ÍNDICE LISTA DE TABLAS

ÍNDICE
LISTA DE TABLAS....................................................................................
iii
LISTA DE FIGURAS..................................................................................
iv
RESUMEN.................................................................................................
v
INTRODUCCIÓN....................................................................................
vi
JUSTIFICACIÓN........................................................................................
viii
OBJETIVOS..............................................................................................
ix
HIPÓTESIS................................................................................................
xi
I.
MARCO DE REFERENCIA
1.1 CAMARÓN (Penaeus sp)..............................................................
1
1.1.1 Producción de camarón.....................................................
2
1.1.2 Composición química de los residuos del camarón........
2
1.1.3 Morfología.........................................................................
4
1.1.4 Composición química........................................................
6
1.2 PROTEÍNAS....................................................................................
6
1.2.1Clasificación........................................................................
8
1.2.2 Proteínas de productos marinos.......................................
10
1.2.3 Composición en aminoácidos..........................................
10
1.2.4 Propiedades funcionales....................................................
12
1.3 HIDROLIZADOS DE PROTEÍNAS................................................
13
1.3.1 Métodos de obtención......................................................
14
1.3.2 Hidrólisis enzimática........................................................
15
1.3.3 Ensilado.............................................................................
15
1.4 PRINCIPIOS BÁSICOS DE ELECTROFORESIS..............................
17
1.4.1 Definición............................................................................
17
1.4.2 Parámetros eléctricos..........................................................
18
1.4.3 Electroforesis como método analítico de proteínas..........
19
1.4.4 Punto isoeléctrico en electroforesis (IEF)...........................
20
1.4.5 La matriz. ..............................................................................
21
1.4.5.1 Gel de agarosa...........................................................
21
1.4.5.2 Gel de poliacrilamida.............................................
24
II. MATERIAL Y MÉTODOS
29
2.1 UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO...............................................
29
2.2 MATERIAL BIOLÓGICO..............................................................
29
2.3 DESCRIPCIÓN DE EQUIPOS Y REACTIVOS................................
30
2.3.1 Determinación de proteína.................................................
30
2.3.2 Preparación de los hidrolizados de proteínas...................
30
2.4 METODOLOGÍA...........................................................................
31
2.4.1 Electroforesis SDS –Poliacrilamida (SDS - PAGE)............
31
2.4.2 Electroforesis con gel de agarosa.........................................
37
III. ESULTADOS Y DISCUSIÓN
40
3.1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS...............................................
40
3.1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida.............................
41
3.1.2 Electroforesis en gel de agarosa..........................................
44
CONCLUSIONES...........................................................................................
46
BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................
48
LISTA DE TABLAS
TABLA
1
PÁGINA
Volumen de producción de camarón en peso desembarcado, por
origen y entidad federativa, 1999 (toneladas)................................
2
3
Composición de los desechos de camarón, análisis de cabeza y
Cáscara..............................................................................................
3
3
Composición del camarón (100 g, de porción comestible)...........
6
4
Clasificación de proteínas de acuerdo con su composición
forma, solubilidad y función biológica..........................................
5
9
Composición de aminoácidos de las proteínas de los productos
marinos...............................................................................................
11
6
Perfil de aminoácidos de las proteínas de cefalotórax de camarón
11
7
Propiedades funcionales de las proteínas empleadas en alimentos
13
8
Las normas de la proteína con el peso molecular aproximado.......
19
9
SDS – PAGE...........................................................................................
33
10
Cantidad de muestra por poso...........................................................
35
11
Contenido de proteína del extracto hidrolizado de cabeza de
camarón de bahía..............................................................................
40
LISTA DE FIGURAS
FIGURA
PÁGINA
1
El camarón y sus partes............................................................................
2
Estructura química de la agarosa y la estructura de la polimerización
5
del gel.......................................................................................................... 23
3
Estructura química del gel de poliacrilamida.......................................... 25
4
Acción del tamizado del gel de poliacrilamida............................... 27
5
Placa de vidrio formando un sandwich agregándole el gel de
Poliacrilamida.................................................................................... 34
6
Cámara de electroforesis................................................................... 35
7
Cámara de electroforesis para geles de agarosa bandas de papel
filtro sumergidas una en ácido acético y NaOH.............................. 37
8
Refrigerante para equipo de electroforesis en gel de agarosa........ 38
9
Proteínas de extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una
placa de gel de poliacrilamida con marcador de pesos
moleculares.......................................................................................... 42
10 Proteínas de extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una
placa de gel de poliacrilamida con marcador de pesos
moleculares.......................................................................................... 43
11 Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en
una placa de gel de agarosa.............................................................. 44
12 Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en
una placa de gel de agarosa.............................................................. 45
RESUMEN
En la presente investigación se partió de extractos proteicos de cabeza de camarón
de bahía que fueron hidrolizados por tres métodos diferentes que son hidrólisis
química, hidrólisis enzimática e hidrólisis mediante fermentación láctica.
A los hidrolizados proteicos se les determinó la cantidad de proteína por el método
Bradford, se les determinó el peso molecular por medio de electroforesis con gel de
poliacrilamida y su punto isoeléctrico por electroforesis con gel de agarosa.
Los resultados obtenidos de los distintos hidrolizados muestran que estos contienen
la misma cantidad de proteína: La diferencia obtenida en la electroforesis por gel
de poliacrilamida fue la posición de sus bandas; en la electroforesis por gel de
agarosa todas las bandas se encontraron en la misma posición y el mismo número
de bandas, por los resultados obtenidos se considera que es más conveniente la
utilización de los hidrolizados químicos y enzimáticos debido a la optimización en
tiempo en comparación con la hidrólisis mediante fermentación láctica.
INTRODUCCIÓN
Actualmente la industria pesquera en nuestro país y en particular en el estado de
Sonora es muy productiva. Con incrementos promedios por año del 12 % en la
producción camaronera, el camarón es considerado como una especie de alto
valor económico (Semarnap, 1996). El camarón es un organismo artrópodo el cual
se divide en tres regiones principales: cefalotórax, abdomen y telsón.
De la producción nacional de camarón, el 39% se distribuye en el mercado interno
y el 61% en el mercado internacional (La Economía mexicana en cifras, 1993). En
los últimos años los municipios costeros del sur de Sonora han generado 3100
toneladas de cabeza de camarón. Tomando en cuenta que solo el 50% de camarón
es comestible y el resto (cefalotórax) no lo es, convirtiéndose en contaminantes los
cuales son desechos sólidos depositados en basureros, rellenos sanitarios o tirados
directamente al mar. El cefalotórax o cabeza de camarón como es mejor conocido
tiene varios componentes como son; las proteínas, enzimas, pigmentos y quitina,
los cuales se pueden aprovechar.
De estos residuos podemos obtener productos de valor agregado como en el caso
de la proteína utilizada como suplementos alimenticios, tanto en animales como
en humanos. Las proteínas también cuentan con propiedades funcionales las
cuales pueden ser utilizadas en la industria alimentaría.
Considerando lo anterior es necesario dar un tratamiento a los desechos
desarrollando tecnologías que permitan la recuperación de los compuestos de
interés que están contenidos en el cefalotórax, como son las proteínas
caracterizándolas en base a su peso molecular y punto isoeléctrico.
Desde principios del presente siglo, muchos científicos se dedicaron a la creación
de técnicas para el estudio de proteínas. Se generaron métodos para separar
proteínas de mezclas por su aptitud de migrar en un campo eléctrico. Se crearon
las bases de lo que hoy se conoce de manera general como electroforesis de
proteínas.
En un inicio se utilizaron las técnicas en solución libre y más adelante se encontró
que éstas presentaban muchas desventajas, tanto en el procedimiento como en la
evaluación e interpretación de resultados. Se descubrió que la utilización de
soportes inertes por donde migran las proteínas, permitía obtener mejores
resultados y su interpretación no resultaba tan complicada. Estos fueron
cambiando a medida que se requería mejorar la técnica y resolución de la misma.
Uno de los soportes más recientes y versátiles usado en electroforesis es el gel, el
cual presenta características ideales para análisis de proteínas. Las más utilizadas
son las de agarosa y de poliacrilamida, donde éstos últimos han desplazado casi
por completo a todos los demás soportes.
JUSTIFICACIÓN
No se sabe que componentes se encuentran presentes en los diferentes extractos
hidrolizados de cabeza de camarón los cuales se pueden obtener por medio de una
hidrólisis química(QC), hidrólisis enzimática(EA) e hidrólisis de ensilado(EL); Por
lo que en este trabajo pretende caracterizar las proteínas extraídas de la cabeza de
camarón, basándose en sus propiedades como son peso molecular y punto
isoeléctrico. Con esta característica se le daría una mejor utilización a las proteínas
extraídas.
Tomando en cuenta que la cabeza de camarón es un producto de cierto valor
nutricional y puede ser aprovechado por las industrias alimenticias por sus
propiedades funcionales o como suplemento alimenticio para el mismo camarón,
es importante desarrollar tecnologías que permitan la recuperación de los
productos de interés contenidos en la cabeza de camarón. De esta formase
determinaría la factibilidad de las proteínas obtenidas, evitando un poco la
contaminación del ambiente y manteniendo así su equilibrio ecológico.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Caracterizar químicamente las proteínas que fueron extraídas por tres métodos
diferentes de hidrólisis (químico, enzimática y fermentación láctica), en base a su
peso molecular y su punto isoeléctrico.
OBJETIVOS PARTICULARES
= Establecer la técnica para la evaluación del peso molecular de las proteínas
extraídas de la cabeza de camarón con electroforesis en poliacrilamida.
= Estandarizar la técnica de electroforesis con agarosa, para determinar
puntos isoeléctricos de las proteínas extraídas de la cabeza de camarón.
HIPÓTESIS
La composición de las proteínas obtenidas de los extractos al aplicar los métodos de
hidrólisis química, enzimática y ensilado láctico, son diferentes.
1 I. MARCO DE REFERENCIA
1.1 CAMARÓN (Penaeus sp).
La literatura sobre los camarones peneidos se remonta al año de 1798, cuando
Fabricius publicó la descripción taxonómica de género Penaeus. Los camarones
peneidos son animales de aguas marinas. Se encuentran tanto en aguas someras
como en profundas, en regiones tropicales, subtropicales y templadas. La mayoría
de las especies comerciales son miembros de la subfamilia Penaeinae y viven en
aguas litorales.
Desde el punto de vista comercial los camarones del género Penaeus son
importantes debido a su gran tamaño y alto precio en el mercado. Las especies de
importancia comercial en México son, en el Atlántico: P.setiferus, y P. aztecus y en
el Pacífico: P. californiensis, P. stylirostris, P. vannamei y P. brevirostris (CICTUS,
1984).
2 1.1.1 Producción de camarón.
La industria pesquera en nuestro país y en particular en el Estado de Sonora es
muy productiva, con incrementos promedios por año del 12% en producción
camaronera, por lo que el camarón es considerado como una especie de alto valor
económico (Semarnap, 1996). Lo anterior hace ver la necesidad de implementar
métodos que hagan más rentable la operación de captura, cultivo e
industrialización del camarón.
De la producción nacional del camarón, el 39% se distribuye en el mercado
interno y el 61% en el internacional (La economía mexicana en cifras, 1993). La
superficie potencial disponible para la camaronicultura en México es
aproximadamente 335, 000 Has, distribuidas en ambos litorales; el Estado de
Sonora cuenta con 40,000 Has disponibles (Barrera, 1987).
El volumen de la producción de camarón en peso vivo (toneladas) por origen y
entidad federativa se muestra en la Tabla 1, según el anuario estadístico de pesca
de la SEMARNAP, 1999.
1.1.2 Composición química de los residuos del camarón.
Como ya se había visto sólo del 50-65 % del camarón es comestible, el resto es el
cefalotórax y es considerado como un desecho. Este cefalotórax contiene
aproximadamente un 50 % de proteína (ver Tabla 2), la cuál podría aprovecharse.
La mayor parte de la proteína se encuentran en la cabeza de camarón.
3 Tabla 1. Volumen de producción de camarón en peso desembarcado, por origen y
entidad federativa, 1999 (toneladas).
ORIGEN
LITORAL / ENTIDAD
TOTAL
TOTAL
78,234
CULTIVO ESTEROS Y ALTAMAR
BAHÍAS
28,288
22,314
27,632
LITORAL DEL PACÍFICO
BAJA CALIFORNIA
BAJA CALIFORNIA SUR
SONORA
SINALOA
NAYARIT
COLIMA
JALISCO
GUERRERO
OAXACA
CHIAPAS
60,499
535
458
21,183
25,251
6,51
220
9
66
2,438
3,824
26,901
48
38
12,496
12,680
1,474
63
1
101
16,388
308
1,351
5,904
4,074
23
7
19
1,916
2,785
17,210
486
313
7,335
6,667
967
134
48
522
938
LITORAL DEL GOLFO
Y CARIBE
TAMAULIPAS
VERACRUZ
TABASCO
CAMPECHE
YUCATÁN
QUINTANA ROO
17,735
9,822
1,950
403
4,063
1,030
466
1,387
368
11
1,008
-
5,926
4,392
1,241
276
17
-
10,422
5,062
709
127
4,052
5
466
Fuente: http: //www.semarnap.gob.mx:8891/estad/anua99/c98a04.htm
Tabla 2. Composición de los desechos de camarón, análisis de cabeza y cáscara.
% Proteína
%Grasa
Cabeza
53.5
8.9
11.1
Cáscara
22.8
0.4
27.2
Fuente: Meyers, 1986.
% Quitina % Cenizas
% Calcio
% Fósforo
22.6
7.2
1.68
31.7
11.1
3.16
4 1.1.3 Morfología.
Los camarones pertenecen a la clase de los crustáceos que son organismos
artrópodos mandibulados con apéndices birrameos articulados, con dos pares de
antenas y branquias. Una de las principales características de los crustáceos es la
presencia de un exoesqueleto de origen quitinoso, secretado por la epidermis, con
calcificación posteriores (CICTUS, 1984).
El camarón (Penaeus sp.) además cuenta con cinco pares de patas “caminadoras” y
cinco pares de patas “nadadoras”. En su exoesqueleto se observa más la
segmentación del cuerpo, el cual se divide en tres regiones principales: cabeza,
abdomen y telson o cola, como se observo en la Figura 1 (Ruello, 1976).
El cefalotórax o cabeza se encuentra localizado en la parte anterior del organismo
y contiene la mayor parte de los organismos vitales: rostro, anténulas, antenas
(órganos sensitivos), y aparato bucal. En el interior se encuentra la parte anterior y
media del aparato digestivo, hepatopáncreas, branquias y gónadas. En el exterior
se observan cinco pares de las patas que le sirven para caminar, llamadas
ambulacrales, caminadoras o periódopos (Soluap, 1998).
Abdomen, es la parte que se aprovecha para el consumo y está cubierta por un
caparazón duro que sirve de protección (Nickerson, 1978).
Telson (cola), le proporciona sentido de dirección al movimiento y también le sirve
para nadar a contracorriente (Nickerson, 1978).
5 Figura 1. El camarón y sus partes.
Fuente: Soluap, 1998.
6 1.1.4 Composición química
El camarón es muy nutritivo, en general su valor calórico es aproximadamente de
4.5 kJ/g y contiene entre 75 y 80 % de agua, 18-20 % de proteína y cerca de 1 %
de grasa (Tabla 3).
Tabla 3. Composición del camarón (100 g de porción comestible).
Componente
Cantidad
Agua (g)
78.2
Proteína (g)
18.1
Grasa (g)
0.8
Carbohidratos (g)
1.5
Calorías (cal)
91.0
Calcio (mg)
63.0
Fósforo (mg)
166.0
Hierro (mg)
1.60
Tiamina (mg)
0.02
Niacina (mg)
3.20
Riboflavina (mg)
0.03
Fuente: Charley, 1987.
1.2 PROTEÍNAS
Las proteínas son biomoléculas de alto peso molecular y están formadas por la
unión de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. Todas sus propiedades
7 nutritivas y sus características físicas y químicas dependen completamente del
tipo, de la concentración y de la secuencia de unión de los monómeros
constituyentes (Badui, 1996).
Por definición las proteínas son polímeros de un alto peso molecular, cuando se
solubilizan son de dimensiones coloidales, tienen propiedades anfotéricas, y su
hidrólisis completa produce una mezcla de aminoácidos. Estos aminoácidos son
ácidos orgánicos que contienen ya sea un grupo amino o uno imino en el átomo
del carbono alfa (Mertz, 1992).
Debido a que están constituidas de aminoácidos, las proteínas también desarrollan
una carga neta que depende de la influencia de los diferentes grupos R ionizables
(R-radicales alifáticos o aromáticos) y el pH al que se encuentren. Es decir, pueden
tener una carga positiva o negativa, o bien no tener carga cuando se llega a su
punto isoeléctrico (Badui, 1982).
Originalmente las proteínas se clasifican como globulares y fibrosas, de acuerdo
con su estructura física tridimensional; las primeras tienen forma casi esférica,
mientras que las segundas son cadenas largas lineales y muy rígidas.
Posteriormente, se descubrió que las proteínas globulares presentan diferentes
estados de ordenación dentro de su propia molécula. La destrucción de dicha
conformación de la proteína trae consigo la pérdida de su actividad.
Estructura primaria. Está determinada por la forma secuencial y ordenada que se
encuentran distribuidos los aminoácidos a lo largo de la cadena de la proteína y es
una propiedad altamente reproducible, controlada genéticamente y única para
cada fracción proteica.
Estructura secundaria. Se refiere a la ordenación regular y periódica del espacio de
las cadenas polipeptídicas a lo largo de una dirección, lo que es más evidente en
8 las proteínas fibrosas. Existen tres principales tipos de estructuras secundarias de
las proteínas: la alfa hélice, la conformación beta y la hélice de la colágena, pero
todas están estabilizadas por diferentes fuerzas, siendo las más importantes las
electrostáticas, los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrófobas y las
interacciones dipolo-dipolo.
Estructura terciaria. Se refiere al modo que la cadena polipeptídica se curva o se
pliega tridimensionalmente para producir una estructura estrechamente plegada
y compacta, característica de las proteínas globulares. A diferencia de las proteínas
fibrosas, que son moléculas lineales, las globulares tienen su cadena compacta con
un alto grado de organización y presentan uniones covalentes (disulfuroS-S),
hidrófilas, hidrófobas y también iónicas (Badui, 1993).
Estructura cuaternaria. A diferencia de las anteriores no necesariamente existen en
todos los polipéptidos y se refiere a la asociación de dos o más cadenas (iguales o
diferentes) a través de uniones no covalentes; Pone de manifiesto la disposición en
el espacio de las proteínas compuestas por más de una fracción (Badui, 1993).
1.2.1 Clasificación.
Existen varios métodos de clasificación de las proteínas, los principales están
basados en la composición, la forma, la solubilidad y la función biológica de estos
biopolímeros. En general los criterios más comunes para clasificarlas se refieren a
su composición y a su solubilidad.
Las proteínas simples son aquellas que están compuestas exclusivamente de
aminoácidos, mientras que las conjugadas contienen además un grupo no
proteico, como se muestra en la Tabla 4(Badui, 1993).
9 Tabla 4. Clasificación de proteínas de acuerdo con su composición, forma,
solubilidad y función biológica.
Clasificación
Propiedades
A. Por composición
1. Simple
Contiene solo aminoácidos
2. Conjugado
Contiene una fracción no proteica
a) Metaloproteína
Pigmentos
b) Glucoproteína
Contiene hidratos de carbono
c) Fosfoproteína
Contiene fósforo
d)Lipoproteína
Contiene lípidos
e) Nucleoproteínas
Contiene ácidos nucleicos
B. Por su forma
1.
Globular
Esférica u ovoides
2.
Fibrosa
Forman fibras de tejido conectivo, de ligamentos y
tendones. Pelo, lana, uñas, cuernos. Proteína
muscular. Responsable de la coagulación de la
sangre.
C. Por solubilidad
1.
Albúminas
Solubles en agua y en soluciones salinas diluidas
2.
Globulinas
Poco solubles en agua, solubles en soluciones salinas
3.
Histonas
Alto contenido de aminoácidos básicos
No coagulan por calor
4.
Glutelinas
Insolubles en agua y en alcohol
Solubles en álcalis y ácidos débiles
5.
Prolaminas
Solubles al 70% de alcohol
6.
Escleroproteínas
Insolubles en la mayoría de los disolventes
D. Por función biológica
1.
Estructurales
Forman parte estructural de cuerpo
2.
Enzimas
Catalina reacciones biológicas
3.
Hormonas
Mensajeros químicos
4.
Toxinas
Proteínas dañinas, generadas por microorganismos
5.
Anticuerpos
Proteínas protectoras elaboradas por el organismo
6.
Transporte de O2
Transporta O2 de los pulmones a los tejidos
Almacén de O2 en el músculo
Fuente: Badui, 1996.
10 1.2.2 Proteínas de productos marinos.
Los pescados crudos y los invertebrados marinos tienen proteínas de excelente
calidad nutricional; su alto valor nutritivo ha sido confirmado en experimentos
biológicos. La digestibilidad in vivo de las proteínas de pescado crudo esta en el
rango de 90% a 98%, y la de los crustáceos es de alrededor del 85% (Zdzislaw,
1990).
1.2.3 Composición de aminoácidos.
La composición de aminoácidos de las proteínas se establece, después de la
hidrólisis de los enlaces peptídicos, mediante el análisis de aminoácidos liberados
(Cheftel, 1989).
Ningún procedimiento hidroliza completamente a las proteínas en sus
aminoácidos constituyentes sin la pérdida parcial de alguno de ellos. Por lo general
el método que se elige es la hidrólisis con HCl 6N a 110ºC en tubo sellado al vacío,
durante 24 a 96 horas (Murray, 1988).
En la Tabla 5 se muestra la composición en aminoácidos promedio de los
productos marinos y en la Tabla 6 se indica la composición en aminoácidos
esenciales del cefalotórax de camarón.
11 Tabla 5. Composición de aminoácidos de las proteínas de los productos marinos.
Aminoácido
Media (%) Rango(%)
Alanina
7.91
7.7-8.8
Arginina
5.95
5.7-6.3
Ácido aspartico
10.34
9.9-10.9
Sistina
1.04
0.9-1.1
Ácido glutámico
14.91
14.3-15.4
Glicina
4.6
4.2-5.4
Histidina
2.01
1.8-2.2
Isoleucina
6.03
5.5-6.3
Leucina
8.41
7.8-9.1
Lysina
8.81
7.9-9.5
Methionina
2.97
2.8-3.2
Fenilalanina
3.92
3.7-4.1
Prolina
3.52
3.3-3.7
Serina
5.14
4.6-6.0
Treonina
4.62
4.4-5.0
Triptófano
0.96
0.9-1.0
Tirosina
3.27
3.1-3.4
Valina
5.95
5.6-6.2
Fuente: Braekkan, 1962
Tabla 6. Perfil de aminoácidos de las proteínas de cefalotórax de camarón.
Aminoácido
Arginina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lysina
Methionina
Fenilalanina
Treonina
Triptófano
Valina
Cantidad
6.13
2.24
5.78
7.01
6.58
2.24
5.13
4.14
1.19
5.95
g/100g de proteína
Fuente: Shahidi, 1997.
12 1.2.4 Propiedades funcionales.
Las proteínas no sólo son fuente de aminoácidos sino que, debido a su naturaleza
polimérica, su presencia influye decididamente en las características reológicas y
de textura del alimento que hacen que este sea más aceptado por el consumidor.
Las propiedades funcionales se definen como cualquier propiedad fisicoquímica de
los polímeros que afectan y modifican alguna característica de los alimentos y
contribuye a la calidad final del producto, como se muestra en la Tabla 7 (Badui,
1996).
Las proteínas y específicamente las de origen animal, presentan diversas
propiedades fisicoquímicas y mecánicas como solubilidad, plasticidad, carácter
ligante y emulsificante, Es necesario dominar estas propiedades para poder
controlar las características de los sistemas alimentarios durante la transformación
y las propiedades mecánicas de los productos obtenidos. Por lo tanto las proteínas
serán valoradas en el mercado, basándose en sus propiedades funcionales
(Bourgeois, 1986).
13 Tabla 7. Propiedades funcionales de las proteínas empleadas en alimentos.
PROPIEDAD
Hidratación
FUNCIÓN
Solubilidad, dispersión, absorción de agua, espesante,
gelificante,
viscosidad,
formación
de
masa
y
propiedades reológicas en general.
Estructural y reológica
Elasticidad,
cohesión,
formación
de
redes
tridimensionales, formación de fibras, viscosidad,
agregación, gelificación.
Sensorial
Color, sabor, olor, textura, turbidez, arenosidad, etc.
Superficie
Emulsificación, espumante, estabilización, formación
de complejos lípido proteicos.
Otras
Compatibilidad con aditivos, acción enzimática y
modificación de propiedades de alimentos.
Fuente: Badui, 1996.
1.3 HIDROLIZADOS DE PROTEÍNAS.
DEFINICIÓN
Es un producto obtenido por la hidrólisis (química o enzimática) de las
proteínas de la materia prima, por acción de un agente preexistente o adicionado
(Bourgeois, 1986).
Durante el proceso de hidrólisis de una proteína hay liberación o captura de
protones H+ (Sorensen, 1908). Durante el proceso de reacción proteolítica, el pH
cambiará, excepto en la región de 5.0-6.0 donde la captura y liberación de
protones está en equilibrio. A pH menor a 3.1 –3.6, el grupo carboxílico estará
14 más del cincuenta por ciento disociado y el grupo amino completamente
protonado; Presentándose una captura de 0.5 a1.0 equivalentes de H+ por cada
equivalente de enlaces peptídicos rotos, manifestándose un rápido incremento de
pH si éste no es controlado (Steinhardt y Beychok, 1964).
1.3.1 Métodos de obtención.
Hidrólisis Química
Esta se da por la acción de agentes químicos, generalmente inorgánicos. Las
condiciones de proceso son drásticas: temperatura de 100 ºC y altas presiones.
Puede ser realizada por condiciones ácidas o básicas:
Hidrólisis ácida.
En la hidrólisis ácida el uso del ácido clorhídrico tiene la ventaja, después de la
neutralización con sosa, de producir cloruro de sodio que es importante
conservador para el producto. La hidrólisis ácida tiene el inconveniente de
descomponer en forma parcial algunos aminoácidos y destruir por completo al
triptofano. Es necesario suplementar al hidrolizado con estos aminoácidos
(Bourgeois, 1986).
Hidrólisis alcalina.
La hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio provoca la destrucción de la cisteína,
cistina, arginina y metionina. También produce una racemización de aminoácidos,
con lo que se reduce el valor alimenticio del
producto, por que sólo los L-
aminoácidos son asimilables. La hidrólisis moderada produce un hidrolizado que
15 contiene aún una porción importante (50%) de proteínas de alto peso molecular
(Bourgeois, 1986).
1.3.2 Hidrólisis enzimática.
Las enzimas son catalizadores de origen proteico producidas por organismos vivos.
Tres son las principales características que hacen notables a las enzimas sobre
otros catalizadores: el poder catalítico, su especificidad y la capacidad para regular
su capacidad catalítica por una variedad de compuestos naturales (Rodríguez,
1999).
Las proteínas vegetales, las del pescado y las desnaturalizadas por el calor o por los
disolventes, pueden solubilizarse mediante una proteólisis parcial, con enzimas
como la papaína, la bromelina, la pepsina o proteasas de diversa especies de los
géneros Aspergillus, Bacillus, o Streptomyces. La proteolisis parcial puede así,
facilitar la extracción y purificación de proteínas a partir de diversas fuentes
(Fennema, 1993).
1.3.3. ENSILADO
Este es el proceso de preservación de materiales mediante el uso de ácidos que
previenen el crecimiento de microorganismos que producen putrefacción. Ha sido
aplicado a los desechos de pescado por muchos años y durante el proceso las
enzimas presentes de manera natural en las vísceras digieren las proteínas,
resultando un producto líquido que puede ser usado en la alimentación animal. El
ácido puede ser agregado o generado in situ por fermentación bacteriana (Hall,
1994).
16 Fermentación láctica
La fermentación ácido láctica es uno de los métodos ancestrales para preservar
alimentos; por medio de ésta también se logran mejoras de las propiedades
sensoriales y nutricionales. Las fermentaciones lácticas son aquellas en las que el
ácido es producido in situ por bacterias lácticas a partir de una fuente de
carbohidratos. Los microorganismos responsables pueden pertenecer a la
microflora natural o ser cultivos iniciadores (Frazier, 1993).
Las condiciones para que se desarrolle con seguridad la fermentación láctica
dependen sobre todo de la rapidez de crecimiento y producción de ácido por parte
de la bacteria láctica y la supresión, por la disminución del pH u otros factores
antimicrobianos, de microorganismos competitivos. La mayor influencia en el
crecimiento de bacterias lácticas y la velocidad con la cual decrece el pH de la
fermentación son debidos a: (i) disponibilidad de carbohidratos fermentables; (ii)
disponibilidad de factores orgánicos de crecimiento; (iii) anaerobiosis; (iv)
temperatura; (v) concentración de cloruro de sodio; (vi) concentración de ácidos
orgánicos y valor de pH; (vii) concentración de bióxido de carbono; (viii)
producción de otros compuestos inhibitorios; (ix) capacidad de amortiguamiento
del sustrato; (x) cantidad inicial de bacterias lácticas; y (xi) cantidad inicial de
microorganismos competidores (Owens, 1985).
17 1.4 PRINCIPIOS BÁSICOS DE ELECTROFORESIS.
1.4.1 Definición.
La electroforesis de manera sencilla puede definirse como la migración de una
partícula cargada bajo una influencia (Andews, 1986).
La electroforesis consiste en mover partículas cargadas (iones) dentro de un campo
eléctrico. El desplazamiento ocurre por medio de un líquido sostenido por una
sustancia sólida inerte, por ejemplo un papel o un gel (Bohinski, 1973).
Electroforesis se refiere al movimiento de las partículas cargadas contenidas en un
medio, debido a la influencia de un campo eléctrico; ésta constituye una técnica
más poderosa para la purificación de las moléculas biológicas. En la separación de
proteínas por medio de un campo eléctrico, la carga y naturaleza anfotérica de esa
juega un papel fundamental (Tejeda, 1995).
Electroforesis es el trasporte de partículas a través de un disolvente mediante un
campo eléctrico (Freifelder, 1991).
Principios físicos
Cuando una molécula es colocada en un campo eléctrico, una fuerza es ejercitada
en ella, que depende tanto de la intensidad del campo eléctrico como además de la
carga de esta molécula (Cooper, 1977: Freifelder, 1976). La ecuación matemática
usada para expresar ese fenómeno es:
F=(E/d)(q)
Donde F es la fuerza, E la diferencia de potencial entre electrodos (campo
eléctrico), d es la distancia entre electrodos, e/d es la intensidad del campo y q es
la carga neta de la molécula.
18 Si la molécula o partícula con carga q es colocada en un campo eléctrico E, se
moverá con una velocidad constante v, que esta determinada por el balance
eléctrico Eq y la resistencia al avance por viscosidad fv. La ecuación que representa
este fenómeno es:
Eq=fv
Donde Eq es la fuerza eléctrica, f es el coeficiente de fricción de la molécula (una
función de los parámetros físicos de la molécula), v es la velocidad de carga y fv la
resistencia al avance por viscosidad.
Usando estas ecuaciones es posible determinar la movilidad μ característica de una
molécula definida, que es su velocidad por campo eléctrico externo conocido:
Movilidad = μ= v/E=q/f
1.4.2. Los Parámetros eléctricos
Lo fundamental de electroforesis es el voltaje aplicado al sistema. La velocidad de
una moléculas es directamente proporcional al gradiente de voltaje circundante.
Dos ecuaciones eléctricas básicas son importantes en la electroforesis.
La ley de Ohm’s
V = IR
ó
I = V/R
La ley de Ohm’s relaciona el voltaje moderado en los voltios (V), actual (I)
moderado en los amperios (UN), y resistente (R) midió en los ohms (Ω).
La ecuación de poder describe la cantidad de calor que se produce en un circuito:
P=VI
ó
P=I2R
ó P=V2/R
19 Donde P es poder, que es moderado en watts (W). En el circuito de electroforesis,
el voltaje y corriente son proporcionadas por un poder de suministro (DC);
electrodos, conductores, buffer y gel actúan como
resistencias simples. La
resistencia de Buffer baja cuando la temperatura aumenta, la resistencia en las
cargas son discontinuas cuando aumenta el calor en los iones.
1.4.3 Electroforesis como método analítico de proteínas.
Puesto que las proteínas poseen una carga neta a cualquier pH distinta al de su
punto isoeléctrico (pI), ellas también pueden migrar y su velocidad de migración
va a depender de sus densidades de carga;
a mayor densidad
de carga, la
molécula migra muy rápido.
La aplicación de un campo eléctrico a una mezcla de proteínas provocará que esta
migre a distintas velocidades hacia uno u otro de los electrodos, dependiendo de su
carga neta, lo que provocara que se separen una de otra. En la Tabla 8 se muestran
los pesos moleculares aproximados de algunas proteínas.
Tabla 8. Las normas de la proteína con el peso molecular aproximado.
Proteínas
Aprotinin, Bovine Lung
α-Lactalbumin, bovine milk
Trypsin inhibitor, soybean
Trypsinogen, bovine pancreas
Carbonic anhydrase
Glyceraldehyde-3-dehydrogenase
Albumin, egg
Albumin, bovine
Phosphorylase b, rabbit muscle
β- Galactosidase, E.Coli
Myosin, rabbit muscle
Fuente: Navarrete del toro
MOL. WT
6,500
14,200
20,000
24,000
29,000
36,000
45,000
66,000
97,000
116,000
205,000
20 Una proteína con una carga eléctrica positiva, se desplaza hacia el cátodo con
carga negativa; por el contrario se posee una carga eléctrica negativa, se desplaza
el ánodo positivo. Si el pH de la solución coincide con el pI de la proteína, no
tendrá carga eléctrica y no se desplazara hacia ninguno de los eléctrodos. Esto es la
migración electroforética de las proteínas.
Si una mezcla de dos o más proteínas cuyos pI sean diferentes se disuelven en un
medio de determinado pH; Las diferencias entre éste y el pI de cada proteína serán
distintos y por ello su valor de carga neta y su velocidad de migración en el campo
eléctrico serán también distintos. Este fenómeno constituye el fraccionamiento
electroforético, o sea la separación de los componentes de una mezcla de proteínas
(Blanco, 1990, Hames y Rickwood,1990).
1.4.4 Punto isoeléctrico en electroforesis (IEF).
Las moléculas compuestas de aminoácidos anfotericos. La natural anfotericidad
de las proteínas les permite actuar como un ácido o una base. Debido a sus grupos
ionizables carboxilo, amino y otros, los aminoácidos son capaces de desarrollar
una carga (+) o (-) de acuerdo con el pH al que se encuentren; es decir, su
carácter anfotérico les confiere la capacidad de recibir y de donar electrones; Esta
situación hace que exista un estado químico conocido como punto isoeléctrico (pI)
o de doble ion, en el que se cuenta con el mismo número de cargas positivas y
negativas y cuya carga neta es cero. Los aminoácidos pueden tener, tres estados
que dependen del pH: A PH<pI se encuentra en forma protonada o catiónica; En el
pI su carga cero, y a pH>pI adquiere una carga negativa o aniónica. Es decir no
existe un pH en el cual estos anfolitos estén completamente ausentes de cargas
21 eléctricas, ya que las presentan aún el pI. En cualquiera de sus tres estados pueden
ligar iones de carga contraria por fuerzas electrostáticas débiles (Badui, 1996).
Puesto que las diferentes proteínas poseen valor de punto isoeléctrico diferente,
también son diferentes debido a que difieren en el contenido de aminoácidos con
grupos R ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras mediante
precipitación isoeléctrica (Lehninger, 1990)
1.4.5 La matriz.
Pueden entallarse los geles para cribar moléculas de una gama amplia de tamaños
por la opción apropiada de la concentración de la matriz. Entre estos geles se
encuentran el gel de agarosa y de poliacrilamida.
1.4.5.1 Gel de agarosa.
El gel de agarosa es un polímero lineal natural de los polisacáridos galactosa y 3,6
anhidrogalactosa. El material deriva del agar de alga Gelidium amansii
(Bender,1992).
Agarosa es un polisacárido muy purificado derivado del agar. Los poros de un gel
de agarosa son grandes. La agarosa es utilizada para separar las macromoléculas
como los ácidos nucleicos (50 a 30000 pares de bases), proteínas de gran tamaño
y proteínas complejas (Navarrete del Toro).
Esta característica del poro es suficiente para no retener a la mayoría de las
moléculas proteicas que migran, por lo que su separación dependerá
fundamentalmente de la carga neta de éstas, o sea, se utiliza principalmente en los
sistemas de separación en estado nativo.
22 La agarosa, que viene en forma de polvo, es soluble en agua, más aún cuando esta
hervida y caliente. Esta permanece en estado líquido hasta que la temperatura
disminuye a cerca de 40ºC, que es el punto donde gelifica (Hoefer 1994).
En la Figura 2 mostramos la estructura química de la agarosa y la estructura de la
polimerización del gel.
El tamaño del poro y las características de criba de una gel son determinadas
ajustando la concentración de agarosa en el gel. Entre mayor sea la concentración
es más pequeño el tamaño del poro. El rango de la concentración es 0.4% un 4.0%
(W/V). El gel del agarosa es frágil y debe manejarse cuidadosamente. Un gel de
agarosa debe ocuparse siempre con algunos apoyos para que el gel permanezca
entero, ya sea una bandeja o una espátula ancha (Navarrete del Toro).
23 Figura 2: Estructura química de la agarosa y la estructura de la polimerización del
gel. (Hoefer, 1994).
24 1.4.5.2 Gel de poliacrilamida.
Los geles de Poliacrilamida son físicamente más duros que los geles de agarosa.
Además su estructura química es más compleja, así como lo son también su
preparación y uso (Hoefer, 1994).
Estos geles se obtienen por la polimerización del monómero acrilamida (CH2=CHCO-NH2)
y
N,N-metilenbisacarilamida
(CH2=
CH-CO-NH-CH2-NH-CO-
CH=CH2), también llamada bisacilamida o BIS para abreviar. Este ultimo
compuesto esta formado de cadenas cruzadas (Bender, 1992; Hames y Rickwood,
1990).
La polimerización de acrilamida se lleva a cabo por vía química, debido a que esta
necesita de un
iniciador del proceso, y el más comúnmente utilizado es le
persulfato de amonio (APS). Se añade además un acelerador como N, N, N`, N`tetrametilendiamina (TEMED). El sistema APS-TEMED, cataliza la formación de
radicales libres persulfatos lo que en definitiva inicia la polimerización (Dunbar,
1987).
En la formación del gel, monómeros de acrilamida se polimerizan en largas
cadenas que están enlazadas covalentemente por el BIS; éste es el que mantiene
junta la estructura. La estructura química del gel de poliacriamida se observa en la
Figura 3 (Hoefer, 1994).
25 NH2
|
CO
|
-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CHξ
|
ξ
ξ
CO
CO
CO
CO
ξ
|
ξ
ξ
NH2
NH
NH
NH
|
ξ
ξ
|
CH2
|
NH
NH2
NH
|
|
|
CO
CO
CO
|
|
|
-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH|
ξ
CO
CO
ξ
|
NH2
NH
|
CH2
|
|
|
NH2
NH
NH2
NH
NH
|
|
|
|
|
CO
CO
CO
CO
CO
|
|
|
|
|
-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CHξ
ξ
CO
CO
ξ
ξ
NH
NH2
ξ
Figura 3: Estructura química del gel de poliacrilamida. (Hoefer, 1994)
26 En los geles de poliacrilamida pueden conseguirse poros de diferentes diámetros
según las condiciones de polimerización; como consecuencia, para un gel de
determinado poro, el tamaño molecular y la carga neta serán los factores
determinantes de la separación de la molécula de una mezcla.
El poro de gel formado dependerá de las concentraciones de acrilamida y BIS
durante la polimerización. El tamaño de éste decrece a medida que la
concentración de acrilamida total aumenta. Para una determinada concentración
de acrilamida monomérica, el tamaño del poro dependerá del entrecruzamiento
producido.
La acción de tamizado del gel de poliacrilamida se observa en la Figura 4 y se da
por la red tridimensional de fibras y poros que se forman por la interacción y
entrecruzamiento del BIS y las cadenas de acrilamida (Deutscher, 1990).
Los patrones de proteína son separados por electroforesis en geles con 5 a 15% de
entrecruzamiento de porosidad variable (Murray, Granner, otros, 1988).
La aplicación más común de esta técnica es la determinación de peso molecular de
los protómeros después de la desnaturalización del oligómero y separando en geles
que contienen el detergente iónico dodecilsulfato sódico (SDS) (Murray, Granner,
otros, 1988)
27 Mezcla de
macromoléculas
Gel poroso
Electroforesis
Figura 4: Acción de tamizado del gel poliacrilamida (Lubert, 1993).
28 La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una poderosa herramienta a la
que el bioquímico recurre para efectuar separaciones, aislamientos, evaluaciones
de pureza y cuantificaciones del peso molecular. Es posible fraguar una matriz
uniforme de gel de poliacrilamida (no en forma de grumos) moldeándola, ya sea
como una delgada capa entre dos vidrios o como un cilindro o barrera dentro de
un tubo. La estructura química de la poliacrilamida forma una trampa porosa, a
través de la cual se mueven las partículas cargadas con velocidad proporcional a
sus propios valores.
Las ventajas de la PAGE son su facilidad y rapidez de operación, la alta precisión
de su detecciones, el hecho de que no daña sustancias tan delicadas como las
proteínas y los ácidos nucleicos, y que permiten separar los componentes
individuales de mezclas complejas (Bohinski, 1973).
Los geles de poliacrilamida han remplazado a los de almidón por su mejor efecto
como matriz molecular y por proporcionar el control del tamaño de sus poros
utilizando concentraciones distintas de los monómeros de partida, a demás de
presentar una adsorción despreciable de material proteico. La poliacrilamida es
comúntemente el medio de soporte más efectivo para la electroforesis de proteínas
(Freifelder, 1991). Sin embargo, el manejo de geles de poliacrilamida conlleva
cierta precaución: ya que es neurotóxico y debe manejarse con el cuidado las
soluciones.
29 II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO.
El presente trabajo se realizó en los laboratorios de ecodesarrollo de la Unidad
Obregón del Instituto Tecnológico de Sonora.
2.2 MATERIAL BIOLÓGICO.
Como material biológico se empleó extracto de proteína de la cabeza de camarón
de bahía que se recolectó en el campo pesquero del Paredón Colorado, Sonora, el
cual fue transportado en hielo para finalmente ser congelado a –20ºC hasta su
utilización.
30 2.3 DESCRIPCIÓN DE EQUIPOS Y REACTIVOS.
2.3.1 Determinación de proteína.
El contenido de proteína y su concentración, fue cuantificada empleando el método
descrito por Bradford (1976) utilizando seroalbumina bovina (BSA, por sus siglas
en ingles), a una concentración 1mg/1ml. La curva estándar se elaboró con 0, 1, 3, 5,
7, 9 y10 mg de BSA. La mezcla de reacción contenía la muestra del hidrolizado de
proteína extraído de cabeza de camarón de bahía (EA, E L, Q C) aplicando 3 μl en
cada tubo y adicionando 5 ml de reactivo Bradford, después se agitó para mezclar
perfectamente y se esperaron 2 minutos para leer la absorbancia en el
espectrofotómetro, antes de 1 hora de reacción.
La absorbancia del complejo colorido fue registrada a 595 nm, en el rango visible.
La concentración de proteína en cada muestra fue calculada interpolando los valores
de absorbancia en la curva estándar y fueron expresados en mg/ml de proteína.
2.3.2 Preparación de los hidrolizados de proteínas.
1. Tomar 2 ml de muestra y colocarlas en un tubo de ensaye.
2. Ajustar el pH con NaOH 10 N hasta 6.7.
3. Agitar y se toma una alícuota de 1 ml.
4. Sé centrífuga, 5ºC, 10000 hertz por 5 min.
5. Se toma la alícuota del sobrenadante 100 Ml y se le agrega 10 Ml de Buffer
de muestra.
31 Buffer de muestra: 2x sample buffer (0.125 M Tris, HCl, 4%, SDS 20%v/v
glycerol, 0.02% azul de bromofenol, pH 6.8)
2.4 METODOLOGÍA.
2.4.1 Electroforesis SDS –Poliacrilamida (SDS - page).
Preparando y vertiendo la solución del monómero.
(es usada con agua destilada y se filtra todas las soluciones)
La solución de Monómero (30.8%T, 2.7%Cbis)
Los geles de Poliacrilamida son descritos por la referencia a dos características:
1) La concentración del monómero total, (T%)
%T = (g Acrilamida + g Bis - Acrilamida / el volumen Total) x100
2) La concentración de monómeros de crosslinking, (C%).
%C=g Bis –Acrylamide / (g Acrylamide + g Bis - Acrylamide) x100
60.0g de acrilamida (FW 71.08)
1.6 g de bisacrylamide (FW 154.2)
H2O a 200ml
Almacene a 3 meses a 4ºC en refrigeración.
Gel buffer de corrida (1.5 tris de M - HCl, pH 8.8)
32 54.4 g Tris base (FW 121.1)
Agregue 150 ml H2O
Ajustar a pH 8.8 con HCl
Ajustar a 300 ml con agua y almacene a 3 meses a 4ºC en refrigeración
Gel buffer de concentración (0.5 M Tris - HCl, pH 6.8)
6.0 g Tris basan (FW 121.1)
Agregue 60 ml H2 O ajustar a pH 6.8 con HCl
Ajustar a 100 ml con el agua y almacene a 3 meses a las 4ºC en refrigeración.
10% SDS ( dodecylsulfate de sodio)
10g SDS
H2O a 100ml
Almacene a 6 meses a la temperatura de 25-26ºC.
10% Persulfato de amonio (Iniciador)
0.1g Amonio persulphate
H 2 O a 1.0 ml
Haga las alícuotas y guarde a –4ºC
33 TEMED (N,N,N',N ', - TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE)
Manténgalo en su lugar en botella ámbar y en ambiente.
El Gel de separación
1. En un vaso de precipitado de 20 ml, mezcle la solución listada en la Tabla
9.
Tabla 9. SDS – PAGE.
Substance
Agua destilada
Separating gel (ml)
Staking gel (ml)
6.6
6.8
5
0.0
0.0
1.25
8
1.7
SDS 10%
0.2
0.1
APS 10%
0.2
0.1
TEMED
0.008
0.01
20
10
Gel buffer de corrida
Gel buffer de concentración
Acrilamida
Total monómero
2. Agregar 20 ml de la solución ( gel de separación) en medio de la placa
formando el sandwich Figura 5.
34 Figura 5. Placas de vidrio formando un sandwich agregándole el gel de
poliacrilamida
3. Tomar
0.5 ml de alcohol isopropílico y colocar sobre el gel que se
encuentra entre las placas de vidrio.
4. El gel debe ser totalmente polimerizado después de 1-2 horas.
5. Después de la polimerización, con sanitas retirar el alcohol isopropílico.
Gel concentrador
6. En un vaso de precipitados de 20 ml, mezcle la solución listada en la tabla
9.
7. Agregar la solución de gel apilando e inserta un peine en el sandwich.
Tener cuidado para no entrampar ninguna burbuja debajo de los dientes
del peine.
8. Esperar a polimerizar por lo menos 60 minutos.
9. Colocar las placas en una cámara de electroforesis vertical, retirar el peine
y el separador de la parte inferior y agregar la solución Buffer del
electrodo. Ver Figura6.
35 Figura 6. Cámara de electroforesis
El Buffer del electrodo 5X(0.025 M Tris, 0.192 Glicina de M, 0.1% SDS, pH
8.3)
30.28 g de Tris (FW 121.1)
144.13 g de Glicina
10g SDS
Aforar con H2O destilada hasta 2 Lit.
10. Colocar las muestras en los pozos:
TABLA 10. Cantidad de muestra por pozos.
MUESTRA
CANTIDAD (μl)
EA
50
EL
50
QC
50
36 11. Se le dan las condiciones de corrimiento set= 0100vts, 50 mA, 8Wts. por
4:30 hrs.
12. Se retira el gel de las placas y se pone a colorear por un tiempo 2-3 hrs. con
solución de stok.
solución de Stok.
La solución stok (0.05% Coomassie Brillant azulan, 40% metanol, 7% acético
ácido)
0.5 g azul coomassie brillante R
400ml metanol, disolver por 2 horas con agitación.
Entonces agregue:
70 ml el ácido acético
H2O a 1000 ml
13. Decolorar con la solución desteñidora I por 12 hrs. y con la II por 3-4 hrs.
Solución Desteñidora I
40 % metanol
7% ácido acético
Solución Desteñidora II
7% ácido acético
5% metanol
14. Secar el gel y observar los corrimientos, comparar con la muestra de pesos
moleculares.
37 2.4.2 Electroforesis con gel de agarosa.
1.
Pesar 0.32 gr. de agarosa IEF depositar en un vaso de precipitados.
2.
Pesar 4 gr. de sorbitol se mezcla en el vaso que contiene la agarosa.
3.
Se agregan 38 ml de agua bidestilada.
4.
Poner a hervir por 2 min. A 90ºC.
5.
Retirar del calor y esperar a que baje a 75ºC la temperatura.
6.
Agregar 1.5 ml de anfolito y mezclar bien
7.
Tomar la solución con una jeringa de 20 ml y poner en el sanwich de las
placas previamente preparadas.
8.
Esperar a que solidifique y retirar las placas de vidrio para obtener la placa
de gel de agarosa.
9.
Colocar la
placa de gel en la cámara horizontal de electroforesis 30
minutos a 1400 V, 30 mA, 8 Wtts. Junto con las bandas de papel filtro
sumergidas una en ácido acético 0.25M esta tira se coloca en ánodo (+),
otra es sumergida en NaOH 0.25M y es colocada en el cátodo (-), ver
Figura 7.
Figura 7. Cámara de electroforesis para geles de agarosa con el gel y las bandas de
papel filtro sumergidas una en ácido acético y NaOH.
10.
Encender la carga de refrigeración a 4ºC, ver Figura 8.
38 Figura 8. Refrigerante para equipo de electroforesis en gel de agarosa.
11.
Transcurridos los 30 min. Se coloca el portamuestras y las muestras ya
preparadas se corre 1 ½ hrs. A 1500vts, 30MA, 8 Wts.
12.
Retirar el gel de agarosa.
13.
Se fija por 30min.
Solución fijadora
5% ácido sulfosalicilico.
10% ácido tricloroacetico.
Agua destilada 850ml.
14.
El gel es lavado en dos ocasiones con la solución desteñidora durante 15 min.
Cada vez.
La composición de la solución decolorante es:
35% metanol
10% ácido acético
agua destilada.
39 15.
El gel es secado completamente en un horno a 80 ºC de 30-40 min.
16.
Después del secado se pone con la solución colorante de 5-10 min.
Solución colorante:
0.2% de azul de comassie R250.
Disuelto en la solución decolorante.
17.
Después se coloca en la solución decolorante de 15-30 minutos hasta que
desaparezca el color del fondo del gel.
18.
Por último secarlo de nuevo.
40 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A continuación se presentan los resultados de las corridas electroforéticas
realizados a los extractos hidrolizados de cabeza de camarón, así como la
interpretación de los mismos.
3.1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.
En la Tabla 11 se muestran los valores de proteína soluble de los extractos
hidrolizados de cabeza de camarón de bahía.
Tabla 11. Contenido de proteína del extracto hidrolizado de cabeza de camarón de
bahía.
Muestra
Proteína soluble (mg/ml).
EA
4.58
EL
4.58
QC
4.58
41 Los contenidos de proteína presentan un promedio 4.58 mg/ml de los extractos
hidrolizados. Se considera que no hay variación en la forma de extracción de la
muestra, ya sea una extracción por hidrólisis química, enzimática o ensilado por
fermentación láctica. Debido a que tienen el mismo contenido de proteína.
3.1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida.
A continuación se muestran las placas de gel de poliacrilamida (Figura 9 y 10)con
los pesos moleculares de proteínas presentes determinados por electroforesis,
empleando geles del 12% de poliacrilamida de 0.75 mm de espesor en los cuales se
utilizaron marcadores de bajo peso molecular de SIGMA.
Las placas de gel de poliacrilamida realizadas a los extractos hidrolizados de
cabeza de camarón mostraron zonas azules sobre un fondo azul un poco más claro
del gel entre 66,000 y 20,000 Da, lo que presenta zonas de peso molecular. En
esta placa se puede observar que la diferencia en la extracción de los hidrolizados
es que la EA tiene proteínas de 36, 000 Da mientas que en EL y QC no se
encuentra presente tomando en cuenta que la EA no contiene la proteína de peso
molecular de 29,000Da y EL y QC si la contienen.
42 Da
PM
EA
EL
QC
EA
EL
QC
66,000
45,000
36,000
29,000
24,000
20,000
14,200
Figura 9. Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una
placa de gel de poliacrilamida con el marcador de pesos moleculares.
43 Da
PM
EA
EL
QC
EA
EL
QC
66,000
45,000
36,000
29,000
24,000
20,000
14,200
Figura 10. Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una
placa de gel de poliacrilamida con el marcador de pesos moleculares.
44 3.1.2 Electroforesis en gel de agarosa.
La proteínas también pueden separarse electroforéticamente según sus contenidos
relativos en aminoácidos ácidos o básicos. En las Figuras 11 y 12 se muestran las
placas con gel de agarosa en el cual se utilizaron anfolitos de un rango de pH 103 y también un marcador de bajo peso molecular de SIGMA.
En las placas de gel de agarosa se puede observar que el marcador de peso
molecular va del rango de pH 9.6 – 4.1. En los extractos de hidrolizados de cabeza
de camarón no se encuentra diferencia alguna en cuanto a su punto isoeléctrico
puesto que los extractos hidrolizados EA, EL, QC presentan las mismas bandas en
todas las extracciones.
PH
PM EA
EL
QC
9.6
9.4
8.6
8.0
7.4
7.0
6.1
4.1
Figura 11. Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una
placa de gel de agarosa.
45 pH
PM
EA
EL
QC
9.6
9.4
8.6
8.0
7.4
7.0
6.1
4.1
Figura 12. Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una
placa de gel de agarosa.
46 CONCLUSIÓN
= En los extractos hidrolizados de cabeza de camarón no existe diferencia en
cuanto a contenido de proteína puesto que contienen la misma cantidad de
proteína.
= En la determinación de bandas en las placas de gel de poliacrilamida en
cuanto a cantidad de numero de bandas no existe diferencia alguna, pero
la diferencia existe en el tipo de extracción del hidrolizado debido a que en
EA contiene la banda de 36,000 Da, y los hidrolizados EL y QC no la
contiene, presentando estas una banda de 29,000 Da que no contiene EA.
47 = En las placas de gel de agarosa, los extractos hidrolizados de cabeza de
camarón de bahía, no tuvieron diferencia alguna en cuanto al número de
bandas y la colocación del punto isoeléctrico de las proteínas.
= Por los resultados obtenidos de los extractos hidrolizados de cabeza de
camarón, se considera que es más conveniente la utilización de los
hidrolizados químicos y enzimáticos; por su rapidez de extracción en
comparación con la fermentación láctica y no encontrarse una diferencia
en cuanto a contenido de proteínas determinada por método Bradford.
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