Productos proteolıticos circulantes de

Clinical Chemistry 60:1
233–242 (2014)
Diagnóstico de cáncer
Productos proteolı́ticos circulantes de carboxipeptidasa
N para la detección temprana del cáncer de mama
Yaojun Li,1† Yueguo Li,1,2† Tao Chen,1† Anna S. Kuklina,1 Paul Bernard,1 Francisco J. Esteva,3 Haifa Shen,1,4
Mauro Ferrari,1,5 y Ye Hu1,4*
ANTECEDENTES: La carboxipeptidasa N (CPN) es importante en la regulación de las hormonas del péptido natriurético auricular, los factores de crecimiento y las
citocinas al escindir especı́ficamente sus residuos básicos del extremo C. Investigamos si los péptidos circulantes especı́ficamente escindidos mediante CPN en el
microentorno del tumor pueden ser indicadores especı́ficos de la fase del cáncer de mama.
MÉTODOS:
La actividad de la CPN se midió a través de
un análisis de escisión de péptidos ex vivo mediante la
incubación del péptido C3f sintetizado (His6-C3f_
S1304-R1320-His6) en los lı́quidos intersticiales de tumores mamarios y tejidos mamarios normales próximos en ratones con implantación ortotópica de la
estirpe celular humana MDA-MB-231. La naturaleza y
el alcance de la escisión de péptidos mediante CPN se
investigó a través de la determinación de los perfiles de
fragmentos con fraccionamiento de nanoporos y
espectrometrı́a de masas. Los perfiles de fragmentos en
el lı́quido intersticial se relacionaron con las concentraciones de péptidos catalizados mediante CPN en muestras de sangre obtenidas de ratones portadores de tumores, mujeres sanas y pacientes con cáncer de mama.
La expresión de CPN en el mismo conjunto de muestras se examinó con mayor detenimiento mediante
inmunohistoquı́mica e inmunotransferencia.
RESULTADOS: Demostramos que la generación de C3f_
R1310-L1319 se relacionó especı́ficamente con el nivel de
expresión de CPN. En las muestras de ratones y pacientes
sintomáticos, la CPN aumentó claramente en tejidos
tumorales en comparación con el tejido mamario normal, mientras que la abundancia de CPN correspondiente en la sangre permaneció constante. Las con-
1
Department of Nanomedicine, The Methodist Hospital Research Institute (Departamento de Nanomedicina, Instituto de Investigación del Hospital Metodista), Houston, TX; 2 Department of Clinical Laboratory, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Key Laboratory of Cancer Prevention and
Therapy (Departamento de Laboratorio Clı́nico, Instituto de Cáncer y Hospital de
la Universidad Médica Tianjin, Laboratorio Principal de Prevención de Cáncer y
Tratamiento), Tianjin, China; 3 Division of Hematology-Oncology, New York
University Cancer Institute (División de Hematologı́a y Oncologı́a, Instituto del
Cáncer de la Universidad de Nueva York), Nueva York, NY; 4 Department of Cell
and Developmental Biology, Weill Cornell Medical College of Cornell University
(Departamento de Biologı́a Celular y de Desarrollo, Escuela de Medicina Weill
centraciones de 6 péptidos catalizados mediante CPN
se incrementaron de manera predominante en el suero
extraı́do de los ratones (n ⫽ 8) 2 semanas luego de la
implantación ortotópica. Seis péptidos homólogos
demostraron una expresión significativamente más
alta en el plasma de los pacientes ya en la primera etapa
patógena del cáncer de mama.
CONCLUSIONES: Las concentraciones de péptidos catalizados mediante CPN circulante reflejan la actividad de
la CPN en los tumores. Estos biomarcadores muestran
un fuerte potencial para el diagnóstico no invasivo y
temprano del cáncer de mama.
© 2014 American Association for Clinical Chemistry
Quizás en preparación para la evolución de la enfermedad
o como resultado de esta, las células en el microentorno
del tumor habitualmente secretan varias clases de
proteı́nas, como citocinas, factores de crecimiento, proteasas y peptidasas, por nombrar algunas (1, 2 ). En teorı́a,
cualquiera de estas proteı́nas secretadas, o todas, pueden
servir como biomarcadores de la evolución del tumor
(3, 4 ). Sin embargo, la realidad es mucho más compleja
de supervisar debido al amplio grado de fluctuación en la
abundancia y la localización de estas proteı́nas secretadas
por tumores, especialmente en la primera etapa del desarrollo del tumor o la metástasis (5, 6 ). Es ası́ que resulta
factible que aprovechemos el hecho de que las proteasas/
peptidasas secretadas en el microentorno del tumor
generan productos proteolı́ticos, también llamados
péptidos circulantes, y estos se liberan continuamente
al lı́quido intersticial, linfa, y eventualmente ingresan al
torrente sanguı́neo (7 ). Por consiguiente, las muestras
de sangre pueden proporcionar amplia información
Cornell de la Universidad de Cornell), Nueva York, NY; 5 Department of Internal
Medicine, Weill Cornell Medical College of Cornell University (Departamento de
Medicina Interna, Escuela de Medicina Weill Cornell de la Universidad de
Cornell), Nueva York, NY.
† Yaojun Li, Yueguo Li y Tao Chen contribuyeron de igual manera al trabajo.
* Dirigir correspondencia para estos autores a: The Methodist Hospital Research
Institute, 6670 Bertner Ave. R8-213, Houston, TX 77030. Fax 713-441-7834;
correo electrónico: [email protected].
Recibido para la publicación el lunes, 08 de julio de 2013; aceptado para la
publicación el viernes, 20 de septiembre de 2013.
Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2013.211953
233
sobre el cuerpo, “codificado” en los patrones y la cantidad de esos péptidos (8 ). Una ventaja adicional de la
búsqueda de este tipo de información a partir de las
muestras de sangre es que estas muestras son de fácil
acceso y están menos propensas al sesgo de selección
que las muestras de tejidos. Varios estudios han presentado la elaboración integral de perfiles de péptidos circulantes en forma cualitativa y cuantitativa, lo que demuestra su gran potencial para el uso como una
plataforma rápida, rentable y precisa para el diagnóstico del cáncer y la evaluación terapéutica a pesar de la
complejidad del entorno de la fisiopatologı́a del cáncer
(9 –11 ). Sin embargo, solo algunos estudios han demostrado una correlación directa entre la presencia (o
cantidad) de estos péptidos circulantes, las proteasas/
peptidasas que los generan y las funciones que desempeñan en la evolución de cáncer (12–15 ).
La carboxipeptidasa N (CPN),6 también conocida
como arginina/lisina carboxipeptidasa, cininasa I o
inactivador de la anafilotoxina, forma parte de una familia más grande de metalopeptidasas de zinc (16 ).
Diversas metalopeptidasas realizan la escisión del extremo carboxı́lico (C) de la arginina o lisina de los péptidos endógenos; por lo tanto, se cambia la actividad de
los sustratos peptı́dicos y la capacidad de unión a receptores (17, 18 ). Se conoce que la CPN actúa sobre los
péptidos, la bradicinina (BK9), las anafilotoxinas (C3a,
C4a y C5a), y los fibrinopéptidos A y B (19 ). El nonapéptido BK9, cuya secuencia de aminoácidos RPPGFSPFR permanece idéntica en los genomas humanos y
de ratones, aumenta los vasos sanguı́neos y provoca
la disminución de la presión arterial como consecuencia. La eliminación del extremo C de la arginina
mediante CPN, y por consiguiente, la pérdida de la
función de unión con su receptor, es un importante
paso regulador de la inactivación de BK9 (18 ). El C3f
(C3f_S1304-R1320) es un heptadeca-péptido (secuencia
de aminoácidos SSKITHRIHWESASLLR en humanos
y SSATTFRLLWENGNLLR en ratones) que se genera a
partir de la proteólisis de C3b mediante el factor de
complemento I en sangre (20 ). También se ha informado al C3f_S1304-R1320 como sustrato de CPN, según
lo determinado en un estudio in vitro (21 ). Profumo y
cols. y Villanuva y cols. atribuyeron varios fragmentos
derivados de C3f_S1304-R1320 y BK9 al cáncer humano
de vejiga, de próstata y de mama (10, 11 ). Teniendo en
cuenta estos resultados, el único estudio que pudimos
6
Abreviaturas no estándar: CPN, carboxipeptidasa N; C, carboxi; BK, bradicinina;
CM, medio de cultivo celular condicionado; EM, espectrometrı́a de masas;
ACTH, corticotropina; NPS, sı́lice nanoporoso; PROSPER, servidor web de especificidad de sustratos de proteasa; IHC, inmunohistoquı́mica; TIF, lı́quido
intersticial tumoral; NIF, lı́quido intersticial normal; BC-I, etapa I del cáncer de
mama; CPE, carboxipeptidasa E. (consulte editorial en la página 4)
234 Clinical Chemistry 60:1 (2014)
identificar que intenta establecer una relación entre la
CPN y el cáncer se realizó hace décadas en 1983, en la
cual los investigadores observaron una mayor actividad de CPN en el suero de pacientes con cáncer de
pulmón (22 ). En nuestro estudio actual, intentamos
vincular la actividad catalı́tica de la CPN con los patrones de sus productos proteolı́ticos durante la evolución del tumor en un modelo murino con cáncer de
mama y en muestras clı́nicas de pacientes con cáncer de
mama. Nuestros resultados indican firmemente que
los péptidos circulantes generados por CPN, como un
miembro representativo de las metalopeptidasas, pueden servir como claros indicadores de la aparición temprana de la enfermedad y la evolución.
Materiales y métodos
OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE Y MODELO MURINO CON
CÁNCER DE MAMA
Todos los protocolos de estudios en animales fueron
aprobados por el Institutional Animal Care and Use
Committee of the Methodist Hospital Research Institute (Comité Institucional para el Cuidado y Uso de
Animales del Instituto de Investigación de The Methodist Hospital). Se adquirieron ratones hembra (por
grupo de edad entre 6 y 8 semanas, homocigóticos para
inmunodeficiencia combinada severa) a Charles River
Laboratories. Se inyectó de forma subcutánea 1 ⫻ 107
células MDA-MB-231 suspendidas en 100 ␮l de PBS en
el costado derecho de ocho ratones. El volumen del tumor
se calculó cada dos semanas con la fórmula ␲/6 ⫻ longitud ⫻ ancho2. Las muestras de sangre se extrajeron de 8
ratones mediante sangrado retroorbitario en 5 puntos
temporales diferentes (antes de la inyección y 2, 4, 6 y 8
semanas después de la inyección). En cada punto temporal, se extrajeron muestras de sangre de 100-␮l a cada
ratón. Las muestras de sangre se mantuvieron a 25°C durante 1 h y luego se centrifugaron a 4000 g durante 15 min
a 25°C. Se obtuvo el suero y se almacenó a -80°C hasta su
utilización. Luego de la muerte de los ratones en la octava
semana, se obtuvieron tejidos tumorales y mamarios normales próximos de los ratones y luego se almacenaron a
-80°C hasta su utilización.
EXTRACCIÓN DE LÍQUIDO INTERSTICIAL
Se homogeneizaron cinco miligramos de tejido (normal o tumoral) en 300 ␮l de PBS en hielo con un homogeneizador OMNI. El lı́quido intersticial se obtuvo
mediante centrifugación de muestras de tejido homogeneizadas a 3000 g durante 30 min a 4°C. La concentración de proteı́nas se determinó mediante el análisis
de Bradford (Bio-Rad). Las muestras de lı́quido intersticial se almacenaron a ⫺80°C hasta su utilización.
CPN catalizada péptidos de detección precoz del cáncer de mama
REDUCCIÓN DE CPN POR LÍQUIDO INTERSTICIAL
El anticuerpo anti-CPN (Abcam) se inmovilizó en microesferas magnéticas Dynal (Life Technologies) conforme a las instrucciones del fabricante. Las muestras
(1 g/l) de lı́quido intersticial o medio de cultivo celular
(CM) acondicionado se incubaron con 0.4 mg de microesferas recubiertas de anticuerpos durante 1 h a
25°C. Después de 5 enjuagues con 0.5 ml de PBS, se
eluyó la CPN de las microesferas con 100 ␮l de 0.1
mol/l glicina (pH 3). El flujo y el eluido se analizaron
mediante inmunotransferencia para evaluar la eficacia
de la reducción.
de la t de Student mediante MarkerView para las comparaciones de muestras de casos y control.
Resultados
SECUENCIA DE TRABAJO DEL ESTUDIO PEPTÍDICO EN
BIOMARCADORES DE PÉPTIDOS CIRCULANTES
Se agregaron cinco microlitros de cada muestra de suero/pasma, obtenidos de ratones o pacientes clı́nicos
con cáncer de mama en 5 diferentes etapas (consulte
los Datos complementarios que acompañan la versión
en lı́nea de este informe en http://www.clinchem.org/
content/vol60/issue1), con 100 nmol/l de péptido corticotropina de patrón interno (ACTH) 18 –39 (SigmaAldrich) para la posterior cuantificación. Luego, se
realizó el pipeteo de las muestras en pocillos individuales organizados en micromatriz genética de sı́lice nanoporoso (NPS) de 4 pulgadas y la incubación a 25°C en
una cámara húmeda durante 30 min. Luego de la extracción de las muestras residuales, se enjuagaron 4
veces los pocillos con 10 ␮l de agua desionizada. Para la
elución, se aplicaron 5 ␮l de una solución con 50 % de
acetonitrilo y 0.1 % de ácido trifluoroacético a cada
pocillo durante 90 s, lo que posibilitó la extracción de
los péptidos de la micromatriz genética de NPS. Luego,
se enviaron los eluidos a la secuenciación de perfiles y
péptidos mediante EM-MALDI-TOF (consulte los
protocolos en los Datos complementarios en lı́nea).
A fin de verificar nuestra hipótesis de que los productos
péptidos catalizados mediante CPN que se encuentran
en la circulación pueden realmente ser fuertes indicadores de la enfermedad, diseñamos e implementamos
una secuencia de trabajo sistemática que finalizó en un
grupo de caracterı́sticas distintivas que podrı́a dar a
conocer el diagnóstico de la enfermedad (Fig. 1) como
se explica a continuación. Algunos de los experimentos
fundamentales incluyeron la inducción de cáncer de
mama en un modelo murino mediante la inyección de
células de cáncer de mama MDA-MB-231 humanas a
los animales. Fue importante evaluar primero la actividad de la CPN en el microentorno mediante un análisis
de escisión ex vivo. Aquı́, los lı́quidos intersticiales
extraı́dos de los animales se incubaron con péptidos
C3f sintetizados (His6-C3f_S1304-R1320-His6), como el
sustrato de CPN, y los sitios de escisión se predijeron
mediante herramientas de bioinformática [p. ej., el
servidor web de especificidad de sustratos de proteasa
(PROSPER) (23 ), http://lightning.med.monash.edu/
PROSPER/webserver.html] y se marcaron en la Fig. 2A.
Los péptidos se aislaron con un método de fraccionamiento de nanoporos previamente desarrollado por
nuestro grupo (9, 24 –28 ). En resumen, los péptidos de
bajo peso molecular se capturan y preservan en micromatrices genéticas de NPS, y se separan de otras
proteı́nas de alto peso molecular, con frecuencia abrumadoras, antes del análisis de EM. El análisis mediante
EM puede proporcionar información cuantitativa para
diversas especies de péptidos en una muestra única y
también ayudar a identificar la información de la secuencia (9, 24, 25, 27–29 ). La expresión in vivo de la CPN en
tejidos [evaluado mediante inmunohistoquı́mica (IHC)]
o en sangre (mediante inmunotransferencia) se relaciona
con la presencia o la cantidad (consulte los protocolos en
los Datos complementarios en lı́nea). Con estos resultados, luego realizamos la validación clı́nica, en la cual los
posibles biomarcadores de péptidos se examinan en
muestras de plasma obtenidas de cohortes de pacientes en
diferentes etapas del cáncer. También se evaluó la expresión de la CPN en sangre y tejido tumoral humano y
se la relacionó con la de los sustratos de péptidos.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
ANÁLISIS DE ESCISIÓN DE PÉPTIDOS EX VIVO Y VALIDACIÓN
Los datos de la EM-MALDI-TOF se procesaron con el
software MarkerView v. 1.2.1 (AB SCIEX). Los datos se
normalizaron mediante el péptido de patrón interno
ACTH 18 –39 (Sigma-Aldrich). Se realizaron pruebas
IN VIVO
ANÁLISIS DE ESCISIÓN DE PÉPTIDOS EX VIVO
Las muestras (1 g/l) del lı́quido intersticial se preincubaron a 37°C durante 15 min con 10 mmol/l AEDT
para una prueba de inhibición. Se utilizó el péptido
C3f con identificación His-tag (His6-C3f_S1304-R1320His6), sintetizado con 95% de pureza mediante GL
Biochem a una concentración final de 100 ␮mol/l para
este análisis. Los péptidos escindidos se extrajeron de la
solución de reacción mediante fraccionamiento de
nanoporos y se detectaron mediante espectrometrı́a de
masas MALDI-TOF (EM) de acuerdo con los protocolos descriptos en nuestra publicación anterior (9 ).
FRACCIONAMIENTO DE NANOPOROS
Como se indica en la Fig. 2A, la marca “FR” en la
secuencia de péptidos representa un sitio de escisión
conocido de la quimotripsina, una proteasa sérica que
Clinical Chemistry 60:1 (2014) 235
Figura 1. Secuencia de trabajo del estudio peptı́dico en biomarcadores de péptidos circulantes.
(A), Los péptidos circulantes se generan en el microentorno del tumor y se liberan al torrente sanguı́neo. (B), La actividad de
la peptidasa especı́fica del tumor (CPN, por ejemplo) en el lı́quido intersticial se evalúa mediante análisis de escisión ex vivo.
(C), El fraccionamiento de nanoporos se utiliza para extraer péptidos de muestras de suero/plasma o la solución de reacción
del análisis de escisión ex vivo. (D), La cuantificación e identificación de secuencias de los péptidos se determinan mediante
espectrometrı́a de masas. (E), La validación in vivo y la validación clı́nica se realizan mediante inmunohistoquı́mica,
inmunotransferencia y espectrometrı́a de masas.
el AEDT no puede inhibir. Si se realiza la escisión mediante quimotripsina, puede detectarse un valor
máximo de péptidos en una escala de EM a una m/z de
2206.13. Después de la extracción de la marca His6-tag
en ambos extremos del péptido sintético por parte del
factor I, la CPN realiza la escisión de “R” del extremo
terminal C de C3f_R1310-R1320 para generar C3f_R1310L1319 con una m/z de 1227.68. La adición de AEDT
inactiva la CPN mediante la quelación del ión zinc en
su dominio catalı́tico. Para la posterior validación ex
vivo de estos eventos de escisión, realizamos el análisis
de escisión de péptidos mediante la incubación de péptidos sintéticos con lı́quido intersticial tumoral (TIF) y
CM de células MDA-MB-231. Los resultados indicaron que la producción de C3f_R1310-L1319 en TIF fue 6
veces mayor que en el lı́quido intersticial normal (NIF).
Como se muestra en la Fig. 2, C y D, la adición de AEDT
inhibió claramente la escisión de C3f_R1310-L1319; sin
embargo, no pudo evitar la generación del valor
236 Clinical Chemistry 60:1 (2014)
máximo a una m/z ⫽ 2206.13 en muestras con TIF, NIF
y CM, lo que sugiere la posibilidad de que C3f_R1310L1319 se haya generado finalmente mediante metalopeptidasa, que se comprobó en este estudio que era
CPN. En especial, se inhibió la generación de C3f_
R1310-L1319 con una m/z de 1227.68, pero no el péptido
con una m/z de 2206.13, al extraer CPN mediante inmunodepleción (confirmado por inmunotransferencia,
Fig. 2B) de los lı́quidos intersticiales o CM. La expresión
de CPN, validada mediante inmunotransferencia antiCPN y tinción de IHC, se incrementó en el tejido tumoral en comparación con aquel en el tejido mamario
normal (Fig. 3, A y B). De hecho, las células glandulares
y adipocitos en tejido mamario de ratón normal expresaron una CPN débil o inexistente, mientras que las
células mioepiteliales exhibieron una mayor concentración de CPN. Como se muestra en la Fig. 3C, la
concentración de CPN en el suero de ratones permaneció constante durante el crecimiento del tumor.
CPN catalizada péptidos de detección precoz del cáncer de mama
Figura 2. Análisis de escisión de péptidos ex vivo en el péptido C3f sintético.
(A), Los sitios especı́ficos de escisión se indican en el péptido C3f, un sustrato del factor I de las enzimas, quimotripsina y CPN.
(B), Detección de CPN en diferentes condiciones de análisis. Reducción de CPN en lı́quido intersticial normal [NIF (CPN⫺)] o
tumoral [TIF (CPN⫺)]; disminución de proteı́na CPN en lı́quido intersticial normal [CPN (NIF)] o tumoral [CPN (TIF)]. (C, D), Se
realizó la incubación de NIF y TIF (20 ␮l de 1 g/l) a partir de un modelo murino con cáncer de mama o CM de células MB-MDA
231 con péptidos C3f sintéticos (concentración final de 100 ␮mol/l) a 37°C durante 1 h, seguido del fraccionamiento de
nanoporos y EM MALDI-TOF. C3f, péptido sintético His6-C3f_S1304-R1320-His6 solamente; NIF o TIF, lı́quido intersticial normal
o tumoral solamente; AEDT, un inhibidor de la CPN; NIF (CPN⫺) y TIF (CPN⫺), lı́quido intersticial de tejido normal y tumoral
con reducción de CPN; CM (CPN⫺), medio acondicionado con reducción de CPN.
IDENTIFICACIÓN PEPTÍDICA SÉRICA EN MODELO MURINO
Insertamos células MDA-MB-231 en ratones atı́micos
mediante implantación ortotópica para inducir el crecimiento del tumor. El volumen del tumor se midió a
intervalos de 2 semanas durante un total de 4 puntos
temporales con tamaños de tumor medio entre 8 ratones a 69.8 (30.9) mm3, 190.3 (91.9) mm3, 718.9
(380.9) mm3 y 1548.0 (804.6) mm3, respectivamente
(consulte la Fig. S1 complementaria en lı́nea). Después
de obtener el suero de ratón, procesamos un total de
120 muestras de suero (tres copias de 40 muestras de
suero, incluido el suero obtenido de 8 ratones durante
el curso de 5 puntos temporales) en fraccionamiento de
micromatriz genética de NPS y luego realizamos una
prueba de todos los eluidos en una placa de EM
MALDI-TOF de 192 pocillos. Cada escala de EM
MALDI-TOF incluyó alrededor de 150 valores máximos monoisotópicos en el rango de 800 a 3500 Da
(consulte la Fig. complementaria S2A en lı́nea). Los
datos se importaron en el software MarkerView para el
Clinical Chemistry 60:1 (2014) 237
Figura 3. Expresión de CPN en suero y tejidos de ratones.
(A), Expresión de inmunotransferencia de CPN en NIF y TIF. Se utilizó el gel con coloración azul brillante de Coomassie (CBB)
para la evaluación de carga uniforme. Tanto la inmunotransferencia como el gel con coloración CBB estuvieron sujetos al
análisis cuantitativo de la imagen mediante el software ImageJ (NIH) y el resultado se presentó por histograma. (B), Análisis
de inmunohistoquı́mica de CPN en tejido mamario normal y tejido tumoral obtenido en la segunda y la octava semanas. (C),
Inmunotransferencia de CPN en suero de ratones. La seroalbúmina (SA) con coloración Ponceau S sirve como control interno
de carga. (Grupos: 0, segunda, cuarta, sexta, octava semana; n ⫽ 4/grupo).
análisis de la prueba de la t. En comparación con los
controles normales obtenidos antes de la implantación
del tumor, se encontraron diferentes valores máximos
en las muestras afectadas después de la aplicación de los
criterios primarios (P ⬍ 0.05) y secundarios (cambio
en el incremento en veces ⬎2) (consulte la Fig. suplementaria en lı́nea S2B). La información de secuencias obtenida mediante cromatografı́a de lı́quidos y
espectrometrı́a de masas en tándem de alto rendimiento demostró 6 péptidos diferenciales, que incluyeron 5 de C3f y 1 de BK9, y su apariencia se relacionó con
la expresión de CPN. Por lo tanto, estos péptidos se
seleccionaron para estudios posteriores (consulte la
Tabla complementaria en lı́nea S1). Es importante
destacar que los 6 péptidos demostraron una tendencia
238 Clinical Chemistry 60:1 (2014)
similar durante las primeras 4 semanas después de la
inducción del tumor (Fig. 4) y la cantidad alcanzó un
valor máximo en la semana 2 (la primera medición de
crecimiento del tumor) y luego se redujo considerablemente hacia la semana 4. Curiosamente, la cantidad de
casi todos los péptidos C3f aumentó de nuevo ligeramente en las semanas 6 y 8. Las excepciones incluyeron
el péptido C3f_R1304-L1319, con una m/z de 1821.95,
que aumentó nuevamente solo en la semana 6 antes de
reducirse por segunda vez en la semana 8, y el péptido
BK8, que permaneció estable en la semana 6 antes de
reducirse en la semana 8. Las intensidades absolutas
(indicador de concentración) de C3f_R1310-L1319 y, de
forma más destacada, BK8, fueron mayores que
aquellas correspondientes a los otros fragmentos.
CPN catalizada péptidos de detección precoz del cáncer de mama
Figura 4. El diagrama de dispersión vertical de las intensidades de valores máximos normalizados en la EM MALDI
TOF para las posibles caracterı́sticas distintivas de péptidos en muestras de suero obtenidas de animales portadores
de tumores (modelo murino con cáncer de mama).
La relación de masa-carga y la identificación de secuencias se enumeran en cada panel. Número de ratones, n ⫽ 8; prueba de
la t de Student, *P ⬍ 0.05, **P ⬍ 0.01 y ***P ⬍ 0.001.
VALIDACIÓN CLÍNICA
Esperábamos que nuestras conclusiones sobre el modelo murino con cáncer de mama se reflejaran en las
muestras clı́nicas obtenidas de pacientes con cáncer de
mama, lo que posicionarı́a a nuestro enfoque para la
traducción clı́nica. Para proporcionar evidencia clara,
obtuvimos una preparación de matrices de tejidos comerciales que contiene 110 secciones de tejido mamario humano, que incluye muestras de tejidos de 200
casos de cáncer de mama (etapas patológicas I–III) y 10
muestras de tejidos mamarios normales próximos al
cáncer/adenosis como controles (consulte los detalles
del análisis en http://www.biomax.us/tissue-arrays/
Breast/BC081116a). Los análisis realizados mediante
IHC con estas matrices comerciales demostraron que
ciertamente la expresión de CPN aumentó por lo general en las muestras obtenidas de pacientes con cáncer de
mama independientemente de la etapa de la enfermedad (Fig. 5A). Al realizar la puntuación de estas 110
secciones tomando como referencia un sistema de
puntuación informado por Zhang y cols (30 )., el 100 %
de los controles (n ⫽ 10) recibió una puntuación de 1⫹
o menos, lo que significó que la CPN presentó una
expresión débil o inexistente en los controles. Sin embargo, en todas las etapas del cáncer de mama que se
representaron en la matriz, el 85 % de las muestras
recibieron puntuaciones superiores a 1⫹ y el 70 % recibieron puntuaciones superiores a 2⫹ (Fig. 5B y Fig.
suplementaria en lı́nea S3). En forma opuesta, la cantidad de CPN en plasma se mantuvo constante entre los
pacientes con cáncer de mama y la cohorte de control
(Fig. 5C).
Para la posterior validación, se realizó la elaboración de perfiles de los péptidos circulantes de interés
en 58 muestras de plasma humano, incluidas las muestras de controles sanos (n ⫽ 10) y de pacientes con
cáncer de mama en etapa I (BC-I, n ⫽ 11), cáncer de
mama en etapa II (BC-II, n ⫽ 12), cáncer de mama en
etapa III (BC-III, n ⫽ 15) y cáncer de mama en etapa IV
(BC-IV, n ⫽ 10). Los datos de la EM MALDI-TOF
demostraron que las especies de BK8 aparecieron en
mayor cantidad en las etapas I y II del cáncer de mama
(BC-I y BC-II) en comparación con los controles sanos
(BC-I frente a control, P ⬍ 0.001; BC-II frente a conClinical Chemistry 60:1 (2014) 239
Figura 5. Expresión de CPN en plasma y tejidos humanos.
(A), Tinciones de IHC para CPN en la cohorte de control humana (tejido normal o adenosis próximos al cáncer) y tejidos
tumorales. (B), El histograma muestra el porcentaje de resultados de la puntuación de tinciones de IHC para CPN (n ⫽ 10, 7,
77 y 16 para control, preparaciones BC-I, BC-II y BC-III, respectivamente). El método de puntuación del patrón de tinción de
IHC hace referencia al protocolo informado por Zhang y cols (30 ). (C), Expresión de CPN mediante inmunotransferencia en
plasma humano de controles sanos y pacientes con cáncer de mama en diferentes etapas de la enfermedad (I, II, III y IV). La
seroalbúmina (SA) con coloración Ponceau S sirvió como control interno; n ⫽ 4/grupo.
trol, P ⬍ 0.05) (Fig. 6 y Tabla suplementaria en lı́nea
S2). Quizás más sorprendente, las especies de péptidos
C3f_R1310-L1319, C3f_R1309-L1319, C3f_R1308-L1319,
C3f_R1305-L1319 y C3f_R1304-L1319 se presentaron de
forma perceptible en muestras de BC-I y BC-II en comparación con las muestras de la cohorte sana (P ⬍
0.001) (Fig. 6); estos resultados coincidieron con
aquellos informados por Profumo y cols (10 ). En conjunto, los patrones de estos productos catalizados mediante CPN en las muestras clı́nicas de pacientes con
cáncer de mama coincidieron ampliamente con nuestras observaciones en el modelo murino con cáncer de
mama. Como demuestran nuestros resultados, los
niveles de expresión de los 6 péptidos especı́ficos de
CPN no demostraron una diferencia significativa entre
el suero y plasma de ratones antes del procesamiento
del experimento de validación en las muestras de
plasma humano (consulte la Fig. S4 complementaria
en lı́nea).
Análisis
Se han realizado gran cantidad de estudios en búsqueda
de biomarcadores para el diagnóstico precoz de enfermedades, pero de forma frustrante, aún carecemos de
candidatos definitivos que puedan usarse para predecir
la aparición temprana de la enfermedad y para poder
hacerlo con gran precisión y especificidad. El diagnóstico y pronóstico con frecuencia deficientes se deben en
parte a la ausencia de un enfoque que pueda identificar
marcadores con tales caracterı́sticas de una forma no
240 Clinical Chemistry 60:1 (2014)
invasiva, reproducible y que conduzca a procesos terapéuticos rápidos (31 ). Debido a que se conoce que ciertas proteasas/peptidasas desempeñan funciones importantes en varios tipos de cáncer, una comprensión
más profunda de ciertos eventos proteolı́ticos, particularmente en el microentorno del tumor, facilitará
la identificación de los productos derivados del tumor y que eventualmente se secretan a la circulación
(8, 11, 13, 32 ). La identificación de proteomas en suero
luego proporciona un “mapa” que podemos usar para
rastrear las caracterı́sticas distintivas inmunológicas o
metabólicas especificas del cáncer que indican la evolución del tumor a la etapa inicial (6, 10, 12, 14 ).
En este estudio, examinamos la actividad de la
CPN, una proteasa conocida por desempeñar una función en varios tipos de cáncer, dentro del microentorno
del tumor ası́ como en la circulación sanguı́nea de ratones (modelo murino con cáncer de mama) y pacientes con diagnóstico de cáncer de mama (diferentes
etapas). Los fragmentos de péptidos generados por la
CPN residente del tumor y liberados al torrente
sanguı́neo (sus cantidades e identidades están representadas en nuestros análisis integrales en el presente)
se relacionan ampliamente con la expresión enzimática
y reflejan el estado fisiopatológico del organismo. Por
lo tanto, recomendamos su uso como biomarcadores
distintivos y precisos del diagnóstico temprano del
cáncer de mama y la evaluación de riesgos, que ciertamente se detectarán e identificarán en forma previa a la
metástasis y quizás incluso antes de la aparición del
CPN catalizada péptidos de detección precoz del cáncer de mama
Figura 6. Perfiles de posibles caracterı́sticas distintivas de péptidos en plasma de mujeres sanas con cáncer de
mama en diferentes etapas patológicas.
Número de muestras n ⫽ 10, controles sanos; n ⫽ 11, BC-I; n ⫽ 12, BC-II; n ⫽ 15, BC-III; n ⫽ 10, BC-IV; prueba de la t- de
Student, *P ⬍ 0.05 y ***P ⬍ 0.001.
tumor mediante cualquier caracterı́stica observable
utilizada con frecuencia en la clı́nica.
Un estudio in vitro anterior ha demostrado que la
CPN puede escindir el extremo C de la arginina de
C3f_S1304-R1320; sin embargo, no resultó claro si la
CPN era la única peptidasa especı́fica capaz de hacerlo
en dicho estado particular del análisis (21 ). Para llegar
a tal conclusión, redujimos la actividad de la CPN en
análisis de proteasas que incluyeron NIF, TIF y CM
antes de agregar el péptido C3f sintético. Los espectros
de la EM MALDI-TOF obtenidos demostraron que la
escisión de C3f_R1310-L1319 finalizó de hecho en el
lı́quido intersticial y el CM, y confirmaron la especificidad de la CPN en relación con el extremo C de la
arginina de C3f. Sabemos que fue la CPN y no otras
proteasas, por ejemplo la carboxipeptidasa E (CPE), la
enzima especı́fica responsable de esta escisión dado que
el estudio anterior habı́a demostrado que las células
MDA-MB-231 pueden secretar CPN y CPE (33 ). Asimismo, las fuertes intensidades de m/z en los fragmentos C3f_R1310-L1319 observados en TIF demuestran la
mayor actividad de la CPN en el microentorno del tumor en comparación con su equivalente en el tejido
mamario normal. El estudio de inmunotransferencia
demostró una actividad de la CPN dos veces mayor en
TIF en comparación con NIF, posteriormente confirmado por el análisis de IHC de tejidos normales y
tumorales. Por lo tanto, resulta evidente que la CPN
presenta una alta expresión en el tejido tumoral y secreción al TIF en la etapa inicial del cáncer de mama. La
importancia fisiológica y oncológica de este evento
debe estudiarse en mayor profundidad. Si bien la CPN
se expresa débilmente en las células glandulares y altamente en células mioepiteliales, ambos tipos de células
se consideran poblaciones minoritarias en el tejido
mamario normal. En adipocitos, la población mayoritaria en el tejido mamario normal, no observamos ninguna expresión detectable de CPN. La estirpe celular
MDA-MB-231 aquı́ utilizada pertenece a la estirpe celular epitelial, al igual que las células mioepiteliales.
Además de su alta expresión y secreción de CPN, las
células MDA-MB-231 presentaron un ı́ndice de proliferación rápida y causaron la diferenciación deficiente
del tejido tumoral, lo que probablemente explica el aumento en la actividad de CPN observado en TIF en
comparación con NIF.
Resultó sorprendente detectar que el nivel de expresión de la CPN no se diferenció considerablemente
en el suero de sujetos enfermos y de control, ratones o
humanos. Esta observación sugiere que debido a la diClinical Chemistry 60:1 (2014) 241
lución, es posible que no se detecte rápidamente cualquier pérdida adicional de CPN del microentorno del
tumor que supere la concentración de fondo de la CPN
en el suero. Como describieron otros investigadores, la
CPN activa se secreta a la circulación como una
molécula 280-kDa, que comprende 2 subunidades 83kDa reguladoras y 2 subunidades 50-kDa catalı́ticas
(16, 19, 22 ). Concluimos que las mayores concentraciones de péptidos circulantes catalizados mediante
CPN presentados aquı́ se derivan de la escisión por la
CPN residente en el microentorno del tumor en lugar
de las enzimas que circulan en la sangre. Creemos
firmemente que es precisamente esta observación la
que vuelve a la idea de usar péptidos circulantes catalizados mediante CPN como biomarcadores de la enfermedad mucho más atractiva y viable.
Debido a que los espectros de la EM MALDI-TOF
presentaron caracterı́sticas distintivas de péptidos expresadas de forma más perceptible en las muestras de
sangre de animales y pacientes con cáncer de mama, se
esperarı́a ver ciertos cambios (incrementos) de dichos
péptidos en TIF en comparación con NIF en ratones
portadores de tumores. De hecho, sus señales o valores
máximos no se detectaron mediante EM MALDI-TOF.
La escasez de dichos péptidos en el lı́quido intersticial
probablemente se deba a su continua liberación del microentorno del tumor y su acumulación en la sangre.
Sin embargo, aún debe comprobarse si esta explicación
refleja el proceso fisiológico real.
Los niveles de expresión de los péptidos circulantes pueden equilibrarse mediante las actividades de diversas proteasas/peptidasas, algunas de las cuales promueven la producción proteolı́tica, mientras que otras
inhiben simultáneamente la producción de péptidos
degradados (18, 21, 34 ). En el modelo murino con
cáncer de mama aquı́ examinado, las cantidades de los
6 péptidos circulantes se redujeron considerablemente
en la semana 4 después de alcanzar el valor máximo en
la semana 2. Ciertos estudios han demostrado que la
enzima convertidora de la angiotensina y la endopeptidasa neutral inhiben la escisión de BK9 en plasma humano (18 ). Suponemos que una peptidasa diferente de
la CPN puede ser más activa en el tejido o en la sangre a
medida que el tumor madura, lo que conduce a una
reducción en los péptidos escindidos mediante CPN.
Tomando como base las predicciones realizadas con el
programa PROSPER (23 ), seleccionamos la catepsina
G como una peptidasa que podrı́a ser responsable de la
escisión de fragmentos C3f en el sitio de “LW”. Otros
estudios han sugerido una importante función para la
catepsina G en la evolución del tumor, especialmente
en la metástasis (35, 36 ). Como tal, pareciera que la
catepsina G podrı́a participar en la reducción de
la abundancia de los fragmentos C3f en la sangre hacia
la etapa media en la evolución del tumor. Dado que los
242 Clinical Chemistry 60:1 (2014)
péptidos informados en este estudio no se liberan directamente del tumor, su abundancia en la sangre
puede estar regulada por otras enzimas además de la
CPN, como la catepsina G. Por lo tanto, estos péptidos
pueden no relacionarse por completo con la carga del
tumor.
Acumulativamente, nuestros resultados representan la primera demostración, conforme a nuestros
conocimientos, que relaciona claramente la actividad
proteolı́tica de la CPN, particularmente en los sitios de
los tumores, con los patrones de escisión de sus sustratos catalı́ticos C3f y BK en la sangre, mediante un enfoque rápido, reproducible, sensible, preciso y no invasivo. Serı́a realmente ingenuo pensar que los péptidos
catalizados mediante CPN y la enzima misma son los
únicos biomarcadores especı́ficos para el diagnóstico
del cáncer de mama. Sin embargo, sostenemos que estos pueden usarse como una medida complementaria
para el diagnóstico muy temprano del crecimiento del
tumor, particularmente debido a que la actividad de la
CPN dentro del tumor en este punto ya puede detectarse mediante muestras de sangre. Dicha sensibilidad
junto con todas las caracterı́sticas arriba mencionadas
se prestan de forma correcta para su traducción en la
clı́nica, para el cáncer de mama y quizás otras
patologı́as.
Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que
han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a
la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e interpretación
de estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación con su contenido
intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo publicado.
Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de
declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de interés:
Empleo o liderazgo: No se declara.
Papel del consultor o asesor: No se declara.
Propiedad de acciones: No se declara.
Honorarios: No se declara.
Financiamiento de la investigación: Department of Pathology at
TMH (Departamento de Patologı́a del TMH); F.J. Esteva, the
Methodist Hospital Research Institute and the Breast Cancer Research Foundation (Instituto de Investigación del Hospital Metodista y Fundación para la Investigación del Cáncer de Mama); H.
Shen, NIH U54CA151668; M. Ferrari, DoD W81XWH-09 –1-0212 y
NIH U54CA151668; Y. Hu, DoD W81XWH-09 –1-0212 y NIH
U54CA151668.
Testimonio de expertos: No se declara.
Patentes: No se declara.
Papel del patrocinador: Las organizaciones patrocinadoras desempeñaron una función directa en el diseño del estudio y la revisión e
interpretación de los datos.
Agradecimientos: Todos los autores reconocen el apoyo de las
muestras clı́nicas proporcionadas por el Department of Breast Cancer Oncology at the University of Texas M.D. Anderson Cancer Cen-
CPN catalizada péptidos de detección precoz del cáncer de mama
ter (Departamento de Oncologia del Cáncer de Mama del Centro
M.D. Anderson de la Universidad de Texas). Agradecemos especialmente la contribución de Pamela McShane del Biorepository Core of
the Methodist Hospital (Centro Biorepositorio del Hospital Metodista, TMH) y el apoyo financiero del Departamento de Patologı́a del
TMH.
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