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Universidad de La Habana Facultad de Química Tesis de Diploma Comparabilidad estructural mediante MALDI-MS de la secuencia aminoacídica del Racotumomab obtenido por dos fuentes diferentes. Autora: Loida Coto Oruña Tutor: Lic. José Alberto Gómez Pérez Centro Inmunología Molecular 2016 ¡No es grande el que se deja arrebatar por la vida, sino el que la doma! ¡No el que va, palpitante y rugiente, por donde sus pasiones, o las ajenas, lo empujan, sino el que clava los pies en medio de la vida, y enfrenta a los demás y a si propio, y ve – como por sobre dosel – sus pasiones domadas! José Martí Obras Completas. T. 2, pág. 403, párr. 5, lín. 4 A mi madre, por su incondicionalidad inamovible y por asumir mis expectativas como suyas propias, y a mi esposo, por su apoyo en los momentos buenos y malos durante los cinco años de mi carrera y por estar presente siempre que lo necesité Agradecimientos: Primeramente agradecerle a Dios que en todo momento estuvo conmigo guiando mis pasos A la Revolución por haberme permitido estudiar en esta facultad A mi tutor, sin el cual esta tesis no hubiera sido posible, por sus consejos siempre tan oportunos, por su apoyo, paciencia y por todo lo que me enseñó durante este tiempo A mis padres por estar s a mi lado apoyándome en mis decisiones y nutriéndome con sus experiencias y consejos, pero sobre todo gracias por enseñarme a ser perseverante y por adentrarme en los caminos de la ciencia. En especial a mi madre por su presencia integra e incondicional durante estos 5 años, sin la cual no hubiera tenido el valor suficiente para llegar hasta aquí. Gracias a mi compañero de vida, Jorge, por su apoyo durante estos 5 años tan importantes para mí, por estar ahí justo en el momento preciso, por su sinceridad y comprensión, por todo su amor, ese amor tan grande que me dio fuerzas para superar tantas cosas que se avecinaron durante mi carrera. A mis suegros y a María por brindarme todo su cariño A la profe Loli de la facultad por su ayuda y disposición, por sus consejos para la confección de la tesis A todos los compañeros del departamento de Calidad de productos en desarrollo del CIM, en especial a Tania Gómez porque con una espontaneidad inmensa me ofreció su colaboración apoyo y tiempo, a Azalia porque enseguida se movilizó en función de imprimir mi tesis, a Lisel y a Joaquín por su preocupación, a todos muchas gracias incluyendo a mi tutor por acogerme como uno de ustedes y hacerme sentir en familia. A Aymed por ofrecerme su ayuda, y a todas las personas del CIM que de una forma u otra contribuyeron a que esta tesis fuera posible. A Shey por ser mi compañera de estudio durante la universidad, por estar ahí tan sincronizada conmigo cuando más lo necesité, por compartir conmigo tantas madrugadas en vela estudiando, rifándonos quien iba a hacer el café para no quedarnos dormidos y sobre todo por brindarme su amistad que vale oro. A Lidin que aunque no siguió con nosotros en la carrera también formó parte de mi círculo de estudio y compartimos muchos momentos juntas A Greter que fue como una amiga con espíritu de madre, por sus consejos y preocupación desde que nos conocimos A Claudia Iriarte, por estar en todo momento disponible durante estos 5 años cada vez que teníamos alguna duda, y por decir cuando más lo necesitamos: caballero acuérdense que me pueden llamar a cualquier hora, mil gracias iri A todos los profesores de la facultad principalmente a aquellos que me impartieron clases, de los cuales guardaré siempre los conocimientos recibidos y muchos recuerdos gratos Gracias a mis amigas de la Lenin, en especial a: Romy y a Amanda porque me han brindado su apoyo incondicional, por escucharme y recordarme siempre, que puedo contar con ellas para lo que sea A mis sobris: Eylincita y Jorge y a mi cuñi Manuel que estuvieron siempre al tanto de mí A todos mis compañeros de aula por estar presentes cada día de clases y compartir los momentos buenos y malos de la carrera. Abreviaturas y siglas ABREBIATURAS Y SIGLAS 1E10 aa AcM ACN ADCC AEX AF4 Asu CD CDC CDR CE-SDS CEX CH cIEF CIM CL DRX DSC DTT E1 E2 EMA ESI Fab FAB Fc FDA FTIR Fuc Gal HC HDX-MS HHL Hi HL IAA ICH anticuerpo monoclonal Racotumomab aminoácido anticuerpo monoclonal acetonitrilo citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (del inglés: antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) Cromatografía de intercambio aniónico (del inglés: Anion exchange Chromatography) Fraccionamiento en flujo con campo de flujo asimétrico (del inglés: Asymmetrical flow field-flow fractination) succinimida Dicroísmo circular (del inglés: circular dichroism) citotoxicidad dependiente del complemento (del inglés: complement dependent cytotoxicity) Regiones determinantes de la complementariedad (del inglés: complementaritydetermining region) Electroforesis Capilar con dodecilsulfato de sodio (del inglés: Capillary Electrophoresis - Sodium Dodecyl Sulfate) Cromatografía de intercambio Catiónico (del inglés: Cationic Exchange Chromatography) dominio constante de la cadena pesada (del inglés: constant domain of heavy chain) capilaridad con un enfoque isoeléctrico (de sus siglas en inglés: capillary IsoElectric Focusing) Centro de Inmunología Molecular dominio constante de la cadena ligera (del inglés: constant domain of light chain) Difracción por rayos X Calorimetría diferencial de barrido (del inglés: Differential Scanning Calorimetry) ditiotreitol primera solución de elución de la extracción en fase sólida segunda solución de elución de la extracción en fase sólida Agencia europea de medicamentos (del inglés: European Medicines Agency) Ionización por electronebulización (del inglés: Electrospray Ionization) fragmento de unión al antígeno (del inglés: antigen-binding fragment) Bombardeo con átomos rápidos (del inglés: Fast Atom Bombardment) fragmento cristalizable (del inglés: crystallizable Fragment) Administración de alimentos y medicamentos (del inglés: Food and Drug Administration) Transformada de fourier infrarroja (del inglés: Fourier transform infrared) fucosa galactosa cadena pesada (del inglés: heavy chain) Espectrometría de masas por intercambio de hidrogeno deuterio (del inglés: hydrogen deuterium exchange mass spectrometry) variante sin una cadena ligera (del inglés: variant with one missing light chain) región bisagra (del inglés: hinge region) la mitad del AcM (del inglés: half antibodies) iodoacetamida de acuerdo con la Conferencia Internacional sobre la Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de las guías productos farmacéuticos para uso humano (de sus siglas en inglés: According to the International Conference on Harmonization of Techical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use guideline) Abreviaturas y siglas IEF Ig IgG isoAsp LAM LC LMW PTMs MALDI m/z Man MP MS NAcGlc NANA NGNA PD PK Qpir RMN SEC SE-HPLC SPR TA TOF VH VL Focalización isoeléctrica (del inglés: isoelectric focusing) inmunoglobina inmunoglobina de tipo G isoaspártico líquido ascítico murino cadena ligera (del inglés: Light chain) monómero de bajo peso molecular (del inglés: low-molecular weight) modificaciones post-traduccionales (del inglés: post-translational modifications) Ionización mediante desorción por láser asistida por una matriz (del inglés: Matrix assisted Laser Desorption Ionization) Relación masa/carga manosas mapeo de péptidos Espectrometría de masas (del inglés: mass spectrometry) N-acetilglucosamina ácido N-acetilneuramínico ácido N-glicolilneuramínico Farmacodinámica (del inglés: pharmacodynamics) Farmacocinética (del inglés: pharmacokinetics) ácido piroglutámico Resonancia magnética nuclear Cromatografía de exclusión molecular (del inglés: Size Exclusion Chromatography) HPLC de exclusión molecular Resonancia de plasmones superficiales (del inglés: Surface Plasmon Resonance) tanque agitado Analizador de tiempo de vuelo (del inglés: Time-Of-Flight) dominio variable de la cadena pesada (del inglés: variable domain of heavy chain) dominio variable de la cadena ligera (del inglés: variable domain of light chain) Códigos de tres letras y de una letra utilizados en este trabajo para los aminoácidos Aminoácido Ácido Aspártico Ácido Glutámico Alanina Arginina Asparagina Cisteína Fenilalanina Glicina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Prolina Serina Tirosina Triptófano Treonina Valina Código de tres letras Asp Glu Ala Arg Asn Cys Phe Gly Gln His Ile Leu Lys Met Pro Ser Tyr Trp Thr Val Código de una letra D E A R N C F G Q H I L K M P S Y W T V Resumen RESUMEN El Racotumomab (1E10) es un anticuerpo monoclonal (AcM) anti-idiotipo de origen murino, que es utilizado para el tratamiento del cáncer de pulmón. Dicho producto puede ser obtenido a partir de dos fuentes diferentes: una es in vivo, a partir del líquido ascítico murino proveniente de ratones (AcM 1E10 LAM) y la otra industrial basada en la fermentación en biorreactores de tanque agitado (AcM 1E10 TA). En el Centro de Inmunología Molecular (CIM) el AcM 1E10 se produce por la segunda vía, ya que es la más recomendada. Las agencias regulatorias establecen que ante cualquier cambio en el proceso de obtención de un AcM, el productor tiene que demostrar que este no altera la eficacia clínica o la seguridad del producto biológico, por lo que cualquier variación realizada en el proceso de fabricación de un bioterapéutico debe estar aparejada de un estudio de comparabilidad. En este trabajo se realizó un estudio de comparabilidad entre el AcM 1E10 LAM y el AcM 1E10 TA. Para este propósito se empleó la espectrometría de masas MALDI-TOF y se logró mapear el 72,0% de la cadena pesada y el 73,8% de la cadena ligera del AcM 1E10 TA. Así como, el 66,3% de la cadena pesada y el 72,0% de la cadena ligera del AcM 1E10 LAM. Además, se determinaron las modificaciones post-traduccionales (PTMs) presentes en ambos productos. Luego, de los resultados obtenidos se concluyó que ambas moléculas son estructuralmente comparables. Abstract ABSTRACT The Racotumomab (1E10) is an anti-idiotype murine origin monoclonal antibody (MAb), which is used for the treatment of lung cancer. This product can be obtained by two different sources: one is in vivo, from mouse ascites fluid (1E10 LAM) and the other is based on the fermentation in stirred tank bioreactors (1E10 TA). In the Center of Molecular Immunology (CIM), the 1E10 MAb is produced by the second route, since it is the most recommended. The Regulatory agencies require that before any change in the production process of a MAb, the producer has to show that the change does not alter neither, the clinical efficacy or the safety of the product. So, any changes made to the manufacturing process of a biotherapeutic, must be accompanied by a comparability study. In this work, it was accomplished a comparability study between the 1E10 MAb produced from LAM and Stirred Tank bioreactors. For this purpose, it was used MALDITOF Mass Spectrometry technology, that allowed to map the 72,0% of the heavy chain and the 73,8% of the light chain of the 1E10 TA, and also, the 66,3% of the heavy chain and the 72,0% of the light chain from 1E10 LAM. Also, it was determined the posttranslational modifications present in the MAb obtained from both sources. Then, from the obtained results, it was concluded that both molecules are structurally comparable. Índice ÍNDICE ÍNDICE .......................................................................................................................................................................... 8 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................................... 1 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 4 1.1 ANTICUERPOS MONOCLONALES ...................................................................................................... 4 1.1.1 Características generales y surgimiento de los Anticuerpos monoclonales .......................... 4 1.1.2 Anticuerpos monoclonales para uso terapéutico ................................................................... 5 1.2 RACOTUMOMAB (NOMBRE COMERCIAL VAXIRA®) ........................................................................ 7 1.2.1 1.3 LOS ANTICUERPOS EN LA INDUSTRIA BIOFARMACÉUTICA. BIOSIMILARES ...................................... 9 1.4 ESTUDIOS DE COMPARABILIDAD ................................................................................................... 10 1.5 CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ............................................................... 12 1.6 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES POR HETEROGENEIDADES DE CARGA.......................... 15 1.6.1 Glicosilación de proteínas................................................................................................... 16 1.6.2 Oxidación de metionina ...................................................................................................... 18 1.6.3 Deamidación de asparagina ................................................................................................ 19 1.6.4 Residuos de ácido piroglutámico en el N-terminal de las IgGs .......................................... 20 1.6.5 Modificaciones del C-terminal ........................................................................................... 21 1.7 LAS TÉCNICAS DE IONIZACIÓN SUAVE ........................................................................................... 21 1.7.1 1.8 2 MALDI-TOF ...................................................................................................................... 22 HERRAMIENTAS COMPUTACIONALES PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR MALDI-MS ............ 24 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................... 26 2.1 REACTIVOS, MUESTRAS Y DISOLVENTES ....................................................................................... 26 2.2 PROCEDIMIENTO PARA LA DESGLICOSILACIÓN ............................................................................. 27 2.3 EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS ..................................................................................................... 27 2.4 DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS A UTILIZAR ................................................................................. 28 2.4.1 3 Obtención del Racotumomab ............................................................................................... 8 Procedimiento para la digestión. ......................................................................................... 28 2.4.1.1 Preparación de los Tampones .................................................................................................. 28 2.4.1.2 Reducción y Alquilación ......................................................................................................... 28 2.4.1.3 Digestión con las enzimas Tripsina y Lys-C ........................................................................... 28 2.4.2 Purificación mediante Extracción en fase sólida con cartuchos C18 .................................. 29 2.4.3 Espectrometría de masas MALDI-TOF .............................................................................. 29 2.4.3.1 Preparación de la matriz para MALDI .................................................................................. 29 2.4.3.2 Preparación de las muestras para el análisis por masas ........................................................... 29 2.4.3.3 Obtención y registro de los espectros de masa con ionización MALDI .................................. 29 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 31 3.1 COMPARABILIDAD ESTRUCTURAL DE LAS MOLÉCULAS 1E10 LAM Y 1E10 TA ........................... 31 Índice 3.1.1 Análisis de la estructura primaria ....................................................................................... 32 3.1.2 Análisis de los extremos ..................................................................................................... 42 3.1.2.1 Extremo N-terminal de la cadena pesada ................................................................................ 42 3.1.2.2 Extremo C-terminal de la cadena pesada ................................................................................ 43 3.1.2.3 Extremo N-terminal de la cadena ligera .................................................................................. 46 3.1.2.4 Extremo C-terminal de la cadena ligera .................................................................................. 47 3.1.3 Análisis de otras modificaciones post-traduccionales ........................................................ 49 3.1.3.1 Deamidación de Asparagina .................................................................................................... 49 3.1.3.2 Oxidación de metionina .......................................................................................................... 54 3.1.4 Análisis de los perfiles de glicosilación .............................................................................. 56 3.1.5 Consideraciones finales ...................................................................................................... 61 CONCLUSIONES ...................................................................................................................................................... 64 RECOMENDACIONES ............................................................................................................................................ 65 REFERENIAS ............................................................................................................................................................ 66 ANEXOS ..................................................................................................................................................................... 75 Introducción INTRODUCCIÓN Debido a la elevada incidencia del cáncer en Cuba y en el resto del mundo, esta dolencia se ha convertido en una de las principales causas de muerte durante los últimos años. En la búsqueda de novedosos esquemas terapéuticos, el Centro de Inmunología Molecular (CIM), ha desarrollado el anticuerpo monoclonal Racotumomab (1E10), comercialmente conocido como Vaxira, el cual ha sido aplicado con prometedores resultados clínicos en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas. La seguridad e inmunogenicidad de la vacunación idiotípica con el AcM 1E10 ha sido demostrada en ensayos clínicos fase I en pacientes con cáncer de mama, melanoma y pulmón [1-4]. En la actualidad, el AcM 1E10 se obtiene a partir de líquido ascítico murino (LAM). Este método permite obtener pequeñas cantidades de anticuerpo muy concentrado sin la necesidad de una alta tecnología. El proceso de obtención de bioproductos a partir de esta fuente, tiene como inconveniente el alto costo que representa mantener animales de experimentación en condiciones asépticas, la dificultad para el escalado del proceso y el alto riesgo de contaminación con agentes adventicios provenientes del ratón como virus y ADN [5]. Por otro lado, en la mayoría de los países desarrollados el uso de fluido ascítico murino para la producción de bioterapéuticos está restringido a casos excepcionales y algunos países prohíben la utilización masiva de animales para este fin debido a consideraciones éticas sobre el bienestar de los animales [5]. En la actualidad, las agencias regulatorias europea y norteamericana justifican el uso de ascitis solo en casos excepcionales donde se demuestre que la molécula no se puede obtener en un sistema in vitro [6]. Por las razones antes expuestas, el CIM ha desarrollado una estrategia de producción de dicho anticuerpo a escala industrial que consiste en un proceso de fermentación en tanque agitado utilizando un medio químicamente definido, libre de proteínas, lo cual es fundamental para la manufactura de un AcM de alta pureza y de calidad consistente lote a lote [7]. Los anticuerpos monoclonales son productos extraordinariamente heterogéneos [8] y cualquier cambio en el proceso de fabricación puede conllevar a variaciones en las modificaciones post-traduccionales (PTMs) del producto, las cuales pueden tener un impacto 1 Introducción (o no) en la calidad, la seguridad y potencia del mismo [9, 10]. Solamente unas pocas diferencias entre ambos producto son aceptadas por las autoridades sanitarias, con la seguridad de que estas no tienen relevancia clínica [9, 11]. Para demostrar que los cambios realizados en el proceso productivo no afecta la seguridad y eficacia clínica del producto biológico, las agencias regulatorias exigen que se realice un estudio de comparabilidad entre los productos obtenidos antes y después del cambio de proceso [6]. Los estudios de comparabilidad parten de la comparación estructural de las moléculas. La demostración de comparabilidad no requiere que los atributos de producto precambio y post-cambio deben ser idénticos, sino que entre ellos exista una alta similitud, y que la secuencia aminoacídica sea la misma para ambos [12, 13]. Una de las técnicas analíticas más altamente utilizadas para este tipo de estudios es la espectrometría de masas (MS), esta se ha implementado considerablemente en la caracterización de proteínas terapéuticas y la detección de las modificaciones post-traduccionales debido a su sensibilidad analítica, especificidad y selectividad [14]. Específicamente la espectrometría de masas MALDI-TOF es un poderoso método para identificar compuestos de elevada complejidad estructural. En un estudio inicial a escala de banco, se realizó una comparabilidad de un lote de AcM 1E10 producido a partir de fluido ascítico murino y otro a partir de biorreactores, del cual se concluyó que ambas moléculas eran comparables [15]. Posteriormente se realizó un cambio en la escala de producción de 10L a 41L, esto conllevó a un nuevo estudio de comparabilidad entre los productos obtenidos a partir de las diferentes escalas [16]. No obstante, en estos estudios no fue posible mapear el 100% de la secuencia aminoacídica de la molécula, lo que constituye un requisito indispensable en los estudios de comparabilidad para biosimilares y cambios de proceso [17]. Tampoco fueron identificados todos los extremos terminales de las cadenas pesadas y ligeras del AcM 1E10, quedando estos estudios incompletos, en cuanto a la estructura primaria del AcM 1E10. Además, el estudio de comparabilidad entre el AcM 1E10 obtenido a partir de la nueva escala de producción (41L) y el obtenido por ascitis, no ha sido realizado todavía. 2 Introducción Por las razones antes mencionadas se plantea el siguiente problema científico: ¿La introducción de cambios en el proceso productivo a escala industrial del AcM 1E10 provocará variaciones en su estructura primaria con relación al obtenido a partir de líquido ascítico murino (1E10 LAM)? Para dar respuesta a este problema científico, se propuso la siguiente hipótesis: La utilización de la espectrometría de masa MALDI-TOF permitirá determinar la estructura primaria del AcM 1E10 y de esta manera realizar una comparabilidad estructural del anticuerpo en los procesos de obtención a partir de líquido ascítico murino (1E10 LAM) y de fermentación en tanque agitado (1E10 TA). El objetivo general de este trabajo fue: Realizar un estudio de comparabilidad en cuanto a la estructura primaria y posibles modificaciones post-traduccionales del AcM 1E10 obtenido a partir de biorreactores y líquido ascítico, mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Para el cumplimiento del mismo se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Mapear la secuencia aminoacídica del 1E10, incluyendo posibles modificaciones posttraduccionales a partir de los espectros de masas obtenidos para ambos productos. 2. Identificar el perfil de glicoformas del 1E10 producido por ambos procesos, haciendo uso de los espectros de masas correspondientes en cada caso. 3. Comprobar la comparabilidad de las estructuras primarias del anticuerpo 1E10 LAM y 1E10 TA mediante el análisis de los resultados obtenidos. 3 Revisión Bibliográfica 1. 1.1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Anticuerpos monoclonales 1.1.1 Características generales y surgimiento de los Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos son glicoproteínas solubles miembros de una familia de moléculas conocidas como inmunoglobulinas (Ig), que constituyen la rama humoral del sistema de respuesta inmune, siendo sintetizadas y secretadas de manera exclusiva por un tipo particular de glóbulo blanco denominado linfocito B; y que reconocen específicamente un determinante antigénico (epítope) dado [18]. En 1975, en un trabajo que posteriormente les valió el premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein demostraron la posibilidad de producir anticuerpos monoclonales (AcMs) mediante la fusión de linfocitos B con células mielomatosas (células tumorales inmortales); donde los híbridos resultantes heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, siendo posible el aislamiento de aquellos híbridos secretores del anticuerpo en el cual se está interesado [19]. Así nacieron los AcMs, posteriormente denominados de primera generación, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante técnicas de biología molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generación. Entre los AcMs de segunda generación se destacan los anticuerpos quiméricos y humanizados; construcciones genéticas en las cuales se conservan las regiones variables del anticuerpo original de ratón, o incluso solo los CDR (Regiones Determinantes de la Complemetariedad o hipervariables) y unos pocos residuos adicionales, trasplantados sobre un contexto totalmente humano (framework o regiones constantes) (Fig. 1). De esta forma se le dota al anticuerpo de las funciones efectoras propias de las inmunoglobulinas humanas, conservándose la especificidad del AcM murino; y reduciéndose las posibilidades de reacción humano – antimurino; por lo que aumenta su eficacia terapéutica [18, 20]. 4 Revisión Bibliográfica Fig. 1 Evolución de los Anticuerpos monoclonales. Desde su descubrimiento hasta la fecha, los AcMs se han convertido en una herramienta fundamental de la investigación biomédica, encontrando una de las aplicaciones de mayor interés en el monitoreo, diagnóstico y tratamiento de tumores malignos. 1.1.2 Anticuerpos monoclonales para uso terapéutico Los anticuerpos terapéuticos han sido vehículos atractivos para el diseño de fármacos debido a su alta especificidad, impacto terapéutico, y de larga vida media in vivo. En el caso de los anticuerpos monoclonales como una clase terapéutica, son fácilmente adaptables a una variedad de usos en formas que las moléculas pequeñas no son capaces y presentan un perfil farmacocinético mejorado en comparación con las proteínas de fusión asociadas por sí solas [21]. Los anticuerpos terapéuticos pueden ser producidos por hibridomas generados a partir de la fusión estable de células de mieloma inmortalizadas con células B de ratones inmunizados con un antígeno de interés. También pueden ser generados mediante técnicas de ADN recombinante o por otras vías como: animales modificados genéticamente (Ej: ratones transgénicos con repertorios inmunes humanos) [9]. Actualmente todos los anticuerpos terapéuticos comercializados son moléculas de inmunoglobina de tipo G (IgG), predominantemente de la subclase IgG1, y solo unos pocos son IgG2 e IgG4. Las IgG3 no se han desarrollado con fines terapéuticos debido a que presentan una vida media más corta, y son susceptibles a la proteólisis en la región bisagra y polimorfismo atípico extensivo. También se han desarrollado algunos derivados de estas 5 Revisión Bibliográfica moléculas con fines terapéuticos tales como: fragmentos Fab, proteínas de fusión Fc, anticuerpos conjugados, radioinmunoconjugados y anticuerpos bioespecíficos [9]. Estructuralmente las IgGs son glicoproteínas tetrámeras con un peso molecular de aproximadamente 150kDa. Están compuestas por dos cadenas pesadas idénticas (HC, alrededor de 50kDa) y dos cadenas ligeras idénticas (LC, alrededor de 20kDa). Los puentes disulfuros (16 para IgG1 e IgG4 y 18 para IgG2) e interacciones no covalentes mantienen su estructura tridimensional [9]. La cadena ligera de la IgG1 está conectada a la cadena pesada por un enlace disulfuro entre el último residuo de cisteína de la cadena ligera y el quinto residuo de cisteína de la cadena pesada (Fig. 2). Sin embargo, para las IgG2 e IgG4, la cadena ligera está ligada a la cadena pesada por un enlace disulfuro entre el último residuo de cisteína de la cadena ligera y el tercer residuo de cisteína de la cadena pesada. Las dos cadenas pesadas están conectados en la región bisagra (Hi) por un número variable de enlaces disulfuro: 2 para IgG1 e IgG4 y 4 para IgG2. Los restantes 12 puentes disulfuro son intra-cadenas y delimitan 6 dominios globulares diferentes. Un dominio variable (VL) y uno constante (CL) para las cadenas ligeras y un dominio variable (VH) y tres constantes para las cadenas pesadas (CH1, CH2 y CH3) (Fig. 2). Los residuos de cisteína que forman los enlaces disulfuro inter-cadenas se encuentran en la región bisagra con la excepción del tercer residuo de cisteína de la cadena pesada en las IgG2 e IgG4, que está situado entre la interfaz de los dominios VH y CH1 [2224]. Funcionalmente, las IgGs consisten en un fragmento cristalizable (Fc) y dos fragmentos idénticos de unión al antígeno (Fab) conectados por una región bisagra flexible. El Fab, o fragmento de unión al antígeno, se compone de la región N-terminal de la cadena pesada (Fd) y de toda la cadena ligera. Este fragmento está compuesto de un dominio constante (CH1 y CL) y otro variable de cada una de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo (VH y VL). La región variable contiene una región determinante de complementariedad (CDR) al final de la superficie de la IgG, que se une al antígeno y presenta una alta especificidad (Fig. 2). La región Fab se conecta a la Fc por una región bisagra, que le ofrece flexibilidad a las IgGs. El fragmento Fc se compone de los dominios constantes CH2 y CH3 de ambas cadenas pesadas. Estas regiones difieren entre isotipos de IgGs pero no varían en secuencia de 6 Revisión Bibliográfica aminoácidos entre los anticuerpos de un solo isotipo. Un elemento importante a considerar del Fc, es que incluye un sitio de glicosilación conservado para las IgGs [22, 23, 25]. La simplicidad y una mayor estabilidad de la estructura de las IgGs1 la han hecho la plantilla más común para el diseño de anticuerpos terapéuticos. Fig. 2 Estructura global de la IgG1. 1.2 Racotumomab (nombre comercial Vaxira®) Vaxira es una vacuna terapéutica cuyo principio activo es el anticuerpo monoclonal antiidiotipo Racotumomab adsorbido en gel de hidróxido de aluminio como adyuvante. Este producto demostró interesantes beneficios en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas [2]. El Racotumomab es un anticuerpo monoclonal murino de la subclase IgG1 que se obtuvo por la inmunización de ratones Balb/c con el anticuerpo monoclonal P3 [16, 26]. Este último es un anticuerpo monoclonal murino de la subclase IgM que fue generado por la inmunización de ratones Balb/c con el gangliósido NGcGM3 [27]. El AcM P3 reconoce específicamente los gangliósidos que tienen ácido siálico N-glicolilados, en particular al gangliósido N-Glicolil GM3 (NeuGcGM3), un tipo de antígeno tumoral presente en la superficie de células cancerosas de pulmón, mama y melanoma (Fig. 3). Existen varios anticuerpos generados contra el AcM P3, de ellos el más estudiado es el AcM 1E10. Este anticuerpo tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune en especies donde este antígeno no es propio, como son los humanos y los pollos [26, 28]. El gangliósido NeuGcGM3 participa en la promoción de la proliferación de las células malignas y la neoangiogénesis tumoral, constituyendo un blanco idóneo para la inmunoterapia del cáncer. 7 Revisión Bibliográfica Fig. 3: Esquematización de la estructura trisacarídica del gangliósido NeuGcGM3 y su expresión en células tumorales. La inmunización de pacientes portadores de tumores de pulmón de células no pequeñas con la vacuna Vaxira induce en los pacientes la producción de anticuerpos específicos de isotipo IgG e IgM contra el gangliósido NeuGcGM3, capaces de reconocer este antígeno y provocar el lisado de la superficie tumoral (Fig. 4) [1]. Fig. 4 Respuesta inmunológica simplificada de Vaxira. 1.2.1 Obtención del Racotumomab El 1E10 se puede obtener tanto a partir de líquido ascítico murino (LAM) mediante la tecnología de hibridomas, o mediante el cultivo de estos hibridomas en biorreactores. La tecnología de hibridomas se basa en la fusión de células de diferentes tipos y de diferentes especies para formar híbridos. Una línea celular productora de anticuerpos generada por esta tecnología, proviene de la integración física, mediante un agente fusógeno, de células productoras de anticuerpos de un animal inmunizado y células de una línea de plasmacitoma con un similar estadio de diferenciación. El hibridoma resultante puede preservar la capacidad 8 Revisión Bibliográfica de secretar inmunoglobulinas específicas y la posibilidad de reproducirse indefinidamente. Esta metodología ha resultado muy exitosa con células de ratón y rata [29]. El uso de ascitis murina para producir AcMs a escala industrial es altamente costoso y es cada vez más cuestionado por las agencias regulatorias. En este método se necesitan miles de ratones que deben ser mantenidos en condiciones asépticas y monitoreados a diario como control de proceso, con el consiguiente costo en instalaciones y personal de trabajo. Por otro lado, la ascitis obtenida debe ser rigurosamente caracterizada para determinar los niveles de endotoxinas, esterilidad y presencia de virus murinos [30]. Por las razones anteriormente señaladas, la obtención del AcM 1E10 (Racotumomab) se realiza actualmente a partir de biorreactores de tanque agitado con células de hibridomas en un medio libre de proteínas en modo perfusión [7]. 1.3 Los anticuerpos en la industria Biofarmacéutica. Biosimilares Los anticuerpos monoclonales constituyen la categoría más dominante y de más rápido crecimiento dentro de las terapias biológicas en el mercado y en los proyectos en desarrollo. En los últimos 25 años más de 30 inmunoglobinas y sus derivados han sido aprobados para uso en varias indicaciones terapéuticas como: tratamiento de diversos cánceres y enfermedades inmunológicas [31]. Muchas patentes biofarmacéuticas registradas expirarán la próxima década, lo cual constituye una gran oportunidad para los productos biosimilares de entrar en el mercado mundial. Los biosimilares se definen como medicamentos biológicos comparables (pero no idénticos) en la calidad, seguridad y eficacia con los productos de referencia [32]. En el caso de los anticuerpos biosimilares estos son versiones de las copias originales que estarán fuera de la patente en los próximos años, y presentan una actividad biológica similar a la del producto original [9, 33]. A diferencia de las versiones genéricas de pequeñas moléculas (150 Da - 600Da), no es posible producir copias moleculares exactas de tales glicoproteínas grandes y complejas (150 000Da). Los biosimilares son producidos a partir de clones de diferentes células y diferentes procesos de fabricación. Como consecuencia, se pueden observar diferencias en la glicosilación y otras microvariaciones, que pueden tener un impacto (o no) en la calidad, la seguridad y potencia del 9 Revisión Bibliográfica producto [15, 34, 35]. Solo muy pequeñas diferencias entre el biosimilar y el AcM de referencia pueden ser aceptadas por las autoridades sanitarias, con la seguridad de que estas diferencias no tienen relevancia clínica. Algunas de estas diferencias son inevitables y pueden ser atribuidas al proceso de producción (materias primas, sistema de expresión, clonación de genes, condiciones de fermentación, procesos de purificación, formulación y empaquetado) [6]. El desarrollo de biosimilares implica un enfoque iterativo que conduce a un proceso de fabricación que ofrece un producto altamente similar. Posteriormente, la similitud con el producto original se demuestra por un amplio programa de comparabilidad. El desarrollo biosimilar comienza con una profunda caracterización del producto original para obtener la mayor comprensión posible del producto original. Sobre la base de esta caracterización, se ejecuta un programa de comparabilidad molecular, pre-clínico y clínico para demostrar y confirmar la biosimilitud [6, 36]. 1.4 Estudios de comparabilidad Los productos biológicos varían en el transcurso del tiempo como consecuencia de modificaciones al proceso productivo. Consecuentemente, los productores necesitan demostrar la consistencia y robustez del proceso productivo, implementando buenas prácticas productivas, modernos controles de calidad, procedimientos de aseguramiento de la calidad, controles en proceso y validación de los procesos [6]. Debido a que los AcMs son moléculas complejas que poseen una alta heterogeneidad estructural determinada por la presencia de diferentes modificaciones post-traduccionales, cualquier cambio en los procesos productivos, podrían ocasionar variabilidad de los atributos de calidad del producto [21]. Por esto, los cambios en los procesos productivos de las proteínas de uso terapéutico están estrechamente vigilados por las agencias regulatorias. Ante cualquier cambio en el proceso productivo, el productor tiene que demostrar que el cambio no altera la eficacia clínica o la seguridad del producto biológico. La evaluación de estos cambios se realiza mediante un estudio de comparabilidad entre los productos obtenidos antes y después del cambio de proceso. Los estudios de comparabilidad deben realizarse según los criterios establecidos en las guías para la producción de productos biológicos (ICH). En la guía 10 Revisión Bibliográfica ICHQ5E se establece que ―la demostración de comparabilidad no significa necesariamente que los atributos de producto pre-cambio y post-cambio deben ser idénticos, sino que entre ellos exista una alta similitud, el conocimiento generado en el estudio debe ser lo suficientemente predictivo como para asegurar que los cambios observados no tienen efecto adverso en la eficacia o seguridad del producto‖ [37]. Los estudios de comparabilidad parten de la comparación estructural de los productos. Para ello son empleados métodos analíticos actuales que posibilitan detectar pequeños cambios estructurales en los anticuerpos, los cuales son monitoreados para determinar la consistencia y la variabilidad lote a lote del proceso productivo. Dependiendo del tipo de cambio, estos se categorizan como de riesgo bajo, moderado o alto [6, 38]. En la figura 5 se muestra, de acuerdo a la naturaleza de los cambios, cual es el nivel de riesgo asociado y los datos que se requiere suministrar a la agencia regulatoria para demostrar el impacto relacionado al cambio en el producto. Fig. 5 La naturaleza de los cambios en el proceso productivo determinan el tipo y cantidad de datos requeridos para evaluar la comparabilidad. En un trabajo publicado recientemente, Balázs Vezér y colaboradores [6] realizaron un detallado análisis de todos los reportes públicos europeos de evaluación de cambios (European Public Assessment Report, EPAR, por sus siglas en inglés) en anticuerpos monoclonales aprobados por la Agencia de Medicamentos Europea (European Medicines Angeny, EMA por sus siglas en inglés), desde 1998 hasta octubre de 2014. Ellos encontraron reportes de cambios para 29 anticuerpos registrados por la EMA con 404 cambios aprobados para el proceso de fabricación de estos anticuerpos. De los cambios anteriormente mencionados en el proceso de manufactura, 22 fueron categorizados como de alto riesgo, 286 de riesgo moderado y 96 como de bajo riesgo (Fig. 6). El número de cambios varió de 0 (pertuzumab) a 50 (infliximab) y 5 11 Revisión Bibliográfica productos tenían más de 25 cambios aprobados en la industria manufacturera (infliximab, basiliximab, trastuzumab, adalimumab y el eculizumab) (Fig. 6). Fig. 6 Número de cambios en la fabricación de anticuerpos monoclonales encontrados en los informes EPAR, de acuerdo con la categoría de riesgo. Si se toma como referencia el número medio anual de cambios para estos 29 productos, (19982014), o sea, el número de cambios reportados para cada producto, entre el número de años desde su autorización para uso en la práctica médica, se constata que este fue de 1,8 (variando de 0 a 3,71) [6]. Esto pone en evidencia, que es una práctica muy común introducir cambios (mejoras) en los procesos de fabricación de productos biotecnológicos, particularmente anticuerpos monoclonales. 1.5 Caracterización de Anticuerpos Monoclonales Los AcMs presentan variadas fuentes de microheterogeneidad. Las mismas, están asociadas con modificaciones estructurales como resultado de las condiciones de fermentación, purificación y almacenamiento [14, 23]. Por lo tanto, una caracterización detallada de estas modificaciones es extremadamente importante, debido a que podrían afectar las propiedades físicas, químicas, farmacocinéticas y farmacodinámicas, así como podrían alterar la estabilidad y la actividad biológica de los AcMs. Una de las técnicas analíticas altamente utilizadas en la 12 Revisión Bibliográfica investigación y el desarrollo farmacéutico es la MS, siendo muy aplicada en la caracterización de AcMs, debido a su elevada sensibilidad, selectividad y especificidad analítica. En particular el descubrimiento de las tecnologías de ionización MALDI y ESI han permitido la medición de pesos moleculares, determinación de estructuras primarias, modificaciones post-traduccionales y la secuenciación de proteínas [14, 39]. En la tabla 1 se muestra una panorámica del conjunto de herramientas analíticas utilizadas para la caracterización físico-química y funcional de un anticuerpo biosimilar con el producto original [36]. Como se puede observar en esta tabla, la espectrometría de masas (MS), junto a una amplia gama de métodos cromatográficos y electroforéticos son las que llevan el peso fundamental en el análisis de la estructura primaria, modificaciones post-traduccionales [32, 40, 41], heterogeneidad por tamaño molecular, e incluso en el análisis estructural de orden superior, como es el caso del análisis de puentes disulfuro y estructura terciaria mediante la técnica de HDX-MS [42-44]. En consecuencia con esto, para el estudio de comparabilidad estructural realizado en este trabajo el mapeo de péptidos haciendo uso de la MS, jugó un papel de primer orden. Tabla 1: Métodos y herramientas analíticas utilizados para la caracterización físico-química y funcional de los AcMs biosimilares con los productos de referencias Categoría Caracterización Físico-química Estructura primaria Estructura de órdenes superiores Heterogeneidades de carga generales y modificaciones Atributos de calidad Métodos Secuencia aminoacídica MP por RP-HPLC-ESI-MS Reducido, masa intacta del AcM, HC y LC por RPHPLC-ESI-MS , MP por RP-HPLC-UV Reducido, MALDI-MS. MP por RP-HPLC-ESI-MS no Reducido, MALDI-MS Ensayo de Edman CD, FTIR, HDX-MS, Rayos X DSC CEX con y sin digestión Puentes disulfuro Tioles libres Estructura secundaria y terciaria Estabilidad termodinámica Variantes 0K, variantes ácidas, variantes básicas, variante con Gln, variante con Lys, prolina amidada Glicación 13 Afinidad con boronoato Revisión Bibliográfica Categoría de aa Glicosilación Heterogeneidad por tamaño Caracterización Funcional Unión a la diana y al receptor Bioactividad Atributos de calidad Oxidación/deamidación/variantes del Cterminal Galactosilación, sialilación, manosilación, afucosilación, NacGlc bisectada, NGNA, patrón de glicosilación cualitativo Monómero, variantes de LMW y HMW (Agregados) HC,LC, HC aglicosilada, variantes recortadas Monómeros, variantes LMW (Ej: (HL) y variante HHL) y HMW Partículas subdivisibles Partículas visibles Métodos MP por RP-HPLC-UV/MS FcRn enlazado FcγR unido Diana enlazada, Potencia CDC, Potencia ADCC, Apoptosis SPR NP-HPLC-FL, MALDIMS, ESI-MS SEC, AF4 CE-SDS Reducido CE-SDS no Reducido Oscurecimiento de la luz Inspección visual Ensayos celulares En un estudio preliminar, Machado y colaboradores realizaron una caracterización molecular e inmunológica del 1E10 en dos lotes de producto, uno producido a partir de LAM y el otro en biorreactores de tanque agitado, con el fin de determinar el impacto del proceso de fabricación en el comportamiento de la vacuna. Con respecto al patrón de glicosilación, ellos observaron ligeras diferencias en cuanto a las estructuras minoritarias, sin embargo, el análisis de las estructuras oligosacarídicas mayoritarias arrojó que las mismas eran comparables. En cuanto a la estructura primaria los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2, revelando que únicamente se detectó diferencias en el contenido de oxidación de la metionina 396 (M396), modificación que solo estaba presente en el producto obtenido a partir de biorreactores [15]. Tabla 2: Modificaciones encontradas para el 1E10 LAM y el 1E10 TA Modificaciones N-terminal de glutamina a ácido piroglutámico Glicosilación de Asn 294 Deamidación de Asn 141 (cadena pesada) Deamidación de Asn 157(cadena ligera) Deamidación de Asn 161(cadena ligera) 14 1E10 LAM + 1E10TA + + + + + + + + + Revisión Bibliográfica Modificaciones Oxidación de Met 396 1E10 LAM + 1E10TA - + modificado. – sin modificar. Posteriormente se realizó otro estudio de comparabilidad, debido a un cambio en la escala de producción de 10L a 41L. En este estudio se encontró formación de ácido piroglutámico a partir de glutamina para ambas escalas de producción por TA. También se determinó que el perfil de glicosilación de ambas moléculas resultaron ser similares [16]. 1.6 Modificaciones post-traduccionales por heterogeneidades de carga Debido a su alta complejidad, los AcMs pueden presentar una alta heterogeneidad de especies cargadas (variantes de carga). La caracterización y cuantificación de la heterogeneidad de cargas es un requisito regulatorio para los productos biotecnológicos, pues se plantea que podrían influir potencialmente en su actividad biológica y estabilidad [40, 45, 46]. Las variantes de cargas se pueden clasificar como ácidas o básicas dependiendo de sus puntos isoeléctricos (pI) en relación con las especies principales. Cuando los anticuerpos son analizados mediante métodos que se basan en IEF, las variantes de cargas con un pI relativamente más bajo se clasifican como ácidas, mientras que aquellas con un pI relativamente más alto hacen referencia a variantes básicas [23, 40]. Cuando se analizan por métodos basados en cromatografía, las especies ácidas y básicas son definidas en base a sus tiempos relativos de retención al pico principal [23]. En MS las especies ácidas y básicas se determinan a partir de las variaciones de masas presentes en las especies modificadas. En la tabla 3 se muestran las principales vías de degradación química que han sido reportadas como contribuyentes a la formación de variantes ácidas y básicas en las IgGs1 [47-49]. Tabla 3: Principales vías de degradación química que son fuente común de heterogeneidad de cargas en anticuerpos IgGs1. Principales vías de degradación química Sialilación Deamidación de Asn Hidrólisis enzimática de Lys Cterminal de la HC Formación de aductos Formación de Succimida por Efecto Adición de COOH Formación de COOH Pérdida de NH2 Formación de COOH o pérdida deNH2 Pérdida de COOH 15 Especies formadas Ácidas Ácidas Ácidas Ácidas Básicas Revisión Bibliográfica Principales vías de degradación química isomerización de Asp Oxidación de Met,Cys,Lys,His,Trp Mediado por Disulfuro Asialilación (galactosa terminal) Presencia de Lys C-terminal y amidación de glicina Efecto Especies formadas Cambio conformacional Cambio conformacional Pérdida de COOH Formación de NH2 y pérdida de COOH Básicas Básicas Básicas Básicas 1.6.1 Glicosilación de proteínas La glicosilación, o la adición enzimática de sacáridos a proteínas, es una de las más comunes y bien caracterizadas PTMs de los anticuerpos. Estas proteínas a las cuales se le ha añadido una cadena de azúcares son denominadas glicoproteínas [21]. La presencia y naturaleza de las glicoformas pueden impactar en la actividad funcional, el plegamiento, la estabilidad, la farmacocinética y la inmunogenicidad [50]. La glicosilación de proteínas puede ser de dos tipos: N-glicosilación y O-glicosilación. En la N-glicosilación el glicano N-acetilglucosamina se une al grupo amino de la cadena lateral del aminoácido asparagina (Asn o N) de la proteína (Fig. 7). En la O-glicosilación el glicano O-acetilgalactosamina se une al grupo hidroxilo de las cadenas laterales de los aminoácidos Serina (Ser o S) y Treonina (Thr o T) (Fig. 7) [23, 51]. Fig. 7 Representación de los enlaces N-glicosídico y O-glicosídico. Los anticuerpos IgGs son típicamente N-glicosilados en el residuo de Asn 297, en la porción CH2 de la región Fc. Este sitio consiste en un núcleo central de dos residuos de Nacetilglucosamina (GlcNac) y tres manosas (Man) unido a la asparagina 297 (Asn 297) vía enlace amida [21, 23]. La N-glicosilación es dirigida a la secuencia de Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto prolina. Este sitio de glicosilación altamente conservado en la porción Fc de las IgGs presenta ciertos efectos sobre la actividad del anticuerpo in vitro e in vivo, los cuales han sido bien definidos y documentados [23, 51] . 16 Revisión Bibliográfica El patrón de estructuras glicosiladas presentes en el Fc de las IgGs está determinado por el tipo celular, la secuencia aminoacídica y las condiciones de cultivo, por esto se vuelve crítico la selección de un sistema de expresión adecuado para la producción industrial de estas moléculas. Los sistemas de expresión en células de mamíferos producen una glicosilación similar a la humana, por lo que se han convertido en la plataforma de producción más utilizada para estas moléculas [50]. Tanto las IgGs nativas en suero humano, como las IgGs terapéuticas producidas en biorreactores existen como mezclas únicas de diferentes glicoformas. Los glicanos de IgGs comienzan a formarse en el Retículo endoplasmático (RE) como estructuras ramificadas de alta manosa (Fig. 8 en a), antes de ser trasladados a su proteína de destino y exportados al aparato de Golgi. La mayoría de las manosas se eliminan, y una secuencia bien definida de monosacáridos se añade para formar complejos de glicanos biantenarios con un núcleo central, galactosa terminal y ácido siálico, una N-acetilglucosamina bisectante y una fucosa unida a la N-acetilglucosamina que se une a la Asn (Fig. 8 en b). Las proteínas terapéuticas contienen cualquier número de los llamados glicanos formados incompletamente en diferentes proporciones. Los glicanos más comunes varían en el número de ácidos siálicos y galactosa, así como en la presencia o ausencia de fucosa o N-acetilglucosamina bisectante [21]. Representación esquemática Nombre de monosacárido N-acetilglucosamina fucosa manosa galactosa ácido siálico Fig. 8 Representaciones esquemáticas de glicanos de IgG de mamíferos. El glicano en (a) es una forma de alta manosa. Las líneas discontinuas muestran el límite de la estructura del glicano M5 (5 manosas). El glicano en (b) es una forma de complejo biantenario. La tabla 4 resume el impacto de la presencia de algunos azúcares en la estructura de los glicanos unidos a IgGs terapéuticas, en propiedades tales como: seguridad, inmunogenicidad, actividad biológica, eficacia terapéutica y aclaramiento en sangre [52]. 17 Revisión Bibliográfica Tabla 4: Impacto de los glicanos en la región Fc sobre la seguridad/inmunogenicidad, actividad biológica/eficacia y aclaramiento (PK/PD) Especies de Glicanos Seguridad/Inmunogenicidad Galactosa α-1,3-Galactosa Fucosa N-acetilglucosamina bisectada Alta manosa NANA NGNA α-1,3 Fucosa Aclaramiento(PK/PD) D -(-) (-) Actividad biológica /Eficacia + D ++ + D D --- + (-) (-) D -+ + D D D D D + : Impacto positivo; - : Impacto negativo; ++ : Alto impacto positivo; -- : Alto impacto negativo; (-/+) : Impacto potencial; D: desconocido, PK: Farmacocinética, PD: Farmacodinámica 1.6.2 Oxidación de metionina La oxidación de metionina (Met o M) y triptófano (Trp o W) son modificaciones químicas comunes que ocurren en los AcMs durante los procesos de purificación, formulación y almacenamiento [23, 24, 49]. Los aminoácidos que contienen azufre y los aromáticos son los más susceptibles a la oxidación. La metionina ha demostrado ser el aminoácido más comúnmente oxidado en las IgGs. La oxidación de Met puede afectar la capacidad de ionizarse de las cadenas laterales de aminoácidos cercanos, alterando la carga superficial total de la proteína, dando proteínas oxidadas con una ligera carga básica. La oxidación de metionina también puede conducir a cambios críticos en la función y la estructura de la proteína. La cadena pesada de IgG1 contiene dos residuos de metionina conservados en su región Fc, Met 252 y Met428, los cuales se encuentran muy expuestos al disolvente cerca de la bisagra, esto posibilita que se oxiden fácilmente por métodos experimentales [21, 23]. El impacto de la oxidación de Met en la función y la estructura de las IgGs es variable, dependiendo del lugar en la molécula donde se produzca (es decir, la superficie CDR frente a la región constante). Desde un punto de vista regulatorio, la oxidación debe ser controlada y minimizada a la medida de lo posible a través de los procesos, la formulación, y el almacenamiento del producto. La oxidación de metionina en los residuos claves de las IgGs terapéuticas podría 18 Revisión Bibliográfica ocasionar problemas en relación con la potencia y la estabilidad del producto. La oxidación puede reducirse al mínimo mediante una desarrollo cuidadoso de la formulación y llenando los anticuerpos bajo gas de N2 en vez de con aire [23]. 1.6.3 Deamidación de asparagina La deamidación es una vía de degradación común de las proteínas terapéuticas y puede causar cambios en la estructura de la proteína, en la función y la inmunogenicidad [21]. Al igual que con la oxidación, la deamidación puede ser detectada por alteraciones de la carga de la proteína modificada, y puede ser analizada por mapeo de péptidos, cIEF, y / o CEX-HPLC [47]. Los residuos deamidados son de naturaleza ácida, facilitando la resolución de proteínas y péptidos deamidados por cIEF o CEX-HPLC. Estos métodos son útiles para los estudios de chequeo y estabilidad lote a lote. La deamidación en IgGs plegadas (nativas) es lenta y tiende a ocurrir a 37°C y pH 7,4. En los anticuerpos parcialmente desplegados y oxidados, el proceso de deamidación se ocasiona más rápidamente, lo que sugiere que esta PTM es muy dependiente de la secuencia y la conformación de la proteína, así como de factores externos tales como la exposición al solvente de los residuos de asparagina, el pH, la temperatura y otros. Los residuos de asparagina adyacentes a glicina y en regiones flexibles de una proteína son más propensos a someterse a la deamidación [21]. A pH neutro y básico, la deamidación procede a través de la formación de un anillo de cinco miembros correspondiente al intermediario de succinimida (Asu). La reacción de deamidación está mediada por el ataque nucleofílico del nitrógeno del enlace peptídico sobre el carboxilo γ de la asparagina con la liberación del grupo amino en forma de amoníaco y la formación de un intermediario cíclico de succinimida inestable que después se hidroliza en una mezcla de ácido aspártico y ácido isoaspártico (isoAsp y Asp) [53, 54] (Fig. 9). La relación entre isoAsp y Asp en péptidos pequeños es por lo general 3:1 a 4:1. Sin embargo en la deamidación a pH ácido, debido a que ocurre predominantemente la hidrólisis directa de la amida de la cadena lateral, se obtiene solamente Asp [23]. 19 Revisión Bibliográfica Fig. 9 Reacción de deamidación. Los residuos de asparagina en las CDR son vulnerables a la deamidación, lo que es potencialmente atribuible a su alta exposición al solvente y su elevada flexibilidad. La deamidación de estos residuos pueden afectar la unión al antígeno y por lo tanto la potencia del producto. La región Fc contiene el péptido altamente conservado PENNY que presenta dos residuos de asparagina expuestos al disolvente y de fácil deamidación en Asn 384 y Asn 389 [21]. 1.6.4 Residuos de ácido piroglutámico en el N-terminal de las IgGs El piroglutamato, o ácido piro-glutámico es un aminoácido cíclico encontrado en el extremo Nterminal de algunas proteínas y péptidos biológicos. La formación se produce a través de la reorganización de la matriz de los residuos de glutamato (E) o glutamina (Q) (Fig. 10). Aunque esta reacción transcurre espontáneamente a velocidades razonables, la glutaminilciclasa, es una enzima que cataliza esta reacción, y la misma se encuentra en plantas, animales y seres humanos. Las velocidades de reacción para ambos (E, Q) es espontánea y las reacciones catalizadas enzimáticamente parecen ser mucho más rápidas con Q que con residuos de E. Muchos anticuerpos monoclonales contienen ácido piro-glutámico en el N-terminal de sus cadenas ligeras y / o pesada. Para los AcMs, el ácido piro-glutámico puede ser una de las muchas PTMs observadas durante la producción y el almacenamiento. Debido a la pérdida de una amina primaria en la conversión de Q a ácido piro-glutámico los AcMs se vuelven más ácidos. Esta variante está naturalmente presente en las IgGs y no tiene impacto en la seguridad, en la PK ni en la PD [23, 55]. 20 Revisión Bibliográfica Fig. 10 Reacción de ciclación convirtiendo la glutamina N-terminal en un ácido piroglutámico N-terminal. 1.6.5 Modificaciones del C-terminal Entre las modificaciones que puede presentar el C-terminal de los AcMs está la pérdida de lisina (Lys o K) del C-terminal, el cual es un fenómeno muy común que ocurre tanto en las IgGs naturales como en las recombinantes [21]. El residuo de Lys C-terminal de las cadenas pesadas puede ser parcial o completamente removido debido a la actividad de las carboxipeptidasas básicas. La pérdida parcial del residuo de Lys C-terminal ocasiona una mezcla de anticuerpos con cero (0K), uno (1K), o dos (2K) residuos de Lys C-terminal, los cuales pueden ser separados en múltiples bandas/picos por IEF, cIEF, y CEX [24]. 1.7 Las técnicas de ionización suave El primer componente de un espectrómetro de masas es la fuente de ionización, que es donde se producen las especies cargadas. En las técnicas de ionización suave o blanda, hoy en día ampliamente utilizadas, una baja cantidad de energía interna es transmitida a las moléculas durante el proceso de ionización [39]. La desorción por plasma introducida en 1974 es una de las primeras técnicas de ionización blanda capaz de analizar biomoléculas con pesos moleculares muy elevados (hasta unos 100kDa). Posteriormente, fueron desarrolladas nuevas técnicas de ionización suaves, tales como: bombardeo con átomos rápidos (Fast Atom Bombardment: FAB), ionización por electronebulización (Electrospray Ionization: ESI) y la ionización mediante desorción por láser asistida por una matriz (MALDI). Las dos últimas técnicas de ionización han revolucionado la MS, permitiendo su aplicación al estudio de macromoléculas biológicas tales como: carbohidratos, lípidos, proteínas, nucleótidos, y compuestos orgánicos e inorgánicos [56]. 21 Revisión Bibliográfica 1.7.1 MALDI-TOF En el proceso de ionización utilizando la fuente de ionización MALDI la preparación de la muestra desempeña un papel muy importante. El compuesto a analizar se mezcla con un exceso de una matriz apropiada y se soporta en una placa MALDI antes de que se seque. El compuesto en cuestión co-cristaliza dentro de la matriz. Luego los componentes de la mezcla pasan a la fase gaseosa mediante un láser que le dispara al sistema muestra-matriz, causando la vaporización de la matriz que contiene el analito. La matriz absorbe la energía del láser y opera como un donor o aceptor de protones, ionizando al analito en ambas especies, cationes o aniones [39, 56] (Fig. 11). Fig. 11 Proceso de ionización mediante MALDI. En MALDI, los iones son fundamentalmente monocargados, y por tanto, el análisis de los espectros obtenidos por esta técnica, es muy simple. La matriz minimiza el daño que puede causar el pulso del láser a la muestra, pues absorbe la mayor parte de la energía incidente e incrementa la eficiencia de la transferencia de energía del láser a la muestra. Con esta técnica no es necesario ajustar la longitud de onda para hacerla coincidir con la absorción de cada muestra, puesto que la matriz es la que absorbe la radiación del láser. Además, dado que el proceso es independiente de las propiedades de absorción y tamaño del compuesto que se analiza, la fuente de ionización MALDI permite la desorción e ionización de sustancias con masas moleculares muy altas. Por ejemplo es posible la detección de picomoles de proteínas con masas moleculares superiores a 300 000Da. También permite el análisis de múltiples muestras simultáneamente y posee una alta precisión en la medición de las masas [39]. 22 Revisión Bibliográfica En esta técnica han sido utilizados láseres de diferentes tipos. Los láseres ultravioleta son los más empleados debido a su fácil manipulación y bajo costo, siendo los de nitrógeno (=337nm) los estándares. La fuente de ionización por MALDI, por ionizar analitos con muy alta masa molecular, se acopla generalmente al analizador de tiempo de vuelo, (TOF, del inglés Time-Of-Flight), ya que este último tiene la capacidad de analizar analitos en un amplio rango de masas [39]. En un espectrómetro de masas con analizador de tiempo de vuelo, los iones son extraídos en pulsos de la fuente de ionización e inmediatamente son acelerados mediante la acción de un campo eléctrico para lograr la uniformidad en sus energías cinéticas antes de que entren al analizador. Posteriormente los iones con movimiento rectilíneo uniforme atraviesan un tubo evacuado hacia el detector. Mientras mayor sea el valor de la razón de m/z de cada ion, más lentamente arribará el ion al detector (Fig. 12). La deficiencia principal de los analizadores TOF es su baja resolución espectral, lo que tiene su origen en que iones de igual m/ z presentan cierta dispersión en los valores de energía cinética después de la aceleración; por lo tanto, iones de un valor de m/z dado se superponen con los valores m/z próximos al llegar al detector. Entre las variantes utilizadas para enfrentar esta dificultad se destaca la utilización de un reflector iónico electrostático, denominado reflectrón, compuesto por una serie de rejillas y electrodos de anillo. El reflectrón crea un campo retardador que actúan como un espejo y envía los iones de retorno hacia el tubo de vuelo. El reflectrón incrementa la resolución. Este sistema se denomina TOF-reflectrón, para diferenciarlo del TOF-lineal [39]. Los analizadores TOF son directamente compatibles con las técnicas de ionización por pulsos, tales como MALDI. Por ejemplo, una combinación ampliamente utilizada es el MALDI-TOF. 23 Revisión Bibliográfica Fig. 12 Esquema del funcionamiento de un analizador TOF-reflectrón. 1.8 Herramientas computacionales para el análisis de proteínas por MALDI-MS La MS con frecuencia produce conjuntos de datos muy complicados, y por lo tanto es necesario la aplicación de herramientas computacionales para el análisis y la interpretación de estos datos. Una gama de bases de datos de acceso público o comercial, paquetes de software y servicios web están disponibles para el análisis de la información obtenida por MS (Tabla 5). Estos recursos computacionales proporcionan aplicaciones para el cálculo de la masa molecular de la proteína intacta y las masas moleculares de los péptidos generados por digestión con proteasas específicas. También resultan de gran ayuda en la elucidación de la estructura primaria de las proteínas, mediante la asignación y alineación automatizada de las masas de los péptidos y la secuencia de la proteína con la secuencia afín en las bases de datos. Para el análisis de las modificaciones post-traduccionales esto constituye una gran ventaja, debido a que es posible combinar y / o comparar los resultados obtenidos mediante MS, con los resultados in-sílico adquiridos a partir de herramientas computacionales optimizadas para la predicción de los sitios susceptibles a ser modificados. Para ello, los paquetes de software disponibles se centran en el manejo de grandes conjuntos de datos y resultados obtenidos en los estudios proteómicos [57]. 24 Revisión Bibliográfica Tabla 5: Algunos servicios computacionales y herramientas para el análisis de proteínas por MS. Nombre Sitio Web ExPASy www.expasy.org ProteinCenter GPMAW Mascot Propósito Referencia Software para la Público secuencia de proteínas y el análisis de masas www.proxeon.com Herramienta Comercial computacional para el análisis de bases de datos de proteómica www.gpmaw.com Secuencia de Comercial proteínas y análisis de masas www.matrixscience.com Herramienta Público/Comercial computacional para la identificación de proteínas por los datos MS y MS/MS. 25 Materiales y métodos 2 2.1 MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos, muestras y disolventes Los reactivos que fueron utilizados para la digestión de la proteína son los siguientes: bicarbonato de amonio (AMBI) grado LC-MS, Fluka, Alemania; ditiotreitol (DTT) (viales de 7,7mg, de un solo uso) e iodoacetamida (IAA) (viales de 9,3mg, de un solo uso) ambos con grado LC-MS y correspondientes a Termo Scientific, EUA. La enzima tripsina utilizada es de Promega, EUA y la Lys-C de Wako, Japón. Los reactivos y disolventes utilizados para la extracción en fase sólida y la preparación de la matriz CHCA para el análisis por MS fueron los siguientes: ácido trifluoroacético (TFA) para el análisis de secuencias de proteínas Merck, Alemania; ácido fórmico (FA), Fluka, Alemania, metanol (MeOH) grado HPLC de Merck, Alemania; acetonitrilo (ACN) grado HPLC LC/MS de Sigma, EUA; ácido fórmico grado LCMS correspondiente a Fluka, 98%, Alemania. Para la preparación de la matriz ácido α-ciano-4 hidroxicinnamico (CHCA), LaserBio Labs, Francia, también se utilizó fosfato de amonio dibásico de Fluka, Alemania. Para calibrar las mezcla de péptidos proteolíticos se empleó como estándar externo una mezcla de péptidos del kit C104 - Peptide calibration Mix 4 (Proteomix) 500-3500Da, LaserBio Labs, Francia. El agua empleada en todos los experimentos fue de calidad milli Q, obtenida de un sistema Purelab Bioscience, Elga, Inglaterra. Las diez muestras del AcM 1E10 empleadas fueron obtenidas en el departamento de desarrollo de procesos del CIM según las normas y procedimientos establecidos por la institución y presentan grado de calidad terapéutico. Ocho de las muestras corresponden a diferentes lotes de producción del anticuerpo en estudio obtenido por biorreactores, de las cuales cuatro se encontraban glicosiladas y las otras cuatro desglicosiladas. Luego las dos muestras restantes corresponden al AcM 1E10 obtenido por el LAM e igualmente una de ellas se encontraba glicosilada y la otra desglicosilada. Las muestras de biorreactores correspondieron a los siguientes lotes de producción: TA1, TA2, TA3 y TA4. 26 Materiales y métodos 2.2 Procedimiento para la desglicosilación Las muestras fueron desglicosiladas mediante el procedimiento H10PNO001, siguiendo las instrucciones que aparecen detalladas en el kit de desglicosilación P075L de la firma Biolabs de Inglaterra. Se tomó el equivalente de 100µg de cada lote de anticuerpo, se le adicionó 10µL de solución de desnaturalización que viene con el kit y se desnaturaliza la proteína mediante calentamiento durante 10min a 100oC. Se deja enfriar a TA y se adicionan entonces 10µL de tampón de reacción y 10µL de NP-40 al 10%. Ambos reactivos suministrados con el kit. Finalmente se añade 1µL de la enzima PNGase F y se incuba 2h a 37oC en baño termostatado. Finalizado este tiempo, se añaden 3 volúmenes de etanol frío (-40oC), se deja reposar durante 10min a esta temperatura y se procede a centrifugar a 10 000 gravedades durante 10min con el objetivo de separar los glicanos de la proteína precipitada. 2.3 Equipamiento y accesorios Vortex Genius 3, IKA, Alemania Centrífuga de viales Mini Star, VWR, Korea Balanza Analítica AUW120, SHIMADZU, Japón Baño termostático WB22, WiseBath, Korea Thermomixer eppendorf AG, Alemania Sistema purificador de agua PureLab ultra bioscience, Elga, Inglaterra Extracción en fase sólida (SPE), SPE 12-Position Vacuum Manifold, Phenomenex, EUA Rotoevaporador a vacío, Proteomic CentriVap® Concentrator Systems, LABCONCO, EUA Espectrómetro de Masas MALDI-TOF/TOF AXIMA Performance, SHIMADZU Kratos, Manchester, Inglaterra 27 Materiales y métodos 2.4 2.4.1 Descripción de las técnicas a utilizar Procedimiento para la digestión. Para realizar la digestión fue utilizado el procedimiento descrito en el Kit de trabajo (InSolution Tryptic Digestion and Guanidination Kit) correspondiente a la firma Pierce, EUA. 2.4.1.1 Preparación de los Tampones Tampón de digestión. Se pesaron 10mg de bicarbonato de amonio (AMBI) y se disolvieron en 2,5ml de agua ultra pura para una concentración final de 50mM. Tampón Reductor. Se resuspendió el contenido del vial de DTT en 500µl de agua ultrapura para una concentración final de 100mM. Tampón de alquilación. Se preparó justo antes de su uso. En 9,3mg de IAA contenidos en un vial recubierto para evitar la exposición a la luz, se añadió 132µl de AMBI para una concentración final de 375mM. Todas las muestras fueron ajustadas a una concentración de 1mg/ml con el tampón de digestión. 2.4.1.2 Reducción y Alquilación La reducción de los puentes disulfuros se realizó mediante la adición de 15µl del tampón reductor (DTT) a cada muestra, se agita vigorosamente en el vortex y se centrifuga. Se incuban las muestras a 95°C durante 5min y se dejan enfriar a temperatura ambiente. El bloqueo de las cisteínas libres se realizó adicionando 4µl de iodoacetamida a cada muestra, las que nuevamente se agitan en el vortex, se centrifugan y seguidamente se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20min. Una vez concluida la incubación se procede a la digestión enzimática. 2.4.1.3 Digestión con las enzimas Tripsina y Lys-C Las muestras previamente reducidas y carbamidometiladas fueron digeridas con Tripsina a una relación enzima:sustrato de 1:20 (masa:masa), mientras que para Lys-C la relación enzima:sustrato fue de 1:40 (masa:masa). Las reacciones se incubaron durante 16h a 37ºC en baño termostatado. Seguidamente se añadió 0,6µl de ácido trifluoroacético para detener la reacción. 28 Materiales y métodos 2.4.2 Purificación mediante Extracción en fase sólida con cartuchos C18 Las minicolumnas C18 (Sep-Pak Vac 1cc (50 mg), Water, EUA) se activaron con una solución de 90% de metanol en agua, y seguidamente se equilibraron con solución de 0,1% de ácido fórmico en agua. Las minicolumnas C18 equilibradas se cargaron entonces con las diferentes mezclas de péptidos. Los péptidos retenidos en la minicolumnas se desalaron con solución de equilibrio y posteriormente se lavaron con solución de 2% de metanol en agua más 0,1% de ácido fórmico. A continuación, se procede a la elución, la cual se realiza en dos etapas: una primera con solución de acetonitrilo al 8% en agua más ácido fórmico al 0,1% (Solución de Elución 1) y finalmente en una segunda elución con solución de acetonitrilo al 65% en agua más ácido fórmico al 0,1% (Solución de Elución 2). Finalmente los péptidos eluidos se secaron en un rotoevaporador a vacío para su posterior análisis por espectrometría de masas. 2.4.3 Espectrometría de masas MALDI-TOF 2.4.3.1 Preparación de la matriz para MALDI La matriz utilizada para el análisis fue el ácido α-ciano-4 hidroxicinnamico (CHCA). La matriz contiene una masa de 5mg de CHCA, la cual se preparó a una concentración de 5mg/ml de la siguiente forma: 50% ACN con 0,1% ácido trifluoroacético en agua y 6mM de sal fosfato de amonio. 2.4.3.2 Preparación de las muestras para el análisis por masas Una vez secadas las muestras en el rotoevaporador a vacío estas se diluyeron en 8µl de una solución de 2% de ACN en agua más 0,1% de ácido trifluoroacético y seguidamente cada muestra se diluyó 10 y 20 veces con la matriz ácido α-ciano-4 hidroxicinnamico (CHCA), luego se toma 1µl de cada dilución por duplicado y se aplicaron sobre una placa para espectrometría de masas MALDI y se dejaron secar a temperatura ambiente. 2.4.3.3 Obtención y registro de los espectros de masa con ionización MALDI Los datos de MS fueron adquiridos utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF. El instrumento está equipado con el láser de N2 a 337nm. Los espectros de masa se adquirieron 29 Materiales y métodos en modo positivo reflectrón, irradiando al azar a la muestra. La potencia del láser se ajustó para cada muestra oscilando entre los 95% y 100% de potencia del láser para obtener la mejor resolución y la mejor relación señal/ ruido (S/N) para los picos de péptidos observados. Se acumularon 200 disparos para cada muestra donde la velocidad de pulsación del láser fue de 30Hz. Las mediciones se realizaron en un rango de masas de 500Da hasta 4000Da. Los espectros fueron procesados con el programa Axima Biotech Launchpad versión 2.8.4, Shimadzu, Kratos, Inglaterra, el cual controla el Espectrómetro, y permite la calibración y el análisis de datos. El software GPMAW, versión 8.10, Dinamarca, se utilizó para las digestiones proteolíticas in sílico, la fragmentación de péptidos teórica y para la anotación detallada de las secuencias del AcM 1E10 [58]. También se empleó el programa mMASS [59, 60], versión 5.4.1, Alemania, para un análisis preciso de los espectros de masas individuales, la recalibración de los espectros, la modelación del patrón isotópico y la digestión in sílico del anticuerpo. Para el análisis y la identificación de los péptidos se recurrió al software Findpept descrito por Alexandre Gattiker colaboradores [61], luego para el estudio de los posibles glicopéptidos se usó GLycoMod [62] ambos del portal de herramientas bioinformática EXPASY, Suiza. 30 Resultados y discusión 3 3.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Comparabilidad estructural de las moléculas 1E10 LAM y 1E10 TA El proceso de fabricación de un producto biológico se modifica generalmente varias veces durante su ciclo de vida, con el fin de: incrementar la robustez del proceso, introducir nuevas tecnologías, introducir nuevos suministradores de materias primas, o cambiar la escala o el sitio de producción como consecuencia del aumento de la demanda del mercado [6, 63, 64]. Como se señala anteriormente, ante cualquier cambio en el proceso de fabricación de un producto biotecnológico, es obligatorio realizar un estudio de comparabilidad entre la molécula obtenida en las nuevas condiciones con respecto a la producida en las condiciones anteriores [6, 63, 64]. En este estudio se deben caracterizar las diferencias estructurales de ambos productos para asegurar que los cambios en el proceso no afecten las propiedades farmacocinéticas, farmacodinámicas, el mecanismo de acción, así como la eficacia clínica y seguridad de la proteína en cuestión. La estructura de productos biológicos complejos no es fácil de caracterizar. Las proteínas terapéuticas poseen rasgos estructurales que si son modificados, aunque sea ligeramente, pueden afectar su eficacia clínica [64]. Debido a su inherente variabilidad, complejidad y heterogeneidad, es imposible establecer que dos productos protéicos son idénticos. Asimismo, productos protéicos individuales muestran microheterogeneidad y variabilidad lote a lote, por lo que no son idénticos entre ellos [65]. Por lo tanto, los marcos regulatorios que se han creado en todo el mundo, requieren una amplia comparación de la calidad, la eficacia y la seguridad para mostrar la similitud entre el producto original y el producto obtenido a partir del proceso optimizado. Debido a estas diferencias inevitables en los procesos de fabricación, es necesario que las secuencias de aminoácidos sean las mismas en su totalidad (100%), y solo pueden ser aceptadas pequeñas diferencias en el patrón de microheterogeneidad de las moléculas [17]. 31 Resultados y discusión 3.1.1 Análisis de la estructura primaria La estructura primaria del AcM 1E10 se determinó por espectrometría de masas MALDI-TOF, haciendo uso de las enzimas Tripsina y Lys-C. Con este estudio se mapeó el 72,0% de la cadena ligera (LC) y el 66,3% de la cadena pesada (HC) para el 1E10 LAM, asi como el 73,8% de la LC y el 72,0% de la HC para el caso del AcM 1E10 TA. En las tablas 6 y 7 se presentan los péptidos trípticos y algunos péptidos obtenidos con Lys-C que no se pudieron determinar con tripsina, correspondientes a la cadena pesada y a la cadena ligera del AcM 1E10. Los espectros y tablas de todos los lotes digeridos con Lys-C y digeridos con tripsina, asi como los lotes que fueron sometidos al proceso de desglicosilación se muestran en los anexos del 1 al 10. Para simplificar este primer análisis, solo se utilizaron los espectros del lote de 1E10 LAM y los espectros de uno de los lotes de 1E10 TA (AcM 1E10 TA1). Los espectros que se muestran en las figuras 13 y 14 correspondientes a la primera y segunda elución de la extracción en fase sólida, con 8% y 65% de ACN respectivamente, exhiben una correspondencia prácticamente absoluta entre los valores de m/z de los péptidos trípticos del AcM 1E10 LAM y el AcM 1E10 TA1. Esto demuestra la notable similitud existente entre ambos productos. Adicionalmente, en los anexos 1 y 2 se muestra la comparación de los cuatro lotes de TA con el lote de LAM que resalta igualmente la gran analogía entre todos los lotes estudiados. Un aspecto de gran importancia en el análisis estructural de los productos biológicos por MS, es la exactitud de los datos experimentales. En nuestro estudio, todos los péptidos determinados en cada uno de los lotes comparados presentaron una exactitud ≤0,3m/z, esto manifiesta la veracidad de los resultados obtenidos, pues para esta técnica, está establecido que valores <0,5m/z son adecuados [66-68]. En la figura 13 se pueden observar los péptidos trípticos cuya masa se encuentra en el intervalo de 500Da-1900Da. De manera general estos péptidos coinciden con los de mayor polaridad y menor masa, siendo estos los que eluyen en la solución con 8% de ACN (E1). Aunque debemos destacar que algunos péptidos, como el LT04, con 1028,58m/z, eluye en la segunda elución (E2) (Fig.14 y Tabla 7). Esto se debe, a que este péptido cuya secuencia es LLIYYTSR, está conformado por un 63% de aminoácidos apolares, como son: la leucina (L), la isoleucina (I) y la 32 Resultados y discusión tirosina (Y). Sin embargo, el péptido LL08, con la secuencia aminoacídica IDGSERQNGVLNSWTDQDSK, que de acuerdo a su dimensión (2249,04m/z), se esperaba que eluyera en E2, lo hace en E1, a causa de que el 75% de los aa que lo constituyen, son polares: ácido aspártico (D), serina (S), ácido glutámico (E), arginina (R), glutamina (Q), asparagina (N) y lisina (K). Fig. 13 Espectros correspondientes a la primera elución de la extracción en fase sólida (E1) del AcM 1E10 LAM y del AcM 1E10 TA1 (de abajo hacia arriba). Los espectros de los lotes de TA2, TA3 y TA4 están en el Anexo1. Fig. 14 Espectros correspondientes a la segunda elución de la extracción en fase sólida (E2) del AcM 1E10 LAM y del AcM 1E10 TA1 (de abajo hacia arriba). Los espectros de los lotes de TA2, TA3 y TA4 están en el Anexo2. 33 Resultados y discusión En E2 eluyeron los péptidos retenidos en las minicolumnas C18 después de haber realizado la primera elución. Estos péptidos se caracterizan por ser los de mayor hidrofobicidad y por lo general, presentan los valores de masas más altos (Fig. 14). También en la mezcla de péptidos de la primera fracción de elución (E1) fueron encontradas un número considerable de glicoformas, las que por contener un alto contenido de azúcares unidos a la asparagina correspondiente, son estructuras marcadamente hidrofílicas, y eluyen todas con la solución de más bajo contenido de ACN. Adicionalmente, este péptido, cuya secuencia es EEQFNSTFR, es un péptido marcadamente hidrofílico, por lo que unido al hecho mencionado anteriormente de los glicanos enlazados, es consecuente su elución en columnas de fase reversa con un escaso contenido de ACN en la fase móvil. Un análisis más detallado sobre este particular será realizado más adelante, correspondiente al análisis de la glicosilación. Estas separaciones permitieron purificar las muestras de contaminantes que son introducidos inevitablemente durante la preparación de las mismas, tales como sales, detergentes y otros reactivos utilizados para su elaboración, así como simplificar considerablemente la mezcla de péptidos que se introduce al espectrómetro para su estudio. Para este análisis, se utilizó la tripsina como proteasa principal, debido a que la misma es considerada la enzima estándar de oro para la identificación de proteínas a partir de sus péptidos mediante MS [69, 70]. La preferencia de esta enzima se debe a su estabilidad en una amplia gama de condiciones, su alta actividad y especificidad al sustrato [71]. La tripsina escinde específicamente en el lado carboxilo de los residuos lisina (K) y arginina (R), excepto cuando están seguidas por prolina (P) [72, 73], dando como resultado péptidos uniformes con una longitud de 10-12 residuos que pueden ser analizados por MS. La tripsina por sí sola no genera péptidos que abarquen toda la proteína. Además esta enzima es más específica en la escisión de los residuos de R que en los de K. Para resolver esto, se han explorado otras proteasas alternativas, y se recomienda la digestión en serie con la enzima Lys-C. La Lys-C escinde en el lado carboxilo de los residuos de K. Además de su estricta especificidad, otra ventaja importante es su resistencia frente a agentes desnaturalizantes. Esta enzima es altamente complementaria a la tripsina, pues ambas proteasas presentan una actividad óptima a pHs similares (pH 7-9) [71]. 34 Resultados y discusión Tabla 6: Péptidos de la cadena pesada del AcM 1E10 LAM y de los AcMs 1E10 TA1- 4 identificados por mapeo peptídico MALDI-TOF No. de péptido Desde-Hasta Secuencia MH+Teor (m/z) HT01 HT02 HT03 HT04 HT05 HT06 HT07 HT08 HT09 HT10 HT11 HT12 [1-19] [20-23] [24-38] [39-59] [60-63] [64-65] [66-67] [68-74] [75-85] [86-98] [99-123] [124-151] HT13 [152-213] HT14 HT15 HT15-HT16 HT16 HT17 HT18 HT19 HT20 HT21 HT22 HT23 HT24 [214-216] [217-217] [217-221] [218-221] [222-246] [247-256] [257-266] [267-290] [291-299] [300-315] [316-318] [319-320] .QpirVQLQQSGAELVKPGASVK.l k.LSCK.a k.ASGYTFTSYDINWVR.q r.QRPEQGLEWIGWIFPGDGSTK.y k.YNEK.f k.FK.g k.GK.a k.ATLTTDK.s k.SSSTAYMQLSR.l r.LTSEDSAVYFCAR.e r.EDYYDNSYYFDYWGQGTTLTVSSAK.t k.TTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK.g k.GYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDL YTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTK.v k.VDK.k k.K.i k.KIVPR.d k.IVPR.d r.DCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPK.d k.DVLTITLTPK.v k.VTCVVVDISK.d k.DDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPR.e r.EEQFNSTFR.s r.SVSELPIMHQDWLNGK.e k.EFK.c k.CR.v 1950,06 507,26 1779,83 2401,19 553,26 294,18* 204,13* 749,40 1230,58 1518,69 2973,28 2860,46 6521,19 * 361,21* 147,11* 612,42 484,32* 2922,40 1100,66 1119,61 2845,31 1157,52 1853,92 423,22* 335,15* 35 MH+Med (m/z) LAM 1949,98 N/D 1779,87 2401,22 N/D N/D N/D N/D 1230,58 1518,69 2973,26 2860,27 MH+Med (m/z) TA1 1950,07 N/D 1779,85 2401,17 553,31 N/D N/D N/D 1230,66 1518,72 2973,32 2861,26 MH+Med (m/z) TA2 1950,11 N/D 1779,85 2401,16 553,30 N/D N/D N/D 1230,64 1518,73 2973,28 2861,34 MH+Med (m/z) TA3 1950,06 N/D 1779,85 2401,18 553,28 N/D N/D N/D 1230,58 1518,69 2973.33 2861,54 MH+Med (m/z) TA4 1950,05 N/D 1779,83 2401,19 553,27 N/D N/D N/D 1230,74 1518,77 2973,28 2861,52 N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D 612,38 N/D 2922,47 1100,57 N/D 2845,28 N/D 1853,88 N/D N/D N/D N/D 612,34 N/D 2922,44 1100,67 N/D 2845,21 1157,41 1853,90 N/D N/D N/D N/D 612,36 N/D 2922,47 1100,62 N/D 2845,23 1157,43 1853,88 N/D N/D N/D N/D N/D N/D 2922,48 1100,64 N/D 2845,27 N/D 1853,88 N/D N/D N/D N/D 612,35 N/D 2922,40 1100,60 N/D 2845,23 1157.51 1853,91 N/D N/D Resultados y discusión 1243,67 448,28* 248,16* 457,29* 1210,68 606,29 262,14* MH+Med (m/z) LAM 1243,61 N/D N/D N/D N/D N/D N/D MH+Med (m/z) TA1 1243,60 N/D N/D N/D N/D 606,30 N/D MH+Med (m/z) TA2 1243,60 N/D N/D N/D N/D N/D N/D MH+Med (m/z) TA3 1243,62 N/D N/D N/D N/D 606,27 N/D MH+Med (m/z) TA4 1243,65 N/D N/D N/D N/D 606,21 N/D 3618,66 N/D N/D N/D N/D N/D 1965,89 601,37 2905,31 812,43 1119,61 1559,80 1210,68 1965,89 N/D 2905,34 N/D N/D 1559,69 1210,60 1965,97 601,37 2905,32 812, 21 1119,42 1559,79 1210.61 1965,89 N/D 2905,33 812,32 1119,53 1559,78 1210,62 1965,86 601,27 2905,33 812,36 1119,63 1559,75 1210,70 1965,97 601,31 2905,37 812,31 N/D 1559,78 1210,64 MH+Teor (m/z) No. de péptido Desde-Hasta Secuencia HT25 HT26 HT27 HT28 HT29 HT30 HT31 [321-332] [333-336] [337-338] [339-342] [343-353] [354-358] [359-360] HT32 [361-390] HT33 HT34 HT35 HT36 HL18 HL21 HL25 [391-407] [408-412] [413-437] [438-445] [257-266] [319-332] [343-353] r.VNSAAFPAPIEK.t k.TISK.t K.g k.TK.g k.GRPK.a k.APQVYTIPPPK.e k.EQMAK.d k.DK.v k.VSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYK. n k.NTQPIMDTDGSYFVYSK.l k.LNVQK.s k.SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK.s k.SLSHSPGK k.VTCVVVDISK.d k.CRVNSAAFPAPIEK.t k.APQVYTIPPPK.e H: cadena pesada, T: digestión con tripsina, L: digestión con Lys-C, N/D: no determinado,*: los péptidos que no se pudieron determinar porque se encuentra fuera de los límites de detección del espectrómetro (≤500m/z y ≥4000m/z), en rojo las modificaciones post-traduccionales, en verde los sitios de N-glicosilación. 36 Resultados y discusión Tabla 7: Péptidos de la cadena ligera del AcM 1E10 LAM y de los AcMs 1E10 TA1- 4 identificados por mapeo peptídico MALDI-TOF LT01 LT02 LT03 LT04 LT05 [1-18] [19-24] [25-45] [46-53] [54-61] .DIQMTQTTSSLSASLGDR.v r.VTISCR.a r.ASQDISNYLNWYQQKPDGTVK.l k.LLIYYTSR.l r.LHSGVPSR.f 1910,91 735,38 2455,19 1028,58 852,47 MH+Med (m/z) LAM 1910,84 735,39 2455,15 1028,59 852,46 LT06 [62-103] r.FSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGN TLPWTFGGGTK.l 4535,06* N/D N/D N/D N/D N/D LT07 LT07-LT08 LT08 [104-107] [104-108] [108-108] 476,27* 632,37 175,12* N/D N/D N/D N/D 632,33 N/D N/D N/D N/D N/D 632,33 N/D N/D 632,35 N/D LT08-LT09 [108-142] 3727,84 3727,80 3727,81 3727,82 3727,80 3727,86 LT09 [109-142] 3571,74 3571,81 3571,80 3571,80 3571,79 N/D LT10 LT11 LT12 LT12-LT13 LT13 LT14 LT15 LT16 LT17 LT18 LT19 [143-147] [148-149] [150-155] [150-169] [156-169] [170-183] [184-188] [189-199] [200-207] [208-211] [212-214] 588,34 333,19* 676,33 2249,04 1591,73 1534,73 711,29 1347,57 832,48 523,26 422,13* 588,31 N/D 676,33 N/D N/D N/D 711,29 1347,58 832,60 523,26 N/D 588,37 N/D 676,34 N/D 1593,91 N/D 711,30 1347,60 832,47 523,25 N/D 588,27 N/D 676,34 N/D N/D N/D 711,32 1347,57 N/D 523,26 N/D 588,31 N/D 676,34 N/D 1593,93 N/D 711,30 1347,58 832,44 523,27 N/D 588,32 N/D 676,33 N/D 1593,82 N/D 711,32 1347,57 N/D 523,26 N/D No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) Secuencia k.LESK.r k.LESKR.a k.R.a k.RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNN FYPK.d r.ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNF YPK.d k.DINVK.w k.WK.I k.IDGSER.q k.IDGSERQNGVLNSWTDQDSK.d r.QNGVLNSWTDQDSK.d k.DSTYSMSSTLTLTK.d k.DEYER.h r.HNSYTCEATHK.t k.TSTSPIVK.s k.SFNR.n NEC 37 MH+Med. (m/z) TA1 1910,83 735,41 2455,20 1028,58 852,46 MH+Med. (m/z) TA2 1910,91 735,34 2455,22 1028,58 852,50 MH+Med. (m/z) TA3 1911,01 735,43 2455,22 1028,60 852,48 MH+Med (m/z) TA4 1911,01 735,42 2455,29 1028,58 852,47 Resultados y discusión No. de péptido LT18-LT19 LL08 LL07-LL08 LL10 LL12 DesdeHasta [208-214] [150-169] [148-169] [184-199] [208-214] MH+Teor (m/z) Secuencia k.SFNRNEC. k.IDGSERQNGVLNSWTDQDSK.d k.WKIDGSERQNGVLNSWTDQDSK.d k.DEYERHNSYTCEATHK.t k.SFNRNEC. 926,38 2249,04 2563,22 2039,85 926,38 MH+Med (m/z) LAM N/D 2249,90 2563,93 2039,85 926,37 MH+Med. (m/z) TA1 N/D 2249,98 2564,19 2039,85 926,39 MH+Med. (m/z) TA2 N/D 2250,13 2564,23 2039,86 926,39 MH+Med. (m/z) TA3 N/D 2250,23 N/D 2039,85 926,26 MH+Med (m/z) TA4 N/D 2250,13 2564,26 2039,86 926,38 H: cadena pesada, T: digestión con tripsina, L: digestión con Lys-C, N/D: no determinado,*: los péptidos que no se pudieron determinar porque se encuentra fuera de los límites de detección del espectrómetro (≤500m/z y ≥4000m/z), en rojo las modificaciones post-traduccionales, en verde los sitios de N-glicosilación. 38 Resultados y discusión En los resultados anteriores se puede observar que la mayor parte de los péptidos no detectados (N/D), y que se encuentran dentro del rango de trabajo del espectrómetro (500m/z-4000m/z), son aquellos que contienen residuos de K en su estructura (HT02, HT08, HT19, HT29, HT30, HT34, LT13 y LT14). Este suceso puede deberse a varios factores, como son: 1. errores de cortes por múltiples sitios de corte. Este fenómeno se puede localizar en las secuencias de aa donde se encuentren múltiples sitios de corte juntos [70, 72]. Ejemplo de eso lo constituyen los péptidos HT15 y HT16 (k.KIVPR.d), donde hay dos K consecutivas y los péptidos LT08 y LT09 (k.RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK.d), donde hay una K y una R. En el primer caso, los péptidos no pudieron ser determinados individualmente, por lo que la presencia de este error de corte nos permitió mapear, además del péptido HT16, al péptido HT15, constituido solamente por una K y que está totalmente fuera del rango de trabajo del espectrómetro. En el segundo caso, si bien pudo ser determinado el péptido LT09 de manera individual, el error de corte nos permitió mapear el péptido LT08, constituido únicamente por una R y por lo tanto, al igual que para el HT15, fuera del intervalo de trabajo del espectrómetro. 2. errores de corte por presencia de aa ácidos. Otra fuente de errores de cortes es cuando próximo al sitio de escisión están presentes aminoácidos ácidos como el ácido aspártico (D) y el ácido glutámico (E) [72, 73]. Con respecto a esto, el péptido HT08 no pudo ser mapeado lo cual coincide con lo reportado por Slechotova y colaboradores [72]. Aquí, el sitio de corte se encuentra contiguo a un residuo de D (k.ATLTTDK.s). Esta cercanía entre ambos aminoácidos disminuye la velocidad de digestión hasta un 0,3%, siendo dicha secuencia una de las más probables para producir errores de cortes por presencia de aa ácidos. Otro péptido donde ocurrió este fenómeno fue el HT29 (k.APQVYTIPPPK.e). Este caso es particularmente llamativo, pues a pesar de que no pudo ser mapeado con tripsina en ninguno de los lotes, tanto desglicosilados, como glicosilados, si pudo ser identificado cuando se utilizó la enzima Lys-C (péptido HL25 en Anexos 7 y 9). Esto se explica por la superior especificidad de esta enzima con respecto a la tripsina en los sitios de corte que presentan K. Un caso singular es el péptido HT19 (k.VTCVVVDISK.d), el cual no pudo ser mapeado en ninguno de los lotes estudiados, sin embargo el péptido HT22, cuya secuencia es r.SVSELPIMHQDWLNGK.e, pudo ser mapeado en todos los lotes estudiados. Esta diferencia se puede explicar debido a que el ácido aspártico es un inhibidor más potente de la 39 Resultados y discusión digestión que el ácido glutámico, la presencia de este aa cerca de la K dificulta el corte de la enzima más que si presentara un E. Este efecto es causado por el aumento de la acidez de la cadena lateral del ácido aspártico [70]. Los péptidos, HT30 (k.EQMAK.d), LT13 (r.QNGVLNSWTDQDSK.d) y LT14 (k.DSTYSMSSTLTLTK.d) también estuvieron afectados por la proximidad de los aa ácidos D y E, así como por la menor especificidad de la tripsina sobre los residuos de K [72]. 3. dominancia de los péptidos que poseen R en su extremo C-terminal. En los análisis efectuados hasta el momento es notorio que la mayor parte de los péptidos no identificados en el intervalo de ≥500m/z y ≤4000m/z, son péptidos que poseen una K en su extremo carboxiterminal (HT02, HT08, HT19, HT29, HT34 y LT14) (Tablas 6 y 7). Adicionalmente, otros péptidos que también poseen una K en su extremo C-terminal fueron mapeados con baja intensidad. Este fenómeno ha sido ampliamente estudiado y se le conoce como la dominancia de los péptidos que poseen R en su extremo C-terminal, en detrimento de los que poseen K. En algunos estudios se ha reportado que hasta el 94% de los picos más intensos dentro de un espectro de MALDI son péptidos que poseen R en su extremo C-terminal [74]. Este fenómeno está muy relacionado con la mayor basicidad de la R con respecto a K y por lo tanto, a su facilidad para protonarse y ser detectada en el espectrómetro [75, 76]. 4. supresión iónica. Expresa que en una mezcla compleja de péptidos, la presencia o ausencia de un péptido en particular puede afectar la intensidad iónica de otros péptidos en la mezcla. Si bien no está del todo claro los mecanismos por los cuales discurre este fenómeno, existen evidencias que apuntan a que la afinidad por el protón y su movilidad son los dos factores principales involucrados en la supresión iónica de péptidos y que su basicidad e hidrofobicidad están menos relacionados con el mismo [77]. 5. Otro aspecto que influyó determinantemente en el mapeo incompleto de la secuencia aminoacídica del 1E10, lo constituye la presencia de algunos péptidos cuya masa se encuentra fuera de los límites de trabajo del espectrómetro (≤500m/z y ≥4000m/z). Este es el caso de los péptidos: HT06, HT07, HT14, HT15, HT24, HT28, HT31, LT07, LT08, LT11 y LT19, todos con relaciones m/z <500. Sobre este particular, es apropiado destacar que en MALDI-MS la matriz (ácido orgánico) que se utiliza para lograr la ionización eficiente de los péptidos interfiere en la zona de medición de bajas masas, por lo tanto es prácticamente imposible extraer información útil en este intervalo de medición. De hecho, algunos autores consideran que el rango útil de medición en MALDI-MS es a partir de 700m/z, 800m/z, o 40 Resultados y discusión incluso 1000m/z [78]. Para medir en la zona de bajas masas en mezclas complejas de péptidos, digamos hasta 500m/z, es importante realizar una separación de los péptidos de la muestra, al menos de manera grosera para simplificar dicha muestra, que fue lo que se realizó en este trabajo con las minicolumnas de C18. En cuanto a los péptidos con m/z >4000 (HT13 y LT06), es oportuno resaltar que el espectrómetro que se utilizó es capaz de medir de manera efectiva relaciones m/z de hasta 500 000Da, pero sucede, que en mezclas complejas de péptidos, los iones con relaciones m/z muy alta son suprimidos completamente del espectro, fenómeno que ya fue analizado anteriormente. A pesar de los inconvenientes mencionados anteriormente con relación a los péptidos trípticos, vale señalar que la mayor parte de ellos fueron identificados correctamente, con buena resolución (600-9000), relación señal/ruido (24-2700) y una excelente exactitud en la determinación de las razones m/z (≤0,3) (Tablas 6 y 7 y Anexos 3-10), en todos los lotes estudiados, ya sea en sus formas originales o formando parte de algún error de corte. Por otra parte, el uso de múltiples proteasas de manera complementaria permite aumentar el mapeo de la secuencia aminoacídica y proporcionar una identificación más extensa de las PTMs [69]. La utilización de la proteasa Lys-C permitió determinar una serie de péptidos que con tripsina no fue posible, lo cual ha sido reportado en la literatura [79, 80]. Además con esta enzima se pudo corroborar la existencia de algunos péptidos que fueron identificados con la digestión tríptica (Tabla 6-7 y Anexos 7-10). Un péptido de vital importancia en el análisis de la estructura primaria de este anticuerpo, lo constituye el HT21, el cual presenta un sitio de N-glicosilación conservado en la asparagina 295 de la cadena pesada (HC). Los resultados obtenidos demostraron que para el AcM 1E10 LAM este péptido estaba únicamente glicosilado, mientras que en el AcM 1E10 TA se presentó tanto en su forma glicosilada, como en su forma aglicosilada. En el epígrafe correspondiente a glicosilación se realizará un análisis detallado sobre la glicosilación del anticuerpo. 41 Resultados y discusión 3.1.2 Análisis de los extremos Otro aspecto de singular importancia en el análisis estructural de los AcMs es el tema de los extremos de dichas moléculas [81]. Los extremos de los AcMs se encuentran considerablemente expuestos al solvente. Esta exposición al solvente hace a la molécula más propensa a sufrir fragmentaciones y modificaciones en los últimos aa que conforman dichos sitios. Por lo que la identificación de los 4 extremos terminales de un AcM, constituye un elemento importante en la caracterización estructural de este tipo de moléculas. En este trabajo se logró identificar los 4 extremos terminales tanto del AcM 1E10 TA como del AcM 1E10 LAM. Con respecto a los extremos de la HC, las principales modificaciones post-traduccionales reportadas son: formación de ácido-piroglutámico en el N-terminal y la pérdida de lisina, así como la pérdida de glicina con amidación de prolina, ambas en el C-terminal. Estas modificaciones pueden ser identificadas teniendo en cuenta la variación en la masa que ocasionan dichas modificaciones [23]. 3.1.2.1 Extremo N-terminal de la cadena pesada En muchos estudios se ha demostrado que la glutamina N-terminal de la cadena pesada de los AcMs se transforma parcial o completamente en el derivado cíclico ácido piroglutámico (Qpir) mediante una reacción que puede ocurrir de manera espontánea o mediada por catálisis enzimática [24]. Esta reacción consiste en la ciclación de la amina N-terminal y la consiguiente pérdida de NH3 (-17Da) [82]. En este estudio se confirmó que tanto en el AcM 1E10 producido en líquido ascítico como en el producido en tanque agitado, la glutamina N-terminal de la cadena pesada (HT01) se encontraba exclusivamente en forma de ácido piroglutámico (Tabla 6 y Fig. 15). Esta modificación fue también observada por Machado y colaboradores y por de la Luz y colaboradores en sus respetivos trabajos [15, 16], aunque no se especifica si fue total o parcialmente. En la figura 15 se muestran los espectros del péptido N-terminal de la HC del AcM 1E10 y la secuencia aminoacídica correspondiente a dicho péptido. 42 Resultados y discusión Como se puede observar, el extremo N-terminal de la cadena pesada cuya relación m/z es de 1967,06 se encuentra desplazado 17m/z por debajo de su masa real, es decir en 1950m/z tanto para el AcM 1E10 LAM como para los cuatro lotes de AcM 1E10 TA. Este corrimiento se traduce en la conversión de la glutamina N-terminal en ácido piroglutámico (Qpir). Los resultados obtenidos para todos los lotes analizados presentaron incertidumbres que no sobrepasaron los 0,1m/z (péptido HT01 en Anexo 3). Esto representa una exactitud extremadamente buena (<0,5m/z), lo cual incrementa la confiabilidad de los resultados obtenidos. Fig. 15 Extremo N-terminal de la HC con conversión de Q a Qpir. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). 3.1.2.2 Extremo C-terminal de la cadena pesada La identificación del péptido C-Terminal de la cadena pesada de anticuerpos monoclonales es compleja, debido a que en muchas ocasiones es procesado con pérdida de lisina (K) [83]. El residuo de K del C-terminal de la HC puede ser parcial o completamente removido como consecuencia de la actividad de carboxipeptidasas básicas presentes en los sobrenadantes de cultivo. 43 Resultados y discusión Tanto en el AcM 1E10 LAM como en el AcM 1E10 TA el péptido C-terminal de la cadena pesada (HT36) fue encontrado con pérdida de lisina. Esta modificación ocasionó una disminución del peso molecular del C-terminal de la HC en 128Da [23]. También en el AcM 1E10 TA se identificó el péptido correspondiente al C-terminal de la HC en su estado original, es decir sin escisión de K (Fig. 16). Los valores de relación m/z obtenidos experimentalmente para el péptido HT36 estuvieron muy cercanos al valor teórico (812,43m/z), y el mayor valor de incertidumbre entre todos los lotes analizados fue de 0,2m/z (péptido HT36 en Anexo 3), lo que indica de manera clara la presencia de esta especie en los lotes de 1E10 provenientes de TA. Estos resultados coincidieron en gran parte con lo reportado por Machado y colaboradores [15], quienes no pudieron mapear este péptido mediante MS, pero obtuvieron estos datos de manera indirecta a partir del análisis de carga superficial del AcM 1E10 en cromatografía de intercambio catiónico débil, concluyendo que el AcM 1E10 TA presenta el C-terminal de la HC con y sin pérdida de K y que el AcM 1E10 LAM solo presenta el C-terminal con pérdida de K . Es destacable que por primera vez es posible mapear mediante MS el extremo C-terminal de la cadena pesada del AcM 1E10. En la figura 16 se muestran los espectros obtenidos para los lotes de TA y el lote de LAM en la región donde debe aparecer el péptido C-terminal sin pérdida de la lisina. En esta figura se puede observar claramente que el AcM 1E10 LAM no presenta señal a la altura de los 812m/z, lo que indica pérdida total de la K terminal. Se debe resaltar que tanto esta modificación post-traduccional como la pérdida de glicina con amidación de la prolina contigua, se ha demostrado que no afectan la calidad ni las propiedades farmacobiológicas del anticuerpo monoclonal [83] y que una vez que el producto es administrado al paciente esta K es escindida inmediatamente. 44 Resultados y discusión Fig. 16 Extremo C-terminal de la HC con K. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Como se mencionó anteriormente el péptido C-terminal de la HC del AcM 1E10 también se pudo determinar con pérdida de lisina. Los espectros correspondientes a dicha modificación se muestran en la figura 17. Este fenómeno ha sido ampliamente estudiado y se ha comprobado que es la mayor causa de heterogeneidad de carga en anticuerpos monoclonales [40, 84]. El estudio de carga superficial en anticuerpos se considera como la cualidad más propensa a ser afectada por cualquier cambio en el proceso productivo y en particular las variantes sin lisina (0K),con una lisina (1K) y con dos lisinas (2K) son las especies dominantes dentro de este análisis. Además el perfil cromatográfico del contenido de K ha sido utilizado como elemento de robustez en estudios de consistencia por cambios de escala y sitio del proceso de fabricación [64]. 45 Resultados y discusión Fig. 17 Extremo C-terminal de la HC con pérdida de K. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). En la figura 17 se puede observar una señal alrededor de 684m/z, la cual se corresponde con una disminución de 128Da en la masa del péptido C-terminal de la HC (812,43m/z). Esta pérdida de masa se debe a la ruptura de la lisina terminal tanto para el AcM 1E10 LAM como para el AcM 1E10 TA, lo que quiere decir que esta especie está presente en ambos productos, siendo de hecho, la única presente para el C-terminal del 1E10 LAM. A diferencia de Dick y colaboradores [85] en el presente análisis no se encontró la modificación que conduce a pérdida de glicina con amidación de prolina para ninguno de los lotes de producto estudiados. 3.1.2.3 Extremo N-terminal de la cadena ligera El extremo N-terminal de la LC (LT01) fue mapeado correctamente tanto para el AcM 1E10 LAM como en el AcM 1E10 TA (Tabla 7 y Fig. 18). Estos resultados coinciden con los estudios realizados anteriormente para este anticuerpo [15, 16]. 46 Resultados y discusión A continuación se muestra el péptido N-terminal de la cadena ligera del AcM 1E10 LAM y de los lotes de 1E10 TA. Fig. 18 Extremo N-terminal de la cadena ligera. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). A partir del valor de masa teórico del péptido N-terminal de la LC, se determinó que la incertidumbre de esta medición para este péptido no supera los 0,1Da (péptido LT01 en Anexo 6), lo que corrobora la veracidad de los valores obtenidos. 3.1.2.4 Extremo C-terminal de la cadena ligera El extremo C-terminal de la LC presenta en su estructura un sitio de N-glicosilación, que no ha sido mapeado hasta el presente. Además cuando se utiliza tripsina para la digestión del AcM, se produce un péptido de solo tres aminoácidos, LT19 (Tabla 7), el cual, debido a su pequeña masa (422,13Da) se encuentra fuera de las posibilidades de su análisis mediante MALDI-MS. Sin embargo, con la utilización de la enzima Lys-C, se obtiene un péptido de siete aminoácidos, LL12 (Tabla 7), con 926,38m/z, que es perfectamente medible mediante la tecnología MALDIMS. 47 Resultados y discusión De esta forma, fue posible mapear por primera vez el extremo C-terminal del AcM 1E10, (Tabla 7 y Fig. 19), pues en los trabajos anteriores [15, 16], solo se utilizó tripsina como enzima de digestión. Se demostró asimismo, que la molécula de 1E10 no se encuentra glicosilada en este sitio, siendo este resultado de gran significación y valor para este trabajo. Fig. 19 Extremo C-terminal de la cadena ligera de los lotes glicosilados digeridos con Lys-C. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Como se muestra en la figura 19 y en el anexo 8 (péptido LL12), la incertidumbre del péptido Nterminal de la LC para todos los lotes de TA y el lote de LAM presentó como valor máximo 0,1Da. Este dato confirma de manera efectiva la presencia del péptico C-terminal de la cadena ligera en su estado no glicosilado, además, en el análisis de las muestras desglicosiladas digeridas con la enzima Lys-C, este péptido se observa exactamente con esta misma masa (Fig. 20), o sea, sin el clásico corrimiento de 1Da debido al proceso de desglicosilación, lo que ratifica el hecho que no se encuentra asociado a ninguna glicoforma. 48 Resultados y discusión Fig. 20 Extremo C-terminal de la cadena ligera de los lotes desglicosilados digeridos con Lys-C. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). 3.1.3 Análisis de otras modificaciones post-traduccionales 3.1.3.1 Deamidación de Asparagina La deamidación de Asparagina (N), es uno de los principales mecanismos de degradación química en las proteínas farmacéuticas durante la producción y el almacenamiento [41]. Esta PTM se evidencia en MS con un incremento de 1Da [8, 40]. En un estudio realizado anteriormente [15] con el 1E10, se reportaron tres sitios de deamidación para esta molécula, uno en la cadena pesada (asparagina 141) y dos en la cadena ligera (asparaginas 157 y 161). Con el presente trabajo, se pudo corroborar el sitio de deamidación de N141 en todos los lotes de AcM 1E10 TA estudiados, (Fig. 21 y péptido HT12 en Tabla 6) y no en el AcM 1E10 producido a partir de LAM, lo cual concuerda completamente con lo reportado por Machado y colaboradores para esta molécula [15]. 49 Resultados y discusión Fig. 21 Péptido HT12. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Como dato adicional se debe destacar la excelente exactitud en la relación m/z obtenida para el péptido HT12 en todos los lotes estudiados, valor que se encuentra en el rango de ±0,2m/z con relación al valor teórico en cada caso (péptido HT12 en Anexo 3). Con respecto a los dos sitios de deamidación reportados en la cadena ligera para este anticuerpo (péptido LT13), los resultados obtenidos no concuerdan exactamente con lo reportado por Machado y colaboradores [15]. En este estudio, detectamos una señal cerca de los 1593,90m/z en los espectros correspondientes, que coincide exactamente con la encontrada por Machado y colaboradores y que fue asignada al péptido LT13 como doblemente deamidado (Fig. 22 y péptido LT13 en Tabla 7). 50 Resultados y discusión Fig. 22 Péptido LT13. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Primeramente también se asumió, que este péptido se encontraba doblemente deamidado. No obstante, como se puede apreciar claramente en la figura anterior este péptido no pudo ser detectado para el 1E10 LAM, ni doblemente deamidado, monodeamidado (1592,91Da), o en su forma original (1591,91Da), mientras que para los lotes TA2 y TA3 se obtiene una señal bastante pobre en términos de resolución y señal/ruido. Solo en los lotes TA1 y TA4 se obtienen señales apropiadas. Sin embargo, cuando se hace el análisis de los péptidos obtenidos a partir de la digestión del anticuerpo con la enzima Lys-C, se obtiene una señal peptídica intensa en torno al valor de 2250m/z, (Fig. 23 y péptido LL08 en Tabla 7). Esta señal se encuentra corrida 1Da con respecto al valor teórico (2249,04Da) del péptido LL08, el cual contiene las dos asparaginas correspondientes al péptido LT13 obtenido por la digestión con la enzima tripsina. Teniendo en cuenta que el corrimiento observado es únicamente de 1Da, se puede arribar a la conclusión de que solo está deamidada una de las dos asparaginas susceptibles a la deamidación que presenta este péptido (IDGSERQNGVLNSWTDQDSK) y no en los dos sitios de deamidación como fue descrito originalmente por Machado y colaboradores. Adicionalmente, en lo reportado por estos autores no se muestra el espectro, y tan solo se menciona que se obtuvo una señal peptídica 51 Resultados y discusión correspondiente a 1593m/z, o sea, corrido 2Da con respecto a su valor teórico, muy similar a la obtenida en el presente trabajo. Fig. 23 Péptido LL08. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Otra diferencia importante en relación a lo reportado por Machado y colaboradores es que ellos encontraron esta doble deamidación exclusivamente en el producto obtenido a partir de LAM, mientras que en los resultados mostrados se evidenció que la deamidación ocurre tanto, en el producto obtenido a partir de LAM como en el obtenido a partir de TA. Estos datos fueron verificados posteriormente a través del error de corte LL07-LL08 (WKIDGSERQNGVLNSWTDQDSK) con esta misma enzima, originado probablemente por la cercanía de un ácido aspártico al sitio de corte de LL08. El valor de masa teórico de este péptido es 2563,22Da. En todos los casos se obtuvo este péptido corrido 1Da con respecto a este valor, excepto para el tercer lote de TA en el cual este error de corte no fue observado (Fig. 24 y error de corte LL07-LL08 en Tabla 7). Estos datos permitieron concluir de manera definitiva, que el 52 Resultados y discusión proceso de deamidación estaba ocurriendo solamente en uno de los posibles sitios de deamidación y no en los dos. Fig. 24 Error de corte LL07-LL08. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3, AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Se consideró que aunque el péptido LL08 presenta dos sitios posibles de deamidación (N157 y N161), la asparagina que se encuentra deamidada es la 157, debido a que esta asparagina esta seguida por glicina, lo que constituye por mucho, el sitio más susceptible para la deamidación en proteínas [24]. La asparagina 141 se encuentra en la región constante del anticuerpo, mientras que la asparagina 157 está en la región consevada del fragmento de unión al antígeno (Fab). Esto indica que probablemente ninguno de los tres sitios de deamidación encontrados tengan influencia en la actividad antitumoral descrita para el AcM 1E10. Al igual que para HT12, el péptido LL08 se identificó con una exactitud excelente, siendo la incertidumbre en la determinación de la masa ≤0,2Da, lo que permitió asignar esta señal al péptido LL08 (péptido LL08 en Anexo10). 53 Resultados y discusión La deamidación de los residuos de asparagina es un fenómeno que se favorece a pHs básicos como los que se utilizan en la purificación del AcM 1E10 y en las digestiones enzimáticas, y está considerada como una de las causas principales de degradación de los anticuerpos monoclonales durante su almacenamiento [54]. 3.1.3.2 Oxidación de metionina La oxidación de metionina (M) es otra de las tan estudiadas PTMs. En este trabajo no se detectó oxidación de metionina en ninguno de los péptidos que contienen este aa. Sin embargo Machado y colaboradores encontraron la oxidación de la M396 de la cadena pesada del AcM 1E10 TA en el péptido HT33 [15]. En la actualidad está bien establecido que la oxidación de metionina es una modificación química que puede alterar la conformación y la estabilidad de los AcMs a través de la desestabilización de las estructuras de los dominios CH2 y CH3 localizados en el Fc. Los espectros del péptido HT33 se muestran en la figura 25, donde A muestra aquellos espectros obtenidos en este estudio y B muestra los espectros obtenidos por Machado y colaboradores. Como se puede observar en los espectros obtenidos en este estudio no se encontró ninguna señal correspondiente a un incremento de masa de 16Da para el péptido que contiene la M396 (HT33), lo que evidencia que el mismo no está oxidado. 54 Resultados y discusión A B Fig. 25 Oxidación de Metionina 396 en el péptido HT33. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 obtenidos en este estudio (A). AcM 1E10 LAM y AcM 1E10 TA reportados por Machado y colaboradores (B). 55 Resultados y discusión 3.1.4 Análisis de los perfiles de glicosilación Debido al gran impacto que tiene la glicosilación de la región Fc sobre la conformación y la estabilidad de los AcMs [86], se realizó un análisis de los perfiles de glicosilación del AcM 1E10 LAM y el AcM 1E10 TA. Este análisis glicopeptídico se encuentra asociado al primer sitio de glicosilación de la estructura primaria del anticuerpo 1E10 (péptido HT21: EEQFNSTFR), debido a que este fue el único de los dos sitios de N-glicosilación que se mostró glicosilado. Los espectros correspondientes al péptido HT21 para el AcM 1E10 LAM y para los lotes de AcM 1E10 TA de los lotes desglicosilados y glicosilados se muestran en las figuras 26 y 27 respectivamente. Fig. 26 Péptido HT21 correspondientes a los lotes desglicosilados. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). Como se muestra en la figura 26 y en el anexo 5 el péptido HT21 con 1157,52m/z apareció corrido 1Da respecto a su valor teórico, tanto en el espectro del AcM 1E10 LAM desglicosilado como en los lotes de 1E10 TA desglicosilado. Esto evidencia que el proceso de desglicosilación del anticuerpo con PNGaseF ocasionó la deamidación de la asparagina correspondiente al sitio 56 Resultados y discusión de N-glicosilación originando la ruptura del enlace glicosídico, y convirtiendo la asparagina en un ácido aspártico [87]. En la figura 27 y en la tabla 6 se puede presenciar el péptido HT21 en su masa original para el 1E10 TA1, TA2 y TA4 de los lotes glicosilado. Sin embargo, no ocurrió lo mismo con el lote glicosilado del AcM 1E10 LAM, para el cual este péptido no fue encontrado en su forma aglicosilada, y únicamente se pudo identificar asociado a diferentes glicanos. Fig. 27 Péptido HT21 correspondientes a los lotes glicosilados. AcM 1E10 LAM, AcM 1E10 TA1, AcM 1E10 TA2, AcM 1E10 TA3 y AcM 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba). La presencia de este péptido en su forma aglicosilada en el 1E10 TA es minoritaria, debido a que este sitio de N-glicosilación es muy susceptible a enlazarse a diferentes glicanos. También se debe destacar que para el lote 1E10 TA3, aunque no es posible asignar una señal se puede apreciar la presencia de la misma, a diferencia del 1E10 LAM, donde solo se observa ruido a la altura de la señal correspondiente al péptido aglicosilado. Es importante señalar que la presencia de N-glicanos en las proteínas es una de las mayores fuentes de heterogeneidad en ellas y que por primera vez para este anticuerpo se encuentra la estructura aglicosilada, pues en los trabajos 57 Resultados y discusión anteriores [15, 16] nunca había sido detectada esta especie, algo que se ha reportado para otros anticuerpos comerciales, igualmente de manera muy minoritaria [88]. El estudio de los glicopéptidos se centrará en los resultados obtenidos para el AcM 1E10 LAM y el AcM 1E10 TA1 con el fin de simplificar este análisis, lo cual resulta posible debido a la similitud existente entre los resultados obtenidos para todos los lotes de TA (Anexo 11). A continuación se muestran los espectros correspondientes a los glicopéptidos que fueron encontrados en el AcM 1E10 TA1 y en el AcM 1E10 LAM. Fig. 28 Espectros de los glicopéptidos encontrados para el AcM 1E10 LAM y para el AcM 1E10 TA1 (de abajo hacia arriba). En los círculos rojos se muestran las glicoformas mayoritarias. Las estructuras oligosacarídicas N-enlazadas a los AcM 1E10 LAM y AcM 1E10 TA fueron estructuras di-antenas fucosiladas y afucosiladas y estructuras de alta manosa (Tabla 8). Los picos más intensos, se identificaron como estructuras agalactosiladas y fucosiladas (G0F), y monogalactosiladas y fucosiladas (G1F). Esto coincide con los resultados obtenidos en los 58 Resultados y discusión estudios anteriores y con lo reportado en la literatura para anticuerpos monoclonales [89-91]. Al igual que para el estudio mencionado anteriormente, la estructura G0F representó la de mayor peso (Tabla 8, Fig. 28 y Anexo 11). En cuanto a la estructura G2F, la misma se encuentra representada de manera minoritaria en las muestras analizadas, lo que coincide con lo reportado por Machado y colaboradores [15]. Tabla 8: Glicopéptidos identificados en el primer sitio de glicosilación del AcM 1E10 LAM y del AcM 1E10 TA1 MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM MH+Med. (m/z) TA1 Nombre de los glicanos 2236,92 2236,94 No encontrado G0F-M-N 2252,92 2252,91 No encontrado G0-N 2373,95 2373,95 No encontrado M5 2398,98 2398,97 No encontrado G0F-N 2456,00 2456.00 2456.05 G0 2602,05 2601,97 2602,03 G0F 2618.05 2618,36 2618,34 G1 2764,11 2764,12 2764,08 G1F 2926,16 2926,21 2926,17 G2F G: galactosa M: manosa F: fucosa 59 Estructura de los glicanos N: N-acetilglucosamina Resultados y discusión En este estudio se mapearon por primera vez un importante número de estructuras minoritarias para el AcM 1E10 (G0F-M-N, G0-N, G0F-N y M5). No obstante, solo fueron detectadas para el LAM y las mismas han sido reportadas para otros anticuerpos monoclonales igualmente en una baja proporción (Tabla 8 y Fig. 28). Además, las estructuras afucosiladas (G0 y G1), comunes en todos los anticuerpos [52] tampoco habían sido mapeadas anteriormente y se lograron identificar con el presente trabajo. Una discrepancia importante con lo encontrado por Machado y colaboradores [15] respecto a este trabajo, lo constituye el hecho de que identificaron tres estructuras sialidadas minoritarias, mientras que en el presente estudio no se detectó ninguna. Hay varios aspectos a tener en cuenta al tratar de explicar esta discordancia: El primero, es que estos autores [15] obtuvieron los resultados a partir de una separación cromatográfica en HPLC de fase normal utilizando una columna TSK-GEL Amide 80 de los oligosacáridos marcados con el reactivo fluorescente 2-aminobenzadina (2-AB). Posteriormente, los tiempos de retención de cada pico son convertidos a unidades de glucosa (GU), mediante la comparación de estos con un hidrolizado de dextrana marcado con 2-AB como patrón de referencia y separado también en el mismo sistema. Este sistema es ampliamente utilizado y ha probado su utilidad en múltiples estudios de glicanos, tanto en proteínas recombinantes como a nivel glicómico en células y tejidos [92-94], no obstante, su mayor utilidad ha sido como método de cuantificación y no como método de identificación, aunque también ha sido utilizado con este propósito. Para ser utilizado como métodos de identificación, el sistema debe estar cuidadosamente calibrado y validado, pues las asignaciones se harán de manera indirecta, a partir de un índice de GU, de lo contrario se corre el riesgo de hacer asignaciones erróneas. Es llamativo el hecho de que Machado y colaboradores [15] no encontraran ninguna estructura oligosacarídica afucosilada, cuando estas, aunque de forma minoritaria siempre están presentes en todos los análisis de anticuerpos que se han reportado en la literatura, particularmente las estructuras G0, G1, e incluso G2 [52]. Por lo tanto, se considera que en lo reportado por Machado y colaboradores pudiera haberse dado algún problema de calibración del sistema que condujera a algún error en las asignaciones realizadas. 60 Resultados y discusión El segundo elemento es la sensibilidad. La MALDI-MS es tanto o más sensible que el sistema HPLC-fluorescencia utilizado por Machado y colaboradores. Teniendo en cuenta que en el estudio mencionado anteriormente [15] se asignaron un considerable número de especies minoritarias, algunas de ellas representando menos del 1% del total de especies presentes en el anticuerpo, es paradójico entonces que no fueran capaces de encontrar una estructura como G0, que acontece para alrededor del 2,5% del total de estructuras en esta molécula. Es este entonces otro elemento que señala a algún error en la calibración del sistema. Inversamente, el fenómeno de sensibilidad pudiera explicar también que en el presente trabajo fuera posible mapear un número importante de estructuras minoritarias que acontecen para menos del 1% del total de glicanos del anticuerpo y que Machado y colaboradores [15] no pudieron encontrar. Finalmente, hay un aspecto que apunta en la dirección opuesta a los otros dos. Está bien documentado, que durante la MALDI-MS de moléculas polisialidadas, particularmente gangliósidos, pero también glicanos, puede ocurrir pérdida de ácido siálico durante el proceso de ionización [95-97], no obstante, es necesario aclarar que en todos estos reportes se habla de moléculas que contienen más de 3 ácidos siálicos y nunca de moléculas mono o di sialidadas como las reportadas por Machado y colaboradores, pero es un hecho que no se debe obviar y que pudiera estar atentando contra los resultados obtenidos. Lo más usual en el análisis de glicanos es el uso combinado de ambos métodos. Se utiliza MALDI-MS o ESI-MS, aunque mayormente MALDI, para la identificación de los glicanos y la cromatografía como método de cuantificación y separación [98]. Con respecto a las discrepancias encontradas entre el anticuerpo producido a partir de LAM respecto a TA, o sea, a la pequeña fracción de aglicosilación del péptido HT21 en el AcM 1E10 TA y a las estructuras minoritarias encontradas en el AcM 1E10 LAM, se considera que las mismas no son de relevancia para su función biológica, ya que este anticuerpo es utilizado como vacuna, es decir, lo que se requiere de él es la generación de una potente respuesta inmunogénica, en la cual la glicosilación no juega un rol fundamental. 3.1.5 Consideraciones finales De los análisis realizados en este estudio se confirma que el AcM 1E10 LAM y el AcM 1E10 TA son comparables en cuanto a su estructura primaria. En estos análisis fueron identificados los 61 Resultados y discusión cuatro extremos terminales de ambas moléculas y sus modificaciones post-trasduccionales. Adicionalmente, fueron identificados dos sitios de deamidación, uno en la asparagina 141 de la HC y el otro en la asparagina 157 de la LC. La deamidación detectada en la LC estuvo presente tanto en el AcM 1E10 LAM como en el AcM 1E10 TA, pero la deamidación de la cadena pesada solo se observó en el AcM 1E10 TA. A pesar de esta diferencia, no se cree que esto constituya una discrepancia representativa entre ambos productos, debido a que esta modificación fue encontrada en la región constante (Fc) del AcM, por lo que no afecta la calidad ni la seguridad del producto bioterapéutico. Sin embargo la oxidación de metionina, se considera una modificación que provoca un impacto considerable en las propiedades y la efectividad del medicamento por encontrarse en la región hipervariable del anticuerpo. Esta modificación fue detectada por Machado y colaboradores para el anticuerpo producido a partir de TA y no fue detectada en el presente estudio para ninguno de los lotes estudiados, lo que pudiera atribuirse a las mejoras efectuadas en el proceso productivo de este anticuerpo. A continuación se muestran las secuencias confirmadas por MS para las cadenas ligera y pesada del AcM 1E10 LAM y del AcM 1E10 TA. En rojo la secuencia mapeada. Subrayado los péptidos cuya masa se encuentra fuera del rango de trabajo del espectrómetro. Los superíndices identifican las modificaciones post-traduccionales encontradas (deam: deamidación, pir: ácido piroglutámico, per: pérdida de lisina, glic: glicosilación). Cadena pesada del AcM 1E10 LAM QpirVQLQQSGAE10LVKPGASVKL20SCKASGYTFT30SYDINWVRQR40PEQGLEWIGW50IFPGDG STKY60NEKFKGKATL70TTDKSSSTAY80MQLSRLTSED90SAVYFCARED100YYDNSYYFDY110W GQGTTLTVS120SAKTTPPSVY130PLAPGSAAQT140NSMVTLGCLV150KGYFPEPVTV160TWNSGS LSSG170VHTFPAVLQS180DLYTLSSSVT190VPSSPRPSET200VTCNVAHPAS210STKVDKKIVP2 20RDCGCKPCIC230TVPEVSSVFI240FPPKPKDVLT250ITLTPKVTCV260VVDISKDDPE270VQF SWFVDDV280EVHTAQTQPR290EEQFNglicSTFRS300VSELPIMHQD310WLNGKEFKCR320VNSAA FPAPI330EKTISKTKGR340PKAPQVYTIP350PPKEQMAKDK360VSLTCMITDF370FPEDITVEWQ 380WNGQPAENYK390NTQPIMDTDG400SYFVYSKLNV410QKSNWEAGNT420FTCSVLHEGL430HNH HTEKSLS440HSPGKper 62 Resultados y discusión Cadena ligera del AcM 1E10 LAM DIQMTQTTSS10LSASLGDRVT20ISCRASQDIS30NYLNWYQQKP40DGTVKLLIYY50TSRLHSGV PS60RFSGSGSGTD70YSLTISNLEQ80EDIATYFCQQ90GNTLPWTFGG100GTKLESKRAD110AAP TVSIFPP120SSEQLTSGGA130SVVCFLNNFY140PKDINVKWKI150DGSERQNdeamGVL160NSWTD QDSKD170STYSMSSTLT180LTKDEYERHN190SYTCEATHKT200STSPIVKSFN210RNEC Cadena pesada del AcM 1E10 TA QpirVQLQQSGAE10LVKPGASVKL20SCKASGYTFT30SYDINWVRQR40PEQGLEWIGW50IFPGDG STKY60NEKFKGKATL70TTDKSSSTAY80MQLSRLTSED90SAVYFCARED100YYDNSYYFDY110W GQGTTLTVS120SAKTTPPSVY130PLAPGSAAQT140NdeamSMVTLGCLV150KGYFPEPVTV160TWN SGSLSSG170VHTFPAVLQS180DLYTLSSSVT190VPSSPRPSET200VTCNVAHPAS210STKVDKKI VP220RDCGCKPCIC230TVPEVSSVFI240FPPKPKDVLT250ITLTPKVTCV260VVDISKDDPE270V QFSWFVDDV280EVHTAQTQPR290EEQFNglicSTFRS300VSELPIMHQD310WLNGKEFKCR320VNS AAFPAPI330EKTISKTKGR340PKAPQVYTIP350PPKEQMAKDK360VSLTCMITDF370FPEDITVE WQ380WNGQPAENYK390NTQPIMDTDG400SYFVYSKLNV410QKSNWEAGNT420FTCSVLHEGL430H NHHTEKSLS440HSPGKper Cadena ligera del AcM 1E10 TA DIQMTQTTSS10LSASLGDRVT20ISCRASQDIS30NYLNWYQQKP40DGTVKLLIYY50TSRLHSGV PS60RFSGSGSGTD70YSLTISNLEQ80EDIATYFCQQ90GNTLPWTFGG100GTKLESKRAD110AAP TVSIFPP120SSEQLTSGGA130SVVCFLNNFY140PKDINVKWKI150DGSERQNdeamGVL160NSWTD QDSKD170STYSMSSTLT180LTKDEYERHN190SYTCEATHKT200STSPIVKSFN210RNEC Con respecto al análisis del perfil de glicosilación, ambos anticuerpos presentaron un mismo patrón de estructuras mayoritarias, particularmente G0F y G1F. Aunque en el AcM 1E10 TA el sitio de glicosilación analizado se presentó en su forma aglicosilada y en el AcM 1E10 LAM se encontraron cuatro nuevas estructuras minoritarias, consideramos que esto no constituye una diferencia relevante entre ambos productos. 63 Conclusiones CONCLUSIONES 1. La espectrometría de masa MALDI-TOF permitió mapear: para el AcM 1E10 LAM el 66,3% de cadena pesada y el 72,0% de cadena ligera, y para el AcM 1E10 TA el 72,0% de la cadena pesada y el 73,8% de la cadena ligera, se mapearon por primera vez los cuatro extremos terminales de ambos productos y se identificaron las modificaciones post-trasduccionales presentes tanto en el AcM 1E10 LAM como en el AcM 1E10 TA. 2. Se obtuvieron los perfiles de glicoformas del 1E10 producido por ambos procesos, encontrándose como estructuras mayoritarias la G0F y la G1F. Así como se identificaron por primera vez 4 nuevas estructuras minoritarias en el lote de LAM y una pequeña fracción del primer sitio de glicosilación se encontró en su forma aglicosilada para los lotes de TA. 3. Se realizó un análisis de los resultados obtenidos y se demostró que los anticuerpos monoclonales, 1E10 LAM y 1E10 TA, son comparables. 64 Recomendaciones RECOMENDACIONES 1. Mapear el 100% de la secuencia aminoacídica utilizando enzimas complementarias, tales como la quimiotripsina, Glu-C o Asp-N. 2. Utilizar la técnica de HPLC con fase inversa para lograr una separación óptima de los péptidos a procesar. 3. Analizar los péptidos fraccionados mediante MALDI- MS/MS con el objetibo de alcanzar una identificación más detallada del anticuerpo en estudio. 65 Referencias REFERENIAS 1. Alfonso M., Díaz A., Hernández A.M., Pérez A., Rodríguez E., Bitton R., Pérez R. and Vázquez A.M. An anti-idiotype vaccine elicits a specific response to N-glycolyl sialic acid residues of glycoconjugates in melanoma patients. J Immunol, 2002. 168(5): p. 2523-9. 2. Alfonso S., Díaz R.M., de la Torre A., Santiesteban E., Aguirre F., Pérez K., Rodríguez J.L., Barroso Mdel C., Hernández A.M., Toledo D., Gabri M.R., Alonso D.F., Viada C., Gómez R.E., Suarez E., Vázquez A.M., Pérez R. and Macías A.E. 1E10 anti-idiotype vaccine in non-small cell lung cancer: experience in stage IIIb/IV patients. Cancer Biol Ther, 2007. 6(12): p. 1847-52. 3. Díaz A., Alfonso M., Alonso R., Saurez G., Troche M., Catala M., Díaz R.M., Pérez R. and Vázquez A.M. Immune responses in breast cancer patients immunized with an anti-idiotype antibody mimicking NeuGc-containing gangliosides. Clin Immunol, 2003. 107(2): p. 80-9. 4. Neninger E., Díaz R.M., de la Torre A., Rives R., Díaz A., Saurez G., Gabri M.R., Alonso D.F., Wilkinson B., Alfonso A.M., Combet T., Pérez R. and Vázquez A.M. Active immunotherapy with 1E10 anti-idiotype vaccine in patients with small cell lung cancer: report of a phase I trial. Cancer Biol Ther, 2007. 6(2): p. 145-50. 5. Hendriksen C.F. and Leeu W. Production of monoclonal antibodies by the ascites method in laboratory animals. Res Immunol 1998. 149(6): p. 535-42. 6. Vezer B., Buzas Z., Sebeszta M. and Zrubka Z. Authorized manufacturing changes for therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) in European Public Assessment Report (EPAR) documents. Curr Med Res Opin, 2016. 32(5): p. 829-34. 7. Shukla A.A., Hubbard B., Tressel T., Guhan S. and Low D. Downstream processing of monoclonal antibodies--application of platform approaches. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007. 848(1): p. 28-39. 8. An Y., Zhang Y., Mueller H.M., Shameem M. and Chen X. A new tool for monoclonal antibody analysis: application of IdeS proteolysis in IgG domain-specific characterization. MAbs, 2014. 6(4): p. 879-93. 9. Beck A., Sanglier-Cianferani, S., and Van Dorsselaer, A. Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry. Anal Chem, 2012. 84(11): p. 4637-46. 10. Haberger M., Bomans K., Diepold K., Hook M., Gassner J., Schlothauer T., Zwick A., Spick C., Kepert J.F., Hienz B., Wiedmann M., Beck H., Metzger P., Molhoj M., Knoblich C., Grauschopf U., Reusch D. and Bulau P. Assessment of chemical modifications of sites in the CDRs of recombinant antibodies: Susceptibility vs. functionality of critical quality attributes. MAbs, 2014. 6(2): p. 327-39. 66 Referencias 11. Singleton C.A. MS in the analysis of biosimilars. Bioanalysis, 2014. 6(12): p. 162737. 12. European Medicines Agency. Guideline on similar biological medicinal products containing monoclonal antibodies—non-clinical and clinical issues, 2012. Disponible en:http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/201 2/06/WC500128686.pdf. Consultado: 20/5/2016 13. Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Scientific considerations in demonstrating biosimilarity to a reference product, 2012. Disponible en: http://www.fda.gov/downloas/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Gui dances/UCM291128.pdf. Consultado: 20/5/2016. 14. Chen G., Warrack B.M., Goodenough A.K., Wei H., Wang-Iverson D.B. and Tymiak A.A. Characterization of protein therapeutics by mass spectrometry: recent developments and future directions. Drug Discov Today, 2011. 16(1-2): p. 58-64. 15. Machado Y.J., Rabasa Y., Montesinos R., Cremata J., Besada V., Fuentes D., Castillo A., de la Luz K.R., Vázquez A.M. and Himly M. Physicochemical and biological characterization of 1E10 anti-idiotype vaccine. BMC Biotechnol, 2011. 11: p. 112. 16. de la Luz-Hernández K., Rabasa Y., Montesinos R., Fuentes D., Santo-Tomas J.F., Morales O., Aguilar Y., Pacheco B. and Castillo A. Cancer vaccine characterization: from bench to clinic. Vaccine, 2014. 32(24): p. 2851-8. 17. Weise M., Bielsky M.C., De Smet K., Ehmann F., Ekman N., Giezen T.J., Gravanis I., Heim H.K., Heinonen E., Ho K., Moreau A., Narayanan G., Kruse N.A., Reichmann G., Thorpe R., van Aerts L., Vleminckx C., Wadhwa M. and Schneider C.K. Biosimilars: what clinicians should know. Blood, 2012. 120(26): p. 5111-7. 18. Gavilondo J.V., Anticuerpos Monoclonales. 1995, La Habana: Elfos. 19. Kohler G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. J Immunol, 1975. 174(5): p. 2453-5. 20. Crombet T., Pérez R., Lage A., Osorio M. and Cruz T. Anticuerpo monoclonal humanizado h-R3: un nuevo concepto terapéutico para el tratamiento del cáncer avanzado. Biotecnología aplicada, 2003. 20(1): p. 33-51. 21. Hmiel L.K., Brorson K.A. and Boyne M.T., 2nd. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Anal Bioanal Chem, 2015. 407(1): p. 79-94. 22. Liu H. and May K. Disulfide bond structures of IgG molecules: structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs, 2012. 4(1): p. 17-23. 67 Referencias 23. Beck A., Wagner-Rousset E., Ayoub D., Van Dorsselaer A. and Sanglier-Cianferani S. Characterization of therapeutic antibodies and related products. Anal Chem, 2013. 85(2): p. 715-36. 24. Liu H., Gaza-Bulseco G., Faldu D., Chumsae C. and Sun J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J Pharm Sci, 2008. 97(7): p. 2426-47. 25. Zhang H., Cui W. and Gross M.L. Mass spectrometry for the biophysical characterization of therapeutic monoclonal antibodies. FEBS Lett, 2014. 588(2): p. 308-17. 26. Vázquez A.M., Pérez A., Hernández A.M., Macías A., Alfonso M., Bombino G. and Pérez R. Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody. Hybridoma, 1998. 17(6): p. 527-34. 27. Vázquez A.M., Alfonso M., Lanne B., Karlsson K.A., Carr A., Barroso O., Fernández L.E., Rengifo E., Lanio M.E. and Álvarez C. Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids. Hybridoma, 1995. 14(6): p. 551-6. 28. Hernández A.M., Toledo D., Martínez D., Grinan T., Brito V., Macías A., Alfonso S., Rondon T., Suarez E., Vázquez A.M. and Pérez R. Characterization of the antibody response against NeuGcGM3 ganglioside elicited in non-small cell lung cancer patients immunized with an anti-idiotype antibody. J Immunol, 2008. 181(9): p. 662534. 29. González A.O. Anticuerpos monoclonales murinos: descripción de protocolos técnicos. Revista Biomédica, 1995. 6(3): p. 2-3. 30. Little M., Kipriyanov S.M., Le Gall F. and Moldenhauer G. Of mice and men: hybridoma and recombinant antibodies. Immunol Today, 2000. 21(8): p. 364-70. 31. Beck A., Wurch T., Bailly C. and Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol, 2010. 10(5): p. 345-52. 32. Tan Q., Guo Q., Fang C., Wang C., Li B., Wang H., Li J. and Guo Y. Characterization and comparison of commercially available TNF receptor 2-Fc fusion protein products. MAbs, 2012. 4(6): p. 761-74. 33. Tsiftsoglou A.S., Ruiz S. and Schneider C.K. Development and regulation of biosimilars: current status and future challenges. BioDrugs, 2013. 27(3): p. 203-11. 34. Li C., Rossomando A., Wu S.L. and Karger B.L. Comparability analysis of anti-CD20 commercial (rituximab) and RNAi-mediated fucosylated antibodies by two LC-MS approaches. MAbs, 2013. 5(4): p. 565-75. 35. Ayoub D., Jabs W., Resemann A., Evers W., Evans C., Main L., Baessmann C., Wagner-Rousset E., Suckau D. and Beck A. Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle68 Referencias down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques. MAbs, 2013. 5(5): p. 699-710. 36. Visser J., Feuerstein I., Stangler T., Schmiederer T., Fritsch C. and Schiestl M. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs, 2013. 27(5): p. 495-507. 37. International Conference on Harmonisation (ICH) of Technical Requirements for registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH Harmonised Tripartite Guideline Comparability of Biotechnological/ Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process Q5E, 2004. Disponible en:www.ich.org/fileadmin/ Public_Web_Site/ ICH_Products/Guidelines /Quality/Q5E/Step4/Q5E_Guideline.pdf. Consultado: 21/5/2016 38. Lee J.F., Litten J.B. and Grampp G. Comparability and biosimilarity: considerations for the healthcare provider. Curr Med Res Opin, 2012. 28(6): p. 1053-8. 39. Pérez C. and Ortiz P., Espectroscopia. Vol. I. 2010, La Habana: Editorial Félix Varela. 40. Neill A., Nowak C., Patel R., Ponniah G., González N., Miano D. and Liu H. Characterization of Recombinant Monoclonal Antibody Charge Variants Using OFFGEL Fractionation, Weak Anion Exchange Chromatography, and Mass Spectrometry. Anal Chem, 2015. 87(12): p. 6204-11. 41. Zhang Y.T., Hu J., Pace A.L., Wong R., Wang Y.J. and Kao Y.H. Characterization of asparagine 330 deamidation in an Fc-fragment of IgG1 using cation exchange chromatography and peptide mapping. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2014. 965: p. 65-71. 42. Abzalimov R.R., Bobst C.E. and Kaltashov I.A. A new approach to measuring protein backbone protection with high spatial resolution using H/D exchange and electron capture dissociation. Anal Chem, 2013. 85(19): p. 9173-80. 43. Konermann L., Pan J. and Liu Y.H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc Rev, 2011. 40(3): p. 1224-34. 44. Rand K.D., Zehl M. and Jorgensen T.J. Measuring the hydrogen/deuterium exchange of proteins at high spatial resolution by mass spectrometry: overcoming gas-phase hydrogen/deuterium scrambling. Acc Chem Res, 2014. 47(10): p. 3018-27. 45. He X.Z., Que A.H. and Mo J.J. Analysis of charge heterogeneities in mAbs using imaged CE. Electrophoresis, 2009. 30(5): p. 714-22. 46. Vlasak J. and Ionescu R. Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by chargesensitive methods. Curr Pharm Biotechnol, 2008. 9(6): p. 468-81. 69 Referencias 47. Ponniah G., Kita A., Nowak C., Neill A., Kori Y., Rajendran S. and Liu H. Characterization of the acidic species of a monoclonal antibody using weak cation exchange chromatography and LC-MS. Anal Chem, 2015. 87(17): p. 9084-92. 48. Du Y., Walsh A., Ehrick R., Xu W., May K. and Liu H. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs, 2012. 4(5): p. 578-85. 49. Khawli L.A., Goswami S., Hutchinson R., Kwong Z.W., Yang J., Wang X., Yao Z., Sreedhara A., Cano T., Tesar D., Nijem I., Allison D.E., Wong P.Y., Kao Y.H., Quan C., Joshi A., Harris R.J. and Motchnik P. Charge variants in IgG1: Isolation, characterization, in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. MAbs, 2010. 2(6): p. 613-24. 50. Sethuraman N. and Stadheim T.A. Challenges in therapeutic glycoprotein production. Curr Opin Biotechnol, 2006. 17(4): p. 341-6. 51. Medzihradszky K.F. Characterization of site-specific N-glycosylation. Methods Mol Biol, 2008. 446: p. 293-316. 52. Reusch D. and Tejada M.L. Fc glycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes. Glycobiology, 2015. 25(12): p. 1325-34. 53. Harris R.J., Kabakoff B., Macchi F.D., Shen F.J., Kwong M., Andya J.D., Shire S.J., Bjork N., Totpal K. and Chen A.B. Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2001. 752(2): p. 233-45. 54. Vlasak J., Bussat M.C., Wang S., Wagner-Rousset E., Schaefer M., Klinguer-Hamour C., Kirchmeier M., Corvaia N., Ionescu R. and Beck A. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody. Anal Biochem, 2009. 392(2): p. 145-54. 55. Yu L., Vizel A., Huff M.B., Young M., Remmele R.L., Jr. and He B. Investigation of N-terminal glutamate cyclization of recombinant monoclonal antibody in formulation development. J Pharm Biomed Anal, 2006. 42(4): p. 455-63. 56. Di Girolamo F., Lante I., Muraca M. and Putignani L. The Role of Mass Spectrometry in the "Omics" Era. Curr Org Chem, 2013. 17(23): p. 2891-2905. 57. Hjernø K. and Jensen O.N., MALDI-MS in Protein Chemistry and Proteomics, in MALDI MS. 2007, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. p. 83-108. 58. Peri S., Steen H. and Pandey A. GPMAW--a software tool for analyzing proteins and peptides. Trends Biochem Sci, 2001. 26(11): p. 687-9. 59. Strohalm M., Kavan D., Novak P., Volny M. and Havlicek V. mMass 3: a crossplatform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem, 2010. 82(11): p. 4648-51. 70 Referencias 60. Kukacka Z., Rosulek M., Strohalm M., Kavan D. and Novak P. Mapping protein structural changes by quantitative cross-linking. Methods, 2015. 89: p. 112-20. 61. Gattiker A., Bienvenut W.V., Bairoch A. and Gasteiger E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics, 2002. 2(10): p. 1435-44. 62. Cooper C.A., Gasteiger E. and Packer N.H. GlycoMod--a software tool for determining glycosylation compositions from mass spectrometric data. Proteomics, 2001. 1(2): p. 340-9. 63. Schiestl M., Stangler T., Torella C., Cepeljnik T., Toll H. and Grau R. Acceptable changes in quality attributes of glycosylated biopharmaceuticals. Nat Biotechnol, 2011. 29(4): p. 310-2. 64. Tebbey P.W., Varga A., Naill M., Clewell J. and Venema J. Consistency of quality attributes for the glycosylated monoclonal antibody Humira(R) (adalimumab). MAbs, 2015. 7(5): p. 805-11. 65. Halim L.A., Brinks V., Jiskoot W., Romeijn S., Haselberg R., Burns C., Wadhwa M. and Schellekens H. Quality and Batch-to-Batch Consistency of Original and Biosimilar Epoetin Products. J Pharm Sci, 2016. 105(2): p. 542-50. 66. Aebersold R. and Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 2003. 422(6928): p. 198-207. 67. Vestal M. and Hayden K. High performance MALDI-TOF mass spectrometry for proteomics. International Journal of Mass Spectrometry, 2007. 268(2–3): p. 83-92. 68. Vestal M. and Juhasz P. Resolution and mass accuracy in matrix-assisted laser desorption ionization- time-of-flight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 1998. 9(9): p. 892-911. 69. Trevisiol S., Ayoub D., Lesur A., Ancheva L., Gallien S. and Domon B. The use of proteases complementary to trypsin to probe isoforms and modifications. Proteomics, 2016. 16(5): p. 715-28. 70. Fang P., Liu M., Xue Y., Yao J., Zhang Y., Shen H. and Yang P. Controlling nonspecific trypsin cleavages in LC-MS/MS-based shotgun proteomics using optimized experimental conditions. Analyst, 2015. 140(22): p. 7613-21. 71. Tsiatsiani L. and Heck A.J. Proteomics beyond trypsin. FEBS J, 2015. 282(14): p. 2612-26. 72. Slechtova T., Gilar M., Kalikova K. and Tesarova E. Insight into Trypsin Miscleavage: Comparison of Kinetic Constants of Problematic Peptide Sequences. Anal Chem, 2015. 87(15): p. 7636-43. 71 Referencias 73. Siepen J.A., Keevil E.J., Knight D. and Hubbard S.J. Prediction of missed cleavage sites in tryptic peptides aids protein identification in proteomics. J Proteome Res, 2007. 6(1): p. 399-408. 74. Krause E., Wenschuh H. and Jungblut P.R. The dominance of arginine-containing peptides in MALDI-derived tryptic mass fingerprints of proteins. Anal Chem, 1999. 71(19): p. 4160-5. 75. Harrison A.G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews, 1997. 16(4): p. 201-217. 76. Bleiholder C., Suhai S. and Paizs B. Revising the proton affinity scale of the naturally occurring alpha-amino acids. J Am Soc Mass Spectrom, 2006. 17(9): p. 1275-81. 77. Annesley T.M. Ion suppression in mass spectrometry. Clin Chem, 2003. 49(7): p. 1041-4. 78. Krutchinsky A.N. and Chait B.T. On the nature of the chemical noise in MALDI mass spectra. J Am Soc Mass Spectrom, 2002. 13(2): p. 129-34. 79. Jung S.K., Lee K.H., Jeon J.W., Lee J.W., Kwon B.O., Kim Y.J., Bae J.S., Kim D.I., Lee S.Y. and Chang S.J. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs, 2014. 6(5): p. 1163-77. 80. Chen S.L., Wu S.L., Huang L.J., Huang J.B. and Chen S.H. A global comparability approach for biosimilar monoclonal antibodies using LC-tandem MS based proteomics. J Pharm Biomed Anal, 2013. 80: p. 126-35. 81. Nakazawa T., Yamaguchi M., Okamura T.A., Ando E., Nishimura O. and Tsunasawa S. Terminal proteomics: N- and C-terminal analyses for high-fidelity identification of proteins using MS. Proteomics, 2008. 8(4): p. 673-85. 82. Dick L.W., Jr., Kim C., Qiu D. and Cheng K.C. Determination of the origin of the Nterminal pyro-glutamate variation in monoclonal antibodies using model peptides. Biotechnol Bioeng, 2007. 97(3): p. 544-53. 83. van den Bremer E.T., Beurskens F.J., Voorhorst M., Engelberts P.J., de Jong R.N., van der Boom B.G., Cook E.M., Lindorfer M.A., Taylor R.P., van Berkel P.H. and Parren P.W. Human IgG is produced in a pro-form that requires clipping of Cterminal lysines for maximal complement activation. MAbs, 2015. 7(4): p. 672-80. 84. Antes B., Amon S., Rizzi A., Wiederkum S., Kainer M., Szolar O., Fido M., Kircheis R. and Nechansky A. Analysis of lysine clipping of a humanized Lewis-Y specific IgG antibody and its relation to Fc-mediated effector function. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007. 852(1-2): p. 250-6. 85. Dick L.W., Jr., Qiu D., Mahon D., Adamo M. and Cheng K.C. C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies: investigation of test methods and possible causes. Biotechnol Bioeng, 2008. 100(6): p. 1132-43. 72 Referencias 86. Zheng K., Bantog C. and Bayer R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs, 2011. 3(6): p. 568-76. 87. Harvey D.J. Analysis of carbohydrates and glycoconjugates by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: An update covering the period 1999-2000. Mass Spectrom Rev, 2006. 25(4): p. 595-662. 88. Beck A., Debaene F., Diemer H., Wagner-Rousset E., Colas O., Dorsselaer A.V. and Cianférani S. Cutting-edge mass spectrometry characterization of originator, biosimilar and biobetter antibodies. Journal of Mass Spectrometry, 2015. 50(2): p. 285-297. 89. Reusch D., Haberger M., Maier B., Maier M., Kloseck R., Zimmermann B., Hook M., Szabo Z., Tep S., Wegstein J., Alt N., Bulau P. and Wuhrer M. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-part 1: separation-based methods. MAbs, 2015. 7(1): p. 167-79. 90. Gornik O., Pavic T. and Lauc G. Alternative glycosylation modulates function of IgG and other proteins - implications on evolution and disease. Biochim Biophys Acta, 2012. 1820(9): p. 1318-26. 91. Hamm M., Wang Y. and Rustandi R.R. Characterization of N-Linked Glycosylation in a Monoclonal Antibody Produced in NS0 Cells Using Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Pharmaceuticals (Basel), 2013. 6(3): p. 393-406. 92. Kozak R.P., Tortosa C.B., Fernandes D.L. and Spencer D.I. Comparison of procainamide and 2-aminobenzamide labeling for profiling and identification of glycans by liquid chromatography with fluorescence detection coupled to electrospray ionization-mass spectrometry. Anal Biochem, 2015. 486: p. 38-40. 93. Ruhaak L.R., Zauner G., Huhn C., Bruggink C., Deelder A.M. and Wuhrer M. Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010. 397(8): p. 3457-3481. 94. Pabst M., Kolarich D., Poltl G., Dalik T., Lubec G., Hofinger A. and Altmann F. Comparison of fluorescent labels for oligosaccharides and introduction of a new postlabeling purification method. Anal Biochem, 2009. 384(2): p. 263-73. 95. Nie H., Li Y. and Sun X.L. Recent advances in sialic acid-focused glycomics. J Proteomics, 2012. 75(11): p. 3098-112. 96. Alley W.R., Jr. and Novotny M.V. Structural glycomic analyses at high sensitivity: a decade of progress. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif), 2013. 6: p. 237-65. 97. Li H., Zhao X., Zhang Q., Feng X., Liu B.F. and Liu X. Solid-phase methylamidation for sialoglycomics by MALDI-MS. Anal Bioanal Chem, 2014. 406(25): p. 6235-46. 73 Referencias 98. Bongers J., Devincentis J., Fu J., Huang P., Kirkley D.H., Leister K., Liu P., Ludwig R., Rumney K., Tao L., Wu W. and Russell R.J. Characterization of glycosylation sites for a recombinant IgG1 monoclonal antibody and a CTLA4-Ig fusion protein by liquid chromatography-mass spectrometry peptide mapping. J Chromatogr A, 2011. 1218(45): p. 8140-9. 74 Anexos ANEXOS ANEXO 1: Espectros de la primera elución de la extracción en fase sólida de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 2: Espectros de la segunda elución de la extracción en fase sólida de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 3: Resultados de digestión con tripsina de los lotes glicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 4: Resultados de la digestión con Tripsina de los lotes glicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 5: Resultados de la digestión con Tripsina de los lotes desglicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 6: Resultados de la digestión con Tripsina de los lotes desglicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 7: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes glicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 8: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes glicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 9: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes desglicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 10: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes desglicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. ANEXO 11: Espectros de los glicopéptidos de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba) Nota1: En las tablas N/D significa: no determinado, Inc: incertidumbre. Nota2: Las incertidumbres de los péptidos deamidados y desglicosilados fueron determinadas tomando como valor teórico el péptido desplazado 1 Da con respecto a su valor real, debido al desplazamiento en la señal que ocasionan dichas modificaciones. 75 Anexos Anexo 1: Espectros de la primera elución (E1) de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba) Anexos Anexo 2: Espectros de la segunda elución (E2) de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba) Anexos Anexo 3: Resultados de digestión con tripsina de los lotes glicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med. (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med. (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 HT01 HT03 HT04 HT05 HT09 HT10 HT11 HT12 HT15-HT16 HT17 HT20 HT21 HT22 HT25 HT30 HT33 HT34 HT35 HT36 [1-19] [24-38] [39-59] [60-63] [75-85] [86-98] [99-123] [124-151] [217-221] [222-246] [267-290] [291-299] [300-315] [321-332] [354-358] [391-407] [408-412] 413-437] [438-445] 1950,06 1779,83 2401,19 553,26 1230,58 1518,69 2973.28 2860,46 612,42 2922,40 2845,31 1157,52 1853,92 1243,67 606,29 1965,89 601,37 2905,31 812,43 1949,98 1779,87 2401,22 N/D N/D 1518,69 2973,26 2860,27 N/D 2922,47 2845,28 N/D 1853,88 1243,61 N/D 1965,89 N/D 2905,34 N/D 0,08 0,04 0,03 N/D N/D 0,00 0,02 0,19 N/D 0,07 0,03 N/D 0,04 0,06 N/D 0,00 N/D 0,03 N/D 1950,07 1779,85 2401,17 553,31 N/D 1518,72 2973,32 2861,26 612,34 2922,44 2845,21 1157,41 1853,90 1243,60 606,30 1965,97 601,37 2905,32 812,21 0,01 0,02 0,02 0,05 N/D 0,03 0,04 0,20 0,08 0,04 0,10 0,11 0,02 0,07 0,01 0,08 0,00 0,01 0,22 1950,11 1779,85 2401,16 553,30 1230,59 1518,73 2973,28 2861,34 612,36 2922,47 2845,23 1157,43 1853,88 1243,60 N/D 1965,89 N/D 2905,33 812,32 0,05 0,02 0,03 0,04 0,01 0,04 0,00 0,20 0,06 0,07 0.08 0,09 0,04 0,07 N/D 0,00 N/D 0,02 0,11 1950,06 1779,85 2401,18 553,28 N/D 1518,69 2973,33 2861,54 N/D 2922,48 2845,27 N/D 1853,88 1243,62 606,27 1965,86 601,27 2905,33 812,36 0,00 0,02 0,01 0,02 N/D 004 0,05 0,08 N/D 0,08 0,04 N/D 0,04 0,05 0,02 0,03 0,10 0,02 0,07 1950,05 1779,83 2401,19 553,27 1230,46 1518,77 2973,28 2861,52 612,35 2922,40 2845,23 1157,51 1853,91 1243,65 606,21 1965,97 601,31 2905,37 812,31 0,01 0,00 0,00 0,01 0,12 0,08 0,00 0,06 0,07 0,00 0,08 0,01 0,01 0,02 0,08 0,08 0,06 0,06 0,12 Anexos Anexo 4: Resultados de la digestión con Tripsina de los lotes glicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 LT01 LT02 LT03 LT04 LT05 LT07-LT08 LT08-LT09 LT09 LT10 LT12 LT13 LT15 LT16 LT17 LT18 [1-18] [19-24] [25-45] [46-53] [54-61] [104-108] [108-142] [109-142] [143-147] [150-155] [156-169] [184-188] [189-199] [200-207] [208-211] 1910,91 735,38 2455,19 1028,58 852,47 632,37 3727,84 3571,74 588,34 676,33 1591,73 711,29 1347,57 832,48 523,26 1910,84 735,39 2455,15 1028,59 852,46 N/D 3727,80 3571,81 588,31 676,33 N/D 711,29 1347,58 832,60 523,26 0,07 0,01 0,04 0,01 0,01 N/D 0,04 0,07 0,03 0,00 N/D 0,00 0,01 0,12 0,00 1910,83 735,41 2455,20 1028,58 852,46 632,33 3727,81 3571,80 588,37 676,34 1593,91 711,30 1347,60 832,47 523,25 0,08 0,03 0,01 0,00 0,01 0,04 0,03 0,06 0,03 0,01 0,18 0,01 0,03 0,01 0,01 1910,91 734,34 2455,22 1028,58 852,50 N/D 3727,82 3571,80 588,27 676,34 N/D 711,32 1347,57 N/D 523,26 0,00 0,04 0,03 0,00 0,03 N/D 0,02 0,06 0,07 0,01 N/D 0,03 0,00 N/D 0,00 1911,01 735,43 2455,22 1028,60 852,48 632,33 3727,80 N/D 588,31 676,34 1593,93 711,30 1347,58 832,44 523,27 0,10 0,05 0,03 0,02 0,01 0,04 0,04 N/D 0,03 0,01 0,20 0,01 0,01 0,04 0,01 1911,01 735,42 2455,29 1028,58 852,47 632,35 3727,86 N/D 588,32 676,33 1593,82 711,32 1347,57 N/D 523,26 0,10 0,04 0,10 0,00 0,00 0,02 0,02 N/D 0,02 0,00 0,09 0,03 0,00 N/D 0,00 Anexos Anexo 5: Resultados de la digestión con Tripsina de los lotes desglicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido HT01 HT03 HT04 HT09 HT10 HT11 HT12 HT15-HT16 HT18 HT20 HT21 HT22 HT25 HT33 DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 [1-19] [24-38] [39-59] [75-85] [86-98] [99-123] [124-151] [217-221] [247-256] [267-290] [291-299] [300-315] [321-332] [391-407] 1950,06 1779,83 2401,19 1230,58 1518,69 2973,28 2860,46 612,42 1100,66 2845,31 1157,52 1853,92 1243,67 1965,89 1950,06 1779,83 2401,16 1230,58 1518,69 2973,28 N/D 612,38 1100,57 2845,30 1158,51 1853,84 1243,65 1965,87 0,00 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00 N/D 0,04 0,09 0,01 0,01 0,08 0,02 0,02 1950,13 1779,87 2401,20 1230,66 1518,75 2973,51 2861,67 612,38 1100,67 2845,27 1158,41 1853,83 1243,61 1965,86 0,07 0,04 0,01 0,08 0,06 0,23 0,21 0,04 0,01 0,04 0,11 0,09 0,06 0,03 N/D 1779,82 2401,20 1230,64 1518,73 2973,54 N/D N/D 1100,62 2845,20 1158,44 1853,91 1243,64 1965,89 N/D 0,01 0,01 0,06 0,04 0,26 N/D N/D 0,04 0,11 0,08 0,01 0,03 0,00 N/D 1779,85 2401,20 1230,58 1518,69 2973,51 2861,51 N/D 1100,64 2845,24 1158,37 1853,81 1243,68 1965,87 N/D 0,02 0,01 0,00 0,00 0,23 0,05 N/D 0,02 0,07 0,15 0,11 0,01 0,02 N/D 1779,82 2401,22 1230,74 1518,77 2973,51 N/D N/D 1100,60 2845,33 1158,56 1853,93 1243,65 1965,89 N/D 0,01 0,03 0,16 0,08 0,23 N/D N/D 0,06 0,02 0,04 0,01 0,02 0,00 Anexos Anexo 6: Resultados de la digestión con Tripsina de los lotes desglicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) T,A2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 LT01 LT02 LT03 LT04 LT05 LT08-LT09 LT09 LT12 LT15 LT16 [1-18] [19-24] [25-45] [46-53] [54-61] [108-142] [109-142] [150-155] [184-188] [189-199] 1910,91 735,38 2455,19 1028,58 852,47 3727,84 3571,74 676,33 711,29 1347,57 1910,90 735,38 2455,19 1028,60 852,53 3727,85 3561,66 676,39 711,25 1347,57 0,01 0,00 0,00 0,02 0,06 0,01 0,08 0,06 0,04 0,00 1910,94 735,39 2455,19 1028,58 852,44 3727,63 3571,68 676,30 711,32 1347,56 0,03 0,01 0,00 0,00 0,03 0,21 0,06 0,03 0,03 0,01 1911,00 735,43 2455,20 1028,54 852,45 3727,84 N/D N/D 711,26 1347,58 0,09 0,05 0,01 0,04 0.02 0,00 N/D N/D 0,03 0,01 1911,01 735,37 2455,18 1028,58 852,45 3727,81 3571,79 676,32 711,32 1347,57 0,10 0,01 0,01 0,00 0,02 0,03 0,05 0,01 0,03 0,00 1910,97 735,40 2455,19 1028,56 852,50 3727,88 N/D N/D 711,29 1347,54 0,06 0,02 0,00 0,02 0,03 0,04 N/D N/D 0,00 0,03 Anexos Anexo 7: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes glicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc. (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 HL013-HL14 HL14 HL21 HL25 HL29 HL31 [217-226] [218-226] [319-332] [343-353] [391-407] [413-437] 1232,62 1104,53 1559,80 1210,68 1965,89 2905,31 1232,69 1104,43 1559,69 1210,60 1965,89 2905,17 0,07 0,10 0,11 0,08 0,00 0,14 1232,71 1104,51 1559,79 1210,61 1965,89 2905,43 0,09 0,02 0,01 0,07 0,00 0,12 1232,73 1104,49 1559,78 1210,62 1965,86 N/D 0,11 0,04 0,02 0,06 0,03 N/D 1232,72 1104,48 1559,75 1210,70 1965,87 N/D 0,10 0,05 0,05 0,02 0,02 N/D 1232,67 1104,56 1559,78 1210,64 1965,89 N/D 0,05 0,03 0,02 0,04 0,00 N/D Anexo 8: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes glicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc. (m/z) LAM MH+Med. (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 LL05 LL08 LL10 LL11 LL12 [108-142] [150-169] [184-199] [200-207] [208-214] 3727,84 2249,04 2039,85 832,48 926,38 3727,80 2249,99 2039,85 N/D 926,37 0,04 0,05 0,00 N/D 0,01 3727,84 2249,84 2039,85 832,31 926,39 0,00 0,20 0,00 0,17 0,01 3727,84 2250,18 2039,86 N/D 926,39 0,00 0,14 0,01 N/D 0,01 N/D N/D 2039,85 N/D 926,26 N/D N/D 0,00 N/D 0,12 N/D N/D 2039,86 832,28 926,38 N/D N/D 0,01 0,20 0,00 Anexos Anexo 9: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes desglicosilados para la cadena pesada de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med. (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 HL10 HL013-HL14 HL14-HL15 HL14 HL15 HL15-HL16 HL17 HL18 HL21 HL25 HL29 [124-151] [217-226] [218-244] [218-226] [227-244] [227-246] [247-256] [257-266] [319-332] [343-353] [391-407] 2860,46 1232,62 3162,57 1104,53 2077,05 2302,20 1100,66 1119,61 1559,80 1210,68 1965,89 N/D 1232,60 N/D 1104,56 N/D 2302,02 1100,66 N/D 1559,72 1210,68 1965,87 N/D 0,02 N/D 0,03 N/D 0,18 0,00 N/D 0,08 0,00 0,02 2861,45 1232,67 N/D 1104,54 N/D 2302,40 1100,63 1119,42 1559,83 1210,69 1965,84 0,01 0,05 N/D 0,01 N/D 0,20 0,03 0,19 0,03 0,01 0,05 2861,43 1232,64 3162,56 1104,58 2077,03 2302,26 1100,63 1119,53 1559,80 1210,66 1965,83 0,03 0,02 0,01 0,05 0,02 0,06 0,03 0,08 0,00 0,02 0,06 2861,38 1232,69 3162,41 1104,47 2077,03 2302,22 1100,65 1119,63 1559,79 1210,66 1965,92 0,08 0,07 0,16 0,06 0,02 0,02 0,01 0,02 0,01 0,02 0,03 2861,38 1232,63 3162,56 1104,53 2077,05 2302,23 1100,66 N/D 1559,94 1210,64 1965,85 0,08 0,01 0,01 0,00 0,00 0,03 0,00 N/D 0,14 0,04 0,04 Anexo 10: Resultados de la digestión con Lys-C de los lotes desglicosilados para la cadena ligera de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4. Se muestran los péptidos de 500-4000 m/z que se mapearon No. de péptido DesdeHasta MH+Teor (m/z) MH+Med (m/z) LAM Inc (m/z) LAM MH+Med (m/z) TA1 Inc (m/z) TA1 MH+Med (m/z) TA2 Inc (m/z) TA2 MH+Med (m/z) TA3 Inc (m/z) TA3 MH+Med. (m/z) TA4 Inc (m/z) TA4 LL05 LL07-LL08 LL08 LL10 LL12 [108-142] [148-169] [150-169] [184-199] [208-214] 3727,84 2563,22 2249,04 2039,85 926,38 N/D 2563,93 2249,90 2039,85 926,38 N/D 0,29 0,14 0,00 0,00 3727,84 2564,19 2249,98 2039,84 926,37 0,00 0,03 0,06 0,01 0,01 3727,84 2564,23 2250,13 2039,85 926,41 0,00 0,01 0,09 0,00 0,03 3727,66 N/D 2250,23 2039,85 926,40 0,18 N/D 0,19 0,00 0,02 3727,83 2564,26 2250,13 2039,85 926,29 0,01 0,04 0,09 0,00 0,09 Anexos Anexo 11: Espectros de los glicopéptidos de los AcMs: 1E10 LAM, 1E10 TA1, 1E10 TA2, 1E10 TA3 y 1E10 TA4 (de abajo hacia arriba)
