TEMA 23: EVALUCÓN DE LA INMUNIDAD: ÍNDICE:

TEMA 23:
EVALUCÓN DE LA INMUNIDAD:
ÍNDICE:
1. Los inmunoensayos son las técnicas de detección basadas en la reacción Ag-Ac.
2. Para poder realizar inmunoensayos hay que disponer de anticuerpos
específicos: policlonales y monclonales.
3. Inmunoensayos de precipitación y aglutinación.
4. Enzimo-inmuno-análisis (EIA): ELICASA indirecto y ELICASA en sándwich.
5. Inmunoensayos radiactivos: RIA competitivo e inmunoprecipitación.
6. Inmunoensayos fluorescentes: el directo y el indirecto.
7. Inmunoensayos revelados por complemento. Un tipo: microlinfocitotoxicidad
8. Ensayos en la respuesta inmunitaria innata.
9. Ensayos de la respuesta inmunitaria adaptativa.
10. Pruebas específicas: de hipersensibilidad y alergia, de autoinmunidad, de
histocompatibilidad y de inmunodeficiencias.
11. Micromatices.
1. LOS INMUNOENSAYOS SON LAS TÉCNICAS DE DETECCIÓN
BASADAS EN LA REACCIÓN AG-AC:
INMUNOENSAYOS: son las técnicas que emplean anticuerpos y se basan en la
especificidad de la reacción Ag-Ac. Esta interacción Ag-AC es una relación bimolecular
perfecta.
Los anticuerpos aparte de ser un elemento de la respuesta inmune, también tienen
utilidad diagnóstica y terapéutica.
Los inmunoensayos son importantes para el diagnóstico de enfermedades, estimar el
grado de respuesta inmune humoral y la identificación de moléculas de interés
medico. Se diferencian unos de otros en la rapidez y sensibilidad: unos son cualitativos
y otros permiten cuantificar sustancias.
La reacción Ag-Ac dependerá de anticuerpo de sus regiones hipervariables que
constituyen el parátopo o puntos de contacto con el epítopo del Ag. Un Ag puede
tener muchos epítopos, que pueden ser lineales (una secuencia correlativa de
aminoácidos) o conformacionales (aminoácidos próximos en el espacio, pero
separados en la secuencia lineal de la proteína). Está unión no es covalente, débil
altamente específica y está en equilibrio dinámico.
Métodos que ponen de manifiesto la reacción Ag-Ac una vez producida:
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Propiedades físicas de los inmunocomplejos
Posibilidad de combinar diferentes sustancias con la fracción constante de los
Ac (Fc).
Combinarse el inmunoensayo con las células.
Se elegirá un método u otro dependiendo de las características de las moléculas o Ag
que quiere detectarse, su concentración, si es soluble o se expresa en células o tejidos
experiencia, etc.
2. PARA PODER REALIZAR INMUNOENSAYOS HAY QUE DISPONER DE
ANTICUERPOS ESPECÍFICOS:
Para poder realizar inmunoensayos en el laboratorio se necesita obtener anticuerpos
específicos más o menos purificados. Se pueden usar:
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ANTICUERPOS POLICLONALES: se obtienen de sueros de animales
inmunizados por alguna sustancia antigénica. Después de esta
inmunización, se produce la estimulación de distintas células del
sistema inmunitario (macrófagos, dendríticas y linfocitos B y T). los
linfocitos B activados y diferenciados a células plasmáticas secretarán
una mezcla de Ac derivados de la activación de clones de linfocitos B.
este tipo de respuesta es llamada policlonal. Y al suero de un animal que
contiene una mezcla de anticuerpos frente a un inmunógeno se llama
antisuero policlonal o suero inmunitario. Por lo tanto son Ag
heterogéneos y los Ac actúan todos contra un mismo Ag, siendo cada
uno específico para un epítopo diferente.
ANTICUERPOS MONOCLONALES: grandes cantidades de un solo Ac que
reconocen un solo epítopo, ya que todos proceden de un único clon de
linfocitos B. estos Ac monoclonales se obtienen fusionando linfocitos B
de animales inmunizados capaces de producir Ac, con células B
tumorales, produciendo células híbridas inmortales o hibridomas, que
pueden clonarse y cultivarse in vitro. Este hibridoma produce Ac de un
solo tipo y procede de un único clon, se denomina monoclonal.
Estos Ac son útiles para diagnósticos pero si queremos usarlos para
terapia debemos realizar su humanización mediante:
 Anticuerpos quimérico
 Anticuerpos humanizados
 Anticuerpos humanos
3. INMUNOENSAYOS DE PRECIPITACIÓN Y AGLUTINACIÓN:
La formación de inmunocomplejos se realiza mediante la formación de técnicas de
precipitación (cuando el Ag forma parte de un elemento com bacterias , hematíes o
bolitas de látex) o por técnicas de aglutinación (cuando los Ag son solubles). Para
realizar estas técnicas es necesario:
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Tener elevadas concentraciones de Ac y/o Ag.
Que los Ac reconozcan diferentes epítopos del Ag (policlonales).
Ag muestren varios epítopos.
Que la concentración del AC y del AG estén en prorciones óptimas.
Esto permite que los inmunocomplejos precipiten o se produzca aglutinación de las
partículas para poder cuantificar o identificar la presencia del Ag. Por lo que habrá
ténicas cuantitativas (indican concentración) y cualitativas (indican presencia o
ausencia del antígeno).
Algunas técnicas de precipitación son, por ejemplo, la inmunodifusión radial (RID),
inmunodifusion doble, inmunoelectroforesis y nefelometría.
Un ejemplo de técnicas de aglutinación sería: hemaglutinación, también, la
aglutinación bacteriana y el estudio del factor reumatoide.
4. ENZIMO-INMUNO-ANÁLISIS (EIA):
El enzimo-inmuno-analisis llamado ELISA es la técnica más utilizada para cuantificar
cualquier proteína soluble en la mayor parte de los fluidos corporales o medios de
cultivo en el laboratorio. Es un inmunoensayo en medio líquido, donde Ag o Ab está
absorbido sobre un plástico. Tenemos que disponer de Ac monoclonales para la
proteína que se quiere cuantificar. Las más habituales son:
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ELICASA indirecto: cuando queremos cuantificar Ac en suero.
ELICASA en sándwich: cuando lo que se va a cuantificar es una proteína sérica
(no un anticuerpo, como en el anterior).
5. INMUNOENSAYOS RADIACTIVOS:
El radioinmunoensayo (RIA): inmunoensayo basado en el marcaje radiactivo de
antígenos y anticuerpos. Tipos:
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RIA competitivo: es el más usado. La sustancia a cuantificar competirá con
cantidades radiactivas conocidas de esa misma sustancia para unirse con su
anticuerpo específico.
Inmunoprecipitación: para saber si un determinado tipo celular expresa la
proteína de interés, de modo basal o tras la inducción de algún estimulo.
6. INMUNOENSAYOS FLUORESCENTES:
Son inmunoensayos en los que el Ac está acoplado por su porción Fc a una sustancia
fluorescente o fluorocromo. Se usa sobre células en suspensión o fijadas a
portaobjetos. Tipos:
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Inmunofluorescencia indirecta: el Ac fluorescente y el Ag SÍ encuentra otro Ac
sin marcar.
Inmunofluorescencia directa: el Ac fluorescente y el Ag NO encuentra otro Ac
sin marcar.
7. INMUNOENSAYOS REVELADOS POR COMPLEMENTO:
Hay técnicas que activan la reacción Ag-Ac mediante el uso del sistema del
complemento. El ejemplo más importante es el de microlinfocitotoxicidad, que se
emplea para la tipificación serológica del sistema HLA.
8. ENSAYOS EN LA RESPUESTA INMUNITARIA INNATA:
Pruebas que se realizan en el laboratorio para evaluar la inmunidad innata:
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Función global del sistema del complemento: mediante la prueba del CH50,
que cuantifica su capacidad hemolítica, expresada como la dilución del suero
en estudio, necesaria para provocar la lisis del 50% de lo hematíes
sensibilizados con un anticuerpo natural.
Por fagocitosis: por la función celular de monocitos-macrófagos y algunos
granulocitos.
Choque o explosión oxidativa: las células fagocíticas degradan
intracelularmente los microbios fagocitados.
Citotoxicidad mediada por linfocitos NK: consiste en enfrentar los linfocitos del
individuo estudiado, con una línea celular sensible a la acción de NK.
9. ENSAYOS DE RESPUESTA INMUNITARIA ADAPTATIVA:
Hay diferentes pruebas que nos permiten evaluar la inmunidad adaptativa de un
individuo:
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ELICASA: (nombrado anteriormente).
Separación celular inmuno-magnética: se mezcla la suspensión celular (sangre)
con microesferas magnéticas recubiertas de un Ac monoclonal, que luego se
acercara a un tubo de ensayo con un potente imán que atrapará las
microesferas. Se decanta su contenido sin llegar a separa el tubo del imán.
De manera in vitro: mediante la estimulación de linfocitos con mitógenos
(inductores de mitosis), se suelen usar como mitógenos: lectinas vegetales,
determinadas sustancias químicas, Ac monoclonales, citocinas y
superantígenos bacterianos. Después de esta estimulación con mitógenos, se
evalúa la función celular midiendo la proliferación de los mitógenos mediante
la síntesis de ADN (la manera más habitual).
La citolisis mediada por linfocitos Tc (CD8+): es la única específica de Ag,
necesita sensibilización previa, está restringida por HLA y se evalua mediante la
lisis específica inducida sobre células diana.
Técnica de ELISPOT: identifica y cuantifica las células B formadoras de Ac
específicos para un Ag dado. También se usa para cuantifiar los linfocitos T que
sintetizan citocinas frente a un Ag determinado.
10. PRUEBAS ESPECÍFICAS:
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DE HIPERSENSIBILIDAD Y ALERGIA: la presencia de IgE específica responsable
de las respuestas de hipersensibilidad inmediata se puede determinar in vitro
por pruebas cutáneas, que consisten en la exploración epicutánea o
subcutánea al alérgeno sospechoso. Se colocan los alérgenos sobre la piel del
paciente y se añaden una gota de incisión o arañazo, se deja actuar un tiempo y
si el paciente está sensibilizado, la IgE desencadenará la desgranulación
instantánea de los mastocitos que producirá una inflamación local en el lugar
donde el paciente sea sensible al alérgeno.
DE AUTOINMUNIDAD: por inmunodeficiencia indirecta (IFI): detecta la
presencia de Ac circulantes, necesarios para el correcto diagnóstico de
enfermedades autoinmunitarias.
DE HISTOCOMPATIBILIDAD: se realiza el “tipaje” de los antígenos HLA de
donantes y receptores. Para prevenir el rechazo hiperagudo de los trasplantes
se estudiará los anticuerpos anti-HLA de receptores, también se estudiará los
HLA de donantes.
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DE INMUNODEFICIENCIAS: las inmunodeficiencias son enfermedades
hereditarias. Para detectar estas enfermedades alguno de los siguientes
estudios debería resultar anormal: estudio de las subpoblaciones de linfocitos
circulantes y la cuantificación de principales Ig séricas.
11.MICROMATICES:
Los primeros fabricados han sido los de ADN, que fijan una colección de miles de
sondas genéticas sobre una matriz física. Así, con un solo ensayo se estudia la
expresión de miles de genes de un determinado tipo celular mediante la hibridación
del ARN mensajero de la célula con todas las sondas fijadoras en el soporte.
Actualmente, existen los chips o arrays con miles de Ag adheridos sobre un soporte
sólido. Al añadir suero de un paciente sobre ellos, se pueden realizar miles de
inmunoensayos y detectar la IgE específica en un proceso alérgeno o la presencia de
un autoanticuerpo. Si pegamos sobre el soporte sólido cientos de anticuerpos
diferentes, detectaremos la presencia de un determinado Ag, esta técnica se llama
inmunoarrays.