La pasteurización como medida de control de las

Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
La pasteurización como medida de control de las
enfermedades causadas por micobacterias en
los sistemas de crianza de producción lechera
Nielsen Laura Mariela; Medina Luis Felipe; Traversa María Julia
Tandil, agosto 2016
La pasteurización como medida de control de las
enfermedades causadas por micobacterias en los sistemas de
crianza de producción lechera
Tesina de la Orientación Producción Bovinos de Leche, presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Laura
Mariela Nielsen.
Tutor: M. V. Medina Luis Felipe
Directora: Dra. Traversa María Julia
Evaluador: Dra. María Fernanda Vega
Agradecimientos
A María Julia Traversa y María Fernanda Vega
A Luis Medina y Santiago Piagentini
A Alejandra Díaz e Inés Rivas
A mi familia
A Camilo y su familia
A mis compañeros y amigos, especialmente Valeria Pérez, Belén Acosta,
Lucas Palacio, Gastón Arregui, Juan Manuel Herrera, Rocío Orellano y Julia
Brea
Dedicatoria
En memoria de Papá
Resumen
En los bovinos existen dos enfermedades infectocontagiosas de gran
importancia económica y sanitaria para los establecimientos de producción
láctea a nivel mundial causadas por micobacterias, la tuberculosis (TBC) y la
paratuberculosis (PTBC) causadas por Mycobacterium bovis y por M. avium
subespecie paratuberculosis, respectivamente. Los agentes causales de estas
dos enfermedades comparten la vía de transmisión digestiva y ambos
presentan gran resistencia en el medio ambiente. Los objetivos de esta tesina
son revisar la bibliografía concerniente a la respuesta al tratamiento térmico de
estas micobacterias y efectuar recomendaciones para la implementación del
proceso de pasteurización de la leche en los sistemas de crianza de tambo.
Los datos concernientes al comportamiento térmico del género Mycobacterium
se presentan ordenados de manera cronológica en una matriz de datos. A
partir de la revisión se concluyó que la pasteurización es un proceso eficaz
para evitar la transmisión de la tuberculosis bovina por la vía digestiva a los
terneros y logra reducir la dosis infectiva del agente causal de la
paratuberculosis bovina.
Palabras clave: micobacterias,
pasteurización, terneros.
tuberculosis,
paratuberculosis,
leche,
Índice
1. Introducción .............................................................................................................................1
2. Metodología .............................................................................................................................4
3. Resultados ................................................................................................................................6
3.1. Excreción de micobacterias en productos biológicos ........................................................9
3.1.1. Excreción de Mycobacterium bovis en leche ..............................................................9
3.1.2. Excreción de Map en leche y materia fecal ..............................................................10
3.2. Resistencia térmica de los microorganismos del género Mycobacterium en leche ........11
3.2.1. Valor D ......................................................................................................................13
3.2.2. Cinética de inactivación bajo condiciones de laboratorio ........................................14
3.2.3. Estudios de inactivación bajo pasteurización comercial ...........................................17
3.2.4. Pasteurización de la leche destinada a la alimentación de terneros ........................18
3.3. Recomendaciones para la implementación de la pasteurización en rodeos lecheros .....20
3.3.1. Requerimientos de instalación .................................................................................20
3.3.2. Consideraciones para el uso diario ...........................................................................21
3.3.3. Manejo de la leche previo y posterior a la pasteurización .......................................21
3.3.4. Opciones disponibles en el mercado ........................................................................21
3.3.5. Consideraciones al pasteurizar calostro ...................................................................22
3.4. Modificaciones a la pasteurización y estrategias que la complementan .........................23
3.4.1. Modificaciones a la pasteurización ...........................................................................23
3.4.2. Homogeneizado .......................................................................................................24
3.4.3. Bactofugación y microfiltrado ..................................................................................24
4. Conclusiones ..........................................................................................................................25
5. Bibliografía .............................................................................................................................26
1. Introducción
En los bovinos existen dos enfermedades causadas por micobacterias, la
tuberculosis (TBC) y la paratuberculosis (PTBC). La primera es una
enfermedad
infecciosa
crónica
causada
por
Mycobacterium
bovis
y
caracterizada por la presentación de granulomas típicos en diversos órganos.
Puede afectar a otras especies domésticas y silvestres, incluido el hombre. La
segunda es también una enfermedad crónica producida por M. avium subsp.
paratuberculosis (Map), que afecta a bovinos, ovinos y caprinos. Se caracteriza
por la presentación de inflamación granulomatosa difusa de la mucosa
intestinal lo que conlleva a la diarrea crónica y adelgazamiento progresivo en
todas las especies afectadas (Blood y Radostits, 1992). Es considerada una
enfermedad con potencial zoonótico ya que se la asocia a la enfermedad de
Crohn en los humanos (EC) (Chiodini et al., 2012).
Ambas enfermedades presentan una distribución mundial (Figuras 1 y 2). La
prevalencia más elevada de tuberculosis se registra en gran parte de África y
ciertas partes de Asia y América. Muchos países desarrollados han reducido o
eliminado la TBC del ganado vacuno a través de planes de control y
erradicación de la enfermedad. Sin embargo, en la fauna salvaje de Canadá, el
Reino Unido, los Estados Unidos y Nueva Zelanda subsisten importantes
fuentes de infección. Por su parte la presencia de PTBC en países de Europa,
Estados Unidos y Australia ha motivado la implementación de planes de control
de la enfermedad (Paolicchi y Romano, 2003, OIE, 2014).
En nuestro país la prevalencia de infección de TBC se estima que oscila entre
un 2% y un 4% (Torres, 2011), mientras que la información disponible de PTBC
se limita a la provincia de Buenos Aires en rodeos de cría de la Cuenca del
Salado con seroprevalencias de entre el 7,2% y el 19,6% (Paolicchi y Romano,
2003).
1
Figura 1. Distribución mundial de tuberculosis bovina para el primer semestre
del año 2014. Fuente: OIE, 2014 http://www.oie.int/es/
Figura 2. Distribución mundial de paratuberculosis para el primer semestre del
año 2014. Fuente: OIE, 2014 http://www.oie.int/es/
Ambas enfermedades ocasionan pérdidas en los sistemas de producción
animal. Se calcula que las debidas a TBC en Argentina, estarían en los 63
millones de dólares estadounidenses al año, siendo el principal componente la
pérdida de peso en los bovinos (36%), las pérdidas en producción de leche
(13%) y el decomiso en frigoríficos y mataderos (10%) (Torres, 2009). En el
caso de PTBC se estima que durante el año 2001 se produjeron pérdidas
2
aproximadas de 6,3 y 22 millones de dólares estadounidenses en las cuencas
lecheras de la provincia de Buenos Aires y en la Cuenca del Río Salado
respectivamente, siendo la merma en la producción del 19% (Paolicchi, 2007).
Más allá de las pérdidas económicas existen implicancias en salud pública ya
que la TBC es una zoonosis presente en Argentina. Según datos del Instituto
Nacional de Enfermedades Respiratorias entre los años 1988 y 2006 se
confirmaron 2485 casos pulmonares de tuberculosis, el porcentaje de los
debidos a M. bovis fue 2,7% entre 1988 y 1993, 1,7% entre 1994 y 1999 y 1,3%
entre 2000 y 2006 (de Kantor et al., 2008). Con respecto al agente causal de la
PTBC implicado como potencial agente etiológico de la EC, se cree que se
transmitiría al humano a través de la leche ya que existen evidencias de que
Map sobrevive al proceso de pasteurización y es posible cultivarlo a partir de
muestras de leche comercializable (Cirone et al., 2007).
Los agentes causales de estas dos enfermedades comparten la vía de
transmisión digestiva siendo la principal en el caso de Map y segunda en orden
de importancia, después de la respiratoria, para M. bovis. Las vacas infectadas
pueden excretar ambos bacilos en la leche y de esta forma transmitirlos a las
categorías más jóvenes. Según Traversa y Jorge (2006), el diseño de un
programa de saneamiento debe estar compuesto por la interrelación de
medidas sanitarias y de manejo destinada a impedir la transmisión de la
infección y no quedar sujeto al éxito de una sola medida sanitaria. Por lo tanto,
impedir la transmisión a las categorías más jóvenes es fundamental para lograr
una reposición sana que permita al productor reemplazar los animales
infectados eliminados y evitar la compra de vaquillonas con el riesgo sanitario
que esto implica (Garro et al., 2010). La pasteurización de la leche es una
medida sanitaria que ha sido utilizada para proveer a los terneros alimento
seguro. Por tal motivo los objetivos de esta tesina son realizar una revisión
bibliográfica concerniente a la respuesta al tratamiento térmico de las
micobacterias y efectuar recomendaciones para la implementación del proceso
de pasteurización en los sistemas de crianza de tambo.
3
2. Metodología
El inicio de esta revisión bibliográfica fue la lectura de dos artículos
denominados “Thermal inactivation of several Mycobacterium spp. in milk by
pasteurization” y “Factores de riesgo de tuberculosis bovina en rodeos lecheros
de las provincias de Córdoba y Santa Fe” publicados en Irlanda y Argentina en
los años 1996 y 2010, respectivamente. A partir de ahí se valoraron las citas
bibliográficas de ambos artículos y resultaron de relevancia los autores
Hermon-Taylor y Chiodini quienes poseen un índice h de citas por autor en el
buscador científico Scopus de 34 y 25, respectivamente. Otros autores
revisados como Pavlas, M. y Stumbo C. R. con respectivos índices h de 4 y 3
no fueron seleccionados. Para avanzar cronológicamente en la búsqueda se
consultaron artículos que citaban a estos autores hasta el año 2014. La
búsqueda además se enriqueció con el buscador Google académico en el cual
se buscaron en idioma castellano las palabras clave “pasteurización”, “leche”,
“terneros” y “Mycobacterium”.
Los criterios para la selección de los artículos estuvieron basados en:

Idioma. Se seleccionaron aquellos artículos escritos en español o inglés.

Fuente. Se seleccionaron artículos procedentes de universidades,
instituciones gubernamentales y revistas indexadas.

Lectura de título, resumen, autores y fecha para valorar relevancia en
esta revisión.
Finalmente,
fueron
16
los
artículos
referidos
a
resistencia
térmica
micobacteriana incluidos para su evaluación (Figura 3) y complementados con
32 artículos relacionados.
4
“Factores de riesgo de
tuberculosis bovina en
rodeos lecheros de las
provincias de Córdoba y
Santa Fe”, Garro et al.,
2010. Argentina
“Thermal inactivation of
several Mycobacterium
spp. in milk by
pasteurization”, Grant et
al., 1996. Irlanda
Referencias
bibliográficas
Surge relevancia
Chiodini y HermonTaylor
Google académico
Criterios de selección:
Palabras clave:
“pasteurización”,
“leche”, “terneros”,
“Mycobacterium”

Idioma

Fuente

Valoración del autor

Valoración del título

Valoración del resumen
Trabajos que los citan
Límite temporal:
año 2014
Figura 3. Diagrama de flujo que muestra la estrategia de la búsqueda
bibliográfica.
5
3. Resultados
Los datos concernientes al comportamiento térmico del género Mycobacterium
en la leche se presentan ordenados de manera cronológica en la siguiente
matriz de datos de la bibliografía consultada (Tabla 1).
Tabla 1. Matriz de datos
Referencia
Chiodini y
HermonTaylor,
1993.
Reino
Unido
Inóculo
Mycobacterium spp. y
Temp. Particularidades
inicial
Tiempo
respuesta a
(ºC)
del ensayo
(UFC/mL)
pasteurización
M. bovis sensible
100%.
Map
sobrevive 5-9%,
30´
63
En laboratorio.
equivale a 500-900
Inmersión en
UFC/mL (reducción de
baño de agua.
2 log10)
Leche cruda
10 4
Tubo de ensayo,
M. bovis sensible
vol.: 10mL.
100%.
Map
Agitación durante
sobrevive 3-5%,
proceso
15"
72
equivale 300-500
UFC/mL (reducción de
2 log10)
Sustrato
Grant et
al., 1996a.
Leche cruda
Irlanda del
Norte
10 7
30´
63,5
30´
63,5
15"
71,7
10 4
Grant et
al., 1996b.
Leche cruda
Irlanda del
Norte
30´
63,5
15"
71,7
10 7
En laboratorio.
Inmersión en
baño de agua.
Tubo de ensayo,
vol.: 5 mL.
Sin agitar
durante proceso
M. bovis y M. fortuitum
sensibles 100%.
M. avium, M.
intracellulare y M.
kansasii sobreviven 10
UFC/mL (reducción de
6 log10)
M. bovis sensible
100%. Map sobrevive <
1% en el 50% de las
En laboratorio.
muestras,
equivale a
Inmersión en
menos
de
100
UFC/mL
baño de agua.
(reducción
>
2
log10)
Tubo de ensayo,
vol.: 5mL.
Map sobrevive <1% en
Sin agitar
el 55% de las
durante proceso
muestras, equivale a
En laboratorio.
Inmersión en
baño de agua.
Unidad
pasteurizadora
HTST a escala,
vol.: 250mL.
Sin agitar
durante proceso
menos de 100 UFC/mL
(reducción > 2 log10)
M. bovis sensible
100%. Map sobrevive
<1% en el 96% de las
muestras, equivale a
menos de 100.000
UFC/mL (reducción > 2
log10)
Map sobrevive <1% en
el 85% de las
muestras, equivale a
menos de 100.000
UFC/mL (reducción > 2
log10)
6
Millar et
al., 1996.
Reino
Unido
Muestreo
semanal de
leche
pasteurizada
comercializada
en Inglaterra y
Gales, durante
18 meses.
Sometida a PCR
Leche
pasteurizada
de
supermercado
10 8
Stabel et
al., 1997.
EE.UU.
Leche cruda
10 4-6
Sung et
al., 1998.
EE.UU.
Leche cruda
10 6
Stabel,
2001.
EE.UU.
Leche cruda
10 3
Pearce et
al., 2001.
Nueva
Zelanda
30´
Leche cruda
10
3
15"
Map presente en el 7%
de las muestras, con
picos de detección en
ene-mar y sep-nov
Map bovina y humana.
En laboratorio.
A 65ºC, 5´: sobrevive
Inmersión en
3
10
UFC/mL (reducción
baño de agua.
de 5 log10).
Tubo de ensayo,
A 72ºC, 1´: sobrevive
65vol.: 5mL.
104 UFC/mL (reducción
72Sin agitar
de 4 log10).
74-76
durante
No
se inactiva
proceso.
totalmente
luego de 30´.
Sonicado para
No
se
obtienen
ventajas
romper
en
la
reducción
a 74 y
agrupamientos
76ºC
5560657072-75
Pasteurizador
comercial a
escala, vol.: 12L. Leche fluye
por el circuito.
Sonicado para
romper
agrupamientos
Map bovina y humana
sensible 100% a partir
de los 65ºC
En laboratorio.
Inmersión en
baño de agua.
Tubo de ensayo,
Map bovina y humana.
vol.: 1,5mL.
D72ºC 11.6. HTST 100%
Sin agitar
Varios
efectiva en
62durante
intervalos
concentraciones
65proceso.
de
iniciales <10 1 UFC/mL.
68-72 Una porción se
tiempo
Los agrupamientos
homogeneiza
celulares no afectan al
para estudiar
valor D
efecto del
agrupamiento
celular sobre el
valor D
30´
65,5
Pasteurizador
LTLT.
Con revolvedor
Map sensible 100%
15"
636669-72
Pasteurizador a
escala HTST.
Capacidad de
120L/hora.
Flujo turbulento
Map sensible 100%.
Valor extrapolado D72ºC:
2,03 (implica una
reducción > 7 log10)
7
Grant et
al., 2002.
Irlanda
del Norte
No calculado.
PCR y cultivo
Leche cruda
para detectar
(infectada
presencia y
naturalmente)
viabilidad,
respectivamente.
Leche cruda
(12 litros)
Stabel et
al., 2004.
EE.UU.
Ayele et
al., 2004.
República
Checa.
Calostro
10 2-6
10 5
Leche
pasteurizada
de
supermercado
15"25"
73
15"
72
15"
15"
Leche cruda
(infectada
naturalmente)
McDonald
et al.,
2005.
Australia
Leche cruda
4 X 10 3-4
15"20"25"
Grant et
al., 2005.
Irlanda
del Norte
Leche cruda
10 1-5
15"25"60"
6472
Estudio
longitudinal.
Pasteurizador
comercial
HTST.
Capacidad de
2000L/hora.
Flujo turbulento.
Con y sin
homogeneizado
Map puede resistir a
73ºC, por 15 o 25”,
con o sin
homogeneizado, si
se encuentra en
cantidades
suficientes previo al
tratamiento térmico.
No obstante, habría
alguna ventaja si la
pasteurización se
combina con el
homogeneizado
Map sensible 100%
Pasteurizador
comercial
HTST. Flujo
turbulento
A 72ºC: Map
sensible 100%.
A 64ºC: sobrevive
menos de 3
UFC/mL.
La IgG presenta una
reducción promedio
del 25%
Muestreo de
leche
pasteurizada
comercializada
Map presente en el
en República
1,6% de las
Checa (n=244),
muestras
durante 6
72
meses.
Sometida a
cultivo y PCR.
Unidad
Map presente en el
pasteurizadora
2% de las muestras
a escala.
Pasteurizador
comercial
El homogeneizado
HTST.
aumentó 10 veces
Capacidad de
las UFC/mL
72presentes.
Map
3000L/hora.
75Flujo turbulento.
sobrevive 1
78
Homogeneizado
UFC/250mL en el
previo al
85% de las muestras
tratamiento
(reducción > 6log 10)
térmico
Map sobrevive 10-20
UFC/150mL en el
Pasteurizador a
3% de las muestras
escala HTST.
(reducción de 4-5,2
Flujo turbulento.
log10).
72,5Con y sin
Extender el tiempo
84,5 homogeneizado
no implica mayor
previo al
reducción
tratamiento
bacteriana. Mejor
térmico
resultado al
homogeneizar.
8
Ellingson
Leche
et al.,
pasteurizada
2005.
de
EE.UU. supermercado
Muestreo de
leche
pasteurizada
comercializada
en EE.UU.
(n=702),
durante 12
meses.
Sometida a
cultivo y PCR
Map presente en el
2,8% de las
muestras, con picos
de detección en JulSept.
Paolicchi
et al.,
2007.
Argentina
72,5
Pasteurizador
comercial
HTST.
Capacidad de
300L/hora.
Flujo turbulento
Map y M. phlei
sensibles 100%
63
72
132
Muestreo de
leche
pasteurizada
comercializada
en Argentina
(n=70), durante
7 meses.
Sometida a
cultivo y PCR.
Map presente en el
2,86% de las
muestras
Leche cruda
Paolicchi
Leche
et al.,
pasteurizada
2012.
de
Argentina supermercado
10 4-6
15"30"60"
30´
15"
2"
3.1. Excreción de micobacterias en productos biológicos
Los animales infectados eliminan las micobacterias en diversas secreciones
constituyendo la principal fuente de infección para el resto de los animales del
rodeo (Blood y Radostits, 1992). Conocer la excreción de micobacterias a
través de las secreciones implicadas en la transmisión digestiva y
cuantificarlas, resulta fundamental para determinar el riesgo de infección al que
están expuestos los animales, así como para desarrollar medidas de control
adecuadas.
3.1.1. Excreción de Mycobacterium bovis en leche
En 1981 Matthias estimó que sólo el 4% de las vacas positivas a la prueba
tuberculínica elimina M. bovis por leche. En investigaciones posteriores se
determinó mediante el cultivo bacteriológico un porcentaje similar de excretoras
y a este dato se adicionó que menos del 0,5% de las vacas reactoras
9
evidencian lesiones tuberculosas en la glándula mamaria o en los linfonodos
retromamarios drenantes (Goodchild y Clifton-Hadley, 2001; Pardo et al.,
2001). Estudios basados en PCR sobre muestras de leche de vacas
tuberculinopositivas provenientes de rodeos infectados muestran resultados
oscilantes desde la no detección de animales positivos hasta amplificaciones
del 14 al 100% de las muestras procesadas. Estas diferencias estarían dadas
por el patrón errático de eliminación del bacilo tuberculoso asociado con la
inmunidad mediada por células en vacas tuberculosas y otros factores
epidemiológicos como la inmunosupresión viral, el desbalance metabólico, la
utilización de corticosteroides y la presencia del periparto (Serrano-Moreno et
al., 2008). En este sentido ha sido descripto que una hiporeactividad
inmunológica general asociada al parto en vacas tuberculosas implicaría una
falta de respuesta a la prueba anocaudal (Blood y Radostits, 1992) y una
reactivación de la infección aumentando la excreción de M. bovis (SerranoMoreno et al., 2008).
Los terneros de un establecimiento de producción lechera con TBC están en
riesgo de contraer la infección cuando son alimentados con un pool de calostro
y leche cruda (Rentería y Hernández, 1996, Philips et al., 2003, Garro et al.,
2011b). La dosis infectiva para establecer la infección tuberculosa por la vía
oral es superior a la necesaria para establecer la infección por la vía
respiratoria, entre varios miles a un millón de microorganismos versus un
microorganismo contenido en una gota infectiva que logre alcanzar el alvéolo
(Menzies y Neill, 2000, Philips et al., 2003). No obstante, un estudio confirmó
que el consumo de calostro proveniente de ganado reactor es una fuente de
transmisión de M. bovis para los terneros y que la transmisión puede tener
lugar aún por la ingestión de calostro de vacas falso negativas a la prueba
anocaudal (Rentería y Hernández, 1996). De igual forma los terneros pueden
infectarse al ingerir leche de vacas subclínicamente infectadas que excretan
103 UFC/mL (Philips et al., 2003).
3.1.2. Excreción de Map en leche y materia fecal
La leche obtenida del ordeño de vacas provenientes de un rodeo infectado con
PTBC es una fuente de infección de Map para los terneros. Por un lado, se
10
produce la contaminación fecal de la ubre, siendo los recuentos de Map en
heces de vacas con PTBC clínica de 108-12 UFC/g (Chiodini y Hermon-Taylor,
1993; Grant et al., 2002). Por otro lado, es posible la excreción directa de Map
en la leche (Stabel et al., 2014). Existen estudios que informan el aislamiento
de Map de un 35% de las muestras de leche obtenidas de vacas con PTBC
clínicamente avanzada, con recuentos microbianos de 100 UFC/mL de leche
(Chiodini y Hermon-Taylor, 1993, Giese y Ahrens, 2000). No obstante, a nivel
de rodeo los animales infectados clínicamente normales son más numerosos.
Los estudios sobre esta población indican un 22% y un 11,6% de positividad a
partir de muestras de linfonodos retromamarios y de leche respectivamente,
con recuentos celulares de 2 a 8 UFC/50mL de muestra (Sweeney et al., 1992).
Teniendo en cuenta que la PTBC tiene un largo periodo de incubación, y los
signos clínicos pueden no ser visibles hasta que el animal tiene entre 3 y 5
años de vida, es posible que animales asintomáticos eliminen Map en heces y
leche por 18 meses previo a mostrar signos de enfermedad, por lo que el
productor no es consciente del problema (Blood y Radostits, 1992). A pesar de
las dificultades que se presentan al momento de cultivar este microorganismo
que posee desarrollo lento y requerimientos nutricionales especiales, estos
investigadores han logrado aislarlo y cuantificarlo a partir de leche naturalmente
infectada ratificando la posibilidad de difusión hematógena y linfógena del
bacilo hacia la leche (Matthias, 1981).
3.2. Resistencia térmica de los microorganismos del género Mycobacterium en
leche
Los estudios sobre resistencia térmica de los patógenos en la leche son
fundamentales para evaluar la seguridad de los alimentos lácteos. Sin
embargo, no existe un protocolo estandarizado para desarrollar estas pruebas
de resistencia térmica sobre los peligros potenciales para la salud humana y
animal (Condron et al., 2014). En este sentido, existen distintos grupos de
trabajo abocados a estudiar la resistencia térmica de las micobacterias en la
leche (Figura 4). Las metodologías utilizadas son diversas lo que dificulta y a
veces impide comparar los resultados obtenidos llevando a desacuerdos que
no pueden resolverse fácilmente (Figura 5) (Grant, 1998, Cerf y Griffiths,
11
2000). Un ejemplo de esto son los resultados obtenidos en el laboratorio que
no pueden extrapolarse directamente a las condiciones de pasteurización
comercial. No obstante, ambas metodologías se complementan; mientras los
estudios de laboratorio proveen el conocimiento básico sobre la resistencia
térmica microbiana, los resultados obtenidos en el laboratorio son validados
bajo condiciones de pasteurización comercial (Condron et al., 2014).
Figura 4. Resistencia térmica de las micobacterias en leche. Trabajos
publicados por país desde el año 1993 hasta el año 2012.
12
Figura 5. Variables analizadas en los estudios acerca de resistencia térmica de
las micobacterias.
3.2.1. Valor D
Una forma de reflejar la resistencia térmica de los microorganismos es a través
del valor D. Éste se define como el tiempo de reducción decimal o tiempo en
segundos requerido para destruir el 90% de los microorganismos presentes a
una temperatura determinada; es una medida de la velocidad de muerte
microbiana (Jay et al., 2009). Cuanto mayor sea el valor D, tanto más resistente
al calor será la bacteria. A modo de ejemplo, en la Tabla 2 pueden observarse
valores D correspondientes a diversas micobacterias. Según Sung y Collins
(1998), el valor D71,7ºC para M. bovis es igual a 4, mientras que para Map el
D72ºC es de 11,6, indicando su mayor resistencia al calor. Estos valores fueron
13
determinados a partir de tubos de ensayo inmersos en un baño de agua en
laboratorio. En contraposición, Pearce et al (2001) citan un valor D72ºC para
Map de 2,03 utilizando un pasteurizador comercial a escala.
Tabla 2. Valores D para diferentes micobacterias.
Valor D (en segundos)
Bacteria
M. bovis
Map
Referencia
D62ºC
D65ºC
D71,7ºC
D72ºC
-
-
4
-
Sung y Collins, 1998
229
48
-
11,6
Sung y Collins, 1998
15
6
-
2,03
Pearce et al., 2001
-
-
-
M. tuberculosis 12-18
Stumbo, 1973 en Jay et
al., 2009
3.2.2. Cinética de inactivación bajo condiciones de laboratorio
Inóculos iniciales de M. bovis de 104 UFC/mL resultaron ser completamente
sensibles a los tratamientos térmicos LTLT y HTST bajo condiciones de
laboratorio, mientras que el mismo experimento sobre Map permitió recuperar
bacterias viables (Chiodini y Hermon-Taylor, 1993). En un ensayo que estudió
la cinética de inactivación de estas micobacterias (Grant et al., 1996a) se
encontró que M. bovis exhibe una curva de muerte térmica lineal, con 104
UFC/mL se inactiva en 10 minutos; mientras que con 107 UFC/mL lo hace en
20 minutos, tal como puede observarse en la Figura 6 donde el eje de las
ordenadas indica el número de sobrevivientes expresado en Log 10UFC/mL en
función del tiempo expresado en minutos a una temperatura de calentamiento
de 63,5ºC. Por su parte, la mayoría de la población de Map es destruida en los
primeros 5 a 10 minutos, pero quedan sobrevivientes responsables de la forma
cóncava de la curva de muerte térmica (Figura 7).
14
Figura 6. Curva de muerte térmica para M. bovis en leche a 63,5ºC. Cada
punto representa la media de tres repeticiones (± error estándar). Fuente:
Grant, et al., 1996b.
Figura 7. Curva de muerte térmica para Map en leche a 63,5ºC. Cada punto
representa la media de tres repeticiones (± error estándar). Fuente: Grant et al.,
1996b.
Estos hallazgos coinciden con un estudio posterior (Grant et al., 1996b) sobre
varias micobacterias aisladas en leche de origen bovino. M. bovis y M. fortuitum
son destruidas en su totalidad. Sin embargo, el resto de las micobacterias
estudiadas, M. avium, M. intracellulare y M. kansasii, describen una curva de
muerte térmica con cola, similar a la obtenida para Map, pudiendo recuperarse
15
microorganismos viables de las tres especies luego del tratamiento térmico
(Figura 8). Es importante destacar que M. intracellulare es patógeno para los
animales y se aísla de reactores positivos a la prueba tuberculínica anocaudal
que presentan lesiones compatibles con tuberculosis (Traversa et al., 2011) y
M. kansasii es responsable de infecciones pulmonares en los seres humanos y
se aísla de ganglios linfáticos y leche de vacas asintomáticas (Bercovier y
Vincent, 2001).
Figura 8. Curva de muerte térmica de algunas micobacterias en leche a
63,5ºC: (a) M. bovis; (b) M. fortuitum; (c) M. avium; (d) M. intracellulare; (e) M.
kansasii. Fuente: Grant et al., 1996a.
La explicación de este diferente comportamiento térmico para bacterias del
mismo género estaría dada por dos características:
A.
Tendencia a agruparse en medio líquido, debido a la hidrofobicidad de
su pared (McFadden en Grant et al., 1996a). Las paredes de las micobacterias
tienen un contenido muy elevado de lípidos, de hasta el 60%, del cual gran
parte está adherido a polisacáridos, formando glucolípidos que se ubican en
una capa externa de la pared, siendo los responsables del carácter hidrófobo
de la misma (Wolinsky, 1996). Esto les permite agruparse (Figura 9) y, en
consecuencia, las bacterias que se hallan en el centro del agrupamiento
requieren un calentamiento adicional para ser inactivadas (Grant et al., 2005).
16
M. bovis es la excepción, la cual muestra una orientación paralela en su
agrupamiento (Grant et al., 1996a). Esta diferencia podría ser la responsable
de su mayor sensibilidad térmica.
B.
Velocidad de crecimiento. El incremento en la resistencia térmica ha sido
relacionado con una célula microbiana menos activa. Aunque el mecanismo no
es conocido, las células bacterianas tienden a ser más resistentes al calor en la
fase estacionaria del crecimiento y menos durante la fase logarítmica, (Jay et
al., 2009). Esto podría explicar la mayor sensibilidad térmica de M. fortuitum,
una bacteria de crecimiento rápido dentro de las micobacterias.
Figura 9. Células de Map agrupadas (A) y aisladas (B). Ambas muestras
fueron ácido-alcohol resistentes, las fotos fueron tomadas con microscopio de
luz (Zeiss, Oberkochen, Germany). Magnificación: 38.300. Fuente: Sung y
Collins, 1998.
3.2.3. Estudios de inactivación bajo pasteurización comercial
La resistencia térmica de Map ha sido y continúa siendo objeto de gran debate
entre los investigadores. A diferencia de lo que ocurre con M. bovis las
investigaciones llevadas a cabo en el laboratorio no logran la eliminación
completa de Map. La principal hipótesis para explicar este hecho apunta a la
permanencia estática de la leche durante el tratamiento térmico, ya que la
totalidad de la leche debe alcanzar rápidamente la temperatura de
pasteurización (Grant et al., 1996b). Para esto debe circular de manera
turbulenta. En los pasteurizadores comerciales el flujo turbulento se produce a
causa de los relieves de las superficies de las placas (Alais, 1988).
17
Con el uso de pasteurizadores comerciales a escala se logró imitar el flujo
turbulento de la leche y bajo estas condiciones inóculos de Map de entre 103 y
106 UFC/mL de leche son destruidos totalmente (Stabel et al., 1997; Pearce et
al., 2001).
No obstante, otros investigadores propusieron evaluar el comportamiento
térmico de cepas salvajes de Map utilizando leche naturalmente infectada
sometida a una pasteurización comercial. Es así que la efectividad del
tratamiento térmico HTST sobre Map fue evaluada en un estudio prospectivo
longitudinal utilizando un pasteurizador comercial y leche naturalmente
infectada recolectada semanalmente durante los meses de diciembre del año
1999 a marzo del año 2000 (Grant et al., 2002). Este periodo fue elegido en
base a una investigación previa que estudió la presencia de Map en leche de
supermercados y que señala a los meses de enero a marzo y de septiembre a
noviembre como los períodos en los que se producen picos de detección del
microorganismo (Millar et al., 1996). Se encontró que la pasteurización HTST
no es completamente efectiva todo el tiempo. Es decir, Map puede resistir el
calentamiento a 72ºC, por 15 segundos si se encuentra en cantidades
suficientemente altas antes de ser sometida al proceso de pasteurización
(Grant et al., 2002).
3.2.4. Pasteurización de la leche destinada a la alimentación de terneros
Según algunos estudios, es posible la implementación exitosa de la
pasteurización baja de la leche destinada a la alimentación de los terneros. Así
lo demuestra un ensayo realizado en un establecimiento lechero equipado con
un pasteurizador discontinuo mediante el cual se logró destruir Map presente
en concentraciones de 103 UFC/mL. En la Figura 10 puede observarse la
recuperación de bacterias viables, representada en la ordenada por las
UFC/mL en función de la temperatura de calentamiento (Stabel, 2001). El
tiempo que insume todo el proceso es de 90 minutos, incluyendo el tiempo
necesario hasta alcanzar la temperatura de pasteurizado y el mantenimiento
por 30 minutos (Figura 11).
18
Figura 10. Recuperación de Map viables en la leche antes y después del
tratamiento térmico en la unidad pasteurizadora discontinua. Los valores
representan la media ± desvío estándar para dos experimentos replicados.
Fuente: Stabel, 2001.
Figura 11. Tiempo versus temperatura de la leche en la unidad pasteurizadora.
Los valores representan la media ± desvío estándar para dos experimentos
replicados. Fuente: Stabel, 2001.
En cuanto a la pasteurización alta, un ensayo utilizando un pasteurizador con
capacidad de 300 l/h disponible en un establecimiento lechero encontró que se
19
logra la eliminación completa de Map en leche inoculada con 106 UFC/mL bajo
esas circunstancias de trabajo (Paolicchi, et al., 2007), coincidiendo con los
hallazgos previos publicados por Stabel et al (2004).
3.3. Recomendaciones para la implementación de la pasteurización en rodeos
lecheros
Un trabajo de la Universidad de Minnesota (Godden, 2003) plantea una serie
de consideraciones para la implementación de la pasteurización de la leche
destinada a los terneros.
3.3.1. Requerimientos de instalación
En primer lugar, se debe determinar el volumen de leche a procesar
diariamente para seleccionar el pasteurizador de capacidad adecuada. En
cuanto al calentador de agua hay que tener en cuenta si la unidad
pasteurizadora lo trae incorporado o debe comprarse aparte, o bien, si el
establecimiento posee un calentador asegurarse que podrá abastecer el
volumen de agua a la temperatura necesaria. Existen en el mercado
pasteurizadores continuos de pequeñas capacidades que tienen incorporado
un calentador eléctrico a la unidad y cuando los volúmenes son mayores, la
fuente energética es el gas.
Es importante conocer el espacio que ocupará la unidad pasteurizadora y su
ubicación final. Los pasteurizadores no vienen provistos de un tanque de
recepción ni de salida de leche. Por lo tanto, debe tenerse en claro si la bomba
de leche succionará a partir del tanque de frío o si será necesario contar con un
recipiente para tal fin. De igual forma, hay que determinar si la leche
pasteurizada será recolectada directamente en el tanque de distribución o será
almacenada en otro sitio.
Finalmente, se evaluará las opciones disponibles en el mercado, teniendo en
cuenta los costos de compra, instalación y consumo, además de la
disponibilidad de repuestos.
20
3.3.2. Consideraciones para el uso diario
Es fundamental que las personas encargadas de procesar la leche estén
capacitadas para operar el pasteurizador y realizar la limpieza adecuada del
equipo, respetando los tiempos y las temperaturas sugeridos/as por el
fabricante. La limpieza inadecuada permite la acumulación de grasa, proteína y
minerales lo que interfiere en la transferencia de calor hacia la leche, además
de servir para el desarrollo bacteriano. Una rutina adecuada de lavado de la
unidad pasteurizadora consta de los mismos pasos de lavado de la ordeñadora
y de los tanques de frío.
3.3.3. Manejo de la leche previo y posterior a la pasteurización
En caso de almacenar la leche fuera del tanque de frío, se deben utilizar
recipientes cerrados y limpios, debiendo refrigerar la leche si no se va a
pasteurizar en el corto plazo. De esta manera se evita el desarrollo bacteriano y
fermentación posterior, con la consecuente producción de ácido y caída de pH.
Esto es importante, debido a que la leche fermentada tiene modificada su
estructura proteica, de manera tal que cuando es sometida al calor se produce
coagulación de la proteína y formación de cuajada. Cuando esta leche es
administrada a los terneros se ve desprovista de gran cantidad de nutrientes
que quedan retenidos en el cuajo.
De igual forma, si la leche pasteurizada no es administrada rápidamente a los
terneros debe ser almacenada en recipientes cerrados y limpios para evitar la
contaminación posterior al tratamiento térmico.
3.3.4. Opciones disponibles en el mercado
En la Tabla 3 se presentan los pasteurizadores disponibles en Tandil. Todos
son de tipo HTST y en la actualidad el mercado no ofrece pasteurizadores de
tipo LTLT. Las unidades con capacidad de hasta 1000 L/hora utilizan la
electricidad como fuente energética, mientras que aquellas con capacidades
mayores requieren gas. El costo de la luz se estima en $1,25/Kw y el del gas
en $12,5/Kg. Los puntos de venta consultados instalan el equipo y ofrecen
servicio técnico y disponibilidad de repuestos. La limpieza del pasteurizador se
realiza mediante el sistema de limpieza en el lugar (conocido como “CIP” del
21
inglés cleaning in place) utilizado para el lavado de la ordeñadora y del tanque
de refrigeración donde la leche permanece hasta que es retirada por el servicio
que la transporta a la usina concentradora.
Tabla 3. Pasteurizadores comerciales disponibles en Tandil. Precios a abril
2016. * Consumo estimado por ternero: 6 litros de leche diarios y dos pasteurizaciones al día.
Capacidad (L/hora)
300
500
500
1000
Calentador de agua
Eléctrico
Eléctrico
Eléctrico
Eléctrico
220
voltios
CA
220
voltios
CA
220 voltios
mono/trifásica
220
voltios
CA
-
7 KW/h
12 KW/h
-
18 KW/h
-
4 KW/h
7 KW/h
7 KW/h
(mono) 3-4
KW/h (tri)
15 KW/h
-
Consumo de gas
-
-
-
-
3 Kg de gas
licuado/h
Termógrafo
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
6400
8100
14600
11900
16500
9.503
12.089
13.587
17.810
24.600
100
160
160
330
660
Tensión de
alimentación
Consumo eléctrico
máximo
Consumo eléctrico
en régimen de
trabajo
Sistema de lavado
CIP
Precio (en USD)
Instalación: 10%
del valor del
equipo
Terneros a
alimentar *
Sí
2000
Calderín a
gas
incorporado
Sí
3.3.5. Consideraciones al pasteurizar calostro
Algunos investigadores sugieren que los terneros alimentados con un pool de
calostro están en riesgo de infectarse con M. bovis debido a la presencia de
vacas falso negativas a la prueba anocaudal (Evangelista, 1996, Garro et al.,
2011). Serrano-Moreno et al (2008) lograron amplificar el genoma de M. bovis
mediante PCR a partir de muestras de calostro, tanto de ganado reactor como
no reactor a la prueba tuberculínica. Si bien los ensayos de pasteurización de
calostro revisados se focalizaron en la destrucción de Map, los resultados de
los mismos indican que esta bacteria puede ser destruida mediante LTLT y
HTST. Sin embargo, se observan pérdidas de inmunoglobulinas del orden del
12,3 al 30% por lo que estos investigadores sugieren que la pasteurización del
22
calostro sólo debe implementarse en aquellos casos en que se clasifique la
calidad del mismo mediante calostrómetro, utilizando sólo aquel de alta calidad
(más de 60mg/mL de inmunoglobulina) además de suministrarlo en el momento
adecuado y en cantidad suficiente (Stabel et al., 2004, Godden, 2009).
3.4. Modificaciones a la pasteurización y estrategias que la complementan
Map ha sido vinculado a la EC en los humanos y la vía de transmisión estaría
dada por el consumo de leche bovina pasteurizada contaminada con el agente
(Tabla 4) (Cirone et al., 2007). De confirmarse el rol de Map como agente
etiológico en la EC, los parámetros establecidos para la pasteurización y
diversas estrategias complementarias deberán ser evaluadas.
Tabla 4. Aislamientos de Map a partir de leche comercial. Fuente: Cirone et al.,
2007.
País
Reino Unido
Cultivos
positivos (%)
2
Referencia
Grant et al., 2002
Estados Unidos
2,8
Ellingson et al., 2005
República Checa
1,6
Ayele et al., 2005
Argentina
2,86
Paolicchi et al., 2005
.
3.4.1. Modificaciones a la pasteurización
En 1998 la industria láctea del Reino Unido adoptó voluntariamente
incrementar de 15 a 25 segundos el tiempo de la pasteurización alta para
incrementar la letalidad del proceso (Grant et al., 2002) debido a que un estudio
llevado a cabo sobre leche de supermercados encontró que el 7% de la leche
estudiada arrojó resultados positivos a Map mediante PCR, aunque no pudo
aislarse mediante cultivo bacteriano (Millar et al., 1996). Sin embargo, diversos
investigadores no hallaron diferencias significativas al extender el tiempo de
pasteurización (Grant et al., 2002; McDonald et al., 2005; Grant et al., 2005;
Paolicchi et al., 2007).
23
En relación a la temperatura de pasteurización, tampoco se obtienen ventajas
significativas en cuanto a la reducción microbiana de Map al elevar la
temperatura del tratamiento térmico entre 74 y 85°C (Stabel et al., 1997;
McDonald et al., 2005; Grant et al., 2005).
3.4.2. Homogeneizado
A pesar de que algunos autores no encontraron diferencias en el
comportamiento térmico de micobacterias agrupadas y aisladas (Sung y
Collins, 1998), otros autores obtuvieron una mayor reducción bacteriana al
homogeneizar la leche previo a la pasteurización de la misma (Grant et al.,
2002, Grant et al., 2005). La industria láctea homogeneiza la leche destinada a
la venta en góndola. Este proceso consiste en la ruptura mecánica y dispersión
de los glóbulos grasos de la leche para evitar la separación de fases de la
misma (Alais, 1988). Al evaluar el efecto del homogeneizado sobre los
agrupamientos microbianos se encontró que reduce el tamaño de los mismos
permitiendo que más células queden expuestas al efecto de la temperatura
(McDonald et al., 2005).
3.4.3. Bactofugación y microfiltrado
Ha sido propuesto el estudio de diversas tecnologías de proceso para combinar
con la pasteurización, tales como la bactofugación y el microfiltrado. El primero
se basa en el uso de la fuerza centrífuga para remover partículas pesadas
como esporas y potenciales agrupamientos bacterianos; mientras que el
segundo utiliza filtros de 1,4 µm para remover bacterias y esporas de la leche
(Grant et al., 2005).
24
4. Conclusiones
Los parámetros de tiempo y temperatura de pasteurización de la leche, tanto
LTLT como HTST, han sido establecidos en base a la sensibilidad térmica de
M. bovis. Los trabajos analizados corroboran este hecho y utilizan a esta
bacteria como control del proceso de pasteurización. Más aun, ha sido y
continúa siendo la estrategia de control para evitar el contagio de tuberculosis
bovina a través de la leche hacia los seres humanos. La pasteurización de la
leche destinada a los terneros es una medida de control de la transmisión de
M. bovis por la vía digestiva. Además, otros autores han probado métodos
alternativos como la acidificación de la leche y en sus ensayos concluyen que
la metodología de inactivación de excelencia es la pasteurización (Michel et al.
2015, Macuamule et al. 2016).
La eficacia de los tratamientos térmicos para eliminar Map de la leche es de
interés mundial y en la actualidad aún resulta controvertida. Aunque varios
investigadores han logrado eliminarlo completamente tanto en LTLT como en
HTST bajo ciertas condiciones de trabajo, otros investigadores no han tenido
tal éxito a punto de aislarla de leche pasteurizada comercializada en
supermercados.
De acuerdo a los estudios de resistencia térmica revisados se encontró que la
cantidad de Map presente en la leche afecta la eficacia de la pasteurización. La
carga bacteriana en leche naturalmente infectada varía a lo largo del tiempo y
se conoce que mientras mayor es el número de microorganismos, mayor es el
riesgo de obtener un producto no apto al final del proceso de pasteurización.
Por lo tanto, un establecimiento lechero que implemente la pasteurización de la
leche destinada a sus terneros debe evitar el uso de aquella proveniente de
animales clínicos que son eliminadores de Map a través de la leche y heces,
además de aplicar prácticas higiénicas adecuadas en la rutina de ordeño que
disminuyan la contaminación de la leche, reduciendo así la carga de Map en el
pool de leche que ingresa al sistema de pasteurización.
25
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