Adicionalmente, se incorporaron al estudio ejemplares de tilapia (Oreochromis niloticus) mantenidas en el acuario emplazado en las instalaciones de la Universidad de Almería en cubas cilíndricas de fibra de vidrio de 0.3 m3 de capacidad, con aireación constante, renovación de agua de 300 L/hora, y condiciones naturales de temperatura y fotoperiodo, en un sistema cerrado de circulación de agua mediante un doble filtro de arena y biológico. Estos peces se habían alimentado dos veces al día de forma manual hasta saciedad aparente con un pienso experimental libre de soja (40.2% de proteína, 10.3% de grasa). La toma de muestras se basó en 5 ejemplares de cada especie siguiendo el mismo protocolo antes descrito. Los peces sacrificados se envasaron en cajas de polipropileno, recubiertos con hielo y se transportaron al laboratorio de Producción Animal de la Universidad de Almería. Se realizó la disección y extracción del tubo digestivo de forma similar a la indicada en el apartado anterior, determinándose, en este caso, la actividad proteasa alcalina a diferentes valores de pH en el medio de reacción. III.2.2. Procesado de las muestras y análisis de las actividades digestivas. Cada fracción digestiva se homogeneizó con agua fría ultrapura en proporción 1:4 (peso:volumen) y se centrifugó a 16000 rpm durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante obtenido se congeló a -80°C hasta el posterior análisis de las actividades enzimáticas. El contenido en proteína soluble de los sobrenadantes se determinó por el método de Bradford (1976), usando seroalbúmina bovina como patrón. La actividad proteasa ácida se determinó utilizando hemoglobina al 0.5% como sustrato según Anson (1938). La actividad proteasa alcalina se evaluó usando el método descrito por Walter (1984), con caseína al 1% como sustrato. El análisis de la actividad tripsina se realizó según el procedimiento descrito por Erlanger et al. (1961) con algunas modificaciones de Faulk et al. (2007). La actividad quimotripsina se determinó según el método descrito por Hummel (1959) modificado por Applebaum y Holt (2003). Para la determinación de la actividad α-amilasa se utilizó un kit comercial de diagnóstico (Labkit, 30140) basado en el método enzimático-cinético CNPG3 (Ying et al., 1998). La actividad lipasa se determinó según el método desarrollado por Gjellesvik et al. (1992) con las modificaciones propuestas por Lazo et al. (2000). Todos los métodos citados están descritos con detalle en el apartado IX (Metodología) de esta Memoria. 118 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada III.3. RESULTADOS. III.3.1. Influencia del pH sobre la actividad proteasa La tabla III.3.1. muestra el efecto del pH sobre la actividad proteasa total en diferentes porciones del digestivo de la corvina. Las proteasas ácidas presentes en el extracto estomacal mostraron un óptimo de actividad para un pH entre 2.0 y3.0. Por su parte, las proteasas de los extractos intestinales mostraron un óptimo de actividad en el rango de pH de 9.0 a 10.0, con un máximo bien definido para este último valor. La distribución de la actividad proteasa alcalina en las distintas porciones del intestino fue homogénea. Tabla III.3.1. Efecto del pH de incubación sobre la actividad proteasa ácida y alcalina (U/mg proteína) de extractos de estómago y diferentes tramos del intestino de la corvina. pH E CP IP ID c 27.45 ±1.94 2.0 26.68c±1.98 3.0 20.41b±1.53 4.0 0.42ª±0.05 5.0 0.33ª±0.03 5.29b±0.51 6.21b±0.97 5.96b±0.59 6.0 0.13ª±0.02 4.17b±0.53 6.68b±1.07 7.31b±0.92 7.0 5.80b±0.56 5.28b±0.62 6.87b±0.70 8.0 8.00c±0.74 6.55b±0.55 11.31c±1.09 9.0 14.14d±0.79 13.06c±0.95 16.71d±0.78 10.0 0.03ª±0.00 0.03ª±0.01 0.03ª±0.01 12.0 Los valores son media ± EEM (N=14). Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre diferentes valores de pH para un mismo fragmento del tracto digestivo. E: estómago; CP: ciegos pilóricos; IP: intestino proximal; ID: intestino distal. III.3.2. Distribución anatómica de las actividades digestivas en la corvina. Los valores medios de los parámetros biométricos de las corvinas utilizadas para el ensayo fueron: 194.7 ± 5.1 g peso total; 2.3 ± 0.5 g peso de hígado; 5.1 ± 0.6 g peso de digestivo; 1.2% ± 0.2 índice hepatosomático; 2.6% ± 0.3 índice digestosomático. Las actividades enzimáticas en extractos de diferentes porciones del tracto digestivo de la corvina expresadas como actividad específica (unidades/mg de proteína) se muestran en tabla III.3.2. 119 Sergio García Mesa Tabla III.3.2. Actividad específica (U/mg proteína) de enzimas digestivas de extractos de estómago y diferentes tramos del intestino de corvina. pH E CP IP ID Proteína 15.63±0.46 10.22±0.33 10.02±0.33 11.73±0.54 soluble (mg/ml) 27.45c±1.94 Proteasa ácida 2.0 Proteasa 14.14d±0.79 13.06c±0.95 16.71d±0.78 8.0 alcalina 1.04a ±0.08 4.32b ±0.23 1.00b ±0.07 1.13a±0.12 Tripsina 8.2 19.34a ±1.53 501.61d±16.25 245.99c±14.37 193.41b ±13.71 Quimotripsina* 7.8 8.62b±0.60 4.05a±0.59 6.73b±0.71 T/QT** 1.09a ±0.07 6.21d ±0.21 4.38c ±0.13 1.99b ±0.20 Lipasa 7.4 0.62a ±0.03 2.65c ±0.10 2.60c ±0.12 1.32b ±0.10 Amilasa 6.0 Los valores son medias ±E EM, N=14. Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre diferentes porciones del digestivo. E: estómago; CP: ciegos pilóricos; IP: intestino proximal; ID: intestino distal *Quimotripsina como mU/mg proteína. **T/QT: Relación de actividades Tripsina/Quimotripsina La actividad proteasa ácida determinada en extractos de estómago incubados a pH 2.0 con hemoglobina como sustrato mostró valores elevados. Por el contrario, no se pudo detectar este tipo de actividad en ninguna otra zona del tubo digestivo. El resto de actividades enzimáticas estudiadas también mostraron cierta presencia en extractos estomacales, si bien en general muy por debajo de las medidas en tramos intestinales. La actividad proteasa alcalina determinada en extractos intestinales incubados a pH 10.0 con caseína como sustrato mostró valores similares a lo largo de todos los tramos del tracto intestinal estudiados. En relación con las actividades proteolíticas específicas estudiadas, tanto la actividad tripsina como quimotripsina fueron claramente superiores en ciegos pilóricos que en tramos posteriores del intestino. La relación T/Q fue superior en ciegos pilóricos e intestino distal e inferior en la porción anterior del intestino. Las actividades lipasa y amilasa también mostraron valores máximos en los extractos de ciegos pilóricos y disminuyeron a lo largo del tracto digestivo, siendo los valores marcadamente inferiores en la porción final del mismo. 120 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada III.3.3. Actividad proteasa alcalina en diferentes especies La tabla III.3.3. muestra los parámetros biométricos de los ejemplares de corvina, dorada, mero y tilapia utilizados para el estudio de la actividad proteasa alcalina. Se utilizaron individuos de peso aproximado para las corvinas y las doradas (467.4 y 321.6 g respectivamente), pero no para las otras dos especies, ya que debimos adaptarnos a los animales disponibles en el momento del muestreo: meros de pesos superiores (817.7 g), tilapias de menor peso (123.0 g). Tabla III.3.3. Parámetros biométricos en las distintas especies. CORVINA MERO TILAPIA 321.60 ±5.28 d 817.75 ±83.48 123.00a±14.58 5.34b±0.96 4.23b±0.84 9.66c±1.66 1.1a±0.09 12.72b±0.90 13.41b±1.22 28.44c±5.71 4.95a±0.77 IHS (%) 1.12±0.15 1.33±0.61 1.20±0.21 0.89±0.07 IDS (%) 2.71a±0.11 4.15b±0.30 3.39ab±0.39 3.95b±0.27 c 467.40 ±34.78 Peso hígado (g) Peso digest. (g) Peso (g) DORADA b Los valores son media ± EEM. (N=5). Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre diferentes especies. IHS: índice hepatosomático; IDS: índice digestosomático. Estas diferencias de peso total entre especies fueron paralelas a las de sus correspondientes hígados, por lo que el índice hepatosomático fue muy similar entre las cuatro especies. No se apreció esta circunstancia en lo que concierne a los tubos digestivos por lo que los índices digestosomáticos resultaron superiores en dorada y tilapia e inferiores en corvina. La actividad proteasa alcalina para las distintas especies y fracciones del tracto digestivo se muestra en la tabla III.3.4. Los resultados muestran valores máximos de actividad en ciegos pilóricos a pH 10.0 para todas las especies. En los extractos de intestino anterior y posterior también son máximos los valores a ese pH, siendo muy similares a los observados en los ciegos pilóricos. Los resultados muestran valores de actividad proteasa alcalina en corvina similares a los de la dorada e inferiores a los de mero y tilapia. 121 Sergio García Mesa Tabla III.3.4. Efecto del pH sobre la actividad proteasa alcalina (U/mg proteína) de extractos de distintas porciones del intestino en las diferentes especies. pH CORVINA DORADA MERO TILAPIA CP 7.0 8.0 9.0 10.0 12.0 0.82a±0.08 0.98a±0.05 1.41a±0.05 3.21a±0.09 0.45a±0.03 1.30a±0.08 1.42a±0.11 1.49a±0.07 4.68b ±0.04 0.42a±0.08 2.39b±0.13 2.76b±0.04 2.77b±0.16 9.49b±0.34 0.42a±0.04 4.83c±0.43 4.48c ±0.28 4.40c ±0.34 9.39c ±0.43 4.25b ±0.08 IP 7.0 8.0 9.0 10.0 12.0 0.75a±0.06 0.78a±0.03 1.01a±0.06 2.72a±0.11 0.43a±0.02 0.78a±0.09 1.19a±0.12 1.63a±0.26 4.01a±0.15 0.39a±0.05 2.27b±0.29 2.32b±0.18 3.10b±0.10 9.47d±0.13 0.33a±0.01 4.39c±0.49 4.81c±0.44 4.27c±0.36 8.40c±0.28 4.14b±0.09 ID 7.0 8.0 9.0 10.0 12.0 0.83a±0.05 0.95a±0.04 1.02a±0.08 2.46a±0.20 0.51b±0.03 0.79a±0.08 1.25a±0.13 1.54a±0.10 4.91 b ±0.26 0.42ab±0.07 2.13b±0.27 2.33b±0.26 2.64b±0.12 9.28c±0.28 0.28a±0.02 4.47c±0.54 5.01c±0.09 4.34c±0.38 9.08c±0.58 4.16c±0.12 Los valores son media ± EEM. (N=5). Superíndices muestran diferencias significativas (P<0.05) entre diferentes especies. CP: ciegos pilóricos; IP: intestino proximal; ID: intestino distal. III.4. DISCUSIÓN. La corvina es un pez carnívoro que, en su hábitat natural, se alimenta de peces pelágicos y cefalópodos (Calderón et al., 1997). Su tracto digestivo es típico de peces carnívoros, estando constituido por un esófago, un estómago de paredes musculosas, una serie de ciegos pilóricos y un intestino no demasiado largo. El tamaño relativo del intestino resultó menor en la corvina que en el resto de las especies estudiadas (tabla III.3.3.), tal y como se refleja en los bajos valores de IDS, propios de peces esencialmente carnívoros. Es difícil comparar resultados con referencia a la actividad digestiva entre distintas especies de peces debido a que los datos proceden de experimentos en los que se utilizan especímenes de muy distinta procedencia, con diferentes tipos de alimentación y distintos tipos de preparación de las enzimas (Alarcón et al., 1998). Sin embargo, el hecho de que los estudios relativos a la capacidad digestiva de la corvina sean escasos (Estévez et al., 2011), nos obliga a comparar los resultados obtenidos en nuestro experimento con los realizados en otros peces, con la finalidad de completar la información sobre la capacidad digestiva de esta especie. 122 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada En este sentido, la actividad pepsina, principal responsable de la actividad proteasa ácida de los peces (Xion et al., 2010), fue inferior en extractos de estómago de las corvinas a la observada en otras especies de peces carnívoros, como el atún rojo (Thunus thynnus, Essed et al., 2002) o el atún azul (Thunnus orientalis, Matus de la Parra et al., 2007) que mostraron valores de 761.3 y 41.3 U/mg proteína respectivamente en condiciones similares de ensayo. Las diferencias podrían ser debidas al diferente tipo de alimentación: piensos comerciales en nuestro experimento frente a una alimentación basada en pescado fresco en el atún. En efecto, debemos tener presente la elevada capacidad tamponadora que presentan las proteínas de origen vegetal presentes en la práctica totalidad de los piensos comerciales. De hecho, el valor óptimo de pH para esta actividad se sitúa normalmente en un estrecho rango alrededor de 2.0 y disminuye sensiblemente cuando nos apartamos de él. Pues bien, cuando se mide el pH del contenido estomacal en peces poco después de la administración del pienso, los valores suelen ser sensiblemente mayores, alrededor de 4.0 en dentón y dorada (Alarcón, 1997); 4.3 en lubina (Eshel et al. 1993); 5.2 en anguila (Takii et al. 1985), o alrededor de 4.0 en seriola (Caruso y Genovese, 1992). Si sumamos este hecho a la rápida velocidad de tránsito del contenido estomacal, cabe plantearse la verdadera importancia de la fase ácida de la digestión en condiciones reales en peces alimentados con piensos que incorporan proteínas vegetales, o más bien que ésta se sobreestime (Yúfera et al., 2012). Una situación diferente se plantea cuando el pez carnívoro se alimenta de su dieta natural, es decir, basada en proteína animal. Cuando se comparan los resultados obtenidos en peces alimentados con piensos comerciales, y, por lo tanto, con proteínas vegetales en su composición, se observan valores superiores en las corvinas a los obtenidos en otros peces como el lenguado senegalés, que mostró valores de actividad proteasa ácida inferiores (10.5 U/mg proteína) (Sáenz de Rodrigáñez et al., 2005). Son muchos los factores que pueden influir sobre la actividad de las enzimas digestivas, en concreto, la edad de los peces (Kuźmina, 1996), la temperatura y estación del año (Kuźmina et al., 1996) y la composición de la dieta (Zambonino Infante y Cahu, 2001), son algunos de los más importantes. El motivo de las diferencias en este caso probablemente ha sido el menor tamaño de los lenguados, 40 g frente a los casi 200 g de las corvinas de nuestro experimento o el diferente contenido en proteína del pienso utilizado (47% frente al 55% en el caso de los lenguados). En peces carnívoros se ha descrito una estrecha relación inversa entre las actividades de pepsina gástrica y proteasa alcalina, hecho que parece sugerir una buena utilización de la proteína por estas especies independientemente de la cantidad y de la calidad de la misma en la dieta (Essed et al., 2002). Nuestros resultados muestran una 123 Sergio García Mesa proporción entre los dos tipos de actividades enzimáticas del orden de 5:1, muy por debajo de la determinada en algunas especies cultivadas como la dorada (Sparus auratus) o el dentón (Dentex dentex), en que fue del orden de 15:1 (Alarcón et al., 1998), pero similar a la encontrada en el atún rojo (Essed et al., 2002) y superior a la hallada en el lenguado senegalés (Sáenz de Rodrigáñez et al., 2005). El perfil de actividad en función del pH observado en el presente experimento para la actividad proteasa ácida mostró valores óptimos en el rango de pH 2.0-3.0 (figura III.4.1.), de manera similar a lo observado en otras especies de peces marinos y dulceacuícolas como la trucha (Kitamikado y Tachido 1960; Guillaume y Choubert, 1999); el pez gato (Jonas et al., 1983), la tilapia (Yamada et al., 1993), el lenguado, el rodaballo y el halibut (Glass et al., 1989), la lubina (Eshel et al., 1993), la dorada y el dentón (Alarcón et al., 1998). Sin embargo, tal y como se ha apuntado con anterioridad, dichos valores de pH son muy improbables en peces alimentados en condiciones de cultivo reales, con piensos que incorporan materias vegetales. 35 Estómago Ciegos pilóricos Intestino proximal Intestino distal U/mg proteína 30 25 20 15 10 5 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH Figura III.4.1. Efecto del pH sobre la actividad proteasa ácida/alcalina en los distintos tramos intestinales La actividad proteasa alcalina mostró valores similares a lo largo del tracto intestinal (figura III.4.1.). No obstante, si se considera la misma distribución anatómica de la actividad tripsina, se observó una clara disminución de la misma en los últimos tramos del intestino. Dado que la tripsina es la enzima que contribuye en mayor proporción al total de actividad proteasa alcalina, resulta extraño el comportamiento antagónico de ambas actividades enzimáticas. Consecuentemente, estos resultados fueron inesperados y no se ha encontrado una explicación fisiológica razonable para ellos. 124 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada En relación con la influencia del pH en dicha actividad, los valores fueron máximos a pH 10.0. Estos resultados coinciden con otros que muestran un máximo de actividad proteasa en un rango de pH entre 8.0 y 10.0 en la carpa (Jonas et al., 1983), el fletán y el rodaballo (Glass et al., 1989), la lubina (Eshel et al., 1993) y el siluro (Xiong et al., 2011). Nuestros resultados muestran una reducida actividad de proteasa alcalina en los extractos de estómago de las corvinas. Otros autores también han descrito bajos niveles de proteasas alcalinas como la tripsina y la quimotripsina en extractos de estómago de peces teleósteos, tal es el caso de Chakrabarti et al. (1995) y Sabapathy y Teo (1993). Deguara et al. (2003) también encontraron proteasas alcalinas en el estómago de dorada, probablemente debido a contaminación a partir de la actividad intestinal. A pesar de no haber realizado un estudio histológico de la mucosa estomacal, consideramos que es altamente improbable que dichas proteasas se hayan generado en el propio estómago, y cabe pensar más bien que su presencia se deba a reflujo del contenido intestinal. Las actividades tripsina (T) y quimotripsina (QT) presentaron su valor máximo en los ciegos pilóricos, con una alta relación T/QT (8.05), lo que, de nuevo, pone de manifiesto el carácter carnívoro de la especie, en coincidencia con lo observado por Essed et al. (2001), quienes encontraron en especies de peces carnívoros como el atún rojo una actividad tripsina cuatro veces mayor que la quimotripsina, mientras que en peces omnívoros, como la carpa se ha descrito justo lo contrario (Jonas et al., 1983). Otros autores han establecido que la relación T/QT en peces es alta durante los periodos de crecimiento rápido y baja durante los de crecimiento lento (Rungruangsak-Torrissen et al., 2006); también se ha observado una relación directa entre este cociente y la eficiencia de conversión del alimento (Sunde et al., 2001). En cualquier caso, ambos tipos de proteasas juegan un papel sinérgico en la digestión de la proteína en el tracto intestinal (Cohen et al., 1981; Uys y Hecht, 1987; Glass et al., 1989), sin duda debido a las diferentes secuencias de aminoácidos sobre las que actúan. Se ha establecido que la tripsina es una enzima clave en la utilización del componente proteico del alimento (Einarsson et al 1997), contribuyendo a un 40-50% de la digestión proteica (Eshel et al., 1993) y que juega un papel clave en la regulación del crecimiento de los peces controlando la biodisponibilidad intestinal de aminoácidos procedentes de la dieta (Torrissen et al., 1994). No parece extraño si se tiene en cuenta la enorme dependencia de los peces, especialmente carnívoros, de los aminoácidos como fuente de nitrógeno y de energía, fundamental para determinar el crecimiento (Kaushik y Seiliez, 2010) razón que explicaría su uso como predictor del crecimiento en peces como la carpa (Sharma y Chakrabarti, 1999), el bacalao (Lemieux et al., 1999) o el pez lobo (Lamarre et al., 2004, 2007). 125 Sergio García Mesa Los resultados obtenidos al comparar la actividad proteasa alcalina de la corvina con la de otras especies con interés en acuicultura (tabla III.3.4.) han mostrado valores inferiores a los encontrados en la primera parte del experimento para todos los valores de pH de incubación, y en los diferentes fragmentos intestinales estudiados. La menor capacidad proteolítica puede ser debida al mayor tamaño de las corvinas en el segundo ensayo(467 g frente a 190 g), ya que algunos autores describen una mayor actividad proteasa en peces pequeños comparados con los de mayor tamaño (Klahan et al., 2009 en tilapia; Bai et al., 2003 en Ancherythroculter nigrocauda); sin embargo, otros autores han indicado una mayor actividad proteasa alcalina en peces grandes (Tramati et al., 2005 en el sargo picudo; Jun-Sheng et al., 2006 en tilapia). Estos últimos autores lo explican como un aumento de la capacidad digestiva de los peces al aumentar su tamaño, con el consiguiente incremento en su capacidad de crecimiento. Estas contradicciones entre los diferentes ensayos probablemente se deban a que es la fase de crecimiento de los peces la que determina su actividad digestiva más que el tamaño de los mismos. Otras posibles causas de esta menor actividad proteasa alcalina encontrada en las corvinas de mayor tamaño pueden ser las diferentes condiciones de cultivo entre los dos grupos de peces, ya que las corvinas de la primera parte del experimento se mantuvieron en tanques con agua recirculada a 22 °C y se alimentaron con un pienso de 47% de proteína, mientras que las de la segunda parte del experimento se mantuvieron en jaulas flotantes con una temperatura de 15 °C (en el momento del muestreo) y fueron alimentadas con un pienso de 44% de proteína. Los valores de actividad proteasa alcalina se mantuvieron constantes a lo largo del intestino, de forma similar a lo observado en las corvinas de menor tamaño. Frecuentemente se ha observado una disminución de la actividad proteasa y, en general de todas las actividades digestivas, en las porciones distales del intestino de los peces (Jun-Sheng et al., 2006, Xiong et al., 2011). El mantenimiento de la actividad proteasa en esta especie puede ser debido a una especie de “compensación” de su intestino relativamente corto y un tránsito rápido del alimento. Los resultados muestran valores de actividad específica proteasa alcalina en la especie que nos ocupa similares a los de la dorada e inferiores a los de mero y tilapia. La similitud con la dorada nos indica que se trata de dos especies carnívoras con buena capacidad para digerir las proteínas del alimento. Los mayores valores observados en el mero pueden ser debidos a una mayor capacidad de digestión de las proteínas por esta especie, o bien a que se encuentran en fase de crecimiento más rápido, al tratarse de una especie de mayor tamaño que las anteriores. 126 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada La alta actividad proteasa alcalina observada en la tilapia frente a especies carnívoras como la dorada y la corvina podría ser también debida a su menor tamaño (123 g), y, por lo tanto, a encontrarse en una etapa de crecimiento más rápido. También hay que tener en cuenta que las condiciones de cultivo han sido bastante diferentes. Adicionalmente, puede haberse puesto de manifiesto un efecto de compensación de la baja proteína de la dieta natural de peces herbívoros como la tilapia mediante el aumento de su actividad enzimática (Sabapathy y Teo, 1993; Hidalgo, et al., 1999), posiblemente para maximizar la eficiencia de utilización de las proteínas (Chan et al., 2004), aunque en este caso las tilapias se han alimentado con un contenido proteico del 40%. El menor contenido en proteína de la dieta natural de peces herbívoros también puede verse compensado por un mayor tamaño del intestino (Stevens, 1988); esto no ocurre en nuestros resultados que muestran un índice digestosomático similar para todas las especies, incluso con valores ligeramente inferiores para la tilapia. Se puede decir, por lo tanto, que esta especie compensa el menor contenido en proteína en su dieta natural aumentando la actividad proteasa pero manteniendo la longitud del intestino. Las diferencias interespecíficas en la actividad de una enzima digestiva, expresada por unidad de peso de tejido (figura III.4.2.), no siempre significan diferencias similares en la capacidad total del pez para la digestión del sustrato correspondiente, ya que posibles diferencias en el peso del órgano podrían compensar o acentuar las primeras. U/g tejido pilórico 200 CORVINA DORADA MERO TILAPIA 150 100 50 0 7 8 9 pH 10 11 12 Figura III.4.2. Efecto del pH de incubación sobre la actividad proteolítica de extractos de ciegos pilóricos en las distintas especies. En nuestro caso, podemos realizar una aproximación a este aspecto, tomando como referencias, por una parte, la relación entre las actividades de proteasa alcalina por gramo de digestivo de las distintas especies, usando como referencia a nuestra 127 Sergio García Mesa especie de estudio, la corvina (medidas a pH 10.0, que ha proporcionado el máximo de actividad en todos los casos) y, por otra, las relaciones correspondientes entre los respectivos índices digestosomáticos. En ese caso, podemos observar que la corvina, no sólo exhibe una comparativamente menor actividad enzimática por unidad de peso de digestivo, sino también un digestivo más pequeño, en términos relativos (menores IDS) lo que acentúa esas diferencias en detrimento de la corvina. Por ejemplo, en relación con la dorada, la corvina tiene una actividad proteasa alcalina (promediando la de los diferentes segmentos estudiados, maniobra posible a partir de las escasas diferencias interterritoriales encontradas en cada especie) casi un 30% inferior si se expresa por gramo de víscera, pero como también su digestivo (por unidad de peso corporal) es casi un 35 % menor; el “déficit” de actividad proteasa alcalina llegaría a ser de más de un 50% con respecto a la dorada. Estas asunciones deben ser consideradas con cierta reserva debido a las diferencias en la edad/grado de desarrollo existentes entre las especies, lo que podría reducir sus fundamentos, pero pueden ser útiles a la hora de diseñar piensos específicos para cada especie/etapa de crecimiento. La actividad lipasa mostró valores superiores en las primeras porciones del intestino (tabla III.3.2.), de forma similar a lo observado en otras especies de peces como el rodaballo (Fu et al., 2005), Boleophthalmus pectinirostris (Wu et al., 2007), la dorada (Eroldogan et al., 2008), el atún azul (Matus de la Parra et al., 2007) y el siluro (Xiong et al., 2011). Los valores máximos obtenidos en nuestro experimento han sido en los ciegos pilóricos (6.2 U/mg proteína); estos valores son bajos si se comparan con los obtenidos en la misma porción intestinal en el atún azul (Matus de la Parra et al., 2007) que fueron de 27.5 U/mg proteína. Estas diferencias se han observado también en las demás actividades enzimáticas estudiadas, a pesar de haberse medido mediante técnicas similares y podrían ser debidas a la alimentación con pescado fresco del atún frente a la alimentación con pienso comercial en las corvinas, de forma similar a lo comentado anteriormente para la actividad proteasa ácida. Los valores también son inferiores a los observados en otras especies como la trucha y el esturión (Furné et al., 2005) y similares a los observados en tilapia (Jun-sheng et al., 2006). Esto resulta sorprendente porque normalmente se han descrito mayores valores de actividad lipasa en peces carnívoros que en los omnívoros y herbívoros (Chakrabarti et al., 1995; Opuszynski y Shireman, 1995; Tengjaroenkul et al., 2000). Sin embargo, también se han observado bajos niveles de actividad lipasa en peces con bajo contenido en lípidos musculares (Achionye-Nzeh et al., 2006), explicándolo por un bajo aprovechamiento de los lípidos de la dieta. Esto coincide con las bajas actividades observadas en esta especie, caracterizada por su carne magra (Grigorakis et al., 2011) y por sus bajas necesidades de lípidos dietarios (Piccolo et al., 2008; Chatzifotis et al., 2010). 128 Caracterización preliminar de la actividad digestiva de la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801) cultivada La actividad amilasa mostró el mismo patrón observado para la lipasa (tabla III.3.2.), máximo en ciegos pilóricos e intestino proximal y mínimo en intestino distal, con valores muy bajos de actividad en extractos de estómago. Estos resultados son similares a los de otras especies y explican que la digestión del almidón se realiza preferencialmente en la primera porción del intestino (Kuźmina, 1985; Uys y Hecht, 1987; Lundstedt et al., 2004). Alarcón et al., (2001) demostraron la presencia de actividad carbohidrasa en diferentes secciones del intestino de la dorada, desde el estómago hasta el recto, pero fundamentalmente en los ciegos pilóricos e intestino. Un patrón similar se observó en salmón blanco (Chiu y Benítez, 1981) y salmonete (Establier et al., 1985). La presencia de actividad amilasa en el estómago ha sido mostrada por otros autores pero la mayor parte lo explican por una contaminación procedente de la digestión intestinal (Uys y Hecht, 1987; Xiong et al., 2011). La digestión de los hidratos de carbono por los peces carnívoros es limitada debido a la reducida presencia de estos nutrientes en su hábitat alimentario natural y suele mostrar valores inferiores a los de peces omnívoros (Sabapathy y Teo, 1993); sin embargo, los valores obtenidos en nuestro estudio son superiores a los observados en otras especies de peces carnívoros como el siluro (Xiong et al., 2011), ligeramente superiores a los de dorada, trucha y anguila y muy inferiores a los de especies herbívoras como carpa, tenca y pez dorado (Hidalgo et al., 1999). III.5. RESUMEN El presente estudio demuestra la presencia de unas relativamente altas actividades de proteasas y amilasa, y una baja actividad lipasa en el digestivo de la corvina, características que sugieren que esta especie tiene una buena capacidad para digerir sobre todo los componentes proteicos e hidrocarbonados de la dieta. Posteriores investigaciones en las que se determine una posible adaptación de las actividades enzimáticas lipasa y amilasa a cambios en la composición de lípidos e hidratos de carbono del pienso serían de gran interés para contemplar la posibilidad de incluir estos componentes en la dieta de esta especie, con objeto de disminuir la utilización de la proteína como fuente de energía. 129 IV. Efecto del tamaño de la ración diaria sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) IV.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. Uno de los principales determinantes, si no el que más, del éxito de una planta de cría intensiva de peces es el diseño y puesta en práctica de una adecuada estrategia de alimentación. En efecto, una vez conocidas, aunque sólo sea en sus rasgos principales, las necesidades alimentarias de la especie en cuestión, se impone la definición y aplicación de un sistema de alimentación que compatibilice las posibilidades/preferencias de los peces con los intereses económicos del piscicultor. A su vez, una de las variables fundamentales a considerar en el conjunto de esa estrategia es lo que se conoce como tamaño de la ración, es decir, la cantidad de alimento que se debe suministrar a la unidad de cultivo (estanque, piscina, jaula) por unidad de tiempo. Raciones deficitarias pueden generar crecimientos subóptimos y alteraciones en la salud de los animales en tanto que raciones excesivas pueden significar, no sólo un desperdicio económico, sino un grave quebranto de la calidad del medio (Langar y Guillaume, 1994; Sumagaysay, 1998; Ng et al., 2000; Van Ham et al., 2003). En piscicultura, la forma más habitual de expresar el tamaño de la ración es la que usa el día como unidad de tiempo y la relación porcentual entre el peso de alimento y el de la biomasa que lo recibe, como expresión de cantidad. A la hora de determinar cuál puede ser la ración más adecuada es preciso tener en cuenta diversas variables que la influyen como son la edad de los animales, la composición nutricional y energética del pienso, la temperatura y otras variables ambientales o las posibles actividades de la planta (traslados, tratamientos sanitarios, etc.) (Brett y Groves, 1979; Van Ham et al., 2003; Desay y Singh, 2009). Pero, además, para una situación determinada de edad, temperatura, tipo de pienso, etc., conviene efectuar una previsión de la relación que existe entre el tamaño de la ración y la ganancia de peso de los animales. Se habla de ración de mantenimiento 131 Sergio García Mesa como aquella que permite a los peces mantener su peso, es decir la necesaria para compensar las pérdidas derivadas del metabolismo de los animales. Por encima de la misma, cualquier aumento debe suponer un crecimiento neto de los peces; ahora bien, ¿es ésta relación indefinida?, parece ser que no, pues se ha determinado con frecuencia la existencia de una ración máxima como la que provoca una tasa de crecimiento que no es mejorable por aumentos adicionales de la misma (por decirlo de otra forma, esa ración “satura” las capacidades de crecimiento del pez en esas condiciones concretas). Se puede añadir otra cuestión: en el intervalo entre ración de mantenimiento y ración máxima, ¿es lineal la relación entre el tamaño de la misma y la tasa de crecimiento? Si no es así, y esta parece ser una situación bien descrita, pueden aparecer “cambios de ritmo” e incluso “puntos de inflexión” que obliguen al piscicultor a plantearse la necesidad de definir como ración óptima aquella que, aún procurando un crecimiento submáximo, puede ser la más rentable teniendo en cuenta la inversión en pienso y el rendimiento en biomasa comercializable de la explotación (Brett y Shelbourn, 1975; Wurtsbaugh y Davis, 1977; Brett y Groves 1979; Malard et al., 1995; Xie et al., 1997; Ng et al., 2000). Son numerosísimos los trabajos que han explorado estas posibilidades procurando determinar la relación entre tamaño de ración y crecimiento (Livingston y Goiney, 1984) pero, también, entre tamaño de ración e índices de utilización del alimento por los peces a fin de que el piscicultor disponga de información suficiente para tomar una decisión razonable sobre este aspecto de la estrategia alimentaria. Los efectos que el tamaño de la ración pueda tener sobre el crecimiento y la salud de los peces vienen mediatizados por los que sobre su metabolismo intermediario pueden significar esos aportes diferentes de nutrientes y energía que van en la ración diaria. Consideramos pues, muy interesante que la valoración de diferentes raciones no se base exclusivamente en datos de crecimiento/rendimiento sino que explore más en profundidad las bases de esos datos. Por otra parte, el aporte de diferentes dosis diarias de nutrientes y energía y sus posibles efectos sobre el metabolismo general de los peces (Tacon y Cowey, 1985; Talbot, 1985; Metón et al., 1999, 2003; Tang et al., 2003) no sólo afectarán al crecimiento de los mismos sino que, muy probablemente, también lo haga sobre la composición corporal (magnitud de reservas de proteína y grasas, cantidad de agua, etc., en distintas fracciones corporales) (Khan et al., 2004; Sun et al., 2006; Ashmed, 2007) lo que es particularmente relevante en casos, como el que nos ocupa, en que el destino final de esta industria es la alimentación humana. En otras palabras, el tamaño de la ración no sólo puede condicionar el metabolismo y la salud de los animales y, a través de ellos, su crecimiento, sino que también puede repercutir sobre la calidad (aceptación) del producto ofertado. 132 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). En los últimos años se ha desarrollado una creciente atención por el estudio de los mecanismos implicados en la defensa antioxidante en los peces tanto por el interés de los datos que pueden aportar para el estudio de la evolución filogenética de estos importantísimos mecanismos de protección frente al estrés oxidativo como por su aplicación en la detección de diversas fuentes de contaminación ambiental (Rabie et al., 1972; Smith, 1976; Radi et al., 1985a, b; Roberts et al., 1987; Di Giulio et al., 1989; Nakano et al., 1992; Filho et al., 1993; Filho y Boveris, 1993; Ross et al., 2001; Basha y Rani, 2003; Berntssen et al., 2003; Avci et al., 2005; Martínez-Álvarez et al., 2005). Es previsible que, entre las maniobras que puedan generar alguna forma de estrés de este tipo se encuentre la subalimentación, parcial o total, por lo que consideramos muy interesante realizar una aproximación a la naturaleza de estos mecanismos en la corvina, especie para la que no existe por el momento dicha información, así como determinar el posible efecto que distintos tamaños de ración (este ensayo) o el ayuno/realimentación (capítulo siguiente) puedan tener sobre algunos elementos clave de la batería de defensas antioxidantes. En este experimento y teniendo en cuenta datos previos con ésta (Bajandas et al., 2009a; Velazco et al., 2009) y otras especies próximas, pretendemos una aproximación a la definición de una ración óptima para la cría de corvinas, así como los posibles efectos del tamaño de la ración sobre el metabolismo y la composición de los animales y el estado de estrés oxidativo. Para ello se ensayan tres tamaños de ración en lotes duplicados de corvinas jóvenes y se valoran sus efectos cobre crecimiento, biometría, composición de los animales, actividad de varios enzimas claves de las principales rutas metabólicas y sobre algunos elementos del pool de defensas frente al mencionado estrés. VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS. IV.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos Los animales experimentales procedían de una puesta en cautividad, provocada en el Centro del IFAPA “El Toruño”, a partir de progenitores salvajes mediante inducción hormonal según el método descrito por Grau et al. (2007). El experimento se desarrolló en las instalaciones de dicho centro con un total de 600 individuos (62.1 ± 0.5 g de peso medio inicial) que fueron distribuidos al azar en 6 tanques, correspondientes a los 3 tratamientos experimentales por duplicado. Antes del comienzo del ensayo, los peces se mantuvieron durante dos semanas en los tanques experimentales para su aclimatación. 133 Durante 120 días se probaron, en lotes duplicados, tres tamaños de ración diaria: bajo (0.6% del peso corporal, lotes F06), intermedio (1.1 % del peso corporal, lotes F11) y alto (1.6% del peso corporal, lotes F16), con el fin de determinar el efecto de la tasa de alimentación sobre el crecimiento y la fisiología de la corvina. Los peces se alimentaron por la mañana. Simultáneamente, en otros dos lotes, se midió la influencia del ayuno y la realimentación con unos lotes adicionales según se describe en el siguiente experimento (apartado V). El pienso empleado fue uno comercial (SKRETTING, tipo C.V.6), específico para corvina, con un tamaño de grano adecuado al de nuestros animales. La composición del pienso aparece detallada en la tabla IV.2.1. Tabla IV.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca) Componente Proteína bruta Grasa bruta (extracto etéreo) Cenizas Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)* Energía** (MJ/Kg) Relación Proteína/Energía (g/MJ) 472.0 204.7 77.2 246.1 238.3 198.0 * calculado como 1000 – (proteína bruta + extracto etéreo + cenizas) ** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y MELN, respectivamente Los tanques experimentales eran cuadrangulares, de fibra de vidrio, con una capacidad de 4 m3, y estaban abastecidos con agua de mar (37‰ de salinidad), en un circuito con un flujo continuo de 5 L/min (dos renovaciones completas por día). El fotoperíodo operante durante el experimento fue el natural. La aireación se realizaba a través de un sistema general de la instalación gracias a grupos electrosoplantes, que conducía el aire a cada tanque. La concentración de oxígeno durante todo el experimento estuvo por encima de 6 mg/L (ppm) (niveles de saturación superiores al 87%). La temperatura media del agua a lo largo del periodo experimental fue 18.9 ± 0.1 °C. Además, las cantidades de amonio y nitrito se mantuvieron siempre muy por debajo de las concentraciones consideradas perjudiciales (2 ppm), gracias a la alta tasa de renovación y buena calidad del agua empleada, así como a las buenas prácticas de mantenimiento. Para el mantenimiento de los peces se procedía a una limpieza diaria. Cada uno de los tanques contaba con un rebosadero y una red de protección, para evitar que los animales saltaran fuera del tanque de forma accidental. 134 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Los animales se pesaron individualmente al inicio del periodo de aclimatación. Durante las dos semanas de ese periodo todos los lotes fueron alimentados con la misma ración diaria. El día del inicio del experimento propiamente dicho, se realizaron medidas biométricas externas de 20 individuos por lote (tras anestesia ligera con 2fenoxietanol 0.1 mg/L) determinándose el peso, la longitud total y la altura máxima. De los 20 individuos por lote destinados a medidas externas, 3 de ellos (6 por tratamiento) se sacrificaron con una dosis letal de anestésico (2-fenoxietanol 0.35 mg/L), y se diseccionaron para determinar el peso de hígado, digestivo, paquete visceral y del filete del lado derecho. A continuación se implantó el racionamiento diferenciado antes mencionado. Muestreos similares al descrito se llevaron a cabo los días 20, 40, 60, 80, 100 y 120 del experimento. A partir de la estimación de la biomasa total presente en cada tanque en los días de muestreo se recalculó la ración total a suministrar a cada uno para mantenerla lo más homogénea y ajustada a los valores previstos. A partir del día 60 del experimento, además de los muestreos y determinaciones de rutina antes citados, el músculo del lado derecho del pez se reservó para determinar su composición bioquímica, el hígado y una porción del músculo del lado izquierdo se destinaron a la determinación de actividades enzimáticas, tanto del metabolismo intermediario, como de los indicadores del estrés oxidativo. IV.2.2. Procesado de las muestras. Los días indicados y, tras un ayuno de 24 horas, se sacrificaron los peces integrantes de cada muestra. El hígado y una porción de músculo blanco de la parte anterior dorsal de los peces fueron diseccionados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta que se usaron para los estudios metabólicos en las instalaciones de la UGR. Los tejidos se homogenizaron según se detalla en el apartado IX de esta Memoria. IV.2.3. Parámetros biométricos y composición química A partir de los datos de esos muestreos, se calcularon el incremento de peso (GAP) de los peces, así como varios índices de crecimiento y utilización de la dieta, como son IRP, SGR, TCA o FCR, TEA o FER e índices biométricos, K, IHS, IVS, IDS y RF (ver apartado IX). Los peces muestreados para análisis de la composición química fueron almacenados en hielo y transportados hasta las instalaciones de la UGR. Se diseccionó la 135 parte derecha del músculo y se procedió a la determinación de la composición según se detalla en el apartado IX Metodología. IV.2.4. Análisis de la actividad enzimática Los ensayos enzimáticos en hígado y músculo se realizaron según se detalla en el citado apartado IX: Metodología de esta Memoria. Se determinaron las siguientes actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo intermediario: Acetoacetil CoA Tiolasa (ACoAT; EC 2.3.1.9), Citrato Sintasa (CS; EC 4.1.3.7), Enzima Málico (EM; EC 1.1.1.40) Fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa; EC 3.1.3.11), Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49), Glutamato Dehidrogenasa (GDH; EC 1.4.1.2), Glutamato Oxalacetato Transaminasa (GOT; EC 2.6.1.1), Glutamato Piruvato Transaminasa (GPT; EC 2.6.1.2), Glicerol Kinasa (GyK; EC 2.7.1.30), Hexokinasa (HK; EC 2.7.1.1), β-Hidroxiacil CoA Deshidrogenasa (HOAD; EC 1.1.1.35), Lactato Deshidrogenasa (LDH; EC 1.1.1.27) y Piruvato Kinasa (PK; EC 2.7.1.40), Además, se valoraron las siguientes relacionadas con el estrés oxidativo: Catalasa (CAT; EC 1.11.1.6.), DT-diaforasa (DTD; 1.6.99.2.), Glutation Peroxidasa (GPX; EC 1.11.1.9.), Glutation Reductasa (GR; 1.6.4.2.), Glutation Transferasa (GST; 2.5.1.18), Superóxido Dismutasa (SOD; 1.15.1.1.) y la presencia de Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico (TBARs) o Malondialdehído (MDA) como índice de daño oxidativo. También se determinó el contenido en glucógeno en hígado y músculo blanco. IV.2.5. Análisis estadístico Para valorar estadísticamente el efecto de los tratamientos y, dentro de cada tratamiento, la posible evolución temporal de los distintos parámetros, se utilizó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) seguido el test de Duncan (Duncan, 1955) (P < 0.05) usando el paquete estadístico SPSS 15.0 para Windows. IV.3. RESULTADOS IV.3.1. Crecimiento En las tablas IV.3.1. y IV.3.2. se exponen algunos datos de crecimiento y aprovechamiento de la dieta para las corvinas alimentadas con los distintos tamaños de ración diaria; el tratamiento F06 provocó un menor crecimiento, pues los peces alcanzaron un menor peso final y longitud total, estas diferencias se comenzaron a observar transcurridos tan sólo 20 días de experimento. Los tratamientos F11 y F16 no provocaron diferencias significativas de estos índices al final del periodo experimental. 136 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). En la tabla IV.3.2. se observa, como se ha indicado antes, el mayor crecimiento de las corvinas con las raciones F11 y F16, sin embargo se detectó un mejor aprovechamiento de la dieta en aquellas que se alimentaron al 0.6% peso/día (F06), en este caso, el F16 (ración más alta) fue el tratamiento que presentó los peores índices de aprovechamiento. Tabla IV.3.1. Evolución temporal de varios índices biométricos de las corvinas alimentadas, durante 120 días, con distintas raciones diarias: F06 (0.6% peso/día), F11 (1.1% peso/día) y F16 (1.6% peso/día). Días 0 20 40 60 80 100 120 F06 Longitud Total (cm) F11 F16 F06 Peso (g) F11 F16 F06 K F11 F16 19.03a 19.72b,1 20.35c,1 21.47d 22.20e 23.26f.1 23.51f,1 0.17 0.16 0.108 0.19 0.21 0.24 0.16 18.88a 20.20b,2 20.98.c,2 21.94d 22.51e 24.01f.2 24.30f,2 0.19 0.14 0.133 0.16 0.25 0.18 0.18 18.78a 19.93b,1-2 20.56c,1 21.90d 22.87e 23.35e.1 24.19f,2 0.19 0.12 0.14 0.18 0.23 0.27 0.17 79.42a 87.57ab,1 94.45b,1 104.70c,1 112.60c,1 123.87d,1 135.14d,1 1.850 1.55 1.69 2.93 3.30 4.30 2.96 79.87a 95.20b,2 104.20b,2 114.75c,2 124.25c,2 135.57d,2 146.90d,2 2.457 2.171 2.15 2.89 4.24 3.43 3.68 77.45a 90.95b,1-2 97.37b,1 113.27c,2 126.17d,2 133.5d,2 144.75e,2 2.632 1.86 2.14 3.11 3.95 4.51 3.29 1.15b 1.13b 1.11b 1.05a,1 1.02a,1 1.04a 1.03a 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 1.17f 1.14e 1.11d 1.08c,2 1.07c,2 1.05b 1.01a 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 1.15f 1.14e 1.10d 1.07c,1-2 1.05c,1-2 1.03b 1.01a 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 Los valores son media ± EEM (N=20) para todos los muestreos excepto para el día 120, donde N=40. Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo. Diferentes números indican diferencias significativas(P<0.05) entre tratamientos. K: Índice de condición. Tabla IV.3.2. Crecimiento y eficacia de utilización del alimento de las corvinas alimentadas, durante 120 días, con distintas raciones alimentarias, F06 (0.6% peso/día), F11 (1.1% peso/día) y F16 (1.6% peso/día). F06 GAP 55.71 IRP 70.42 SGR 0.44 TCA 1.321 FER 0.763 PER 1.613 3.04 6.73 0.03 0.07 0.04 0.08 F11 67.03 83.97 0.51 2.392 0.422 0.892 3.93 5.73 0.03 0.16 0.03 0.06 F16 67.30 87.30 0.52 3.123 0.321 0.681 3.30 8.43 0.04 0.19 0.02 0.04 Los valores son media ± EEM de dos lotes experimentales. Diferentes números indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos. GAP: Ganancia Absoluta de Peso; IRP: Incremento Relativo de Peso; SGR: Tasa de Crecimiento Específico; TCA: Tasa de Conversión del Alimento; FER: Tasa de Eficiencia Alimentaria; PER: Coeficiente de Eficiencia Proteica; 137 IV.3.2. Índices biométricos En la tabla IV.3.3. se expone el efecto de los distintos tamaños de ración diaria sobre algunos parámetros biométricos. Los índices viscerosomático (IVS), digestosomático (IDS) y de rendimiento del filete (RF) no presentaron diferencias más allá de las ocurridas durante el crecimiento de los individuos, es decir, los distintos niveles de ración no los afectaron. No obstante, se observó que el tamaño de ración sí tuvo un efecto sobre el índice hepatosomático (IHS): en la mayor parte del periodo experimental, este índice fue superior para el tratamiento F11 y F16, siendo incluso significativamente mayor en F11 al final del periodo experimental. Tabla IV.3.3. Evolución temporal de algunos índices biométricos de las corvinas alimentadas, durante 120 días, con distintas raciones alimentarias, F06 (0.6% peso/día), F11 (1.1% peso/día) y F16 (1.6% peso/día). 0 20 40 60 80 100 120 F06 IHS F11 F16 F06 IVS F11 F16 F06 IDS F11 F16 F06 RF F11 F16 2.83b 3.15b.12 2.70b 2.24a 1.76a 1.70a,1 1.87a,1 0.20 0.20 0.28 0.10 0.15 0.23 0.12 2.77c 3.22c.2 2.76c 2.29b 2.04ab 1.76a,1 2.13ab,2 0.14 0.14 0.11 0.11 0.15 0.21 0.08 2.97c 2.82c.1 2.62c 2.43bc 2.16ab 2.07ab,2 1.76a,1 0.23 0.23 0.49 0.11 0.16 0.10 0.13 11.01 11.21 10.88 10.54 9.17 10.42 9.17 0.65 0.46 0.73 0.99 0.54 0.87 1.34 11.94d 12.64d 11.06c 9.47ab 9.84b 8.77ab 8.29a 0.22 0.42 0.28 0.28 0.23 0.61 0.34 11.78bc 12.58c 11.86b 11.14b 9.18ab 9.19ab 8.19a 0.78 0.88 0.78 0.68 0.59 0.27 0.52 2.39b 2.35ab 2.30ab 2.28a 2.05a 2.03ª 1.87ª 0.18 0.15 0.25 0.14 0.17 0.17 0.03 2.22b 2.23b 2.21b 2.14b 2.00ab 2.12b 1.78a 0.30 0.16 0.14 0.07 0.09 0.08 0.09 2.49b 2.50b 2.43b 2.31b 2.02a 2.07a 1.99a 0.26 0.21 0.13 0.09 0.08 0.08 0.04 39.54a 40.11a 41.22ab 42.49b 40.88ab 45.02c 44.44c 1.50 2.03 1.94 3.57 1.09 0.46 0.48 39.19a 41.61ab 42.35b 46.57c 42.28b 44.31bc 44.10bc 1.00 1.99 1.57 5.33 0.68 0.95 0.36 39.32a 40.21a 41.32ab 40.21a 42.17b 44.63c 44.36c 1.03 2.34 1.35 3.78 0.32 0.49 0.29 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo. Diferentes números indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos. IHS: Índice hepatosomático; IVS: Índice viscerosomático; IDS: Índice digestosomático; RF: Rendimiento del filete Se pudo observar una disminución significativa de los índices IHS, IVS e IDS a lo largo del periodo experimental, mientras que el RF mostró una tendencia a aumentar. 138 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). IV.3.3. Composición En cuanto a la composición del músculo e hígado de las corvinas sometidas a distintas raciones diarias (tabla IV.3.4.) se observaron pocos cambios que, en cualquier caso sólo se hicieron patentes el día 120 o último del ensayo. No obstante, las corvinas alimentadas con una ración diaria del 1.1% peso/día presentaron menor proporción de agua, lípidos y cenizas y mayor proporción de glucógeno y proteínas en músculo, aunque estas diferencias fueron significativas sólo para agua y cenizas al final del periodo experimental. En lo que respecta glucógeno hepático se observó una tendencia a disminuir con el avance del experimento en todos los tratamientos, encontrándose, al final, diferencias significativas entre tratamientos, siendo los valores en los lotes F11 los más altos. IV.3.4. Actividades enzimáticas del metabolismo intermediario Las actividades de algunas enzimas indicadoras del metabolismo intermediario se determinaron los días 60 y 120 del experimento (tablas IV.3.5. y IV.3.6.). Se pudo apreciar que el metabolismo pareció verse afectado por el tamaño de la ración suministrada, de modo que el día 60 de experimento aparecieron diferencias en las actividades de algunas de las enzimas indicadas, mientras que al día 120, o final del experimento, estas diferencias persistieron y aparecieron algunas otras. En líneas generales, en el tratamiento F11 se hace patente el mantenimiento de las actividades de la mayoría de las enzimas del metabolismo intermediario entre los días 60 y 120; siendo las corvinas alimentadas con las dos raciones más extremas las que presentaron mayores diferencias. IV.3.4.1. HÍGADO Al días 60 del experimento, la hexokinasa (HK) mostró una mayor actividad en los peces que recibieron menor ración, mientras que el día 120 se detectó la situación contraria. La lactato deshidrogenasa (LDH) también se vio afectada desde el día 60 de experimento, de modo que la ración más alta provocó una menor actividad de esta enzima, situación que se prolongó hasta el día 120. La actividad piruvato kinasa (PK) presentó una relación directa con los niveles dietarios el día 60; sin embargo, el día 120 se encontró que la relación era inversa. La fructosa 1,6 bisfosfatasa (FBPasa) se vio influida por el tamaño de ración desde el día 60 en la misma forma en que lo fue la HK. 139 La actividad de glicerol kinasa (GyK) no se vio afectada en los primeros 60 días de experimento, siendo constatables los efectos del tamaño de ración el día 120, en el que el menor tamaño de ración se correspondió con una menor actividad de este esta enzima. La 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (HOAD) no pareció verse influida en ningún momento por el tamaño de la ración. Las actividades de enzima málico (EM) y de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), presentaron comportamientos similares el día 120 del experimento, siendo significativamente mayores en los animales que recibieron la ración más alta. La actividad G6PDH estaba aumentada en esos mismos animales, mientras que la actividad del EM era menor en los F06. La glutamato deshidrogenasa (GDH) es otra enzima que no se vio influenciada el día 60 del experimento pero, al final del mismo, esa actividad era mayor en aquellas corvinas que recibieron un mayor tamaño de ración. Las actividades de glutamato oxalacetato transaminasa (GOT) y de glutamato piruvato transaminasa (GPT) presentaron la misma tendencia: el día 60 ya se hicieron patentes los efectos positivos del aumento del nivel dietario; pero el día 120 se observó que la actividad de estas enzimas disminuyó para F06 y aumentó para F16. Las actividades de acetoacetil-CoA tiolasa (ACoAT) y citrato sintasa (CS) no se vieron afectadas en ningún momento por el tamaño de la ración. IV.3.4.2. MÚSCULO Aunque el tamaño de la ración pareció afectar a la actividad de bastantes enzimas hepáticas, dichos efectos fueron mucho menores en músculo. No obstante, sí que se detectaron algunos cambios, sobre todo en aquellas enzimas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos (tabla IV.3.6.). Previamente, debemos destacar la incapacidad de detectar la actividad G6PDH en el músculo de las corvinas, ya que parece ser tan baja que no nos fue posible medirla con la técnica empleada. El día 60 del experimento, LDH, PK y FBPasa presentaron las mayores actividades en el tratamiento F11 y las menores en F16, mientras que la HK mostró su actividad más baja en F06. Sin embargo, el día 120 las tres primeras enzimas presentaron sus máximos para las corvinas alimentadas al 0.6% mientras que la HK no se vio afectada. 140 F16 F11 F06 F16 F11 F06 Lípidos 6.87 0.55 7.32 0.53 7.13 0.80 6.84 0.31 6.44 0.58 6.74 0.67 Humedad 77.85 0.13 77.30 0.27 77.48 0.23 77.86xy 0.15 77.37x 0.22 78.06y 0.17 3.99 87.51 4.32 88.41 2.06 87.86 4.11 86.42 3.15 87.09 2.98 87.93 Proteínas Músculo 0.05 6.00y 0.06 5.84x 0.03 6.09y 0.13 5.97 0.13 6.13 0.06 6.09 Cenizas 0.04 1.83 0.08 1.83 0.06 1.76 0.04 1.87 0.03 1.88 0.06 1.97 Glucógeno 3.52 54.11x 4.18 67.85y 4.93 57.09xy 11.12 81.08 5.70 90.16 5.94 96.53 Glucógeno 3.01 62.82 2.40 57.18 4.18 62.12 1.17 53.08 5.99 62.95 5.43 58.93 Proteínas Hígado Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, día 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…). Humedad: % agua. Lípidos: % extracto etéreo en sustancia seca. Cenizas: % cenizas en sustancia seca. Proteínas: % en sustancia seca. Glucógeno: mg/g de tejido. 120 60 Día Tabla IV.3.4. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11:1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la composición del músculo e hígado de corvinas. Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). El tamaño de la ración sí que influyó sobre la actividad GDH al final del ensayo, siendo mayor en aquellos animales alimentados con la ración de menor tamaño. 141 Tabla IV.3.5. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad específica F11 F06 F16 F11 F06 FBPasa G6PDH GDH HK 0.57 9.48ab HOAD 3.64 88.16b LDH 1.24 39.33a PK 3.92 GyK EM 0.40 3.26b GPT CS 80.82 414.52b 103.85b 25.03 GOT ACoAT 1.70 21.18b 22.66 312.11a 68.13a 24.95 3.26 29.06 34.41 10.54 6.55 6.48 16.34 2.92 0.93 11.70b 9.42 0.28 5.19 55.76b 2.55b 5.02 64.42a 2.14 0.86 9.09a 10.30 1.94 13.97 1.53 107.15x 23.69x 5.79 113.65x 39.49y 11.64 154.76y 26.21x 0.13 0.86 9.87 1.33 0.08 1.61x 1.02 11.28 1.04 0.22 1.07 12.78 2.11xy 0.23 1.87 1.72 2.28y 20.37y 15.11x 1.36a 21.53 2.10 0.91 12.31b 5.87 82.44 10.48 0.83 8.50b 2.09 20.09b 14.75 2.41 22.40 1.08 11.25b 6.51 3.55 0.40 4.03a 12.14 111.12y 433.51y 161.14y 21.64y 5.63 73.45x 374.20xy 82.09x 7.25 80.18x 306.97x 75.58x 7.79 88.72 414.76b 113.74b 21.24 1.11 0.95 11.85a 19.23 0.78 7.99a 3.67 0.82 7.07b 48.14 2.15 1.01 17.87x 20.95 1.12 11.55x 2.23 0.21 3.00x 43.95 1.51 19.39 2.00 22.37x 4.13 0.93 12.90x 42.42 0.48 4.25x 2.70 29.31y 1.26 1.69 17.74y 19.63 0.57 6.04y 1.93 1.58 23.33 42.24 4.87 50.36 101.24b 34.44a 48.45 (mU/mg de proteína) de algunas enzimas implicadas en el metabolismo intermediario del hígado de corvinas. Día 60 120 F16 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, día 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…). ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. 142 143 F16 F11 F06 F16 F11 F06 CS 20.90 1.02 21.01 1.77 19.82 1.03 21.11 1.94 19.53 1.61 23.68 2.33 ACoAT 1.83 0.08 1.52 0.13 1.56 0.13 1.71 0.05 1.74 0.14 1.70 0.09 0.19 1.10 0.09 1.06 0.15 1.18 0.41 4.80y 0.37 2.50x 0.81 n.d n.d 1.15 13.34x 1.29 20.92y 1.72 23.08y n.d 4.63y 24.30 1.97 22.11 1.63 24.41 GDH 2.04 n.d n.d. n.d. G6PDH 0.08 1.57a 1.47ab 0.15 0.20 2.16b 1.05a 0.16 0.13 1.52a 1.59b 0.14 FBPasa EM 10.66 110.39 9.35 102.30 6.17 103.83 11.81 117.49 11.57 119.45 9.25 112.45 GOT 0.85 9.89 0.99 10.79 1.19 12.39 0.69 9.31 0.97 10.17 0.76 8.99 GPT 4.57 46.73 4.47 47.25 5.29 57.10 3.37 40.58 4.08 48.97 2.81 43.33 GyK 0.13 1.17 0.09 1.29 0.10 1.38 0.12 1.16b 0.13 1.13b 0.07 0.61a HK 0.19 2.15 0.21 2.01 0.20 2.31 0.19 2.39 0.23 2.33 0.12 2.30 HOAD 4.28 775.17x 121.97 1473.58y 178.12 1944.18z 62.31 972.25a 129.69 1441.73b 111.61 1175.15ab LDH 85.41 1113.63xy 51.13 1006.55x 99.58 1302.82y 43.32 465.03a 58.04 736.10b 43.32 620.43ab PK Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratmientos, día 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…).. n.d.: no detectada. ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. 120 60 Día Tabla IV.3.6. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad específica (mU/mg de proteína) de algunas enzimas implicadas en el metabolismo intermediario del músculo de corvinas. Sergio García Mesa IV.3.5. Estrés oxidativo IV.3.5. 1. HÍGADO El tamaño de la ración pareció influir en algunos parámetros indicadores del estrés oxidativo en el hígado de las corvinas (tabla IV.3.7.). TablaIV.3.7. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad de algunas enzimas indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el hígado de corvinas. Día F06 60 F11 F16 F06 120 F11 F16 CAT1 DTD2 GPX2 GR2 GST2 SOD1 TBARs3 48.81ab 5.91b 90.26 5.18 52.07b 60.89 44.19 4.11 0.58 7.36 0.49 4.45 5.20 3.06 53.71b 3.07a 81.59 4.43 36.71a 57.62 50.00 4.03 0.30 6.27 0.35 2.88 5.03 2.60 38.84a 4.91b 91.04 5.32 45.54ab 57.95 61.21 2.62 0.36 2.91 0.40 2.59 3.88 4.04 44.34xy 5.62y 78.95y 3.84y 75.69z 59.31y 35.52x 4.05 0.51 5.60 0.24 3.64 3.48 1.54 48.91y 4.25x 72.42y 4.01y 34.37y 52.15xy 45.57x 3.82 0.43 6.00 0.22 1.33 3.87 3.31 36.64x 3.45x 52.29x 3.11x 24.40x 46.07x 78.57y 1.98 0.34 3.12 0.20 1.89 4.37 6.88 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…). 1 2 3 Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido. CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico De forma general se observó que las corvinas sometidas a raciones más restrictivas presentaban mayores niveles de actividad en algunas enzimas antioxidantes. Esta situación se acentuó y extendió a todas las actividades enzimáticas el día 120, presentando F06 los mayores registros para las defensas antioxidantes, que fueron intermedios para F11 y menores en F16. Por lo tanto, los valores de daño oxidativo fueron superiores para F16 y menores para F06. IV.3.5.2. MÚSCULO En músculo, en el que no pudimos detectar actividad catalasa con la técnica empleada, el efecto del tamaño de la ración sobre los otros parámetros indicativos de estrés oxidativo (tabla IV.3.8.) no fue tan significativo como en el hígado. Así, conviene destacar el poco efecto de los tamaños de ración sobre la actividad de las enzimas antioxidantes determinada en el día 60. Al final del experimento, tan sólo 144 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). se observó un efecto de los niveles dietarios en dos enzimas, la DT-diaforasa (DTD) y la glutation reductasa (GR), que responde a las tendencias que se ha destacado, mayor actividad en aquellos tratamientos en que la restricción alimentaria era mayor. No obstante el daño oxidativo (medido por la determinación de TBARs) no presentó diferencias significativas atribuibles al tamaño de la ración. . Tabla IV.3.8. Efecto del tamaño de la ración diaria (F06: 0.6% peso, F11: 1.1% peso y F16: 1.6% peso) sobre la actividad de algunas enzimas indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el músculo de corvinas. CAT1 Día F06 60 120 F11 GR2 GST2 SOD1 TBARs3 2.32 12.32 0.27 5.03 13.36a 31.34a n.d. n.d. F06 n.d. F16 GPX2 n.d. F16 F11 DTD2 n.d. n.d. 0.09 0.66 0.02 0.50 0.72 5.66 1.91 14.77 0.33 4.90 15.71b 39.72a 0.18 1.02 0.03 0.28 0.75 2.52 1.96 13.61 0.32 5.13 15.33b 13.36b 0.11 0.80 0.01 0.36 0.38 0.54 2.20xy 13.39 0.36y 4.32 15.51 15.98 0.12 0.56 0.03 0.27 1.25 1.05 1.69x 12.19 0.31y 4.24 12.59 19.04 0.17 0.86 0.02 0.35 0.91 1.88 2.37y 13.53 0.49x 4.20 14.77 18.94 0.21 0.96 0.04 0.34 1.08 1.68 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, 60 (a,b,c…) y día 120 (x,y,z…). 1 2 3 Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido. CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. n.d.. no detectada. IV.4. DISCUSIÓN La gestión de la alimentación en términos de la optimización de la tasa alimentaria se ha convertido en una exigencia en el cultivo de peces siendo una de las áreas cruciales de investigación en piscicultura. Controlando la ración alimentaria óptima definida, según Brett et al., (1969) y Elliot (1975), como la ración que proporciona el mejor crecimiento con la menor ingesta de alimento, los piscicultores pueden reducir el coste del alimento y maximizar el crecimiento y también son capaces de mejorar otros factores como la variación del tamaño de los individuos y la calidad del agua (Marimuthu et al., 2001). Al tratarse de una especie relativamente nueva en piscicultura, aún son necesarios estudios sobre este tema en el caso de la corvina. Los resultados de este experimento (tabla IV.3.1.) indican que las corvinas alimentadas con la ración más baja de las ensayadas (0.6% peso corporal/día, lotes F06) 145 Sergio García Mesa presentaron un crecimiento más reducido, sin embargo éste fue prácticamente similar para los lotes que recibieron las raciones intermedia (1.1 %peso corporal/día, lotes F11) y alta (1.6% peso corporal/día, lotes F16) lo que parece indicar un peor aprovechamiento del alimento en estas últimas en relación con F11. Es normal en peces y otros animales que la relación entre tamaño de ración y crecimiento no sea lineal, sino curvilínea, del tipo de la que se expone en la figura IV.4.1. La no proporcionalidad entre ración y crecimiento significa que el grado de utilización del mismo varía según el tamaño de aquella. En nuestro caso observamos como el FER va cayendo (peor uso del pienso para crecimiento) a medida que la ración aumenta; en otras palabras, el crecimiento (SGR) y la utilización del alimento (FER o TCA) no son los mejores a la misma ración (Xie et al., 1997; Fang et al., 2010). En nuestro caso las corvinas que mejor crecen no son la que mejor utilizan el alimento y viceversa. 1 0.60 0.55 0.8 0.50 0.6 0.45 0.4 0.40 0.2 0.35 0 0.30 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 Tamaños de ración (% peso biomasa/día) Figura IV.4.1. Efecto del tamaño de la ración sobre SGR ( ), eje de la izquierda, y FER ( ), eje de la derecha). En principio, y desde el punto de vista comercial, la ración F11 sería la más conveniente (óptima) en este caso ya que los peces alimentados con ella crecen prácticamente lo mismo que los que consumen una ración casi un 50% mayor (F16). La ración F06, pese a ser muy bien aprovechada no es suficiente para producir un crecimiento aceptable. La definición de una ración óptima no sólo es de interés comercial sino también ecológico, pues muy probablemente reduzca los desechos sólidos al medio (Brett et al., 1969; Elliot, 1975; Khan et al., 2004; Desai et al., 2009). Son numerosos los estudios que indican que las mejor utilización del alimento se da para raciones submáximas (Wurstbaugh y Davis, 1977; Cox y Coutant, 1981; Cui y Wooton, 146 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). 1998; Hasan y Macintosh, 1991; Li y Lovell, 1992; Van Ham et al., 2003 y Sun et al., 2006). En cuanto a la retención proteica (PER) (tabla IV.3.2.), dado que todos los peces fueron alimentados con el mismo pienso, los datos son reflejo de los de utilización general del pienso, esto es, significativamente mejores para el tratamiento F06, presentado F11 valores intermedios, en torno a 1, lo que indica que, en este caso, las corvinas ganan un gramo de peso por cada gramo de proteína que consumen. En un experimento de Bajandas et al., (2009a, b), las corvinas presentaron un crecimiento óptimo con raciones de 2.5-5% peso corporal/día pero, en ese caso, se trataba de corvinas más jóvenes (6 y 20 gramos) y es bien sabido que en la mayoría de los peces de acuicultura, el tamaño de la ración óptima (cuando se expresa en relación al peso del animal) disminuye al crecer el pez (Niimi y Beamish, 1974; Staples y Nomura, 1976; Xie et al., 1997). A la hora de comparar los resultados de crecimiento de este experimento con los obtenidos en otros ensayos encontramos datos algo variables. En efecto los SGR en este caso (0.4-0.5) son inferiores a los reportados por otros autores como Piccolo et al. (2008) o Chatzifotis et al. (2011) pero superiores a los de Ortega y De la Gándara (2007). Otros experimentos recogidos en esta Memoria presentan un SGR para corvina del rango 0.5-0.6. Es obvio que para que estas comparaciones sean válidas deberían tener en cuenta factores tan importantes como la composición del pienso, el tamaño de la ración, la edad de los animales, las condiciones ambientales, la raza o variedad, etc. Sin embargo, los índices de crecimiento y eficiencia alimentaria aquí descritos son similares a los presentados por otros especies de peces marinos cultivados (Company et al., 1999; Peres y Oliva-Teles, 1999; Chou et al., 2001; Regost et al., 2001; Wang et al., 2005; Espinós et al., 2003). Algunos autores (Goddard, 1996; Puvanendran et al., 2003) indican que si los peces se alimentan con raciones reducidas, los más grandes y/o agresivos comen a expensas de los más pequeños. Es decir, diferencias en el tamaño corporal podrían tener un impacto significativo en la capacidad de los peces para competir socialmente lo que podría reflejarse en un menor crecimiento global del grupo. En este experimento no se ha observado esta posible jerarquización, pues los coeficientes de variación obtenidos en los distintos lotes son muy similares (F16: 21%; F11: 23% y F06: 21%). A menudo, algunos índices como el de condición (K), el hepatosmático (IHS) y el digestosomático (IDS) (tablas IV.3.1. y IV.3.3) se usan para valorar el estado nutricional 147 Sergio García Mesa de los peces, porque se pueden determinar fácil y rápidamente (Rueda et al., 1998; Gaylord y Gatlin, 2000; Qian et al., 2000; Zhu et al., 2001; Cho et al., 2006). En nuestro caso, como se indica antes, ni K ni el IDS presentaron efecto alguno derivado por los distintos tamaños de ración administrados, lo que indica que dentro de cada lote los animales están creciendo isométricamente. Con respecto a la composición química del animal, Shearer (1994) revisó varios trabajos desarrollados en salmónidos, prestando especial atención a la composición proximal en función del tamaño de ración que recibían concluyendo que los niveles de proteína y cenizas venían determinados por el tamaño del animal (endógenamente controlado), que los lípidos dependían de factores endógenos y exógenos (tamaño del pez, dieta, demanda metabólica) y que la humedad está inversamente relacionada con el contenido de lípidos corporales. Estos postulados están de acuerdo con los resultados obtenidos por otros autores (Van Ham et al., 2003; Khan et al., 2004; Ahmed, 2007), aunque también se ha descrito que distintos tamaños de ración no tienen efecto en la composición de los nutrientes corporales (Xie et al., 2001). En este experimento encontramos poco efecto del tamaño de ración sobre la composición proximal del músculo e hígado. No obstante, las corvinas del tratamiento F11 presentaban un menor contenido de agua, aunque tal hecho no se reflejó en la proporción de lípidos en músculo, sí se acompañó de un descenso del contenido de cenizas en este tejido, hecho descrito anteriormente en aquellas raciones citadas como óptimas en Cirrhinus mrigala (Khan et al., 2004). En cuanto al hígado se observó que el contenido de glucógeno fue significativamente superior en las corvinas F11, lo que coincidía con un IHS significativamente mayor en las mismas al final del experimento. La explicación de un mayor contenido de glucógeno hepático en aquellas corvinas alimentadas a una ración intermedia, podría estar en que esta ración, más próxima al óptimo, provoca que las reservas energéticas estén disponibles en proporciones equilibradas, al contrario de lo que se podría encontrar en peces alimentados por encima y por debajo de este nivel, produciendo las reservas lipídicas un desplazamiento de las de glucógeno; tal hipótesis debería someterse a más verificación, prestando atención a estas fracciones de reserva, pues se ha descrito tanto que, en algunas ocasiones, la restricción parcial o total de alimento produce una acumulación de lípidos en hígado (Pérez-Jiménez, 2008) como que raciones mayores provocan siempre una mayor acumulación de lípidos en general (Khan et al., 2004; Ahmed et al., 2007). 148 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Distintos tamaños de ración diaria significan un diferente aporte de sustratos a las distintas rutas metabólicas, por lo que podría pensarse que eso repercutiera en la actividad de diversos enzimas clave de esas rutas. En la tabla IV.3.5. se exponen los datos obtenidos a este respecto con los tres tamaños de ración ensayados. En términos generales, aunque a los 60 días del inicio de la alimentación diferenciada ya se observaron algunos efectos, estos fueron más notables a los 120 días (figura IV.4.3.). El aumento del tamaño de ración implica uno parejo de los distintos componentes que forman el pienso. En la mayoría de los estudios, sin embargo, se investiga el efecto de la mayor o menor presencia de uno de los componentes del pienso en el metabolismo intermediario, de modo que el efecto de la adición/reducción de carbohidratos, proteínas y lípidos se ha estudiado de forma separada. La actividad de las enzimas del metabolismo intermediario medidas en corvina están dentro del rango encontrado en otras especies cultivadas como trucha arcoíris, esturión, dentón, dorada y lubina (Peres y Oliva-Teles, 2006; Pérez-Jiménez et al., 2007; Moreira et al., 2008; Enes et al., 2008a, b; Pérez-Jiménez et al., 2009; Furné et al., 2009a). Por otra parte hemos detectado un considerablemente mayor efecto del tamaño de la ración sobre el metabolismo hepático que sobre el muscular, lo que nos indica que el primero es más sensible a esos cambios en la magnitud del aporte diario de nutrientes y energía. Efectivamente, en el caso del hígado, pudimos observar que tras 120 días de recibir la alimentación diferenciada, existía una cierta relación directa entre cantidad ingerida de alimento y actividad de la mayoría de las enzimas (figura IV.4.2.). Cuando tomamos como referencia los valores correspondientes a los lotes F11 que, previamente, hemos considerado como los alimentados con la ración que podríamos considerar óptima; observamos que las corvinas alimentadas con la ración más alta exhiben una mayor actividad enzimática mientras que la alimentadas con la ración más baja la presentaban igual o inferior. Es excepción la actividad de LDH para la que la relación anterior se invierte. Existe en la literatura una serie de trabajos (Beamish, 1964; Love, 1970, 1980; Blaxter y Ehrlich, 1974; Jobling, 1980; Johnston, 1981; Du Preez et al., 1986 a, b; Wieser et al., 1992; Navarro y Gutiérrez, 1995; Metón et al., 1999, 2003; Hemre et al., 2002; Furné et al., 2012), que exponen algo relacionado con los resultados del experimento que se describe en la siguiente sección, y es que la privación de alimento tiene un efecto depresor general sobre el metabolismo intermediario. Podríamos extender este argumento a restricciones sólo parciales en la disponibilidad de alimento de forma que 149 Sergio García Mesa los peces alimentados con la ración más alta fueron los que exhibieron una mayor actividad general de las rutas del metabolismo intermediario. Sin embargo, tras los primeros 60 días de alimentación diferenciada se observó que las corvinas alimentadas al 0.6% presentan mayor actividad en muchas de las enzimas determinadas, de forma significativa en EM, FBPasa, G6PDH, GOT, GPT, HOAD y LDH), por lo que parece que el metabolismo se encuentra acelerado por la menor ingesta de alimento, pero al día 120, son éstas las corvinas del tratamiento F06 las que presentan menor actividad en prácticamente la totalidad de las enzimas del metabolismo intermediario, posiblemente porque se hayan adaptado a esta situación de restricción alimentaria y la menor actividad metabólica se centre a un mejor aprovechamiento de la energía de la dieta (tabla IV.3.2, figura IV.4.1.) y de hecho son estos animales, los que, en términos relativos mejor usan el pienso ingerido o, dicho de otra forma, las que menos lo “desperdician” para otros fines, pues la tasa de eficiencia alimentaria (FER) es significativamente superior en estas corvinas F06. Al final del experimento, se observó en las corvinas alimentadas a tasas más bajas una cierta adaptación mediante un incremento de producción de energía por la vía anaerobia, puesto que se detectó un aumento significativo de la actividad LDH hepática (figura IV.4.2.). Este aumento ha sido descrito en otras especies sometidas a condiciones adversas que implican una reducción de la ingesta (Ibarz et al., 2009) y cursa con una reducción en la actividad motora; este aumento coincidía con una reducción en la actividad de la CS, hecho que también detectamos en la corvina aunque, en nuestro caso, esa reducción no fue significativa; pese a ello, la relación entre las actividades de ambas enzimas (en cierta forma, entre las tasas de metabolismo aeróbico y anaeróbico) muestra una relación inversa con el tamaño de la ración (tabla IV.4.1). Tabla IV.4.1. Relación entre actividades de distintas enzimas del metabolismo intermediario en hígado de corvinas sometidas a distintos tamaños de ración GOT/GPT HOAD/CS PK/CS LDH/CS GOT/CS 4.06 0.51 1.35 7.98 15.83 F06 4.55 0.57 2.01 5.79 19.06 F11 2.69 0.54 1.01 4.59 18.58 F16 Siguiendo con este sistema de análisis de datos basado en la relación entre las actividades de diferentes enzimas, podemos inferir de lo expuesto en la citada tabla un mayor uso de los carbohidratos con fines energéticos (deducido de la relación PK/CS) por las corvinas alimentadas con la ración intermedia (F11), lo que podría suponer un cierto efecto de protección de la proteína ingerida, en consonancia con el mejor índice 150 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). de PER (tabla IV.3.2.), acompañado de un crecimiento aceptable, que tienen estos animales con respecto a los alimentados con la ración más alta. Si estudiamos los datos de actividad de las enzimas consideradas como indicadoras de la tasa de catabolismo de aminoácidos (GDH, GOT y GPT), observamos (figura IV.4.2.) que son claramente mayores en los animales que recibieron la ración más alta y, por tanto, la mayor provisión de proteínas; esta situación podría ser indicativa de una mayor tasa de uso de proteínas con fines energéticos por estos animales, lo que se reflejaría en un menor grado de utilización de las mismas para crecimiento (PER); como, además, no hemos detectado cambios en el contenido de proteína muscular (el compartimento corporal donde más se acumula en términos absolutos), podríamos considerar razonablemente que el índice PPV (que mide la proporción de la proteína retenida en relación con la ingerida) también sería menor en este grupo. Según Metón et al. (1999), una menor ración alimentaria conduce a una menor actividad GPT en doradas, de forma similar a lo observado en corvinas (figura IV.4.2.). ACoAT CS EM FBPasa G6PDH GDH GOT GPT GyK HK HOAD LDH PK 120 100 80 % variación 60 40 20 0 -20 -40 -60 F16 F06 Figura IV.4.2. Efecto del tamaño de ración sobre los niveles de actividad de enzimas del metabolismo intermediario hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación respecto al F11. A partir de la relación de actividades GOT/GPT (tabla IV.4.1) se puede deducir que las corvinas alimentadas con las raciones más bajas son más dependientes de aspartato, mientras que las F16 utilizan proporcionalmente más alanina. A diferencia de lo descrito por Metón et al. (1999), con la dorada, la GOT y GPT hepática de las corvinas son igualmente sensibles al tamaño de ración. En conclusión, se podría afirmar que la ración más alta (recordamos, ingesta proteica más elevada) supone un mayor uso de las proteínas con fines energéticos lo 151 Sergio García Mesa que, al coincidir con una menor contribución de los carbohidratos al aporte energético (menor relación PK/CS), no se manifiesta ningún efecto de ahorro proteico. Fernández et al. (2007) consideraban que la mayor de actividades PK y GPT es indicadora de tal tipo de ahorro. Los distintos tamaños de ración no parecen afectar la tasa de β-oxidación de los ácidos grasos, indicada por la HOAD (figura IV.4.2.), algo similar ocurre para la CS y por tanto para la relación HOAD/CS. Ello implicaría la utilización completa del acetil CoA por lo que la célula no se encuentra en la situación de formar cuerpos cetónicos de forma diferenciada en las tres situaciones, de ahí que tampoco se hallen diferencias en la actividad ACoAT. En hígado, el papel de la glucolisis está ligado a la provisión de precursores de procesos de biosíntesis más que para proporcionar pirúvico para la oxidación. En peces alimentados, la oxidación de los α-cetoácidos (derivados del catabolismo de aminoácidos) por el ciclo TCA podría ser la principal ruta de producción de energía en el hígado de trucha con alguna contribución de la β-oxidación de los ácidos grasos (Walton y Cowey, 1982). Cuando los carbohidratos no se presentan en la dieta, la proteína es catabolizada para la síntesis de glucosa (Suárez y Mommsen, 1987). Es importante proporcionar niveles adecuados de carbohidratos en la dieta para asegurar una utilización eficiente de los otros nutrientes (Wilson, 1994). En lo que concierne a las dos enzimas habitualmente consideradas indicadoras de la magnitud de la glucolisis, encontramos resultados algo dispares. En efecto, si bien ambas enzimas aumentan su actividad al hacerlo la ración entre la F06 y F11 (lo que implica una ingesta mayor de carbohidratos), esta situación no se produce al aumentar la ración hasta el tamaño F16; donde la actividad HK prácticamente se mantiene, pero la PK incluso disminuye. Algunas variables como la temperatura o el contenido de carbohidratos en la dieta no provocan un efecto claro sobre la actividad HK en dorada y lubina (Panserat et al., 2000; Enes et al., 2006a, b; Enes et al., 2008a; Couto et al., 2008), sin embargo en nuestro caso sí detectamos el efecto antes descrito, igual que, como luego veremos, con una actividad reducida en corvinas en ayunas. El tamaño de ración sí tiene un efecto claro sobre la utilización de la glucosa y parece establecerse una relación entre la administración de alimento y la actividad de esta enzima, de modo que ésta es significativamente menor en F06, análogamente a lo que se observaría en el ayuno, pero similar entre F11 y F16, lo que indicaría un mayor uso proporcional de los carbohidratos en F11. Se piensa que la HK es una enzima que emplea de forma limitada la glucosa en peces (Newsholme y Start, 1973) lo que explicaría que no se produzca un aumento en su actividad paralelo al de la ración, al pasar de la intermedia a la más alta. La situación de 152 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). la PK es más difícil de explicar; es cierto que varios autores han descrito, en diferentes especies de peces, que esta actividad es inducible (Panserat et al., 2000; Fernández et al., 2007; Enes et al., 2006a, b; Couto et al., 2008; Enes et al., 2008a, b). En nuestras corvinas, una mejora en la utilización de los carbohidratos con fines energéticos (ración intermedia, F11) puede ser debida a un aporte diario más adecuado de estos nutrientes, circunstancia que no se produciría con las raciones extremas. Los estudios sobre las repercusiones del volumen de la ingesta de carbohidratos sobre la actividad FBPasa no son coincidentes, ya que la relación inversa entre ambos que detectan algunos (Panserat et al., 2002, en dorada) no es apreciada en otros experimentos (Suárez et al., 1995; Enes et al., 2006a; Couto et al., 2008; Moreira et al., 2008). En nuestro caso, al aumentar el tamaño de la ración de F06 a F11 no detectamos cambios en esta actividad (como veremos en el próximo apartado, tampoco un ayuno absoluto y prolongado pareció afectarla), lo que reforzaría la idea de una regulación poco eficiente de la misma. No obstante, las corvinas alimentadas con la ración más alta sí que mostraron una mayor actividad; la única explicación que se nos ocurre es que tal circunstancia se debe a un mayor aporte de sustratos gluconeogénicos generado por la mayor actividad de las enzimas implicadas en el catabolismo de los aminoácidos y que antes hemos comentado. En los peces alimentados con la ración más baja, una menor actividad FBPasa unida a una, también menor, actividad HK podría contribuir al mantenimiento de la glucemia. La G6PDH y EM son enzimas implicadas en la generación de NADPH (Arnesen et al., 1993; Bouraoi et al., 2011) que puede ser usado para la síntesis de lípidos. En nuestro experimento, la actividad de ambas enzimas aumenta con el tamaño de ración, al igual que ocurría en dorada (Metón et al., 1999) con la G6PDH. Es previsible que esto conduzca a una mayor depósito de lípidos en hígado ya que una mayor tasa lipogénica se traduce en un mayor contenido de lípidos en hígado (Enes et al., 2006b; Enes et al., 2008a; Moreira et al., 2008; Ibarz et al., 2009) pero no disponemos de datos a este respecto en el caso de la corvina. Aunque hemos indicado antes que la actividad HOAD no se encuentra significativamente afectada por el tamaño de ración, sí que observamos que la actividad GyK hepática era menor en las corvinas F06, lo que podría implicar una menor tasa de movilización de lípidos cuando se restringe el tamaño de la ración. Ya hemos indicado al inicio de este apartado que, globalmente, el tamaño de la ración afectó poco al metabolismo muscular, de hecho sólo se detectaron algunas 153 Sergio García Mesa diferencias en algunas enzimas indicadoras del metabolismo de hidratos de carbono (PK, LDH y FBPasa) (figura IV.4.3.). La mayor actividad, tanto de PK como de LDH en F06 (figura IV.4.3.) indicaría un mayor grado de utilización anaeróbica de glucosa, propia de músculo blanco y que podríamos asociar a una mayor frecuencia de episodios de natación explosiva quizá en busca de un alimento poco abundante. Globalmente el aumento de estas actividades unido al mantenimiento de la CS (esto es mayores relaciones PK/CS y LDH/CS, tablas IV.3.6 y IV.4.2.) hace pensar en una mayor dependencia del metabolismo anaerobio en estas corvinas subalimentadas tal como ocurría en el hígado. Al igual que en esa víscera, en músculo no hubo variación en la relación HOAD/CS como consecuencia del tamaño de la ración; esto es, el uso de energía de lípidos con relación al total no se vio afectado. ACoAT CS EM FBPasa GDH GOT GPT GyK HK HOAD LDH PK 100 80 % variación 60 40 20 0 -20 -40 -60 F16 F06 Figura IV.4.3. Efecto del tamaño de la ración sobre los niveles de actividad de enzimas del metabolismo intermediario en músculo de corvinas. Los datos son representados como % de variación respecto al F11. Tabla IV.4.2. Relación entre actividades de distintas enzimas del metabolismo intermediario en músculo de corvinas sometidas a distintos tamaños de ración. GOT/GPT HOAD/CS PK/CS LDH/CS GOT/CS 8.38 0.11 61.71 92.10 4.92 F06 9.48 0.10 51.54 75.45 5.24 F11 11.16 0.09 47.03 32.73 4.66 F16 154 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). La actividad gluconeogénica muscular (indicada por FBPasa) está activada en las corvinas que presentan los regímenes de alimentación más extremos, F06 y F16 (figura IV.4.3.). Muy posiblemente, ello sea debido al aumento de la actividad LDH y PK muscular, las cuales proporcionas sustratos para este proceso (Suárez et al., 1995; Furné et al., 2012). Como en otros experimentos incluidos en esta Memoria, tampoco en este caso hemos podido detectar, con la técnica empleada, actividad alguna de G6PDH en músculo. Como otros autores (Furné, 2008; Pérez-Jiménez, 2008) sí han encontrado esta actividad en otras especies usando la misma técnica, podemos asumir que, en la corvina, la actividad G6PDH es, en cualquier caso, extremadamente baja. Ello provocaría un déficit en la provisión de NADPH para lipogénesis lo que coincide con las escasas reservas musculares de grasa en esta especie. En resumen, el tamaño de ración supuso un aumento de la obtención de energía por vía anaerobia, además de un ahorro proteico por la mejor utilización de los carbohidratos en las corvinas alimentadas con tasas menores y una priorización de obtención de energía a partir de proteína en las corvinas F16. Además de evaluar el crecimiento, la composición química y las enzimas del metabolismo intermediario, se determinaron los posibles efectos que puedan tener diferentes tamaños de ración en el estado oxidativo de las corvinas, centrándose en la determinación de biomarcadores que normalmente responden a la generación de estrés oxidativo, como son la actividad de algunas enzimas (CAT, DTD, GPX, GR, GST y SOD), además de los niveles de peroxidación lipídica que se ha usado como bioindicador del daño oxidativo, a través de la concentración de uno de los productos de rotura de los lipoperóxidos por parte de los radicales libres, el malondialdehído (MDA) (figura IV.4.4.). La SOD cataliza la dismutación del radical superóxido (O2 -1) en H2O y H2O2 y es la primera en canalizar la eliminación de los radicales libres. El aumento de la actividad SOD fue paralelo a la restricción alimentaria, de esta forma podríamos considerar que en las corvinas subalimentadas, F06, estaba teniendo lugar una mayor producción de radicales superóxido que serían neutralizado a H2O2, que a su vez será catalizado por CAT y GPX, eliminando el potencial daño oxidativo. Una situación análoga se detectó en dorada (Pascual et al., 2003) y Salmo trutta (Bayir et al., 2010) alimentadas con distintos tamaños de ración. 155 Sergio García Mesa % variación CAT DTD GPX GR GST SOD TBARs 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -40 F16 F06 Figura V.4.4. Efecto del tamaño de la ración sobre los niveles de actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación respecto al F11. La GPX depende del glutation reducido (GSH) generado por acción de la GR. Por ello, las actividades de estas enzimas están directamente relacionadas, presentando mayores valores en F06 y F11. La actividad del enzima antioxidante GR depende de NADPH. Las corvinas con la ración más elevada (F16) presentan las mayores actividades de enzimas generadoras de dicho NADPH y, sin embargo, es en estos lotes donde detectamos menor actividad GR. Esta aparente incongruencia podría encontrar una explicación, al menos parcial, en el sentido de que una mayor actividad G6PDH no sólo puede estar motivada por una mayor necesidad de NADPH, sino que también sería útil para proporcionar precursores de nucleótidos (ribosa 5-fosfato), lo que implicaría una mayor síntesis proteica (Bastrop et al., 1991; Vigliano et al., 2002). Como hemos indicado antes, en estas corvinas sobrealimentadas, están activadas enzimas implicadas en el catabolismo de los aminoácidos (GDH, GOT y GPT), por lo que se produciría un aumento general de la renovación proteica. La enzima DT-diaforasa, también utiliza como cofactor el NADPH, presentó la misma tendencia descrita para GR y GPX, esto es, las corvinas F06 y F11 presentaban mayor actividad lo que permite una mayor protección de las membranas celulares por la formación de hidroquinonas. La GST posee un papel crítico frente al daño oxidativo que pueden sufrir los ácidos nucleicos y lipídos (George, 1994; Elia et al., 2003), reduciendo los hidroperóxidos (Jackson et al., 2002). Esta actividad es más elevada en las corvinas alimentadas con las 156 Efecto del tamaño de la ración sobre el crecimiento, la utilización de la dieta, el metabolismo y el estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). dos raciones más bajas ayudando a prevenir el daño citado. Pascual et al. (2003), sin embargo, no detectaron influencia del tamaño de ración en la actividad GST en dorada. Así pues, la mayor actividad de las enzimas implicadas en la defensa antioxidante detectada en los peces alimentados con las raciones restringidas parece ser lo suficientemente eficaz para neutralizar dicho daño y de hecho, los niveles de peroxidación lipídica (TBARs) son significativamente menores en los tratamientos citados. El efecto beneficioso de una ración restringida a la hora de evitar daño oxidativo es un lugar común pero, como veremos en el siguiente apartado, la situación de restricción extrema (ayuno total y prolongado) puede tener los efectos contrarios En músculo, los efectos del tamaño de la ración sobre los indicadores del estrés oxidativo son menores que en el hígado, al igual que sucedía con el metabolismo intermediario (figura IV.4.5.). La actividad CAT no fue detectada en músculo con la técnica empleada. % variación GR GPX GST SOD TBARs 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 F16 F06 Figura IV.4.5. Efecto del tamaño de la ración sobre los niveles de actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación respecto al grupo control F11. De hecho, no se detectó efecto alguno de la ración sobre la actividad de las enzimas SOD, GPX y GST así como en los niveles de daño oxidativo, medidos por TBARs. Aquí, a diferencia de lo que ocurría en hígado, existe una relación directa entre el tamaño de la ración y actividades de DTD y GR; no estamos en condiciones de explicar esta situación aparentemente “anómala”, por otra parte la no disponibilidad de antecedentes en la literatura sobre el posible efecto del tamaño de ración sobre estos procesos en músculo, nos impide contrastar y valorar los resultados obtenidos. De cualquier forma, la menor presencia de metabolismo oxidativo en este compartimento 157 Sergio García Mesa corporal en relación con el hígado, es previsible que genere una menor necesidad de estos sistemas de defensa y que éstos sean menos sensibles a cambios inducidos. IV.5. RESUMEN. En nuestras condiciones experimentales, el tamaño de ración diaria más favorable para la cría de corvina de esa edad/tamaño es la que supone un 1.1 % de su peso corporal, que provoca una mejora notable en crecimiento con respecto a la 0.6 % y un mejor aprovechamiento del pienso con respecto a la que significa un 1.6 %. La ración diaria más restringida (0.6 % del peso corporal) provoca ciertos cambios metabólicos notables quizá reflejo de una cierta adaptación a la restricción alimentaria (menor movilización de lípidos, ahorro energético) así como una mayor dependencia del metabolismo anaerobio en el músculo, posiblemente derivada de una actividad natatoria más intensa en relación con una mayor competencia por el alimento. A partir del análisis de las actividades enzimáticas correspondiente se detecta un cierto efecto de la ingesta diría de alimento sobre el uso preferencial de ciertos sustratos energéticos; carbohidratos para la ración más reducida, proteína para la más elevada, lo que supone, en éste último caso un uso más reducido de este nutriente con fines plásticos por lo que el crecimiento se resiente en comparación con la ración intermedia. La restricción alimentaria que supone la ración más baja genera una situación prooxidante que se ha visto neutralizada por el aumento de las actividades de las enzimas implicadas en la defensa antioxidante. 158 V. Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento, metabolismo y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) V.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS Pese a que los procesos vitales significan una demanda continua de energía, todos los animales pasan por periodos más o menos largos de interrupción de la alimentación, su única fuente externa de la misma, durante los cuales dependen de la que hayan podido almacenar con anterioridad. Estos periodos de cese de la alimentación deberán ser tanto más cortos cuanto más elevadas sean las necesidades de energía tal como ocurre en los endotermos (horas, días, salvo situaciones como la hibernación en la que se deprimen notablemente las necesidades energéticas). En cambio, los ectotermos, al tener, por lo común, tasas metabólicas más reducidas, pueden permitirse periodos de ayuno bastante más largos (días, semanas, incluso, años) que pasan a integrarse como algo habitual en su peripecia vital. Los peces pueden verse sometidos, en su medio natural, a variaciones en la disponibilidad de alimento o a “impulsos” comportamentales (reproducción, migraciones) en los que son comunes periodos más o menos dilatados de cese total de la actividad alimentaria y en repetidas ocasiones. Es por eso que, evolutivamente, estos animales han desarrollado respuestas fisiológicas, en definitiva metabólicas, y de conducta a fin de adaptarse y sobrevivir a estas situaciones desfavorables (Bastrop et al., 1991; Méndez y Wieser, 1993). Tanto es así, que algunos son capaces de sobrevivir meses sin alimentarse: Boetius y Boetius (1985) registraron un ayuno de 1594 días en anguila europea (Anguilla anguilla). Sin llegar a estos extremos, en piscicultura es relativamente frecuente introducir periodos de ayuno en la dinámica general de la producción relacionados con ciertas prácticas de la misma que los hacen aconsejables (traslados, tratamientos sanitarios, etc.), empeoramientos imprevistos de las condiciones del medio (temperatura, disponibilidad de oxígeno, presencia de tóxicos, temporales, etc.), preparación de los ejemplares para el sacrificio y comercialización (“acabado”) y, como se está ensayando 159 Sergio García Mesa recientemente, ayunos enfocados al aprovechamiento de lo que se conoce como “crecimiento compensatorio” que se produce durante la realimentación tras un ayuno y que puede significar un mejor aprovechamiento de la comida ofrecida. Por esa doble razón, interés por conocer mejor esta peculiaridad fisiológica de los peces y su posible aplicación a la piscicultura, las repercusiones del ayuno o del ayunorealimentación son un campo de estudio muy solicitado por los investigadores. La respuesta fisiológica al ayuno va a depender de unos factores intrínsecos, como son la propia especie, la edad, el tamaño, y otros extrínsecos, como la temperatura o el fotoperiodo (Shimeno et al., 1990; Méndez y Wieser, 1993; Navarro y Gutiérrez, 1995). Para hacer frente a esta situación desfavorable, los peces comienzan a movilizar sus reservas corporales y tienden a reducir su gasto energético, con tal de mantener las constantes vitales que aseguren la supervivencia (Holecek et al., 2001; Furné et al., 2012). Es decir, con el fin de mantener la homeostasis, los peces se adaptan metabólicamente a la situación de ayuno, apareciendo cambios en las principales rutas metabólicas (Walton y Cowey, 1982; Bastrop et al., 1991). Estos cambios afectan, por ejemplo, a la glucemia (Gutiérrez et al., 1991; Pérez-Jiménez et al., 2007; Furné et al.,2012), a través de cambios en las rutas glucogenolíticas y gluconeogénicas (Machado et al., 1988; Navarro y Gutiérrez, 1995; Metón et al., 2003; Pérez-Jiménez et al., 2007; Furné, 2008; McCue, 2010) . Si el ayuno se prolonga se va a producir la movilización de las reservas lipídicas con lo que se generan glicerol, otro sustrato para la gluconeogénesis, y ácidos grasos de los triglicéridos para proporcionar energía (Machado et al., 1988). Aunque, según Zammit y Newsholme (1979), a diferencia de los mamíferos, los peces no dependen de los cuerpos cetónicos como fuente de energía. La última reserva que se moviliza durante el ayuno son las proteínas corporales lo que se pone de manifiesto en cambios en la actividad de enzimas implicados y de la propia composición corporal; los aminoácidos generados podrán ser usados como combustible inmediato o como sustrato de gluconeogénesis (Black y Love, 1986; Soengas et al., 1997; Sánchez-Muros et al., 1996; Vigliano et al., 2002). Esta secuencia de utilización de reservas provoca que la magnitud de las mismas se altere de forma diferencial según la duración de ese periodo de privación de alimento en relación, además, con los factores antes mencionados (edad, hábitat alimentario, 160 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). estado nutricional previo, temperatura del agua, etc.) por lo que los efectos sobre la pérdida de peso (del pez entero y de sus vísceras) y los posibles cambios en la composición corporal podrán ser muy variables (Shimeno et al., 1990; Soengas et al., 1996). Por otra parte, la implicación de los distintos territorios puede ser muy diferente, en este sentido, la mayoría de los estudios se han llevado a cabo en hígado y músculo (Weatherley y Gill, 1981; Black y Love, 1986; Lim y Ip, 1989; Méndez y Weiser, 1993; Pérez-Jiménez et al., 2012; Furné et al., 2012). Como es previsible, el ayuno debe disminuir la actividad de las rutas metabólicas implicadas en el almacenamiento de reservas energéticas (Shimeno, 1990; Bastrop et al., 1991; Vigliano et al., 2002). Cuando el pez puede realimentarse tras un periodo de ayuno se enfrenta a un nuevo reajuste metabólico que también ha sido estudiado ampliamente (Machado et al., 1988; Shimeno et al., 1990; Méndez y Wieser, 1993; Metón et al., 2003; PérezJiménez et al., 2012; Furné et al., 2012). Esos reajustes, unidos a los digestivos, suelen conducir a una mejora de la tasa de crecimiento (lo que se conoce como “crecimiento compensatorio”) que también está siendo estudiado con detalle (Weatherley y Gill, 1981; Wieser et al., 1992; Nicieza y Metcalfe, 1997; Ali et al., 2003; Xie et al., 2001; Zhu et al., 2004; Cho et al., 2005; Eroldogan et al., 2006; Ferrando et al., 2009). El ayuno, sea cual sea su duración, genera una situación de estrés metabólico que puede repercutir en la tasa de producción de radicales libres y/o en la actividad de los sistemas de defensa antioxidante por lo que la influencia de aquel en la génesis de situaciones de estrés oxidativo también ha sido estudiado en diversas especies de peces (Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2010; Bayir et al., 2011). Teniendo en cuenta, los antecedentes mencionados, se diseñó y realizó este experimento en el que dos lotes de corvinas se sometieron a un ayuno absoluto de 60 días seguido de un periodo de realimentación de otros 60 días. Durante los 4 meses del experimento se realizó un seguimiento de determinadas variables biométricas y de composición, otras metabólicas y, finalmente, algunas relacionadas con el estrés oxidativo. Este experimento se realizó simultáneamente con el descrito en el capítulo anterior, de forma que, para todos los casos se usaron como referencia sendos lotes control alimentados de forma continua de entre los usados en aquel experimento. 161 Sergio García Mesa V.2. MATERIAL Y MÉTODOS V.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos Los animales empleados así como las condiciones experimentales se describen con más detalle en la sección de Material y Métodos del apartado IV. Con el fin de determinar el efecto del ayuno y la posterior realimentación sobre el crecimiento y la fisiología de la corvina se constituyeron dos lotes de 100 animales cada uno, a los que se privó completamente del alimento durante 60 días; al final de ese periodo de ayuno, los peces empezaron a alimentarse con una ración diaria del 1.1 % del peso corporal y se prolongó el seguimiento durante 60 días más. Este experimento se realizó simultáneamente al descrito en el apartado IV (efecto del tamaño de la ración), usando los lotes F11 de aquél, también alimentados con una ración diaria del 1.1 % del peso corporal, como controles para éste. El pienso empleado fue de la marca SKRETING, en concreto el tipo C.V.6, específico para corvina, con un tamaño de grano adecuado al de nuestros animales. La composición del pienso aparece detallada en la tabla V.2.1. Tabla V.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca) Componente Proteína bruta Extracto etéreo Cenizas Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)* Energía** (MJ/Kg) Relación Proteína/Energía (g/MJ) 472.0 204.7 77.2 246.1 238.3 198.0 * calculado como 1000 – (Proteína bruta + extracto etéreo + cenizas) ** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y MELN, respectivamente A partir de una estimación de la biomasa total presente en cada tanque, basada en los muestreos en los días 60, 80, 100 y 120 del experimento se calculó la ración total a suministrar a cada uno de los dos tanques para mantener la ración diaria lo más homogénea y ajustada a los valores previstos durante este periodo de realimentación. 162 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). V.2.2.Procesado de las muestras En los días señalados, se sacrificaron algunos peces, tomados al azar de cada lote, tras un ayuno previo de 24 horas. El hígado y una porción de músculo blanco de la parte anterior dorsal de los peces fueron diseccionados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta que se usaron para los estudios metabólicos en las instalaciones de la UGR. Los tejidos se homogenizaron según se detalla en el apartado IX de esta Memoria. V.2.3. Parámetros biométricos y composición química. A partir de datos de esos muestreos, se calcularon el incremento de peso (GAP) de los peces, así como varios índices de crecimiento y utilización de la dieta, como son IRP, SGR, TCA o FCR, TEA o FER e índices biométricos, K, IHS, IVS, IDS y RF. Los peces destinados al estudio de la composición química se almacenaron en hielo y se transportaron rápidamente hasta las instalaciones de la UGR. Se diseccionó la parte derecha del músculo y se procedió a la determinación de la composición según se detalla en el apartado IX Metodología. V.2.4. Análisis de la actividad enzimática Los ensayos enzimáticos en hígado y músculo se realizaron según se detalla en el anexo IX (Metodología) de esta memoria. Se determinaron las siguientes actividades enzimáticas: Acetoacetil CoA Tiolasa (ACoAT; EC 2.3.1.9.), Citrato Sintasa (CS; EC 4.1.3.7), Enzima Málico (EM; EC 1.1.1.40.) Fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa; EC 3.1.3.11), Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49), Glutamato Deshidrogenasa (GDH; EC 1.4.1.2), Glutamato Oxalacetato Transaminasa (GOT; EC 2.6.1.1.), Glutamato Piruvato Transaminasa (GPT; EC 2.6.1.2.), Glicerol Kinasa (GyK; EC 2.7.1.30.), Hexokinasa (HK; EC 2.7.1.1.), β-Hidroxiacil CoA Deshidrogenasa (HOAD; EC 1.1.1.35), Lactato Deshidrogenasa (LDH; EC 1.1.1.27) y Piruvato Kinasa (PK; EC 2.7.1.40), relacionadas con el metabolismo intermediario, y Catalasa (CAT; EC 1.11.1.6.), DT-Diaforasa (DTD; 1.6.99.2.), Glutation Peroxidasa (GPX; EC 1.11.1.9.), Glutation Reductasa (GR; 1.6.4.2.), Glutation tTansferasa (GST; 2.5.1.18), Superóxido Dismutasa (SOD; 1.15.1.1.) y Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico (TBARs) o Malondialdehído (MDA), relacionadas con el estrés oxidativo. También se determinó el contenido en glucógeno en hígado y músculo blanco. 163 Sergio García Mesa V.2.5. Análisis estadístico Se utilizó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) usando el software SPSS 15.0 para Windows. La diferencias significativas (P<0.05) entre los distintos tratamientos y puntos de muestreo de determinaron por el test de Duncan (Duncan, 1955). V.3. RESULTADOS V.3.1. Crecimiento En la tabla V.3.1 se exponen los valores de algunos parámetros biométricos de las corvinas que sufrieron un periodo de ayuno seguido de un periodo de realimentación (S/RF11), comparados con los del tratamiento que se consideró como control (F11). El ayuno de los peces se acompañó de una pérdida de peso asociada a una disminución del índice de condición (K). Con la realimentación se produjo un aumento rápido de los tres parámetros citados, pero no alcanzaron los valores del control, salvo para el K se igualó a los valores control a los 40 días de realimentación. Tabla V.3.1. Evolución temporal de varios índices biométricos de las corvinas sometidas a 60 días de ayuno y 60 días de realimentación (S/RF11) frente a las alimentadas de forma continuada (F11). Días de cultivo Longitud total (cm) S/RF11 F11 S/RF11 Peso (g) F11 K1 S/RF11 F11 0 20 40 60 80 100 120 18.72a 19.08ab* 18.91a* 19.55b* 20.21c* 21.29d* 22.24e* 0.19 0.19 0.20 0.17 0.19 0.20 0.17 18.88a 20.10b 20.48b 21.94cd 22.51d 24.02e 24.30e 0.19 0.19 0.23 0.15 0.25 0.19 0.18 77.10bc 73.38ab* 67.28a* 67.20a* 82.08c* 102.08d* 114.03e* 2.40 2.24 2.33 1.83 2.41 2.92 2.48 79.88a 92.33b 103.36c 114.75c 124.25d 135.58e 146.90f 2.46 2.86 3.34 2.89 4.25 3.43 3.69 1.16f 1.00d* 0.98c* 0.89a* 0.99c* 1.05e 1.02d 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 1.17e 1.14d 1.12d 1.08c 1.07c 1.04b 1.01a 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 Los valores son media ± EEM (N=20) para todos los muestreos excepto para el día 120, donde N=40. Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo. * Indica diferencias significativas (P<0.05) 1 entre S/RF11 y su control (F11). Índice de condición. 164 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). En la tabla V.3.2. se muestran los índices de crecimiento y aprovechamiento del alimento de las corvinas. Como es lógico, durante el ayuno todos los índices de crecimiento fueron negativos. Con la realimentación (60-120 días), las corvinas comenzaron a crecer a un ritmo mayor que las controles, aunque se alimentaran con un tamaño de ración similar y así presentaron un crecimiento específico (SGR) muy superior, además de una mejor conversión del alimento. Tabla V.3.2. Crecimiento y utilización del alimento en corvinas ayunadas/realimentadas (S/RF11) y alimentadas continuamente (F11). Para los lotes S/RF11 se exponen los datos de los dos subperiodos: ayuno (días 0-60) y realimentación (días 60-120). GAP1 0-60 IRP2 60-120 0-60 60-120 SGR3 0-60 TCA4 60-120 0-60 PER5 60-120 0-60 60-120 FER6 0-60 60-120 0.97* 2.20* 1.04* S/RF11 -9.90* 46.83* -12.84* 69.67* -0.23* 0.88* 0.45 1.28 0.47 1.64 0.01 0.02 0.05 0.12 0.06 67.03 83.97 0.51 2.39 0.89 0.42 F11 3.93 5.73 0.03 0.16 0.06 0.03 Los valores son media ± EEM de dos lotes experimentales. * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su 1 2 3 4 control (F11). Ganancia Absoluta de Peso; Incremento Relativo de Peso; Tasa de Crecimiento Específico; Tasa de 5 6 Conversión del Alimento; Coeficiente de Eficiencia Proteica; Tasa de Eficiencia Alimentaria. V.3.2. Índices biométricos En la tabla V.3.3. se recoge el efecto del ayuno y la realimentación sobre algunos parámetros biométricos frente al grupo considerado como control (F11). El ayuno prácticamente no afectó a los índices Víscerosomático (IVS), Digestosomático (IDS) y de Rendimiento del Filete (RF), pero sí provocó una disminución importante del Índice Hepatosomático (IHS) en cada periodo evaluado. Tabla V.3.3. Evolución temporal de algunos índices biométricos de las corvinas sometidas a 60 días de ayuno y 60 días de realimentación (S/RF11) frente a las alimentadas de forma continuada (F11). IHS1 IVS2 IDS3 RF4 0 20 40 60 80 100 120 S/RF11 2.71c 1.33b* 0.99a* 0.65ab* 1.77b* 2.56c* 2.58c* 0.20 0.20 0.36 0.08 0.19 0.10 0.05 F11 2.77c 3.22c 2.76c 2.29b 2.04ab 1.77a 2.13ab 0.14 0.14 0.11 0.11 0.15 0.21 0.08 S/RF11 11.78ab 10.28ab* 10.31ab* 10.33ab* 10.33ab 11.14b* 9.45a* 0.53 0.63 0.50 0.37 0.59 0.45 0.35 F11 11.95d 12.65d 11.06c 9.47ab 9.84b 8.77ab 8.29a 0.22 0.42 0.28 0.28 0.23 0.60 0.34 S/RF11 2.25ab 2.19a 2.24ab 2.12a 3.00c* 2.82bc* 2.38ab* 0.10 0.20 0.05 0.03 0.31 0.14 0.11 F11 2.23b 2.23b 2.21b 2.14b 2.00ab 2.12b 1.78a 0.30 0.16 0.14 0.07 0.09 0.08 0.087 S/RF11 39.27ab 38.60ab* 38.01a* 37.85a* 38.69ab* 42.19c 43.20d 1.41 1.35 2.02 2.04 1.04 0.65 0.62 F11 39.19a 41.61ab 42.35b 46.57c 42.28b 44.32bc 44.10bc 1.00 1.99 1.57 5.33 0.68 0.95 0.37 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del 1 tiempo. * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). Índice hepatosomático; 2 3 4 Índice viscerosomático; Índice digestosomático; Rendimiento del filete 165 Sergio García Mesa La realimentación dio lugar a que todos los índices aumentaran, este aumento fue más lento para IVS y RF (el día 100 pareció recuperarse e igualar al control) y muy significativo y rápido para IHS e IDS (a los 20 días de realimentación se superaron o igualaron los del grupo control), de modo que durante el resto del período de realimentación se encontraron muy por encima de los valores presentados en los controles F11. Nota: En la mayoría de los resultados que se presentan a continuación (tablas V.3.4 en adelante), se realiza una exposición doble: en primer lugar se presentan los datos obtenidos el día final del ayuno de los lotes S/RF11 junto a los de los lotes F11 considerados como sus controles (se visualiza así el efecto del ayuno). A continuación se presenta la evolución de esos datos durante los 60 días de realimentación para los lotes S/RF11 (para visualizar así el efecto de la realimentación). V.3.3. Composición El efecto del ayuno durante 60 días sobre la composición de las corvinas (S/RF11) se recoge en la tabla V.3.4. donde se compara con el grupo control (F11). La tabla V.3.5. muestra los datos de composición de músculo e hígado de corvinas del tratamiento S/RF11 en los diferentes periodos evaluados. Tabla V.3.4. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la composición de músculo e hígado de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11). Humedad Lípidos Músculo Proteínas Cenizas Glucógeno S/RF11-60 79.96* 5.38* 76.34* 6.69* 1.99 26.23* 0.21 0.27 2.26 0.12 0.07 0.67 5.19 F11-60 77.30 7.32 87.09 6.13 1.88 90.16 62.95 0.27 0.53 3.06 0.13 0.03 5.70 5.99 Grupo Hígado Glucógeno Proteínas 68.02 Los valores son media ± EEM (N=6). * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). Humedad: % agua. Lípidos: % extracto etéreo en sustancia seca. Cenizas: % cenizas en sustancia seca. Proteínas: % en sustancia seca. Glucógeno: mg/g tejido. En cuanto a la composición del músculo, el contenido de agua aumentó con el ayuno y se mantuvo elevado durante las primeras fases de realimentación, no obstante descendió al final del período experimental y las diferencias significativas con F11 desparecieron. El contenido de lípidos disminuyó durante el ayuno pero se recuperó rápidamente en el músculo por lo que en tan sólo 20 días desaparecieron las diferencias con el lote control. El contenido en minerales fue significativamente mayor en las corvinas en ayunas frente a las alimentadas, la realimentación dio lugar a que desaparecieran rápidamente estas diferencias, los valores de esta fracción muscular fueron bastante constantes a lo largo de esta segunda etapa. 166 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). El contenido en proteína disminuyó con el ayuno, aumentando lentamente a lo largo de la realimentación hasta igualarse al del grupo control. La privación de alimento no afectó a la cantidad de glucógeno muscular, sin embargo, a los 40 días de realimentación aumentó este contenido para volver a disminuir al final del periodo de realimentación. Tabla V.3.5. Evolución temporal de la composición muscular y hepática de las corvinas durante un periodo de 60 días de realimentación tras uno de ayuno de 60 días (día 60: inicio de la realimentación). Día Humedad c Lípidos a Músculo Proteínas Glucógeno a 60 79.96 5.38 48.20 0.21 0.27 2.26 80 78.54 100 78.29 120 b 6.36 b 0.31 3.32 7.15 51.84 a 0.51 4.32 77.69 6.74 0.10 0.33 0.28 0.18 ab b b 1.99 ab 0.07 a 1.80 a 62.74 b 1.79 2.81 0.04 47.68 Minerales b 68.02 b 72.25 26.23 0.12 0.67 6.46 0.04 b 0.20 2.20 6.14 a a 6.69 a 0.11 Hígado Glucógeno Proteínas ab 77.75 6.09 a 110.92 6.19 a 76.16 0.07 3.84 0.05 10.43 c b 5.19 4.05 67.87 2.79 75.19 5.88 Los valores son media ± EEM (N=6) Diferentes letras indican diferencias significativas (P<0.05) a lo largo del tiempo. Humedad: % agua. Lípidos: % extracto etéreo en sustancia seca. Cenizas: % cenizas en sustancia seca. Proteínas: % en sustancia seca. Glucógeno: mg glucógeno/ g tejido. Las reservas glucogénicas hepáticas estaban muy disminuidas tras 60 días de ayuno; no obstante, en tan sólo 20 días de realimentación triplicaron su valor acercándose a los valores de las controles, por su parte, la proteína hepática no reflejó efecto alguno del ayuno ni de la realimentación. V.3.4. Actividades enzimáticas del metabolismo intermediario V.3.4.1. HÍGADO En las tablas V.3.6. y V.3.7. aparecen las actividades enzimáticas del hígado de las corvinas al final del periodo de ayuno de 60 días y durante la posterior realimentación. El ayuno supuso la inhibición significativa de la mayoría de las actividades enzimáticas medidas frente a los valores observados en las corvinas controles. Algunas de ellas se recuperaron durante la realimentación (ACoAT, EM, G6PDH, GyK y PK) mientras que otras se mantuvieron en valores inferiores a los controles durante todo este periodo (CS y LDH). Las actividades hexokinasa (HK), piruvato kinasa (PK) y fructosa 1,6 bifosfatasa (FBPasa) se vieron disminuidas por la privación de alimento, pero la realimentación 167 Sergio García Mesa produjo una recuperación de las mismas de forma que al final de este periodo presentaban valores similares a los controles HK y FBPasa o ligeramente inferiores (PK). El ayuno también produjo una reducción de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) y de la citrato sintasa (CS), pero en este caso, esas actividades no se recuperaron durante la realimentación. Las actividades de glicerol kinasa (GyK), enzima málico (EM), glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y acetoacetil-CoA tiolasa (ACoAT) mostraron un descenso significativo durante el ayuno, todas ellas se recuperaron durante la realimentación, aunque con distinta secuencia temporal: 20 días para la GyK y EM, 40 días para la G6PDH y ACoAT. La 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (HOAD) no se afectó por el ayuno. En el periodo de realimentación, se detectó una disminución de la actividad, manteniéndose esta situación hasta el final del periodo experimental. La glutamato deshidrogenasa (GDH) tampoco presentó efectos del ayuno, pero en este caso se detectaron valores inferiores tras una realimentación de 20 días, valores que se recuperaron posteriormente. Una tendencia similar se encontró para la actividad glutamato oxalacetato transaminasa (GOT). En cambio glutamato piruvato transaminasa (GPT) mostró un aumento significativo de su actividad durante el ayuno que desapareció tras 20 días de realimentación, aunque se detectó un nuevo aumento al final de este periodo. 168 169 CS 15.61* 1.16 19.23 1.11 ACoAT 12.61* 1.05 48.14 3.67 0.40 4.03 0.16 1.30* EM 1.08 11.25 0.80 10.01* FBPasa 2.09 20.09 0.45 7.20* G6PDH 5.87 82.44 6.20 88.85 GDH 22.66 312.11 10.12 340.40 GOT 3.92 68.13 4.73 105.18* GPT 2.14 21.53 0.22 3.16* GyK 0.28 2.55 0.18 2.04* HK 0.93 11.70 1.01 12.84 HOAD 2.92 34.44 0.68 17.71* LDH 9.42 101.24 3.87 63.57* PK CS 15.61* 1.16 13.89 1.18 14.94 2.08 14.93 1.11 ACoAT 12.61* 1.05 25.56b 1.72 53.18d 3.29 43.38c 3.89 0.35 4.96c 0.17 3.47b 0.38 4.05b 0.16 1.30* EM 0.78 13.14b 0.97 17.19c 0.55 10.78a 0.80 10.01* FBPasa 1.70 19.59c 1.49 18.01bc 1.43 14.30b 0.45 7.20* G6PDH 10.24 121.72c 7.21 77.01ab 4.90 60.29a 6.20 88.85 GDH 16.12 300.38ab 17.03 435.12c 23.02 254.30a 10.12 340.40 GOT 12.06 141.80c 9.77 142.00c 5.26 66.33a 4.73 105.18* GPT 1.99 21.98b 1.20 20.70b 1.92 21.10b 0.22 3.16* GyK Los valores son media ± EEM (N=6) Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo (P<0.05). 120 100 80 60 Día 0.21 2.60b 0.12 1.42a 0.38 3.14c 0.18 2.04* HK 0.65 6.75a 0.80 8.30a 0.62 6.84a 1.01 12.84 HOAD 1.29 15.90b 0.55 8.50a 1.43 17.98b 0.68 17.71* LDH 5.05 72.19ab 6.82 91.51bc 10.62 105.51c 3.87 63.57* PK Tabla V.3.7. Evolución temporal de la actividad específica (mU/mg proteína) de algunas enzimas clave del el metabolismo intermediario en el hígado de corvinas durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día 60: inicio de la realimentación). Los valores son media ± EEM (N=6) * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. F11-60 S/RF11-60 Grupo Tabla V.3.6. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad específica (mU/mg de proteína) de algunas enzimas clave del metabolismo intermediario en el hígado de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11). Sergio García Mesa V.3.4.2. MÚSCULO El metabolismo del músculo también se vio afectado por el ayuno de 60 días y la posterior realimentación, sin embargo, los cambios fueron diferentes a los observados en hígado (tablas V.3.8. y V.3.9.). Previamente, debemos destacar que con la técnica utilizada no pudimos detectar actividad alguna de G6PDH en este tejido. La actividad HK muscular no mostró efecto del ayuno, con la realimentación se detectó un aumento de la misma, aunque los valores volvieron a disminuir al final del periodo controlado. Tampoco se observó un efecto del ayuno sobre la actividad de la FBPasa, la realimentación conllevó un aumento de la misma, pero tal efecto desapareció al final del periodo experimental. Este mismo efecto se observó sobre las actividades GPT y EM. La actividad ACoAT muscular, a diferencia de la hepática, mostró un aumento significativo al final del ayuno. Durante las primeras etapas de la realimentación siguieron aumentando los valores para disminuir de forma significativa en las últimas. También la actividad de la HOAD muscular aumentó con el ayuno; durante la realimentación, esta actividad fue cayendo paulatinamente hasta el final del experimento, llegando a ser menor a la de los controles. Un efecto similar del ayuno y realimentación se observó para las actividades CS, GyK y GOT. El ayuno tuvo un efecto inhibidor sobre la actividad, tanto de PK como de GDH, mientras que la realimentación supuso la total y completa recuperación de la misma desde los primeros 20 días. De la misma forma, hubo un descenso significativo en la actividad de la LDH con el ayuno mientras que la realimentación produjo un aumento gradual de dicha actividad hasta valores superiores a los controles. 170 171 2.56 21.01 1.77 0.14 1.52 0.13 0.16 1.05 0.06 0.68 EM 0.20 2.16 0.17 1.94 FBPasa n.d n.d G6PDH 1.97 22.11 1.32 15.37* GDH 11.57 119.45 11.47 144.96* GOT 0.97 10.17 4.08 48.97 0.09 0.87 69.32* 3.89 GyK GPT 0.13 1.13 0.55 7.62* HK 0.23 2.33 1.01 12.84 HOAD 158.84 1441.73 044.55 554.84* LDH PK CS 31.02* 2.56 36.06b 2.92 19.87a 1.71 20.23a 1.52 ACoAT 2.20* 0.14 2.82c 0.29 2.14ab 0.09 1.54a 0.11 0.05 0.79a 0.08 1.29b 0.15 1.08b 0.06 0.68 EM 0.06 1.18a 0.29 2.99c 0.30 3.45c 0.17 1.94 FBPasa n.d n.d n.d n.d G6PDH 2.19 24.75b 1.67 23.02b 2.38 25.40b 1.32 15.37* GDH 10.63 119.14b 8.29 87.87a 9.93 133.86b 11.47 144.96* GOT 0.91 12.04b 1.02 15.82c 1.50 15.17bc 3.79 47.39a 5.94 67.06b 3.81 66.85b 0.09 0.87 69.32* 3.89 GyK GPT 0.09 1.05a 0.17 1.95b 0.08 0.79a 0.55 7.62* HK 0.11 1.58a 0.24 2.26a 0.49 6.53b 1.01 12.84 HOAD Los valores son media ± EEM (N=6) Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo (P<0.05). n.d. no detectada 120 100 80 60 Día 199.22 2232.70c 77.45 1762.87ab 71.97 1007.72b 044.55 554.84* LDH 54.71 637.48b 76.41 769.11bc 71.72 875.09c 11.55 191.57* PK Tabla V.3.7. Evolución temporal de la actividad específica (mU/mg proteína) de algunas enzimas clave del el metabolismo intermediario en el hígado de corvinas durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día 60: inicio de la realimentación). 71.45 736.10 11.55 191.57* Los valores son media ± EEM (N=6) * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). n.d. no detectada. ACoAT: Acetoacetil CoA Tiolasa; CS: Citrato Sintasa; EM: Enzima Málico; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; GOT: Glutamato Oxalacetato Transaminasa; GPT Glutamato Piruvato Transaminasa; GyK: Glicerol Kinasa; HK: Hexokinasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. F11-60 31.02* 2.20* S/RF1160 CS ACoAT Grupo Tabla V.3.8. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad de algunos enzimas clave del metabolismo intermediario en el músculo de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11). Sergio García Mesa V.3.5. Estrés oxidativo Los efectos del ayuno sobre las defensas enzimáticas antioxidantes y el posible daño oxidativo de los lípidos en el hígado en las corvinas sometidas a ayuno (S/RF11) se presentan en la tabla V.3.10. donde se contrastan con el grupo control alimentado (F11). En la tabla V.3.11 se exponen los resultados de la evolución de estos parámetros durante la realimentación en los lotes S/RF11. Idéntica disposición, pero con los datos del músculo, se presenta en las tablas V.3.12. y V.3.13. respectivamente. V.3.5.1. HÍGADO Tabla V.3.10. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad de algunas enzimas indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el hígado de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11). CAT1 DTD2 GPX2 GR2 GST2 SOD1 TBARs3 S/RF11-60 35.29* 2.13* 64.15* 5.55 13.93* 49.52 302.80* 1.62 0.19 3.17 0.42 1.07 1.08 29.06 F11-60 53.71 3.07 81.59 4.43 36.71 57.62 50.00 4.03 0.30 6.27 0.35 2.88 5.03 2.60 Grupo Los valores son media ± EEM (N=6). * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). 1 2 3 Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido. CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico Tabla V.3.11. Evolución temporal de la actividad de algunas enzimas indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el hígado de la corvina durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día 60: inicio de la realimentación). Día 60 80 100 120 CAT1 35.29 a DTD2 2.13 a GPX2 64.15 b GR2 5.55 c GST2 13.93 a SOD1 TBARs3 b 302,80b 49.52 1.62 0.19 3.17 0.42 1.07 1.08 29,06 33.03a 3.86b 51.09a 3.69a 44.55c 35.55a 47,58a 3.11 0.35 1.98 0.27 3.75 2.75 3,22 41.35a 8.59d 110.43c 4.87bc 75.65d 66.71c 40,97a 2.67 0.75 3.79 0.39 5.92 4.53 3,19 55.43b 7.06c 64.20b 3.98ab 31.45b 49.52ab 40,63a 4.90 0.35 4.54 0.12 2.95 1.08 3,61 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo (P<0.05). 1 2 3 Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido. CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico En general se observó un descenso significativo de las actividades antioxidantes determinadas en hígado al final del periodo de ayuno, tal es el caso de las actividades catalasa (CAT), DT-diaforasa (DTD), glutation peroxidasa (GPX) y glutation transferasa (GST). En la primera de ellas se produjo una recuperación al cabo de 60 días de 172 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). realimentación; en las demás esta recuperación llevó a valores más altos el día 100 para después alcanzar valores similares o superiores a las controles. El ayuno afectó a las actividades glutation reductasa (GR) y superóxido dismutasa (SOD), pero mientras que en la primera se observó un descenso con la realimentación, en la segunda produjo un aumento de la actividad el día 100, con un descenso posterior hasta valores similares al control. El ayuno de 60 días provocó un daño oxidativo de lípidos del hígado. La realimentación trajo consigo una disminución significativa del mismo de forma que, en tan sólo 20 días, los valores de TBARs disminuyeron hasta valores similares al control y luego se estabilizó. V.3.5.2. MÚSCULO Tabla V.3.12. Efecto del ayuno de 60 días (lote S/RF11) sobre la actividad de algunos enzimas indicadores del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el músculo de la corvina tomando como referencia el grupo control alimentado (F11). CAT1 DTD2 GPX2 GR2 GST2 SOD1 TBARs3 Grupo S/RF11-60 F11-60 n.d. 1.33* 18.99* 0.48* 7.30* 21.23* 0.09 0.79 0.03 0.37 1.42 22.90* 0.52 n.d. 1.91 14.77 0.33 4.90 15.71 39.72 0.18 1.02 0.03 0.28 0.75 2.52 Los valores son media ± EEM (N=6). * Indica diferencias significativas (P<0.05) entre S/RF11 y su control (F11). 1 2 3 Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido. CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico Tabla V.3.13. Evolución temporal de la actividad de algunas enzimas indicadoras del estrés oxidativo y nivel de peroxidación lipídica en el músculo de la corvina durante un periodo de realimentación de 60 días tras un ayuno de 60 días. (día 60: inicio de la realimentación). Día CAT1 DTD2 GPX2 GR2 GST2 SOD1 TBARs3 60 n.d. 1.33a 18.99b 0.48b 7.30b 21.23b 22.90a 0.09 0.79 0.03 0.37 1.42 0.52 n.d. 2.20b 19.50b 0.53b 7.29b 19.35b 21.31a 0.17 1.94 0.04 0.73 0.57 1.83 n.d. 3.47c 21.47b 0.48b 7.28b 18.83b 35.85b 0.26 1.38 0.04 0.57 1.74 3.71 n.d. 2.28b 11.86a 0.30a 3.68a 11.45a 23.56a 0.16 0.45 0.02 0.12 0.98 2.15 80 100 120 Los valores son media ± EEM (N=6). Diferentes letras indican diferencias significativas a lo largo del tiempo (P<0.05) 1 2 3 Expresado como U/mg proteína. Expresado como mU/mg proteína. Expresado como nmol MDA/g tejido. CAT: catalasa; DTD: DT-diaforasa; GPX: glutation peroxidasa; GR: glutation reductasa; GST: glutation transferasa; SOD: superóxido dismutasa; TBARs: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico 173 Sergio García Mesa En la tabla V.3.12. se comparan los datos referentes al estatus oxidativo en músculo de los animales que han soportado un ayuno de 60 días (S/RF11) frente al grupo control (F11). Los valores de las actividades específicas de enzimas relacionadas con el estrés oxidativo y el nivel de peroxidación lipídica en músculo aparecen en la tabla V.3.13. No pudimos determinar actividad CAT en este tejido con la técnica empleada. V.4. DISCUSIÓN V.4.1. Efectos del ayuno SOBRE EL CRECIMIENTO, LA BIOMETRÍA Y LA COMPOSICIÓN. El ayuno de organismos heterótrofos se ha definido como la insuficiencia de una ración determinada para compensar las pérdidas metabólicas (Bayne, 1973), lo que conduce a la pérdida de peso, posiblemente el signo más obvio y con mayor frecuencia documentado como respuesta al ayuno. La pérdida de masa orgánica durante el ayuno es inevitable y, simplemente, una consecuencia de las primera y segunda leyes de la termodinámica (McCue, 2010). Durante el ayuno, los peces parecen usar estrategias para conservar la energía corporal, la cual debe satisfacer sus necesidades calóricas, minimizando la pérdida de la misma (Navarro y Gutiérrez, 1995; Figueroa et al., 2000). Reducir el gasto energético debería lograrse por cambios fisiológicos y/o comportamentales. La tasa a la que los animales pierden peso es muy variable dependiendo de dos factores generales. Primero, los animales difieren en lo que respecta al total de necesidades energéticas, que dependen del peso, la temperatura corporal y la posición filogenética (Garland et al., 2005; Muñoz-García y Williams, 2005). Segundo, los animales también difieren en cómo administran sus reservas energéticas durante el ayuno (Coulson y Hernández, 1968; Bryden y Stokes, 1969; Lindstedt y Boyce, 1985; Navarro y Gutiérrez, 1995; McCue, 2007). En el presente estudio los peces ayunados disminuyeron su peso corporal en un 12% tomando como referencia los animales que se alimentaron con una ración 1.1 % (peso corporal/día). Estas pérdidas de peso (0.21%/día) fueron muy inferiores a las que se encontraron en dorada (0.63%/día) o trucha (0.82%/día) (Power et al., 2000; Pottinger et al., 2003), también sometidas a ayuno. La capacidad de resistir a la pérdida de masa corporal podría ser una adaptación plausible al ayuno (figura V.4.1.). 174 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). % Variación GAP IRP SGR 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 Figura V.4.1. Efecto del ayuno sobre Ganancia Absoluta de Peso (GAP), Incremento Relativo de Peso (IRP) y Tasa de Crecimiento Específico (SGR). Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. Muchos autores han encontrado que durante el ayuno los peces pierden peso según una determinada secuencia temporal, primero la pérdida es más rápida y luego sigue una fase de pérdida lenta volviendo, finalmente, a una nueva aceleración de la misma (Kristoffersson y Broberg, 1971; Moon, 1983; Hervant y Renault, 2002; Comoglio et al., 2004; McCue, 2010). Se podría considerar que el cambio entre las dos primeras fases citadas significa algún tipo de aclimatación, en el que la tasa metabólica se regula hacia abajo (Hepher et al., 1983; Ali et al., 2003). Echevarría et al. (1997) propusieron que la disminución en el peso de lubinas ayunadas se desarrolla en 2 fases, con un punto de inflexión a los 50 días de ayuno. Esto sugiere, en principio, una primera fase en la que predomina la movilización de las reservas energéticas, y una segunda en la que el factor predominante es la movilización de las estructuras (principalmente, músculo). No obstante, en este experimento el punto de inflexión se hallaría a los 40 días de ayuno, siendo la tasa de pérdida de peso mucho más lenta desde ese momento hasta el final del periodo de ayuno (figura V.4.2). 130 gramos 120 110 S/RF11 100 F11 90 80 Figura V.4.2. Evolución del peso de las corvinas ayunadas (S/RF11) frente al grupo control alimentado (F11). 70 60 0 20 Días 40 60 Power et al. (2000) encontraron en lubina que el ayuno de 3 semanas causó un descenso significativo del peso, sin embargo no se produjeron cambios en el índice de condición (K), coincidiendo con Love (1980) en que este índice es una medida fisiológica inadecuada de ayuno. Por el contrario, otros autores lo consideran una herramienta rápida y eficaz para valorar el estado nutricional de los peces (Rueda et al., 1998; Gaylor y Gatlin, 2000; Qian et al., 2000; Xie et al., 2001; Zhu et al., 2001; Cho et al., 2006) ya 175 Sergio García Mesa que su descenso se correlaciona con la privación de alimento, lo que está de acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, en el que K es significativamente menor a los 60 días de ayuno (figura V.4.3.). K IHS IDS IVS RF 20 % variación 0 -20 -40 -60 -80 Figura V.4.3. Efecto del ayuno sobre distintos índices biométricos en corvina. Los datos se representan como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11 Otros índices que se pueden emplear como indicadores del estado fisiológico de los peces, son el hepatosomático (IHS) y el disgestomático (IDS) (figura V.4.3.), pues la disminución de peso de estos compartimentos corporales provoca que los peces se “estilicen” y, consecuente, K se vea afectado también (Creach y Bouche, 1969; Renaud y Moon, 1980; Black y Love, 1986; Foster y Moon, 1991; Farbridge y Leatherland, 1992; Grigorakis y Alexis, 2005). Durante el ayuno, la dinámica de la utilización de la energía endógena puede diferir entre especies (Takahashi et al., 2011), pues algunos peces movilizan en primera instancia las reservas de carbohidratos, mientras que otros hacen lo propio con los lípidos, en cualquier caso la degradación de la proteínas parece ser el último recurso (Black y Love, 1986; Castellini y Rea, 1992; Navarro y Gutiérrez, 1995; Bines, 1999; Hervant et al., 2001; Caloin, 2004). El hígado es uno de los órganos más afectados por el ayuno y normalmente el glucógeno (cuyo almacén principal en peces es esta víscera) es la primera reserva que se usa como fuente de energía (Kamra, 1966; Sakaguchi, 1976; Renaud y Moon, 1980; Morata et al., 1982; Foster y Moon, 1991; Navarro y Gutiérrez, 1995; Echevarría et al., 1997; Metón et al., 2003). Sin embargo se ha registrado en algunas especies, como la carpa (C. carpio), el mantenimiento del contenido de glucógeno hepático tras 67 días de ayuno (Navarro y Gutiérrez, 1995), ya que en estas especies se mantiene para ser capaz de sobrevivir en condiciones de anoxia. El que las corvinas privadas de alimento conserven, tras 60 días, el 28% del glucógeno hepático con respecto a las alimentadas (figura V.4.4.A.), podría indicar, al igual que en otras especies (Navarro y Gutiérrez, 1995; Hung et al., 1997; Shimeno et al., 1997; Power et al., 2000; Figuereido-Garutti et al., 176 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). 2002; Metón et al., 2003; Pérez-Jiménez et al., 2007; Furné et al., 2012), que pueda sobrevivir un periodo más prolongado de 60 días de ayuno, tal como Chrysophrys major, en la que no se agota el glucógeno hepático hasta pasados 92 días de ayuno (Yamauchi et al., 1975). En general, el ayuno ejerce poca influencia en la tasa de síntesis proteica hepática en peces, aunque la de degradación aumenta bajo tales condiciones (Cowey y Walton, 1989; Navarro y Gutiérrez, 1995). En Macquaria ambigua, si la privación de alimento se prolonga 60 días, se produce un descenso en el contenido de las proteínas hepáticas (Collins y Anderson, 1995). En las corvinas las proteínas hepáticas no parecen afectarse por un ayuno de esta duración (figura V.4.4.A.), posiblemente porque estos animales desarrollen estrategias fisiológicas para reciclar las proteínas endógenas, reduciendo los requerimientos gluconeogénicos o minimizando de otra manera la pérdida neta de proteínas durante el ayuno. Este ahorro proteico podría servir al mantenimiento de las funciones vitales (Nelson, 1987; Hoffer y Forse, 1990; Cherel et al. 1991; Battley et al., 2001; Holecek et al., 2001). A B %Glucógeno %Proteínas -40 -60 -80 % variación % variación -20 %Minerales %Glucógeno %Proteínas 10 20 0 %Lípidos 0 -10 -20 -30 Figura V.4.4. A, efecto del ayuno sobre la composición del hígado de las corvinas. B, efecto del ayuno sobre la composición del músculo de las corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a los de su grupo control, F11. Al ser el componente más abundante (más de la mitad del peso corporal según Mommsen, 2001), el músculo esquelético sirve de reservorio de proteínas en algunos animales durante el ayuno (Cherel et al., 1991; Houlihan, 1991; Piersma et al., 1999; Bauchinger y Biebach, 2001; McCue, 2010) pero, a menudo, la locomoción obliga a que se diferencien qué grupos musculares se pueden atrofiar (Yacoe, 1983; Nelson, 1987; Parker y Holm, 1990; Cherel et al., 1991; Piersma et al., 1999; Bauchinger y Biebach, 2005). El índice rendimiento del filete (RF) señala la importancia del músculo esquelético en relación al peso del animal. Como indica la figura V.4.3., el ayuno conlleva 177 Sergio García Mesa que este índice disminuya de forma considerable, cosa no se detectó en otras especies (Dubost et al., 1997; Nagai y Ikeda, 1971; Rasmussen et al., 2000). El descenso del RF, debido muy probablemente a la degradación del músculo blanco (Blasco et al., 1992; van Dijik et al., 2005), junto con el descenso del IHS, contribuyó a que el valor de K disminuyera tras el ayuno. En peces, el metabolismo está fundamentalmente basado en los lípidos y las proteínas, en particular en carnívoros (Jobling, 1994), en los que lípidos a menudo constituyen la principal fuente para el mantenimiento en condiciones adversas (Weatherley y Gill, 1987; Bull y Metcalfe, 1997). Si éstas se prolongan, aumenta la proteolisis muscular y la movilización de los aminoácidos derivados de las proteínas musculares para la utilización en otros tejidos más vitales (Navarro y Gutiérrez, 1995). Los datos de composición del músculo (figura V.4.4.B.) muestran importantes cambios en el mismo durante el ayuno. Se observa un aumento del contenido de agua y minerales acompañado de un descenso de los lípidos y proteínas, de forma similar a lo que encontraron Quinton y Blake (1990) en trucha arcoíris ayunada 3 semanas. Love (1970) encontró en el bacalao (G. morhua) en ayunas que el aumento del contenido de agua en músculo, por encima del valor control de 81%, correspondía con la cantidad de proteína utilizada. Las pérdidas de materia orgánicas en los animales sometidos a ayuno pueden confundirse con cambios similares en el contenido de agua en tejidos y órganos. Se sabe que el contenido de agua aumenta en los tejidos y órganos durante el ayuno (Grably y Peiery, 1981; Woo y Murat, 1981; Moon, 1983; Blasco et al., 1992; Yi y Chang, 1994; Hervant et al., 2001; Frick et al., 2008a). Un aumento de la hidratación de los tejidos juega un papel en la limitación de la pérdida o mantenimiento del peso húmedo corporal durante el ayuno (Love, 1970). En la figura V.4.5. se representa una estimación de la pérdida de músculo debida al ayuno (calculada a partir del peso de los animales y de los correspondientes RF), observándose diferencias al expresarlo tanto en % en sustancia fresca como % en sustancia seca. Vemos que la pérdida de masa muscular es menor si se expresa en sustancia seca, o sea, la hidratación del músculo de las corvinas ayunadas podría hacer que la magnitud de la pérdida corporal total fuera menor la pérdida de peso corporal y esto enmascararía parcialmente el verdadero descenso de peso “orgánico” de los animales. Un descenso drástico en el peso de los peces puede suponer un grave riesgo en su supervivencia, más allá de las cuestiones metabólicas, pues un brusco descenso del mismo podría provocar, incluso, problemas de flotabilidad. 178 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). ∆ Peso músculo 0 -10 -20 Figura V.4.5. Variación del peso del músculo de las corvinas tras el ayuno de 60 días, expresado en % sustancia fresca y % sustancia seca -30 -40 % Sust. fresca % Sust. seca La sustitución de la materia orgánica perdida por agua no está completamente entendida (Navarro y Gutiérrez, 1995), pero una posible explicación es la de que el incremento del contenido de agua en los tejidos resulta de una aumento de la presión osmótica de los mismos que deriva, a su vez, del de los niveles de metabolitos. Una segunda posibilidad es la de que las células reemplacen la materia orgánica con agua para mantener el tamaño y, por lo tanto, la funcionalidad durante el ayuno (McCue, 2010). El contenido graso del músculo de las corvinas disminuye tras el ayuno; este descenso, aunque significativo, es menor al que cabría esperar, lo que podría ser debido al bajo contenido en grasa de la corvina. En especies con alto contenido en grasa muscular, la movilización de los lípidos intramusculares se inicia en cuanto cesa la alimentación. Rhamdia hilarii, al igual que la corvina, no presenta un tejido adiposo organizado o visible en la cavidad abdominal y durante el ayuno los lípidos intramusculares (5% del peso fresco) juegan un papel importante en las necesidades energéticas totales (Machado et al., 1988). En esta especie, tras 30 días de ayuno, la grasa muscular se redujo una quinta parte, lo que, considerando que el músculo constituye el 60-70% del peso, representa una importante fuente de energía. Los lípidos se utilizan de diferente forma para proporcionar la energía requerida para el metabolismo fundamental durante el ayuno (Gaylord y Gatlin, 2000; Zhu et al., 2001; Takahashi et al., 2011). Descensos similares en el contenido de lípidos en músculo se han registrado en esturión, dorada, lubina y dentón (Grigorakis y Alexis, 2005; Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al., 2012, respectivamente). Las proteínas musculares se ven notablemente afectadas en una especie magra como la corvina, cuyo músculo, como hemos indicado, presenta unos bajos porcentajes de grasa y glucógeno. Durante periodos de ayuno largos, se inicia el catabolismo de las proteínas musculares y los aminoácidos resultantes pasan a ser las principales fuentes de energía de los peces (Love, 1970; Walton y Cowey, 1982). Según Nagai y Ikeda, (1971) el ayuno de 2 meses en perca produjo un descenso del RF y de las proteínas musculares, de modo que el contenido de las proteínas en el cuerpo entero cayó un 22%, frente a la 179 Sergio García Mesa caída del 30% encontrada en las proteínas del músculo de corvina en el mismo periodo de ayuno. Lowery y Somero (1990) demostraron que el ayuno prolongado en Paralabrax nebulifer resultó en un descenso de la concentración de las proteínas del músculo blanco. Además, estos autores pusieron de manifiesto un control selectivo en la síntesis proteica durante el ayuno, sugiriendo que la regulación podría servir para mantener el equilibrio entre la actividad relativa de las enzimas musculares. Cuando las proteínas musculares se degradan, se eliminan preferentemente algunas de las proteínas contráctiles y solubles (Navarro y Gutiérrez, 1995). Estudios posteriores confirmaron la movilización de proteínas de la fracción miofibrilar a la sarcoplasmática en el músculo del bacalao (Beaulieu y Guderley, 1998). En cualquier caso, la movilización de las proteínas del músculo esquelético a consecuencia del ayuno ha sido descrita en numerosas especies de peces (Stirling, 1976; Alliot et al., 1984; Pastoureaud, 1991; Echevarría et al., 1997; Pérez-Jiménez et al., 2007). El contenido de glucógeno muscular apenas se ve afectado por el ayuno en algunas especies de peces (Dave et al., 1975; Gutiérrez et al., 1991; Blasco et al., 1992; Barcellos et al., 2010; Furné et al., 2012), lo que indica que es un sustrato poco utilizado por el músculo blanco en tales condiciones. Generalmente se asume que el glucógeno muscular de los peces contribuye poco al gasto energético total (Machado et al., 1988) ya que se emplea en los episodios de natación explosiva, relacionados con conductas de escape o captura de alimento, en las que dicho músculo utiliza el glucógeno de forma anaerobia (Wood, 1991; Moon y Foster, 1995). Debe tenerse en cuenta, por su inmediata participación en la actividad muscular, que el glucógeno es aquí un compuesto muy inestable y que su movilización está más relacionada con el aumento de la actividad muscular que con los procesos de ayuno. El aumento relativo de minerales observado en el músculo durante el ayuno (figura V.4.4.B.) podría deberse al mantenimiento de los valores absolutos de éstos añadido a la disminución del contenido lipídico y proteico. Un beneficio potencial de mantener los micronutrientes esenciales en el músculo sería la posibilidad de un crecimiento más rápido ante la reversión de la situación de ayuno (Prunescu et al., 2003; McCue, 2010). El almacenamiento alternativo de algunas sustancias como lípidos y glucógeno presenta inconvenientes en el medio acuoso. Aunque los lípidos proporcionan el mayor contenido energético por unidad de peso entre los compuestos de almacenamiento, sus 180 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). ventajas energéticas deben valorarse conjuntamente con sus contribuciones positivas a la flotabilidad y su relativamente lenta tasa de movilización comparada con la de glucógeno o proteínas. En los respiradores acuáticos que tienen que trabajar dentro de las limitaciones impuestas por la relativamente baja solubilidad del oxígeno en el agua, el uso energético de los lípidos podrían interpretarse como un inconveniente, dado su menor coeficiente respiratorio (< 0.7 J/unidad de O2 para lípidos, frente a >0.9 J/ unidad de O2 para proteínas) apuntando de nuevo a las proteínas como sustrato oxidativo primario (Mommsen, 2001). Esto podría explicar, en parte, porque los peces en general sometidos a un periodo de ayuno tan prolongado no agotan sus reservas lipídicas ni glucogénicas antes de comenzar a movilizar sus reservas proteicas. SOBRE EL METABOLISMO INTERMEDIARIO Como se ha comentado anteriormente, el ayuno supone un reajuste que atañe tanto a aspectos fisiológicos como comportamentales. Entre los aspectos fisiológicos, el metabolismo intermediario entrañará el empleo y/o regulación de unas rutas metabólicas frente a otras a partir de las reservas corporales. La disminución de la tasa metabólica general durante la restricción alimentaria de los peces se ha descrito por numerosos autores (Beamish, 1964; Love, 1970, 1980; Blaxter y Ehrlich, 1974; Jobling, 1980; Johnston, 1981; Du Preez et al., 1986 a, b; Wieser et al., 1992; Navarro y Gutiérrez, 1995; Hemre et al., 2002; Furné et al., 2012). Según Moon y Foster, 1995, se han identificado dos etapas durante el ayuno en lo que concierne al metabolismo, una inicial con pocos cambios metabólicos seguido de otra con cambios más intensos, razón por la que se decidió analizar los niveles de las enzimas del metabolismo intermediario en corvina tras un ayuno largo de 60 días. Los cambios en el metabolismo de los carbohidratos durante el ayuno pueden estudiarse a través de la determinación de la actividad de enzimas implicadas en la glucolisis como hexokinasa (HK) y piruvato kinasa (PK) (Moon, 1983; Méndez y Wieser, 1993; Soengas et al., 1996, 1998), en la gluconeogénesis como la fructosa 1,6,bisfosfatasa (F16Pasa), así como varias transaminasas (Klain et al., 1977; Moon, 1983; Foster y Moon, 1991; Soengas et al., 1996; Segner et al., 1997). En diversas especies de peces se ha puesto de manifiesto que tanto la glucogenolisis hepática como el menor uso de la glucosa circulante contribuyen al mantenimiento de la glucemia durante el ayuno (Hung et al., 1997; Shimeno et al., 1997; Power et al., 2000; Figuereido-Garutti et al., 2002; Metón et al., 2003; Pottinger et al., 2003; Polakof et al., 2007; Furné et al., 2012). Nuestros resultados han mostrado una inhibición de las actividades PK y HK hepáticas durante el ayuno de las corvinas (figura 181 Sergio García Mesa V.4.6.), en línea con lo descrito previamente por otros autores (Shimeno et al., 1997; Kirchner et al., 2005; Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al., 2012), que también detectan una disminución de estas actividades. Dado que la PK está situada “más abajo” en la ruta glucolítica, podríamos pensar que la misma se encuentra bastante inhibida en el ayuno. La menor disminución de la actividad HK podría proveer de glucosa fosforilada para otros fines. A su vez, una baja tasa de glucolisis podría influir sobre la tasa de glucogenolisis, que pese a ser importante (figura V.4.4.A.), no llega a agotar estas reservas pese a lo prolongado del ayuno, tal y como se ha comentado antes. ACoAT CS EM FBPasaG6PDH GDH GOT GPT GyK HK HOAD LDH PK 80 60 % variación 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100 Figura V.4.6. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del metabolismo intermediario hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control alimentado, F11 La gluconeogénesis hepática, indicada por la actividad de la FBPasa, aunque algo menor a las corvinas ayunadas, prácticamente se mantiene con respecto al control. Esto ya fue detectado en otras especies por Pérez-Jiménez et al. (2012) y Furné et al. (2012) lo que, unido la inhibición de la HK hepática descrita anteriormente podría indicar un mantenimiento de la glucemia en estos animales, tal como encontraron Moon et al. (1989) en trucha arcoíris o Navarro et al. (1992) en la trucha Salmo trutta. No obstante, algunos autores han observado un incremento de la actividad FBPasa en otras especies de peces (Navarro y Gutiérrez, 1995; Soengas et al., 1996; Segner et al., 1997; Metón et al., 2003; Kirchner et al., 2005) para contribuir al mantenimiento de la glucemia. En nuestro caso, de los posibles sustratos gluconeogénicos, los aminoácidos y derivados de la oxidación de ácidos grasos son los que parecen adquirir más importancia, como lo demuestra el mantenimiento de las actividades de GDH y de GOT y la elevada actividad de GPT por un lado y el mantenimiento de la de HOAD por otro, como más adelante se expondrá; en cambio, podemos descartar el posible uso de otros sustratos 182 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). gluconeogénicos como el lactato o el glicerol, dada la disminución de las actividades LDH y GyK (figura V.4.6.). La actividad de la CS, enzima implicada en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT), es considerada como reflejo de la capacidad aeróbica de un organismo por lo que el análisis de la misma puede arrojar luz sobre si se producen cambios en la citada capacidad de los peces durante condiciones adversas (Frick et al., 2008b). El descenso de la actividad CS hepática detectado en la corvina en ayunas (figura V.4.6.) supone que el metabolismo aerobio se ha reducido, lo que puede ser considerado una medida de ahorro energético para la supervivencia de los animales, de modo que sus necesidades metabólicas estén ahora por debajo de las que imperan en animales alimentados. Esta reducción podría explicar la relativamente leve pérdida de peso y el no agotamiento de las reservas corporales a los que antes nos hemos referido. Durante el ayuno de las corvinas se ha observado una disminución significativa de la actividad de dos de las enzimas implicadas en la síntesis de lípidos, la G6PDH citoplasmática y la EM mitocondrial, lo que también ocurre en trucha arcoíris (Bastrop et al., 1991), dentón (Pérez-Jiménez et al., 2012) y esturión (Furné et al., 2012). Ambas enzimas generan poder reductor en forma de NADPH necesario para la lipogénesis (Arnesen et al., 1993; Bouraoi et al., 2011). Esta disminución coincide con la observada en el contenido en lípidos del músculo de las corvinas ayunadas, debido a que el hígado es el órgano más importante para la síntesis de ácidos grasos (Lin et al., 1977; Likimani y Wilson, 1982). El descenso del contenido lipídico de músculo también está relacionado con el mantenimiento de la actividad HOAD (figura V.4.6.), ya que si se mantiene la lipolisis en niveles parecidos a situaciones control y se inhibe la lipogénesis, el balance del contenido muscular de lípidos será negativo, lo que indicaría la movilización de las reservas lipídicas musculares con fines energéticos. El ayuno genera en mamíferos una situación cetogénica asociada con una utilización acelerada de los ácidos grasos, mejorando la gluconeogénesis (Cahill, 1970). En teleósteos, los datos sobre el metabolismo de los cuerpos cetónicos en ayunas proporciona resultados controvertidos. Zammit y Newsholme (1979) especulaban que el ayuno, a diferencia de lo que ocurre en mamíferos, no genera una dependencia de los cuerpos cetónicos pero sí de los ácidos grasos. Nuestros datos sobre la actividad ACoAT irían en línea con ello y con lo encontrado por Pérez-Jiménez et al. (2012). 183 Sergio García Mesa Numerosos autores han descrito que el aumento de la β-oxidación suministra un exceso de acetil CoA que podría desequilibrar el ciclo de Krebs, pues el acetil CoA se fusiona con el oxalacetato por medio de la CS; este exceso de acetil CoA podría colapsar el ciclo e inhibir el metabolismo oxidativo; para evitarlo, se produce un aumento de la actividad HOAD paralelo al de la actividad CS y alguna enzima que proporcione intermediarios del ciclo de Krebs, con la finalidad de que ésta cumpla su objetivo (Frick et al., 2008b; Pérez-Jiménez et al., 2009; Furné et al., 2012). En las corvinas ayunadas la actividad CS disminuye a pesar de que la HOAD se mantiene en valores similares a los de los peces alimentados (figura V.4.6.), esto podría indicar que el acetil CoA generado por la β-oxidación se derivaría hacia gluconeogénesis (que también mantiene los valores similares a los de las corvinas alimentadas), ya que como se ha indicado antes la cetogénesis hepática está disminuida (inhibición de la actividad de ACoAT) (figura V.4.6.). Se ha podido observar en las corvinas sometidas a ayuno el mantenimiento de las actividades de GOT y GDH (figura V.4.6.), encargadas de la producción de oxalacetato y α-cetoglutarato, respectivamente, ambos intermediarios del ciclo de Krebs. También se ha producido un aumento significativo de la transaminasa hepática GPT encargada de la producción de piruvato a partir de alanina. Estos resultados indican la utilización de las proteínas musculares para el mantenimiento de la glucemia en los peces en ayunas. Se ha descrito por numerosos autores que el aumento de las actividades de FBPasa, GDH, GPT y GOT favorece la vía gluconeogénica a partir de aminoácidos (Suárez y Mommsen, 1987; Larsson y Lewander, 1973; Cowey et al., 1977; Sakamoto et al., 1978; French et al., 1981; Lupiáñez et al., 1989; Vieira et al., 2005; Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al., 2012). En resumen, los resultados muestran que las corvinas en situación de ayuno prolongado obtienen la energía de las proteínas y lípidos corporales, que se movilizan hasta el hígado para la obtención de energía y producción de la glucosa necesaria para aquellos órganos en los que esta molécula es un sustrato preferente. En el músculo blanco (figura V.4.7.) nos encontramos un ajuste metabólico frente al ayuno diferente al del hígado. La ruta glucolítica (actividades HK y PK) del músculo (figura V.4.7.) está disminuida tras 60 días de ayuno, el descenso del empleo de los carbohidratos con fines energéticos estaría de acuerdo con un menor uso del glucógeno muscular durante el ayuno (Dave et al., 1975; Gutiérrez et al., 1991; Blasco et al., 1992), reservándose con otros fines, como sería la producción de energía en anaerobiosis durante la natación 184 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). explosiva para, por ejemplo, escapar de depredadores. En especies como la trucha arcoíris (Furné et al., 2012) y el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2012), el ayuno provoca un aumento significativo de la actividad de la PK muscular, que se correlaciona con un descenso en el contenido de glucógeno. Pero en corvina en situación de ayuno prolongado, el catabolismo de los carbohidratos no parece tener tanta importancia en la producción de energía metabólica, ya que la actividad LDH de músculo blanco también se encuentra disminuida, con un 50% de inhibición con respecto al control. Por tanto, la contribución del músculo a las necesidades energéticas durante el ayuno prolongado se basará preferentemente en la degradación de proteínas y lípidos. ACoAT CS EM FBPasa GDH GOT GPT GyK HK HOAD LDH PK 220 % variación 170 120 70 20 -30 -80 Figura V.4.7. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del metabolismo intermediario muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11 La actividad gluconeogénica (FBPasa) muscular se mantiene durante el ayuno (figura V.4.7.) al igual que ocurría en el hígado, lo que pone de nuevo de manifiesto la importancia de la glucosa en determinados tejidos. Pero en el caso del músculo, el sustrato gluconeogénico principal podría ser el glicerol, pues de los sustratos posibles, la actividad enzimática relacionada que aumenta es la GyK (figura V.4.7.) tal como ocurre en el dentón (Pérez-Jiménez et al., 2009). La reducida proporción de lípidos en músculo en esta especie se asocia a una menor actividad lipogénica durante el ayuno (deducida a partir de la inhibición de la EM, y de la escasa, si alguna, actividad G6PDH) y a una mayor actividad de las enzimas lipolíticas, HOAD y GyK (figura V.4.7.) dando lugar a que ésta sea la ruta prioritaria para la obtención de energía y movilización de sustratos a otros órganos. Este descenso del contenido de lípidos musculares y el aumento de las actividades de enzimas lipolíticas ha 185 Sergio García Mesa sido descrito en trucha y esturión (Furné et al., 2012), dentón (Pérez-Jiménez et al., 2012) y lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007); en este último caso, las lubinas sometidas a ayuno presentaron una reducción del contenido lipídico muscular y de la actividad HOAD, indicando que los lípidos musculares eran exportados a otros tejidos para ser metabolizados (Moon y Foster, 1995). En corvina en ayunas hemos detectado un aumento superior al 200% de la actividad HOAD con respecto a las controles, esta gran activación podría suplir tanto las necesidades metabólicas del músculo como del hígado, dado que en este órgano los niveles de esta enzima se mantenían en los mismos niveles que los peces controles. El aumento de la actividad de CS proporcionaría una vía de utilización del acetil CoA generado por esta oxidación aumentada de los ácidos grasos. Ahora bien, la reacción de la CS también requiere ácido oxalacético para continuar y que no se colapse el ciclo; el piruvato es el principal precursor del oxalacético, por lo que la actividad de GPT hepática y GOT muscular podría satisfacer esta demanda. No obstante, una parte del acetilCoA proporcionado por la β-oxidación se utilizará para dar cuerpos cetónicos (3-β hidroxibutirato o acetoacetilCoA) como indica el aumento de la actividad ACoAT (figura V.4.7.). El mantenimiento y/o aumento de las actividades transaminasas junto con el descenso de la proporción de las proteínas musculares parecen indicar el uso de este sustrato con fines energéticos (Blasco et al., 1992; Furné, et al. 2012). Cabría esperar que el ayuno prolongado aumentase la proteolisis muscular, además de disminuir la tasa de síntesis proteica. En nuestro estudio el aumento de la proteolisis se pone de manifiesto por la disminución del contenido proteico muscular observado, que da lugar a que el balance final de proteínas musculares sea negativo, sin embargo, no tenemos evidencia metabólica sobre la tasa de síntesis proteica. En definitiva, durante el ayuno se encuentran inhibidas las rutas glucolíticas del músculo, reservándose el glucógeno muscular para otros fines. La vía prioritaria para la obtención de energía en músculo se centra en el metabolismo de ácidos grasos, que se acompaña de un aumento de la capacidad aerobia del músculo, además de la degradación de las proteínas musculares para obtener energía. 186 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). SOBRE EL STATUS OXIDATIVO. Las actividades de las enzimas CAT, DTD, GPX, GR, GST, SOD y el índice de peroxidación lipídica (TBARs) se han descrito como biomarcadores útiles de la situación prooxidante en mamíferos (Robinson et al., 1997; Gomi y Matsuo, 1998; Domenicali et al., 2001) y en peces (Stephensen et al., 2002; Pandey et al., 2003; Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Trenzado et al., 2006; Furné et al., 2009b; Bayir et al., 2011); por otra parte, es sabido que el ayuno puede afectar a las defensas antioxidantes en peces (Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009b). En nuestro estudio, el ayuno prolongado de 60 días conlleva un descenso general de las actividades enzimáticas antioxidantes (figura V.4.8.), debido posiblemente a que el metabolismo oxidativo está muy disminuido y la energía obtenida a partir de las reservas corporales se destina a la supervivencia de los individuos en detrimento del status oxidativo, dándose una situación de conflicto energético en el que prima la subsistencia de los animales (Guderley et al., 2003; Furné et al., 2012). En general se ha constatado una mayor actividad de las enzimas antioxidantes en hígado que en músculo (tablas V.3.11. y V.3.13.), muy posiblemente por ser el órgano de mayor importancia en mantener la homeostasis corporal. La peroxidación lipídica se ha usado comúnmente como indicador del daño oxidativo y así, los niveles de MDA (TBARs), uno de los productos de la rotura de los lipoperóxidos por los radicales libres (Griffiths et al., 2002) nos sirven para evaluar el efecto del ayuno a largo plazo sobre este parámetro. El ayuno aumentó notablemente los niveles de peroxidación lipídica en hígado de corvina, lo que coincide con lo encontrado en trabajos realizados en otras especies (Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009b; Bayir et al., 2011). La privación de alimento debe provocar un aumento de formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y una disminución de la actividad de las defensas antioxidantes que resultarán insuficientes para la eliminación de esos ROS, lo que conduce a la aparición de lipoperóxidos (Bayir et al., 2011). 187 Sergio García Mesa CAT DTD GPX GR GST SOD TBARs 500 % variación 400 300 200 100 0 -100 Figura V.4.8. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. Los datos obtenidos por otros autores en cuanto al efecto del ayuno sobre las actividades de las enzimas antioxidantes son muy dispersos: en bacalao del Atlántico se observó un aumento de dicha actividad en el hígado (Guderley et al., 2003); Pascual et al. (2003) observaron en dorada sometida a un periodo de ayuno, un descenso de la actividad CAT y aumento de las de SOD, GR y GPX; en dentón, Morales et al. (2004) encontraron que cinco semanas de ayuno provocaron un aumento de las actividades de SOD, CAT y GPX hepáticas; en esturión y trucha se observó un descenso de las actividades de SOD, CAT, GR y GPX hepáticas, pero no para la GR que se mantuvo en trucha (Furné et al., 2009b); en Salmo trutta la privación de alimento provocó una mayor actividad de CAT, SOD, GR y CAT y un descenso del 23% de la de GST frente a un grupo control alimentado a saciedad (Bayir et al., 2011). En este estudio, la actividad de SOD hepática no vio afectada por el ayuno, lo que indica un mantenimiento en la producción de radicales superóxido. Como se ha descrito anteriormente (figura V.4.6.), el ayuno provocó un descenso del metabolismo oxidativo, indicado por la menor actividad CS hepática, por lo tanto cabría esperar una menor producción de radicales libres y menor actividad SOD. Sin embargo, algunos investigadores han encontrado que durante el ayuno aumentan la actividad HOAD (situación que se da en las corvinas) y la producción de peróxidos de hidrógeno (Kerckaert et al., 1982; Ishii et al., 1980; van der Branden et al., 1984), por lo que la actividad SOD hepática sería insuficiente para eliminar los radicales libres generados durante el ayuno, produciéndose y acumulándose daño oxidativo en las membranas celulares, según indican los niveles de peroxidación lipídica (figura V.4.8.). 188 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). El daño oxidativo podría haber sido menor en las corvinas ayunadas, pues el H 2O2 producido por la SOD puede catalizarse por otras enzimas, CAT y GPX, sin embargo la disminución de actividad de estas dos enzimas (figura V.4.8.) da lugar a que la cascada de oxidación continúe en las biomoléculas. La menor actividad CAT (34%) implica una menor descomposición del H2O2, éste a su vez, en combinación de radicales superóxido (producidos por el metabolismo oxidativo y la β-oxidación), da lugar a radicales hidroxilo (Brownlee et al., 1977) y oxígeno singlete (1O2) (Misra y Fridovich, 1972). La actividad GPX (21% menor en corvinas ayunadas), además de descomponer el H2O2, parece tener un papel importante en la protección y detoxificación a los lipoperóxidos (Little y O’Brien, 1968; Nakano et al., 1999; Díaz et al., 2010), por lo que la cascada reactiva continúa en los tejidos y además no se detoxifican los lipoperóxidos. De la misma forma en que se ha descrito en estudios previos (Blom et al., 2000; Pascual et al., 2003; Bayir et al., 2011), la actividad GST hepática de las corvina en ayuno fue menor (64%) que en las que habías sido alimentadas. La GST posee un papel crítico frente al daño oxidativo (George, 1994; Elia et al., 2003), pues previene el daño oxidativo en los ácidos nucleicos y lipídicos, reduciendo los hidroperóxidos (Jackson et al., 2002). Se ha propuesto que la vía de las pentosas fosfato es la ruta predominante que genera NADPH, necesario para las defensas antioxidantes (Pandolfi et al., 1995; Gaetani et al., 1994; Tian et al., 1999; Kirkman et al., 1999; Leopold y Loscalzo, 2000; Morales et al., 2004); se podría pensar que la inhibición de la actividad G6PDH y EM observada en el hígado de las corvinas ayunadas sea la causa de la inhibición generalizada observada en las enzimas implicadas en esas defensas en el hígado. Por ejemplo, el posible déficit de NADPH afecta la actividad GR, implicada en la génesis de GSH, necesario, a su vez, para la actividad de GPX, que también se vería disminuida. De hecho se ha detectado en peces en condiciones de ayuno (Benuck et al., 1995; Papadopoulos et al., 1997; Robinson et al., 1997; Vendemiale et al., 2001; Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004) una menor tasa de reciclaje de GSH. La actividad de la DTD hepática (enzima que protege a las membranas de posibles daños por peroxidación lipídica) también se vio afectada negativamente por el ayuno, siendo un 30% menor que en las corvinas usadas como controles. Como la reacción de DTD depende del cofactor reducido NADPH, se podría invocar para este descenso la misma razón que en los casos anteriores. No sólo la mayor producción de radicales superóxido, sino también la de H 2O2 y la menor actividad de las defensas antioxidantes enzimáticas, provocan que la tasa de 189 Sergio García Mesa peroxidación de los lípidos sea un 500% superior en el hígado de las corvinas ayunadas, con el consiguiente daño potencial del sistema de membranas de estas células. Ha sido el hígado la principal diana de los estudios de estrés oxidativo, de ahí que la bibliografía existente acerca de la influencia del ayuno en los indicadores del estrés oxidativo en músculo y otros componentes corporales sea bastante más escasa. Como hemos indicado antes, en nuestro estudio, las actividades de las enzimas antioxidantes de músculo son notablemente inferiores a las encontradas en hígado (figura V.4.9.). Por otra parte, a diferencia de lo que ocurría en aquella víscera, en este caso hay un aumento general de la actividad de las defensas antioxidantes en respuesta al ayuno y, en consecuencia, disminuye el nivel de peroxidación lipídica. DTD GPX GR GST SOD MDA 60 % variación 40 20 0 -20 -40 -60 Figura V.4.9. Efecto del ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. El mantenimiento y/o aumento general de las actividades antioxidantes musculares durante el ayuno se ha descrito con anterioridad en otras especies de peces (Guderley et al., 2003 en bacalao del Atlántico; Furné et al., 2009b, en esturión y trucha), éstos últimos observaron también un descenso de las mismas en el hígado, una situación similar a la descrita para la corvina. En el último caso, esta situación se explica sobre la base de que el músculo puede ser considerado como un tejido de reserva energética que se moviliza en situación de ayuno (Guderley et al., 2003; Furné et al., 2009b) por lo que sería lógico esperar un aumento de la actividad de sus defensas antioxidantes con el fin de neutralizar el efecto prooxidante del ayuno y mantener estas reservas hasta su degradación, lo que lleva a estos autores a considerar al hígado como un mejor indicador ante posibles situaciones de estrés oxidativo. 190 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). La única enzima muscular, que como ocurría en el hígado, se deprime durante el ayuno es la DT-diaforasa muscular, posiblemente por encontrarse en la célula con una menor disponibilidad de NADPH derivada, en este caso, de una menor actividad de EM (figura V.4.8.). Tal vez haya una preferencia por emplear el escaso NADPH celular en la reducción del glutation (GSH), pues la enzima que se encarga de su reducción (GR) no se encuentra inhibida, ni tampoco la que emplea este GSH (la GPX), en detrimento de la actividad DT-diaforasa. En resumen, hemos detectado importantes efectos del ayuno prolongado en las rutas metabólicas del hígado de las corvinas. El metabolismo oxidativo disminuye con la privación prolongada de alimento, lo que se puede interpretar como reflejo de una reducción de las necesidades metabólicas lo que, a su vez, reduce el impacto sobre la pérdida de peso y la magnitud de algunas reservas corporales. Se detectó el empleo de las reservas glucogénicas del hígado aunque no se han agotado totalmente. También hemos podido observar que esta especie obtiene energía durante el ayuno a partir de lípidos y proteínas hepáticas y musculares, que se emplean como sustratos gluconeogénicos en hígado para proporcionar glucosa a aquellos tejidos en los que es un sustrato preferente. Con respecto a las actividades implicadas en la defensa contra el estrés oxidativo, se han detectado tendencias opuestas; así, la mayor parte de las enzimas se han inhibido en hígado mientras que se han activado en el músculo; esto ha supuesto un aumento en el daño oxidativo de los lípidos hepáticos y no en los musculares. V.4.2. Efectos de la realimentación SOBRE EL CRECIMIENTO, LA BIOMETRÍA Y LA COMPOSICIÓN. Muchos animales muestran, durante la realimentación que sigue a un periodo de ayuno, una mayor tasa de crecimiento que sus coespecíficos alimentados de forma continuada (Wilson y Osbourn, 1960; Dobson y Holmes, 1984; Jobling, 1994; Ali et al., 2003; Ferrando et al., 2009). Se piensa que esta tendencia pretende restaurar el tamaño original y, por eso, se le llama crecimiento compensatorio (Ali et al., 2003). En el caso de las corvinas, la realimentación supuso, desde el principio, una mejora en los índices de crecimiento, GAP, IRP y SGR, (figura V.4.10.) teniendo más importancia este crecimiento compensatorio los primeros 40 días de realimentación, pues es cuando se obtienen los mejores valores de crecimiento, mientras que los siguientes 20 días de realimentación la tasa de crecimiento cae hasta aproximarse al de las corvinas control. 191 Sergio García Mesa GAP IRP SGR 200 150 100 50 0 -50 -100 -150 -200 % variación Figura V.4.10. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre Ganancia Absoluta de Peso (GAP), Incremento Relativo de Peso (IRP) y Tasa de Crecimiento Específico (SGR). Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. 60 80 100 120 Días experimento El crecimiento compensatorio adquiere mucha importancia en los peces incluidos como especies de interés económico por su explotación comercial. Una consecuencia importante del crecimiento compensatorio es la convergencia de las trayectorias de crecimiento de los individuos, lo que refleja la búsqueda del consecuente “sobrecrecimiento” (Ali et al., 2003). En función del grado de crecimiento compensatorio, éste se puede clasificar en: i) completo cuando los animales alcanzan finalmente el mismo tamaño que los que han sido alimentados continuamente; ii) parcial si los animales privados de alimento no logran igualar el tamaño de los que se han alimentado normalmente, pero muestran tasas de crecimiento relativamente rápidas y pueden tener mejores tasas de conversión de alimento durante el periodo de realimentación y iii) sobrecompensación cuando los animales que han experimentado una restricción de alimento alcanzan, durante la realimentación, un tamaño que supera al de los animales que no han sufrido tal restricción. La posibilidad del crecimiento compensatorio completo de los peces varía dependiendo de la especie, el tamaño, el protocolo alimentario, la temperatura del agua, la ingesta de nutrientes, la duración del experimento, etc. (Bilton y Robins, 1973; Jobling y Koskela, 1996; Rueda et al., 1998; Saether y Jobling, 1999; Gaylord y Gatlin, 2000, 2001; Tian y Qin, 2004; Zhu et al., 2004; Cho 2005; Cho y Jo, 2005). Las corvinas, tras la realimentación de 60 días, presentaron un crecimiento compensatorio sólo parcial (figura V.4.11.); normalmente los ciclos simétricos de ayuno/realimentación producen una compensación parcial (Aranyakananda et al., 1996; Christensen y McLean, 1998), tal como se observó en bacalao (G. morhua) (Jobling, 1994) o trucha alpina (Salvelinus alpinus) (Jobling, 1993). 192 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). 160 140 gramos 120 S/RF11 100 F11 80 Figura V.4.11. Evolución del peso de las corvinas ayunadas (línea continua) / realimentadas (línea discontinua) (S/RF11) frente al grupo control (F11)). 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Días experimento 100 120 El crecimiento compensatorio se ha descrito también en otros salmónidos (Bilton y Robins, 1973; Miglavs y Jobling, 1989a, b; Quinton y Blake, 1990; Jobling y Koskela, 1996; Damsgaard y Dill, 1998), Ictalurus punctatus (Gaylord y Gatlin, 2000; 2001), carpín dorado (Xie et al., 2001; Zhu et al., 2004), pargo (Rueda et al., 1998), el pez plano Paralichthys olivaceus L. (Cho 2005) y lubina (Ferrando et al., 2009). Las bases fisiológicas del crecimiento compensatorio no están completamente esclarecidas; normalmente, en paralelo con el mismo se observa un aumento de la ingesta, que puede cursar, además, con una mejora en la conversión y eficiencia del alimento (Dobson y Holmes, 1984; Quinton y Blake, 1990; Russell y Wootton, 1992; Hayward et al., 1997; Gaylord y Gatlin, 2001; Ali et al., 2003); aunque en algunos estudios se ha encontrado que esto no es así y que el crecimiento compensatorio se debe únicamente a la hiperfagia (Miglavs y Jobling, 1989a; Hayward et al., 1997; Nikki et al., 2004) pero Boujard et al. (2000) sugieren en trucha arcoíris que la hiperfagia era una respuesta a la restricción de alimento mientras que la privación total del mismo genera, además, una mejora en la utilización del alimento durante la realimentación. Con el fin de demostrar esta segunda posibilidad en el caso de las corvinas realimentadas tras un ayuno con respecto a las alimentadas de forma continua, ambos grupos recibieron la misma ración, evaluándose los cambios en la tasa de conversión del alimento y eficiencia alimentaria y de uso de la proteína (figura V.4.12.) 3.5 3.0 F11 (0-60) F11 (60-120) S/RF11 (60-120) Figura V.4.12. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre índices de crecimiento y aprovechamiento de la dieta Tasa de conversión de alimento (FCR), Tasa de eficiencia alimentaria (FER) y Tasa de eficiencia proteica (PER). Para F11 el periodo 0-60 días y 60-120 días y S/RF11 el periodo 60-120. 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 FCR FER PER 193 Sergio García Mesa Las eficiencias alimentarias mejoraron con la realimentación, FCR y FER presentaron valores próximos a 1, indicando un muy buen aprovechamiento. El PER también fue muy superior durante esta fase, lo que significa un mayor incremento de biomasa por unidad de proteína ingerida, tal y como han demostrado varios autores (Bilton y Robins, 1973; Dobson y Holmes, 1984 Miglavs y Jobling, 1989a, b; Jobling et al., 1994; Qian et al., 2000; Gaylord y Gatlin, 2001) en distintas especies. La mejora del PER y el FER podría ser indicativa de una mejora metabólica durante la realimentación, como se discutirá más adelante. En cualquier caso, periodos de privación de alimento se podrían emplear exitosamente en corvina para aprovechar el beneficio que supone el crecimiento compensatorio y optimizar la producción en una explotación comercial, gracias al ahorro en pienso que supone el periodo de ayuno pero, también, a la reducción de los costes en mano de obra y la mejora de la calidad del agua (Hayward et al., 1997; Cho, 2005; Reigh et al., 2006). El término “crecimiento compensatorio” se ha empleado normalmente para describir incrementos en las tasas de crecimiento en longitud o peso corporal. Sin embargo, el crecimiento relativo de los distintos componentes corporales pueden ser diferente durante el mismo, produciendo modificación en la forma del pez (deducido por el índice K) (Emerson, 1986). Por otra parte, la magnitud y la dinámica del crecimiento compensatorio también pueden variar en función de la duración del ayuno y el tiempo de realimentación (Nicieza y Metcalfe, 1997). K IHS IDS IVS RF 60 % variación 40 20 Figura V.4.13. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre distintos índices biométricos en corvina. Los datos se representan como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. 0 -20 -40 -60 -80 60 80 100 120 Días experimento El índice K se afectó negativamente por el ayuno pero aumentó con la realimentación, recuperándose completamente a los 40 días de la misma (figura V.4.13.), sin producirse una distorsión de la forma por el posible crecimiento compensatorio de otros órganos. 194 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). El patrón de crecimiento compensatorio varía entre compartimentos corporales (Weatherley y Gill, 1981, 1987). El indice hepatosomático (IHS) es un buen indicador del crecimiento compensatorio de Paralichthys olivaceus L. según Cho, (2005); en el caso de las corvinas realimentadas hemos detectado un sobrecrecimiento del hígado, debido en gran parte al acopio de sustancias de reserva como es el glucógeno hepático (figura V.4.14.A.); sin descartar la posible contribución de los lípidos, aunque no disponemos de esos datos. En Salvelinus alpinus, Miglavs y Jobling (1989a) encontraron un aumento relativo del tamaño del hígado y un mayor contenido de glucógeno con la realimentación. El índice de rendimiento del filete (RF) se recuperó progresivamente durante la realimentación para presentar valores similares al control a los dos meses; Nagai y Ikeda, (1971) detectaron la misma recuperación, también en 60 días, en perca. Durante el ayuno, el descenso del IHS y del RF podrían ser los principales responsables de la disminución del K; parece que la recuperación de estos dos índices por lo que, durante la realimentación deberían implicar en mayor medida la recuperación del K. En trucha arcoíris, la realimentación tras un periodo de ayuno se asocia con un rápido restablecimiento del tamaño relativo de los órganos (Weatherley y Gill, 1981, 1987). La realimentación supuso un cambio muy notable en el Índice Digestosomático (IDS); debido a que, tanto las estructuras digestivas como su equipamiento enzimático, deben aumentar con la nueva situación para intentar conseguir el máximo aprovechamiento de los nutrientes. A continuación, nos planteamos valorar si los parámetros de composición de hígado y músculo a que se vieron afectados por el ayuno, se recuperan con la realimentación (figura V.4.14.A y B). B %Glucógeno %Proteínas % variación %Lípidos %Minerales %Glucógeno %Proteínas 20 20 60 0 80 -20 100 -40 120 10 % variación A 40 0 60 -10 80 -20 100 -30 120 -60 -40 -80 -50 Figura V.4.14. A, efecto de la realimentación tras el ayuno sobre la composición del hígado de las corvinas (S/RF11). B, efecto de la realimentación tras el ayuno sobre la composición del músculo de las corvinas (S/RF11). Los datos se representan como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control, F11. 195 Sergio García Mesa El contenido de glucógeno hepático aumentó notablemente con la realimentación (figura V.4.14.A.), sobrepasando los valores del control el día 40 de realimentación, al igual que observaron Méndez y Weiser (1993) en Rutilus rutilus, para posteriormente decrecer hasta valores similares al control. Como se ha comentado anteriormente, el incremento del IHS de la corvinas realimentadas se debe en gran parte a la mayor acumulación de glucógeno en el hígado, coincidiendo la mayor proporción hígado/cuerpo con el mayor contenido de glucógeno. Este hecho está bien documentado en otras especies como la perca (Nagai e Ikeda, 1971), Macquria ambigua (Collins y Anderson, 1995), el salmón atlántico (Soengas et al., 1996), la dorada (Power et al., 2000; Metón et al., 2003), la trucha arcoíris (Pottinguer et al., 2003) y la lubina (Pérez-Jiménez et al., 2007). Al igual que durante el ayuno, tampoco la realimentación modificó el contenido de proteínas en el hígado (figura V.4.14.A.); esto estaría de acuerdo con lo comentado anteriormente: las proteínas hepáticas son imprescindibles para desarrollar las funciones vitales (Cherel et al. 1991; Battley et al., 2001; Holecek et al., 2001). Sin embargo, durante la realimentación se recuperaron los niveles de proteínas y lípidos musculares que cayeron durante el ayuno (figura V.4.14.B.), de acuerdo con lo descrito en otras especies como salmón atlántico (Metcalfe y Thorpe, 1992; Bull et al., 1996; Bull y Metcalfe, 1997) o perca (Blasco et al., 1992); esta recuperación se puede asociar con el aumento de la tasa de lipogénesis y el descenso de la de lipolisis observados tanto en músculo como en hígado, como se comentará más adelante. La recuperación ha sido más lenta para las proteínas que para los lípidos, al igual que se encontró en la perca (Blasco et al., 1992). Como hemos indicado antes, el aumento del contenido relativo de minerales en músculo (figura V. 4.14.B.) encontrado durante el ayuno podría tener un efecto beneficioso durante la realimentación y contribuir al crecimiento compensatorio del músculo, pues se podrían requerir en estos animales para un mayor crecimiento (Prunescu et al., 2003). En general se ha observado que el crecimiento compensatorio cesa a los 40 días de realimentación, puesto que, a partir de ese momento, los índices de crecimiento, se asemejan a los de los controles; recordamos que también para ese día la composición del músculo e hígado se igualaban con ellos. Según van Dijik et al. (2005) el crecimiento compensatorio cesa tan pronto como las reservas se restauran y el pez está preparado para hacer frente a otro, potencial, periodo de privación de alimento. 196 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). SOBRE EL METABOLISMO INTERMEDIARIO La mayor parte de las actividades enzimáticas hepáticas estudiadas han vuelto a los valores controles durante el periodo de realimentación, como se ha descrito en la mayoría de estudios realizados en peces (Méndez y Weiser, 1993; Soengas et al., 1996; Collins y Anderson, 1997; Metón et al., 2003; Polakof et al., 2007; Pérez-Jiménez et al., 2012; Furné et al., 2012). Los valores de HK y PK hepáticas fueron superiores tras 20 días de realimentación, probablemente por la necesidad de mejorar el procesamiento del componente hidrocarbonado del alimento, tal como han descrito Soengas et al. (2006), Polakof et al. (2007) o Pérez-Jiménez et al. (2012); sin embargo, se ha observado un retraso en el aumento de la utilización de los aminoácidos dietarios para uso energético, deducible a partir del retardo (segundo periodo de realimentación) que se ha producido la recuperación de las actividades implicadas en los procesos gluconeogénicos (FBPasa, GOT y GPT). De cualquier forma, el exceso de producción de glucosa por estas vías se ha acumulado en forma de glucógeno hepático (figura V.4.14.A.), que ha aumentado su contenido en este periodo de forma significativa. ACoAT CS EM FBPasa G6PDH GDH GOT GPT GyK HK HOAD LDH PK 110 85 60 % variación 60 35 10 80 100 120 -15 -40 -65 -90 Figura V.4.15. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del metabolismo intermediario hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno - realimentación respecto a su grupo control F11 Las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de lípidos también se recuperan con la realimentación (figura V.4.15.). La enzima HOAD disminuye su actividad una vez que se restablece la alimentación, lo que entraña una menor degradación de los lípidos corporales con el fin de restablecer las reservas energéticas. 197 Sergio García Mesa Las enzimas lipogénicas, EM y G6PDH, que se habían inhibido durante el ayuno, se recuperan progresivamente, hasta valores iguales (G6PDH) o superiores (EM) a los controles al final del periodo de realimentación; esto supone un aumento en la producción de NADPH que, junto con la mayor actividad de las transaminasas hepáticas, favorecen los procesos lipogénicos a partir de sustratos proteicos ingeridos con el alimento. En doradas sometidas a ayuno/realimentación (Metón et al., 2003) se observó durante la realimentación una mejora de la glucolisis y de la vía de las pentosas fosfato, en línea con lo expuesto. No obstante, algunas actividades enzimáticas no se recuperaron durante la realimentación (CS, LDH, figura V.4.15.). El mantenimiento de la reducida actividad CS, podría indicar el de una reducida tasa metabólica oxidativa, al menos durante un tiempo, lo que permitiría una máxima utilización de los nutrientes de la dieta para el crecimiento compensatorio. También la obtención anaerobia de energía (LDH) se mantendría con el mismo fin. Así pues, en la corvina, tal como se ha descrito en otras especies (Beamish 1964; Love, 1970; Blaxter y Ehrlich, 1974; Jobling, 1980; Wieser et al., 1992; Ali et al., 2003), podría existir un mecanismo de supervivencia, en el que los animales mejoran el perfil metabólico para obtener un máximo crecimiento tras un periodo de deficiencia alimentaria. La recuperación de las actividades enzimáticas específicas parece ser más lenta en el músculo que en el hígado (figura V.4.16.); de hecho, en la mayor parte de ellas no se han observado valores similares a los controles hasta los 60 días de realimentación. ACoAT CS EM FBPasa GDH GOT GPT GyK HK HOAD LDH PK 220 170 %variación 120 70 60 80 100 120 20 -30 -80 Figura V.4.16. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del metabolismo intermediario muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno - realimentación respecto a su grupo control F11 198 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). De forma excepcional, las actividades PK, FBPasa, GDH y GPT sí se recuperan en los primeros 20 días de realimentación, contribuyendo, posiblemente, al proceso de aprovechamiento del alimento comentado anteriormente en el caso de las enzimas hepáticas; en este caso, la energía obtenida no se ha utilizado para síntesis de glucógeno, cuyos valores no se han visto afectados por la realimentación al igual que tampoco se vieron afectados por el ayuno. Los procesos lipolíticos (actividades GyK y HOAD) permanecieron activados durante las primeras etapas de la realimentación, mostrando valores similares a los del ayuno durante los primeros 80 (HOAD) o 100 días (GyK), a partir de entonces disminuyen hasta valores similares o inferiores a los controles. Este retraso se ha observado también en otras especies de peces (Furné et al., 2012; Pérez-Jiménez et al., 2012). También se ha detectado un retraso en la restauración de los valores de ACoAT, lo que podría deberse a la degradación de los cuerpos cetónicos que se han acumulado en este tejido a lo lardo de todo el periodo de ayuno (Zammit y Newshome, 1979). La actividad LDH, que se había inhibido por el ayuno, también recupera los valores de los controles, incluso aumenta de forma significativa al final del periodo de realimentación. Este aumento puede ser reflejo de una mayor actividad natatoria, pues disminuir la misma no dejaba de ser una adaptación comportamental para disminuir el gasto energético durante el ayuno previo. SOBRE EL STATUS OXIDATIVO. Los indicadores del estrés oxidativo medidos durante el ayuno tienden a recuperar sus valores con la realimentación (figura V.4.17.). CAT DTD GPX GR GST SOD TBARs % variación 500 400 60 300 80 200 100 120 100 0 -100 Figura V.4.17. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico hepático en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. 199 Sergio García Mesa Los valores de peroxidación lipídica, que habían aumentado de forma significativa con el ayuno, disminuyen hasta hacerse similares a los controles durante los primeros 20 días de realimentación, al igual a lo que se ha descrito en otras especies (Pascual et al., 2003; Morales et al., 2004; Furné et al., 2009; Bayir et al., 2011). De nuevo la literatura recoge un comportamiento menos uniforme de las defensas antioxidantes enzimáticas durante la realimentación: en dorada se observó una recuperación de las actividades SOD y CAT, un descenso de GPX y GST y aumento de GR (Pascual et al., 2003) tras 21 días de realimentación; en dentón, tres semanas de realimentación fueron suficientes para la completa recuperación de las actividades antioxidantes CAT, SOD, GPX y GR (Morales et al., 2004); tras 60 días de realimentación se detectó la recuperación de la actividad de CAT en trucha, además de la recuperación de la de SOD en esturión (Furné et al., 2009b); en Salmo trutta se observó que 21 días de realimentación provocaban un aumento de la actividad SOD, GPX, CAT y GR y una recuperación de la GST (Bayir et al., 2011). La variabilidad en los resultados de la actividad de las enzimas antioxidantes puede ser debida a un insuficiente periodo de realimentación; en las corvinas realimentadas 20 días, la actividad de las enzimas CAT, GPX, SOD y GR no se recuperó, tan sólo lo hace DTD y GST, de ahí la importancia de prolongar el periodo de realimentación. La desaparición del daño oxidativo, determinado por la tasa de peroxidación lipídica, tras 20 días de realimentación puede deberse a una menor producción de radicales libres, pues se observa que ese mismo día, las enzimas metabólicas anteriormente señaladas como generadoras de radicales superóxido (CS) y peróxidos de hidrógeno (HOAD) presentan una actividad mucho menor al control (figura V.4.15.), situación que junto con el aporte de energía de los nutrientes metabolizados conduciría a que el daño oxidativo desapareciera. Si los estudios del efecto del ayuno sobre el estrés oxidativo en músculo son escasos, el efecto de la realimentación también ha sido poco estudiada (Pérez-Jiménez, 2008; Furné et al., 2009). En la figura V.4.18. se expone la evolución de los indicadores del estrés oxidativo en este compartimento durante la realimentación. Los reducidos niveles de peroxidación en músculo se mantienen a lo largo de todo el período de realimentación, lo que indica que los lípidos musculares son una reserva energética apreciada que debe salvaguardarse de los agentes prooxidantes. 200 Efecto del ayuno y posterior realimentación sobre el crecimiento y estrés oxidativo en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). DTD GPX GR GST SOD TBARs 100 % variación 80 60 60 40 80 20 100 0 120 -20 -40 -60 Figura V.4.18. Efecto de la realimentación tras el ayuno sobre los niveles de actividad de las enzimas del estrés oxidativo y daño lipídico muscular en corvinas. Los datos son representados como % de variación de los distintos parámetros en los animales sometidos a ayuno respecto a su grupo control F11. La actividad de todas las enzimas antioxidantes musculares se mantienen elevadas hasta el día 40 de realimentación, día que se ha indicado anteriormente como de cese del crecimiento compensatorio. Pudiera ser que durante el crecimiento compensatorio se dé una situación de protección oxidativa de los sustratos susceptibles del ataque de los radicales libres, estos sustratos como se ha indicado incluyen a los ácidos grasos altamente insaturados (PUFA). Durante este crecimiento compensatorio la proporción de lípidos en músculo aumenta, por lo que la protección de éstos también debe hacerlo. A diferencia de lo descrito en esturión y trucha (Furné et al., 2009b), el aumento de los lípidos musculares con la realimentación no se acompañó de un aumento de las defensas antioxidantes, por lo que finalmente encontraron daño oxidativo durante la realimentación. A modo de resumen, la realimentación supuso la completa recuperación de las reservas corporales y actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo. En hígado y músculo, de forma general se produce inicialmente un descenso de las rutas catabólicas y aumento de las anabólicas, con la finalidad de la rápida recuperación de las reservas energéticas, una vez alcanzadas, las actividades enzimáticas presentan valores similares al control. Del mismo modo, mejora el status oxidativo, eliminándose el daño producido en las membranas celulares hepáticas durante el periodo de ayuno y manteniendo bajo el daño oxidativo en músculo. 201 Sergio García Mesa V.5. RESUMEN Se ha descrito una relativamente buena adaptación de las corvinas al ayuno, pues tras un periodo de 60 días sorprende la poca pérdida de peso corporal, que se vio acompañada de una paralela de algunos compartimentos corporales, sobre todo del hígado y de la fracción muscular, debidas, muy probablemente a movilización de glucógeno hepático, así como los lípidos y proteínas musculares que se emplean con fines energéticos. Durante el ayuno se produjo un reajuste fisiológico que afecta a prácticamente todas la rutas metabólicas. En hígado y músculo se detectó una inhibición general de la glucolisis y el mantenimiento de la gluconeogénesis a partir de aminoácidos y ácidos grasos, por lo que es predecible que se mantenga la glucemia. Otra adaptación al ayuno fue la reducción del metabolismo oxidativo observada en el hígado. En músculo aumentó notablemente la actividad lipolítica, destacando como ruta prioritaria para la obtención de energía, lo que se acompañó de un aumento del metabolismo oxidativo muscular, con el fin de utilizar los productos finales de la β-oxidación en el ciclo de Krebs; en relación con ello, también se detectó un aumento del metabolismo proteico quizá con el fin de proporcionar intermediarios para que el ciclo continúe. El ayuno se ha descrito como una situación claramente prooxidante que, al ir acompañada en las corvinas por un descenso general de la actividad de las enzimas antioxidantes y de la generación de cofactores reducidos necesarios para su actividad, provocó cierto daño oxidativo. Sin embargo en músculo, quizá debido a su carácter de reserva energética cuantitativamente mayoritaria basada en lípidos que se movilizan en esta situación de ayuno, primó una situación de protección anti-oxidativa encaminada a permitir la integridad de la misma. Con la realimentación se observó un crecimiento compensatorio parcial, debido con seguridad a un mejor uso del alimento recibido. Durante el mismo se restituyeron las reservas energéticas gracias a la modulación en las actividades correspondientes del metabolismo intermediario, observándose una mayor actividad de aquellas enzimas relacionadas con procesos anabólicos. Además, la realimentación supuso la desaparición del daño oxidativo hepático, tanto por una previsible menor producción de radicales libres como por un aumento cierto de las actividades enzimáticas antioxidantes en esa víscera. 202 VI. Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. VI.1. INTRODUCCIÓN / OBJETIVOS. El manejo de la alimentación en términos de la optimización de la tasa y frecuencia de alimentación es muy importante en el cultivo de peces marinos habiéndose convertido en una de las áreas de investigación más importantes en el mundo de la piscicultura. La sobrealimentación y el alimento no consumido alteran la calidad del agua (Ng et al., 2000) mientras que el inadecuado suministro del mismo tienen un impacto directo sobre los costes de producción (Mihelakakis et al., 2002). Una estrategia alimentaria adecuada mejora el crecimiento, supervivencia y utilización del alimento reduciendo su desperdicio y la dispersión de la talla de los peces por lo que aumenta la eficiencia de la producción (Güroy et al., 2006). El efecto de la frecuencia de alimentación sobre el crecimiento y los índices de conversión del alimento por los peces han sido estudiados para distintas especies con resultados similares a pesar de incluir especies que presentaban diferencias en el comportamiento alimentario. Por citar algunos, tilapias (O. niloticus) alimentadas 6 días a la semana crecían de forma similar y mostraron mejores índices de conversión que las alimentadas 7 días a la semana (El Sayed et al., 2005); resultados similares obtuvieron Eroldogan et al., (2006) en dorada, aunque el crecimiento fue menor en los peces alimentados 5 días a la semana comparados con los alimentados los 7 días; por su parte, Wu et al., (2004) mostraron que, cuando se alimentaba a saciedad, el pez gato (I. punctatus) tenía tasas de crecimiento e índices de utilización de la dieta similares independientemente de si se alimentaba 6 o 7 días a la semana, por la mañana o por la tarde; finalmente, Rodríguez et al., (2005) encontraron en el lenguado senegalés ganancias de peso similares cuando los peces se alimentaron durante el día que durante la noche. El protocolo de alimentación puede afectar a la cantidad de alimento consumida por el pez habiéndose mostrado una estrecha relación entre la actividad de 203 Sergio García Mesa algunos enzimas del metabolismo energético y la disponibilidad del alimento (Sullivan y Somero, 1983), debido a que los nutrientes procedentes de la digestión del alimento están disponibles para las rutas metabólicas de producción de energía. De la misma forma, la actividad de esos enzimas está correlacionada con las tasas de crecimiento. Algunos autores han mostrado una fuerte correlación positiva entre la tasa de crecimiento y la actividad de enzimas glucolíticas en el músculo blanco de los peces: Pelletier et al. (1993) en bacalao atlántico o Lamarre et al. (2004) en pez lobo (Anarhichas lupus). Las actividad citrato sintasa (CS) en músculo blanco también refleja las tasas de crecimiento en dos especies de gádidos, bacalao atlántico y carbonero Pollachius virens (Foster et al., 1993; Mathers et al., 1992). La textura es uno de los principales parámetros de calidad considerados en peces cultivados y depende del contenido de grasa muscular y su distribución en el músculo (Regost et al., 2001; Espe et al., 2004; Hagen et al., 2007; Poli et al., 2009; Hardy y Lee, 2010; Sándor et al., 2011). Los lípidos y el colágeno son dos constituyentes del músculo que influyen de forma opuesta sobre la textura de la carne del pescado (Thakur et al. 2002, 2003). El ablandamiento de la carne es uno de los principales síntomas en que se manifiesta la pérdida de frescura y, por tanto, de calidad de los peces cultivados. Se han realizado gran cantidad de estudios que demuestran que los cambios texturales ocurridos en el músculo del pescado durante el almacenamiento post-mortem son resultado de la degradación de los componentes miofibrilares por proteolisis (Delbarre-Ladrat, et al., 2006). Los fragmentos proteicos liberados como consecuencia de ésta pueden ser utilizados como marcadores de la desorganización en el músculo de pescado. El tipo de fragmento proteico liberado es dependiente del tiempo y de la temperatura, pero el índice de liberación es dependiente de la especie (Papa et al., 1996). La utilización de técnicas bioquímicas y electroforéticas (SDS-PAGE) para estudiar los cambios cualitativos y cuantitativos en las proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares del músculo de corvinas con posterioridad a su sacrificio nos daría mucha información sobre las características de calidad del músculo en esta especie. El presente estudio se propone establecer el efecto y la evolución de los cambios producidos por distintas frecuencias de alimentación semanal sobre los parámetros de crecimiento y sus posibles consecuencias metabólicas en tres fracciones corporales de la corvina: sangre, hígado y músculo blanco, estos últimos, principales órganos implicados en el metabolismo intermediario, conversión y distribución de la energía del alimento en el organismo. También se evaluará la influencia de las variaciones en la frecuencia de alimentación sobre los parámetros de 204 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. calidad de su carne y el patrón electroforético de las proteínas musculares como una primera aproximación al tema del efecto del periodo de conservación post-mortem sobre la calidad de este pescado. VI.2. MATERIALES Y MÉTODOS VI.2.1. Animales, condiciones experimentales y muestreos Para la realización de estos ensayos se han utilizado juveniles de corvina de 170 g de peso inicial, criados en las instalaciones del Centro del IFAPA de El Toruño, en el Puerto de Santa María (Cádiz). Los ejemplares se distribuyeron en 8 tanques de 4 m3 (40 peces por tanque) y se mantuvieron durante un periodo experimental de 90 días, tras un periodo de adaptación de 14 días, con un suministro de agua previamente filtrada y aireada a razón de 5-10 L/min con una temperatura de 23.1 ± 0.1 °C. Se ensayaron, por duplicado, cuatro regímenes alimenticios, a saber, 7, 6 y 5 días a la semana por la mañana (el dispensador se activaba a las 9:00; lotes 7M, 6M y 5M, respectivamente) y 5 días a la semana por la tarde (el dispensador se activaba a las 14:00; lotes 5T); los lotes 6M no recibieron alimento los domingos, mientras que los lotes 5M y 5T tampoco se alimentaron los sábados. Todos los lotes recibieron ración semanal total calculada sobre la base de un 0.7% del peso corporal por día para los lotes 7M. Esta ración es algo inferior establecida como óptima para corvinas de este tamaño (Cárdenas, 2010) con el objeto de asegurar, en lo posible, la ingesta de todo el alimento ofrecido. Se utilizó un pienso comercial (SKRETTING, C.V. 6) específico para corvina, cuya composición se muestra en la tabla VI.2.1. El contenido en energía bruta se calculó aplicando los factores de conversión estándar recomendado por Brett y Groves (1979). Se utilizaron dispensadores automáticos de alimento y, cuando fue necesario, el no consumido se recogió mediante un colector, se filtró y una cantidad similar fue añadida al lote correspondiente el día siguiente. 205 Sergio García Mesa Tabla III.2.1. Composición del pienso (g/kg, en sustancia seca). Componente Proteína bruta Grasa bruta (extracto etéreo) Cenizas Material extractivo libre de nitrógeno (MELN)* Energía** (MJ/Kg) Relación Proteína/Energía (g/MJ) 472.0 204.7 77.2 246.1 238.3 198.0 * calculado como 1000 – (proteína bruta + extracto etéreo + cenizas) ** calculado sobre la base de 24.3, 39.7 y 17.2 KJ/g de proteína, lípidos y MELN, respectivamente Al principio del experimento (día 0), se tomaron 12 peces al azar de un tanque reservorio común que se sedaron de acuerdo la normativa para uso de animales (2010/63/EU; 2-fenoxietanol 0.35 mL/L) para definir los parámetros iniciales: seis de ellos fueron utilizados para determinar metabolitos en plasma y actividad enzimática en hígado y músculo blanco, los otros seis fueron destinados al estudio de la composición corporal y biometría (extracción y peso del hígado, músculo y digestivo). A continuación se tomaron del mismo reservorio 40 peces para cada uno de los ocho tanques experimentales. Como parámetro de crecimiento se consideró el peso de todos los peces del lote; para la determinación de los parámetros biométricos se determinaron el peso y la longitud total (parámetros externos) de 20 peces. Los días 45 y 90 del ensayo, se muestrearon veinte peces de cada tanque para la determinación de parámetros externos y seis de ellos se sacrificaron, tres para análisis de composición del plasma, actividad enzimática y contenido en glucógeno; y los otros tres para determinación de parámetros biométricos y composición bioquímica. El tamaño de la ración se ajustó periódicamente en función de los datos de evolución de peso. El crecimiento y la eficiencia alimentaria se determinaron calculando la ganancia absoluta de peso, el incremento relativo de peso, la tasa de crecimiento específico, el índice de conversión del alimento, el coeficiente de eficiencia proteica y el valor productivo de la proteína (para más detalles ver apartado IX de esta Memoria). 206 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. VI.2.2.Procesado de la sangre y los tejidos Tras un periodo de ayuno previo de 24 horas, se sacrificaron los peces según XXXX. Las muestras de sangre se tomaron rápidamente tal como se indica en el apartado IX Metodología. El hígado y una porción de músculo blanco de la parte anterior dorsal de los peces fueron diseccionados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta que se usaron para los estudios metabólicos en las instalaciones de la UGR. Los tejidos se homogenizaron según se detalla en el apartado IX de esta Memoria. VI.2.3. Parámetros biométricos y composición química Los peces utilizados para este propósito fueron almacenados en hielo y transportados hasta las instalaciones de la UGR. Todos los peces se pesaron y midieron, a continuación se diseccionaron el músculo y las vísceras para la determinación de los índices de condición, hepatosomático, digestosomático, rendimiento de filete, según se describe en el apartado IX. Posteriormente, el cuerpo de los peces en su conjunto, así como la parte derecha del músculo se usaron para determinación de la composición química según se detalla en el citado apartado IX. VI.2.4. Análisis de metabolitos plasmáticos y actividad enzimática Se determinaron los niveles plasmáticos de glucosa, lípidos totales, triglicéridos, colesterol y proteínas totales usando las técnicas descritas en el apartado IX. Los ensayos enzimáticos en hígado y músculo se realizaron según se detalla en el mismo apartadoIX. Se determinaron las siguientes actividades enzimáticas: Piruvato Kinasa (PK; EC 2.7.1.40), Lactato Deshidrogenasa (LDH; EC 1.1.1.27), Fructosa 1,6Bisfosfatasa (FBPasa; EC 3.1.3.11), Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49), Glutamato Deshidrogenasa (GDH; EC 1.4.1.2), Citrato Sintasa (CS; EC 4.1.3.7) y β-Hidroxiacil CoA Deshidrogenasa (HOAD; EC 1.1.1.35). También se determinó el contenido en glucógeno en hígado y músculo blanco. VI.2.5. Estudio de la calidad del músculo Los peces utilizados para este propósito fueron envasados en cajas de polipropileno, recubiertos con hielo y transportados al laboratorio de Producción 207 Sergio García Mesa Animal de la UAL para la realización de los análisis pertinentes. Una vez allí, se almacenaron en cámara fría a 4 °C, envueltos en papel de aluminio. Para el estudio de la evolución post-mortem se tomaron muestras de 6 corvinas a las 24, 48, 72 y 144 horas después de su sacrificio. En cada individuo se determinó la firmeza del pez completo y el pH, a continuación se obtuvieron muestras de la parte anterior del músculo dorsal de la parte izquierda del pez. Una parte se usó para determinación de la capacidad de retención de agua (CRA); el resto de la muestra de músculo se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta la realización de ulteriores análisis de extracción y valoración de diferentes fracciones proteicas. Los métodos de determinación de firmeza, pH y CRA, así como los de extracción de las fracciones de proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares y su cuantificación y separación electroforética también se detallan en el apartado de IX de esta Memoria VI.2.6. Análisis estadístico El efecto de cada tratamiento sobre las variables estudiadas se realizó mediante ANOVA de una vía seguido de comparación de las medias mediante el procedimiento de Duncan (1955). Cuando no se especifica otro, se consideró el nivel de significación del 95 % para indicar diferencias significativas (P<0.05). Cuando los resultados se expresan como un porcentaje (por ejemplo la densitometría) los datos fueron normalizados usando la transformación del arcotangente y su raíz cuadrada previo al análisis estadístico, según Sokal y Rohlf (1981). Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando un software específico (SPSS). VI.3. RESULTADOS VI.3.1. Crecimiento e índices morfométricos La tabla VI.3.1. muestra la ganancia de peso de los diferentes lotes experimentales expresada según diversos índices. Las corvinas alimentadas 6 días a la semana (lotes 6M) exhibieron los mejores valores de estos índices al aumentar su peso inicial en torno a un 80 %. Por el contrario, las alimentadas 5 días a la semana por la tarde (lotes 5T) mostraron la menor ganancia de peso, aunque las diferencias entre tratamientos no fueron estadísticamente significativas en ninguno de los casos. Puesto que todos los lotes recibieron la misma cantidad de alimento, los índices de conversión exhibieron una tendencia inversa a la mostrada por las ganancias de peso, los mejores 208 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. resultados para los lotes 6M y los peores para los 5T. De nuevo las diferencias no fueron estadísticamente significativas. En cuanto al grado de utilización de la proteína de la dieta para incremento de peso y retención de proteína corporal (PER y VPP respectivamente), tampoco se observaron diferencias estadísticas entre tratamientos, pero los mayores valores de PER se encontraron en los lotes 6M mientras que los lotes 7M mostraron los máximos para el VPP. Los lotes alimentados sólo 5 días a la semana por la tarde mostraron los valores más bajos para ambos índices. Tabla VI.3.1. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre los parámetros de crecimiento y utilización del alimento en las corvinas. Frecuencia alimentaria GAP IRP SGR TCA FER PER VPP 5M 116.8 69.77 0.59 1.12 0.90 1.91 29.39 14.72 9.06 0.09 0.08 0.06 0.19 0.55 5T 109.14 63.61 0.54 1.24 0.82 1.76 25.21 15.21 11.67 0.08 0.19 0.13 0.27 5.82 6M 133.11 78.10 0.64 1.04 0.96 2.04 33.59 2.05 1.42 0.01 0.03 0.02 0.05 3.22 7M 115.60 66.37 0.57 1.15 0.87 1.85 35.67 1.82 3.06 0.01 0.01 0.01 0.01 4.72 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. GAP: Ganancia Absoluta de Peso; IRP: Incremento Relativo de Peso; SGR: Tasa de Crecimiento Específico; TCA: Tasa de Conversión del Alimento; PER: Coeficiente de Eficiencia Proteica; FER: Tasa de Eficiencia Alimentaria. VPP: Valor Productivo de la Proteína. Los datos de parámetros biométricos de los respectivos lotes se muestran en la tabla VI.3.2. Todos los peces aumentaron su peso y longitud a lo largo del experimento pero no se observó un efecto significativo de los diferentes regímenes el día 45. Al final del experimento, día 90, los peces 6M eran algo más largos y pesados que los demás. Los otros índices biométricos determinados no se afectaron ni por el tiempo ni por el régimen dietario, al menos de forma significativa, por lo que la morfología general de los peces (K) se mantuvo sin cambios, mientras que no se detectó un posible crecimiento diferencial del hígado, tracto digestivo y músculo (IHS, IDS y RF). VI.3.2. Composición corporal La composición química del cuerpo y el músculo de las corvinas se muestra en la tabla VI.3.3. El contenido corporal de agua y cenizas de los peces permaneció muy estable a lo largo del experimento, no detectándose efectos del régimen dietario. Durante el desarrollo del experimento, se apreció una ligera pero general tendencia a reducir el porcentaje de proteína corporal acompañada por un igualmente ligero 209 Sergio García Mesa aumento de los depósitos de lípidos, de forma que los lotes 5M y 7M presentaron mayor contenido en lípidos y menor en proteína el día 45 de cultivo. Es de destacar que al final del experimento, los lotes 6M y 7M exhibieron mayor contenido proteico que los 5M y 5T, mientras el contenido en lípidos fue más parecido entre grupos, aunque los peces 6M mostraron los valores más bajos. Tabla VI.3.2. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre los parámetros biométricos en corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento. Longitud total* (cm) Peso Total* (g) K* IHS◊ IDS◊ RF◊ 25.82 171.2 1.005 1.47 1.88 44.60 0.07 1.50 0.002 0.16 0.06 2.49 5M 27.06 210.29 1.06 1.29 1.84 44.85 0.30 7.10 0.01 0.08 0.03 0.90 5T 27.42 216.90 1.04 1.45 1.99 46.56 0.38 10.75 0.01 0.11 0.03 0.61 6M 27.44 226.28 1.10 1.58 1.91 46.49 0.27 9.54 0.06 0.14 0.06 0.60 7M 27.31 212.98 1.04 1.46 2.05 45.43 Días 0 45 5M 5T 90 6M 7M 0.40 10.80 0.07 0.11 0.07 0.61 30.05xy 285.5xy 1.06 1.40 1.88 45.11 0.26 6.43 0.03 0.16 0.12 0.53 29.18x 277.61x 1.03 1.30 1.90 44.44 0.22 6.42 0.01 0.10 0.05 0.96 30.81y 303.63y 1.03 1.51 1.80 46.21 1.18 5.31 0.01 0.14 0.12 3.07 30.23xy 289.83xy 1.04 1.58 1.78 45.79 0.20 5.93 0.04 0.08 0.16 0.74 Los valores son medias ± EEM (*N=160 en el día 0 y 40 por tratamiento en el día 45 y 90; ◊N=6). Valores con x,y,z... a,b,c... diferentes superíndices indican diferencias atribuíbles a la frecuencia alimentaria a los 45 ( ) y 90 ( ) días (P<0.05). 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. K: Índice de condición. IHS: Índice hepatosomatico. IDS: Índice digestosomatico. RF: Rendimiento de filete. En cuanto al músculo, mientras que el contenido en cenizas no se afectó significativamente ni por el tiempo ni por el régimen alimentario, los contenidos de agua y proteína sufrieron una ligera reducción en todos los grupos; estos cambios fueron acompañados por un ligero incremento en el contenido lipídico. Sobre el posible efecto del régimen alimentario, la única diferencia significativa detectada se refiere al contenido en proteína, mostrando los peces 5T mayores valores y los 5M y 6M los menores, al final del experimento. 210 211 71.41±0.47 70.30±0.68 6M 7M 23.02a±0.51 25.05ab±0.73 62.27c±0.24 25.37ab±0.92 56.95a±0.37 70.36±0.36 5T 61.32c±0.44 28.32b±1.22 58.83b±0.42 70.76±0.64 5M 7M 23.90y±0.52 71.15±0.07 6M 60.16x ±1.03 20.70x±0.52 63.23xy±0.64 71.37±0.12 23.02y±0.32 60.57x±0.91 22.35xy±0.56 23.28±0.97 62.38±1.18 65.57y ±1.44 70.96±1.34 5T Lípidos Proteína 12.57±0.36 12.28±0.20 11.97±0.14 12.46±0.60 12.65±0.53 13.35±0.21 13.57±0.51 13.27±0.32 11.76±0.60 Cenizas 76.53±0.25 76.85±0.18 76.78±0.29 76.52±0.33 77.33±0.39 77.6±0.39 77.53±0.27 77.08±0.09 78.49±0.13 Agua 80.25ab±0.75 78.98a±0.63 82.62b±0.82 78.67a±1.3 84.67±2.57 87.16±2.66 86.81±2.11 83.68±1.35 90.96±0.66 Proteína 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. ) y 90 ( x,y,z... a,b,c... 8.11±0.77 7.49±0.77 6.98±0.51 7.83±0.57 6.18±0.29 5.55±0.55 5.52±0.51 5.11±0.4 5.65±0.34 Lípidos Composición del músculo Los valores son medias ± EEM (N=6).Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la frecuencia alimentaria a los 45 ( 90 45 70.70±0.66 70.22±1.29 0 5M Agua Días Composición corporal ) días (P<0.05). 5.85±0.22 5.91±0.09 5.99±0.07 5.78±0.15 5.78y±0.09 6.22x±0.07 6.30x±0.10 6.28x±0.06 6.19±0.05 Cenizas Tabla VI.3.3. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre la composición corporal y del músculo (% ss) de las corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento Sergio García Mesa Tabla VI.3.4. Efecto del tiempo de experimento sobre algunos parámetros (diferencias estadísticas se muestran con diferentes números (1,2,3) (P<0.05)). lotes Días 5M 0-45-90 5T 6M 7M 0-45-90 0-45-90 0-45-90 1-2-3 1-2-3 1-2-1 n.s. n.s. n.s. 1-2-3 1-2-3 n.s. n.s. n.s. n.s. 1-2-3 1-2-3 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 2-2-1 1,2-1-2 1-2-1,2 n.s. 1,2-2-1 n.s. 1-2-1,2 n.s. n.s. n.s. n.s. 2-1-1 2-1,2-1 n.s 1,2-2-1 2-1-1 2-2-1 1,2-1-2 2-2-1 2-1-1 2-1-1 1-1-2 2-1-1,2 Parámetros Biométricos Longitud Total Peso Total K HIS IDS RF 1-2-3 1-2-3 1-2-2 n.s. n.s. n.s. Composición corporal Agua Proteína Lípidos Cenizas n.s. 2-1,2-1 1-1-2 n.s. Composición músculo Agua Proteína Lípidos Cenizas 2-1-1 3-2-1 1-1-2 2-2-1 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. n.s.: diferencias no significativas VI.3.3. Metabolitos plasmáticos El análisis de los metabolitos plasmáticos se realizó al principio y al final del experimento (tabla VI.3.5.). No se detectaron cambios significativos en los niveles de glucosa y lípidos totales desde el principio hasta el final del experimento. Los contenidos en colesterol y triglicéridos mostraron una tendencia significativa a disminuir, sólo en los lotes 7M para el colesterol y en los 5T, 6M y 7M para los triglicéridos. El contenido en proteína aumentó en todos los tratamientos excepto en los peces 7M. La frecuencia de alimentación influyó significativamente sobre el nivel de lípidos totales y proteína: los lípidos totales fueron mayores en peces alimentados 7 días a la semana y más bajos en los alimentados sólo 5 días por semana, independientemente de la hora a que se suministrara el alimento a estos últimos. El nivel de proteínas mostró una tendencia opuesta, los valores más altos se encontraron en los peces alimentados 5 días (5M y 5T) y los menores en los peces 7M. 212 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. Tabla VI.3.5. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre la composición del plasma (mg /100 mL) de las corvinas a los 0 y 90 días de experimento. Días Glucosa Colesterol Triglicéridos Lípidos Totales Proteínas 0 81.33 90.66 173.89 1619.65 1899.91 7.00 3.77 11.55 121.34 183.61 5M 85.85 77.32 135.39 1391.05a 3235.59*b 6.69 4.10 12.57 83.04 289.18 5T 93.88 78.97 119.82* 1427.14a 3049.10*ab 4.58 2.89 11.37 93.44 76.83 6M 81.93 77.32 109.95* 1584.73a-b 2909.58*ab 6.65 3.25 10.94 82.55 210.15 7M 89.85 72.68* 97.80* 1889.34b 2184.89a 4.54 9.39 83.04 174.99 90 5.83 a,b,c... Los valores son medias ± EEM (N=6) Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la frecuencia alimentaria a los 90 días (p<0.05). * Indica diferencias significativas atribuibles al tiempo de cultivo (día 0 vs. día 90) (p<0.05). 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. VI.3.4. Actividades enzimáticas en hígado y músculo En la tabla VI.3.6. se muestra el efecto de la frecuencia de alimentación y la duración del experimento sobre la actividad metabólica y el contenido de glucógeno en el hígado; las diferencias significativas atribuibles a la segunda variable se muestran en la tabla VI.3.8. Considerando el tiempo de experimento (tabla VI.3.8.), se detectó una ligera tendencia a disminuir la actividad enzimática desde el principio hasta los 45 y 90 días, aunque esta tendencia sólo fue estadísticamente significativa para CS, GDH y HOAD. La actividad G6PDH se mantuvo constante para todos los tratamientos, excepto 6M en que disminuyó significativamente a los 90 días. El contenido hepático en glucógeno aumentó de forma significativa desde el día 0 hasta el 45 y, a partir de entonces, se mantuvo excepto para los peces alimentados 7 días a la semana en que fue significativamente superior. La frecuencia de alimentación (tabla VI.3.6.) no influyó significativamente sobre las actividades FBPasa y GDH. A los 45 días, los valores de CS, G6PDH, HOAD y PK fueron menores en los peces alimentados 5 días a la semana frente a los alimentados 6 y 7 días por semana, mientras que la actividad de la LDH mostró mayores valores para los lotes 6M. A los 90 días algunas de las actividades enzimáticas parecían haber sido afectadas por la frecuencia alimentaria, solo las correspondientes a CS y HOAD mostraron 213 Sergio García Mesa menores valores para 5M y G6PDH para 6M. El contenido en glucógeno fue similar para todos los tratamientos a los 45 días y significativamente superior en lotes 7M a los 90 días. Tabla VI.3.6. Influencia de la frecuencia de alimenatción sobre actividades enzimáticas (mU/mg proteína) y contenido en glucógeno (mg glucógeno/g tejido) en el hígado de las corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento Días CS FBPasa GDH G6PDH HOAD LDH PK Glucógeno 0 17.62 22.95 114.99 30.02 18.17 87.47 32.77 64.67 0.84 2.12 10.17 2.89 1.68 8.01 2.83 6.92 x 5M 13.30 19.99 65.98 24.25 0.75 1.90 4.50 2.44 x 5T 45 6M 7M 5M 5T 90 6M 7M x xy 86.34 11.76 xy 0.60 x 80.82 xy 5.55 27.53 xy 2.42 x 101.33 5.41 x 103.8 13.45 18.93 25.53 9.98 74.19 0.88 1.63 6.17 0.72 0.70 6.55 25.94 2.34 9.53 18.07y 19.18 96.22y 29.07 14.26yz 102.97y 36.78y 87.16 0.84 1.72 5.59 3.41 1.14 7.61 3.12 1.36 17.97y 21.32 101.17y 29.40 15.73z 65.31x 33.88xy 89.53 0.74 1.88 6.79 0.71 1.12 5.70 1.15 1.36 11.15a 20.14 73.72 32.90b 8.95a 113.06 23.34 89.43a 0.89 1.99 6.74 1.47 0.66 11.21 2.21 5.12 15.24b 21.52 69.04 36.55b 11.61ab 90.05 25.80 85.01a 0.77 2.08 2.91 2.72 0.64 5.19 1.74 5.63 14.91b 17.15 68.87 24.27a 12.90b 97.65 27.11 82.94a 0.26 1.58 5.38 1.54 0.76 5.82 2.34 3.15 14.49ab 17.17 68.60 33.91b 12.19b 104.14 27.70 110.32b 1.30 1.00 3.86 2.46 0.68 9.87 2.36 2.57 Los valores son medias ± EEM (N=6). Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la x,y,z... a,b,c... frecuencia alimentaria a los 45 ( ) y 90 ( ) días (P<0.05). 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. CS: Citrato Sintasa; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. Los valores de la actividad específica de las enzimas metabólicas y el contenido en glucógeno en el músculo blanco de las corvinas (tabla VI.3.7.) mostraron cambios diferentes a los ocurridos en el hígado a lo largo del experimento, y al igual se sucedió en experimentos previos, la actividad G6PDH no fue posible determinarla. El tiempo de experimento influyó significativamente sobre las actividades CS, HOAD y PK musculares (tabla VI.3.8.), la actividad CS disminuyó a partir del día 0 hasta los 45 y 90 días en todos los tratamientos, la actividad HOAD sólo para los lotes 5M mientras que la actividad PK aumentó en todos excepto 7M. Los valores de glucógeno también disminuyeron significativamente desde el principio hasta el final del experimento. 214 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. La frecuencia alimentaria no pareció influir sobre la actividad enzimática a los 45 días del experimento pero al final del mismo, las actividades GDH y FBPasa mostraron valores significativamente mayores en los peces 6M y 5T, respectivamente, mientras que las actividades LDH y PK fueron significativamente menores en 7M y la HOAD en 5M. No se observaron cambios significativos en las demás actividades enzimáticas en función del tratamiento el día final del experimento. Tabla VI.3.7. Influencia de la frecuencia de alimentación sobre actividades enzimáticas (mU/mg proteína) y contenido en glucógeno (mg glucógeno/g tejido) en el músculo de las corvinas a los 0, 45 y 90 días de experimento Días CS 22.04 FBPasa 2.98 GDH 46.47 1.98 0.27 3.66 5M 14.20 2.49 39.96 0.89 0.21 3.77 5T 15.03 2.02 41.58 1.07 0.20 4.16 6M 15.41 2.07 38.53 1.03 0.17 3.25 7M 14.88 2.03 48.69 1.22 0.17 3.59 0 45 5M 5T 90 10.97 0.89 11.72 0.75 a 2.79 37.95 0.22 2.97 b 4.1 0.41 ab 3.15 G6PDH n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. a n.d. ab 43.76 n.d. 4.01 b 6M 12.68 53.32 0.91 0.32 4.63 7M 14.51 3.48ab 46.73ab 1.41 0.31 2.29 n.d. n.d. HOAD 7.54 LDH 1530.72 PK 1045.69 Glucógeno 4.62 0.69 112.47 89.64 0.36 7.75 1483.68 1092.66 1.85x 0.67 161.62 83.98 0.05 5.59 2069.11 1114.41 3.95y 0.25 198.43 110.67 0.23 6.95 1753.59 1032.24 3.27y 0.66 150.78 96.74 0.31 6.46 2056.37 1280.59 3.46y 0.59 151.22 83.98 0.31 a 1858.06 0.24 180.64 2.86 5.22 b 0.48 9.51 c ab 88.93 2443.56 b 227.54 1865.39 1434.21 ab 0.13 1587.88 b 141.18 ab 1415.10 1.67a 1.89ab 0.18 ab 1.36a 0.68 132.6 102.09 0.11 5.80b 1368.65a 1151.21a 2.30b 0.46 129.81 81.47 0.13 Los valores son medias ± EEM (N=6). Valores con diferentes superíndices indican diferencias atribuibles a la frecuencia x,y,z... a,b,c... alimentaria a los 45 ( ) y 90 ( ) días (P<0.05).n.d.= no detectada. 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. CS: Citrato Sintasa; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. Los peces alimentados 5 días a la semana por la mañana (5M) mostraron un contenido en glucógeno muscular significativamente menor a los 45 días, a los 90 disminuyeron en los otros tratamientos, siendo significativamente mayores los valores de 7M. 215 Sergio García Mesa Tabla VI.3.8. Efecto del tiempo de experimento sobre algunos parámetros (diferencias significativas se muestran con diferentes números (1,2,3) (P<0.05) lotes días Enzimas del hígado CS FBPasa GDH G6PDH HOAD LDH PK Glucógeno 5M 5T 6M 7M 0-45-90 0-45-90 0-45-90 0-45-90 2-1-1 n.s. 2-1-1 n.s. 2-1-1 n.s. n.s. 1-2-1,2 2-1-1,2 n.s. 2-1,2-1 1,2-1-2 2-1-1 n.s. n.s. 1-2-1,2 1,2-2-1 n.s. 2-1,2-1 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 2-1,2-1 n.s. 2-1,2-1 1,2-1-2 n.s. 1-1,2-2 2-1-1 n.s. n.s. 2-2-1 n.s. 1-1,2-2 2-1-1 2-1-1 1,2-1-2 n.s. n.s. 1-1,2-2 1-1-2 2-2-1 2-1,2-1 1,2-1-2 n.s. n.s. n.s. 1,2-1-2 2-2-1 2-1,2-1 1,2-1-2 n.s. n.s. 1-2-1 n.s. 2-1,2-1 Enzimas del músculo CS FBPasa GDH HOAD LDH PK Glucógeno 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. n.s.: diferencias no significativas. CS: Citrato Sintasa; FBPasa; Fructosa Bisfosfatasa; G6PDH: Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa; GDH: Glutamato Deshidrogenasa; HOAD: 3-hidroxiacil CoA Deshidrogenasa; LDH: Lactato Deshidrogenasa; PK: Piruvato Kinasa. VI.3.4. Firmeza, pH y capacidad de retención de agua (CRA) En la tabla VI.3.1.9. y en la figura VI.4.1. se muestra la evolución post-mortem de la firmeza, pH y CRA (capacidad de retención de agua) del músculo de las corvinas sometidas a las distintas frecuencias alimentarias. Tanto éstas como el tiempo de almacenamiento, influyeron significativamente sobre los tres parámetros estudiados. Con respecto a la firmeza, se detectó una relación directa con la frecuencia de alimentación semanal, circunstancia que se mantuvo a lo largo del periodo de conservación post-mortem de 144 horas (144 hpm). Los peces alimentados 5 días a la semana y por la mañana (5M) mostraron valores similares de firmeza las primeras horas post-mortem, pero al final del periodo de almacenamiento exhibían valores inferiores los alimentados por la tarde. El tiempo de almacenamiento supuso, a su vez, una disminución de este parámetro en todas las frecuencias alimentarias estudiadas. Los valores de pH mostraron un efecto opuesto a los de firmeza, al inicio del periodo de conservación (24 hpm), los valores de las corvinas alimentadas 5 días a la semana (5M y 5T) eran superiores a los de los otros peces (6M y 7M). Durante el 216 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. almacenamiento se detectó una disminución, en todos los lotes, de los valores de este parámetro a las 48 hpm y un posterior aumento a partir de las 72 hpm. Con respecto a la capacidad de retención de agua (CRA), las corvinas alimentadas por la tarde (5T) mostraban valores más altos que las alimentas por la mañana, no detectándose diferencias significativas entre éstas. Esta diferencia se vio atenuada durante el almacenamiento, que provocó una disminución de los valores de este parámetro para todos los tratamientos estudiados. Tabla VI.3.9. Efecto de la frecuencia alimentaria en la firmeza, pH y capacidad de retención de agua (CRA) en las corvinas tras el sacrificio. Hpm 24 5M 5T 6M 7M 35.16ab,3 34.61a,3 41.78c,3 39.00bc,3 6.87 6.19 3.46 1.81 a,2 Firmeza (N) 48 24.67 4.74 2.83 b,1 72 144 24 48 pH 72 144 24 CRA (%) 26.33 48 72 144 22.50 20.24 a,2 37.50 c,2 1.39 a,1 34.87 33.19b,2 3.91 d,2 30.83c,2 2.26 2.21 2.38 3.75 22.45b,1 19.90a,1 30.88c,1 26.68bc,1 2.24 1.93 7.07 4.98 6.79 2 0.10 6.24 2 6.90 0.38 2 6.15 6.56 a1 0.07 2 6.26 6.39 a2 0.09 b1 5.96 ab2 0.16 0.10 0.10 0.06 6.562 6.422 6.49 b1 6.44 bc3 0.16 0.11 0.14 0.09 6.54 2 6.53 2 6.48 b1 6.47 c3 0.10 0.11 0.11 0.17 70.80b3 70.50a2 69.31a3 68.81a4 0.63 0.34 0.58 0.65 70.41 b3 0.48 69.40 69.90 b2 0.44 c2 69.83 c12 68.78 a23 0.65 67.50 67.97a3 0.52 b1 66.06a2 0.30 0.66 0.57 0.34 66.98a1 68.00b1 68.38b12 66.98a2 0.66 0.83 0.54 0.35 a,b.. Los valores son media ± EEM (N=6). Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) debidas a las frecuencias de alimentación. 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. FA: frecuencia alimentaria; Hpm: horas post-mortem. VI.3.5. Contenido en proteínas En la tabla VI.3.10. se muestra la evolución post-mortem del contenido de diferentes tipos de proteínas musculares de las corvinas alimentadas con distintas 1,2… Muestran diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) debidas al tiempo de almacenamiento. 217 Sergio García Mesa frecuencias semanal. Los resultados obtenidos no mostraron influencia significativa ni de éstas ni del tiempo de almacenamiento. Se ha podido observar una tendencia a aumentar las proteínas sarcoplasmáticas (PSP) al disminuir la frecuencia alimentaria semanal; así, los lotes 7M mostraron menores contenidos en proteínas sarcoplásmicas que los 6M, 5M y 5T aunque esas diferencias no fueron estadísticamente significativas. De la misma forma, las proteínas miofibrilares (PMF) mostraron una tendencia a disminuir cuando los peces se alimentaban 5 días frente a los alimentados 6 y 7 días por semana y también con el tiempo de almacenamiento; sin embargo, las diferencias tampoco son significativas posiblemente debido a la alta dispersión de los datos individuales. Tabla VI.3.10. Influencia del tamaño de frecuencia alimentaria sobre el contenido de proteínas totales (PT), sarcoplásmicas (PSP) y miofibrilares (PMF) y aminoácidos (AAs) (mg/g de músculo seco) a diferentes tiempos después del sacrificio. 6M Hpm 5M 5T 7M 24 28.96±4.40 25.23±4.15 27.53±4.51 22.57±2.87 144 29.66±2.59 28.18±2.00 27.35±3.08 24.53±2.05 24 68.02±7.72 68.31±2.93 74.09±7.13 74.06±7.39 144 69.91±6.54 61.55±6.69 71.80±4.05 71.64±11.49 24 96.98±5.68 93.54±1.25 101.62±7.87 96.62±8.71 144 99.57±5.76 89.73±7.74 99.16±6.71 96.16±10.76 24 26.03±5.72 26.89±6.09 28.39±5.93 25.52±4.08 144 31.51±5.73 25.44±3.95 24.45±4.02 26.30±3.41 PSP PMF PT AAS Los valores son media ± EEM (N=6). No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) debidas a las frecuencias de alimentación ni al tiempo de almacenamiento. 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. Hpm: horas post-mortem. VI.3.6. Análisis electroforético de las proteínas sarcoplasmáticas (PSP) La figura VI.3.1. muestra el resultado de la separación en geles SDS-PAGE de las fracciones proteicas de los extractos de las proteínas sarcoplásmicas del músculo de la corvina. La densidad óptica relativa (DOR) de las distintas bandas (expresada en % sobre la densidad óptica relativa total de cada carril) se expone en la tabla VI.3.11. 218 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. Tras la separación electroforética se obtuvieron 12 bandas principales a partir de los extractos de proteínas sarcoplásmicas que, cuando se comparan con el patrón, se identifican con proteínas de pesos moleculares relativos de 97, 58, 50, 45, 43, 40, 38, 36, 28, 26, 24 y 16 kDa. La banda B-43 mostró los mayores porcentajes (por encima del 20 %); seguida de la banda de 16 kDa que mostró valores entre el 12 y el 14 %, las bandas B-45 y B-40 que constituyeron entre el 10 y 12 % del total; a continuación las bandas, B-38 y B-36 sobre un 8% cada una. El resto de las bandas tuvieron una importancia similar en el conjunto de los carriles: B-96, B-58, B-50, B-28, B-26, siendo la B-24 la que menor densidad óptica presentó. 205kDa 116 kDa 97.4 kDa 97 kDa 66 kDa 58 kDa 50kDa 45kDa 43kDa 40kDa 38 kDa 36 kDa 45 kDa 29 kDa 28 kDa 26 kDa 24 kDa 16 kDa P 7M 6M 5T 5M ------------------------------------24 hpm 7M 6M 5T 5M --------------------------------------144 hpm Figura VI.3.1. Patrón electroforético de la proteínas sarcoplasmáticas del músculo de corvinas, alimentadas con diferentes frecuencias alimentarias, a las 24 y 144 horas postmorten. El análisis estadístico de los datos muestra que los valores obtenidos no se han visto afectados de forma significativa por las diferentes frecuencias alimentarias; además, la mayoría de las bandas se mantuvieron casi sin cambios durante el almacenamiento; solamente se han observado diferencias estadísticamente significativas en las banda B-43 que han disminuido para todas las frecuencias alimentarias entre las 24 y 144 hpm (aunque las diferencias solamente son significativas para las corvinas 5M y 5T) y la banda B-36 que experimenta un cambio contrario en los tratamientos 7M y 6M. 219 Sergio García Mesa Tabla VI.3.11. Efecto de la frecuencia de alimentación y tiempos de almacenamiento sobre la densidad óptica relativa (DOR) de cada banda expresada en % sobre el total de la densidad óptica de las proteínas sarcoplasmáticas en las corvinas. Hpm 24 144 Fracciones proteicas 5M 5T 6M 7M B-96 4.71±0.90 5.06±1.32 5.13±0.81 5.19±0.39 B-58 5.54±0.22 5.82±0.45 5.45±0.75 5.04±0.83 B-50 5.86±0.60 6.15±0.66 5.47±1.19 6.07±0.76 B-45 11.95±0.61 11.77±0.69 12.32±0.88 11.86±0.47 B-43 24.28±1.13 23.85±0.73 23.61±0.86 23.51±0.75 B-40 10.60±1.73 10.67±0.43 11.53±0.84 11.46±0.31 B-38 7.47±1.03 6.52±1.26 7.29±0.89 7.78±0.79 B-36 6.70±2.05 6.67±1.07 5.83±0.37 5.88±1.18 B-28 3.92±0.58 4.04±0.90 3.87±0.66 3.32±0.20 B-26 3.18±0.59 3.88±0.74 3.31±0.75 3.40±0.88 B-24 2.88±0.41 2.68±0.23 2.72±0.83 3.00±0.64 B-16 12.83±0.92 13.39±0.60 14.08±0.36 13.68±0.78 B-96 4.68±0.50 4.63±0.55 4.35±0.89 5.01±0.52 B-58 5.78±1.04 5.09±0.93 5.34±1.32 5.65±1.11 B-50 4.89±1.01 5.24±1.17 5.89±0.45 5.36*±0.96 B-45 11.76±0.59 12.76±1.18 12.18±1.42 11.18±0.33 B-43 22.83*±0.30 22.08*±0.55 22.41±1.98 22.38±1.18 B-40 11.33±0.65 11.04±0.78 10.79±0.94 11.81±0.37 B-38 6.92±0.40 6.93±1.11 6.72±1.54 6.65±0.36 B-36 6.59±0.49 6.93±1.03 6.61*±0.30 6.94*±0.54 B-28 4.91±0.59 5.07±0.58 5.57±0.31 4.94±0.97 B-26 3.82±0.36 4.20±0.96 4.67±0.71 4.09±0.91 B-24 3.03±0.36 3.00±0.63 3.21±0.27 2.67±0.99 B-16 13.40±0.51 13.27±1.11 12.61±1.29 13.01±0.58 Los valores son media ± EEM (N=6). *Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) debidas al tiempo de almacenamiento. Hpm: horas post-mortem. 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. 220 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. VI.3.7. Análisis electroforético de las proteínas miofibrilares (PMF) En los geles se muestran las fracciones obtenidas tras la separación electroforética de las proteínas miofibrilares (figura VI.3.2.), así como la cuantificación de su densidad óptica relativa (DOR) (tabla VI.3.12), se han observado diversas bandas, entre las cuáles se identifican, según la literatura consultada, como cadena pesada de miosina (200kDa), Proteína C (146 kDa), actina (45 kDa), Troponina-T (38 kDa), banda de 35 kDa y péptido de 30 kDa, que ha aparecido solo en los extractos realizados a las 144 hpm. Tabla VI.3.12. Efecto de la frecuencia de alimentación y tiempo de almacenamiento sobre la densidad óptica relativa (DOR) de cada banda expresada en % sobre el total de la densidad óptica de las proteínas miofibrilares de las corvinas. Fracciones Hpm 5M 5T 6M 7M proteicas 24 144 200 kDa1 37.13a±0.18 39.32b±0.42 37.51a±1.46 37.74a±0.68 146 kDa2 1.17a±0.23 1.61ab±0.52 2.61c±0.34 1.91b±0.60 45 kDa3 30.71b±0.29 28.74a±0.55 30.15ab±1.68 31.35b±1.32 38 kDa4 29.01b±0.58 27.38a±0.76 27.27a±0.85 26.34a±0.66 35 kDa 2.44a±0.32 3.26b±0.51 2.71ab±0.25 3.06b±0.42 30 kDa - - - - 200 kDa1 37.02ab±0.66 35.07*a±0.82 37.21b±2.88 37.79b±0.75 146 kDa2 3.09*c±0.63 2.66*bc±0.19 2.42 b±0.16 1.82 a±0.23 45 kDa3 27.90*±0.99 30.23*±0.91 28.80±0.77 30.58±0.22 38 kDa4 28.73 b±0.38 28.91*b±0.71 28.93 b±1.98 27.25*a±0.39 35 kDa 1.61*b±0.41 1.74*b±0.27 0.84*b±0.21 0.64*a±0.10 30 kDa 1.65*b±0.70 1.52*b±0.70 1.79*a±0.45 2.08*a±0.06 a,b.. Los valores son media ± EEM (N=6). Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) debidas a las frecuencias alimentarias; *Muestran diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) debidas al tiempo de almacenamiento. 1 2 3 4 200 kDA: Cadena Pesada de miosina; 146 kDA: Proteína C; 45 kDa: actina; 38 kDa: Troponina-T. FA: frecuencia alimentaria; Hpm: horas post-mortem. 5M: 5 días/semana por la mañana. 5T: 5 días/semana por la tarde. 6M: 6 días/semana por la mañana. 7M: 7días/semana por la mañana. 221 Sergio García Mesa Las fracciones proteicas mayoritarias han sido la actina y la miosina, con aproximadamente un 30 y un 40% del total de la proteína de cada carril, respectivamente. La Troponina-T ha mostrado valores aproximados de entre el 24 y 29 % del total. Las bandas correspondientes a la proteína C y la de 35 kDa han tenido poca importancia relativa en el conjunto, no superando el 6% entre las dos. 205kDa 200kDa 146kDa 116 kDa 97.4 kDa 66 kDa 45kDa 38 kDa 45 kDa 35 kDa 30 kDa 29 kDa P 7M 6M 5T 5M 7M 6M 5T 5M --------------------------------------- ----------------------------------24 hpm 144 hpm Figura VI.3.2. Patrón electroforético de las proteínas miofibrilares del músculo de corvinas, alimentadas con diferentes frecuencias alimentarias, a las 24 y 144 horas post-morten. El análisis de los datos demostró, a las 24 hpm, un aumento de la banda de miosina y una disminución de la de actina en los peces alimentados cinco días a la semana por la tarde. También se observaron cambios opuestos en la Troponina-T, que aumentó, y la banda de 35 kDa, que disminuyó en los peces 5M con respecto a los demás. La banda de la proteína C era menor en los lotes 5M y 5T que en los lotes 7M y 6M. A las 144 hpm se observaban tendencias diferentes a las detectadas 24 hpm, disminuyendo las bandas de miosina y de 30 kDa en las corvinas 5T y aumentando la proteína C y la banda de 35 kDa en los tratamientos 6M, 5M y 5T frente a las corvinas alimentadas 7 días a la semana. El tiempo de almacenamiento afectó de forma significativa a la densidad óptica relativa de la banda de miosina en las corvinas 5T, las bandas de proteína C y actina para las 5M y para las 5T. La banda de 35 kDa disminuyó drásticamente en todas las 222 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. frecuencias alimentarias, apareciendo la banda de 30 kDa que, de hecho, no se observó a las 24 hpm. VI.4. DISCUSIÓN Existe una creciente evidencia de que el éxito de la alimentación de un cultivo intensivo de peces depende no solo de ¿qué? come el pez, sino también de otros aspectos de la estrategia alimentaria como son ¿cuándo? y ¿con qué frecuencia deben ser alimentados? Por lo tanto, cuestiones como cuál es la hora para suministrar el alimento (¿por la mañana o por la tarde?, ¿en ambas?), o la de si los peces deben ser alimentados todos los días o puede resultar favorable o, al menos, no muy desfavorable, intercalar ayunos cortos o, finalmente, si la ración diaria se debe suministrar de una sola vez o fraccionada en varias tomas diarias, devienen particularmente relevantes. Una definición correcta de estos aspectos puede afectar positivamente tanto al crecimiento y utilización del alimento por el pez (economía) como al impacto medioambiental (ecología) (Lee et al., 2000a; Bolliet et al., 2001; Madrid et al., 2001; Türker, 2006; Marimuthu et al., 2010). La introducción de uno o más días de ayuno por semana durante la fase de engorde de los peces en una granja se ha probado repetidamente con resultados diversos. En nuestro caso, los peces alimentados 5 o 6 días a la semana crecieron de forma muy similar a los alimentados todos los días (tabla VI.3.1.). De hecho, los lotes ayunados un día a la semana (6M) lo hicieron algo más que los demás. Es necesario destacar que en este experimento todos los lotes recibían la misma ración semanal total lo que implica que la tasa de crecimiento no refleja diferencias en la ingesta si no, en cualquier caso, en la utilización del alimento. Resultados previos con otras especies muestran repetidamente que un aumento en la frecuencia de alimentación produce un incremento en la tasa de crecimiento del pez, principalmente debido a un correspondiente incremento en la cantidad de alimento ingerido. También se ha mostrado que esta tendencia exhibe un máximo y así frecuencias mayores que éste no implican un mejora adicional del crecimiento o utilización del alimento (Lee et al., 2000a; Türker, 2006; Marimuthu et al., 2010). Estos hallazgos han demostrado que los resultados de estas maniobras dependen de muchas variables como la especie, la edad (uno de los factores determinantes más importantes: para peces jóvenes se recomiendan mayores frecuencias alimentarias), el tipo y la composición del alimento (sobre todo el contenido en energía), las condiciones ambientales (sobre todo temperatura), etc. 223 Sergio García Mesa Okumus y Bascinar (2001) establecieron que truchas que comían todos los días (F7) crecieron más que las alimentadas sólo cinco días a la semana (F5) o cada dos días (FEOD), pero también que las F5 utilizaban mejor el alimento ingerido (mejor índice de conversión) minimizando las diferencias en crecimiento con respecto a F7. El Sayed et al., (2009) mostraron que tilapias alimentadas 6 días a la semana (T6) ingerían la misma cantidad de alimento (los peces se alimentaron ad libitum) y crecían de forma similar que otros peces alimentados siete días a la semana (T7), mientras que los peces alimentados sólo 5 ó 4 días a la semana exhibían resultados más pobres. Una vez más, los peces privados de alimentación un día a la semana (T6) exhibieron el mejor índice de conversión. Como en nuestro caso, la pausa de un día, parece provocar que la maquinaria comportamental, digestiva y metabólica implicada en la ingesta y utilización del alimento resulte más favorable para los propósitos de crecimiento y utilización del alimento. También debe ser tenida en cuenta la posibilidad de ahorro en costes de personal asociado a esta estrategia alimentaria. Como hemos indicado, las corvinas alimentadas 5 días a la semana crecieron con una tasa similar a la de las alimentadas 6 o 7 días a la semana, aunque, cuando los peces se alimentaron por la tarde (es decir, con un horario diferente al que previamente se había usado con estos peces), la tasa de crecimiento fue la más baja (tabla VI.2.1.). Como se ha comentado anteriormente, el ayuno de dos días a la semana implica una reducción en el crecimiento de la trucha (Okumus y Bascinar, 2001) y la tilapia (El Sayed et al., 2005), pero en esos casos coincidió con una reducción de la ingesta (los peces fueron alimentados hasta saciedad aparente); como hemos señalado antes, en nuestro experimento y para poder descartar el posible efecto de una diferente cantidad de alimento ingerido se suministró una ración semanal idéntica a todos los peces, por lo que parece que la forma de suministro de esta cantidad de alimento a lo largo de la semana tiene sólo una influencia secundaria. Estos resultados coinciden con los de Robinson y Li (1996) y Wu et al. (2004) con juveniles de pez gato criados en tanques, que se alimentaron hasta saciedad; en este caso, alimentarlos 6 o 7 días a la semana resultó irrelevante para propósitos de crecimiento. De confirmarse y generalizarse esta posibilidad, ello daría más opciones al acuicultor. Puesto que todos los peces se alimentaron con el mismo pienso y ración semanal, es decir, consumieron la misma cantidad de proteína, los efectos sobre el PER son reflejo exacto de los que hemos descrito para crecimiento. El Sayed et al. (2005) tampoco encontraron diferencias significativas en PER en el anteriormente comentado experimento con tilapia. El índice VPP contempla tanto el aumento de peso como el contenido en proteína corporal; nuestros datos reflejan mejores índices de VPP en peces 224 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. alimentados 6 o 7 días a la semana, que crecieron algo más y retuvieron más cantidad de proteína. Durante el experimento no cambió el índice de condición (K) de las corvinas (tabla VI.2.2.) que en todos los casos fue de un valor cercano a 1.0, en línea con lo aportado previamente por otros autores (Poli et al., 2003; Piccolo et al., 2008; Chatzifotis et al., 2010) y nosotros mismos en otros apartados de esta Memoria, para esta especie y a diferentes edades. Este es un valor de K típico de un pez delgado (un rasgo físico usualmente valorado por los consumidores de peces cultivados). Otros índices biométricos como la proporción relativa del peso de hígado, tracto digestivo y filete con respecto al peso corporal total de los peces no variaron durante el experimento o por efecto del régimen alimentario (tabla VI.2.2.). Cuando se han probado diferentes regímenes alimentarios permitiendo la ingesta de alimento hasta saciedad, hay una tendencia general (Lee et al., 2000a,b; Marimuthu et al., 2010) a que un aumento en la frecuencia alimentara implique algunos cambios en la composición corporal, sobre todo en el contenido de grasa y proteína, lo que puede modificar de forma diferencial el peso de las reservas asociadas al hígado, tracto digestivo o músculo y, por lo tanto, alterar los correspondientes IHS, IDS y RF, respectivamente. Este no es nuestro caso, aunque una acumulación diferencial de grasa en otros compartimentos (por ejemplo grasa perivisceral o hígado) no debe ser descartada si se consideran los datos de composición del pez completo (valores significativamente menores del contenido en lípidos totales se observaron en corvinas 6M y de proteína en 5T a los 90 días). Tanto los peces salvajes como los mantenidos en el laboratorio o la granja exhiben patrones, más o menos pronunciados, de preferencias con respecto a la hora de alimentación a lo largo del día. Así, algunas especies son diurnas, otras nocturnas y, finalmente, otras comen de forma continuada. Estas variaciones diarias en el apetito pueden coincidir con una mejor predisposición digestiva y metabólica para usar con éxito el alimento ingerido y, por tanto, deben ser tenidas en cuenta en el protocolo de alimentación semanal (ver revisión de Bolliet et al., 2001). No hay datos publicados sobre las preferencias de horario de alimentación de la corvina, pero parece que en su hábitat natural se alimenta preferentemente durante las horas de luz como ocurre con los peces de este ensayo a lo largo del periodo experimental. Incluimos unos lotes alimentados por la tarde para ver si su hábito es realmente diurno como comúnmente se cree. 225 Sergio García Mesa Así pues, con respecto a los lotes 7M, los 5T estuvieron sometidos no sólo a una reducción en el número de días por semana en que reciben alimento sino también a un cambio en el horario previo de suministro del mismo. La ligera reducción en la utilización del alimento observada en el grupo 5T (peores valores de índice de conversión) puede ser atribuida, al menos en parte, a esta doble fuente de novedad. No obstante, no debe descartarse una aptitud más favorable para el uso del alimento cuando se ingiere durante la fotofase temprana (lotes M) que podría reflejar un rasgo intrínseco de esta especie y/o un tipo de habituación al programa de alimentación previo. Normalmente a lo largo de un cultivo intensivo se observa un aumento del rango del tamaño de los peces, este aumento de la variación del tamaño se explica por el establecimiento de una jerarquía y dominancia social de algunos de algunos individuos que monopolizan el alimento disponible (Thomassen y Fjaera, 1996). Una estrategia alimentaria adecuada resultaría en una reducción en el rango de tamaños, evitándose, incluso, el canibalismo que suele aparecer asociado a grupos heterogéneos (Fontaine et al., 1997; Marimuthu et al., 2010). En las corvinas alimentadas con distinta frecuencia alimentaria semanal se apreciaron diferencias en la distribución de las poblaciónes, pues el coeficiente de variación del tamaño de los individuos de 6M (12.9%) resultó claramente inferior al encontrado en los otros tres tratamiento (15.5 a 17.%) es apenas 90 días de experimento. Así pues, la misma frecuencia alimentaria que resultaba algo más favorable en base a datos de crecimiento y aprovechamiento de la dieta y composición corporal, sería la más adecuada para obtener una distribución de pesos más homogénea. Aunque los datos de coeficiente de variación presentados en los distintos lotes no son aún alarmantes, no olvidemos que se han originado durante sólo 90 días por lo que es previsible que, con el paso del tiempo, las diferencias fueran amentando especialmente en los lotes alimentados 5 días a la semana lo que podría provocar la acentuación de esos fenómenos de jerarquía/dominancia a la hora del reparto del alimento entrando en un bucle de agravamiento del problema, sólo neutralizable, en parte, mediante selecciones frecuentes de animales por tamaños y traslados, tarea que demanda dedicación de personal y suele afectar notablemente a los peces que la sufre. Ya en 1977, Grayton y Beamish describieron que una ración restringida al 2% proporcionaba un patrón de crecimiento más homogéneo entre individuos, cuando se comparaba con un sistema de alimentación a saciedad. Para comprobar la posibilidad de una progresiva adaptación metabólica a las diferentes frecuencias alimentarias como una influencia en la disponibilidad de alimento (Sullivan y Somero, 1983), se ha realizado el estudio de diversas actividades enzimáticas 226 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. hepáticas y musculares indicativas del estado metabólico de los peces (tablas VI.3.6. y VI.3.7.) en distintos tiempos de cultivo (0, 45 y 90 días), dada la posibilidad de que puedan suponer alteraciones con consecuencias negativas sobre la rentabilidad del cultivo a largo plazo. Se ha comprobado que el metabolismo intermediario de los peces puede adaptarse a factores como la actividad física (Lushchak et al., 2001) o los ciclos de luz/oscuridad (Polakof et al., 2007) y, sobre todo, a aspectos de la estrategia alimentaria como son la composición de la dieta y su contenido en energía (Regost, 2001; Suárez et al., 2002; Kolditz et al., 2008; Moreira et al., 2008; Pérez Jiménez et al., 2009; Enes et al., 2009), el ayuno o la restricción del alimento (Shikata et al., 1993; Navarro y Gutiérrez, 1995; Regost, 2001; Pérez Jiménez et al., 2007) o la reducción de la frecuencia alimentaria (Nakagawa et al., 1995). El hígado es el órgano de mayor importancia en el metabolismo intermediario, ya que en él se centralizan los sistemas de almacén y/o distribución de los nutrientes y de la energía (Gatlin, 2010). En este estudio se observó una inhibición de la mayoría de las enzimas cuya actividad se midió en los peces alimentados 5 días a la semana, posiblemente motivada por una estrategia de ahorro de las reservas energéticas como respuesta al hecho de no obtener alimento todos los días. Los cambios se produjeron de forma secuencial, a los 45 días de cultivo se detectó una disminución de prácticamente todas las actividades enzimáticas en las corvinas 5M y 5T; a los 90 días se habían recuperado los valores en las corvinas 5T mientras que las 5M seguían mostrando valores inferiores al resto de los tratamientos. Efectivamente, las actividades de CS y HOAD fueron significativamente inferiores en las corvinas alimentadas 5 días. La actividad enzimática CS es indicativa de la tasa de metabolismo aeróbico, puesto que todas las vías de degradación dan como producto final los sustratos o los intermediarios del ciclo de Krebs, del cual este enzima forma parte, mientras que la HOAD está implicada en el catabolismo de los lípidos (βoxidación). Estudios realizados en dentón (Morales et al., 2004) y pez lobo (Lamarre et al., 2007) sometidos a ayuno mostraron una activación significativa de estos dos enzimas debido posiblemente a la movilización de la grasa de depósito y generación de acetil-CoA y su utilización en el ciclo de Krebs. Sin embargo, otros autores encontraron una disminución en la actividad de estos dos enzimas en peces ayunados (Foster y Moon, 1991), lo que fue interpretado como una reducción de la tasa metabólica hepática en respuesta a la privación de alimento ya que estos dos enzimas se consideran indicativas (sobre todo la CS, Tripathi y Verma, 2003) de la tasa metabólica general del pez. 227 Sergio García Mesa Así, aunque la falta de alimentación durante dos días a la semana no significa una verdadera situación de ayuno y, por lo tanto, no es suficiente para inducir un cambio metabólico global y amplio en los peces, es posible que los que no reciben alimento todos los días, especialmente 5M y 5T, hayan adaptado su metabolismo a una situación parecida a la del ayuno y hayan desarrollado una estrategia de ahorro energético similar a la comentada anteriormente. Análogamente, la PK, enzima clave que cataliza la última etapa de la glucolisis, muestra una disminución significativa de su actividad en hígado de trucha y dorada en situaciones de ayuno (Metón et al., 1999, 2003; Kirchner et al., 2003) y una lenta recuperación durante la realimentación (Metón et al., 2003). Esto coincide con los menores niveles de actividad PK encontrados en los lotes de corvinas alimentados 5 días a la semana y pueden reflejar una utilización preferencial de los carbohidratos del alimento para recuperación de los niveles de glucógeno agotados en los días de ayuno más que para obtención de energía, lo cual podría suceder pues en estos mismos tratamientos se observa una mayor actividad gluconeogénica (FBPasa) y los niveles de glucógeno hepático son bastante similares entre tratamientos. El contenido en glucógeno hepático es ligeramente superior en estos peces a los 45 días. La importancia del glucógeno como fuente de energía durante el ayuno varía según la especie. Algunas, como lubina, dorada o trucha, lo consumen durante la primera fase de ayuno y lo recuperan rápidamente durante los primeros días de la realimentación (Navarro y Gutiérrez, 1995; Metón et al., 2003; Soengas et al., 2006; Pérez-Jiménez et al., 2007), pero otras, como la carpa, anguila americana y salmón atlántico utilizan preferentemente los almacenes lipídicos durante el ayuno mientras que el glucógeno no se modifica (Sundby et al., 1991). El mantenimiento de la concentración de glucosa plasmática y de los niveles de glucógeno hepático en las corvinas podría indicar que pertenecen a este último grupo. Diversos autores han observado en peces en ayunas una marcada disminución en la actividad de los enzimas de la vía de las pentosas fosfato, G6PDH y 6PGDH (Hung et al., 1997; Shimeno et al., 1997), lo que conlleva un descenso en la síntesis de lípidos por no contar la célula con suficiente poder reductor en forma de NADPH (Vigliano et al., 2002). Las corvinas alimentadas todos los días (7M) mostraron valores altos de la actividad G6PDH junto con un mayor contenido lipídico corporal y altos niveles de lípidos circulantes. En comparación con ellas, se observó una disminución de la actividad de esta enzima y del contenido lipídico corporal en las corvinas 6M (tabla VI.3.3.), pero este no fue el caso de los lotes alimentados 5 días a la semana, que mostraron valores similares a las 7M. Nos resulta complicado explicar esta situación. Es posible que la mayor ingesta de estos peces durante los días en que sí se alimentan con respecto a los 228 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. otros lotes haya provocado una alta actividad lipogénica dada la limitada capacidad de los hepatocitos para usar ácidos grasos para provisión de energía (Vigliano et al., 2002). Esta supuesta mayor tasa de síntesis de lípidos coincide con un mayor contenido en lípidos corporales al final del experimento, probablemente acumulados en hígado o en forma de grasa perivisceral; sin embargo, los niveles de lípidos circulantes en estas corvinas son inferiores a los de las demás, lo que podría reflejar una mayor captación de estos metabolitos desde el torrente sanguíneo. Los menores valores de lípidos corporales medidos en las corvinas 6M así como la menor actividad G6PDH en las mismas podrían ser reflejo de una frecuencia de alimentación más favorable para los animales. La corvina es un pez magro que, incluso cuando se alimenta con piensos de alto contenido lipídico, no muestra tendencia a modificar su grasa corporal (Piccolo et al., 2008), por lo tanto, una elevada tasa de síntesis de lípidos en esta especie puede ser indicio de un desequilibrio nutricional; de hecho, se ha relacionado frecuentemente el aumento en la síntesis de lípidos y su almacenamiento en el hígado o depósito perivisceral con una alimentación desequilibrada (Caballero et al., 2004). También Nakagawa et al., (1995) observaron inhibición de las actividades lipogénicas y disminución del depósito de lípidos en pargos alimentados con altas frecuencias de alimentación, que fueron las que mejores resultados de crecimiento produjeron. Las actividades enzimáticas mediadas en músculo (tabla VI.3.7.) mostraron tendencias diferentes a las observadas en hígado. La actividad CS, relacionada con la capacidad del pez para un ejercicio aeróbico sostenido (Hochachka y Somero, 1984), fue menor en este órgano en las corvinas 5M, 5T y 6M. Esta disminución coincide con un aumento en la tasa metabólica anaerobia, indicada por las mayores actividades de LDH, como proveedora de sustrato para la anterior, la PK. La activación de estoa enzimas está asociada a movimientos rápidos y vigorosos relacionados con la actividad alimentaria y que se realizan gracias al consumo del glucógeno muscular (Lushchak et al., 2001). Algunos autores las han utilizado como marcadores para el estudio del comportamiento alimentario de los peces de vida libre (Schulte et al., 2000), siendo más baja en peces que viven en aguas profundas con poca actividad locomotora (Sullivan et al., 1983). Los resultados de nuestro experimento muestran actividades más altas de estas dos enzimas en el músculo de las corvinas alimentadas 5 y 6 días a la semana con respecto a las alimentadas todos los días que, además, mostraron mayor contenido en glucógeno. La causa podría haber sido un mayor esfuerzo en la consecución de la cantidad de alimento deseado, fundamentalmente en las corvinas 5T que recibieron el 229 Sergio García Mesa alimento a una hora inusual, coincidiendo con una mayor actividad gluconeogénica (mayores valores de FBPasa) en estos peces. Algunos autores interpretan este aumento de actividad como un factor estresante que supone un consumo de energía extra y repercute negativamente en el crecimiento de los peces (Alanärä, 1992), lo que coincide con los peores resultados de crecimiento e índices de conversión detectados en los peces 5M y, sobre todo, en los 5T. En cuanto a los mayores valores de actividad HOAD, y por lo tanto, de degradación lipídica, mostrados por los peces 6M frente al resto de los tratamientos, contribuyen al menor contenido lipídico corporal de estos peces comentado en los apartados anteriores, que también puede estar motivado por los mayores valores observados para la actividad enzimática GDH. La firmeza (figura VI.4.1.) del músculo de los peces es uno de los principales parámetros de calidad ya que disminuye rápidamente después del sacrificio, además, es un índice del proceso de rigor post-mortem que tiene lugar en el músculo de estos animales. La disminución de la frecuencia de alimentación semanal tuvo efectos negativos sobre la firmeza del músculo de las corvinas, que fue menor en las alimentadas 5 días a la semana, independientemente de la hora. También se pudieron observar valores más altos de pH (figura VI.4.2.) al inicio de la conservación en el músculo de las corvinas 5M y 5T que en las 7M y 6M, sin embargo, estas diferencias se atenuaron a partir de las 48 hpm, no habiéndose observado influencia del tratamiento sobre este parámetro. La CRA de las corvinas (figura VI.4.3.) mostró valores muy similares para todos los tratamientos, solamente han sido estadísticamente superiores los correspondientes a las corvinas alimentadas 5 días a la semana por la tarde que, sin embargo, se igualaron al resto durante el almacenamiento. Uno de los factores más importantes que influyen en las características del músculo de los peces es la integridad de las proteínas miofibrilares (PMF) responsables de la contracción muscular. La disminución de la frecuencia de alimentación semanal provocó un aumento en el contenido de proteínas solubles (PSP) y de aminoácidos libres, y una disminución simultánea en el contenido de PMF en el músculo de las corvinas a las 24 hpm. Estas diferencias fueron escasas y, posiblemente debido a la dispersión de los datos, no significativas; sin embargo, pueden interpretarse como que dichas condiciones había aumentado ligeramente la susceptibilidad del músculo a la proteólisis. Esta mayor susceptibilidad a la proteólisis puede haber sido la causa de la menor firmeza y la mayor CRA observadas en las corvinas 5T. Estudios similares 230 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. realizados en otras especies de peces sí observan una disminución en el contenido de proteínas sarcoplásmicas cuando se disminuye el aporte dietario como ocurre en el salmón (Einen et al., 1999) o en el bacalao (Beaulieu y Guderley, 1998), si bien este consumo ocurre en periodos largos de ayuno o restricciones alimentarias intensas. 7M Firmeza (N) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 24 6M 5M 5T 48 72 96 120 Tiempo (horas post-morten) 144 Figura VI.4.1. Evolución post-mortem de la firmeza del músculo de las corvinas alimentadas con distintas frecuencias alimentarias 7M 7.5 6M 5M 5T 7.0 pH 6.5 6.0 5.5 0 24 48 72 96 120 Tiempo (horas post-morten) 144 Figura VI.4.2. Evolución post-mortem del pH del músculo las corvinas alimentadas con distintas frecuencias alimentarias 7M 75 6M 5M 5T CRA 70 65 60 0 24 48 72 96 120 Tiempo (horas post-morten) 144 Figura VI.4.3. Evolución post-mortem de la capacidad de retención del agua (C.R.A.) del músculo las corvinas alimentadas con distintas frecuencias alimentarias 231 Sergio García Mesa También se ha podido observar una tendencia no significativa a disminuir el contenido de proteínas estructurales (PMF) durante el almacenamiento. Si atendemos a las PSP (tabla VI.3.11.), éstas se mantuvieron prácticamente inalteradas, mientras que el contenido en aminoácidos totales no siguió una tendencia clara. La disminución de las PMF (tabla VI.3.12.) se puede atribuir a la proteolisis de esta fracción durante el almacenamiento del pescado, que se refleja nuevamente en la disminución de la firmeza observada durante el almacenamiento en todos los tratamientos. Las proteínas sarcoplásmicas están constituidas principalmente por las implicadas en el metabolismo muscular (Picariello et al., 2006). Algunas de las bandas obtenidas en este ensayo coincidieron con las identificadas por Savage et al. (1990) y Picariello et al. (2006) en carne de cerdo: el péptido de 97 kDa lo identificaron con el enzima glucógeno fosforilasa; el de 58 kDa con la piruvato kinasa, el de 46 kDa con la enolasa, el de 43 kDa con la creatina kinasa, el de 40 kDa con la aldolasa, el de 38 kDa con la lactato deshidrogenada, el de 36 kDa con la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa y el de 16 kDa con la mioglobina. Chéret et al., (2006) las describieron de forma similar para el músculo de lubina. Otras bandas encontradas poseen una masa molecular relativa de 34, 27, 25, 21.5 y 17 kDa; por último se observaron también dos bandas de bajo peso molecular, 13 y 12 kDa. El patrón electroforético de estas proteínas (cuantificado en la tabla VI.3.11. y representado en la figura VI.3.1.) no se vio afectado por la frecuencia alimentaria. Tampoco se detectó una hidrólisis importante de las mismas durante el almacenamiento post-mortem, indicando una gran estabilidad de esta fracción proteica en la corvina. El papel que juegan estos enzimas en el metabolismo post-mortem no está aun suficientemente estudiado, y menos aún en el músculo de los peces. Con respecto a las PMF (figura VI.3.2. y tabla VI.3.12), las fracciones separadas por SDS-PAGE se han agrupado (de acuerdo con los valores encontrados en la literatura consultada) de la siguiente forma: cadena pesada de miosina (200 kDa), proteína C (146 kDa), actina (45 kDa), troponina-T (Tn-T, 38 kDa), una banda de 35 kDa y otra banda de 30 kDa. La banda de miosina ha sido la que ha contribuido de forma mayoritaria a la densidad óptica total de cada carril, con más del 30 %, seguida de las bandas actina y troponina-T, con algo menos del 30 % cada una. En el músculo de lubina se han descrito 8 bandas principales dentro de esta fracción proteica (Chéret et al., 2006), dos más de las observadas por nosotros en corvina: α-actinina (100 kD) y desmina (55 kD). También Michalczyk y Surowka (2007) identificaron en trucha arcoíris, además de las observadas en nuestro experimento, 232 Estudio de diferentes frecuencias de alimentación semanal en la corvina (Argyrosomus regius, Asso 1801). Implicaciones productivas, fisiológicas y sobre la calidad. otras fracciones con masas moleculares de 180 kDa (proteína M); 102 y 107 kDa (actinina); 39,5 kDa (-tropomiosina); 35.6 kDa (-tropomiosina); y una serie de bandas desde 35 a 17.6 kDa que identificaron con la cadena ligera de miosina. Las dos bandas ausentes en nuestros geles, α-actinina (100 kD) y desmina (55 kD), se han encontrado en dorada (Suárez et al., 2009a, 2010) y en dentón (Suárez et al., 2009b). A diferencia de lo observado para las PSP, la frecuencia de alimentación semanal sí ha tenido una influencia importante sobre el perfil electroforético de esta fracción proteica, que podría ser responsable de los menores cambios observados en las propiedades texturales. Así, las corvinas alimentadas 5 días a la semana mostraban valores inferiores para la banda de 146 kDa con respecto a los encontrados en las alimentadas 6 y 7 días. También las corvinas 5T exhibieron alteraciones en la proporción relativa de las bandas de miosina y de actina cuando se comparan con los demás tratamientos, mientras que las 5M las mostraron en las bandas de 38 (troponina-T) y 35 kDa. El principal cambio en el patrón electroforético de las PMF durante el almacenamiento post-mortem fue la aparición de una banda de 30 kDa a las 144 hpm que coincidió con la disminución significativa de la DOR de la banda de 35 kDa. También se ha observado una disminución significativa de la banda de miosina en las corvinas 6M y 5M y de la Proteína C en 6M y un aumento de la misma en 5T y 5M, que podría estar relacionado con la menor ingesta de alimento aunque estudios realizados en cabritos mostraron una importante degradación de la proteína C y α-actinina cuando se sometieron a restricción dietaria (Almeida et al., 2004). Esto se puede relacionar con el mayor esfuerzo en la consecución de la cantidad de alimento deseado, interpretado como un factor estresante. Diversos autores han indicado que tanto la desmina (55 kDa) (Koohmaraie et al., 1995) como la troponina T (38 kDa) (Huff-Lonergan et al., 1996) son fragmentos proteicos sensibles a la degradación post-mortem y numerosos estudios han mostrado, en el músculo de la mayor parte de las especies, la aparición de un péptido de 30 kDa durante el almacenamiento post-mortem, hasta el punto de haber sido considerado por muchos autores como índice de proteolisis muscular (Nagaraj et al., 2005) y, por lo tanto, de ablandamiento de la carne (Olson et al., 1977). En salmón, Geesink et al., (2000) también identificaron la aparición de un producto de 31 kDa en el precipitado obtenido a partir de miofibrillas del músculo durante el almacenamiento en refrigeración; también Ladrat et al., (2003), observaron la degradación de la troponina T de la lubina por las catepsinas B y L y que aparecía la banda de 30 kDa. En cambio, 233 Sergio García Mesa Toyohara et al., (1990) encontraron un producto de la degradación de 38 kDa como marcador de la textura de la trucha. En nuestro experimento, a las 24 hpm no se ha podido apreciar la banda de desmina y a las 144 hpm no se han observado cambios en la troponina T frente a los valores observados a las 24 hpm, ambas circunstancias podrían ser debidas a la degradación de estos componentes con anterioridad a la realización de los análisis. Sin embargo, la aparición del péptido de 30 kDa a los 6 días de almacenamiento indica la proteólisis de componentes musculares con posterioridad a las 24 hpm. VI.5. RESUMEN Frecuencias alimentarias de 5, 6 o 7 días por semana, con una ración semanal idéntica, parecen tener relativamente poca influencia sobre el crecimiento y la utilización de la dieta en las corvinas en cultivo. No obstante, el régimen de 6 días alimentación:1 día de ayuno puede ser considerado más favorable desde el punto de vista del crecimiento y la composición corporal, además del posible ahorro que supondría en personal. La introducción de dos días seguidos de ayuno por semana provoca algún efecto en el metabolismo hepático de los peces en línea con una respuesta a este ayuno parcial que, a la larga, puede afectar negativamente al crecimiento, la composición corporal y la firmeza del músculo de los peces. Pequeños cambios detectados en el metabolismo del músculo de los peces alimentados 5 días a la semana por la tarde pueden ser consecuencia de la novedad que supone el horario para estos peces, que con anterioridad se habían alimentado por la mañana, y que muestran signos que pueden estar asociados a condición de estrés, lo que implica peores índices productivos en comparación con los lotes alimentados con la misma frecuencia pero por la mañana. Se ha podido describir por primera vez el perfil electroforético de las proteínas musculares de la corvina, habiéndose encontrado algunas alteraciones en el de las proteínas miofibrilares que se reflejan en una menor firmeza y alteraciones en las propiedades de retención de agua precisamente en los peces de los lotes 5T. 234 VII. Conclusiones 1.- Los índices de crecimiento obtenidos, durante las primeras etapas de una prueba piloto de cría de corvina en jaulas, son claramente inferiores a los reportados por experiencias anteriores con la misma especie lo que podría atribuirse a diversas circunstancias como “calidad” de las remesas de juveniles, condiciones ambientales adversas y/o algún fallo en las prácticas de producción utilizadas. No obstante, el que nuestros índices estén en línea con los publicados por otros grupos de investigadores, nos hace pensar que se debe actuar con prudencia a la hora de emprender una explotación comercial masiva de esta especie y que sería necesaria más investigación sobre estos asuntos. 2.- La corvina se ha revelado como un pez magro que mantiene un reducido acúmulo de grasa en su porción comestible (músculo) pese a ser alimentada durante el cultivo con piensos ricos en grasa. Esto significa una peculiaridad metabólica con respecto a otras especies que cabria explorar en profundidad. Por otra parte, el perfil de ácidos grasos de los lípidos musculares de la corvina sufre cambios importantes a lo largo del ciclo de cultivo tendiendo a concluir con el de las grasas del pienso que recibe; pese a ello, se mantienen unos índices de calidad lipídica satisfactorios. 3.- La actividad digestiva de la corvina presenta unas relativamente altas actividades proteásica y amilásica, superiores a la lipásica, aunque, sorprendentemente, la proteasa intestinal muestra valores inferiores a los otras especies cultivadas. Pese a ello, podemos deducir que esta especie tiene una buena capacidad para digerir sobre todo los componentes proteicos e hidrocarbonados de la dieta, conocimento que puede resultar útil para el diseño de futuros piensos específicos. 4.- En base a los índices de crecimiento y utilización del alimento obtenidos, una ración diaria de 1.1% del peso corporal se ha mostrado más favorable que una inferior (0.6%) o superior (1.6%) en corvinas durante las etapas iniciales de engorde. 5.- A partir del análisis de las actividades enzimáticas metabólicas correspondientes, se detecta un efecto del volumen de la ingesta diaria de alimento sobre el uso preferencial de ciertos sustratos energéticos; carbohidratos para la ración más reducida y proteínas para la más elevada, lo que supone, en este último caso, un menor uso de este nutriente con fines plásticos y, por lo tanto hace desaconsejable el uso de raciones muy altas salvo en casos de una extrema necesidad de conseguir crecimientos máximos. 6.- Situaciones como la restricción del tamaño de la ración o el cambio en los horarios habituales de alimentación suponen una mayor dependencia del músculo de estos peces con respecto a la ruta metabólica anaeróbica, probablemente debido a que ambas 235 Sergio García Mesa situaciones entrañan una mayor frecuencia de episodios de natación intensa y repentina. 7.- Durante el ayuno prolongado la corvina pierde peso en menor proporción que otras especies próximas lo que parece conformar la posesión de ciertas peculiaridades metabólicas. La realimentación posterior induce un episodio de crecimiento compensatorio que, en nuestro caso, se debe achacar a un mejor uso del alimento ya que se basó en una ración prefijada lo que descarta el posible papel de una hiperfagia compensadora. 8.- En cualquier caso, el ayuno provoca una clara movilización de proteínas y lípidos al mismo tiempo que se mantienen las rutas gluconeogénicas. La realimentación posterior supone la rápida recuperación de las reservas citadas y un retorno de la actividad de los enzimas implicados en el metabolismo intermediario a los valores previos, algo más lenta en el músculo que en el hígado. 9.- Tanto la restricción alimentaria parcial (ración subóptima) como total (ayuno) afectan al balance del proceso ataque prooxidante/defensa antioxidante aunque de forma diferente. El ataque prooxidante en individuos que reducen parcialmente el aporte de alimento es neutralizado por una activación general de las defensas antioxidantes. En cambio, durante el ayuno total y aunque el descenso de la tasa metabólica global podría significar una menor generación de radicales libres, la situación de precariedad energética extrema provoca un debilitamiento generalizado de las citadas defensas por lo que, en este caso, sí que se genera daño oxidativo. La realimentación revierte rápidamente dicha situación, desapareciendo los indicios de dicho daño. 10.- Si los peces reciben una ración semanal total predeterminada, el que ésta se distribuya en 5, 6 ó 7 días, parece tener poco efecto, si bien, los ligeramente mejores índices de crecimiento y utilización del alimento obtenidos cuando se incluye un día de ayuno a la semana, unidos a la reducción de costes y mejora de la calidad del medio que dicha maniobra presumiblemente entraña, la podrían hacer aconsejable en piscifactorías. 11.- Cuando la frecuencia alimentaria se basó en la introducción de 2 días de ayuno a la semana, se detectaron algunos efectos sobre la composición corporal y las propiedades texturales de los peces, lo que puede afectar negativamente a su aceptación por los consumidores. 236 VIII. BIBLIOGRAFÍA. Abele, D. y Puntarulo, S. 2004. Formation of reactive species and induction of antioxidant defense systems in polar and temperate marine invertebrates and fish. Comp. 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ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PECES Y PIENSOS ................... 6 IX.2.1. Composición bioquímica elemental. ............................................................................. 6 IX.2.2. Determinación del contenido en lípidos y perfil de ácidos grasos en piensos y peces. 7 IX.2.3. Determinación del perfil de aminoácidos en muestras de piensos. .............................. 9 IX.3. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS SANGUÍNEOS ......................................... 10 IX.3.1. Hemograma (constantes eritrocitarias) ....................................................................... 10 IX.3.2. Bioquímica sanguínea .................................................................................................. 11 IX.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DIGESTIVAS ........................ 12 IX.4.2. Determinación de la actividad tripsina. ....................................................................... 15 IX.4.3. Determinación de la actividad quimotripsina.............................................................. 15 IX.4.4. Determinación de la actividad α-amilasa. ................................................................... 16 IX.4.5. Determinación de la actividad lipasa. .......................................................................... 17 IX.4.6. Determinación de la proteína soluble. ........................................................................ 17 IX.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS EN HÍGADO Y MÚSCULO. ... 18 IX.5.1. Determinación de las actividades de enzimas del metabolismo intermediario. ......... 19 IX.5.2. Determinación de parámetros y enzimas indicadoras del estrés oxidativo ................ 28 IX.5.3. Determinación de glucógeno tisular ............................................................................ 34 IX.6. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE CALIDAD DEL MÚSCULO. ................... 36 IX.6.1. Determinación de la firmeza. ...................................................................................... 36 IX.6.2. Determinación del pH. ................................................................................................. 36 IX.6.3. Determinación de la capacidad de retención de agua (CRA) ...................................... 37 IX.6.4. Extracción de proteínas sarcoplasmáticas y iofibrilares. ............................................. 37 IX.6.6. Determinación del contenido de aminoácidos. ........................................................... 39 IX.7.6. Técnica de electroforesis SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio) ....................................................................................................................... 39 IX.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................................. 40 1|Anexo Metodología IX.1. ÍNDICES BIOMÉTRICOS, DE CRECIMIENTO Y DE UTILIZACIÓN DE LA DIETA Para su determinación es preciso, en unos casos, sedar a los animales y, en otros, proceder a su sacrificio. Para ello se siguió el protocolo indicado en la directiva 2010/63/EU del European Council, tras lo cual se hicieron, en cada caso, medidas de longitud y peso de distintas secciones corporales. En el caso de los muestreos a pie de jaula (experimento II.1.) los animales se sacrificaron por choque térmico, sumergiéndolos en agua con hielo. IX.1.1. Índices biométricos Para la determinación de los índices biométricos individuales se usaron ictiómetros, con aproximación a 1 mm, y balanzas, con aproximación a 0.01 g. Las medidas de las diferentes zonas corporales de interés se hicieron según la figura IX.1.1. LONGITUD ÁGIL ALTURA MÁXIMA CABEZA LONGITUD ESTÁNDAR LONGITUD TOTAL Figura IX.1.1. Esquema de las medidas de longitud determinadas en la corvina A partir de las medidas indicadas y del peso de los animales se determinaron: Índice de Condición (K) Se calcula como la relación entre el peso y la longitud de los animales 2|Anexo Metodología Perfil Relativo (PR) Relaciona la altura máxima y la longitud total Índice de Agilidad (IA) Expresa la relación entre longitud, descartadas cabeza y cola, y la altura. siendo la longitud ágil, la distancia entre en plano de la altura máxima y el pedúnculo de la aleta caudal. Índice Cefálico (IC) Relaciona la longitud de la cabeza con la longitud total del pez En algunos peces, tras su sacrificio y disección, se pesaron distintas fracciones corporales, cabeza, paquete visceral, hígado, tracto digestivo y el filete del lado derecho, eliminando previamente la piel. Con estos datos se determinaron los índices: Índice Cráneo-Somático (ICS) Indica la relación porcentual existente entre el peso de la cabeza y el peso corporal. Índice Víscero-Somático (IVS) Indica la relación porcentual existente entre el peso del paquete visceral y el peso corporal, entendiéndose como paquete visceral el conjunto de tracto digestivo, hígado, vejiga natatoria y bazo. Índice Hepato-Somático (IHS) Indica la relación porcentual existente entre el peso del hígado y el peso corporal. 3|Anexo Metodología Índice Digesto-Somático (IDS) Indica el porcentaje existente entre el peso del tracto digestivo y el peso corporal Rendimiento del Filete (RF) Expresa el porcentaje que significa el peso del filete lateral en el peso total del pez. Es una estimación indirecta de la fracción comestible del animal. Puesto que en nuestras determinaciones sólo hemos pesado el filete lateral derecho, para obtener el porcentaje de fracción comestible multiplicamos por 2. IX.1.2. Índices de crecimiento y utilización de la dieta. Estos índices se calculan con los datos de crecimiento y composición de un número amplio de animales de cada lote experimental, por lo que son considerados representativos del lote en cuestión y se relacionan, cuando es preciso, con la cantidad de pienso ingerida por la totalidad del lote pues es imposible determinar la ingesta de cada pez individual. Ganancia Absoluta de Peso (GAP) La ganancia de peso se calcula como la diferencia entre el peso final y el peso inicial del lote o del individuo. Incremento Relativo de Peso (IRP) Se calculó como el porcentaje que la ganancia de peso representa del peso inicial. Tasa de Crecimiento Específico (TCE, en inglés SGR) Refleja el porcentaje de crecimiento diario de los animales y se calcula a partir de los pesos inicial y final de los peces y la duración (días) del experimento 4|Anexo Metodología Coeficiente de crecimiento térmico (CCT) Estima el crecimiento de los peces según el perfil térmico. Donde Pf es el peso final, Pi es el peso inicial y es la suma de la temperatura media diaria, dentro del período considerado, restada en 10 ⁰C, ya que a temperaturas por debajo de 10⁰C el animal no crece, si no que se mantiene, según Cho (1992). Tasa de Conversión de Alimento (TCA, en inglés FCR) Es un índice de conversión del alimento ingerido en biomasa. Se calcula por el cociente entre el alimento ingerido y la ganancia absoluta de peso Tasa de Eficiencia Alimentaria (TEA, en inglés FER) Evalúa la eficiencia de la dieta para promover el crecimiento de los animales. Se calcula por el cociente entre la ganancia absoluta de peso y el alimento ingerido, por lo que equivale a la inversa del índice anterior Coeficiente de Eficiencia Proteica (CEP, en inglés PER) Es un índice de aprovechamiento de la proteína para crecimiento que se calcula a partir de los valores de ganancia de peso y de proteína ingerida durante el periodo experimental. Valor Productivo de la Proteína (VPP) Es un índice del aprovechamiento proteico pues relaciona porcentualmente la ganancia de proteína corporal o proteína retenida con la proteína ingerida. 5|Anexo Metodología IX.2. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PECES Y PIENSOS IX.2.1. Composición bioquímica elemental. Los métodos que se describe en este apartado se aplicaron a muestras de piensos, peces enteros o fracciones corporales de los mismos, previamente almacenados en frío. En esencia, estos análisis se realizaron de acuerdo con los métodos establecidos por la AOAC (2006). Humedad El contenido de agua de una muestra se determina a partir de la diferencia de peso de la misma antes y después de su desecación en la estufa a 105 °C, hasta peso constante. Tras esta desecación, algunas muestras fueron trituradas con un molino mecánico para obtener una harina homogénea, que se almacenó en botes herméticamente cerrados, hasta la realización de análisis adicionales correspondientes. Cenizas Por incineración de la muestras en horno-mufla (Heraeus) a 500 °C, 12 horas, que provoca la desaparición de la materia orgánica, quedando como remanente las cenizas. Proteínas El análisis del contenido proteico se realiza por el método Kjeldahl, mediante la digestión ácida de la muestra con ácido sulfúrico al 96%, utilizando como catalizador una mezcla de sulfato potásico, sulfato cúprico y selenio (100:6:1), en un digestor NitroKjel Dra. Una vez enfriada la muestra, se lleva a un matraz de 100 mL enrasando con agua destilada. Tras la destilación de un volumen de muestra junto con NaOH al 40%, el amoniaco formado se recoge en un matraz que contiene 10 mL de indicador Büchi. Finalmente el destilado se valora con ácido clorhídrico 0.01N. Como factor de conversión del nitrógeno a proteína se emplea 6.25. Grasas La grasa contenida en la muestra se determina gravimétricamente por el método Soxhlet, mediante un aparato (BUCHI 810) de extracción continua con éter dietílico. Las muestras se colocan en cartuchos de papel de filtro con SO4Na2 anhidro para facilitar la desecación de las mismas y se someten a ciclos de extracción continua de la fracción lipídica. 6|Anexo Metodología MELN (Material Extractivo Libre de Nitrógeno) El cálculo del contenido en MELN (asimilable, en primera instancia al de hidratos de carbono) se basó en la diferencia entre 100 y la suma de los valores correspondientes de proteínas, lípidos y cenizas, según la siguiente expresión: IX.2.2. Determinación del contenido en lípidos y perfil de ácidos grasos en piensos y peces. Determinación de lípidos totales Fundamento Para la determinación de los lípidos totales se utiliza el método de Folch (1957). Reactivos Mezcla extractora, cloroformo:metanol (2:1) (v/v) Solución de HCl 0.1N Solución de MgCl2 0.5% Procedimiento A unos 150 mg de harina obtenida por trituración del pienso y/o los peces previamente desecados, se añaden 3 mL de una mezcla extractora cloroformo:metanol 2:1 (v/v). Posteriormente se añaden 3 mL de HCl 0.1 N y 0.3 mL de MgCl 2 0.5 % para que se produzca la precipitación de las proteínas. Después de agitar y centrifugar (2000 xg, 5 min) se separa el extracto lipídico usando una pipeta Pasteur. Sobre el residuo obtenido, se realiza una segunda extracción, reuniendo la fase orgánica resultante con la obtenida anteriormente en un tubo previamente tarado que se lleva a una estufa (2 días, 45 °C) para evaporar el disolvente. Tras enfriamiento, se vuelve a pesar el tubo, obteniendo por diferencia el peso de los lípidos totales contenidos en la muestra seca. Determinación del perfil de ácidos grasos Fundamento Los ácidos grasos se metilan usando el método de Rodríguez-Ruiz et al., (1998) y, posteriormente, se separan e identifican en un cromatógrafo de gases. Para la identificación de picos se utiliza un estándar comercial (Sigma, Aldrich). Reactivos N-hexano Mezcla metilante: metanol:cloruro de acetilo 20:1(v:v) 7|Anexo Metodología Ácido heptadecanoico (C17:0)10 mg/mL Procedimiento Para la determinación del contenido en ácidos grasos de músculo del pez y del pienso, se parte de liofilizados de los mismos. En tubos de ensayo con tapón de rosca se pesan aproximadamente 20 mg de muestra a los que se añade 1 mL de n-hexano tapándolos inmediatamente para evitar la evaporación de éste. A continuación se añaden a cada tubo 100 L de una disolución de patrón interno (ácido heptadecanoico, C17:0). Seguidamente, se adiciona a cada tubo 1 mL de mezcla metilante, volviendo a tapar los tubos, que se colocaron en un thermoblock a 100 °C durante 30 minutos. El papel de la mezcla metilante en las condiciones de reacción anteriores consiste en fragmentar los triglicéridos en glicerol y ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs). Estos FAMEs son los que posteriormente serán identificados y cuantificados por cromatografía gas-líquido (GLC). Una vez concluida la metilación, y tras dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente, se añade 1 mL de agua destilada con el objetivo de limpiar la fase hexánica y arrastrar las posibles impurezas. Posteriormente, se procede a centrifugar los tubos (9000 rpm, 5 min) para eliminar impurezas de tipo físico, se extrae la fase hexánica que contiene los FAMEs de las muestras y del patrón interno y se introducen y concervan en viales numerados para su análisis cromatográfico posterior. Se realizan tres extracciones adicionales con hexano para asegurar el completo arrastre de los FAMEs. Análisis cromatográfico El equipo utilizado fue un cromatógrafo de gases HP modelo 5890 serie II (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA) equipado con un autoinyector (modelo HP 6890) y un detector de ionización de llama (FID). La separación de los FAMEs se lleva a cabo en una columna capilar Omegawax 250 (30 m x 0.25 mm d.i. x 0.25 μm de grosor de película (Supelco, Bellefonte, PA, USA). La temperatura inicial del inyector es de 250 °C y se aplica una rampa de 6 °C /min hasta 240 °C (9 min), calentando un período total de 25 min. Se emplea una relación de split 50:1 y nitrógeno (flujo de 1 mL/min) como gas portador. Usando una mezcla estándar de ácidos grasos (Sigma, Aldrich) se determina el tipo de FAME, comparando con el tiempo de retención del estándar. Los valores de ácidos grasos se expresan como % de los lípidos totales. Índices de calidad lipídica A partir de los datos de composición en ácidos grasos se calculan (Senso et al., 2007): Índice aterogénico (IA): estudia la relación que existe entre la suma de los principales ácidos grasos saturados (14:0 y 16:0) y la suma de los principales PUFAs n-3 (EPA y DHA), siendo los primeros considerados pro-aterogénicos (favorecen la adhesión de los lípidos a células de los sistemas inmunológico y circulatorio) y los segundos anti-aterogénicos (inhiben la agregación plaquetaria y disminuyen los niveles de ácidos grasos esterificados, colesterol y fosfolípidos, lo que previene la aparición de enfermedades micro y macrocoronarias). 8|Anexo Metodología Índice de trombogenicidad (IT): de alguna forma predice la tendencia que existe a la formación de coágulos de sangre en los vasos sanguíneos. Se define como la relación que existe entre los ácidos grasos considerados “pro-trombogénicos” (saturados) y los “antitrombogénicos” (MUFAs, PUFAs n-6 y PUFAs n-3). Calidad de los lípidos del pescado (CLP): es la relación en la que los principales PUFAs n3 (EPA y DHA) aparecen en el músculo respecto a la totalidad de los lípidos. Cuanto mayor sea el valor de este índice, mayor es la calidad de la fuente lipídica de la dieta. IX.2.3. Determinación del aminograma en muestras de piensos. Fundamento El contenido en aminoácidos se determinó mediante el método de AccQ-Tag, que se basa en el uso de un reactivo de derivatización desarrollado específicamente para el análisis de aminoácidos, el reactivo AccQ-Fluor de la firma comercial Waters. Se usa ácido γ-aminobutírico como patrón interno. Reactivos Ácido clorhídrico 6N Ácido γ-aminobutírico 2.5 mM Kit AccQ-Fluor, constituido por 6-Aminoquinolil-N-Hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) diluido en acetonitrilo y disolución tampón borato sódico 0.2 mM, pH 8.8 Procedimiento Se hidrolizan las muestras (50 mg) con 10 mL de HCl 6 N en atmósfera libre de oxígeno (usando nitrógeno gaseoso) en estufa a 112 °C durante un período de 22 horas. Tras la digestión ácida, se incorporan 5 mL de ácido α-aminobutírico 2.5 mM, y se lleva a un volumen de 50 mL con HCl 25 mM; la mezcla se filtra, con ayuda de vacío, por un tamaño de poro de 0.45 mm. De la mezcla se toman 2 alícuotas de 100 μL que son liofilizadas hasta su análisis. El análisis se inicia con la reacción de derivatización de las muestras, añadiendo 20 μL de la solución AQC a 20μL de la mezcla prederivatización previamente mezclados con 60 μL de la disolución tampón de borato sódico. Así, los aminoácidos forman un compuesto altamente estable y fluorescente a 345 nm. El equipo de cromatografía líquida utilizado fue un sistema Waters mod. 2695 (Milford, MA, USA) constituido por: horno de columna termostatizado, bomba Waters 600, inyector automático Waters 717, detector de fluorescencia (Waters 474) y detector de diodos (Waters 9|Anexo Metodología 996). La columna es Luna Cl8 250 x 4.6 mm. La detección se llevó a cabo por fluorescencia (λ de excitación: 250 nm y λ de emisión: 345 nm). La identificación y cuantificación de los aminoácidos se realiza por comparación con los tiempos de retención del estándar AA 18 de Sigma-Aldrich. IX.3. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS SANGUÍNEOS La sangre se extrajo de la vena caudal de peces, previamente sedados, con jeringas heparinizadas y se conservó en condiciones de frío en tubos heparinizados. Tras separar las alícuotas correspondientes para determinación de hematocrito, recuento eritrocitario y contenido en hemoglobina, se procede, en el resto de la muestra, a la separación del plasma de los glóbulos rojos mediante centrifugación (2500 rpm, 10 min). El plasma sobrenadante se separa y se almacena a -20 °C hasta posterior análisis. IX.3.1. Hemograma (constantes eritrocitarias) Hematocrito El índice hematocrito, que expresa el procentaje que el volumen de glóbulos rojos significa del total de sangre, se determina por centrifugación de la sangre en microcapilares ( 3000 rpm, 10 min). Posteriormente, se miden las longitudes de la banda de glóbulos rojos separada de la fracción plasmática y la del total de la sangre en el capilar y se calcula la relación porcentual entre ellas. Hemoglobina Para la determinación de la concentración de hemoglobina se emplea un kit comercial basado en el método colorimétrico de la cianmetahemoglobina utilizando el reactivo de Drabkin. La hemoglobina, en presencia de ferrocianuro, se oxida a metahemoglobina que, a su vez, reacciona con iones de cianuro a pH 7.2 para dar cianmetahemoglobina (Drabkin y Austin, 1935). La absorbancia de la muestra, proporcional al contenido en hemoglobina de la misma, se mide a 540 nm y los resultados se expresan en g/dL. Recuento de eritrocitos Para realizar el recuento de glóbulos rojos se realiza previamente una dilución de la muestra de sangre con solución isotónica de Hendrick (1:200). La muestra diluida se situa en una cámara de recuento de Neubauer al microscopio, contabilizando el número de glóbulos rojos por unidad de superficie de la misma. 10 | A n e x o M e t o d o l o g í a Donde A es el número de células contadas, v el volumen de sangre diluida situada sobre cadal cuadrado de la cámara de recuento (2.5·10-4 mm3), n el número de cuadros contados y f el factor de dilución. Índices hematológicos A partir de las anteriores constantes eritrocitarias se calcularon: Volumen Corpuscular Medio (VCM): indica el volumen promedio de un glóbulo rojo. Hemoglobina Corpuscular Media (HCM): expresa el contenido de hemoglobina que, por término medio, hay en cada eritrocito. Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM): indica la fracción del volumen eritrocitario ocupado por la hemoglobina. IX.3.2. Bioquímica sanguínea (plasma) Glucosa La determinación de la glucosa se lleva a cabo usando un kit comercial de diagnóstico (Labkit, 30236) basado en el método enzimático colorimétrico GOD-POD (Trinder, 1969). Este método utiliza las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogensa. La abosorbancia de la muestra se midió a 505 nm frente a blanco de reactivo. Se usa una solución patrón de concentración conocida y los resultados se expresan en mg/100 mL. Lípidos totales La determinación de los lípidos totales se realiza utilizando un kit comercial (Labkit, 30345), basado en el método colorimétrico de la sulfafosfovainillina (Cottet y Etienne, 1965) y compuesto por dos reactivos, H2SO4 y fosfovainillina, y una solución estándar de concentración lipídica conocida. Los lípidos insaturados de la muestra forman iones carbonio al reaccionar con el ácido sulfúrico a alta temperatura. Éstos producen, en presencia de la fosfovainillina, una coloración 11 | A n e x o M e t o d o l o g í a rosada cuya intensidad es proporcional a la concentración de lípidos presentes en la muestra, valorada a 520 nm frente a blanco de reactivo. Los resultados se expresan en mg/100 mL. Triglicéridos Se utiliza un kit comercial para diagnóstico (Labkit, 30360), siguiendo un método enzimático colorimétrico GOD-POD (Buccolo y David, 1973), Los triglicéridos de la muestra, al ser tratados con una lipasa, liberan glicerol y ácidos grasos. El glicerol por una serie de reacciones libera H2O2, el cual, a través de la acción de una peroxidasa, genera 4-aminofenazona y pclorofenol que producen una coloración rojiza cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra. La absorbancia de la muestra se mide a 505 nm frente a blanco de reactivo. Los resultados se expresan en mg/100 mL. Colesterol total Se utiliza un kit comercial de diagnóstico (Labkit, 30184) basado en el método enzimático-colorimétrico CHOD-POD (Meiattini et al., 1978). La enzima colesterol esterasa escinde los ésteres de colesterol en ácidos grasos y colesterol. Éste último es transformado por la colesterol oxidasa en 4-colestenona y H2O2. El H2O2 junto con fenol y 4-aminofenazona, por acción de la peroxidasa, produce una coloración proporcional a la concentración de colesterol total en la muestra. La absorbancia de la muestra se mide a 505 nm frente a blanco de reactivo. Los resultados se expresan en mg/100 mL. IX.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DIGESTIVAS Tras el sacrificio, los peces se diseccionaron rápidamente para extraer el digestivo completo que, seguidamente, se sumergió en nitrógeno líquido. Las muestras se conservaron a -80°C hasta su posterior procesado y análisis. El tubo digestivo es dividido en 4 partes: estómago (E), ciegos pilóricos (CP), intestino anterior (IA) e intestino posterior (IP) (Figura IX.4.1.), midiéndose las actividades enzimáticas en cada una de ellas, para lo cual se homogeneizan por separado con un homogeneizador eléctrico “Polytron” modelo PT 2100, usando agua fría purificada en proporción 1:4 (p:v), evitando siempre que se rompa la cadena de frío. Los homogeneizados se centrifugan (16000 rpm, 30 min, 4 °C) en una centrífuga “SIGMA” modelo 3K30. Tras la centrifugación se recoge el sobrenadante que se congela a -80°C hasta el posterior análisis de las actividades enzimáticas. 12 | A n e x o M e t o d o l o g í a Intestino Anterior Intestino Posterior Estómago Ciegos Pilóricos Figura IX.4.1. Anatomía del tubo digestivo de la corvina IX.4.1. Determinación de la actividad proteasa. Determinación de las actividades de las proteasas alcalinas. Fundamento La actividad proteolítica alcalina se estimó siguiendo el método de la hidrólisis de la caseína de Kunitz (1947), modificado por Walter (1984). La caseína se transforma en péptidos y aminoácidos libres por la acción de las proteasas de la muestra. Los péptidos resultantes se miden en estado soluble, tras su separación del sustrato proteico, llevada a cabo por el ácido tricloroacético que, previamente, ha paralizado la reacción por precipitación de las proteínas. Reactivos Tampón universal madre Stauffer (Stauffer, 1989): ácido bórico 57 mM, ácido cítrico monohidratado 33mM, NaH2PO4 33mM y NaOH 31mM Ácido tricloroacético (TCA) 20% (p/v) Solución de caseína al 1%. Se debe llevar la solución a pH básico con NaOH para su completa disolución y, posteriormente, se ajusta el pH con HCl Procedimiento El tampón de trabajo Stauffer se obtiene a partir de 20 mL de tampón universal madre Stauffer, ajustado el pH con HCl y llevándolo a un volumen final de 100 mL. El rango de pHs ensayados fue desde 2 a 12. Caseína (μL) Tampón (μL) TCA (μL) Extracto (μL) Control 500 500 500 20 Test 500 500 500 20 13 | A n e x o M e t o d o l o g í a Para el análisis de cada muestra se hacen controles por duplicado, que actuarán como blancos de la reacción problema (test), estos últimos determinados por triplicado. La mezcla de caseína, tampón y extracto se incuba durante 20 minutos a 37 °C. En los controles, el extracto se añade al final de la incubación, justo antes de añadir el TCA. Con la adición del TCA, parada de la reacción, tanto test como controles, se mantienen 30 minutos a 4 °C para favorecer la precipitación de la caseína no hidrolizada. Las muestras se centrifugan (10000 rpm, 15 min, 4°C), se toman 200 μL y se mide la absorbancia a 280 nm. Determinación de la actividad proteasa ácida. Fundamento Se determina según la metodología de Anson (1938), que mide la proteólisis ácida de la hemoglobina. Por acción de la proteasas, la hemoglobina se hidroliza en péptidos y aminoácidos, siendo la fracción no hidrolizada precipìtada por acción del TCA y midiéndose la fracción soluble. Reactivos Tampón universal madre Stauffer (Stauffer, 1989): ácido bórico 57mM, ácido cítrico monohidratado 33mM, NaH2PO4 33mM y NaOH 31mM Ácido tricloroacético (TCA) al 20% (p/v) Solución de hemoglobina al 0.5% (p/v) Procedimiento Hemoglobina (μL) Tampón (μL) TCA (μL) Extracto (μL) Control 500 500 500 20 Test 500 500 500 20 Los controles se hacen por duplicado y los tests por triplicado, siguiendo el mismo procedimiento anteriormente descrito. CÁLCULOS Se define una Unidad de Actividad Proteolítica (U) como la actividad de enzima que libera 1 mM de tirosina por minuto y por miligramo de proteína, calculándose de acuerdo a la siguiente fórmula: 14 | A n e x o M e t o d o l o g í a Siendo: ∆D.O.: D.O. test – D.O. control V: volumen total en mL T: tiempo de incubación, 20 min v: volumen de extracto en mL P: mg proteína por mL ε280: coeficiente de extinción molar de la tirosina a 280 nm (0.008 /cm M) IX.4.2. Determinación de la actividad tripsina. Fundamento El análisis de la actividad tripsina se realiza según el procedimiento descrito por Erlanger et al., (1961) con algunas modificaciones de Faulk et al. (2007). Este método está basado en el registro de la producción de p-nitroanilina, un producto de la acción de la tripsina de la muestra sobre el sustrato BAPNA. N-benzoil-DL-arginina 4-nitroanilida Tripsina 4-nitroanilina Reactivos Tampón Tris-HCl 50 mM pH 8.2 CaCl2 20 mM N-benzoil-DL-arginina 4-nitroanilida (BAPNA) 1 mM (sustrato) Procedimiento A 20 μL de muestra se añaden 100 μL del tampón y el sustrato (BAPNA). Se determina la producción de 4-nitroanilina monitorizada como variación de densidad óptica a 410 nm, cada 30 segundos, durante 30 minutos, a 30 °C. IX.4.3. Determinación de la actividad quimotripsina. Fundamento La actividad quimotripsina se determina según el método descrito por Hummel (1959) modificado por Applebaum y Holt (2003). Este método está basado en la monitorización de la hidrólisis del N-benzoil-L-tirosina etil éter (BTEE) con producción de tirosina. N-benzoil-L-tirosina etil éter Quimotripsina p-tirosina 15 | A n e x o M e t o d o l o g í a Reactivos Tampón Tris-HCl 0.1 M pH 7.8 CaCl2 25 mM N-benzoil-L-tirosina etil éter (BTEE) 0.566 mM (sustrato) Procedimiento A 20 μL de muestra se añaden 140 μL del tampón de reacción mezclado con el sustrato. Se determina la producción de p-tirosina como variación de absorbancia a 256 nm, cada 20 segundos, durante 20 minutos, a 37 °C. IX.4.4. Determinación de la actividad α-amilasa. Fundamento Se utiliza un kit comercial de diagnóstico (Labkit, 30140) basado en el método enzimático-cinético CNPG3 (Ying et al., 1998). La enzima α-amilasa hidroliza el 2-cloro-4nitrofenil-α-D-maltotriosido (CNPG3) a 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) y forma 2-cloro-4nitrofenil-a-Dmaltosido (CNPG2), maltotriosa (G3) y glucosa (G). La velocidad de formación de CNP, determinado fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de α-amilasa en la muestra. 10 CNPG3 α-amilasa 9 CNP + CNPG2 + G3 + G Reactivos Ácido 2-(N morfolino)etanosulfónico pH 6.0 NaCl 350 mM Acetato cálcico 6mM Tiocianato potásico 900 mM CNPG3 2.25 mM (sustrato) Procedimiento Según pruebas preliminares, a 30 μL de homogenizados de estómago y 20 μL de los de de ciegos pilóricos, intestino anterior y posterior, se añaden 200 μL de solución reactiva. Se determina la producción de CNP como variación de densidad óptica a 405 nm, durante 3 minutos, cada 12 segundos, a 37 °C. 16 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.4.5. Determinación de la actividad lipasa. Fundamento La actividad lipásica se determina según el método desarrollado por Gjellesvik et al., (1992), modificado por Lazo et al. (2000) midiéndose, espectrofotométricamente (400 nm), la producción de nitrofenil a partir de 4-nitrofenil octanoato 4-nitrofenil octanoato Lipasa Nitrofenil + Octanoato Reactivos Tampón Tris-HCl 0.5 mM pH 7.4 Taurocolato sódico 6 mM NaCl 1M 4-nitrofenil octanoato 0.35 mM (sustrato) Procedimiento Se colocan 10 µL de homogeneizado en el pocillo y se inicia la reacción con la adición de 200 µL de mezcla de reacción. Se determina la producción de nitrofenil como variación de densidad óptica a 400 nm, cada 30 segundos, durante 30 minutos, a 30 °C. IX.4.6. Determinación de la proteína soluble. Fundamento Para poder expresar la actividad de los enzimas por miligramo de proteína presente en la muestra, se determina la concentración de proteínas solubles de la misma según la técnica de Bradford (1976), basada en la unión directa del colorante azul de Coomassie a la estructura terciaria de las proteínas. Reactivos Reactivo de Bradford comercial (kit Bio-Rad) Solución patrón de albúmina bovina al 0.06% Procedimiento Curva patrón: [albúmina] µg/mL 0 3 6 12 24 48 Sol. Madre Agua destilada Kit Bio-Rad Vol. Final 0 5 10 20 40 80 800 795 790 780 760 720 200 200 200 200 200 200 1000 1000 1000 1000 1000 1000 17 | A n e x o M e t o d o l o g í a A 5 μL de extracto diluido de cada muestra se añade la cantidad necesaria de agua destilada para ajustar el volumen a 800 μL y finalmente se añaden 200 μL de reactivo de Bradford. Una vez mezclados todos los componentes por agitación, se dejan reposar 5 minutos y se determina su densidad óptica a 595 nm, frente a blanco de reactivo. La concentración de proteína soluble en las muestras se calculó a partir de la curva patrón, en la que se asocian concentraciones conocidas de albúmina, con la densidad óptica correspondiente. Los resultados se expresan en mg proteína/mL. CÁLCULOS DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS La actividad específica (U) de los diferentes enzimas se expresó como la capaz de transformar un μmol de sustrato por minuto y por miligramo de proteína, calculándose de acuerdo con la siguiente fórmula: Siendo: ∆D.O./∆t: decremento de densidad óptica/min V: volumen total en mL v: volumen de extracto en mL d: longitud de paso de luz, para estas microplacas es 0.6 cm 10-6: factor de conversión a μM 103: conversión de litros a mililitros P: mg proteína/mL ε 410: coeficiente de extinción molar del 4-nitroanilina a 410 nm (8800/ cm M) ε 256: coeficiente de extinción molar del BTEE a 256 nm (964/ cm M) ε 405: coeficiente de extinción molar del CNP a 405 nm (12.83/ cm M) ε 400: coeficiente de extinción molar del nitrofenil a 400 nm (16300/ cm M) IX.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS EN HÍGADO Y MÚSCULO. Los animales recién sacrificados se diseccionaron rápidamente para extraer el hígado completo y/o una porción del músculo blanco, del área dorsal anterior izquierda, que se sumergieron en nitrógeno líquido. Las muestras se conservaron a -80°C hasta posterior procesado y análisis. En el momento oportuno, las muestras de hígado y músculo se homogeneizan en un homogeneizador eléctrico “Polytron” modelo PT 2100, siempre evitando que se rompa la 18 | A n e x o M e t o d o l o g í a cadena de frío. Para la homogeneización se usa tampón Tris-HCl 100 mM, EDTA 0.1 mM, tritón X-100 0.1% (detergente que facilita la rotura de las membranas celulares), PMSF (fluoruro de fenilmetil sulfonilo) 0.5 mM, pH 7.8 en una proporción de 1:9 (p:v). Posteriormente, los homogeneizados se centrifugan de 16000 rpm durante 30 minutos a 4 °C en una centrífuga “SIGMA” modelo 3K30. Tras la centrifugación se recoge el sobrenadante que se congela y mantiene a -80°C hasta el posterior análisis de las actividades enzimáticas. IX.5.1. Determinación de las actividades de enzimas del metabolismo intermediario. La determinación de la actividad de todos los enzimas analizados implicados en el metabolismo intermediario se realizó mediante la lectura de cambios en la absorbancia EN una determinada “mezcla de reacción”, diferente según el enzima a analizar. Para ello se usó un espectrofotómetro lector de microplacas PowerWavex de Bio-Tek Instruments Inc. (USA). La concentración óptima de sustrato así como la dilución más apropiada del extracto de un determinado tejido, se establecieron con anterioridad mediante una serie de análisis preliminares. La reacción enzimática se inicia siempre por adición del extracto de la muestra a la mezcla de reacción correspondiente. Todas las soluciones se elaboran con agua destilada, salvo en los casos en que se indica algo diferente. La actividad específica de los diferentes enzimas se considera como la capaz de transformar un milimol de sustrato por minuto y por miligramo de proteína. La cantidad de proteína de los extractos se calcula, en todos los casos, como se describe en el apartado IX.4.6 (método de Bradford). XI.5.1.1. HEXOQUINASA (HK; E.C. 2.7.1.1) Fundamento Se determinó la actividad hexoquinasa según el método empleado por Vijayan et al., (1990). Este método está basado en el registro espectrofotométrico de la reducción del NADP + por una reacción acoplada de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) de la siguiente forma: Glucosa ATP HK Glucosa 6- fosfato ADP NADP G6PDH 6-fosfogluconato NADPH+H + Procedimiento Se mide el incremento de densidad óptica a 340 nm, durante 5 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: 19 | A n e x o M e t o d o l o g í a Concentración en pocillo (mM) 50 2.5 5 0.4 2 U/mL 10 Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 ATP 50 mM MgCl2 100 mM NADP 8 mM G6PDH Glucosa 200 mM (sustrato) Muestra Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 0.57 10 20 XI.5.1.2. PIRUVATO KINASA (PK; E.C. 2.7.1.40) Fundamento La actividad PK se determinó siguiendo el método descrito por Morales et al., (1990), que se basa en la determinación espectrofotométrica de la oxidación del NADPH en una reacción acoplada con el enzima lactato deshidrogenasa (LDH). PK PEP ATP Piruvato ADP LDH NADH + H+ Lactato NADH Procedimiento Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 5 minutos, cada 15 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 KCl 2 M MgCl2 100 mM NADH 3 mM ADP 20 mM LDH PEP 40 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 100 5 0.15 1 2 U/mL 2 Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 10 0.15 10 10 IX.5.1.3. FRUCTOSA BISFOSFATASA (FBPasa; E.C. 3.1.3.11) Fundamento La determinación de la actividad FBPasa se llevó a cabo siguiendo el método propuesto por Latzko y Gibbs (1970) algo modificado. Se basa en la determinación del NADP después de tres reacciones en cadena iniciadas con la actuación de la FBPasa y en las que intervienen fosfoglucoisomerasa (PGI) y G6PDH. 20 | A n e x o M e t o d o l o g í a F(1,6)BP FBPasa PGI F6P G6PD 6PG HHHH + NADP HHHNAPH + H+ G6P Procedimiento Se mide el incremento de densidad óptica a 340 nm, durante 4 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C en una serie de pocillos cuyo contenido es: Concentración en pocillo (mM) 42.84 5 0.5 12 2 U/mL 2 U/mL Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 MgCl2 100 mM NADP 10 mM β-mercaptoetanol 240 mM PGI G6PDH Agua destilada F(1,6)BP 5 mM (sustrato) Muestra 0.5 Volumen en pocillo (μL) 120 10 10 10 0.57 0.57 20 20 10 IX.5.1.4. LACTATO DESHIDROGENASA (LDH; E.C. 1.1.1.27) Fundamento La actividad lactato deshidrogenasa se determinó siguiendo el método de Singer et al., (1990) basado en la detección en la variación de densidad óptica debida a la oxidación del cofactor NADH. Piruvato LDH NADH + H + Lactato + NAD Procedimiento Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 3 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivo Tampón Imidazol 83.3 mM pH 7.4 NADH 3.2 mM Agua destilada Piruvato 20 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 0.16 1 Volumen en pocillo (μL) 140 10 30 10 10 21 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.5.1.5. GLICEROL KINASA (GyK; E.C. 2.7.1.30) Fundamento La actividad glicerol quinasa se determinó según el método propuesto por Vijayan et al., (1990), en el cual se mide el decremento de densidad óptica debido a la oxidación del NADH de acuerdo con las siguientes reacciones en las que también intervienen piruvatokinasa (PK) y LDH: GyK Glicerol ATP Glicerol 3-fosfato ADP + PEP Procedimiento PK Piruvat o NADH + ATP H LDH + Lactato + NAD Se mide el descenso de densidad óptica a 340 nm, durante 6 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Concentración en pocillo (mM) 50 0.75 5 5 10 4 U/mL 4 U/mL 2.5 Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 NADH 15 mM ATP 100 mM MgCl2 100 mM PEP 200 mM PK LDH Glicerol 50 mM (sustrato) Muestra Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 10 0.80 0.30 10 10 IX.5.1.6. 3-HIDROXIACIL CoA DESHIDROGENASA (HOAD; 1.1.1.35) Fundamento La actividad 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa se determinó siguiendo el método de Singer et al., (1990) en el que se valora, espectrofotométricamente, la tasa de oxidación de NADH de acuerdo con la siguiente reacción: AcetoacetilCoA HOAD NADH + H + 3 hidroxiacetilCoA NAD + Procedimiento Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 4 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: 22 | A n e x o M e t o d o l o g í a Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 8 NADH 2 mM Agua destilada Acetoacetil CoA 2 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 0.1 0.1 Volumen en pocillo (μL) 140 10 30 10 10 IX.5.1.7. CITRATO SINTASA (CS; E.C. 2.3.1.9) Fundamento La actividad citrato sintasa se determinó según el método descrito por Thibault et al., (1997), e el que se registra el incremento de densidad óptica a 412 nm producido por la reducción del DTNB. CS AcetilCoA + OAA + H2O CoA –SH + H+ + Citrato DTNB + CoA –SH TNB + CoA –S-S-TNB Procedimiento Se mide el decremento de densidad óptica a 412 nm, durante 5 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 8.0 DTNB 2 mM Acetil-CoA 4 mM Agua destilada OAA 4 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 0.1 0.2 0.2 Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 20 10 10 IX.5.1.8. ENZIMA MÁLICO (EM; E.C. 1.1.1.40) Fundamento El enzima málico se determinó siguiendo el método propuesto por Singer et al., (1990) basado en la medida de la variación de densidad óptica producida por la reducción del NADP+ de acuerdo con la siguiente reacción: EM Malato NADP + Piruvato + CO2 NADPH + H + 23 | A n e x o M e t o d o l o g í a Procedimiento Se mide el incremento de densidad óptica a 340 nm, durante 4 minutos cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Concentración en pocillo (mM) 50 5 0.4 Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 MgCl2 100 mM NADP 8 mM Agua destilada Glicerol 40 mM (sustrato) Muestra 2 Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 10 20 IX.5.1.9. GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA (G6PDH; E.C. 1.1.1.49) Fundamento La actividad glucosa 6-fosfato deshidrogenasa se determinó siguiendo el método descrito por Morales et al., (2004), basado en la variación de densidad óptica como consecuencia de la reducción de NADP+. La actividad enzimática registrada mediante esta técnica sería la suma de las actividades G6PDH y 6PGDH (6-fosfogluconato deshidrogenasa) G6PDH G6P NADP + NAPH + H 6PGDH 6PG + NADP + NAPH + H Ribulosa 5-fosfato + CO2 + Procedimiento Se mide el incremento de densidad óptica (D.O.) a 340 nm, durante 10 minutos, cada 15 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 MgCl2 100 mM *NADP 20 mM G6P 10 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 5 2 1 Volumen en pocillo (μL) 140 10 20 20 10 *NADP disuelto en HCO3Na 119 mM (en cubeta, 11.9 mM) 24 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.5.1.10. GLUTAMATO OXALACETATO TRANSAMINASA (GOT; E.C. 2.6.1.1) Fundamento La actividad glutamato oxalacetato transaminasa se determinó según el método descrito por Singer et al., (1990), en el cual se mide la tasa de oxidación del NADH acoplado a las siguientes reacciones: GOT Aspartato αKG MDH Oxalacetato Glutamato NADH + H Malato + + NAD Procedimiento Se mide el decremento de densidad óptica a 340 nm, durante 3 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Concentración en pocillo (mM) 50 5 0.3 0.05 3 U/mL Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 αKG 200 mM NADH 6 mM Piridoxal fosfato 1 mM MDH Agua destilada L-aspartato 500 mM (sustrato) Muestra Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 0.10 10 10 10 25 IX.5.1.11. GLUTAMATO PIRUVATO TRANSAMINASA (GPT; E.C. 2.6.1.2) Fundamento La técnica empleada está basada en el método utilizada por Morales et al., (2004), siguiendo espectrofotométricamente la disminución de la densidad óptica causada por la desaparición del NADH acoplado a las siguientes reacciones: GPT L-alanina αKG LDH Piruvato Glutamato NADH + H + Lactato + NAD Procedimiento Se mide el decremento de densidad óptica (D.O.) a 340 nm, durante 3 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: 25 | A n e x o M e t o d o l o g í a Concentración en pocillo (mM) 50 10 0.2 0.05 2 U/ml 25 Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 αKG 200 mM NADH 4 mM Piridoxal fosfato 1mM LDH L-alanina 250 mM (sustrato) Muestra Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 0.15 20 10 IX.5.1.12. GLUTAMATO DESHIDROGENASA (GDH; E.C. 1.4.1.2) Fundamento La determinación de la actividad glutamato deshidrogenasa está basada en el seguimiento de la desaparición de NADH valorada por espectrofotometría (Morales et al., 1990). La reacción catalizada por la enzima es la siguiente: GDH + αKG + NH4 NADH + H + Glutamato + H2O + NAD Procedimiento Se mide la disminución de densidad óptica a 340 nm, durante 3 minutos, cada 6 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Tampón Imidazol 71.4 mM pH 7.4 NADH/ADP 2.9/14.3 mM Acetato amónico 3.3 M LDH αKG 200 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 0.2/1 100 2 U/mL 10 Volumen en pocillo (μL) 140 14 6 0.15 10 30 IX.5.1.13. ACETOACETIL CoA TIOLASA (ACoAT; E.C. 2.3.1.9) Fundamento La determinación de la actividad acetoacetil CoA tiolasa se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Singer et al., (1990), en el que se mide la tasa de aparición de acetilCoA de acuerdo con la siguiente reacción: AcetoacetilCoA + CoA 26 | A n e x o M e t o d o l o g í a ACoAT 2 AcetilCoA Procedimiento Se mide el decremento de densidad óptica a 313 nm, durante 5 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivo Tampón Imidazol 71.4 mM pH 8.0 MgCl2 100 mM Acetoacetil CoA 2.8 mM Agua destilada CoA 4.8 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 50 5 0.14 0.24 Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 20 10 10 CÁLCULO DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS La actividad específica (mU) de los diferentes enzimas se expresó como la capaz de transformar un nanomol de sustrato por minuto y por miligramo de proteína, calculándose de acuerdo con la siguiente fórmula: Siendo: ∆D.O./∆t: variación de densidad óptica por unidad de tiempo V: volumen total en mL v: volumen de extracto en mL d: espesor de la cubeta. Para microplacas 0.6 cm 10-9: factor de conversión a nM 103: conversión de litros a mililitros P: mg proteína /mL ε x: coeficiente de extinción molar: ε 340 nm: 6220/ cm M ε 412 nm: 13600/ cm M ε 313 nm: 20500/ cm M 27 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.5.2. Determinación de Parámetros y Enzimas del Estrés Oxidativo IX.5.2.1 NIVELES DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Fundamento La técnica se basa en la medición de la formación de malondialdehido (MDA) tras la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados por la acción de los radicales libres ·OH. El MDA, en presencia de ácido tiobarbitúrico (TBA), da lugar a un producto rosado que absorbe luz a 535 nm (Buege y Aust, 1978). Reactivos Ácido tricloroacético (TCA) 15% (p/v) Ácido tiobarbitúrico (TBA) 0.375% (p/v) HCl 0.25 N Hidroxitolueno butilado (BHT) 0.01% (p/v) Malondialdehido (MDA) 0.1 M Procedimiento Se prepara el siguiente reactivo extemporáneo: 15 g de TCA en 80 mL de HCl, una vez disuelto se añaden 0.375 g de TBA calentando ligeramente. La mezcla resultante se lleva a 100 mL con agua miliQ y se añaden 0.01 g de BHT disolviéndose mediante agitación y calentamiento ligero durante 2 horas. Se realizó una curva patrón a partir de una solución madre de MDA con las siguientes concentraciones: [MDA] (μM) 0.1 0.25 1 5 10 15 20 Solución Madre (μL) 10 25 100 500 1000 1500 2000 Agua miliQ (ml) 9.990 9.975 9.900 9.500 9.000 8.500 8.000 Volumen Total (ml) 10 10 10 10 10 10 10 Para llevar a cabo la reacción, se mezclaron 0.1 mL de muestra (extractor y patrones) con 0.5 mL de reactivo. Tras una agitación vigorosa, se incubó durante 15 minutos a 100 °C. A continuación se dejó enfriar y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. Se tomaron 0.2 mL del sobrenadante y se midió la absorbancia a 535 nm a 25 °C frente al blanco de reactivo. 28 | A n e x o M e t o d o l o g í a CÁLCULOS Los datos de absorbancia obtenidos se interpolan en la recta de regresión construida a partir de la curva patrón. Los niveles de peroxidación lipídica se expresaron como nM de MDA = nmol de MDA/g tejido IX.5.2.2 CATALASA (CAT; E.C. 1.11.1.6) Fundamento La determinación de la actividad catalasa se llevó a cabo usando el método de Aebi (1984). La catalasa puede ejercer una doble función, catalítica y peroxidásica. En este caso, se determinó la actividad catalítica midiendo la desaparición de H2O2 registrada espectrofotométricamente como disminución de densidad óptica. 2 H2O2 2 H2O + O2 Reactivos Tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.0 Solución extemporánea de peróxido de hidrógeno 10.6 mM en tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.0 (sustrato) Procedimiento Se determinó el decremento de densidad óptica a 240 nm durante 3 minutos, cada 12 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos: H2O2 10.6 mM Muestra Concentración en pocillo (mM) 0.53 Volumen en pocillo (μL) 190 10 CÁLCULOS Para el cálculo de la actividad catalasa se utilizó la fórmula: Siendo: ∆D.O./∆t: decremento de densidad óptica/min V: volumen total en mL v: volumen de extracto en mL d: longitud de paso de luz. Para microplacas es 0.6 cm 10-6: factor de conversión a μM 29 | A n e x o M e t o d o l o g í a 103: conversión de litros a mililitros P: mg proteína / mL ε 240: coeficiente de extinción molar del H2O2 a 240 nm (39.58/ cm M) IX.5.2.3 GLUTATION PEROXIDASA (GPX; E.C. 1.11.1.9) Fundamento La actividad de la glutation peroxidasa (GPX) se valoró indirectamente, según Paglia y Valentine (1967), mediante un sistema de ensayo en el que el glutation oxidado (GSSG), formado durante la reacción catalizada por este enzima, es reducido instantánea y continuamente por un exceso de glutation reductasa (GR), produciéndose un nivel constante de glutation reducido (GSH). Así para determinar la actividad de la GPX se mide el descenso de absorbancia a 340 nm debido a la oxidación del NADPH que interviene en la reducción del GSSG a GSH: H2cumeno + 2 GSH GR GPX GSSG H2O GSH NADPH+H + NADP + Procedimiento Para evitar una sobreestimación de la actividad enzimática real, ya que el hidroperóxido de cumeno reacciona aún en ausencia de enzima, se debe realizar una reacción en ausencia de muestra (no catalizada) o control. Se registra el decremento de densidad óptica a 340 nm durante 3 minutos, cada 15 segundos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.1 Azida sódica 4.3 mM EDTA 1 mM GSH 4 mM NADPH 0.2 mM Glutation reductasa Hidroperóxido de cumeno 25.5 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 35 0.23 0.05 0.2 0.01 1.1 U/ml 1.81 Volumen en pocillo (μL) 140 10 10 10 10 0.14 10 10 Reacción control (no catalizada): Se realizan al menos tres determinaciones, en cada pocillo se adicionan 180 μL de solución reactiva y 10 μL de hidroperóxido de cumeno. Reacción problema En cada pocillo se adicionan 180 μL de solución reactiva, 10 μL de hidroperóxido de cumeno y 10 μL de muestra. 30 | A n e x o M e t o d o l o g í a CÁLCULOS Al valor de variación de densidad óptica en el tiempo obtenido para cada muestra, se resta el correspondiente a la reacción control (no catalizada). La actividad enzimática glutation peroxidasa se expresa como nanomoles de NADPH oxidados a NADP por minuto y miligramo de proteína según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades enzimáticas específicas. IX.5.2.4. SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD; 1.15.1.1) Fundamento La determinación de la actividad SOD se realizó siguiendo el método descrito por McCord y Fridovich (1969), basado en la medida de la tasa de inhibición, por parte de la SOD, en el proceso de reducción del citocromo C por los radicales superóxidos O2-, generados por el sistema enzimático xantina – xantina oxidasa XOD Xantina Cit ox Ácido úrico + Cit red O2- SOD H2O + O2 Inhibido por SOD Procedimiento Reactivos Tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.8 EDTA 0.1 mM Citocromo C 1 mM Xantina 1 mM Concentración en pocillo (mM) 44.5 0.10 0.01 Volumen en pocillo (μL) 178 19 3 Esta mezcla reactiva se mantiene a 25 °C protegida de la luz y con aireación durante 50 minutos para conseguir la total oxidación del citocromo C Comprobación de la solución de reacción: Se le adiciona un poco de hidrosulfito sódico a 200 μL de solución reactiva. Previa agitación se mide la absorbancia a 550nm. Se comprueba la reducción total del citocromo C al obtener valores de D.O. comprendidos entre 0.20 y 0.24. Reacción control: Se realizan tres réplicas adicionando al pocillo 200 μL de solución reactiva y 5 μL de xantina oxidasa (XOD). Se lleva a cabo una lectura espectrofotométrica a 550 nm en intervalos de 13 segundos durante 3 minutos a 25 °C. La tasa de reducción del citocromo C de la reacción control debe estar comprendida entre 0.023 – 0.028 unidades. 31 | A n e x o M e t o d o l o g í a Reacción problema: En cada pocillo se adicionan 200 μL de cóctel de reacción, 5 μL de XOD y 5 μL de muestra problema. Se determina el incremento de absorbancia (550 nm) durante 3 minutos, a intervalos de 13 segundos y a una temperatura de 25 °C. CÁLCULOS IX.5.2.5. GLUTATION REDUCTASA (GR; E.C. 1.6.4.2) Fundamento La actividad GR se determinó según el método de Carlberg y Mannervik (1975) con algunas modificaciones, registrándose el descenso de absorbancia producido por la oxidación del NADPH utilizado por la glutation reductasa en el paso de GSSG a GSH. GR GSSG GSH NADPH+H + NADP + Procedimiento Se registró el decremento de densidad óptica producido por la oxidación del NADPH a 340 nm durante 10 minutos cada 18 segundos a 25 °C. En cada pocillo se adicionó lo siguiente: Reactivos NADPH 0.66 mM GSSG 3.25 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 0.63 0.15 Volumen en pocillo (μL) 190 10 10 CÁLCULOS La actividad se expresó como nanomoles de NADPH oxidados a NADP por minuto y miligramo de proteína según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades enzimáticas específicas. 32 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.5.2.6. GLUTATION S-TRANSFERASA (GST; E.C. 2.5.1.18) Fundamento La actividad GST se determinó según el método de Habig et al., (1974), modificado por Frasco et al., (2002). La reacción consiste en la formación de un conjugado de glutation y cloro dinitrobenceno (CDNB) por mediación de la enzima glutation S-transferasa. GSH + CDNB GST GS-CDNB Glutation conjugado Procedimiento Se mide el decremento de densidad óptica producido por la formación del conjugado de glutation y CDNB a 340 nm, cada 20 segundos durante 5 minutos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivos Tampón fosfato potásico 0.1 M GSH 10 mM CDNB 60 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 77.5 1.2 1.23 Volumen en pocillo (μL) 155 25 5 10 CÁLCULOS La unidad de actividad enzimática glutation s-transferasa se expresa como la cantidad de enzima que cataliza la formación de un mol de producto (conjugado de CDNB con GSH) por minuto y miligramo proteína, según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades enzimáticas específicas. El coeficiente de extinción molar es de 9.6 /mM cm. IX.5.2.7. DT DIAFORASA (NAD(P)H QUINONA OXIDOREDUCTASA) (NQO1; EC 1.6.99.2) Fundamento La determinación de la actividad DT diaforasa se realizó según Sturve et al., (2005). La función antioxidante de la DTD radica en su capacidad única para reducir quinonas a hidroquinonas mediante la aceptación de dos electrones que son cedidos obligatoriamente por NADH o NADPH. La trasferencia de electrones se realizaría desde el NAD(P)H hasta el grupo FAD del centro activo, formándose FADH2 y de aquí pasarían a la quinona reduciéndola. Esto rompe el ciclo redox prooxidante previniendo la formación de radicales superóxido dependiente de la quinonas que, a su vez, puede llevar a la formación de peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo. In vitro la transferencia de los electrones del FADH2 pasan al diclorofenol indofenol (DCPIP), registrándose la variación de color debido a su reducción. 33 | A n e x o M e t o d o l o g í a Procedimiento Para evitar una sobreestimación real de la actividad enzimática, se debe realizar una reacción sin muestra (no catalizada) o control. Se midió la variación de densidad óptica producido por la reducción del DCPIP a 600 nm, cada 20 segundos durante 5 minutos, a 25 °C de temperatura en una serie de pocillos cuyo contenido es: Reactivos Tampón Tris-HCl 50 mM NADH 5 mM Albúmina 0.147% DCPIP 0.42 mM (sustrato) Muestra Concentración en pocillo (mM) 36.25 0.49 0.05 Volumen en pocillo (μL) 145 20 10 25 10 Reacción control. Se realizan al menos tres determinaciones, en cada pocillo se adicionan 165 μL de solución reactiva, 10 μL de albúmina, 25 μL de DCPIP y 10 μL de agua, sustituyendo a la muestra. Reacción problema. En cada pocillo se adicionan 165 μL de solución reactiva, 10 μL de albúmina, 25 μL de DCPIP y 10 μL de muestra. CÁLCULOS Al valor de variación de densidad óptica en el tiempo obtenido para cada muestra, se resta el correspondiente a la reacción control (no catalizada). La unidad de actividad enzimática DT diaforasa se expresa como la cantidad de enzima que cataliza la formación de un mol de producto (DCPIP reducido) por minuto y miligramo de proteína, según la fórmula general descrita para el cálculo de las actividades enzimáticas específicas. El coeficiente de extinción molar es de 21/mM cm. IX.5.3. Determinación de Glucógeno Tisular Para la determinación del glucógeno muscular y hepático se tomaron porciones de ambos tejidos, que fueron homogeneizadas con agua fría purificada en proporción 1:4 (p:v). Las muestras se mantuvieron a -80 °C hasta su posterior análisis. Fundamento El método consiste en una hidrólisis enzimática del glucógeno con amiloglucosidasa según el método de Roehrig y Allerd (1974) modificado. La actividad hidrolítica del enzima es a la 34 | A n e x o M e t o d o l o g í a altura de las uniones α-D (1→4) y α-D (1→6) del glucógeno, liberándose glucosa. Esta enzima es específica y, por tanto, no es necesario aislar el glucógeno para llevar a cabo la hidrólisis. Glucógeno Amiloglucosidasa (Glucosa)n Reactivos Amiloglucosidasa comercial (E. C. 3.2.1.3) Tampón acetato 0.05M, pH 4.5 Glucógeno comercial Procedimiento Hidrólisis del glucógeno A 25 μL de homogenado de cada muestra se añaden, junto con 425 μL de agua destilada, 50 μL de una solución de amiloglucosidasa en tampón acetato (35 U/mL). Se mezcla e incuba a 55 °C durante 10 minutos. El mismo tratamiento enzimático y de incubación se aplica a las muestras de la curva patrón construida con concentraciones conocidas de glucógeno, a partir de una solución estándar de 800 μg de glucógeno / 400 μL de agua destilada. [Glucógeno] μg /400μL Agua destilada (μL) Solución estándar (μL) 0 400 0 25 387.5 12.5 50 375 25 100 350 50 200 300 100 300 250 150 400 200 200 Determinación de glucógeno en estado de glucosa libre Pasado el período de tiempo señalado se determina el contenido en glucosa en 10 µL de la mezcla reacción según el método descrito en el punto IX.3.2. CÁLCULOS La concentración de glucógeno en las muestras se calcula a partir de la curva patrón en la que se asocian concentraciones de glucógeno conocidas con la densidad óptica correspondiente, obtenida al medir la glucosa libre. Los resultados se expresan en mg glucógeno/g tejido. 35 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.6. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE CALIDAD DEL MÚSCULO. IX.6.1. Determinación de la Firmeza. Fundamento Se realizó mediante la técnica de compresión – relajación, presionando con una sonda al pez con una velocidad de desplazamiento constante que pretende simular la acción de un dedo al presionar sobre el pescado. La firmeza, que se expresa en Newtons (N), se considera como la fuerza necesaria para comprimir la muestra y producir el mayor pico durante la compresión; mide la resistencia de las fibras del músculo a la compresión sin rotura. Procedimiento Para la determinación de la firmeza se ha empleado un texturómetro TXT2 plus “Stable Mycro System” que posee una célula de carga de 5 kN y está provisto de un brazo móvil, acoplado al cual se dispone una sonda cilíndrica de punta plana de 20 mm de diámetro. La superficie plana de la sonda presiona la superficie del pez, perpendicular al eje de las fibras musculares. La presión de la sonda sobre el pez se realiza con una velocidad de 1 mm/s, durante 5 s. La profundidad de penetración es de 5 cm, previa a la rotura de las fibras musculares. El equipo se encoontraba en un laboratorio en el que la temperatura ambiental durante los ensayos fue de 18 ± 2 °C. Durante el tiempo que duraron las determinaciones, los peces se mantuvieron en una bandeja con hielo. La firmeza se mide en la parte anterior dorsal coincidiendo con el inicio de la aleta dorsal de las corvinas según se indica en la figura. Figura IX.6.1. Punto de determinación de la firmeza en la corvina. IX.6.2. Determinación del pH. La medida del pH se realiza directamente mediante la inserción en el músculo dorsal de los peces de un electrodo de penetración Crison cat. nº 52-32 previamente calibrado y un pHmetro GLP 21 Crison. Se toman dos medidas de pH por pez realizadas, aproximadamente, en el mismo punto donde se evaluó la firmeza. 36 | A n e x o M e t o d o l o g í a IX.6.3. Determinación de la Capacidad de Retención de Agua (CRA) Fundamento La capacidad de retención del agua se determinó según el método gravimétrico de Pastoriza et al., (1998), adaptándolo a las características particulares del músculo de la corvina. Procedimiento Para la medición de la CRA se emplean trozos de músculo, de aproximadamente 1 g, que se introducen en un tubo de centrífuga, dentro del cual hay otro, más pequeño ,invertido, de esa forma se evitaba que el agua eliminada durante la centrifugación esté en contacto con la muestra. Las muestras se centrifugan a 2500 rpm durante 30 minutos, a 15 °C. CÁLCULOS El porcentaje de agua libre se calcula como la cantidad de agua perdida en la centrifugación, expresada como porcentaje de la masa inicial de la muestra: La CRA se calcula como el porcentaje de agua retenida por 100g de músculo fresco: siendo la humedad inicial, la determinada según se describe en el apartado IX.2.1. (determinación de composición corporal). IX.6.4. Extracción de Proteínas Sarcoplasmáticas y Miofibrilares. Extracto de proteínas sarcoplásmicas. Reactivos Tampón de baja fuerza iónica (BFI) NaHCO3 10 mM, EGTA 1mM. Procedimiento Se realiza la homogenización de la muestra de músculo liofilizado con el tampón de baja fuerza iónica a una concentración de 1.5 mg/mL, utilizando un homogenizador mecánico (PT2100, Polytron), en tres periodos de 15 segundos, separados por pausas de 15 segundos para evitar el calentamiento excesivo de las muestras. A continuación se centrifuga el homogenado (10000 xg, 20 minutos, 4 °C) y se recupera el sobrenadante. Al precipitado se le añaden 5 mL de tampón BFI y se resuspende mediante agitación durante 30 minutos, tras lo cual se vuelve a centrifugar. El sobrenadante obtenido tras 37 | A n e x o M e t o d o l o g í a esta segunda centrifugación se añade al obtenido en la primera, constituyendo ambos la fracción sarcoplásmica, la cual se almacena en alícuotas a -20 °C. Extracto de proteínas miofibrilares. Reactivos Tampón miofibrilar urea 8 M, tritón X-100 (2% v/v), ditiotreitol (DTT) 2 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,2 Procedimiento Al precipitado obtenido tras la separación de las proteínas sarcoplásmicas, se le añaden 5 mL de tampón miofibrilar (TM), se resuspende y se agita durante 30 minutos, tras lo cual se centrifuga nuevamente(10000 xg, 20 minutos, 4 °C). Se recoge el sobrenadante y al precipitado se le añaden 5 mL de tampón TM, para resuspenderlo mediante agitación durante 30 minutos y se vuelve a centrifugar bajo las mismas condiciones indicadas. El sobrenadante se añadió al obtenido tras la primera centrifugación, y ambos constituyeron la fracción miofibrilar, que se almacena a -20 °C. IX.6.5. Determinación del contenido en proteína de los extractos La cantidad de proteína contenida en los extractos se determinó mediante dos procedimientos distintos, dependiendo tanto de la cantidad de proteína soluble presente, como de sus limitaciones cuando se utilizan tampones que contienen detergentes. La concentración de proteína en los extractos sarcoplásmicos se midió según el método de Bradford (1976), descrito en el apartado IX.4.6. La concentración de proteínas miofibrilares de los extractos se determinó por el método del Biuret (Reactivo de Biorad Protein Assay) (Gornall et al., 1949), basado en una reacción colorimétrica. Fundamento Los enlaces peptídicos en un medio alcalino reaccionan con iones cúpricos para formar complejos que absorben luz de 540 nm. Las proteínas toman un intenso color violeta azulado en presencia de estas sales de cobre, siendo la intensidad del color proporcional a la concentración de proteína total en la muestra ensayada. La razón para utilizar este procedimiento es que el método de Biuret, al contrario que el de Bradford, es compatible con la presencia de detergentes en los tampones de extracción de proteínas, como ocurre con el Triton X-100 en el extracto de proteínas miofibrilares. Reactivos El reactivo de Biuret está compuesto por tartrato sódico potásico 15 mM, yoduro sódico 100 mM, yoduro de potasio 5 mM, sulfato de cobre (II) 19 mM, ya preparados para su uso y una solución de seroalbúmina bovina como estándar. 38 | A n e x o M e t o d o l o g í a Procedimiento En cada pocillo se añaden 40 µL de la muestra y 160 µL del reactivo; se mezclan e incuban durante 5 minutos a 37 °C ó 10 minutos a temperatura ambiente. IX.6.6. Determinación del contenido de aminoácidos. Fundamento Se realizó según el método descrito por Church et al. (1983), basando en la reacción del orto-ftalaldialdehído (OPA) y el -mercaptoetanol con las aminas primarias. Los grupos -amino liberados en la hidrólisis proteica reaccionan con el OPA y con el -mercaptoetanol para dar lugar a un complejo que absorbe fuertemente a 340 nm. La absorbancia es similar para todos los grupos -amino. Reactivos Reactivo de orto-ftalaldialdehído (OPA), tetraborato sódico 50 mM, SDS al 4% (v/v), OPA mM y β-mercaptoetanol mM. Tricloroacético (TCA) al 20% (p/v) Procedimiento A los extractos de proteínas sarcoplásmincas, previamente desproteinizados con TCA, se añade el reactivo OPA y se mide la absorbancia a 340 nm en el lector de microplacas. CÁLCULOS La concentración de aminoácidos en las muestras se calcula a partir de una curva patrón en la que se asocian concentraciones de L-leucina conocidas con su correspondiente densidad óptica. Los resultados se expresan en μg aminoácido / g tejido. IX.7.6. Técnica de electroforesis SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio) Fundamento Con objeto de visualizar las posibles diferencias en la degradación de las distintas fracciones de las proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares, se llevaron a cabo separaciones electroforéticas en geles de poliacrilamida (PAA) en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), utilizando el sistema discontinuo de tampones descrito por Laemmli (1970). 39 | A n e x o M e t o d o l o g í a Reactivos Tampón de muestra para electroforesis Tris 0.125M, glicerol 20% (v/v), azul de bromofenol 0.04% (v/v), SDS 2% (p/v), β-mercaptoetanol 20% (v/v) Patrón molecular SDS6H2 (Sigma-Aldrich, 30-200 KDa) Solución de tinción, azul de Coomassie al 0.1% (p/v) en una solución de metanol, ácido acético y agua (35:10:55, respectivamente) Solución desteñidora: metanol, ácido acético y agua (35:10:55) Procedimiento A partir de los extractos de proteínas sarcoplásmicas y miofibrilares se hace una dilución (1:1) con tampón de muestra para electroforesis que se hirvió durante 2 minutos. La electroforesis se realiza en geles de 10 x 10.5 cm, con un espesor de 0.75 mm. Para las proteínas miofibrilares se utilizan geles con un 10% de poliacrilamida, mientras que para aumentar la resolución de las bandas en las proteínas sarcoplásmicas se optó por geles de un 12%. Se utilizan los carriles para introducir muestras (20 µL para las proteínas sarcoplásmicas y 10 µL para las miofibrilares) y se reserva un carril para el patrón molecular. Los geles se someten a una diferencia de potencial constante de 200 V cada uno, durante un tiempo de 75 minutos. Finalizada la separación, los geles permanecen sumergidos durante toda una noche en solución de tinción a temperatura ambiente., tras lo cual se destiñen con la solución desteñidora antes de ser fotografiados. Las fotografías se analizaron con el software Genesnap versión 6.80 (Synoptics). La asignación de masas moleculares relativas y la cuantificación de la contribución de cada fracción proteica teñida separada electroforéticamente al total de proteína contenida en cada carril, se lleva a cabo mediante densitometría, utilizando para ello un programa específico de análisis de geles de electroforesis (Genetools versión 3.07, Synoptics). La contribución porcentual de las distintas fracciones proteicas separadas al conjunto de la proteína presente en cada carril se calcula comparando el área densitométrica de cada proteína, con el área total resultante de la suma de todas las áreas individuales. La identificación de cada fracción se basa en su masa molecular relativa y se le asigna una denominación de acuerdo con los valores consultados en bibliografía. IX.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico de los datos se ha realizado con el paquete estadístico SPSS versión 15.0 para Windows. Para la estimación de los posibles efectos del tratamiento impuesto se realizó el Análisis de la Varianza de una vía (ANOVA) Cuando el análisis de la varianza confirmó la existencia de diferencias significativas se aplicó el test de Duncan. El nivel de significación empleado fue del 95% (P<0.05). Todos los resultados se expresaron como media ± error estándar. Los resultados expresados como porcentaje fueron normalizados previamente, utilizando la transformación del arco de seno de su raíz cuadrada, según Sokal y Rohlf (1981). 40 | A n e x o M e t o d o l o g í a
