poster versión 2014

UANL
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN ®
FCB
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ®
Análisis de la resistencia a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis
(Berliner) en Helicoverpa zea (Boddie)
Saúl Martínez, Benito Pereyra-Alférez, Jesús Medina, Luis Galán-Wong y Feliciano Molina
Instituto de Biotecnología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León. Pedro de Alba y Manuel L. Barragán S/N.
Cd. Universitaria. San Nicolás de los Garza, NL. CP. 66451. Correspondencia: B. Pereyra-Alférez. [email protected]
INTRODUCCIÓN
Las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) son producidas durante la esporulación y tienen
actividad insecticida, por lo que son ampliamente utilizadas como alternativa a los insecticidas
químicos, ya que inocuas al ambiente.
Formulados a base de Bt se han utilizado como insecticidas durante muchos años. Sin embargo, no
fue sino hasta que se logró introducir genes cry en plantas de algodón (1996) y maíz (1997) que el
uso intensivo de esta tecnología se expandió mundialmente (Kumar. 2008). Estos cultivos
biotecnológicos (Cultivos Bt) han demostrado tener un control exitoso sobre muchos lepidópteros
plaga, pero en consecuencia, ejercen una presión de selección importante sobre las poblaciones de
estos insectos.
Helicoverpa zea (Boddie) conocido como “el gusano del algodonero”, junto con Heliothis virescens
(Fabricius) y Pectinophora gossypiella (Saunders), representan una de las principales plagas del
algodonero en Estados Unidos y otras partes de América, sin embargo, H.zea tiene una mayor
probabilidad de desarrollar resistencia, ya que ésta es menos susceptible a Cry1Ac y además está
expuesta a Cry1Ab en maíz Bt (Karim. 2000; Van Frankenhuyzen. 2009), que es una proteína
similar en estructura y modo de acción a Cry1Ac, por lo que existe el riesgo de que desarrolle
resistencia cruzada.
Con el uso de los cultivos Bt, como el algodón Bollgard® y Bollgard II®, el desarrollo de resistencia
en las poblaciones de insectos plaga ha sido de interés primordial. Aunque hasta la fecha no se han
reportado casos de resistencia en cultivos Bt en los Estados Unidos (Moar y Anilkumar. 2006, 2008).
El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de resistencia en insectos
es esencial para diseñar estrategias efectivas para el manejo de plagas resistentes, por lo tanto este
estudio tiene como objetivo aportar información en el comportamiento de la resistencia hacia la
toxina Cry1Ac en Helicoverpa zea.
Las larvas de H. zea fueron capaces de soportar dosis, de hasta 15 veces la LC50 manteniendo una
población estable. Sin embargo, durante éste ensayo se observó que incluso sobrevivían dosis de
hasta 100 veces, pero no con los suficientes individuos para formar una colonia.
Durante 6 generaciones de exposición constante se obtuvieron colonias resistentes a 10 μg y 20 μg de
protoxina Cry1Ac. En la 6ª generación, las colonias colapsaron y no hubo más producción de
huevecillos viables. Además se observaron diferencias notorias en las líneas resistentes con respecto
a la susceptible: retraso en el ciclo biológico, mayor mortalidad de pupas, y una proporción de
machos:hembras de 2 a 1.
Izquierda: Larvas susceptibles que sobrevivieron a una dosis de 20 μg/g después de 7 días; Centro: Testigo; Derecha: Comparación de una larva resistente (Izq.) y una susceptible
(Der.) a los 10 días de vida.
En las cruzas, solamente aquéllas en las que las hembras eran susceptibles tuvieron descendencia
viable.
Se confirmó la presencia de 2 genes de aminopeptidasa y 1 de caderina, que funcionan como
receptores para la δ-endotoxina Cry1Ac.
Arriba: Izq. Gen de Aminopeptidasa 1; Der. Gen de Aminopeptidasa 2. Abajo: Gen de caderina..
Los tres iniciadores fueron probados con las líneas resistentes y la susceptible
Izquierda: Bacillus thuringiensis y cristales parasporales
Centro: Larva de Helicoverpa zea alimentándose de una bellota de algodón
Derecha: Fases del ciclo de vida de Helicoverpa zea (Huevecillo, larva, pupa y adulto o imago)
CONCLUSIONES
METODOLOGÍA
Toma de muestras de algodón Bt
Las hojas, flores, bellotas y fibras de algodón fueron colectadas en predios donde se siembra algodón
Bollgard® y Bollgard II® en localidades de Sonora, Baja California y Coahuila durante 2012 -2013.
Las muestras fueron sometidas a pruebas con inmunotiras Agdia ® para detectar la presencia de las
toxinas Cry1Ac y Cry2Ab, según las especificaciones del producto. Además se recorrieron los
predios con el fin de detectar la presencia de H. zea.
Cría de H. zea.
Se cuenta con una línea de Helicoverpa zea previamente establecida en laboratorio criada a base de
dieta artificial.
Bioensayos
La toxina Cry1Ac fue purificada a partir de la cepa HD-73 de B. thuringiensis var. kurstaki según el
protocolo de Iracheta-Cárdenas (2000)..
Todos los bioensayos fueron llevados a cabo a una temperatura de 28°C, RH 60% y fotoperíodo
14:10
Para determinar la LC50 las larvas neonatas fueron alimentadas con dieta conteniendo
concentraciones de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20 y 50 µg/g (μg de toxina solubilizada/g de dieta) durante
7días.
Para obtener las líneas resistentes, las larvas neonatas se alimentaron a concentraciones de 10 µg/g
(Tabashnik et. al, 2009) y 20 µg/g durante 1 semana. Después de los 7 días las sobrevivientes fueron
criadas en dieta sin tratar hasta completar su ciclo.
Adicionalmente, se realizaron cruzas de adultos sensibles con resistentes para observar la producción
y viabilidad de los huevecillos.
Detección de receptores mediante PCR
Se diseñaron iniciadores para tres receptores asociados a la resistencia a Cry1Ac: una proteína similar
a la caderina, y dos aminopeptidasas (GenBank: AY909578.1, AF521659.1 y AY346383.1,
respectivamente) y mediante PCR se detectó la presencia de estos genes en nuestras líneas de H. zea.
RESULTADOS
Se confirmó la presencia de las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab en las 2 variedades de algodón Bollgard® y
Bollgard II®. La toxina Cry1Ac en la variedad I y Cry1Ac, Cry2Ab y un gen de resistencia a
herbicidas en la variedad II.
La expresión de altas dosis de toxina en el algodón transgénico y los refugios son un método efectivo
para evitar que al menos las poblaciones de H. zea logren establecerse y convertirse en una plaga.
H. zea es capaz de resistir dosis de al menos 15 veces la dosis letal y mantener una población estable
en laboratorio.
La toxina Cry1Ac parece tener un efecto en la fertilidad de las hembras, así como en el desarrollo de
las larvas, lo cual se ve reflejado en la baja producción de huevecillos y el retraso en el desarrollo
larval en las líneas resistentes.
El estudio de resistencia a toxinas Cry aun no es realizado en todas las áreas donde los plantíos
transgénicos son implementados por lo cual es de suma importancia dar seguimiento para incrementar
la información y tener métodos mas eficientes y rápidos para prevenir cualquier tipo de resistencia a
futuro.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Anilkumar, K. J., A. Rodrigo-Simon, J. Ferré, M. Puztai-Carey, Sivasupramaniam and W. J.
Moar. 2008. Production and characterization of Bacillus thuringiensis Cry1Ac-resistant cotton
bollworm Helicoverpa zea (Boddie). Appl. Environ. Microbiol. 74: 462- 469.
• Anilkumar, K. J., Puztai-Carey M. Moar W. J. 2008. Fitness costs associated with Cry1Acresistance Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae): a factor countering selection resistance to Bt
cotton?. J. Econ. Entomol. 101: 1421-1431.
• Iracheta, M., B. Pereyra-Alférez, L. Galán-Wong and J. Ferré. 2000. Screening for Bacillus
thuringiensis crystal proteins active against the cabbage looper, Trichoplusia ni. J. Invertebr.
Pathol. 76:70-75
• Jurat-Fuentes, J. L., and M. J. Adang. 2006. Cry toxin mode of action in susceptible and
resistant Heliothis virescens larvae. J. Invertebr. Pathol. 92:166–171.
• Pigott, C. R, Ellar D. J. 2007. Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71:255–281.
• Soberón, M., Pardo-López, L., López, I. Gómez, I., Tabashnik, B.E., and A. Bravo. 2007.
Engineering modified bt toxins to counter insect resistance. Science 318:1640-1642
• Smith, I.M.; D.G. McNamara; P.R. Scott; K.M. Harris. 1992. Helicoverpa zea. Data sheets on
quarantine pests. CAB International & EPPO.
• Tabashnik, B. E.; Van Rensburg, J. B. J.; Carrière, Y. 2009. Field evolved insect resistance to
Bt crops: definition, theory, and data. J. Econ. Entomol. 102:2011–2025.
• Tabashnik, B. E., T. J. Dennehy, M. A. Sims, K. Larkin, G. P. Head, W. J. Moar, and Y.
Carriere. 2002. Control of resistant pink bollworm (Pectinophora gossypiella) by transgenic
cotton that produces Bacillus thuringiensis toxin Cry2Ab. Appl. Environ. Microbiol. 68:3790–
3794.
• Tabashnik, B. E., Y. Carriere, T. J. Dennehy, S. Morin, M. A. Sisterson, R. T. Roush, A. M.
Shelton, and J. Z. Zhao. 2003. Insect resistance to transgenic Bt crops: lessons from the
laboratory and field. J. Econ. Entomol. 96:1031– 1038.
Muestras de algodón transgénico de cada uno de los predios en las distintas localidades, inmunotiras utilizadas para confirmar la
presencia de proteínas Cry y parcela de algodón transgénico en Torreón, Coahuila.
Se realizó un análisis PROBIT utilizando el programa BMDS (Benchmark Dose Software)
proporcionado por la EPA dando la cifra promedio de 1.309 µg/gramo de dieta como la LC50
referente para el estudio.
Agradecemos al FONDO CIBIOGEM, proyecto “Analisis de la sensibilidad y resistencia de
lepidópteros asociados al cultivo de algodón transgénico” con clave 164429.