Medida del número de microorganismos (II) • Métodos directos:

Medida del número de microorganismos (II)
• Métodos directos:
– Recuento de UFC = viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri
– Recuento de UFC a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas:
• se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore®), y se incuban sobre medio sólido
Medio líquido (40°C aprox.)
Dispersión sobre
superficie
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Filtración por membrana de Millipore® de una muestra (en muestras muy diluidas)
Medida del crecimiento por masa celular (I)
• Métodos directos:
–
–
–
–
Determinación del peso húmedo
Determinación del peso seco
Determinación del N total
Determinación de algún componente característico:
•
•
•
•
ADN, ARN
Proteínas
ATP
Clorofilas (en fotosintéticos)
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Medida del crecimiento por biomasa (II)
• Métodos indirectos:
– Consumo de nutrientes • QO2 (consumo de oxígeno)
• QCO2 (consumo de dióxido de carbono)
– Productos del metabolismo
• Producción de ácidos orgánicos
• Producción de CO2
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Cuando se inoculan células a un medio de cultivo?
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Crecimiento balanceado (=equilibrado) • El número de células, cantidad de biomasa,
concentración de proteínas, ácidos nucléicos, etc.
evolucionan en paralelo (cambian en la misma forma)
• El incremento por unidad de tiempo de los
constituyentes de la población es un valor constante:
• y el nº de células, la masa u otros componentes se
duplican en un mismo lapso de tiempo
Cinética de crecimiento en cultivo discontínuo (batch)
Importancia?
Considerando que el cultivo tiene un crecimiento equilibrado en
la ecuación 1. “N” puede representar cualquiera de estos
factores.
Ecuación 1 N= No x 2n
No = número inicial de células
N= número de células después de n generaciones
n= número de generaciones
Como n= número de generación y td es el tiempo que transcurre,
en cualquier tiempo de cultivo (T) se puede calcular
Ecuación 2
n= T_
td
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Cinética de crecimiento enNcultivo
discontínuo (batch)
N
o
2n
Ec. 1.
N= No x 2n
No = # de células al inicio
N = # de células después de “n” generaciones
n = # de generaciones o duplicaciones
Ec. 2
n= T Tiempo de crec.
td tiempo de duplicación
combinando las ec. 1 y 2:
Ec. 3
N = N0 2T/td
 N = N0 2T/td
Las ecuaciones exponenciales son difíciles de manejar gráficamente, se
transforman en una recta, aplicando logaritmos en los dos términos y
resulta:
Ecuación 4
ln N = ln N0 + (T/td) ln 2
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Ejercicios:
1. Si se inoculan 1.2 x103 bacterias en un medio de cultivo y después de 4 horas de
incubación creciendo exponencialmente se obtienen 1.8 X105 bacterias.
n=?
g =?
td=?
2. Cuántas bacterias habrá en un cultivo después de 51 horas si este se inocula con
1 bacteria que tiene un td= 3 horas
3. Con cuántas bacterias deberá inocularse un medio de cultivo si queremos tener 8.
1x104 bacterias después de 12 horas?
4. Cuánto tiempo tardará una población inicial de 2X102 para llegar a 1.2 x106
bacterias?
Si se inoculan N bacterias que se duplican cada 3 horas en un medio de cultivo
fresco... después de 3 h tendremos 2N bacterias, en otras 3 horas 4N..
Modelo de crecimiento en escalera
Se considera que hay
crecimiento sincrónico que
se ajusta a un modelo
geométrico de crecimiento es
decir que el aumento de la
población se dá en puntos
discretos (3, 6, 9, 12, etc.
horas) . Pero en la práctica
aún en las condiciones
óptimas de crecimiento esto
no se obtiene, porque?
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•Porque las bacterias generalmente
pueden encontrarse en diferentes
etapas del proceso de división
celular por lo que el cultivo no está
sincronizado.
•Incluso si se iniciara con 1 sola
célula,
la
sincronicidad
se
mantendrá solamente por algunas
generaciones.
•Así, se observa que la gráfica de
crecimiento es de tipo exponencial,
que permite utilizar modelos con
funciones
exponenciales
para
calcular parámetros de crecimiento
y predecirlo a diferentes tiempos.
Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento
en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt).
En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente:
Ecuación 5
Es una recta con m= ?
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Cinética del crecimiento (fase exponencial
dN / dt = µ N
La velocidad (tasa) de
crecimiento es proporcional
al número de células
dN / N = µ dt
∫ dN / N = µ ∫ dt
El logaritmo del número de
células varía de forma lineal
con el tiempo.
La pendiente de la recta de
proporcionalidad es la tasa de
crecimiento µ
Ln N – Ln N0 = µ t
Ln N = Ln N0 + µt
N = N0eµt
El aumento del número
de células es exponencial
A la constante de proporcionalidad k se le denominará (μ), y se le
conoce como tasa de crecimiento.
Se transforma en la siguiente función exponencial:
Ecuación 6
N = N0 eμt
=
X = X0 eμt
Es la ecuación general del crecimiento microbiano.
Describe el comportamiento del cultivo en la fase
exponencial de crecimiento (Fase Log)
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4
6
5
7
3
1
2
Cultivo continuo
(sistema abierto)
• Cultivo balanceado que se mantiene por tiempo indefinido, por un flujo de nutrientes contínuo; que incluye:
– Una cámara de cultivo de volumen constante
– A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio
– Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero
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Medio fresco
desde reservorio
Válvula para
controlar el flujo
f (en ml/h)
Pérdida neta células:
-dx/dt = x·D
Crecimiento bruto:
dx/dt = x· μ
Crecimiento neto: dx/dt =
x· μ - x·D = = x (μ-D)
En equilibrio μ = D; luego
dx/dt = 0 y x se hace
constante
D = f/v
(en h-1)
v
x
f (en ml/h)
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