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DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍAS QUÍMICAS UNIVERSIDAD DE CASTILLA LA MANCHA Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel MEMORIA que para optar al grado de Doctor por la Universidad de CastillaLa Mancha presenta: Elena Moliterni Merlo Directores: Dra. Dña. Lourdes Rodríguez Mayor Dr. D. José Villaseñor Camacho Ciudad Real, 2015 La Dra. Dña. Lourdes Rodríguez Mayor, Directora del Centro Nacional del Hidrógeno, y el Dr. D. José Villaseñor Camacho, Profesor Titular de Ingeniería Química de la Universidad de Castilla-La Mancha, en su calidad de Profesores del Programa de Doctorado de la UCLM “Ingeniería Química, Ambiental y de los Materiales”, regulado por el Real Decreto 778/1998, CERTIFICAN: Que el presente trabajo “BIORREMEDIACIÓN de investigación ACELERADA DE titulado SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS TIPO DIÉSEL”, constituye la memoria que presenta Dña. Elena Moliterni Merlo para aspirar al grado de Doctor por la Universidad de CastillaLa Mancha en el citado Programa de Doctorado y que ha sido realizado en los laboratorios del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Castilla-La Mancha y la empresa Alquimia Soluciones Ambientales bajo su dirección. Y para que conste a los efectos oportunos, firman el presente certificado en Ciudad Real a 27 de Noviembre de 2015. Dra. Dña. Lourdes Rodríguez Mayor Dr. D. José Villaseñor Camacho FINANCIACIÓN La presente tesis doctoral ha sido financiada por la Junta de Comunidades de CastillaLa Mancha mediante la concesión de una beca pre-doctoral para la formación de Personal Investigador para la realización de tesis doctorales en empresas privadas. Asimismo, se ha obtenido financiación a través del Proyecto CTM2006-02214 (Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo Diésel), el Proyecto PBI08-0206-7303 (Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos mediante consorcios microbianos mixtos) de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, y el Proyecto UCTR080150, con el mismo título del anterior y financiado por Alquimia Soluciones Ambientales. Índice INDICE RESUMEN .............................................................................................................1 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN ..............................................................................9 1.1. CONTAMINACIÓN DEL SUELO POR HIDROCARBUROS ............................. 11 1.1.1. Marco legal ............................................................................................ 11 1.1.2. Fuentes de contaminación ..................................................................... 14 1.1.3. Efectos de la contaminación con hidrocarburos tipo diésel ................... 16 1.2. TECNOLOGÍAS PARA LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS 18 1.2.1. Clasificación de las técnicas de descontaminación ............................... 18 1.2.2. Fundamentos para la elección de la tecnología de descontaminación .. 20 1.3. FUNDAMENTOS DE LA TECNOLOGÍA DE BIORREMEDIACIÓN .................. 23 1.3.1. Principios básicos de la tecnología de biorremediación ......................... 23 1.3.2. Factores condicionantes en los procesos de biorremediación ............... 24 1.3.3. Ventajas y desventajas de la tecnología de biorremediación................. 26 1.3.4. Contexto actual del uso de las técnicas de biorremediación ................. 28 1.4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 30 CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES, OBJETIVO Y ALCANCE ................................... 37 CAPÍTULO 3. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS COMUNES ............................ 43 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. REACTIVOS Y DISOLVENTES ......................................................................... 45 CARACTERIZACIÓN DE LOS SUELOS OBJETO DE ESTUDIO ..................... 45 CARACTERIZACIÓN DEL GASÓLEO DIÉSEL ................................................. 49 ANÁLISIS DE HIDROCARBUROS POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA ........ 50 MATERIALES Y MEDIOS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS ..... 51 AISLAMIENTO DE LAS POBLACIONES PRESENTES EN LOS SUELOS ...... 52 ENUMERACIÓN DE LA POBLACIÓN MICROBIANA POR LA TÉCNICA NMP 52 CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE LOS CONSORCIOS MICROBIANOS ...... 53 3.9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 55 CAPÍTULO 4. BIOTRATABILIDAD DE HIDROCARBUROS DIÉSEL CON CONSORCIOS MICROBIANOS OBTENIDOS DE SUELOS CONTAMINADOS ...... 57 4.1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 59 4.2. OBJETIVO ........................................................................................................ 61 4.3. PROCEDIMIENTOS ......................................................................................... 61 4.3.1. Preparación de los consorcios para el estudio de biodegradación ......... 61 4.3.2. Caracterización de los consorcios microbianos hidrocarburolíticos XA, XB, XC ............................................................................................................... 62 4.3.3. Diseño de experimentos de biodegradación de diésel ........................... 65 4.3.3.1. Medida de la concentración de biomasa .................................. 68 4.3.3.2. Medida de la tensión superficial ............................................... 69 4.3.3.3. Medida de la concentración de TPH ......................................... 71 Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel 4.3.4. Modelo cinético de biodegradación de diésel en suspensión acuosa ..... 71 4.3.5. Experimentos de producción de biosurfactantes .................................... 74 4.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 75 4.4.1. Verificación del proceso de adaptación y enriquecimiento ..................... 75 4.4.2. Composición de la comunidad microbiana ............................................. 77 4.4.3. Biodegradación de diésel mediante los consorcios X A, XB y XC .............. 80 4.4.4. Estimación de parámetros cinéticos ....................................................... 86 4.4.4.1. Influencia de la concentración de sustrato ................................ 87 4.4.4.2. Influencia de la temperatura de reacción .................................. 91 4.4.4.3. Influencia del tipo de consorcio utilizado .................................. 93 4.4.5. Producción de biosurfactantes por los consorcios XA, XB y XC ............... 94 4.5. CONCLUSIONES.............................................................................................. 96 4.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 98 CAPÍTULO 5. BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON DIÉSEL EN LABORATORIO: ESTUDIO DE VARIABLES Y MODELIZACIÓN ................... 103 5.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 105 5.2. OBJETIVO ...................................................................................................... 108 5.3. PROCEDIMIENTOS........................................................................................ 108 5.3.1. Estudio de la estrategia de biorremediación ......................................... 108 5.3.1.1. Diseño de experimentos ......................................................... 108 5.3.1.2. Procedimiento experimental y muestreo................................. 110 5.3.1.3. Medida de la concentración de biomasa ................................ 111 5.3.1.4. Medida de la concentración de TPH ....................................... 113 5.3.2. Estudio de la influencia del grado de humedad ................................... 114 5.3.2.1. Diseño de experimentos ......................................................... 114 5.3.2.2. Procedimiento experimental y muestreo................................. 114 5.3.3. Estudio de la influencia de la concentración de inóculo a utilizar en un proceso de bioaumento .................................................................................. 115 5.3.3.1. Diseño de experimentos ......................................................... 115 5.3.3.2. Procedimiento experimental y muestreo................................. 116 5.3.4. Modelo cinético de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos en suspensión acuosa ............................................................. 116 5.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 123 5.4.1. Distribución de diésel en los experimentos abióticos ........................... 123 5.4.2. Resultados de los experimentos de biorremediación de suelos en suspensión acuosa ......................................................................................... 125 5.4.2.1. Validación del modelo y estimación de parámetros................ 132 5.4.2.2. Influencia del tipo de suelo ..................................................... 133 5.4.2.3. Elección de la estrategia de biorremediación ......................... 136 5.4.3. Optimización del grado de humedad .................................................... 138 5.4.4. Optimización de la concentración de inóculo ........................................ 140 5.5. CONCLUSIONES............................................................................................ 143 5.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 145 Índice CAPÍTULO 6. VIABILIDAD DE LAS DIFERENTES ESTRATEGIAS DE BIORREMEDIACIÓN A ESCALA PILOTO ........................................................... 149 6.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 151 6.2. OBJETIVO ...................................................................................................... 152 6.3. PROCEDIMIENTOS ....................................................................................... 153 6.3.1. Preparación del suelo ........................................................................... 153 6.3.2. Instalaciones experimentales ............................................................... 153 6.3.3. Descripción de las estrategias utilizadas .............................................. 155 6.3.4. Diseño de experimentos a escala planta piloto..................................... 157 6.3.5. Procedimiento experimental y muestreo ............................................... 158 6.3.6. Análisis de muestras............................................................................. 159 6.3.6.1. Medida de la concentración de biomasa ................................ 159 6.3.6.2. Medida de la concentración de TPH ....................................... 159 6.3.7. Preparación de los ensayos de fitotoxicidad ......................................... 159 6.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 161 6.4.1. Evaluación de la degradación alcanzada en los distintos tratamientos de biorremediación en planta piloto ................................................................ 161 6.4.1.1. Influencia de la estrategia de biorremediación utilizada ......... 161 6.4.1.2. Influencia del grado de humedad del suelo ............................ 171 6.4.1.3. Influencia del modo de operación ........................................... 174 6.4.1.4. Influencia del cambio de escala ............................................. 176 6.4.2. Evaluación del estado del suelo después del proceso de biorremediación: resultados del test de fitotoxicidad ...................................... 179 6.5. CONCLUSIONES ........................................................................................... 184 6.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 185 CAPÍTULO 7. SOSTENIBILIDAD INTEGRAL DE LA ESTRATEGIA DE BIORREMEDIACIÓN DESARROLLADA ............................................................. 189 7.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 191 7.2. OBJETIVO ...................................................................................................... 193 7.3. VIABILIDAD TÉCNICA .................................................................................... 193 7.3.1. Implementación de la estrategia de bioaumento semanal (Estrategia A) ....................................................................................................................... 196 7.3.2. Implementación de la estrategia de bioestimulación con compost maduro (Estrategia B)..................................................................................... 197 7.4. VIABILIDAD AMBIENTAL ............................................................................... 199 7.5. VIABILIDAD ECONÓMICA ............................................................................. 200 7.5.1. Estimación del importe total de la inversión .......................................... 201 7.5.2. Costes de operación ............................................................................. 203 7.5.3. Análisis de rentabilidad ......................................................................... 204 7.6. CONCLUSIONES ............................................................................................ 209 7.7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 211 Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel CAPÍTULO 8. CONCLUSIONES GENERALES ................................................... 213 ANEXOS ............................................................................................................ 219 Resumen 1 Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel 2 Resumen La biorremediación es una tecnología biológica para la descontaminación de suelos basada en la conversión o metabolización de los contaminantes por microorganismos; es decir, requiere una cepa o consorcio microbiano eficiente que degrade la mayor cantidad de contaminante hasta un nivel mínimo. Los procesos de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos (HC) pueden desarrollarse mediante un gran abanico de estrategias. Este hecho permite acoplarse a distintos episodios de contaminación según las características del entorno. La práctica más común es excavar la tierra contaminada y colocarla en un sitio específico para llevar a cabo una atenuación natural simple o una bioestimulación sencilla. Otra opción es llevar a cabo un tratamiento mediante el bioaumento, que consiste en introducir microorganismos en el suelo para acelerar la metabolización del contaminante. A pesar de tratarse de una tecnología con años de experiencia, de la literatura se deducen resultados ambiguos en cuanto a las diferentes estrategias. Estudios más recientes se han centrado en la combinación de las técnicas de bioestimulación y bioaumento, obteniéndose resultados más alentadores. Como resultado del análisis realizado, se considera que las empresas dedicadas a la recuperación de suelos aplicando la tecnología de biorremediación pueden tener un futuro viable. Sin embargo, es necesario hacer un énfasis especial en el desarrollo de innovaciones biotecnológicas para mejorar y optimizar la técnica de la biorremediación. Con estos antecedentes, y en base a lo interesante que resulta afrontar esta problemática, el Departamento de Ingeniería Química de la UCLM y la empresa Alquimia Soluciones Ambientales, aprovechando su experiencia previa en el campo de la Ingeniería Ambiental, acordaron acometer una investigación centrada en la biorremediación acelerada de suelos contaminados con HC. En ese contexto se sitúa la presente tesis doctoral que ha sido realizada en ambas entidades, es decir, en la citada empresa y en la Universidad de Castilla-La Mancha. El objetivo de este trabajo de investigación es desarrollar un proceso de biorremediación para eliminar HC tipo diésel de suelos contaminados, de forma eficaz y más rápida que los tradicionales sistemas de atenuación natural, y aplicable a escala real. Para alcanzar el objetivo global planteado, el presente trabajo se ha dividido en una serie de objetivos parciales que se describen a continuación: - Obtener y caracterizar consorcios microbianos mixtos estables, a partir de los existentes originalmente en diversos emplazamientos (ya sea 3 Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel contaminados o sin contaminar), que tengan capacidad de biodegradar HC diésel y que sirvan de inóculo en los procesos de biorremediación acelerada. - Estudiar la biodegradación de diésel en laboratorio utilizando los anteriores consorcios, caracterizando la estequiometría y cinética del proceso, estudiando el efecto de las variables y modelizándolo, llegando a seleccionar los consorcios con la máxima capacidad biodegradadora. - Estudiar el proceso de biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio, experimentando el efecto de variables como tipo de suelo, inóculo o estrategia de biorremediación, y modelizando el proceso. - Estudiar la extrapolación, desde laboratorio a escala de planta piloto, de varias estrategias de biorremediación, como la bioestimulación y el bioaumento. - Evaluar la viabilidad de implementar el proceso de biorremediación a escala industrial a través de las estrategias seleccionadas en el paso anterior, diseñándolo y calculando sus costes. Para conseguir estos objetivos se planteó un programa de investigación que implicaba: (1) un estudio bibliográfico amplio; (2) la puesta a punto de dispositivos experimentales y técnicas de análisis; (3) la experimentación en laboratorio para realizar el estudio de la biodegradación de HC diésel, y posteriormente la biorremediación de suelos contaminados con dichos HC; (4) la experimentación en planta piloto para realizar la extrapolación del estudio de biorremediación; y (5) el diseño y estudio de la viabilidad técnica y económica de un prototipo a escala industrial optimizado según los resultados de las etapas anteriores. En esta investigación se ha trabajado con cinco suelos de distinta procedencia y características (denominados SA, SB, SC, SD y SE). SA presentaba indicios de contaminación, SB fue contaminado artificialmente con diésel al llegar al laboratorio, SC presentaba contaminación crónica, y los otros dos eran suelos sin contaminar. De ellos se aislaron cinco consorcios microbianos mixtos, denominados respectivamente XA, XB, XC, XD y XE. Todos los consorcios aislados fueron adaptados al consumo de HC mediante resiembras semanales, en las que la única fuente de carbono era diésel. Una vez desarrollados los consorcios microbianos hidrocarburolíticos, se estudiaron sus curvas de crecimiento y se realizó la caracterización microbiológica de los consorcios de los 4 Resumen suelos que presentaban contaminación previa (X A, XB y XC). En los tres consorcios se encontraron especies con capacidad demostrada para la biodegradación de HC, según la literatura previa. Así, se procedió al estudio de los fundamentos de la biodegradación de diésel, mediante experimentos discontinuos en fase líquida a escala de laboratorio: se estudió la influencia del consorcio utilizado (XA, XB y XC), de la temperatura de reacción (25, 30 y 35 °C) y de la concentración inicial de sustrato contaminante (0,5, 1 y 3% en volumen) en el desarrollo de la reacción bioquímica. Por otro lado, se realizó un seguimiento de la generación de biosurfactantes durante dichos experimentos. Los consorcios microbianos estudiados (XA, XB y XC) mostraron una excelente viabilidad durante el proceso de biodegradación de diésel en agua. Se obtuvieron porcentajes de eliminación superiores al 80% en la mayoría de los experimentos y en un tiempo de tratamiento aproximadamente de 40 h. En general, el aumento de la temperatura entre 25 y 30 °C aceleró ligeramente el crecimiento celular y, por tanto, la biodegradación de diésel. A la temperatura de 35 °C se observó que la reacción de biodegradación se inhibía. Por otro lado, se detectó un crecimiento desacoplado al aumentar la concentración inicial de diésel. Mediante el seguimiento de la tensión superficial en los experimentos de biodegradación, se determinó que los consorcios microbianos fueron capaces de producir biosurfactantes. Una mayor producción de biosurfactantes generó un mayor porcentaje de eliminación de diésel y una mayor velocidad de consumo. Se aprovecharon los datos obtenidos en los experimentos de biodegradación de diésel en fase líquida para el desarrollo de un modelo matemático. Dicho modelo, basado en la ecuación de Monod, tenía que reproducir el proceso y proporcionar datos estequiométricos y cinéticos del mismo, con diferentes consorcios microbianos y diferentes condiciones. El modelo ajustó los datos experimentales con unos coeficientes de correlación altos exceptuando los casos en los que se observó inhibición por temperatura. El modelo tampoco tuvo en cuenta el fenómeno de crecimiento desacoplado. Los tres consorcios estudiados mostraron eficacias muy similares en la biodegradación de diésel, y además existía coincidencia en varias especies microbianas presentes en ellos. Este hecho podría deberse a que el proceso de adaptación y aclimatación de los tres consorcios llevó a la obtención de cultivos microbianos con capacidades muy similares. Solo se observaron diferencias significativas entre el consorcio XC y los otros dos consorcios (XB y XA), siendo XC algo mejor. Por este motivo, se seleccionó el consorcio XC para continuar la investigación. 5 Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel Una vez estudiados los fundamentos de la biodegradación en fase líquida, se realizó el estudio del proceso de biorremediación del suelo contaminado con diésel en experimentos discontinuos de laboratorio, probando diferentes estrategias como la bioestimulación y el bioaumento, y estudiando la influencia de factores relevantes en el proceso como el tipo de suelo, la humedad o la concentración de inóculo. Para ello, se llevaron a cabo experimentos en recipientes agitados cerrados, en los que se usaba suelo contaminado y se ponía en suspensión en un medio acuoso con nutrientes inorgánicos, considerando un modelo de flujo de mezcla perfecta. Este estudio se realizó con dos suelos de características texturales distintas (denominados SD y SE, de tipo arcilloso y limoso, respectivamente), que fueron contaminados con diésel antes del comienzo del mismo. Se realizaron cuatro tipos de experimentos en los que la variable en estudio fue la estrategia de biorremediación utilizada: (1) bioestimulación, (2) bioaumento exógeno, (3) una estrategia combinada de bioestimulación y bioaumento exógeno; y, finalmente, (4) una estrategia combinada de bioestimulación y bioaumento con microorganismos endógenos. Los resultados de los experimentos de biorremediación de los dos suelos contaminados con diésel permitieron observar altos porcentajes de eficacia; más del 90% de la concentración inicial fue eliminada en la mayoría de los experimentos en tan sólo 11 días de tratamiento. El factor más importante que determinó la estrategia a seguir, fue la biodisponibilidad del contaminante, pudiendo concluirse que, cuando el contaminante era de fácil acceso (suelo arcilloso), una combinación de la técnica de bioestimulación y bioaumento exógeno (X0+XC) conducía a mejores resultados, mientras que cuando la disponibilidad era limitada, como en el caso del suelo limoso, una estrategia de bioestimulación de consorcios autóctonos era más eficiente. Respecto a las otras variables estudiadas (humedad y concentración de inóculo), se detectó un rango intermedio de humedades en el que se producía la compactación del suelo y el tratamiento de biorremediación no era efectivo. Por otro lado, el uso de un consorcio exógeno (XC) en el suelo arcilloso (SD) conducía a una mayor eficiencia cuanto menor concentración de inóculo era utilizada. Este hecho podría estar relacionado con la competencia que surge entre el propio consorcio presente en el suelo y el enriquecido exógeno. Sin embargo, la experiencia con el consorcio X D, consorcio endógeno enriquecido del suelo arcilloso (SD), reveló lo contrario, una mayor concentración de inóculo podía producir un mayor beneficio en la biorremediación, obteniéndose mayores rendimientos y de forma más rápida. Se desarrolló un modelo matemático que permitiera reproducir los resultados de los experimentos de biorremediación en laboratorio. Dicho modelo consideraba los fenómenos de transporte de diésel entre las cuatro fases existentes (sólida, líquida 6 Resumen acuosa, líquida orgánica y gaseosa) y el equilibrio que se alcanzaba entre ellas. Se consideró una cinética microbiana tipo Monod. El modelo matemático propuesto, así como las hipótesis planteadas para su desarrollo, fueron verificados con los altos coeficientes de correlación hallados entre los datos experimentales y los propuestos por el modelo. Además, los parámetros cinéticos calculados por el modelo, contrastados en bibliografía, resultaron coherentes. Una vez estudiados los fundamentos de la biorremediación de suelos contaminados con HC en laboratorio, se realizó el estudio de extrapolación a planta piloto. Se evaluó el efecto de diferentes variables sobre la eficacia y velocidad del proceso: influencia de la estrategia de biorremediación (bioestimulación, bioaumento o simple atenuación natural), influencia de la humedad a escala piloto e influencia del modo de operación. El objetivo era llevar a cabo el escalado de la tecnología de biorremediación acelerada de suelos contaminados con diésel de la manera más satisfactoria. En todos los experimentos realizados a esta escala se utilizó el suelo arcillo (S D), contaminado con diésel antes de empezar cada uno de los experimentos. Se llevaron a cabo dos tipos de experimentos, según las condiciones óptimas de humedad seleccionadas: en fase saturada y en fase sólida o insaturada. En este segundo caso, los experimentos se realizaron tanto en modo estático como en biorreactor giratorio. De manera general, los rendimientos de descontaminación observados se mantuvieron en el mismo orden de magnitud al cambiar de escala de laboratorio a planta piloto. Todas las estrategias de biorremediación acelerada llevadas a cabo en planta piloto aumentaron el rendimiento más del 70% respecto al simple proceso tradicional de atenuación natural. Por un lado, un bioaumento inicial único (es decir, una única inoculación al comienzo del tratamiento) no mejoró el proceso de biorremediación con respecto a las estrategias de bioestimulación convencional. Sin embargo, el continuo aporte semanal de inóculo fresco (bioaumento semanal continuado) si aumentó el rendimiento respecto a un tratamiento de bioestimulación convencional. Por otro lado, la opción que considera el uso de compost maduro como método novedoso de bioestimulación condujo a un aumento de un 20% aproximadamente en los rendimientos de descontaminación con respecto al resto de estrategias. Por todo ello, tanto el bioaumento semanal como la bioestimulación con compost maduro pueden considerarse como las mejores estrategias para llevar a cabo un hipotético proceso industrial. Los experimentos de biorremediación realizados a escala piloto en estado saturado no mejoraron el proceso de descontaminación respecto a su realización en fase insaturada. Por otro lado, la utilización de biorreactores giratorios sólo resultó beneficiosa en la estrategia de bioaumento semanal continuado respecto al uso de 7 Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel reactores estáticos aireados, y tampoco estaría completamente justificada en un proceso industrial debido a la alta relación coste/eficiencia. Por último, se plantean dos posibilidades hipotéticas de tratamiento industrial. Por un lado, se evalúa la posibilidad de realizar la descontaminación del suelo mediante la estrategia de bioestimulación utilizando compost maduro como agente estimulante y, por otro, utilizar una estrategia de bioaumento semanal continuado. Se pretende demostrar la conveniencia de realizar una inversión para llevar a cabo la recuperación sostenible de un emplazamiento contaminado mediante su descontaminación en un Centro de Tratamiento Especializado, a través de la evaluación de la sostenibilidad integral de las dos estrategias propuestas. Desde el punto de vista comercial, legal y organizacional, no se han observado impedimentos relevantes en la implementación de cualquiera de las estrategias de biorremediación planteadas a escala industrial. Se han considerado los aspectos técnicos, ambientales y económicos, como los determinantes para la evaluación integral, concluyéndose que una inversión de este tipo tendría sentido siempre y cuando el precio de servicio establecido fuera superior a 145 € por tonelada de suelo contaminado. 8 Capítulo 1 ••••••••• ••••••••• Introducción 9 Capítulo 1 10 Introducción 1.1. CONTAMINACIÓN DEL SUELO POR HIDROCARBUROS 1.1.1. Marco legal El grave problema que representa la contaminación de los suelos es un aspecto que lleva abordándose no más de 40 años. Antes de la década de los 70 se hablaba de la contaminación del aire y del agua, pero al suelo se le consideraba con una capacidad de autodepuración casi infinita. La sensibilidad mundial comenzó a cambiar a partir de la declaración de la Carta Europea del Suelo (Consejo de Europa, 1972) desarrollada por el Comité de Ministros del Consejo Europeo para la ONU, donde se estableció que el suelo es uno de los más preciados activos de la humanidad. Se calificó como un recurso fácilmente destruible y se manifestó que debe de ser protegido contra la erosión, la contaminación y el daño que puede causar el desarrollo urbano; a la vez que su calidad debe ser conservada. Para que la protección del suelo empezara a ser efectiva fue necesario que se considerara dentro de un marco de protección ambiental multisectorial. Con este fin, en el Tercer Programa de Acción (1982-1986) (COM, 1983) en materia de Medio Ambiente de la Comunidad Europea (CE), se trató el suelo como un sistema natural con entidad propia, clasificando las agresiones a las que está sometido en tres grupos: contaminación por sustancias nocivas de origen diverso; deterioro de la estructura física o composición química, erosión, riesgos naturales o compactación por uso de maquinaria pesada; y uso inapropiado y consecuencias derivadas de actividades consumidoras de espacio. En el Cuarto Programa de Acción Ambiental de la CE (1987-1992) (COM, 1987) se reconoció de manera oficial la necesidad de una reglamentación referente a la protección del suelo y se instó a los gobiernos de los países miembros a elaborar una normativa de protección bajo las directrices recogidas en las "Bases Científicas para la Protección del Suelo en la Comunidad Europea" (Barth y L´Hermite, 1987). Así, la política ambiental de la CE se enmarcaba dentro de un contexto integracionista, pudiendo sintetizarse los principios fundamentales que la sustentan en: prevención, corrección y conservación. Por ello, en 1990, se creó la Agencia Europea del Medio Ambiente (AEMA), cuyo objetivo principal es proporcionar a la CE y a sus Estados miembros información objetiva, fiable y comparable de la evolución del medio ambiente a escala europea, para que les permitiera adoptar las medidas necesarias para protegerlo y evaluar los resultados de tales medidas. 11 Capítulo 1 Del mismo modo, en 1996 AEMA puso en marcha el Centro Temático Europeo del Suelo (CTE/S), con el objetivo de garantizar y desarrollar información sobre diversos aspectos del suelo de todos los países miembros, de cara a aumentar la comprensión del suelo como recurso natural, documentar los procesos de degradación, y mejorar el nivel de fiabilidad e información comparable acerca de los suelos contaminados. El objetivo del trabajo sobre los sitios contaminados era mejorar el nivel de fiabilidad de la información, permitiendo que la recogida de la misma fuera comparable a nivel europeo y establecer una base para una evaluación de la extensión de la tierra contaminada, el nivel de contaminación y la extensión de la necesidad de reparación en Europa. En España, la primera vez que se abordó la regulación y ordenación de los suelos contaminados fue en la Ley 20/1986, de residuos tóxicos y peligrosos, en la que la Administración General del Estado, de acuerdo con las Comunidades Autónomas, formuló un Plan Nacional de validez en todo el territorio nacional. En base a lo establecido surgió el Plan Nacional de Residuos Industriales 1989-1993 (PNRI, 1989), y desde 1991 hasta 1995 el antiguo Ministerio de Obras Públicas, Transporte y Medio Ambiente estableció el Inventario Nacional de Suelos Contaminados (ISC) en el que alrededor de 18.000 instalaciones industriales fueron declaradas actividades potencialmente contaminantes. Por este motivo, surgió el segundo plan, Plan Nacional de Recuperación de Suelos Contaminados (PNSC I, 1995), que se extendió desde 1995 a 2005. En la Ley 10/1998, de 21 de Abril, de Residuos (Art. 3. Apartado p), se recogía por primera vez en la legislación Española la definición de suelo contaminado: “todo aquel cuyas características físicas, químicas o biológicas han sido alteradas negativamente por la presencia de componentes de carácter peligroso de origen humano, en concentración tal que comporte un riesgo para la salud humana o para el medio ambiente, de acuerdo con los criterios y estándares que se determinen por el Gobierno” . En esta Ley se atribuían a las Comunidades Autónomas las competencias para declarar, delimitar y hacer un inventario de los suelos contaminados y elaborar una lista de prioridades de actuación, en atención al riesgo que supusiera la contaminación del suelo para la salud humana y el medio ambiente. También, en aplicación del principio “ quien contamina paga”, se establecía (Art. 27.2) que los causantes de la contaminación estarían obligados a realizar las actuaciones necesarias para proceder a la limpieza y recuperación, en la forma y plazos que se determinaran por las respectivas Comunidades Autónomas. Posteriormente, la Ley 16/2002, de Prevención y Control Integrado de la Contaminación, indicaba que las actividades potencialmente contaminantes tienen que 12 Introducción tener un plan de control de sus emisiones al aire, suelo y agua, así como adoptar las mejores técnicas disponibles para su tratamiento. En el Real Decreto (RD) 9/2005, de 14 de enero, se establece la relación de actividades potencialmente contaminantes del suelo y los criterios y estándares para la declaración de suelos contaminados. También se hace referencia a la presencia de sustancias químicas de carácter peligroso y de origen humano que pueden alterar las características químicas, físicas y/o biológicas del suelo, lo que comportaría un riesgo que ha de ser cuantificado para estimar el posible daño que se puede derivar para la salud humana y el medio ambiente. En este mismo RD aparecen fijados, por primera vez, los límites por compuesto contaminante para considerar un suelo como contaminado. En referencia a la contaminación por hidrocarburos (HC), aparece el término Hidrocarburos Totales del Petróleo (en adelante TPH, de sus siglas en inglés “Total Petroleum Hydrocarbon”), que se utiliza para describir una familia de varios cientos de compuestos procedentes del petróleo; asimismo se refleja que una -1 concentración superior a 50 mg kg de TPH en el suelo es consecuencia de la actividad humana y que, por ese motivo, habría indicios de contaminación. El Plan Nacional Integrado de Residuos 2008-2015, aprobado posteriormente por el Consejo de Ministros en diciembre de 2008 (PNIR, 2007), contemplaba una serie de medidas en materia de suelos contaminados, entre las que se encontraba la revisión y una puesta al día periódica del RD 9/2005, a medida que se fuera disponiendo de más y mejor información. La última Ley, que deroga la anterior y aplica en esta materia, es la Ley 22/2011, de 28 de julio, de residuos y suelos contaminados. En ella se matizan algunas cuestiones como la determinación de los sujetos responsables de la contaminación de los suelos. Asimismo, y con la finalidad de adquirir un mejor conocimiento de la situación de los suelos contaminados, se regulan las obligaciones de información a las que quedan sujetos tanto los titulares de las actividades potencialmente contaminantes del suelo como los titulares de los suelos contaminados. Además, se refleja que la declaración de un suelo como contaminado obligará a realizar las actuaciones necesarias para proceder a su limpieza y recuperación, en la forma y plazos en que determinen las respectivas Comunidades Autónomas, y será objeto de nota marginal en el Registro de la Propiedad, a iniciativa de la respectiva Comunidad Autónoma. En Castilla-La Mancha se establece el Plan de Gestión de Residuos Industriales con alcance 2014–2020 (Decreto 112/2014), en el que se recogen las pautas para actuar en materia de suelos contaminados dentro de la Comunidad Autónoma. En este decreto se definen las medidas para la rehabilitación del suelo en el que se especifica que “a partir 13 Capítulo 1 del grado de contaminación, evaluado en función del alcance, persistencia y gravedad, se optará por la medida para su rehabilitación más óptima”. Además, queda reflejado que la actividad de descontaminación se llevará a cabo por empresas que garanticen, en todo momento, las capacidades técnicas y dispongan de medios suficientes para llevar a cabo la actividad. Por otro lado, el plan establece unos objetivos para la prevención, recuperación, reutilización y valorización de los suelos contaminados. 1.1.2. Fuentes de contaminación En las dos últimas décadas, como consecuencia del desarrollo urbanístico de las ciudades y de las obras asociadas, se han descubierto nuevos suelos contaminados en antiguas instalaciones y en centros asociados a diversas actividades industriales. Los problemas generados en estos emplazamientos contaminados están estrechamente relacionados con el desarrollo de una sociedad industrial y orientada al consumo. Se ha descubierto también que muchos incidentes de contaminación se deben a la inadecuada disposición de los desechos industriales y urbanos. Además, no sólo la cantidad de residuos ha aumentado drásticamente en estos periodos, sino también el número de sustancias peligrosas contenidas en los productos consumidos. Otra fuente importante de contaminación de los suelos surge durante el manejo de las sustancias derivadas de diversos procesos industriales. En vista de la amplia utilización de sustancias químicas, prácticamente no existe en la actualidad ningún sector industrial cuya actividad quede excluida de la posibilidad de contaminar el suelo. A raíz del Plan Nacional de Recuperación de Suelos Contaminados (PNSC I, 1995), ya en 1997 se publicó un listado con 4.900 sitios potencialmente contaminados en España, de los cuales finalmente fueron declarados 370 como tal. Las comunidades más afectadas fueron Andalucía, Cataluña, País Vasco y la comunidad Valenciana (Tabla 1.1). Más recientemente, la Comisión Europea, en su Estrategia Temática para la Protección del Suelo en el año 2006 (COM, 2006), consideró que en la UE-25 existían 3,5 millones de emplazamientos potencialmente contaminados. Los HC presentes en el suelo pueden ser de origen biológico o antrópico; los primeros son sintetizados por plantas y microorganismos, y los segundos son de origen industrial como los del refino de petróleo. Generalmente, los causantes de la contaminación son de origen antrópico, siendo los más peligrosos y recalcitrantes los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs, de sus siglas en inglés “Polycyclic Aromatic 14 Introducción Hydrocarbons”), los sustituidos con sulfuro o nitrógeno y sus homólogos alquílicos (Gagni y Camm, 2007). Tabla 1.1. Financiación prevista para descontaminar sitios prioritarios en España en el periodo 1995-2005 (PNSC I, 1995). Región Actividades Ind. Potencialmente Contaminantes Sitios potencialmente contaminados Sitios declarados contaminados Financiación M€ Andalucía Aragón 1.396 717 683 356 43 7 418,90 43,52 Asturias 394 160 17 33,09 Baleares Canarias 303 396 13 245 4 12 13,80 32,97 Cantabria C. La Mancha 238 287 81 415 8 15 71,28 41,37 Castilla y León Cataluña 811 4.913 438 611 29 60 33,90 398,85 Ceuta-Melilla 22 5 1 - Extremadura Galicia 183 860 44 543 6 26 3,42 34,54 La Rioja Madrid 153 2.277 40 248 5 25 7,16 57,86 Murcia 469 84 14 145,66 Navarra País Vasco 334 2.059 40 556 9 45 29,71 400,65 Valencia 2.330 340 44 82,65 Total 18.142 4.902 370 1.849,33 El origen de la contaminación del suelo por HC se encuentra muy ligado a derrames, accidentales o intencionados, de combustibles del petróleo en instalaciones de almacenamiento, estaciones de servicio, operaciones de transporte y distribución de los mismos, a roturas de depósitos y conducciones subterráneas (Fingas, 2013), y a la combustión incompleta de estos combustibles fósiles. Sin embargo, sólo los casos más escandalosos son recogidos por los medios de comunicación y son atendidos directamente por los gobiernos. Por desgracia, se trata de un hecho cotidiano y forma parte de la realidad de la sociedad moderna. El trasiego del petróleo desde los campos petrolíferos hasta las instalaciones de refino implica muchas transferencias entre diferentes modos de transporte, incluidos los buques petroleros, oleoductos, vagones y camiones cisterna. Por otro lado, una vez procesados los combustibles, se almacenan en puntos de transferencia y en terminales a lo largo de la ruta hasta llegar al consumidor final. Los accidentes pueden ocurrir en 15 Capítulo 1 cualquiera de estas etapas de producción o de transporte o durante los tiempos de almacenamiento. De tal forma que es muy frecuente encontrar en los suelos aledaños a las instalaciones donde se realizan estas actividades, diversos compuestos presentes en estos combustibles y que son los principales agentes contaminantes del suelo según el RD 9/2005. Por este motivo, las actividades dedicadas a la explotación, distribución y suministro de HC se encuentran consideradas como “actividades potencialmente contaminantes del suelo” en el mismo. Según la memoria de datos estadísticos de la Asociación Española de Operadores de Productos Petrolíferos (AOP, 2013), en el año 2013 existían en España 10 refinerías con capacidad de proceso de 77.000.000 t de crudo de petróleo al año, una capacidad 3 de almacenamiento de productos petrolíferos de 13.000.000 m repartidas entre 47 instalaciones, 4.000 km de oleoductos construidos y alrededor de 10.700 estaciones de servicio. La producción de diésel en España en el año 2014 fue de 27.400.000 t y existió un consumo de 28.400.000 t (CORES, 2014). Un dato interesante es que la tasa de derrames ha disminuido en los últimos 10 años; especialmente los debidos a los accidentes de petroleros. Este hecho es debido a la puesta en marcha de varios programas de formación intensivos, por parte de los gobiernos y empresas implicadas, que han sido desarrollados para reducir el potencial de error humano (ITOPF, 2012). A pesar de esto, los expertos estiman que entre el 30 y el 50% de los derrames de petróleo son causados, directa o indirectamente, por un error humano y entre el 20 y el 40% son causados por fallos en los equipos o mal funcionamiento de las instalaciones (Fingas, 2012). 1.1.3. Efectos de la contaminación con hidrocarburos tipo diésel Los HC son compuestos orgánicos formados por átomos de carbono e hidrógeno. La estructura molecular consiste en una cadena de átomos de carbono que pueden ser lineales o ramificadas, y abiertas o cerradas. Los HC se pueden clasificar en dos tipos, alifáticos y aromáticos. Los alifáticos, a su vez, se pueden clasificar en saturados (alcanos) o insaturados (alquenos y alquinos), según los tipos de enlace que unen entre sí los átomos de carbono. El diésel o gasóleo derivado del petróleo está compuesto aproximadamente de un 75% de HC saturados (principalmente parafinas incluyendo isoparafinas y cicloparafinas) y un 25% de HC aromáticos (incluyendo naftalenos y alcalobencenos) (ATDSR, 1995). La fórmula química general del diésel común es C 12H23, incluyendo cantidades pequeñas de otros HC cuyas fórmulas van desde C10H20 a C15H28. Tiene una 16 Introducción baja solubilidad en agua, un coeficiente de adsorción elevado y un anillo aromático de alta estabilidad (van Hamme y col., 2003). Son los HC de alto peso molecular, los que mayor problemática presentan en el medio ambiente, pues son relativamente inmóviles, de baja volatilidad y baja solubilidad en agua (Dorn y Salanitro, 2000). Muchos de ellos son carcinógenos y mutagénicos. La Organización Mundial de la Salud y la Unión Europea definen dieciséis HC como contaminantes prioritarios y más dañinos para la salud por sus efectos: naftaleno, acenaftileno, acenafteno, benzo(a)antraceno, fluoreno, criseno, fenantreno, benzo(b)fluoreno, antraceno, fluoranteno, benzo(k)fluoreno, pireno, benzo(a)pireno, indeno(1,2,3-cd)pireno, dibenzo(ah)antraceno y benzo(ghi)perileno (Nadal y col., 2004). Las propiedades físicas y químicas del suelo más afectadas por la contaminación con HC se recogen en la Tabla 1.2. Los HC disminuyen el crecimiento e interfieren en el desarrollo normal de la flora y fauna de numerosas formas (Dorn y Salanitro, 2000; van Gestel y col., 2000). Tabla 1.2. Propiedades físicas y químicas del suelo afectadas por la contaminación con HC (SEMARNAT, 1996). Propiedades Físicas Cambio en la estructura del suelo debido a la ruptura de los agregados Aumento de la retención del agua en la capa superficial Cambio del potencial hídrico Aumento del carbono orgánico Propiedades Químicas Disminución del pH, debido a la generación de ácidos orgánicos Aumento en la concentración de manganeso, hierro intercambiable y fósforo disponible Por otro lado, la presencia de HC en el suelo representa un contacto directo con el ecosistema a través de diferentes mecanismos: evaporación al aire, lixiviación, arrastre por aguas superficiales, etc. (Weber y Miller, 1989), extendiéndose por largas distancias y aumentando así la superficie contaminada y puede hacer, eventualmente también, que el foco contaminante alcance una fuente de abastecimiento de agua y perjudique a una población específica de seres vivos. En el caso de que la contaminación alcance una fuente de agua, sus efectos directos son: disminución del contenido de oxígeno, aporte de sólidos y de sustancias orgánicas e inorgánicas, aumento de la salinidad, etc. (Lesser, 1995). Además, los compuestos 17 Capítulo 1 orgánicos ligeros tienden a formar una capa en forma de nata en el nivel freático y se mueven horizontalmente en la dirección del flujo del agua subterránea. Sin embargo, los compuestos orgánicos densos, migran hacia la base del acuífero creando una columna a partir de la cual pueden moverse en la dirección del flujo de agua, contaminando así el acuífero en toda su profundidad (Hernández-Espriú y col., 2011). Algunos HC y compuestos que acompañan a los gasóleos, aun en concentraciones pequeñas, pueden ser sometidos a un proceso de bioacumulación en la cadena alimentaria e incluso biomagnificación, es decir, que su concentración se incrementa al pasar a través de la misma (Davies y col., 2006; Kelly y col., 2007; Takeuchi y col., 2009; Fatemi y Baher, 2009; Sharma y col., 2009). En resumen, los efectos tóxicos de los HC en el medio ambiente dependerán de: - La cantidad, composición y estructura. - La frecuencia y tiempo de exposición. - El estado físico de la contaminación. - Las características del sitio contaminado. - Variables ambientales como temperatura, humedad y oxígeno. - La sensibilidad de la biota específica del ecosistema contaminado. 1.2. TECNOLOGÍAS PARA LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS 1.2.1. Clasificación de las técnicas de descontaminación Existen varias formas de clasificar las técnicas utilizadas para la recuperación de suelos contaminados. Estas clasificaciones se pueden realizar en función de su fundamento físico-químico, biológico o térmico; y del lugar donde se procede a su descontaminación, que puede ser in situ o ex situ (Tabla 1.3). El término in situ designa el desarrollo de la técnica exactamente en el lugar y condiciones donde se ha producido la contaminación (sin desplazamiento a un medio o lugar especial, y sin modificación de las condiciones naturales). Contrariamente, el término ex situ designa el desarrollo de la técnica en un lugar distinto de aquel donde se ha producido la contaminación, aunque éste sea contiguo al que se contaminó. En el último caso son necesarias operaciones de excavado y transporte. Cada uno de los grupos de técnicas clasificadas tiene un rango de aplicabilidad y una serie de limitaciones (Ortiz y col., 2007). La experiencia de las últimas décadas revela que, debido a la gran diversidad de fuentes causantes de contaminación y las diversas limitaciones ambientales, cada proyecto de recuperación de suelo contaminado 18 Introducción debe ser considerado como un caso especial y atender tanto a las características del suelo como a las de las especies contaminantes (nivel de degradabilidad y persistencia, sobre todo) (López-Vizcaíno, 2013). Este es el motivo por el que el estudio de los tratamientos de recuperación de suelos ha sido un tema de gran interés en los últimos años, y ello ha derivado en el desarrollo y adaptación de nuevas tecnologías (Wang y Chen, 2007; Weber, 2007; Busca y col., 2008; Kulkarni y col., 2008) e incluso en la combinación de varias de ellas para aumentar la eficiencia de los proyectos de descontaminación (Yergeau y col., 2009; Goel y col., 2010; Mena, 2015). Tabla 1.3. Principales técnicas de descontaminación de suelos. Atendiendo al lugar donde se procede a su descontaminación Atendiendo al fundamento Características Biológico Se utiliza la diversidad metabólica de microorganismos o plantas para transformar los compuestos tóxicos en sustancias inocuas o menos agresivas. Biorremediación Fitorremediación Rizorremediación Micorremediación Bioventing Físicoquímico Se realiza la degradación o transporte de los contaminantes hacia otro medio físico o forma química menos agresiva. Oxidación Química Electrorremediación Extracción de vapores Enjuague de suelos Térmico Se realiza el calentamiento del suelo con el fin de aumentar la velocidad de Vitrificación volatilización de los compuestos semi- Pirolisis volátiles y mejorar su extracción. In situ Ex situ Biorreactores Biopila Compostaje Landfarming Extracción química Oxi-reducción Qca Deshalogenación Lavado de suelos Gases calientes Incineración Pirolisis Desorción térmica Históricamente, la descontaminación de suelos ha sido realizada mediante técnicas ex situ, a través de la extracción del suelo, seguida por una descarga en lugar habilitado y posterior tratamiento de la tierra contaminada. Por un lado, tiene la ventaja de aislar la contaminación del resto del ecosistema y controlar de manera más efectiva los factores implicados (Talley y Sleeper, 2006), pero presenta serios inconvenientes que limitan su aplicabilidad y eficiencia. Estos incluyen un alto coste y necesidades de mantenimiento y traspaso de la contaminación de un medio a otro (Ortiz y col., 2007). Actualmente, las técnicas de recuperación in situ tienen un coste considerablemente menor que en sus inicios, así como más bajos requerimientos de energía y mantenimiento (Ortiz y col., 2007). Además, eliminan o inmovilizan los contaminantes sin la necesidad de transportar el material contaminado, eliminando así el riesgo de liberación de los contaminantes más volátiles. Sin embargo, los fenómenos de 19 Capítulo 1 transporte de materia y energía se encuentran muy limitados y suelen ser necesarios mayores tiempos para su descontaminación, un instrumental de monitoreo mayor y la homogeneidad en su descontaminación puede ser dudosa (Ortiz y col., 2007). Por otro lado, no en todos los casos es posible continuar con la actividad industrial del sitio afectado mientras se está ejecutando el proceso de descontaminación. 1.2.2. Fundamentos para la elección de la tecnología de descontaminación Como se observa en la Tabla 1.3, existe un amplio abanico de tecnologías de recuperación de suelos, pero no todas son aptas para tratar cualquier suelo contaminado. La elección de la tecnología de descontaminación debe estar basada en un estudio previo del emplazamiento, del tipo de contaminación, del tiempo y grado de actuación y, en general, de todos aquellos factores que alteren o participen de manera directa o indirecta en el proceso (Reddy y col., 1999). Se trata de un trabajo arduo pues de ello depende el éxito de la recuperación del emplazamiento. En general, todas las técnicas necesitan cierta programación y previsión de plazos. Por lo tanto, uno de los principales retos a afrontar en la elección es la planificación de los proyectos y la gestión del riesgo ambiental, de tal forma que se puedan adecuar sus plazos de ejecución. Por otro lado, es necesario evaluar si se requiere el desplazamiento e instalación de unidades móviles voluminosas, que impliquen la necesidad de grandes superficies donde instalarlas, así como los costes de movilización. En el caso de adición de agentes de inmovilización, reacción o estimulación, es necesario evaluar el incremento del volumen total o la pérdida de propiedades del suelo, que pueden hacer impracticable su reutilización en muchos casos. Asociados a todos los factores anteriores, se encuentran los problemas de aceptación social que pueden llegar a ser determinantes en la elección de la técnica. A los propios de cualquier obra (ruido, polvo, tránsito de vehículos y maquinaria, ocupación temporal de espacios, etc.) se suma la percepción de que se trata de una actividad insalubre, que representa un peligro para la salud pública (olores, generación de polvo contaminado, etc.) (Talley y Sleeper, 2006). De manera práctica, Wang y Bartha (1994) describen que la tecnología ideal de descontaminación del suelo debe tender a: - Reducir al mínimo el riesgo para la salud pública y el medio ambiente, con un bajo coste y en un período de tiempo razonable. 20 Introducción - Eliminar la potencial generación de residuos secundarios y evitar transferir de manera no controlada los contaminantes de unas fases a otras. - Proporcionar una solución eficaz a largo plazo. - Minimizar los impactos sobre el suelo y los ecosistemas. - Facilitar el uso apropiado y más beneficioso del suelo. - Reducir al mínimo, o eliminar, el consumo de energía. Si es posible, fomentar el uso de fuentes de energía renovables (energía solar, eólica, etc.). - Minimizar las emisiones de contaminantes atmosféricos. - Evitar el uso de agua dulce de recursos hídricos directos, fomentando el uso de agua reciclada, recuperada y pluvial. - Minimizar la necesidad de acciones correctivas de impacto ambiental. - Evitar afectar las aguas naturales superficiales y subterráneas. - Reducir al mínimo el uso de materiales, facilitando el reciclaje y/o el uso de materiales reciclados. Algunos procedimientos de trabajo más modernos basan la gestión de los suelos contaminados en la evaluación/análisis de riesgos (NICOLE, 2002). Este concepto tiene en cuenta aspectos como el riesgo que presentan para la salud humana y el medio ambiente la suma total de riesgos individuales que presentan los agentes químicos presentes en el sitio contaminado. Una primera evaluación del riesgo se basa en la comparación, de forma individual, de los valores de concentración de los contaminantes hallados en el suelo con los valores de referencia. En estos estudios se evalúan además aspectos ecológicos, económicos y de planificación de los espacios disponibles. Sin embargo, todos estos factores son tan genéricos y subjetivos que son susceptibles de manipulación o interpretación errónea. Por todo ello, se han desarrollado herramientas y conceptos o corrientes de actuación a nivel europeo que permiten, por un lado, definir la sostenibilidad de las diferentes técnicas y, por otro, ayudar a elegir la mejor técnica de recuperación para cada emplazamiento contaminado (Tabla 1.4). Estos estudios de viabilidad son esenciales pero pueden tener un enorme impacto en el coste de la descontaminación a gran escala. La recuperación de emplazamientos contaminados requiere de una integración de las actividades de científicos y tecnólogos, para que pueda convertirse en una realidad. Para el desarrollo de tecnologías económicamente viables, científicos y tecnólogos tienen que ofrecer soluciones 21 Capítulo 1 creativas, ya sea para la introducción de nuevas capacidades o para mejorar la eficiencia de las actuales (Gothalwal, 2013). Tabla 1.4. Herramientas para la evaluación de la sostenibilidad de las técnicas de recuperación de suelos contaminados (CONAMA, 2010). Modelo holandés ROSAREC Se evalúan todas las fases implicadas de la tecnología más sostenible y se realiza una guía para la toma de decisiones. Implica el acuerdo de todas las partes relacionadas con el proceso, identifica desarrollos futuros e incertidumbres, busca soluciones realistas, y evita la sobreestimación de la eficacia de las potenciales tecnologías a emplear. Los diferentes escenarios se evalúan determinando sus riesgos, beneficios ambientales y costes económicos. Modelos de cálculo de “huella de carbono” o impacto ecológico Se cuantifica la producción de CO2 a lo largo de un determinado proyecto de recuperación. Existe un gran número de actividades durante el proceso de descontaminación que gravan el medio ambiente y que se pueden expresar en términos de producción de CO2: uso de electricidad o combustibles, reacciones de oxidación o reducción, producción de aquellos materiales necesarios para la recuperación (requerimientos energéticos de procesos), etc. Se establece un criterio STOP para la recuperación basado en la eficiencia (balance entre la eliminación de contaminante y las emisiones de CO2 aceptables). “Green remediation” Se consideran todos los efectos medioambientales en los proyectos y se incorporan aquellas opciones que maximicen el beneficio neto ambiental de las actuaciones de recuperación. Esencialmente, es la incorporación de las mejores prácticas de ingeniería disponibles en el proceso de planificación y ejecución del proyecto. Evaluación del “ciclo de vida” (LCA) Se cuantifican los impactos ambientales asociados a un producto o servicio, que pueden ser primarios (impactos locales asociados a la contaminación on-site) o secundarios (asociados a mayor nivel y generados por las actividades de recuperación). C2C (cradle to cradle), Se evalúan los materiales utilizados en los procesos de descontaminación, englobándose en la categoría de “técnicos”, que deberían diseñarse a partir de compuestos inocuos, y poder utilizarse en ciclos continuos sin perder integridad o calidad, para no acabar siendo residuos, y “biológicos”, materiales orgánicos que una vez utilizados puedan ser depositados en cualquier medio natural y descomponerse. En este sentido, hay que tener en cuenta que existen diversas tecnologías innovadoras, propuestas más recientemente, que pueden encontrarse en diferentes etapas de desarrollo (investigación, escala piloto o gran escala). Sin embargo, su limitado número de aplicaciones genera la falta de datos acerca de sus costes y eficiencias. 22 Introducción 1.3. FUNDAMENTOS DE LA TECNOLOGÍA DE BIORREMEDIACIÓN 1.3.1. Principios básicos de la tecnología de biorremediación Existe una gran variedad de microorganismos que casi siempre están presentes en los suelos (bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoos) (Eweis y col., 1999), aunque las densidades de población varían ampliamente. Dichos microorganismos cumplen una función doble en el hábitat donde se encuentran: suministrar los compuestos inorgánicos con una valencia adecuada para que las plantas exteriores puedan utilizarlos y, además, contribuir a la continua descomposición y mineralización de la materia orgánica. Dichos microorganismos edáficos se distribuyen de manera no homogénea ocupando micro-hábitats entre las partículas del suelo (Harms y Bosma, 1996). 6 9 En términos generales, se encuentran del orden de 10 -10 bacterias cultivables y en 4 7 torno a 10 -10 hongos cultivables por gramo de suelo (Atlas y Bartha, 2002), aunque se estima que tan solo un 0,1-1% de los microorganismos totales en el suelo son cultivables (Amann y col., 1995). Que un microorganismo sea cultivable quiere decir que mediante el empleo de cualquiera de las técnicas de microbiología clásicas (siembra en placa, método del número más probable, tinciones, etc.) puede ser aislado e identificado. Generalmente, las poblaciones microbianas presentes en los suelos utilizan cualquier fuente de carbono fácilmente asimilable para su supervivencia y desarrollo (Drenovsky y col., 2004), pudiendo llegar a adaptar su metabolismo en función de las condiciones ambientales en las que se encuentren (Grüter y col., 2006) y los parámetros físico-químicos que presente el suelo (Thomassin-Lacroix y col., 2002). La respuesta de la micro-flora edáfica ante disturbios externos que pueden modificar las condiciones ambientales del suelo suele estar representada por cambios en las tasas metabólicas, en la biomasa o en la estructura de las comunidades. Así, en suelos contaminados, las comunidades microbianas presentes suelen estar dominadas por bacterias capaces de sobrevivir a la toxicidad del ambiente, utilizando estos contaminantes para su desarrollo (Rahman y col., 2001; Juwarkar y col., 2010). Se definen los microorganismos hidrocarburolíticos (HiC) como aquellos capaces de degradar HC, obteniendo de ellos la fuente de carbono y energía necesarios. Estos microorganismos facilitan su difusión hacia la célula produciendo sustancias como carbohidratos, ácidos grasos, enzimas y biosurfactantes, que actúan como un biofilm alrededor de la molécula de HC, para posteriormente romperla en compuestos más sencillos de carbono e hidrógeno. En suelos contaminados con HC los microorganismos 23 Capítulo 1 HiC pueden llegar a representar el 100% de la comunidad microbiana, mientras que si no existen indicios de contaminación sólo llegan al 0,1% del total (Davis, 1967). La fracción del total de microorganismos que metabolizan HC es altamente variable, de 6 a 82% para hongos terrestres y de 0,1 a 50% para bacterias de tierra (Davis, 1967). Entre los principales géneros de microorganismos HiC se encuentran: Acinetobacter, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Nocardia, Vibrio, Stenotrophomonas y Rhodococcus (Evans y Fuchs, 1988; Prince y col., 1999; Eweis y col., 1999). La tecnología de la biorremediación fue iniciada por George M. Robinson en 1960, y definida como “la eliminación de contaminantes presentes en el suelo mediante procesos biológicos llevados a cabo por microorganismos”. Para comprender mejor esta tecnología es necesario conocer las interacciones bioquímicas y microbiológicas que ocurren en el suelo (Musarrat y Zaidi, 2006) y que pueden resumirse en (Gothalwal, 2013): - Los procesos bioquímicos afectan por igual a microorganismos exógenos y endógenos del suelo. - Los requisitos de crecimiento microbiano son los mismos para los cultivos desarrollados en laboratorio o en campo. - Un microorganismo añadido a un suelo contaminado no sólo debe pasar la información genética necesaria al reproducirse y ser capaz de expresar esa capacidad in situ, sino que debe también tener la capacidad de convertirse en parte de la comunidad microbiana del suelo. - Entre las limitaciones que resultan de las interacciones con el ecosistema contaminado se incluye la necesidad de aceptar la presencia de otros microorganismos, así como la adaptación a las propiedades físicas y químicas del micro-hábitat en el que se van a desarrollar. 1.3.2. Factores condicionantes en los procesos de biorremediación Desde el punto de vista de la biodegradación, los factores condicionantes principales son las condiciones ambientales, microbiológicas y del sustrato. Sin embargo, en la biorremediación de un suelo existen otros factores adicionales que pueden tener importancia (Tabla 1.5.) (Gothalwal, 2013). 24 Introducción Tabla 1.5. Factores que afectan al proceso de biorremediación. Microbiológicos Crecimiento crítico de la biomasa Mutación y transferencia horizontal de genes Enriquecimiento de las poblaciones microbianas Producción de metabolitos tóxicos Interacciones microbianas (competencia, depredación, etc.) Medioambientales Agotamiento de los sustratos preferenciales Falta de nutrientes Condiciones ambientales inhibitorias (pH, Tª, concentración de O2, etc.) Presencia de una fuente de carbono alternativa Del contaminante Concentración de contaminante/sustrato Estructura química del contaminante - Biodegradabilidad Toxicidad del contaminante Solubilidad del contaminante Co-metabolismo Interacción del proceso biológico aerobio/anaerobio Potencial de oxidación/reducción Disponibilidad de aceptores de electrones Población microbiana presente Limitaciones en la transferencia de materia en la matriz Biodisponibilidad (equilibrio de adsorción/desorción) Incorporación en materia húmica Difusión y solubilidad del oxígeno en la matriz Difusión de los nutrientes en la matriz Dentro de las limitaciones físicas o químicas que afectan al rendimiento de un proceso de biorremediación, destacan dos: i. Biodegradabilidad del contaminante. Es condición indispensable que para aplicar esta tecnología el contaminante pueda ser metabolizado por los microorganismos. Este factor está relacionado con la solubilidad, ramificación, grado de saturación y naturaleza y efecto de los sustituyentes en el contaminante. La solubilidad se define como la disponibilidad potencial del contaminante en la fase acuosa. Cuanto mayor sea la solubilidad del contaminante, más se promueve su movilidad, y aumenta, por tanto, la posibilidad de ser biodegradado y metabolizado por los microorganismos, ya que este proceso tiene lugar preferencialmente en fase acuosa. En cuanto a los HC, éstos se biodegradan con mayor facilidad cuanto menor sea la complejidad de la molécula. Los HC más biodegradables son aquellos con cadenas comprendidas entre 10 y 25 átomos de carbono. Los microorganismos degradan con dificultad anillos saturados, o alcanos muy ramificados (Evans y Fuchs, 1988). 25 Capítulo 1 ii. Estado físico y disponibilidad del contaminante en el suelo. Un contaminante, en función de su estado físico en el medio, presenta una toxicidad de fase y unas características estructurales diferentes: - Fase gas: En esta fase se concentra la mayor fracción volátil de HC, permaneciendo principalmente atrapada en los poros del suelo, en fase vapor. Este hecho ocasiona una disminución de la concentración de oxígeno y una baja disponibilidad del contaminante en fase acuosa, reduciendo las posibilidades de los microorganismos para metabolizarlo (Hanson y col., 1997). - Fase adsorbida: El contaminante se encuentra adsorbido por las partículas del suelo y queda difícilmente disponible para los microorganismos. - Fase disuelta: El contaminante está disuelto en la fase acuosa, donde es totalmente accesible para los microorganismos. - Fase líquida no acuosa: El contaminante líquido en fase no acuosa se encuentra en forma de gotas o película sobre las partículas del suelo. Esta fase es característica de los HC (Stelmack y col., 1998). En este caso el contaminante no está totalmente accesible para el microorganismo y es necesario mejorar su biodisponibilidad. 1.3.3. Ventajas y desventajas de la tecnología de biorremediación Ante la necesidad de desarrollar procesos respetuosos con el medio ambiente, los procesos de biorremediación se presentan como una alternativa sostenible que no genera residuos nocivos (Gothalwal, 2013). Sus características de no toxicidad, en comparación con otros métodos que tienden a formar subproductos de mayor toxicidad que la de los contaminantes originales (Shannon y Unterman, 1993), hacen que su popularidad sea grande al percibirse como más respetuosos con el medio ambiente que el resto de tecnologías. Sin embargo, el desconocimiento de sus posibilidades de aplicación, en términos de biodegradabilidad, por parte de consultoras y administraciones encargadas de las autorizaciones, es un problema añadido y contribuye a atribuirle dudas en cuanto a su eficacia. Los procesos de biorremediación pueden desarrollarse mediante un gran abanico de técnicas (Tabla 1.6.), todas ellas conocidas a nivel internacional aunque en continuo proceso de estudio y mejora. Este hecho permite acoplarse a distintos episodios de contaminación según las características del entorno. 26 Introducción Tabla 1.6. Tecnologías de biorremediación. Bioestimulación Estimulación de la comunidad microbiana endógena del suelo a través de soluciones acuosas enriquecidas con micronutrientes; usado en procesos in situ o ex situ (Alexander, 1994). Bioaumento Adición de cultivos microbiológicos a un medio contaminado; usado frecuentemente en biorreactores y sistemas ex situ. Atenuación Natural Monitorizada Consiste en la monitorización de un sitio contaminado para asegurar que la atenuación natural mediante los microorganismos originalmente presentes en el suelo está ocurriendo; es decir, que el proceso natural para limpiar o atenuar la contaminación se lleva a cabo (USEPA, 2001). Bioventeo o Bioventing Estimulación de la biodegradación natural en condiciones aerobias a través del suministro de aire (van Deuren y col., 1997). Biorreactores La biodegradación se lleva a cabo en un biorreactor. Suele usarse para tratar suelos heterogéneos y poco permeables, o cuando es necesario disminuir el tiempo de tratamiento, permite controlar procesos químicos, físicos y biológicos, que mejoran y aceleran la biodegradación. Es la tecnología más adecuada cuando existen peligros potenciales de descargas y emisiones (Riser-Roberts, 1998). Biopilas El suelo se dispone en hileras. Se adiciona agua y nutrientes y un sistema de aireación continuado. Generalmente se cubren con plástico para controlar los lixiviados, la evaporación y la volatilización de contaminantes, además de favorecer su calentamiento (Eweis y col., 1999). Compostaje Tratamiento del suelo con compuestos orgánicos biodegradables (paja, serrín, estiércol, desechos agrícolas, etc.) que ayudan a mejorar el balance de nutrientes, asegurar una mejor aireación y generación de calor, para obtener subproductos inocuos estables (Semple y col., 2001). Landfarming La superficie del suelo contaminado es tratada en el mismo sitio por medio del arado. El suelo contaminado se mezcla con tierra nueva y se remueve periódicamente para favorecer su aireación (Riser-Roberts, 1998). La mayoría de las técnicas de biorremediación mencionadas en la Tabla 1.6 favorecen la conservación del recurso suelo y aprovechan el potencial natural de regeneración del mismo. Sin embargo, se identifican diversos problemas que obstaculizan su aplicación. En algunas, como landfarming o biopilas, se requieren grandes superficies. Además, de forma general, la biorremediación puede ser un proceso muy lento para algunos casos de contaminación; en las condiciones más óptimas pueden pasar semanas para que el 50% de un combustible diésel se biodegrade, y hasta años para el 10% de un crudo de petróleo en condiciones menos óptimas (Fingas, 2013), con los consecuentes impactos al ecosistema durante todo ese periodo. A pesar de ser un tratamiento más lento que otras técnicas de tipo físico-químico, y estar sujeto a la capacidad de los microorganismos para utilizar los contaminantes como sustrato, la biorremediación emerge como una opción atractiva debido, principalmente, a sus bajos costes económicos (Sutherland y col., 2004; Chen y col., 2006; Juwarkar y col., 2010), especialmente cuando los contaminantes pertenecen al rango medio de destilación del petróleo, como es el caso del diésel (Wang y Bartha, 1994). 27 Capítulo 1 En la Tabla 1.7 se recogen datos sobre costes de operación para distintas tecnologías de descontaminación de suelos, estimados por diversos autores y en distintos ámbitos. Se aprecia que los procesos biológicos pueden llegar a ser la opción más atractiva económicamente en cada una de las comparativas. Tabla 1.7. Comparación de costes de operación de distintas técnicas de descontaminación de suelos, según diversos autores. Costes de Operación USEPA (2002)(2) Eweis y col., (1999) Juwarkar y col., (2010). ($/t) ($/t) (₤/t) 30-75 110 100-200 5-170 Tratamientos de descontaminación PNIR 20072015(1) (€/t) Tratamientos biológicos Tratamientos térmicos 60-90 350-600 250-1.000 30-750 Solidificación/Estabilización - 210 - 17-171 Tratamientos físico-químicos 70-100 90 - 12-600 Notas: (1) Plan Nacional Integrado de Residuos. Anexo 13. II Plan nacional de recuperación de suelos contaminados. (2) Los valores presentados son un promedio de 231 proyectos aplicados para una gran variedad de contaminantes biodegradables (gasolinas, lubricantes y HAP). 1.3.4. Contexto actual del uso de las técnicas de biorremediación Tal y como se ha comentado anteriormente, para la implementación de cualquier tecnología de biorremediación de suelos contaminados con HC se requiere un estudio previo de viabilidad que proporcione la información suficiente para determinar la selección y optimización del tratamiento específico (DOE / PERF, 2002). La práctica más común para la biorremediación de suelos con HC es excavar la tierra contaminada y colocarla en un sitio específico para llevar a cabo la atenuación natural (Kauppi y col., 2011) o la bioestimulación. Los biotratamientos de biopilas son los más comúnmente aplicados a escala real (Riser-Roberts, 1998; Jørgensen y col., 2000; Gallego y col., 2011). Por un lado, lo más habitual es que esta tecnología realice la estimulación de la actividad microbiana aeróbica a través de la aireación y/o adición de nutrientes (N y P, sobre todo) (Peltola y col., 2006), surfactantes para aumentar la disponibilidad del HC (Thomassin-Lacroix y col., 2002; Sarkar y col., 2005; Lin y col., 2010; Xu y Lu, 2010), control de la humedad y otras enmiendas (astillas de madera, paja, serrín, etc.) (Jørgensen y col., 2000; Mohn y col., 2001; Mihial y col., 2006). 28 Introducción Por otro lado, se han aumentado los conocimientos generales sobre el diseño y la eficiencia de las biopilas mediante estudios detallados de los procesos químicos y microbianos que se producen (Chaîneau y col., 2003; Yerushalmi y col., 2003), y específicamente acerca de la evolución de las diferentes familias de HC durante el proceso de biorremediación (Pollard y col., 1999; Gallego y col., 2007). Respecto a la adición de surfactantes, los ramnolípidos han sido unos de los tensioactivos más estudiados en la bioestimulación de la degradación de HC. En una revisión, Mulligan y col., (2001) indicaron que los ramnolípidos pueden solubilizar eficazmente HC y mejorar la biodegradación. Sin embargo, la adición de éstos también puede inhibir la degradación (Chen y col., 2000). En cuanto a los tratamientos de bioaumento, a menos que las condiciones de crecimiento sean óptimas, la adaptación bacteriana puede ser relativamente lenta y llevar a unos malos resultados de biodegradación (Romantschuk y col., 2000; Sinkkonen y col., 2010). Sin embargo, en la literatura se pueden encontrar estudios con diversos grados de éxito en los procesos de bioaumento (Volkering y col., 1998; El Fantroussi y Agathos, 2005; Lin y col., 2010; Xu y Lu, 2010). Thouand y col. (1999) observaron que los inóculos comerciales no eran tan eficaces como los inóculos naturales enriquecidos del emplazamiento contaminado. La eficacia de este enfoque se ve afectado por la capacidad sobre el uso de los HC disponibles que desarrollen los consorcios microbianos autóctonos inoculados y que éstos sean capaces de permanecer activos en el sitio de tratamiento (Lin y col., 2011). En este sentido, de la literatura se deducen resultados ambiguos en cuanto a la estrategia de bioaumento. Sin embargo, en estudios más recientes se han desarrollado proyectos de biorremediación mediante la combinación de las técnicas de bioestimulación y bioaumento (Lin y col., 2011; Adams y col., 2015) que parecen ser más alentadores, con resultados de hasta el 90% de eliminación de HC. Estos estudios ayudan a mejorar y asegurar la eficacia de la biodegradación de HC, siendo importante estudiar los factores bióticos y abióticos para una mejor selección de la estrategia de biorremediación. 29 Capítulo 1 1.4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, G. O., Fufeyin, P. T., Okoro, S. E., Ehinomen, I. (2015). Bioremediation, Biostimulation and Bioaugmention: A Review. International Journal of Environmental Bioremediation & Biodegradation. 3:28-39. Alexander, M. (1994). Biodegradation and Bioremediation. Academic Press. San Diego, USA. Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. American Society for Microbiology. 59:1. AOP. (2013). Memoria de datos estadísticos del sector. Asociación Española de Operadores de Productos Petrolíferos. Madrid, España. Atlas, R. M., Bartha, R. (2002). Ecología microbiana y microbiología ambiental. 1ª Ed. Pearson Education. Madrid, España. 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No es prudente utilizar solo los resultados de las últimas investigaciones y aplicar sólo soluciones innovadoras. La mayoría de los conocimientos están ya disponibles y, en la práctica, a menudo, no son suficientemente utilizados. Por tanto, es necesario dar a conocer el estado del arte e incitar al uso general de las herramientas de análisis más sencillas. Las tecnologías de biorremediación, o los tratamientos biológicos en general, son un pilar clave de la tecnología para el desarrollo sostenible en la eliminación de una amplia gama de contaminantes del suelo. Los tratamientos biológicos suponen una contribución significativa en los esfuerzos de recuperación y descontaminación donde otros métodos de tratamiento físico-químico pueden no ser suficientes ni factibles. Para que la biorremediación sea exitosa se requieren esfuerzos sistemáticos en investigación, centrados en diferentes aspectos, para hacer el proceso más seguro, económico y respetuoso con el medio ambiente. Desde el año 2006, el Departamento de Ingeniería Química de la UCLM, aprovechando su experiencia previa en el campo de la Ingeniería Ambiental, y teniendo en cuenta la importancia de la problemática ya expuesta sobre la contaminación del suelo, realiza investigaciones relacionadas con el tratamiento de suelos contaminados mediante diferentes tecnologías, contando para ello con la ayuda conseguida en varios proyectos del Plan Nacional (CTM2006-02214, CTM2007-60472, CTM2010-18833, CTM2013-45612) y otros a nivel regional o con financiación privada. En este contexto se sitúa la investigación que aborda la presente tesis doctoral, que pertenece al Programa de Doctorado Ingeniería Química, Ambiental y de los Materiales (interuniversitario entre UCLM y URJC) y que se ha realizado en dos instituciones: la empresa Alquimia Soluciones Ambientales y la Universidad de Castilla-La Mancha. Por un lado, la citada empresa consiguió para la autora de la presente tesis doctoral una ayuda pre-doctoral para la formación de personal investigador (Beca FPI) para la realización de tesis doctorales en empresas privadas, ayuda concedida por la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha. 39 Capítulo 2 Por otro lado, la UCLM ha contado con la ayuda del Proyecto CTM2006-02214 (Biorremediación acelerada de suelos contaminados con hidrocarburos tipo Diésel), el Proyecto PBI08-0206-7303 (Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos mediante consorcios microbianos mixtos) de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, y el Proyecto UCTR080150, con el mismo título del anterior, y financiado por la citada empresa. El objetivo de esta investigación es estudiar el tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos tipo diésel mediante la mejora del proceso de biorremediación. Se persigue conocer los fundamentos de dicha tecnología, estudiar la influencia de determinadas variables a escala de laboratorio, realizar posteriormente una extrapolación a mayor escala y finalizar con un estudio de viabilidad técnica y económica. Se selecciona el diésel como modelo de contaminante, por contener una amplia mezcla de HC y considerando la gran probabilidad de casos de contaminación que puedan surgir en el territorio de Castilla-La Mancha y el riesgo potencial que representa para los ecosistemas. Para alcanzar el objetivo global planteado, el presente trabajo se ha desglosado en una serie de objetivos parciales que se describen a continuación: - Obtener y caracterizar consorcios microbianos mixtos con capacidad biodegradadora de HC, aislados de suelos contaminados o sin contaminar, para ser utilizados en los experimentos de biorremediación. - Estudiar la biodegradación de los hidrocarburos diésel a escala de laboratorio, identificando la influencia de las variables de operación más habituales y realizando una modelización matemática del proceso. - Estudiar el proceso de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos diésel a escala de laboratorio, bajo condiciones de operación controladas. Identificar y analizar los factores más influyentes (tipo de inóculo, suelo, estrategia de bioaumento, etc.), y realizar una modelización matemática del proceso. - Estudiar la viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación propuestas a escala de planta piloto. 40 Antecedentes, objetivo y alcance - Evaluar la viabilidad de la implementación a escala industrial del proceso de biorremediación a través de las estrategias seleccionadas. Diseñar el proceso y calcular sus costes. Para conseguir estos objetivos se planteó un programa de investigación con las siguientes etapas: 1. Estudio bibliográfico previo. 2. Puesta a punto de dispositivos experimentales y técnicas de análisis. 3. Experimentación en laboratorio: estudio de la biodegradación de los hidrocarburos diésel y, posteriormente, estudio de la biorremediación de suelos contaminados con diésel. 4. Extrapolación del estudio de biorremediación a escala de planta piloto. 5. Diseño de un prototipo a escala industrial y estudio de viabilidad técnica y económica con el proceso optimizado según los resultados de las etapas anteriores. La experimentación en la etapa 3 se realizó íntegramente en los laboratorios del Departamento de Ingeniería Química de la UCLM, y la experimentación en la etapa 4 se realizó íntegramente en las instalaciones de la empresa Alquimia Soluciones Ambientales. 41 42 Capítulo 3 ••••••••• Reactivos y disolventes Caracterización de los suelos objeto de estudio Caracterización del diésel Análisis de hidrocarburos por cromatografía gaseosa Materiales y medios para el cultivo de microorganismos Aislamiento de las poblaciones presentes en los suelos Enumeración de la población microbiana por la técnica NMP Cultivo y mantenimiento de los consorcios microbianos ••••••••• Materiales y procedimientos comunes 43 Capítulo 3 44 Materiales y procedimientos comunes 3.1. REACTIVOS Y DISOLVENTES Todos los reactivos y disolventes utilizados en este trabajo fueron de la mayor pureza disponible comercialmente. El agua utilizada en los medios de cultivo fue bisdesionizada, calidad Milli-Q. El n-hexano y la acetona utilizados para cromatografía fueron de calidad analítica, suministrados por la casa Merck, y los patrones de hidrocarburos (HC) empleados en cromatografía para la identificación de los compuestos se obtuvieron de la casa Supelco. La fuente de carbono adicionada a los medios de cultivo para el crecimiento y 1 mantenimiento de los microorganismos hidrocarburolíticos (HiC), así como la fuente de contaminación de los suelos objeto de estudio, fue un gasóleo diésel comercial de tipo A para automoción adquirido en una estación de servicio de Ciudad Real. 3.2. CARACTERIZACIÓN DE LOS SUELOS OBJETO DE ESTUDIO Las muestras de suelos utilizadas en el presente trabajo fueron tomadas de distintas zonas de la provincia de Ciudad Real. La muestra de suelo A (S A) fue tomada cerca de una carretera secundaria entre Ciudad Real y Puertollano con indicios de contaminación por el alto tránsito de vehículos; las muestras B y C (SB y SC) son ambas el mismo suelo, tomadas cerca de un tanque de almacenamiento industrial de HC, pero SB se contaminó artificialmente en el laboratorio con gasóleo diésel (C12-C28) después del muestreo. El suelo D (SD) se tomó de la finca experimental “Dehesa de Galiana”, explotada por la Universidad de Castilla-La Mancha, siendo la geomorfología de la zona de textura arcillosa. Finalmente, el suelo E (SE) se tomó de una zona pantanosa cercana al río Záncara a su paso por Socuéllamos (Ciudad Real), un terreno formado mayoritariamente por limos. La profundidad de muestreo fue entre la superficie y 40 cm por debajo. Las muestras fueron guardadas en bolsas estériles y etiquetadas. Una vez realizada la toma de muestras, éstas se llevaron al laboratorio para acondicionarlas de cara a su posterior caracterización. Dicho acondicionamiento consistió en: - Secado. Antes de ninguna manipulación, la muestra de suelo fue secada al aire a temperatura ambiente durante 24 h. 1 Los microorganismos hidrocarburolíticos son aquellos capaces de degradar hidrocarburos, obteniendo de ellos la fuente de carbono y la energía necesarias para su crecimiento. 45 Capítulo 3 - Tamizado. Desde el punto de vista analítico, sólo tienen interés las partículas de suelo con un tamaño inferior a 2 mm de diámetro, en cuya superficie se verifican la casi totalidad de las reacciones del suelo. Por ello, las muestras se pasaron por un tamiz entre 2.000 μm y 160 μm de luz de malla, no siendo en este trabajo una variable de estudio el tamaño de partícula. - Almacenaje. Las muestras se guardaron en condiciones aróbicas a 4 °C en oscuridad hasta posterior análisis y experimentación. A continuación, se detallan los principales análisis físico-químicos realizados a las muestras de suelos y cuyos resultados se presentan al final de este apartado en forma de tabla (Tabla 3.1). Medida de pH La determinación de pH en el suelo se realizó según el método de la pasta saturada ISO 10390 (1994), que consiste en la preparación de una suspensión de suelo en agua en proporción 1:2,5 (v/v). Para ello, se suspendieron 10 g de suelo en 25 mL de agua destilada a pH 7 agitándose mecánicamente durante 30 min. Seguidamente se filtró la suspensión y se procedió a la lectura de pH en un pHmetro Crisol modelo Basic 20. Determinación de la humedad La humedad de un suelo se define como la cantidad de agua que existe en él, referida en porcentaje en peso sobre el total húmedo (% p/p). Para ello se secó una cantidad conocida de suelo a 105 °C durante 16 h en un crisol cerámico previamente tarado. El contenido en agua se calculó por diferencia gravimétrica según el método ISO 11465 (1996). Determinación de la capacidad de campo Se define capacidad de campo como la cantidad máxima de agua (expresada en valores de humedad) que es capaz de retener el suelo sometido a drenaje libre (Israelsen y West, 1922). Para su determinación se empleó un vial de plástico de 50 mL de capacidad nominal. En él se introdujo una base de lecho poroso como soporte del suelo, concretamente arena de obra, y 30 g de suelo seco. Seguidamente se colmató el suelo con agua y se dejó que el exceso de la misma se eliminara por gravedad, mediante una pequeña 46 Materiales y procedimientos comunes perforación en el fondo del vial. Finalmente, cuando cesó la pérdida de agua, por diferencia gravimétrica se obtuvo la capacidad de campo de la muestra de suelo. Análisis de Carbono Total (CT) La concentración de CT resultó de la suma de carbono orgánico más carbono inorgánico, determinados por combustión del suelo en una cámara de reacción a 680 °C empleando un catalizador oxidante. Previamente, se eliminó el agua presente en la muestra mediante su secado en mufla a 110 °C durante 24 h. De esta forma, el carbono existente tanto orgánico como inorgánico se oxidó a CO 2, el cual se detectó en un analizador TOC-5050 de Shimadzu mediante lectura infrarroja. Determinación de la conductividad eléctrica La conductividad eléctrica es una expresión numérica de la capacidad de una disolución para transportar una corriente eléctrica. Esta capacidad depende de la presencia de iones y de su concentración total, de su movilidad, valencia y concentraciones relativas, así como, de la temperatura de medición. Su determinación según el método del extracto saturado ISO 11265 (1996) consistió en disponer una suspensión suelo:agua en proporción 1:5 (v/v) agitándose mecánicamente durante 40 min. Posteriormente, se dejó reposar la mezcla durante 15 min, se filtró y se procedió a la medida en un conductímetro Crisol modelo Basic 30. Determinación de metales pesados y oligometales La identificación de los metales presentes en el suelo se llevó a cabo mediante un análisis con digestión previa. Para realizar la digestión, la muestra de suelo se puso en contacto con 8 mL de HNO3 y 2 mL de HCl en un microondas del tipo Ethos Plus Microwave Labstation a una temperatura final de 180 °C. El residuo resultante se analizó mediante espectrometría atómica por acoplamiento de plasma inducido (ICP-AES). Este procedimiento está basado en el método APHA 3120b (1998). Determinación de la textura del suelo. Para determinar la textura de las muestras de suelo se recurrió al método del densímetro de Bouyoucos (ASTM 152H, 1993). Este método se basa en que la densidad de una suspensión depende de la cantidad de materia suspendida y, asimismo, se sabe que la velocidad de sedimentación depende del tamaño de las partículas (ley de Stokes). Por tanto, a distintos tiempos, sedimentarán partículas de distinto tamaño. Para ello, se preparó una suspensión de 50 g de muestra de suelo en 400 mL de agua destilada y 10 mL de solución dispersante (preparada con 35,7 g de 47 Capítulo 3 hexametafosfato sódico y 7,94 g de carbonato sódico en 1 L de agua destilada). A continuación, la suspensión se agitó mecánicamente durante 30 min. Transcurrido ese tiempo, la mezcla se transfirió a una probeta de 1 L, enrasándose con agua destilada. Se agitó vigorosamente durante 2 min y una vez finalizada, se tomó el tiempo y se dejó la mezcla en reposo. A los 40 segundos se realizó la primera lectura con el densímetro, tomando también el valor de la temperatura. La segunda lectura se llevó a cabo a las 2 h desde que finalizó la agitación, midiéndose nuevamente la temperatura y la densidad. A través de la ecuación [2.1], que relaciona las dos variables medidas, fue posible determinar las fracciones de los distintos componentes del suelo (en función de su textura) expresados en porcentaje en peso (%). X d (T 20) 0,36 100 P [2.1] -1 siendo X, % de Arcilla o % Limo + Arcilla; d, lectura del densímetro (g L ); T, temperatura de la suspensión (°C); P, peso total de la muestra de suelo (g); 20, temperatura de calibración del densímetro (°C); 0,36, factor de corrección de la temperatura. Se sustituyeron los valores obtenidos en las respectivas lecturas, determinándose así el % de limo + arcilla, % de arcilla y % de arena por diferencia de los anteriores. Una vez que se obtuvieron las fracciones de suelo, se empleó el diagrama triangular para la clasificación textural del suelo desarrollado por el United States Department of Agriculture (USDA, 1971) para determinar la textura de las muestras de suelo. Determinación de la concentración de Hidrocarburos Totales del Petróleo en el suelo La determinación del contenido de HC presentes en las muestras de suelo se llevó a cabo según la norma UNE-EN 14039 (2005) para la caracterización de residuos y suelos utilizando n-hexano como agente extractor y analizando el extracto orgánico mediante cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama (GC-FID), tal y como se detalla en el apartado 3.4 de este capítulo. Como se ha indicado anteriormente, en la Tabla 3.1 se recogen los valores de los parámetros indicados para los cinco tipos de suelo utilizados en la presente investigación. 48 Materiales y procedimientos comunes Tabla 3.1. Resultados de la caracterización de los suelos utilizados en la presente investigación. Propiedad SA SB SC SD SE 40,0% 15,0% 45,0% 22,7% 26,9% 50,4% Francoarcilloarenoso 22,7% 26,9% 50,4% Francoarcilloarenoso 50,4% 9,6% 40,0% 4,9% 58,4% 36,7% Arcilloarenoso Francolimoso 7,4 37,0 8,2 39,4 6,6 39,4 5,6 55,2 12,5 62,0 1,3·106 0,4·106 2,3·108 2,3·108 28·108 24·106 50·108 1,4·106 11·106 22·104 pH en agua (1/25 p/v) Cond. eléctrica (μS cm-1) 8,01 242 8,46 366 8,26 497 8,32 253 7,72 2.650 Carbono Total (% p/p) TPH (mg Kg-1) Metales pesados (mg Kg-1) Ag Al Ni As Sn Pb Ti Mn Si (mg Kg-1) Oligoelementos 0,55 16,6 0,56 770,4 0,34 25,0 1,83 0,0 3,98 0,0 178,7 43.482 n.d n.d 12,3 122,4 - 28,9 28.495 n.d n.d 12,3 122,4 - 83,07 26.840 n.d n.d 680,2 7,5 - 202,9 20.736 64,2 4,6 876,2 8,1 1.888 103,7 2168 2,9 2.922 n.d. n.d. 340,1 4,9 91,6 n.d. 1508 B 31,6 Cr 53,2 Co n.d Ba 221,2 Na 392,2 Zn 76,0 Cu n.d. -1 Seimportantes (mg Kg 575,0 Otros nutrientes ) Ca 4.919 Fe 34.531 Mg 3.216 K 2.769 26,1 22,2 n.d. 217,7 392,1 27,8 n.d. 539,2 37,2 21,5 n.d. 242 323,0 22,2 n.d. 472,7 n.d. 70,0 n.d. 250,9 148,5 36,0 5,7 490,8 n.d. n.d. n.d. 25,5 83,1 n.d. n.d. n.d. 26.612 29.481 6.489 6.401 36.712 27.518 9.258 9.442 34.075 26.950 518,0 19.071 93.415 9.002 162 6.234 Textura Arcilla Limo Arena Definición Humedad (% p/p) Capacidad de campo (%) HeT NMP g suelo -1 HiC NMP g suelo -1 Arcilloarenoso Nota: n.d, elemento no detectado en la muestra. Todas las concentraciones se expresan en peso de suelo seco. 3.3. CARACTERIZACIÓN DEL GASÓLEO DIÉSEL Se llevó a cabo la caracterización física y química del gasóleo diésel (en adelante, diésel) empleado como contaminante en este trabajo para determinar su composición y propiedades más relevantes. Para ello, se determinó primero la densidad del diésel de -1 acuerdo a la norma ISO 3675 (1998) resultando un valor de 832 g L . A continuación, se realizó la destilación de una fracción volumétrica del mismo según la norma ASTM-D86 49 Capítulo 3 (2004), y mediante el simulador Hysys® se estimó que su composición (Ver Anexo I) era de: 75% de HC saturados (principalmente parafinas incluyendo, n, iso y cicloparafinas) y 25% de HC aromáticos. Por otro lado, mediante cromatografía gaseosa, tal y como se describe en el apartado 3.4 de este capítulo, se obtuvo el perfil cromatográfico de los distintos HC que componen el diésel. Mediante la superposición con un multi-patrón comercial (Absolute Standard, Inc. Hamden, CT), se identificaron los distintos compuestos según coincidencia en tiempo de retención (Figura 3.1); identificándose compuestos entre 10 y 26 átomos de carbono. Figura 3.1. Perfil cromatográfico del diésel utilizado con superposición de patrón. Se detectaron también compuestos más ligeros y más pesados que podrían ser C9 y C27, pero no llegaron a identificarse, así como, el resto de compuestos intermedios. Entre los compuestos C14-C15 y C16-C17 se detectaron dos compuestos intermedios con concentración importante y no reconocidos que podrían ser el Pristano y el Fitano, componentes clásicos de un diésel convencional. 3.4. ANÁLISIS DE HIDROCARBUROS POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA La concentración de hidrocarburos totales del petróleo (en adelante TPH, de sus siglas en inglés Total Petroleum Hydrocarbon) se utilizó como parámetro analítico para estudiar la biodegradabilidad de diésel en los experimentos de esta investigación. 50 Materiales y procedimientos comunes El análisis de TPH se llevó a cabo mediante cromatografía gaseosa en un cromatógrafo de gases Trace GC Ultra (ThermoFisher Scientific). Los HC presentes en las muestras fueron extraídos con n-hexano y separados en una micro-columna ULTRA FAST capilar con una longitud de 5 m, 0,1 mm de diámetro interno y 0,4 µm de espesor de fase con un detector de ionización de llama. El inyector y el detector se programaron a una temperatura de 250 °C y 280 °C, respectivamente y la rampa térmica empleada fue la siguiente: Tinicial de 50 °C durante 0,1 min seguida de un gradiente de 40 °C min -1 hasta una Tfinal de 280 °C durante 2,68 min. El gas portador utilizado fue helio de -1 máxima pureza y se trabajó a flujo constante de 50 mL min . Los gases de llama utilizados fueron aire, nitrógeno e hidrógeno. El volumen de muestra utilizado por análisis fue de 1,5 µL y la inyección de la misma se realizó en modo split. El equipo utilizado permitía trabajar en modo automático gracias a un muestreador programable. 3.5. MATERIALES Y MEDIOS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS Todos los medios nutritivos, soluciones y materiales utilizados para el cultivo de microorganismos en este trabajo (excepto el diésel) se esterilizaron en un autoclave; los medios y soluciones a 121 °C durante 15 min a 1 atm de presión, y los sólidos a 121 °C durante 30 min a 1 atm de presión, seguidos de un proceso de secado durante 35 min. El procedimiento de esterilización del diésel consistió en un filtrado a través de una membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 μm de diámetro de poro. De este modo, se evitan las posibles pérdidas de compuestos volátiles, que podrían tener lugar durante la esterilización en autoclave, y se garantizan igualmente las condiciones de asepsia. El aislamiento y crecimiento de los microorganismos HiC se realizó en caldo Bushnell-Haas (BHB) de la marca Difco (ver composición en Cuadro 3.1), medio especialmente recomendado para el examen microbiológico de combustibles por la Sociedad Industrial Microbiológica (SIM, Society for Industrial Microbiology) (Allred y col., 1963), suplementado con diésel como única fuente de carbono. Cuadro 3.1. Composición del caldo BHB. MgSO4 ____________________________ 0,20 g CaCl2 ______________________________ 0,02 g KH2PO 4 _____________________________ 1,00 g (NH4)2HPO4__________________________ 1,00 g KNO3 ______________________________ 1,00 g FeCl3 ______________________________ 0,05 g Composición por litro de agua 51 Capítulo 3 En cuanto a los materiales utilizados, cabe destacar los frascos utilizados para el aislamiento y cultivo de los microorganismos. Estos frascos de cultivo, proporcionados 3 por la casa Sarstedt, son estériles y tienen una capacidad nominal de 75 cm , fabricados de poliestireno con el fondo plano, cuello inclinado y con tapón de ventilación provisto de membrana hidrófoba de 0,2 µm que facilita el intercambio gaseoso, característica imprescindible ya que es necesario garantizar condiciones aerobias manteniendo la esterilidad del medio. El equipo incubador utilizado fue de tipo Ecotrón, que permitió la agitación orbital y el mantenimiento de una temperatura adecuada garantizada en todo momento por un sistema de control automático. 3.6. AISLAMIENTO DE LAS POBLACIONES PRESENTES EN LOS SUELOS Tras realizar el tamizado y con los suelos frescos, se procedió al aislamiento de los microorganismos presentes. Para ello, se depositaron 5 g de suelo en un frasco de cultivo y se añadieron 50 mL de BHB. La suspensión se mantuvo durante 12 h en un equipo Ecotrón bajo unas condiciones controladas de agitación (50 rpm) y temperatura (26 °C), con el fin de facilitar el desprendimiento de los microorganismos de las partículas de suelo. Transcurrido este tiempo, la suspensión se trasladó a un tubo Falcon y se centrifugó a 500 xg durante 20 min en una centrífuga Mixtasel de Selecta. El sobrenadante con los microorganismos aislados fue recogido y denominado suspensión inicial (SI). 3.7. ENUMERACIÓN DE LA POBLACIÓN MICROBIANA POR LA TÉCNICA NMP Una vez que los microorganismos se habían aislado en la SI, se procedió a la cuantificación de la población microbiana presente, tanto de los microorganismos heterótrofos totales (HeT), como de los microorganismos HiC. Para tal fin, se utilizó la técnica del Número Más Probable (NMP), empleando la tabla diseñada para series de 5 tubos por dilución (APHA, 2001). La técnica NMP es un método eficiente de estimación de densidades poblacionales, especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible (Oblinger y Koburger, 1975). La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo 52 Materiales y procedimientos comunes particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizar. El número estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística, no siendo el resultado un número preciso (entre el 95 y 99% de intervalo de confianza). Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad), (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de fiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en placas de cultivo, entre otros. Brevemente, el procedimiento seguido consistió en, a partir de la SI de los -9 microorganismos, realizar diluciones seriadas en base 10 hasta 10 , utilizando suero fisiológico estéril como diluyente. Seguidamente, se inoculó 1 mL de cada una de las diluciones, por quintuplicado, en tubos que contenían 5 mL de medio Luria Bertani (LB) suplementado con 0,2% de glucosa o 5 mL de medio BHB suplementado con 1% de diésel, según se pretendiera determinar los microorganismos HeT o la cantidad presente de microorganismos HiC, respectivamente. En ambos casos, se añadió a los medios el -1 indicador redox resazurina, a una concentración de 1 mg L , para favorecer la identificación de los tubos positivos al producirse crecimiento microbiano y la reducción, por tanto, del medio. Los tubos se incubaron durante 3 días en una estufa de incubación a una temperatura de 26 °C, transcurridos los cuales se procedió a la lectura de los resultados. En el caso de los microorganismos HeT, los tubos se consideraron positivos cuando se produjo un viraje de rosa a amarillo, mientras que para los HiC los tubos positivos viraron de azul a rosa. Estos cambios eran el resultado de la reducción de la resazurina como consecuencia del consumo de oxígeno por parte de los microorganismos. 3.8. CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE LOS CONSORCIOS MICROBIANOS El inóculo original, a partir del cual se desarrolló el consorcio microbiano, fue la suspensión inicial (SI) obtenida en el proceso de aislamiento de los microorganismos presentes en cada una de las muestras de suelo. A partir de la SI se llevó a cabo el crecimiento de microorganismos HiC. Para ello, se inocularon 500 μL de SI en frascos de cultivo conteniendo 50 mL de medio BHB suplementado con 1% (v/v) de diésel. Cada cultivo se incubó en un equipo Ecotrón a 50 rpm y 26 °C y se resembró cada semana para mantenerlo en continuo crecimiento y adaptación hasta que se realizaron los 53 Capítulo 3 distintos experimentos de biodegradación. La resiembra consistió en una dilución del cultivo, envejecido a los 7 días, en medio fresco a una proporción 1:200. En bibliografía se pueden encontrar casos similares de adaptación al consumo de HC con cultivos de microorganismos procedentes de suelos contaminados (Viñas, 2005). En total se aislaron y enriquecieron cinco consorcios distintos de microorganismos, correspondientes a los cinco suelos utilizados, tal como se recoge en la Tabla 3.2. Tabla 3.2. Definición de los consorcios aislados. Procedencia del suelo 54 Denominación del suelo Denominación del consorcio Orilla carretera SA XA Cubeto Industrial SB XB Cubeto Industrial SC XC Finca Galiana SD XD Orilla río Záncara SE XE Materiales y procedimientos comunes 3.9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Allred, R. 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Barcelona, España. 55 56 Capítulo 4 ••••••••• Verificación del proceso de enriquecimiento Composición de la comunidad microbiana Biodegradación del diésel mediante los consorcios XA, XB y XC Estimación de parámetros cinéticos: - Influencia de la concentración de sustrato - Influencia de la temperatura de reacción - Influencia del tipo de consorcio Producción de biosurfactantes por los consorcios XA, XB y XC ••••••••• Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos obtenidos de suelos contaminados Capítulo adaptado de: - Moliterni, E., Gómez, R., Villar, M., Fernández, F.J., Rodríguez, L., Villaseñor, J. (2012). Kinetics of biodegradation of diesel fuel by enriched microbial consortia from polluted soils. International Journal of Environmental Science and Technology , DOI:10.1007/s13762-012-0071-5. - Moliterni, E., Gómez, R., Fernández, F.J., Rodríguez, L., Villaseñor, J. (2011). Biosurfactants production during diesel biodegradation by mixed microbial consortia selected from polluted soils. International Journal of Environmental Research, 6 (3):751760. 57 Capítulo 4 Dado que cinco consorcios microbianos fueron aislados de diversos suelos con diferentes características, es de esperar que presenten diferentes respuestas a la biodegradación. Con el objetivo de empezar la investigación por los conocimientos básicos de los fundamentos de la biodegradación, se realiza la caracterización de las cinéticas de crecimiento y un pequeño estudio de las capacidades para generar biosurfactantes de tres de los consorcios, identificándose además las especies microbianas que intervienen en el proceso. 58 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 4.1. INTRODUCCIÓN Antes de la implementación de un proceso de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos (HC) es necesario estudiar los fundamentos de la biodegradación de dichos HC. De este modo se podrán estimar los factores más relevantes que influyen en el proceso de biodegradación sin la interferencia que provoca la presencia del suelo. En investigaciones anteriores se han identificado varios factores importantes que afectan a la eficiencia y la velocidad de biodegradación de HC en el suelo, incluyéndose la temperatura, la concentración del contaminante, el pH, el tipo de microorganismo, la biodisponibilidad del sustrato orgánico, la concentración de oxígeno y la concentración de nutrientes en el medio entre otros (Boopathy, 2000; Sabaté y col., 2004; Torres y col., 2005; Iqbal y col., 2007; Kwapisz y col., 2008), siendo el más importante de ellos, el grado de biodegradabilidad de los contaminantes. En general, los cultivos microbianos de una única especie pueden metabolizar un rango limitado de HC. Sin embargo, un consorcio mixto formado por varias especies y con extensas capacidades para producir enzimas y/o tensioactivos, puede ser más eficiente en la degradación (Rahman y col., 2002). Respecto a este punto, las comunidades microbianas presentes en suelos con contaminación crónica suelen estar dominadas por bacterias capaces de sobrevivir a ambientes tóxicos, capaces de utilizar una gran variedad de contaminantes como sustrato para su crecimiento (Macnaughton y col., 1999). Según esta hipótesis, los suelos contaminados podrían ser una de las principales fuentes para obtener colecciones de consorcios degradadores de HC (Margesin y Schinner, 2001). Además, estos microorganismos tendrían la ventaja añadida de haber sido seleccionados de manera natural por diversos factores ambientales (Al-Saleh y col., 2009) y, por tanto, podrían resistir mejor las diversas formas de estrés ambiental. Vieira y col. (2007) seleccionaron varios consorcios microbianos mixtos aislados de diferentes sitios contaminados y evaluaron sus eficiencias en la biodegradación de diésel. Nikakhtari y col. (2009) también aislaron de manera similar otros consorcios y compararon su capacidad de biodegradación con varios consorcios comerciales, concluyendo que estos últimos tenían una menor capacidad de asimilación de HC que los primeros. Por lo tanto, una técnica útil para el tratamiento de suelos contaminados con HC podría ser un tratamiento con estos consorcios (Ueno y col., 2007; Hosokawa y col., 2009), es decir, aplicar cultivos enriquecidos en microorganismos obtenidos previamente de zonas industriales contaminadas. Sin embargo, antes de realizar este tipo de tratamientos, debe probarse la capacidad real, la eficiencia y la velocidad de 59 Capítulo 4 estos consorcios en la degradación de HC en suspensiones acuosas con el fin de evitar las limitaciones de transferencia de materia que aparecen durante el tratamiento del suelo. De esta manera, en la bibliografía se pueden encontrar varios trabajos en los que se han aislado consorcios microbianos de sitios contaminados, se han enriquecido en varios compuestos, especialmente HC, y se ha discutido su potencial metabólico (Zhang y col., 2010; Oliveira y col., 2011). Además, otros trabajos de investigación (Al-Saleh y col., 2009) han estudiado la capacidad de degradación de consorcios aislados de suelos no contaminados, concluyendo que son igualmente capaces de asimilarlos. El éxito de una tecnología de biorremediación dependerá también de la capacidad microbiana para acceder al HC (Margesin y Schinner, 2001), es decir, la biodisponibilidad del contaminante. En este sentido, el uso de surfactantes es una de las líneas de trabajo más importantes en este campo, pues éstos contribuyen positivamente a la disponibilidad de compuestos hidrófobos, favoreciendo el transporte de los HC, permitiendo su solubilización y mejorando, en definitiva, el acceso por parte de los microorganismos (Franzetti y col., 2008). Estos compuestos son moléculas de carácter anfipático que favorecen la formación de emulsiones al estabilizar la dispersión de los HC. Su uso es bastante común en experiencias de biorremediación de suelos contaminados con HC (Christofi y Ivshina, 2002). En algunas investigaciones, se ha visto que algunos surfactantes favorecen la biorremediación pero también se ha visto que otros pueden actuar como tóxicos para los microorganismos o que éstos degradan el surfactante en lugar del contaminante (Banat, 1995). Además, el empleo de estos compuestos químicos en un tratamiento industrial supone un añadido económico importante (Muthusamy y col., 2008; de Gusmão y col., 2010). En las investigaciones actuales, a la hora de hablar de biorremediación, se tienen en cuenta también las vías degradativas o rutas metabólicas de los microorganismos, y se sabe que los consorcios mixtos de bacterias tienen una amplia gama de mecanismos metabólicos para hacer frente a la degradación de los componentes del petróleo, incluyendo la producción de biosurfactantes y emulsionantes (Willumsen y Karlson, 1997). Los biosurfactantes son moléculas emulsionantes secretadas por algunos microorganismos que tienen la misma función que los surfactantes sintéticos. Además, presentan dos ventajas fundamentales frente a los surfactantes químicos: son sustancias más selectivas y más fácilmente biodegradables (Sadouk y col., 2008; Mulligan y col., 2001). Desde hace más de 20 años se llevan a cabo estudios sobre la caracterización y purificación de estos tensioactivos de origen microbiano, ya que son de considerable importancia para su aplicación en diferentes industrias (Cooper y Paddock, 1984; 60 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos Kosaric y col., 1987). Sin embargo, debido a sus bajos rendimientos de purificación, no han podido competir comercialmente hasta la fecha con los tensioactivos sintéticos. Actualmente se están llevando a cabo estudios de aislamiento y caracterización de biosurfactantes y se está probando su aplicación en procesos de biorremediación (Bordoloi y Konwar, 2009; Nayak y col., 2009; Vasileva-Tonkova y col., 2011; TrejoCastillo y col., 2013), intentando demostrar que estas sustancias pueden ser aisladas y utilizadas en la mejora de las tecnologías de biorremediación. 4.2. OBJETIVO El objetivo de este capítulo es estudiar los fundamentos de la biodegradación de diésel mediante varios consorcios microbianos obtenidos de suelos contaminados. El alcance del trabajo realizado es el siguiente: 1. Obtener consorcios microbianos adaptados a la degradación de diésel. 2. Caracterizar la comunidad microbiana de los consorcios obtenidos. 3. Estudiar la biodegradación de diésel mediante experimentos discontinuos en laboratorio y la influencia de varios factores: temperatura, concentración de diésel y tipo de consorcio utilizado. 4. Estudiar la generación de biosurfactantes, su relación con la tensión superficial y su influencia en la biodegradación. 5. Modelizar el proceso de biodegradación y obtener los parámetros cinéticos y estequiométricos característicos. 4.3. PROCEDIMIENTOS 4.3.1. Preparación de los consorcios para el estudio de biodegradación Los consorcios microbianos HiC utilizados en este capítulo fueron aislados de los suelos SA, SB y SC, cuyas características se recogen en la Tabla 3.1 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes, y adaptados al consumo de diésel, tal y como se detalló en los apartados 3.6 y 3.8 de ese mismo capítulo. Una vez comenzó el proceso de adaptación al consumo de diésel, se estudiaron las curvas de crecimiento de cada uno de los consorcios para establecer el mejor momento de inoculación en los experimentos de biodegradación posteriores. Para ello, se adicionaba 1 mL de inóculo de un consorcio adaptado en frascos de cultivo con 100 mL 61 Capítulo 4 de BHB al 1% (v/v) en diésel. Esto se realizó para cada uno de los tres consorcios seleccionados (XA, XB y XC). Los frascos se incubaron en un equipo tipo Ecotrón a 26 °C y 50 rpm durante una semana y periódicamente se tomaron muestras de 1 mL para medir la densidad óptica a 600 nm en un espectrofotómetro UV-Visible modelo UV-1700 PharmaSpec (Shimadzu) hasta alcanzar la fase estacionaria del crecimiento microbiano. Por otro lado, con el fin de conocer si los consorcios se estaban enriqueciendo en bacterias HiC por pura selección natural, se extrajo el ADN de un consorcio ya enriquecido y aislado de uno de los suelos, y se comparó con el ADN extraído del consorcio original de ese mismo suelo antes del proceso de adaptación. En concreto se utilizó el consorcio XA y la muestra de suelo SA. Seguidamente se realizó una electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y se compararon las tiras de ADN de ambas muestras. El procedimiento seguido en la extracción de ADN y el procedimiento de la técnica de DGGE se detallan en el Anexo II. 4.3.2. Caracterización de los consorcios microbianos hidrocarburolíticos XA, XB y XC Una vez adaptados y enriquecidos los cultivos XA, XB y XC, se estimó conveniente realizar una caracterización sencilla mediante la cual fuera posible conocer, de forma aproximada, las especies que formaban parte de la comunidad microbiana obtenida. Se optó por una caracterización mediante las técnicas clásicas, basadas en la información morfológica y fisiológica que aportan las pruebas de aislamiento y los ensayos bioquímicos, no siendo objeto de este trabajo realizar una caracterización por técnicas más complejas, como son las técnicas moleculares. a) Caracterización morfológica en placa de Petri El primer paso en la caracterización consistió en realizar la siembra en placa de Petri de los consorcios microbianos obtenidos en el proceso de aclimatación. De esta forma, se estudiaron morfológicamente las colonias desarrolladas y se aislaron en nuevas placas de Petri para obtener cultivos puros (Richard y Vogel, 1999). Las placas de Petri se prepararon a partir de medio de cultivo Luria Bertani -1 suplementado con glucosa al que se le adicionó 15 g L de agar bacteriológico europeo, todo de la casa Cultimed. Tras su esterilización, el medio se repartió en placas de 90 mm de diámetro y, al enfriarse, se gelificaron obteniéndose el medio sólido deseado. Una vez formadas las placas, se realizó una siembra en superficie. Ésta consistió en inocular 100 µL de una dilución en base 10 de los cultivos microbianos HiC. El inóculo se extendió mediante un asa de Digralsky y las placas permanecieron durante una semana en una estufa de incubación a 26 °C. Pasado ese tiempo, se procedió a la 62 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos identificación de las distintas colonias crecidas mediante un análisis morfológico (para más información ver Cuadro 4.1). Cuadro 4.1. Caracterización morfológica. Dependiendo del número y tipo de colonias obtenidas en las placas de Petri, se pueden caracterizar morfológicamente las especies presentes a partir de una simple colonia. En cambio, si hay diversidad de colonias, se hace necesario obtener el cepario a partir del cual se realizará la caracterización morfológica y bioquímica. Por ello, se realizan nuevas siembras en placa mediante la técnica de siembra por estría múltiple de cada una de las colonias distintas obtenidas en la primera siembra. El examen de las placas de Petri consiste en aportar la mayor cantidad de información morfológica acerca de las colonias para proceder a la caracterización de la manera más exhaustiva posible. Dicha información consiste en registrar datos sobre el tamaño, color, forma, borde, espesor y superficie e, incluso, algún aspecto relevante de la misma (Brock y Madigan, 2001). b) Caracterización citológica La segunda etapa en el proceso de identificación consistió en observar al microscopio las diferentes especies aisladas por el método del examen fresco y la tinción de Gram, y así conocer la morfología celular (coco, bacilo, espiroqueta, etc.), el tipo de agrupación que presentaba el microorganismo, su respuesta frente a colorantes, estimar su tamaño relativo y, eventualmente, también obtener información adicional acerca de otras características citológicas del organismo en estudio (Bergey y col., 1994). El procedimiento consistió en tomar una pequeña muestra del cultivo puro y depositarla sobre un portaobjetos para observarla en el microscopio de campo claro. Seguidamente se pasó al análisis por el método de tinción, concretamente se optó por una tinción de Gram y de nuevo se procedió a la observación de las bacterias con el microscopio; las bacterias teñidas de color rosa se identificaron como Gram negativas, y las azules, como Gram positivas. c) Caracterización bioquímica Una vez conocidos los tipos de cultivos puros a través de las pruebas morfológicas y citológicas ya comentadas, se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas (Balows y col., 1992): - Prueba de la oxidasa. Permitió determinar la presencia de la enzima citocromo oxidasa. Se realizó con un kit comercial de la casa Merck y 63 Capítulo 4 consistió, básicamente, en observar si el cultivo sufría reacción con una solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina. Si la colonia teñía el reactivo de color lavanda y viraba gradualmente a púrpuranegruzco intenso, la reacción era positiva. - Prueba de la catalasa. Permitió comprobar la presencia de la enzima catalasa. Se llevó a cabo a temperatura ambiente mediante el método del portaobjetos. Con un asa de siembra se recogió el centro de la colonia pura a las 18-24 h de crecimiento y con una pipeta Pasteur se agregó una gota de H2O2 al 30%; el resultado se identificó como positivo al observarse la formación inmediata de burbujas. A continuación, se seleccionó el test comercial más apropiado para cada cultivo según las pruebas ya realizadas (Figura 4.1). Aislar microorganismos en placa Coco Bacilo Gram positivo Gram negativo Gram positivo Gram negativo Prueba de catalasa Prueba de oxidasa Otras pruebas bioquímicas Prueba de oxidasa Catalasa positiva Catalasa negativa Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa negativa API 20 Estafilococo API 20 Estreptococo Neisseria API 20 NE API 20 E Figura 4.1. Esquema de las pruebas bioquímicas realizadas según morfologia y citologia celular. Todos los test elegidos para la caracterización eran una galería API (bioMérieux, Lyon, Francia) que consistían en un sistema miniaturizado de micro-tubos rellenos de sustratos deshidratados en los que se recogían las pruebas bioquímicas convencionales más importantes. Se prepararon suspensiones de los cultivos puros, tal y como estaba especificado en los test, se adicionaron a los micro-tubos y se incubaron durante un tiempo específico en una estufa. Pasado el tiempo de incubación, se reveló la galería 64 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos API y se registró el bionúmero obtenido en un programa informático (Apilab® Plus, de bioMérieux). Por comparación con una biblioteca de datos y en base a que los resultados de las reacciones bioquímicas son específicos de cada bacteria, el programa facilitó el género y la especie de la bacteria estudiada. 4.3.3. Diseño de experimentos de biodegradación de diésel Una vez desarrollados los consorcios microbianos HiC, se procedió al estudio de los fundamentos de la biodegradación de diésel. Se estudió la influencia del consorcio utilizado, de la temperatura y de la concentración de sustrato en el desarrollo de la reacción bioquímica. Para ello se llevaron a cabo distintos experimentos discontinuos de biodegradación en fase líquida con tres tipos de consorcios (XA, XB y XC), previamente aislados de los suelos SA, SB y SC, respectivamente, y adaptados al consumo de diésel (Ver Tabla 3.2 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes). En los experimentos que se detallan a continuación (Tabla 4.1), se estudiaron tres temperaturas de reacción, 25, 30 y 35 °C, todas dentro del rango para microorganismos mesófilos, para analizar la dependencia del crecimiento de los consorcios microbianos HiC con ésta. A su vez, se estudió la dependencia de la concentración inicial (C0) de diésel con tres concentraciones distintas, 0,5, 1 y 3% en volumen. En cada grupo de experimentos se realizó además un experimento de control, es decir, en ausencia de microorganismos para evaluar las posibles pérdidas abióticas por volatilización y otras causas. Tabla 4.1. Diseño de experimentos para el estudio de biodegradación de diésel. C0 (% v/v) 0,5 1 3 Consorcio Abiótico XA XB XC Abiótico XA XB XC Abiótico XA XB XC 25 - √ √ √ √ √ √ √ - √ √ √ T (°C) 30 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 35 - √ √ √ √ - Nota: C0, concentración inicial de diésel; √, experimento realizado; -, experimento no realizado. 65 Capítulo 4 Procedimiento experimental y muestreo Para llevar a cabo los experimentos de biodegradación en fase líquida se emplearon matraces Erlenmeyer de 1 L de capacidad con suspensiones de 400 mL de medio BHB y las diversas concentraciones de diésel a estudio; además se inocularon 4 mL del consorcio de microorganismos HiC correspondiente en cada caso. A cada matraz se le sobrepuso un tapón comercial de celulosa que impidiera la entrada de agentes externos que pudiesen intervenir en el desarrollo microbiano, asegurando condiciones asépticas en el medio de cultivo. Una vez inoculados los matraces, se introdujeron en un baño termostatizado de la casa GFL con agitación orbital bajo las condiciones correspondientes de temperatura y de disponibilidad de sustrato según el experimento realizado, y a 130 rpm, es decir, a una agitación vigorosa para garantizar condiciones aerobias en todo el matraz. Durante la experimentación se tomaron muestras cada cierto tiempo y se realizaron análisis de concentración de biomasa, tensión superficial (TS) y concentración de HC para estudiar la evolución de la biodegradación de diésel. En el caso de la concentración de biomasa, se muestrearon 2 mL de cultivo, y para el seguimiento de las otras dos variables, se tomaron 20 mL que sirvieron para medir la TS en primer lugar y, posteriormente, y puesto que la muestra no había sido alterada, realizar el análisis de HC. Experimentos previos para garantizar condiciones aerobias Con el fin de garantizar condiciones aerobias dentro de los matraces durante el desarrollo del estudio de biodegradación, se realizaron unos experimentos previos en los que la concentración de oxigeno disuelto (COD) fue medida bajo las condiciones de operación seleccionadas. Así, para observar la dependencia de la COD con la temperatura de reacción, se realizaron las curvas de crecimiento de uno de los consorcios de microorganismos HiC al 1% (v/v) en diésel, bajo las tres temperaturas de experimentación y a 130 rpm. Se tomaron medidas de la COD con una sonda YSI Modelo 5000 al principio, [COD]i, y al final del crecimiento microbiano, [COD]f, (Tabla 4.2). A medida que aumentó la temperatura, la COD disminuyó ligeramente en el medio; sin embargo, se mantuvo en valores muy próximos y en todo momento se garantizó una COD adecuada para el crecimiento microbiano (Environmental Response Division, 1998). 66 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos Tabla 4.2. Valores medios de COD al inicio y al final de los experimentos previos. Experimento T (°C) [COD]i (mg L-1) [COD]f (mg L-1) 1 2 25 30 7,33 7,58 7,53 6,42 3 35 6,22 6,17 Por otro lado, la presencia de algunos minerales en una solución reduce la solubilidad de los gases disueltos en ella. Así, las sales disueltas en agua reducen los espacios intermoleculares disponibles para la disolución del oxigeno (APHA, 1992). En la Tabla 4.3 se ilustra el efecto combinado de la temperatura y la salinidad sobre la COD. Por este motivo, en uno de los experimentos previos se comprobó también el efecto de la salinidad, con el fin de observar si las sales del medio BHB podían influir en la COD. Tabla 4.3. Concentraciones de oxígeno disuelto en función de la temperatura y la salinidad. Temperatura (°C) 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 0,030 14,621 12,770 11,288 10,084 9,092 8,263 7,559 6,950 6,412 5,927 5,477 9,055 13,728 12,024 10,656 9,541 8,621 7,850 7,194 6,624 3,121 5,665 5,242 Salinidad (%o) 18,080 Salinidad27,105 (%) 12,888 12,097 11,320 10,656 10,058 9,493 9,027 8,540 8,174 7,749 7,457 7,083 6,845 6,516 6,314 6,017 5,842 5,576 5,414 5,174 5,016 4,799 36,130 11,355 10,031 8,959 8,079 7,346 6,728 6,100 5,734 5,321 4,944 4,591 45,155 10,657 9,441 8,454 7,642 6,964 6,390 5,806 5,464 5,078 4,724 4,392 Nota: los datos han sido tomados de Standard Tests Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 1992). En la Tabla 4.4 se presentan los valores de conductividad medidos en el experimento previo a lo largo del tiempo con un conductímetro Crisol modelo Basic 30. De este experimento se puede concluir que la conductividad se mantuvo prácticamente constante durante toda la reacción biológica, por lo que la salinidad no se vio alterada y no provocó cambios importantes sobre la COD. 67 Capítulo 4 Tabla 4.4. Evolución de la conductividad en el experimento previo. Tiempo (h) 0 4 8,5 10,5 24 27,5 72 Media Conductividad (S cm-1) 3,51 3,59 3,54 3,59 3,26 3,25 2,97 3,38 4.3.3.1. Medida de la concentración de biomasa La evolución de la concentración de biomasa respecto del tiempo se determinó midiendo la densidad óptica (DO) del cultivo mediante espectrofotometría a 600 nm, eliminando la turbidez correspondiente al medio de cultivo sin inóculo con la realización de blancos. Estas medidas se llevaron a cabo durante los experimentos en un espectrofotómetro marca Pharma Spec 1700 de la casa Shimadzu. La DO no ofrece una medida real de la concentración de microorganismos en las muestras de los experimentos, pero se trata de una medida fácil y rápida. Para -1 relacionar la DO con la concentración real de microorganismos (g L ) se realizó un calibrado entre ambas medidas (Sadouk y col., 2008). La concentración real de microorganismos se asumió que puede determinarse como la concentración de sólidos volátiles (SV). Brevemente, se procedió de la siguiente manera: - En un matraz Erlenmeyer de 1 L de capacidad se adicionaron 400 mL de medio BHB al 1% (v/v) en diésel y 4 mL de un inóculo de microorganismos HiC. Se introdujo en un baño de agitación a una temperatura de 25 °C y velocidad de agitación de 130 rpm. - A lo largo del periodo de incubación se tomaron muestras que se trasvasaron a tubos Falcon para determinar la DO y después se determinó la concentración de SV según la norma ASTM E 1755-01 (1991). En la Tabla 4.5 se recogen los datos obtenidos a lo largo del experimento previo de calibración, mostrándose, para cada valor de DO, el valor de la cantidad de SV que fue determinado. 68 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos Tabla 4.5. Relación entre DO y SV. SV (gcélulas L-1) 0 896 1438 1626 1971 2459 3354 DO 0 1,73 2,56 3,07 3,40 4,07 4,99 Mediante el ajuste de los datos fue posible cuantificar el crecimiento microbiano, ya que, por interpolación, se puede conocer la concentración de biomasa presente en el -1 medio (gCélulas L ) conociendo únicamente el valor de DO. En la Figura 4.2 se presenta el ajuste de dichos datos, así como la ecuación que los relaciona. 4000 Conc. biomasa (g L -1) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 y = 656.24x - 180.55 R² = 0.977 500 0 0 1 2 3 4 5 6 Densidad Óptica (Abs) Figura 4.2. Recta de calibrado que relaciona la DO con la concentración de biomasa presente en el cultivo. 4.3.3.2. Medida de la tensión superficial A través de las medidas de la tensión superficial (TS) se estudió la evolución de la posible generación de biosurfactantes, ya que este tipo de sustancias, al estar presentes en un medio, dan lugar a un descenso significativo de la TS (Das y Mukherjee, 2005). A nivel microscópico, la TS se debe a que las fuerzas que afectan a cada molécula son diferentes en el interior del líquido y en la superficie. Así, en el seno de un líquido cada molécula está sometida a fuerzas de atracción que en promedio se anulan. Este 69 Capítulo 4 hecho permite que la molécula tenga una energía bastante baja. Sin embargo, en la superficie hay una fuerza neta hacia el interior del líquido que recibe el nombre de tensión superficial. El método del anillo de Du Nouy permite medir la TS de los medios. En dicho método se mide la fuerza adicional (ΔF) que hay que ejercer sobre un anillo de aluminio cuando se ha introducido en un medio líquido y se quiere sacar de él, es decir, la fuerza que se ejerce justo en el momento en el que la lámina de líquido que queda sobre el anillo se va a romper. Para un sistema dado, la fuerza necesaria para romper dicha película líquida es igual a 4R, donde R, es el radio medio del anillo y , la tensión superficial del líquido. La duplicación del perímetro 2R se debe a que hay dos líneas de separación entre el líquido y el alambre, una en el exterior y otra en el interior del anillo. Este tratamiento se cumple para los líquidos de ángulo de contacto cero y para una situación ideal en donde el anillo sostiene una capa cilíndrica de líquido antes de desprenderse. Como la forma del líquido retenido influye en la fuerza necesaria para la ruptura, se debe utilizar un factor de corrección. Éste se encuentra tabulado en función de las 3 relaciones R /V y R/r, donde V, es el volumen de líquido retenido y r, es el radio del alambre. Por tanto, la TS vendrá dada por la ecuación [4.1]. PF 4R [4.1] siendo P, peso del anillo y F, un factor de corrección que aplica el equipo. El volumen mínimo de líquido necesario para llevar a cabo las medidas de TS fue de 20 mL de medio de cultivo, los cuales fueron vertidos en un vaso de medición de vidrio que se introdujo en la bandeja de apoyo de un tensiómetro TD 2 de LAUDA, el cual realiza las medidas de manera automática. El anillo utilizado tenía las características que se especifican a continuación: Radio medio del anillo (R) = 9,55 mm Radio del alambre (r) = 0,20 mm Antes de cada medida, el tensiómetro fue calibrado con aire y agua hasta una lectura -1 de 71±1 mN m siguiendo la norma ASTM D971-99a (2004). Por defecto, los valores de TS medidos representaban la media de tres replicados con una desviación estándar menor del 0,5% de error. 70 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 4.3.3.3. Medida de la concentración de TPH La evolución de la biodegradación de diésel se determinó mediante medidas de la concentración de los TPH presentes en el medio de cultivo en distintos momentos del experimento. En primer lugar, y previo a la realización de los experimentos, se hicieron distintas optimizaciones en cuanto a la reproducibilidad del método de muestreo, cantidad de disolvente utilizado para la extracción y reproducibilidad del método de extracción. Así, se concluyó que la toma de muestras era completamente representativa con un error de ± 3% con respecto al valor teórico, si se realizaba después de una agitación vigorosa y se muestreaban 20 mL de medio de cultivo. Se optó también por la realización de la extracción de diésel en un único paso utilizando n-hexano como disolvente en una proporción del 10% (v/v) con respecto a la muestra extraída y el método de extracción utilizado fue el método descrito en la norma UNE-EN ISO 9377-2 (2000), para la determinación del índice de HC en agua. Brevemente, este método consistió en poner en contacto el n-hexano con el medio líquido en un Falcon de 50 mL y agitar durante 5 min en vortex. Seguidamente, se procedió a la centrifugación del líquido a 4.000 rpm para separar bien la fase orgánica y líquida. La reproducibilidad del método de extracción con la cantidad de disolvente mencionada fue mayor del 96% en todos los experimentos de optimización previos. Una vez realizado el muestreo y la extracción tal y como se ha explicado, el extracto orgánico se depositó en viales con cierre hermético y se conservó a 4 °C hasta su posterior análisis por cromatografía gaseosa mediante GC-FID tal y como se describió en el apartado 3.5 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes. Para cuantificar los TPH presentes en las muestras se realizó una recta de calibrado a distintas concentraciones de diésel en n-hexano, de tal manera que por interpolación de las áreas cromatográficas fue posible conocer la concentración real de las muestras analizadas. 4.3.4. Modelo cinético de biodegradación de diésel en suspensión acuosa El sistema estudiado en este trabajo se puede identificar con un fermentador discontinuo de tanque agitado de mezcla perfecta, el cual se carga inicialmente con medio de cultivo específico y una concentración determinada de sustrato limitante (C0), dando comienzo la reacción al adicionar un consorcio microbiano como inóculo. Este inóculo se distribuye homogéneamente en el medio, alcanzando una concentración inicial X0. Una vez iniciada la reacción, las concentraciones de biomasa y de sustrato 71 Capítulo 4 cambian con el tiempo hasta la situación final. Las variaciones en las concentraciones de sustrato, C(t), y de biomasa, X(t), son consecuencia de los diferentes procesos microbiológicos que ocurren simultáneamente en cualquier transformación bioquímica: crecimiento y muerte celular, consumo de sustrato para diferentes fines (crecimiento celular, mantenimiento celular y formación de productos) y metabolismo endógeno (Gòdia y López, 1998). Las ecuaciones de diseño, en las que se basa su comportamiento, fueron descritas por Lawrence y McCarty (1970), como modificación del modelo propuesto por Monod (Monod, 1949): Balance de biomasa (BX): Balance de sustrato (BS): dX X K d X dt [4.2] 1 1 dC qp X mS X X YX / S YP / S dt [4.3] -1 -1 siendo X, concentración de biomasa (gcélulas L ); C, concentración de diésel (gTPH L ); -1 Kd, constante cinética de muerte celular (h ); qp, constante cinética de formación de -1 -1 -1 producto (h ); mS, constante cinética de mantenimiento celular (gTPH gcélulas h ); YX/S, rendimiento en masa celular de sustrato (gcélulas g un sustrato (gproducto g -1 TPH); donde: -1 TPH); YP/S, rendimiento en producto de -1 , constante cinética de crecimiento (h ). max C KS C [4.4] -1 siendo max, velocidad máxima de crecimiento específico (h ) y KS, constante de -1 semisaturación (gTPH L ). La expresión de la constante cinética de crecimiento () corrobora que una mayor cantidad de sustrato en el medio conlleva un crecimiento microbiano más veloz y, por consiguiente, un consumo más rápido del sustrato principal hasta llegar al límite marcado por max. Por otro lado, se considera como hipótesis de cálculo, que prácticamente toda la reacción transcurre durante la fase de crecimiento exponencial, de manera que en la ecuación [4.2] el término de muerte celular se considera existente pero insignificante frente al de crecimiento. A su vez, en la ecuación [4.3] se pueden 72 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos despreciar los dos últimos términos, asumiendo que el consumo de sustrato se debe principalmente al crecimiento microbiano. Por consiguiente, las ecuaciones [4.2] y [4.3] quedarían de la siguiente manera: dX X dt Balance de biomasa simplificado (BXS): [4.5] 1 dC X dt Y X /S Balance de sustrato simplificado (BSS): [4.6] Introduciendo la ecuación de la constante cinética de crecimiento [4.4] en las expresiones [4.5] y [4.6], y sustituyendo las diferenciales por incrementos finitos se pueden despejar las concentraciones de biomasa y sustrato teóricas en cada instante (ti): max C t i 1 I 0 X t i X t i 1 X t i 1 K d X t i 1 t i t i 1 K C I t i 1 0 S C I 1 C t i C t i 1 max t i 1 0 X t i 1 YX / S K S C t i 1 I 0 t i t i 1 [4.7] [4.8] -1 siendo I0, sustrato inerte residual (gTPH L ). Por lo general, la tasa de disminución de la concentración celular por procesos endógenos (Kd· X) se modela como de primer orden con respecto a la concentración celular (Bailey y Ollis, 1986). Sin embargo, una vez que el modelo se completó, se observó un valor muy pequeño para la constante cinética de muerte celular en todos los experimentos, por lo que no se consideró dicho parámetro en el apartado de discusión. Este modelo matemático se ha utilizado para estimar los parámetros µmax, Ks, Yx/s e I0 en los experimentos de biodegradación de diésel. Para ello, por un lado, fue necesario disponer de los datos experimentales de las concentraciones de biomasa y sustrato a distintos tiempos y, por otro lado, resolver las ecuaciones [4.7] y [4.8] de manera simultánea utilizando el algoritmo de Gauss-Newton. Inicialmente, se asignaron valores a los parámetros μmax, Ks, I0 y Yx/s y, después de varias iteraciones, los valores de esos parámetros que condujeron al mínimo de la función objetivo Ψ(p) (Ecuación [4.9]) fueron elegidos como las mejores estimaciones. 73 Capítulo 4 ( p) X exp, i X i ( p) C exp, i Ci ( p) n i 1 2 2 [4.9] siendo n, el número de datos experimentales; Xexp,i y Cexp,i, los valores experimentales de concentración de biomasa y sustrato medidas a tiempo ti; Xi(p) y Ci(p), los valores de concentración calculados por el modelo, correspondientes a la medición i. Finalmente, cabe destacar que el modelo cinético empleado es del tipo noestructurado y no-segregado, es decir, las células se consideran todas iguales en promedio y, desde el punto de vista cinético, se tratan como si fueran un componente más del medio, sin definir ninguna estructura interna. Aunque estas simplificaciones son muy importantes, la aplicación de dicho modelo permite obtener buenas predicciones del comportamiento de sistemas como el estudiado (Gòdia y López, 1998). 4.3.5. Experimentos de producción de biosurfactantes Tras comprobar que los consorcios HiC utilizados en los experimentos de biodegradación de diésel eran capaces de disminuir la TS, se realizaron unos experimentos adicionales, en los que se relacionó la cantidad de biosurfactantes producidos con la evolución de la TS. Para ello, se llevaron a cabo experimentos similares a los anteriores (apartado 4.3.3 de este capítulo) con los tres consorcios microbianos HiC (XA, XB y XC) y bajo las condiciones de operación seleccionadas según los resultados obtenidos en el estudio de biodegradación de diésel. En total se realizaron tres nuevos experimentos, uno por cada consorcio microbiano HiC. El tiempo de experimentación fue de 8 días y, durante ese tiempo, se tomaron muestras para medir la evolución de la TS y, simultáneamente, se determinó la concentración de biosurfactantes generados. Para ello, se emplearon matraces Erlenmeyer de 1 L de capacidad que se mantuvieron en un baño termostatizado a una temperatura de 25 °C y una velocidad de agitación de 130 rpm. Cada matraz contenía 400 mL de medio BHB al 1% (v/v) en diésel y un inóculo del 1% (v/v) de consorcio de microorganismos HiC. La TS fue medida tal y como se describió en el apartado 4.3.3.2 de este capítulo, y la concentración de biosurfactantes se determinó por precipitación ácida, tal y como se describe en Porsunthorntawee y col. (2008). A continuación se explica, brevemente, el proceso utilizado: las células bacterianas se eliminaron del medio mediante centrifugación a 11.000 rpm en una centrífuga Jouan C3i de Thermo Electron Corporation durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se trató por acidificación 74 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos con HCl hasta un pH de 2,0, dejándolo durante 24 h a 4 °C hasta su completa precipitación. Posteriormente, las muestras se centrifugaron de nuevo y el pH se ajustó a 6,0 utilizando NaOH (1 M), seguido de una extracción con Solución de Folch (cloroformo-metanol 65:15). La fase orgánica resultante se transfirió a un rotavapor modelo R-114, equipado con un baño modelo B-480 de la casa BUCHI, a una temperatura de 40 °C durante 1 h hasta eliminar el disolvente y obtener un producto residual viscoso de biosurfactantes. Todas las muestras, se llevaron a cabo por triplicado, siendo el resultado final la media de los tres valores. 4.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.4.1. Verificación del proceso de adaptación y enriquecimiento Los cultivos adaptados en las suspensiones con diésel como única fuente de carbono y energía crecieron rápido y, en tan solo 24 h desde la inoculación, empezó a observarse turbidez en el medio de cultivo (Figura 4.4). Figura 4.4. Vista de los consorcios microbianos dentro del incubador Ecotrón. Comparación del medio fresco y medio con cultivo desarrollado. Las curvas de crecimiento establecidas inicialmente permitieron determinar el momento apropiado para inocular los posteriores experimentos de biodegradación. El tiempo medio, estimado como el mejor momento para llevar a cabo la inoculación, fue de, aproximadamente, dos días para todos los consorcios (Figura 4.5), es decir, el punto que correspondió con el momento más alto de la etapa exponencial de crecimiento de los microorganismos. 75 Capítulo 4 16 SA SB SC D e nsidad Óptica (Abs) 14 12 10 8 Inoculación 6 4 2 0 0 25 50 75 100 125 150 175 Ti e mpo (h) Figura 4.5. Optimización del tiempo de inoculación mediante el estudio de las curvas de crecimiento de los consorcios XA, XB y XC. Después de varios meses de sucesivas resiembras según el procedimiento indicado en el apartado 3.8 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes, se utilizó la técnica de DGGE (Anexo II) para verificar el enriquecimiento de los consorcios en microorganismos HiC. Para ello se tomaron como muestras el consorcio adaptado XA y el consorcio original aislado del propio suelo SA; y se compararon mediante esta técnica (Figura 4.6). Foto XA SA Esquema XA SA Figura 4.6. Foto y esquema del gel obtenido tras la técnica de DGGE: comparación del ADN extraído de la muestra del consorcio XA, adaptado tras el proceso de aclimatación, y del consorcio original existente en el suelo SA. Del análisis de los geles, obtenidos en la técnica DGGE, con el ADN de ambas muestras se dedujo que la continua asimilación del sustrato diésel potenció la capacidad 76 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos de biodegradación de las comunidades microbianas de forma selectiva. Muestra de ello fue que se detectó la presencia de una gran variedad de especies en la muestra original de suelo SA (señalado en el esquema con un círculo rojo), que tras el proceso de adaptación (consorcio XA), disminuyó en variedad a causa de esa selección natural. Además, se detectó una intensidad muy grande en cinco especies concretas (flechas rojas) del consorcio enriquecido XA, lo que sugirió un aumento de la población de esas especies microbianas capaces de degradar el diésel, en detrimento del resto. 4.4.2. Composición de la comunidad microbiana En total 8 especies puras de cada consorcio HiC fueron aisladas mediante la siembra en placa de Petri y analizadas de acuerdo al proceso descrito en el apartado 4.3.2 de este mismo capítulo. En la Figura 4.7 se recoge un resumen fotográfico de las técnicas morfológicas y citológicas más importantes llevadas a cabo durante el proceso de caracterización. Figura 4.7. Resultados gráficos caracterización microbiológica. de los métodos de 77 Capítulo 4 Una de las especies identificadas (Staphylococcus lentus) apareció en todos los consorcios HiC analizados (Tabla 4.6), y dos especies se repitieron para los consorcios XB y XC (Stenotrophomonas maltophilia y Pseudomonas fluorescens). Encontrar estas especies en los consorcios no resultó extraño debido a su frecuente presencia en los suelos y, sobre todo, en aquellos que presentan algún tipo de contaminación (Barathi y Vasudevan, 2001; Ueno y col., 2007). Es de destacar que el 75% de las bacterias identificadas son Gram Negativas, que parecen encontrarse más adaptadas a los HC como fuente de carbono (Venosa y col., 1999). Por otro lado, el género Pseudomonas ha sido muy estudiado por la comunidad científica y es conocido por su facilidad en la degradación de HC (Alexander, 1977; Rosenberg, 1992). El resto de bacterias identificadas en los consorcios también han sido estudiadas previamente en otras investigaciones sobre degradación de HC (Chaîneau y col., 1999; Rahman y col., 2002; Medina-Moreno y col., 2005; Lafortune y col., 2009; Owsianiak y col., 2009), y entre las más comunes cabe destacar Burkholderia cepacia y Sphingomonas paucimobilis. 78 Blanco Naranja Crema Blanco Crema Blanco Amarilla Blanco Amarilla Crema Naranja Crema Blanco Blanco Amarilla Crema Amarillenta - Amarilla Naranja Blanco Blanco Blanco XA4 XA5 XA6 XA7 XA9 XB1 XB2 XB4 XB5 XB6 XB7 XB8 XB9 XC1 XC2 XC3 XC4 XC5 XC6 XC7 XC8 + + + +/- - - - - + + + +/- + - +/- - + + - + +/- - + E I E E E E E E E E I E E E E E E I I I E E E B C C C C B B B C B B C B B B B B B C B C B B - + - + + - - - - - - + - - - - - - - + + - - + - - - - + + - - + + - + - + d + + - - - + + d + + + + d d d + + d + + + + + + + + - + + + + d 20 NE Staph 20 NE Staph Staph 20 NE 20 NE 20 E 20 NE 20 NE 20 NE Staph 20 NE 20 E 20 NE 20 NE 20 NE 20 NE 20 NE 20 NE Staph 20 NE 20 NE 20 NE sobria lentus Staphylococcus xylosoxidans cepacia fluorescens Achromobacter Burkholderia Pseudomonas lentus anthropi paucimobilis Staphylococcus Ochrobactrum Sphingomonas spp. sciuri lentus Sphingobacterium Staphylococcus Staphylococcus spp. fluorescens Micrococcus Pseudomonas NI multivorum Sphingobacterium Stenotrophomonas maltophilia NI denitrificans Achromobacter Stenotrophomonas maltophilia anthropi Ochrobactrum NI NI radiobacter Aeromonas Espercie Rhizobium NI Identificación Oxidasa Catalasa API Género Símbolos: +, positivo; -, negativo; +/-, variable; d, débil; NI, No identificado. + - - +/- - + + - + + +/- + + + - - + + + +/- +/- - Grisáceo XA3 - XA2 B Amarillo XA1 I + Nº Aislado Color - Morfología Margen celular (E=Entero; (B=Bacilo; Convexo Opaco I=Irregular) C=Coco) Gram Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos Tabla 4.6. Características bioquímicas y de crecimiento de las bacterias aisladas. 79 Capítulo 4 4.4.3. Biodegradación de diésel mediante los consorcios XA, XB y XC Con el fin de estudiar los fundamentos de la biodegradación de diésel, a continuación se muestran los resultados de los experimentos discontinuos en fase líquida realizados con los consorcios microbianos XA, XB y XC bajo las diferentes condiciones de reacción propuestas. Todos los consorcios de bacterias utilizaron diésel como única fuente de carbono para su crecimiento y, a medida que la concentración de biomasa aumentó, la concentración de diésel se redujo al mismo tiempo, observándose que la mayor reducción correspondió con la fase exponencial del crecimiento bacteriano (Figuras 4.84.10). Excepto en los ensayos realizados a 35 °C, más del 80% de la concentración inicial de diésel fue degradada en todos los experimentos después de 40 h de tratamiento, alcanzando eficacias superiores al 98% en algunos casos. Del mismo modo, Márquez-Rocha y col. (2001) alcanzaron casi el 90% de consumo de diésel después de 13 días. El rápido consumo inicial de diésel de los consorcios utilizados en este trabajo podría estar relacionado con la corta fase de aclimatación observada y la posible generación de biosurfactantes. Así, Ron y Rosenberg (2001), describen la diversidad de biosurfactantes que pueden existir, los microorganismos que los generan y sus diferentes funciones naturales, mientras que Ta-Chen y col. (2008) caracterizan exopolisacáridos producidos por la especie Gordonia alkanivorans CC-JG39 para estimular el crecimiento y aumentar la biodegradación de diésel. Teniendo en cuenta estos trabajos, una posible hipótesis podría ser que los microorganismos en los consorcios mixtos fueron capaces de producir estas sustancias tan rápidamente que la disponibilidad del sustrato se incrementó en un corto período de tiempo y, en consecuencia, se produjo un rápido consumo del sustrato. En cualquier caso, en cualquiera de las Figuras 4.8-4.10 puede observarse que, después de 80 h de tratamiento, no se produjo más disminución de la concentración de diésel. Dicho tiempo de experimentación se correspondió con la fase estacionaria, etapa en la que el sustrato es consumido solo para el mantenimiento celular, dejando una parte del sustrato residual (I0) en el medio. Aunque los experimentos se llevaron a cabo en sistemas cerrados, el sustrato podría haber desaparecido por volatilización externa durante los periodos de muestreo. Para controlar estas pérdidas, las concentraciones de TPH se midieron en los experimentos de control y las pérdidas abióticas de diésel se estimaron en 5,7, 8,67 y 11,33% a 25, 30 y 35 °C, respectivamente. 80 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 4 5 2 0 0 0 40 80 3 % Diesel 20 15 10 4 5 0 120 160 200 240 0 0 20 40 60 80 100120140160180200 T ie m p o (h) T ie m p o (h) 4 2 2 0 0 1 % Diesel 8 6 6 4 4 2 2 0 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 4 2 2 0 0 0 20 40 60 80 100 120 140 T ie m p o (h) 8 T P H (g L -1 ) 4 0.5 % Diesel 6 4 80 70 60 50 40 30 20 6 4 2 2 0 0 0 B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) 6 10 T S (m N m -1 ) 8 90 80 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) B io m a s a (g L -1 ) 0.5 % Diesel 20 40 60 80 100 120 140 160 T ie m p o (h) T ie m p o (h) 10 70 60 50 40 30 20 B io m a s (g L -1 ) 4 10 T P H (g L -1 ) 6 B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) 8 80 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) 1% Diesel T S (m N m -1 ) 10 0 80 70 60 50 40 30 20 B io m a s a (g L -1 ) 10 25 T P H (g L -1 ) 15 B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) 20 90 80 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) 3 % Diesel T S (m N m -1 ) 25 20 40 60 80 100 120 140 160 T ie m p o (h) Figura 4.8. Crecimiento de biomasa del consorcio XA, concentración de TPH y evolución de la TS a la temperatura de 25 °C (1ª columna) y 30 °C (2ª columna) bajo las distintas concentraciones iniciales de diésel (3, 1 y 0,5%). (Simbología: puntos experimentales ,TS; ,TPH; ,Biomasa; línea verde, concentración de TPH predicho por el modelo; línea azul, concentración de biomasa predicha por el modelo). 81 Capítulo 4 4 5 2 0 0 0 3 % Diesel 20 -1 15 10 4 5 0 0 0 20 40 60 80 100120140160180 30 60 90 120 150 180 210 240 T ie m p o (h) T ie m p o (h) 4 4 2 2 0 0 10 6 4 4 2 2 0 0 0 10 0.5 % Diesel 8 T P H (g L -1 ) 90 80 70 60 50 40 30 20 6 6 4 80 70 60 50 40 30 20 6 4 2 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140 160 T ie m p o (h) T ie m p o (h) B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) T ie m p o (h) B io m a s a (g L -1 ) 4 20 40 60 80 100 120 140 T S (m N m -1 ) 6 0 0 T S (m N m -1 ) 8 2 0 T ie m p o (h) 70 60 50 40 30 20 6 4 2 0 20 40 60 80 100120140160 0.5 % Diesel 1 % Diesel 8 T P H (g L -1 ) 6 B io m a s a (g L -1 ) T P H g L -1 8 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) B io m a s a (g L -1 ) 1 % Diesel T S (m N m -1 ) 10 10 80 70 60 50 40 30 20 B io m a s a (g L -1 ) 10 25 T PH ( g L ) 15 B io m a s a (g L -1 ) T P H g L -1 20 80 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) 3 % Diesel T S (m N m -1 ) 25 Figura 4.9. Crecimiento de biomasa del consorcio XB, concentración de TPH y evolución de la TS a la temperatura de 25 °C (1ª columna) y 30 °C (2ª columna) bajo las distintas concentraciones iniciales de diésel (3, 1 y 0,5%). (Simbología: puntos experimentales , TS; , TPH; , Biomasa; línea verde, concentración de TPH predicho por el modelo; línea azul, concentración de biomasa predicha por el modelo). 82 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 5 2 0 0 0 30 60 90 20 T P H (g L -1 ) 4 3 % Diesel 15 10 4 5 0 120 150 180 0 0 20 40 60 80 100120140160180 T ie m p o (h) T ie m p o (h) 4 2 2 0 0 8 6 4 4 2 2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 0 T ie m p o (h) 4 2 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 T ie m p o (h) 8 6 4 80 70 60 50 40 30 20 6 4 2 2 0 0 0 B io m a s a (g L -1 ) 4 0.5 % Diesel T P H (g L -1 ) 6 B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) 8 10 T S (m N m -1 ) 0.5 % Diesel 0 20 40 60 80 100 120 140 160 T ie m p o (h) 90 80 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) 10 70 60 50 40 30 20 6 B io m a s a (g L -1 ) 4 1 % Diesel T P H (g L -1 ) 6 B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) 8 10 T S (m N m -1 ) 1 % Diesel 70 60 50 40 30 20 6 T S (m N m -1 ) 10 0 80 70 60 50 40 30 20 B io m a s a (g L -1 ) 10 B io m a s a (g L -1 ) T P H (g L -1 ) 15 25 T S (m N m -1 ) 3 % Diesel 20 T S (m N m -1 ) 80 70 60 50 40 30 20 6 25 20 40 60 80 100 120 140 160 T ie m p o (h) Figura 4.10. Crecimiento de biomasa del consorcio XC, concentración de TPH y evolución de la TS a la temperatura de 25 °C (1ª columna) y 30 °C (2ª columna) bajo las distintas concentraciones iniciales de diésel (3, 1 y 0,5%). (Simbología: puntos experimentales , TS; , TPH; , Biomasa; línea verde, concentración de TPH predicho por el modelo; línea azul, concentración de biomasa predicha por el modelo). Las Figuras 4.8-4.10 muestran también la vinculación entre la degradación de diésel y la evolución de la TS en todos los experimentos. Se aprecia una reducción rápida de la -1 TS al principio (hasta 40 mN m ), hecho que podría estar relacionado con lo comentado 83 Capítulo 4 anteriormente: la producción de biosurfactantes para mejorar la accesibilidad y biodegradabilidad de diésel (Desai y Banat, 1997; Franzeti y col., 2010). Después de aproximadamente 30 h de tratamiento, durante la fase exponencial del crecimiento -1 bacteriano, la TS aumentó considerablemente, hasta valores cercanos a 60-70 mN m , manteniéndose constante en ese valor durante la fase estacionaria. Lu y col. (2003) informaron que la evolución de la TS de medios de fermentación estaba relacionada con el crecimiento de bacterias, observando una rápida reducción de la TS durante el período exponencial, indicando que la producción de biosurfactantes posiblemente estuviera activa. A partir de entonces, la TS se mantenía constante, sugiriendo que las bacterias podrían haber metabolizado los biosurfactantes (Ławniczak y col., 2013), hecho que podría estar ocurriendo en estos experimentos. Sin embargo, esta tendencia no fue tan claramente observada en los experimentos realizados a 35 °C (Figura 4.11), en los que se observó una clara inhibición térmica y, como consecuencia, no se produjo una biodegradación importante de diésel (< 35% en cualquier caso). 6 4 1.5 1.0 2 0.5 0 0.0 0 20 40 60 80 100120140160 T P H (g L -1 ) -1 T PH (g L ) 8 70 60 50 40 30 20 2.0 50 15 XB 12 40 9 30 2.0 6 1.5 1.0 3 0.5 0 0.0 0 20 40 60 80 100120140160 T ie m p o (h) T ie m p o (h) XC 12 70 60 50 10 40 8 30 4 6 3 4 2 2 1 0 0 0 20 40 60 80 100120140160 TS (mN m -1 ) Bio masa (g L -1 ) 14 T P H (g L -1 ) TS (mN m -1 ) Bio masa (g L-1 ) XA TS (mN m - 1 ) Bio masa (g L - 1 ) 10 T ie m p o (h) Figura 4.11. Crecimiento de biomasa del consorcio XA, XB y XC, concentración de TPH y evolución de la TS a la temperatura de 35 °C bajo una concentración inicial de diésel del 1%.(Simbología: puntos experimentales , TS; , TPH; , Biomasa). 84 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos Para resumir los resultados del proceso de biodegradación, la Tabla 4.7 recoge los porcentajes en la eficiencia de la biodegradación de diésel y el tiempo necesario para degradar el 90% de la concentración inicial. Los tres consorcios tuvieron comportamientos similares, degradando altos porcentajes (superior al 90%, a excepción de uno de los experimentos). A pesar de que las eficiencias en la eliminación de diésel fueron muy similares, cabe señalar una ligera tendencia en relación a los efectos de la concentración de diésel y de la temperatura: un aumento de valor en ambos factores originó un ligero aumento en la tasa de eliminación de diésel, exceptuando los experimentos a 35 °C con inhibición térmica. Tabla 4.7. Resumen de los resultados de biodegradación en fase líquida. Consorcio T (°C) 25 XA 30 35 25 XB 30 35 25 XC 30 35 C0 (% v/v) 0,5 1 3 0,5 1 3 1 0,5 1 3 0,5 1 3 1 0,5 1 3 0,5 1 3 1 Tiempo en degradar 90% diésel (h) 52,1 57,6 35,1 51,7 50,8 54,8 -55,2 48,8 47,3 52,9 43,6 38 -50,9 48,8 41,5 55,3 51,2 40,2 -- Porcentaje eliminación diésel (%) 98 98 91 95 95 95 27 98 92 81 97 98 98 23 93 95 94 97 95 94 30 Velocidad reducción TS (mN m-1 h-1) 0,826 1,026 3,756 1,334 1,193 3,080 0,519 0,826 0,279 0,743 0,874 0,578 0,774 0,822 0,591 0,556 1,176 0,973 1,195 1,031 0,139 Porcentaje reducción TS (%) 34 38 35 48 45 37 15 34 11 30 29 23 33 27 15 21 15 31 45 39 4 Los porcentajes y las velocidades de reducción de la TS se analizan también en la Tabla 4.7, observándose una ligera variación en la velocidad de reducción de la TS a medida que aumenta la temperatura (con excepción de 35 °C), probablemente relacionada con la mejora en el crecimiento microbiano. Sin embargo, parece que la concentración de diésel inicial no causó una dependencia clara sobre esta variable. En términos generales, el consorcio XA (aislado de un suelo poco contaminado) tuvo mejores resultados en la reducción de la TS (mayor velocidad y mayor porcentaje de reducción) que los otros dos consorcios con independencia de las variables estudiadas. 85 Capítulo 4 4.4.4. Estimación de parámetros cinéticos A fin de evaluar la cinética de crecimiento, los datos de concentración de biomasa y TPH obtenidos en los experimentos de biodegradación, se ajustaron a las ecuaciones [4.7] y [4.8]. En general, los resultados del modelo se ajustaron bastante bien con los datos experimentales, lo que indica que el modelo cinético planteado puede predecir la biodegradación del HC con el tiempo. Las Figuras 4.8-4.10 incluyen las curvas teóricas de X(t) y C(t) obtenidas tras el ajuste y los valores de los parámetros obtenidos (I 0, μmax, YX/S) se muestran en la Tabla 4.8. Para los experimentos en los que se observó inhibición térmica no se realizó la modelización y, por tanto, no se obtuvieron sus parámetros cinéticos. Tabla 4.8. Parámetros estimados del modelo de Monod y error asociado a la estimación. Consorcio T (°C) 25 XA 30 25 XB 30 25 XC 30 C0 (% v/v) 0,5 1 3 0,5 1 3 0,5 1 3 0,5 1 3 0,5 I0 (g TPH·L-1) 0 0 0,7 0 0,2 1 0 1 4 0 0,2 5 0 μmax (h-1) 0,33 0,26 0,26 0,30 0,21 0,17 0,30 0,21 0,20 0,34 0,27 0,25 0,30 Yx/s (gcélulas g-1TPH) 0,40 0,25 0,16 0,40 0,27 0,15 0,50 0,08 0,15 0,41 0,15 0,15 0,28 0,9789 0,9599 0,9476 0,9694 0,9560 0,9583 0,9974 0,9652 0,8846 0,9791 0,9870 0,8710 0,9528 1 3 0,5 1 3 1 1 0 0,05 0,5 0,24 0,23 0,30 0,22 0,23 0,22 0,19 0,45 0,30 0,16 0,9531 0,9551 0,8545 0,9491 0,9424 r2 -1 Los valores de μmax oscilaron entre 0,17 y 0,34 h , valores ligeramente superiores a los obtenidos en otros estudios previos (Young y col., 2005; Whang y col., 2008). El -1 consorcio XB mostró el mayor valor de μmax (0,34 h ) para una temperatura de 30 °C y una concentración de diésel inicial de 0,5% (v/v). Sin embargo, si se calcula la media de los valores de μmax observados para cada uno de los consorcios, el mayor valor -1 (0,241 h ) fue obtenido para el consorcio XC. Estos datos podrían indicar que los consorcios aislados de suelos contaminados (XB y XC) proporcionan una velocidad de biodegradación superior de diésel que aquellos cuya procedencia es un suelo no 86 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos contaminado (XA). A pesar de esta apreciación, esta hipótesis no podría ser completamente verificada debido a que todos los consorcios mostraron valores muy similares dentro de un intervalo muy pequeño y las diferencias podrían no ser significativas. La Tabla 4.8 también muestra los coeficientes de correlación del modelo y, por tanto, la significancia de las correlaciones. El modelo de biodegradación propuesto ajustó los datos experimentales de manera satisfactoria con un coeficiente de correlación de Pearson (r2) entre 0,8545 y 0,9974. El valor de la constante de semi-saturación (Ks) puede estar altamente correlacionado con μmax (Schirmer y col., 2000). En este trabajo se obtuvo un valor -1 medio de Ks entre 3 y 5 gTPH L en todos los casos, que permitía ajustar correctamente -1 los resultados del modelo. Valores similares de Ks (3,2 gTPH L ) fueron obtenidos previamente en estudios similares (Young y col., 2005). En otros casos de estudio, se han utilizado diferentes parámetros adicionales para describir el sistema. Por ejemplo, Ghoshal y Luthy (1998) y Mukherji y col. (1998) consideraron la transferencia de masa del HC desde la fase orgánica no acuosa (NAPL, de sus siglas en inglés, non aqueous phase liquid) a la fase acuosa. Dicho modelo se basa en la premisa de que los microorganismos sólo pueden metabolizar el HC cuando éste está en estado disuelto, por lo que estos modelos pueden ser utilizados para determinar si la biodegradación es controlada por la velocidad de disolución o por la velocidad intrínseca de biodegradación por parte de los microorganismos. A pesar de que el modelo propuesto en este estudio no tuvo en cuenta esta transferencia de masa, el modelo cumple el propósito inicial de la investigación. Así, el modelo propuesto ofrece una representación sencilla del comportamiento real de las células. Y, por otra parte, los parámetros físicos del proceso obtenidos pueden ser utilizados como una herramienta valiosa para el diseño básico de fermentadores a gran escala. 4.4.4.1. Influencia de la concentración de sustrato En la Tabla 4.8 se observa que para concentraciones iniciales de diésel bajas, no se detectó sustrato inerte (I0) residual en el medio. Sin embargo, al incrementar la concentración inicial de diésel, se produjo un aumento de las concentraciones de I 0 residual. Este hecho podría explicarse debido al aumento de concentración de la fracción no biodegradable al aumentar la concentración total inicial de diésel. Se han propuesto varias formas de tener en cuenta el valor residual. Algunos autores han propuesto modificaciones del modelo de Monod en donde el valor residual se le 87 Capítulo 4 resta al valor de la concentración de sustrato (Giraldo-Gómez y col., 1992) de acuerdo con: max C Io K S C Io [4.10] Este modelo implica que el crecimiento es nulo cuando C equivale a I0 y máximo cuando C es elevada. Para valores intermedios de concentración este modelo permite respetar el de Monod. En el caso de estudio que aquí se ha presentado, se ha observado la aparición de una concentración residual de diésel degradado, por lo que en las ecuaciones del modelo planteado se ha tenido en cuenta este parámetro. Por otro lado, en la Tabla 4.8 se observa que el valor de μmax disminuyó a medida que la concentración inicial de diésel aumentó y, en consecuencia, el mayor valor se observó a una concentración inicial del 0,5% (v/v) en diésel. En general, esta tendencia se muestra en la Figura 4.12 para todos los consorcios, observándose además un descenso más pronunciado entre 0,5 y 1% (v/v) de diésel inicial y un descenso menos acusado entre el 1 y 3% (v/v). Estas observaciones sugieren inicialmente que, en el rango de concentraciones estudiadas, el diésel pudo convertirse en un producto tóxico para el sistema provocando la inhibición del crecimiento; sin embargo, más adelante se descartará esta hipótesis. 0,4 XA 25ºC max (h-1) 0,3 XA 30ºC XB 25ºC 0,2 XB 30ºC 0,1 XC 25ºC XC 30ºC 0 0 1 2 3 4 % Diésel (v/v) Figura 4.12. Dependencia de μmax con la concentración de diésel inicial. Los símbolos representan los datos experimentales a 25 y 30 °C, mientras que las líneas representan la tendencia general. En la Figura 4.13 se observa que el coeficiente de crecimiento de biomasa (Y x/s) en general evolucionó de manera similar para los tres consorcios, es decir, disminuyendo a 88 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos medida que la concentración inicial de diésel aumentó. Estudios similares de biodegradación han sido publicados con la misma tendencia en la producción de biomasa. Por ejemplo, para el ácido carboxílico trans-4-metil-1-ciclohexano y una -1 mezcla de tolueno con p-xileno, la producción de biomasa disminuyó de 0,34 (50 mg L ) -1 -1 -1 a 0,21 (500 mg L ) (Paslawski y col., 2009) y de 0,68 (0,2 g L ) a 0,3 (0,7 g L ) (Lee y col., 1993), respectivamente. La razón de que la producción de biomasa sea variable no está muy clara, y sugiere diferentes tipos de asimilación del sustrato. 0,5 XA 25 °C XA 30 °C 0,5 XB 25 °C Yx/s (gcélulas g TPH-1) Yx/s (g células g TPH-1) 0,6 0,4 0,3 0,2 0,4 XB 30 °C 0,3 0,2 0,1 0,1 0 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 0,5 1 % D iésel 1,5 2 2,5 3 3,5 % D iésel (a) (b) 0,5 Yx/s (gcélulas g TPH-1) XC 25 °C 0,4 XC 30 °C 0,3 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 % D iésel 3 3,5 (c) Figura 4.13. Efecto de la concentración inicial de diésel en el valor de Yx/s. (a) XA. (b) XB. (c) XC. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la biodegradación de mayores concentraciones de diésel podría provocar un aumento significativo de la fracción de sustrato que ha de utilizarse para mantenimiento celular y no para crecimiento celular, es decir, podría estar ocurriendo un crecimiento desacoplado. Senez (1962) fue el primero que introdujo este concepto para describir el hecho de que los rendimientos de biomasa, bajo ciertas condiciones, son mucho más bajos de lo esperado, lo cual está 89 Capítulo 4 relacionado con una limitada capacidad de asimilación. En otras palabras, todo el sustrato no es consumido para crecimiento celular, sino que puede ser utilizado para otros fines como mantenimiento celular. Los resultados obtenidos muestran que la producción de biomasa se mantuvo en el mismo orden de magnitud a la misma concentración inicial entre 25 y 30 °C. Esto indica que la producción de biomasa fue afectada por el posible crecimiento desacoplado, pero no sufrió tanto con el cambio de temperatura (exceptuando 35 °C). Para comprobar porqué se observó la inhibición de la velocidad de crecimiento, es decir, el descenso del valor de μmax con respecto al aumento de la concentración de sustrato, es necesario introducir una nueva ecuación (van Uden, 1969): Yx / s q s -1 [4.11] -1 siendo qs (gTPH gcélulas h ), la velocidad específica de consumo de sustrato. La ecuación [4.11] indica que la velocidad de crecimiento depende de dos parámetros: la velocidad de consumo de sustrato (qs) y la eficiencia con la que el sustrato consumido se utiliza para producir biomasa (Yx/s). En la Figura 4.14 se representa la relación entre μmax y el coeficiente de producción de biomasa Yx/s para cada consorcio, usando los datos obtenidos a 25 y 30 °C. El resultado de la representación de μmax frente a Yx/s es una recta cuya pendiente representa qmax (con un valor de 0,42 gTPH gcélulas -1 -1 h -1 para el consorcio XA y -1 0,25 gTPH gcélulas h para XB y XC). De este hecho se concluye que la tasa de consumo de sustrato no cambia, al menos con estos consorcios, en el rango de las concentraciones de diésel utilizadas, y que la disminución de la tasa de crecimiento podría ser completamente explicada por la disminución en el rendimiento de biomasa, no viéndose afectada la tasa metabólica de consumo de diésel. Este es un resultado muy relevante desde la perspectiva del proceso de biodegradación, ya que muestra que las células no son envenenadas por el sustrato en el rango de concentraciones estudiado, y conservan toda su capacidad biodegradadora. El hecho de asumir la existencia de un crecimiento desacoplado indica que el término correspondiente al consumo de sustrato para mantenimiento celular (Ecuación [4.3]), no es tan poco importante como en un principio se consideró y, de hecho, el coeficiente de Pearson (Tabla 4.8) indica que el ajuste del modelo empeoró ligeramente al aumentar la concentración inicial de diésel. Aún así, el comportamiento general del modelo es bueno y suficientemente válido para los objetivos ya indicados en este trabajo. 90 0,5 0,5 0,4 0,4 μ m ax (h -1 ) μ m ax (h -1 ) Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 0,3 0,2 XA 25 °C 0,1 0,4 XB 25 °C XB 30 °C 0 0 0,1 0,2 0,3 Yx/s (gcélulas gTPH-1) 0,2 0,1 XA 30 °C 0 0,3 0 0,5 0,1 0,2 0,3 0,4 Yx/s (gcélulas gTPH-1) (a) 0,5 (b) 0,5 y = 0,2541x + 0,1842 μ m ax (h-1 ) 0,4 0,3 0,2 XC 25 °C 0,1 XC 30 °C 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Yx/s (gcélulas gTPH-1) (c) Figura 4.14. Relación entre μmax y Yx/s. (a) XA. (b) XB. (c) XC. 4.4.4.2. Influencia de la temperatura de reacción Se sabe que la temperatura es uno de los factores más importantes en la eficiencia de un proceso de biodegradación (Iqbal y col., 2007). En el presente trabajo, a 35 °C casi no hubo crecimiento microbiano y, como consecuencia, tan sólo se produjo una degradación en torno al 30% de la concentración inicial de TPH para los tres consorcios. Por lo tanto, la reacción biológica fue claramente inhibida. En estas condiciones, se observaron agregados de color amarillento de biomasa adherida a las paredes del matraz, lo que indicó la desintegración y lisis de la biomasa, y también se produjo formación de espuma, especialmente en el segundo día de incubación. El porcentaje de eliminación de diésel decayó más del 65% para todos los consorcios. Estos resultados, en principio, presuponen que pudo haber ocurrido inhibición térmica, ya que las bacterias mesófilas suelen tener un comportamiento negativo de la tasa de crecimiento por encima de su temperatura óptima (Ingraham, 1962). Las causas que podrían haber producido esta inhibición podrían estar relacionadas con la existencia de alguna limitación en el proceso de crecimiento debido a la destrucción térmica de las proteínas, 91 Capítulo 4 o porque las bacterias requieren otros factores de crecimiento a altas temperaturas que no son requeridos a bajas temperaturas. Por último, otra posibilidad podría ser el efecto de la temperatura sobre la concentración de oxígeno en el agua, ya que lo cierto es que -1 -1 cae más de 1 mg L respecto al valor a 25 °C (7,7 mg L ). Sin embargo, a pesar del descenso, este valor es suficiente para el crecimiento bacteriano (APHA, 1992), por lo que se podría descartar esta causa. Con respecto a los experimentos realizados a 25 y 30 °C, la tendencia no está muy clara. Por un lado, no se observó una variación considerable en la concentración de biomasa para los experimentos a 25 y 30 °C realizados para el consorcio XA; sin embargo, se observó una ligera dependencia de crecimiento con la temperatura para los consorcios XB y XC, siendo la concentración celular ligeramente superior al aumentar la temperatura. Wang y col. (2008) concluyeron en su estudio que en el estrecho rango de 24-28 °C, la temperatura desempeña un papel muy importante y afecta el crecimiento de ciertas bacterias. Por otro lado, Dieter y Marvin (1972) informaron que, ocasionalmente, puede ocurrir que los rendimientos celulares obtenidos a temperaturas más bajas sean superiores a los de temperaturas más altas, independientemente de la temperatura a la que el cultivo estuviera adaptado. Esta tendencia se observó en los experimentos con el consorcio XA, en el que el rendimiento de la biomasa y la máxima velocidad específica de crecimiento disminuyeron a temperaturas más altas. Sin embargo, en los experimentos realizados con los consorcios XB y XC, la biodegradación se vio ligeramente favorecida con un aumento de la temperatura. No obstante, no llegó a ser significativa la respuesta en ningún caso (p>0,05) tal y como se deduce del test ANOVA realizado para cada uno de los consorcios y las distintas concentraciones de diésel estudiadas entre las temperaturas de 25 y 30 °C (Tabla 4.9). Tabla 4.9. Resultados del test ANOVA para el estudio de la influencia de la variación de la temperatura entre 25 y 30 °C. Temperaturas (°C) 25-30 92 Concentración (%) 3 1 XA 0,068 0,413 0,5 0,394 Consorcio XB XC 0,408 0,057 0,481 0,142 0,055 0,364 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 4.4.4.3. Influencia del tipo de consorcio utilizado En general, la biodegradación de diésel producida por los consorcios (XA, XB y XC) fue más rápida que otros ejemplos encontrados en literatura (Young y col., 2005; Vieira y col., 2007) y, según Ta-Chen y col. (2008), esto podría ser debido, al menos en parte, a que los microorganismos de los consorcios mixtos produjeron biosurfactantes, que mejoraron y aumentaron la capacidad de biodegradación del HC. Respecto al crecimiento celular observado durante los experimentos de biodegradación, en la fase de latencia los tres consorcios mostraron comportamientos similares con un periodo de adaptación previo de alrededor de 20 h y, en la fase de crecimiento celular, también se comportaron de manera similar, variando en ellos sólo el valor final de concentración de biomasa. Además, analizando los parámetros cinéticos estimados, se puede decir que el comportamiento de todos los consorcios es muy similar, no encontrándose demasiadas diferencias en la biodegradación realizada por unos y otros consorcios. Este hecho podría deberse a que el proceso de adaptación y aclimatación de los tres consorcios llevó a la obtención de cultivos microbianos con capacidades muy similares. De hecho, la Tabla 4.6 muestra que varias especies son comunes en los consorcios XA, XB y XC. Sin embargo, el test ANOVA realizado para el estudio de la significancia en la influencia del consorcio utilizado (Tabla 4.10) reveló que el uso del consorcio XC mostraba resultados significativamente diferentes y algo mejores que los consorcios XB y XA. Esto podría ser debido a que mostró unos valores de μmax de media ligeramente superiores a los otros dos consorcios, dando a entender que este consorcio aislado de un suelo contaminado de manera crónica podría tener una respuesta ligeramente superior. Por este motivo se escogió al consorcio XC para llevar a cabo los experimentos de bioaumento en los siguientes capítulos. Tabla 4.10. Resultados del test ANOVA para el estudio de la influencia del tipo de consorcio utilizado. Temperatura (°C) Comparación de consorcios 25 XA-XB XA-XC XB-XC Concentración de diésel inicial (%) 3 1 0,5 0,035* 0,347 0,349 0,252 0,055 0,410 0,031* 0,001*** 0,006** 30 XA-XB XA-XC XB-XC 0,321 0,028* 0,001*** 0,412 0,090 0,307 0,033* 0,223 0,495 Nota: *, significación estadística al nivel de 0,05; **, nivel de 0,01; ***, nivel de 0,001. 93 Capítulo 4 4.4.5. Producción de biosurfactantes por los consorcios XA, XB y XC Una vez analizados los resultados de la biodegradación de diésel, se llevaron a cabo nuevos experimentos en los que obtener la relación entre la TS y la producción de biosurfactantes para cada consorcio. Dicha relación puede observarse en la Figura 4.15, en la que se han dibujado también dos líneas para indicar la tendencia y obtener el valor de CMC (Concentración Micelar Crítica) como su intersección. 55 XA XC XB 50 TS (mN m -1) 45 40 35 30 25 20 0 1 2 3 4 5 Conc. Biosurfactante (g L -1 ) 6 7 Figura 4.15. Relación entre TS y concentración de biosurfactante. Estimación del valor de CMC. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. En general, se observó una reducción rápida de la TS a medida que aumentó la concentración de biosurfactantes hasta un punto, después del cual, el valor de TS se mantuvo constante. Por definición, la CMC es la concentración de surfactante en la que se observa un cambio brusco en la tasa de reducción de la TS con el aumento de la concentración de tensioactivo, es decir, un punto de inflexión en la curva. Independientemente de la concentración de biosurfactante, no se observó una nueva reducción de la TS con la generación de biosurfactante una vez que el valor de CMC se había alcanzado, sin embargo es de suponer que la formación de micelas sí aumenta (Fox y Bala, 2000). De esta manera, se determinaron los valores de CMC y las productividades específicas de biosurfactante, expresado como el cociente entre la -1 -1 producción de biosurfactante (g L ) y la concentración inicial de diésel (10 g L ). Los -1 -1 -1 valores de CMC estimados fueron 2,72 g L , 0,42 g L y 0,45 g L para el consorcio XA, -1 -1 XB y XC, respectivamente, y los valores de rendimiento fueron 0,69 g g , 0,13 g g y 0,18 g g - 1 para XA, XB y XC, respectivamente. Valores similares fueron publicados por Pornsunthorntawee y col. (2008). La Figura 4.15 muestra que, si bien el consorcio XA no 94 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos mostró la mayor reducción de TS, sí mostró la mayor productividad de biosurfactante y un valor de CMC elevado. Para los otros dos consorcios estudiados, los valores de CMC y el rendimiento de producción de los biosurfactantes fueron similares e inferiores a los valores del consorcio XA. Por último, algunas diferencias se pueden encontrar mediante un análisis comparativo global al vincular la eficacia en la biodegradación (%), la velocidad máxima -1 -1 de biodegradación de diésel (mg L h ) en la fase exponencial y la velocidad media de -1 -1 -1 biodegradación (mg L h ) con la concentración de biosurfactante (g L ) para cada uno de los consorcios a 25 ° C y 1% (v/v) de concentración inicial de diésel. La Figura 4.16 muestra directamente que un aumento en la producción de biosurfactantes conduce a una mayor tasa de eliminación, un mayor valor medio en la velocidad de consumo y una mayor velocidad máxima de consumo de diésel. 100 Velocidad media Velocidad máxima Eficiencia 350 300 97,5 95 250 200 92,5 150 90 100 87,5 50 0 85 0 1 2 3 4 5 6 7 Eficiencia biodegradación (%) Velocidad de biodegradación (mg L-1h- 1) 400 8 Conc. Biosurfactante (g L -1) Figura 4.16. Vinculación de la producción de biosurfactante con la velocidad y porcentaje de eliminación de diésel. 95 Capítulo 4 4.5. CONCLUSIONES De este capítulo se pueden concluir diversos puntos importantes: 1. El proceso de enriquecimiento llevado a cabo con los microorganismos aislados de los suelos contaminados, resulta en una disminución en el número de especies microbianas, limitándose por selección natural tan sólo a aquellas capaces de metabolizar diésel como única fuente de carbono. 2. Los consorcios microbianos estudiados muestran una excelente viabilidad durante el proceso de biodegradación de diésel en agua, obteniéndose porcentajes de eliminación superiores al 80% en la mayoría de los experimentos y en un tiempo de tratamiento aproximadamente de 40 h. 3. En general, el aumento de la temperatura entre 25 y 30 °C acelera ligeramente el crecimiento celular y, por tanto, la biodegradación de diésel presente en el sistema, aunque el test ANOVA revela que las diferencias no son significativas. A la temperatura de 35 °C se observa que la reacción de biodegradación se inhibe, disminuyendo bruscamente la eficacia en el proceso. 4. El aumento de la concentración inicial de diésel origina un descenso del coeficiente Yx/s debido a un fenómeno de crecimiento desacoplado, es decir, un mayor uso de sustrato para mantenimiento celular. Esto además origina un descenso de la velocidad máxima de crecimiento (μmax). 5. Los tres consorcios obtenidos tienen eficacias muy similares en la biodegradación de diésel, y además existe coincidencia en varias especies microbianas en ellos. Este hecho podría deberse a que el proceso de adaptación y aclimatación de los tres consorcios lleva a la obtención de cultivos microbianos con capacidades muy similares. Sin embargo, el test ANOVA indica diferencias significativas entre el consorcio XC y los otros dos consorcios, XB y XA, obteniéndose con éste resultados algo mejores y dando a entender que este consorcio, aislado de un suelo con contaminación crónica, podría tener una respuesta ligeramente superior. Por este motivo, se selecciona el consorcio XC para continuar la investigación en capítulos posteriores. 6. Mediante el seguimiento de la tensión superficial, se determina que los consorcios microbianos son capaces de producir biosurfactantes y que, además, éstos son generados durante la etapa exponencial del crecimiento microbiano. Una mayor producción de biosurfactantes genera un mayor porcentaje de eliminación de diésel y una mayor velocidad de consumo. 96 Biotratabilidad de hidrocarburos diésel con consorcios microbianos 7. El modelo matemático propuesto, basado en la ecuación de Monod, ajusta los datos experimentales con unos coeficientes de correlación de Pearson superiores a 0,85 en todos los casos. Sin embargo, el modelo no se ajusta bien en los casos en los que se observa inhibición por temperatura y tampoco tiene en cuenta el crecimiento desacoplado. Aún así, se trata de un modelo sencillo que podría aplicarse en el diseño de biorreactores para degradación de diésel. 97 Capítulo 4 4.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alexander, M. (1977). Introduction to soil microbiology. Wiley, New York, USA. Al-Saleh, E., Drobiova, H., Obuekwe, C. (2009). Predominant culturable crude oildegrading bacteria in the coast of Kuwait. Int. Biodet. Biodeg. 63:400-406. APHA. (1992). Standard methods for the examination of water and wastewater. 18 ed. American Public Health Association, Washington, DC., USA ASTM D971 – 99a. (2004). Standard Test Method for Interfacial Tension of Oil Against Water by the Ring Method. 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Feasibility of different bioremediation strategies for treatment of clayey and silty recently polluted soils with diesel hydrocarbons. Water, Air & Soil Pollution. DOI: 10.1007/s11270-011-1040-1. - Lacasa, E., Moliterni, E., Rodríguez, L., Villaseñor, J. (2015). Kinetic modelling of a dieselpolluted clayey soil bioremediation process. Science of the Total Environment. (Pendiente de revisión). 103 Capítulo 5 El desafío en los tratamientos de biorremediación es asegurar que determinados microorganismos sean capaces de degradar los contaminantes presentes en los suelos. Por este motivo, y una vez estudiados los fundamentos de la biodegradación en fase líquida por parte de los consorcios degradadores de HC, se realiza ahora el estudio del proceso de biorremediación del suelo en laboratorio, probando diferentes estrategias como bioestimulación y bioaumento, y estudiando la influencia de factores relevantes en el proceso: el tipo de suelo, la humedad o la concentración de inóculo. 104 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio 5.1. INTRODUCCIÓN Para aumentar la eficiencia del proceso de biorremediación de suelos contaminados con HC se pueden aplicar diversas metodologías: (1) bioestimulación, que consiste en la mejora de las condiciones del proceso, es decir, mejorar la disponibilidad de nutrientes, corregir el pH y controlar la humedad entre otros factores, y fomentar así el potencial de biodegradación de los microorganismos autóctonos, y (2) bioaumento, que se basa en la inoculación de una microbiota especial (Gentry y col., 2004). Para esta última opción existen diversas posibilidades de actuación: por un lado existe la posibilidad de utilizar una única cepa o bien un consorcio microbiano mixto y, en este caso, a su vez, elegir entre un consorcio microbiano autóctono, previamente aislado del suelo contaminado que se quiere tratar y enriquecido en el HC como única fuente de carbono, o un consorcio exógeno previamente extraído de otro lugar (Ueno y col., 2007). El bioaumento es una tecnología menos estudiada que la bioestimulación. Vogel y Walter (2001) señalaron algunos factores que afectan al correcto desempeño de este proceso. Estos incluyen entre otros, la estructura química, la concentración y la biodisponibilidad del contaminante, y el tamaño y naturaleza de la población microbiana inoculada. Además, algunos ejemplos han demostrado que esta metodología aún no es de aplicación general. Moller y col. (1995) estudiaron la eficacia de un consorcio microbiano comercial, diseñado específicamente para realizar bioaumento, en un suelo contaminado con diésel y encontraron no solo que la degradación del diésel no se producía, sino que, además, el consorcio añadido reprimía la capacidad de degradación de los microorganismos autóctonos. Por otro lado, Ghazali y col. (2004) utilizaron varios consorcios de microorganismos exógenos para mejorar la biodegradación de diésel en el suelo y, sin embargo, observaron una eficiencia muy baja; los HC solo fueron degradados por un único consorcio, que consistía en seis cepas aisladas de diversos sitios contaminados. Estos investigadores llegaron a la conclusión de que el tipo de tierra y los consorcios microbianos pueden determinar la velocidad y el grado de recuperación del suelo, y sugirieron que se llevaran a cabo otros estudios para evaluar la influencia del tipo de suelo, del tamaño de las partículas que lo forman y las formas en que éstas interaccionan con los HC. Años más tarde, Ueno y col. (2006) observaron que sólo durante las primeras dos semanas, la tasa de degradación de diésel fue mayor con un proceso de bioaumento que con uno de bioestimulación, pero después de este tiempo, no se observaron diferencias en las tasas de degradación en los dos tratamientos. McKew y col. (2007) observaron resultados similares cuando estudiaron la estrategia de bioaumento usando una especie única en la degradación de diésel. En este caso, la degradación de 105 Capítulo 5 n-alcanos sólo se observó durante los primeros cinco días, y el grado de degradación fue menor que el alcanzado por el tratamiento de bioestimulación. Sin embargo, en la literatura reciente se pueden encontrar algunos casos de éxito en los que, por un lado, se han obtenido eficiencias en la eliminación de HC de entre el 70 y el 96% utilizando exclusivamente la estrategia de biaumento (Nasseri y col., 2010; Gargouri y col., 2014; Ma y col., 2015) y, por otro, varios autores que han estudiado la eliminación de HC usando una combinación de las estrategias de bioestimulación y bioaumento con muy buenos resultados (Fan y col., 2014; Suja y col., 2014; Agarry y Latinwo, 2015). En este sentido, se pueden encontrar en la literatura varias revisiones bibliográficas relacionadas con la metodología de bioaumento (Hosokawa y col., 2009; Mrozik y Piotrowska-Seget, 2010; Kuráň y col., 2014). No sólo el tipo de estrategia de biorremediación es lo que va a definir el proceso, sino que, tal y como se comentó en la introducción general, entre los parámetros más importantes que afectan al proceso de biorremediación, está el grado de humedad del suelo. Este factor está directamente relacionado con el grado de biodegradación de los contaminantes ya que influirá en su disponibilidad, en la textura del suelo y en el proceso microbiano en sí. Por este motivo, varios autores basan sus investigaciones en estudiar cual es el grado de humedad óptimo para llevar a cabo el proceso de biorremediación (Shelton y Parkin, 1991; Providenti y col., 1993; Young-Gyun y col., 2000). Muchas de las investigaciones que se llevan a cabo a escala de laboratorio utilizan contenidos de humedad superiores al 40% (p/p) e, incluso, han superado en muchos casos las condiciones de saturación, consistiendo en experimentos que se realizan con suspensiones de suelo en agua, denominándose tal situación fase de lodos o slurry. Los resultados de esas investigaciones sólo son extrapolables a escala real mediante el uso de biorreactores slurry, en los que el gasto de agua es un factor importante a controlar tal y como se verá en el próximo capítulo. Sin embargo, en el resto de tratamientos de biorremediación en fase sólida insaturada (10-40% de humedad) también se hace necesaria esta optimización, ya que, aunque no juega un papel tan importante en la transferencia de materia, sí lo hace en la oxigenación, en el mantenimiento de la estructura celular y en los procesos metabólicos que suceden (Vidali, 2001). Además de los aspectos microbiológicos y los relacionados con los fundamentos químicos y bioquímicos de la biodegradación de HC, también las características físicas y químicas de los suelos influyen en el potencial de biodegradación y, por tanto, alteran la eficiencia del proceso (Atlas y Bartha, 1998). Los aspectos más importantes son los relacionados con el transporte de los contaminantes entre las distintas fases que intervienen en el proceso (Figura 5.1): la matriz suelo como fase sólida (S), el agua (A) y 106 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio la fase orgánica (NAPL, fase líquida no acuosa, de sus siglas en inglés), como fases líquidas, y el aire en contacto con ellas (V), como fase gas. Por ello, una gran parte de los trabajos que se publican actualmente sobre biorremediación de suelos contaminados incluyen estudios de desorción de HC (Juhasz y col., 2014; Spasojevic y col., 2015), y estudios de variables que afectan a la transferencia de materia entre las fases, así como la obtención de coeficientes de reparto (Wang y Vipulanandan, 2001; Woo y col., 2001). Suelo Limpio Suelo contaminado SUELO NAPL AGUA HC ADSORBIDO EN EL SUELO AIRE HC VAPORIZADO HC DISUELTO EN AGUA Figura 5.1. Disposición de un contaminante HC en el suelo. La biodisponibilidad de los contaminantes juega por tanto un rol importante en la biorremediación de HC. Tal y como se explicó en el capítulo anterior, para un sistema de dos fases (agua-HC), numerosos estudios han indicado que la velocidad de disolución desde la fase orgánica no soluble, NAPL, determina la velocidad de biodegradación (Ghoshal y Luthy, 1998; Alshafie y Ghoshal, 2003) ya que los microorganismos no son capaces de consumir el HC directamente de esta fase (Mukherji y col., 1998). Pero también existen otros estudios que han demostrado que los microorganismos son capaces de acceder al HC en estado libre como NAPL directamente desde la interfase HC-agua (Nakahara y col., 1977; Rosenberg y col., 1989), pudiéndose entender así la alta velocidad de biodegradación de muchos HC en estado libre. Sin embargo, en sistemas de tres fases donde el HC se encuentra parcial o fuertemente adsorbido en las partículas de suelo, su accesibilidad se presume limitada. Por este motivo, también numerosos modelos matemáticos han sido desarrollados para describir el proceso de biorremediación de HC en este tipo de sistemas. Algunos están basados en la premisa de que los microorganismos sólo pueden utilizar los HC en fase disuelta (Ramaswami y Luthy, 1997; Wang y Vipulanandan, 2001; Mulder y col., 2001; Ostendorf y col., 2007), pero algunos otros sugieren que los compuestos adsorbidos también están disponibles directamente para los microorganismos sin necesidad de que se produzca su desorción (Mukherji y col., 1998; Woo y col., 2001; Park y col., 2001). La alta controversia que 107 Capítulo 5 existe en la actual literatura sobre este tema hace necesario el estudio en profundidad de este tipo de sistema. 5.2. OBJETIVO El objetivo general de este capítulo se centra en estudiar la viabilidad de la técnica de biorremediación de suelos contaminados con diésel a escala de laboratorio bajo distintas condiciones de operación, de tal forma que se puedan seleccionar aquellas más beneficiosas para el proceso a mayor escala. Como sub-objetivos se plantean los siguientes: 1. Estudiar la influencia del tipo de inóculo y discutir la viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación (bioestimulación y bioaumento autóctono o bioaumento exógeno) a escala de laboratorio. 2. Estudiar la influencia del tipo de suelo (arcilloso o limoso) en el proceso de biorremediación. 3. Analizar la biodisponibilidad del contaminante en cada una de las fases que intervienen en el proceso de biorremediación y la transferencia de materia que ocurre entre ellas. 4. Optimizar el grado de humedad ideal y la cantidad de inóculo a añadir en un proceso de biorremediación de este tipo. 5. Modelizar el proceso de biorremediación llevado a cabo en los experimentos de laboratorio y analizar los parámetros cinéticos característicos. 5.3. PROCEDIMIENTOS 5.3.1. Estudio de la estrategia de biorremediación 5.3.1.1. Diseño de experimentos Los experimentos se realizaron en modo discontinuo y a escala de laboratorio en recipientes agitados cerrados, considerando un modelo de flujo de mezcla perfecta. En ellos se dispuso una pequeña cantidad de suelo contaminado en suspensión en agua que contenía todos los nutrientes adicionales para el cultivo microbiano (medio BHB). Los recipientes se colocaron en un equipo de agitación orbital termostatizado para mantener la temperatura constante y la agitación necesaria (Figura 5.2). 108 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio CO2 O2 Aire Medio acuoso con nutrientes Napl Partículas de suelo (a) (b) Figura 5.2. Experimentos de biorremediación en laboratorio. (a) Esquema de sistema en microcosmos. (b) Vista de experimentos en instalación. Este estudio se realizó con dos tipos de suelo de características texturales distintas; se eligió un suelo de tipo arcilloso, nombrado como S D, y otro de textura limosa, SE, cuyas características pueden observarse en la Tabla 3.1 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes. Para cada tipo de suelo se realizaron cuatro experimentos en los que la variable en estudio fue la estrategia de biorremediación aplicada, existiendo las siguientes opciones: - Bioestimulación (experimento X0), es decir, no se realizó la inoculación de ningún consorcio, estudiándose el proceso con los microorganismos presentes en el propio suelo contaminado. - Bioaumento exógeno (experimento XC), es decir, utilizando únicamente un consorcio exógeno previamente enriquecido y adaptado al consumo de HC diésel. Para la realización de este experimento fue necesario esterilizar previamente el suelo. El consorcio exógeno utilizado fue el consorcio XC, obtenido del suelo contaminado SC y estudiado en el capítulo anterior. - Estrategia combinada de bioestimulación y bioaumento exógeno (experimento X0+XC), es decir, adición de microorganismos exógenos X C en un suelo que además contenía microorganismos autóctonos X 0. 109 Capítulo 5 - Estrategia combinada de bioestimulación y bioaumento con microorganismos autóctonos (experimento X0+X0e), es decir, adición de microorganismos autóctonos previamente aislados y adaptados al consumo de HC diésel (X0e) al suelo que además contenía los microorganismos autóctonos X0. El consorcio X0e se corresponde con el consorcio XD, en caso del suelo arcilloso, y con XE, en el caso del suelo limoso. Además, se realizó un experimento de control o “no inoculado” (NI) con cada suelo esterilizado (SE) para contabilizar las pérdidas de HC diésel ajenas a la biodegradación. En total se realizaron diez experimentos que se muestran en la Tabla 5.1. Todos los experimentos fueron realizados por duplicado con el fin de comprobar la reproducibilidad de los resultados. Tabla 5.1. Diseño de experimentos en microcosmos. Estrategia Abiótico Bioestimulación Bioaumento exógeno Bioestimulación + Bioaumento exógeno Bioestimulación + Bioaumento autóctono Arcilloso NI/SE X0 XC X0+XC X0+X0e Limoso NI/SE X0 XC X0+XC X0+X0e Suelo Nota: siendo Xo, consorcio de microorganismos endógenos presente en el suelo a estudio; XC, consorcio de microorganismos exógenos obtenidos de SC, especializados en la biodegradación de diésel; X0e, consorcio de microorganismos endógenos inicialmente presente en el suelo objeto a estudio, aislado y enriquecido en la metabolización de diésel, y que se corresponde con XD o XE, según el suelo estudiado; NI, no inóculo; SE, suelo estéril. 5.3.1.2. Procedimiento experimental y muestreo El suelo se contaminó artificialmente 3 días antes del comienzo de los experimentos con 17.000 mg kg -1 de diésel. Para ello se dispusieron 15 g de suelo en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 mL de capacidad y se le adicionaron 300 μL de diésel. En el caso de utilizar suelos estériles para los experimentos abióticos, éstos se introdujeron previamente (500 g) en un bote y se esterilizaron en un autoclave a 121 °C durante 15 min. Cada experimento consistió en disponer 14 matraces Erlenmeyer con 15 g de suelo contaminado a los que se adicionaron 30 mL de medio BHB e inóculo en una proporción 1:1,5 (v/v, con respecto al contaminante) del consorcio específico de microorganismos en el caso que correspondió. Los matraces fueron tapados con un tapón comercial de celulosa, de la casa Selecta, y depositados en un equipo de agitación orbital (Tipo 110 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio MaXQ4000 de Thermo Fisher Scientific) a 25 °C y 130 rpm durante 11 días hasta análisis (Figura 5.2). La relación final de C/N/P, ajustada con el medio BHB, fue de 100/7,7/3,9. En un sistema de experimentación de este tipo, la medida de cualquier variable resulta compleja por la heterogeneidad del sistema. Por ese motivo para cada experimento (Tabla 5.1) el muestreo consistió en un seguimiento exhaustivo durante los días 0, 1, 2, 3, 4, 7 y 11, en el que se tomaba el contenido completo de dos matraces. En ambos matraces se analizó el crecimiento microbiano a través de la concentración de biomasa y la concentración residual de diésel en el sistema mediante el análisis de TPH. Para ello, se vertió cada suspensión a un tubo Falcon de 50 mL de capacidad y se dejó reposar durante 10 min. A continuación, se tomaron 2 mL del sobrenadante líquido, que se utilizaron para conocer la concentración de biomasa. Seguidamente, el Falcon se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min para separar la fase suelo de la líquida y, una vez separadas, se tomaron 5 mL de la fase acuosa intermedia (sin tomar líquido de la zona superior donde reposa la NAPL). A continuación, el resto de fase líquida (agua y fase NAPL) se trasvasó a un nuevo tubo Falcon. Así, una vez separadas las fases, se procedió al análisis de la concentración de TPH en cada una de ellas. 5.3.1.3. Medida de la concentración de biomasa La concentración de biomasa analizada fue la correspondiente a los microorganismos HiC, es decir, se evaluó exclusivamente la biomasa especializada en la degradación de HC, pues es la que tiene especial interés. Para ello, se analizaron los 2 mL tomados del sobrenadante de la suspensión del Falcon mediante la técnica del NMP descrita en el apartado 3.7 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes de la presente memoria, utilizando diésel como única fuente de carbono. Para interpretar los valores de NMP obtenidos en términos de concentración, se realizó una recta de calibrado, previa a la realización de los experimentos, que -1 relacionaba la magnitud medida con la masa de células por unidad de volumen (g L ). El procedimiento consistió en obtener el valor de NMP a lo largo de la incubación de un consorcio cualquiera a la vez que se obtenía el valor de los sólidos volátiles (SV) presentes en ese momento en el medio de cultivo, asumiendo que el peso de las células no varía de unos consorcios a otros. El procedimiento seguido consistió en lo siguiente: - Se dispusieron 11 matraces Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a los que se les adicionaron 150 mL de medio BHB, 1,5 mL de diésel y 1,5 mL de 111 Capítulo 5 inóculo de un consorcio de microorganismos HiC y se incubaron a 26 °C y 130 rpm. - A un tiempo dado se realizaba el análisis de cada uno de los matraces; muestreándose 5 mL de suspensión para realizar la medida NMP y el resto se utilizó para determinar la concentración de SV según la norma ASTM E 1755-01 (1991). En la Tabla 5.2 se recogen los datos obtenidos a lo largo de dicha calibración; observándose para cada valor de NMP, el valor de la concentración de SV que fue medido. Tabla 5.2. Relación entre NMP y SV. Log NMP SV (gcélulas L-1) 2,477 4,322 8,491 22 77 475 9,845 10,114 645 682 10,698 758 10,845 11,146 647 735 11,322 12,146 13,380 737 706 716 A través del ajuste de los datos de la Tabla 5.2 fue posible cuantificar el crecimiento microbiano, ya que por interpolación se pudo conocer el valor de la cantidad de células -1 presentes en el medio (g L ) conociendo únicamente el valor del NMP del mismo. En la Figura 5.3 se observa el ajuste de dichos datos, así como la ecuación que los relaciona. 112 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio 1000 900 800 SV (mg L -1 ) 700 600 500 400 300 200 y = 77,31x - 172,94 R² = 0,922 100 0 0 2 4 6 8 10 12 14 l o g NMP Figura 5.3. Recta de calibrado SV–log NMP. 5.3.1.4. Medida de la concentración de TPH A lo largo de los 11 días de experimentación se determinó la concentración de TPH presentes en cada una de las fases del sistema experimental mediante la extracción de diésel residual. Las medidas se realizaron de diferente forma según la fase muestreada: - La fase suelo fue analizada según la norma UNE-EN 14039 (2005) para la caracterización de residuos, utilizando 10 g de NaHSO 4 como agente desecante y 5 mL de n-hexano como agente extractor. - La fase líquida (NAPL y acuosa en conjunto) fue analizada según la norma UNE-EN ISO 9377-2 (2001), para la determinación del índice de HC en agua con 2 mL de n-hexano. - La fase acuosa (los 5 mL muestreados) fue analizada según la norma UNEEN ISO 9377-2 (2001) con 1 mL de n-hexano. Una vez llevadas a cabo las extracciones, los extractos orgánicos resultantes se depositaron en viales de cromatografía y se conservaron a 4 °C hasta posterior análisis por cromatografía gaseosa con GC-FID según el apartado 3.5 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes de la presente memoria. La concentración de HC en la fase gas se determinó en los experimentos abióticos restando del total de la concentración inicial, la medida en cada una de las fases restantes. Para cuantificar la concentración de TPH presente en las muestras se realizó una recta de calibrado a distintas concentraciones de diésel en n-hexano, de tal manera que, 113 Capítulo 5 por interpolación de las áreas cromatográficas, fue posible conocer la concentración real de las muestras analizadas. 5.3.2. Estudio de la influencia del grado de humedad 5.3.2.1. Diseño de experimentos De manera similar a los anteriores, se prepararon nuevos experimentos en los que se estudió el efecto del grado de humedad en la biorremediación del suelo. En este caso, y una vez analizados los resultados de los experimentos anteriores, este estudio sólo se realizó con el suelo arcilloso, nombrado como S D. Se realizaron siete experimentos (por triplicado) bajo las mismas condiciones de operación, y variando únicamente entre ellos la cantidad de medio acuoso añadido (Tabla 5.3), de forma que la humedad del suelo variase entre un 6 y un 53%, aproximadamente. De este modo, se pasó de un suelo húmedo insaturado hasta un suelo en suspensión, pasando por situaciones intermedias de humedad creciente. Tabla 5.3. Diseño de experimentos para el estudio de la influencia del grado de humedad. Fase Sólida Barro Suspensión Medio acuoso adicionado (mL) 0 0,5 2 4 6 Humedad (%) 6,34 11,03 18,71 26,80 33,47 8 40,26 15 Saturado (53,31) 5.3.2.2. Procedimiento experimental y muestreo El suelo se contaminó artificialmente 3 días antes del comienzo de los experimentos -1 con una concentración de 17.000 mg kg de diésel. Los experimentos se realizaron en matraces Erlenmeyer de vidrio de 250 mL. Cada experimento consistió en 7 matraces con 15 g de suelo contaminado, a los que se adicionó inóculo X D en una proporción 1:1 (v/v) con respecto al contaminante y la cantidad de medio acuoso correspondiente. Los matraces fueron tapados con un tapón comercial de celulosa, de la casa Selecta, y depositados en un equipo con agitación orbital a 25 °C y 130 rpm durante 20 días hasta posterior análisis. 114 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio Cada 2-3 días se realizó el análisis de concentración de TPH en toda la masa de reacción sin distinción entre fases, analizándose el contenido total del matraz en una sola extracción con n-hexano según la norma UNE-EN 14039 (2005). Posteriormente se analizaron los extractos por cromatografía gaseosa con GC-FID de igual modo que se ha comentado anteriormente (apartado 5.3.1.4). De manera paralela se dispusieron 4 matraces adicionales a los 7 ya mencionados, para cada valor de humedad estudiado, que sirvieron como experimento de control para determinar la pérdida semanal de humedad (Figura 5.4). 70 6,34% 18,70% 33,47% Saturado Humedad (%) 60 11,00% 26,80% 40,26% 50 40 30 20 10 0 0 60 120 180 240 300 360 420 480 Ti e mpo (h) Figura 5.4. Comprobación de la variación de humedad en los experimentos de biorremediación. 5.3.3. Estudio de la influencia de la concentración de inóculo a utilizar en un proceso de bioaumento 5.3.3.1. Diseño de experimentos Estos experimentos se realizaron únicamente con el suelo arcilloso con el fin de evaluar la eficacia de dos consorcios aislados para bioaumento y conocer además la concentración óptima de inóculo necesaria en los experimentos que se realizarían a posteriori a mayor escala. Se realizaron en total seis nuevos experimentos en microcosmos por duplicado (Tabla 5.4), variando la concentración de inóculo añadido y el tipo de consorcio utilizado. Los tres primeros experimentos se inocularon con el consorcio XC y los tres restantes 115 Capítulo 5 fueron inoculados con el consorcio XD (es decir, un consorcio obtenido del propio suelo arcilloso por enriquecimiento y adaptación al consumo de diésel, X 0e). Tabla 5.4. Diseño de experimentos para el estudio de la concentración de inóculo a adicionar en un proceso de bioaumento. Consorcio Relación HC:Cantidad de inóculo (v/v) 1:0,68 1:1,35 1:0,33 XC √ √ √ XD √ √ √ 5.3.3.2. Procedimiento experimental y muestreo El suelo se contaminó artificialmente 3 días antes del comienzo de los experimentos -1 con una concentración de diésel de 65.000 mg kg . Los experimentos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL de capacidad. Cada experimento consistió en 9 matraces con 20 mL de medio BHB y 10 g de suelo contaminado en suspensión, a los que se adicionó la concentración del inóculo correspondiente. Los matraces fueron tapados con un tapón comercial de celulosa, de la casa Selecta, y depositados en un equipo de agitación orbital a 25 °C y 130 rpm durante 20 días hasta análisis. Cada 2-3 días se realizó el análisis de la concentración de TPH analizándose el contenido total del matraz sin diferenciar entre las fases que lo componen. Se realizó la extracción con n-hexano según la norma UNE-EN 14039 (2005), tal y como se indicó anteriormente. Después, los extractos se analizaron por cromatografía gaseosa con GCFID según el apartado 5.3.1.4. 5.3.4. Modelo cinético de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos en suspensión acuosa a. Descripción del sistema El sistema estudiado puede asemejarse a un reactor discontinuo de mezcla perfecta, el cual ha sido cargado inicialmente con una matriz suelo, un medio de cultivo específico (agua con nutrientes inorgánicos) y una cierta cantidad de diésel como concentración determinada de sustrato (contaminante inicial, Co). La reacción comienza al adicionar y activarse un inóculo de un consorcio microbiano, que es distribuido homogéneamente 116 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio en el medio, alcanzando una concentración inicial X0. Una vez iniciada la reacción, la actividad microbiana consume HC, y la concentración de sustrato cambia con el tiempo debido a fenómenos de trasporte entre las fases y a la biodegradación, provocando este último el crecimiento de biomasa. Para la formulación del modelo se asumen las siguientes hipótesis de partida: Se trata de un sistema cerrado, adiabático y de masa total constante. Se considera que los HC diésel pueden encontrarse presentes en el sistema en cuatro fases: disueltos en la fase acuosa, adsorbidos en el suelo, en forma libre como fase líquida orgánica (NAPL) o volatilizados en la fase gas. Desde el momento inicial, momento en el que el suelo contaminado entra en contacto con el medio acuoso y con los microorganismos, existe un reparto de HC diésel entre todas las fases presentes y además existe una biodegradación del mismo. El sistema evoluciona hasta alcanzar un equilibrio final, momento en el que los microorganismos han dejado de consumir el HC. Tras la inoculación, las bacterias se encuentran distribuidas homogéneamente por todo el sistema, teniendo acceso al HC en cualquiera de estas tres fases: acuosa (A), adsorbida (S) o NAPL. Se considera que la biodegradación se puede llevar a cabo en cualquiera de ellas a través de las interfases (Guo y col., 1999; Park y col., 2001; Woo y col., 2001) y debido a la generación de biosurfactantes. Las bacterias encargadas de realizar la biodegradación del HC siguen una cinética de crecimiento según la ecuación de Monod. Por tanto, el sistema impone que la tasa de crecimiento es cero sólo si la concentración de diésel es cero. Se considera la existencia de una concentración de sustrato residual en todas las fases a partir de la cual no se produce crecimiento, incluso prolongando el tiempo de incubación (Nocentini y col., 2000). Dicha concentración residual puede ser una fracción no biodegradable o una fracción inaccesible para los microorganismos, de tal manera que cuando se alcanza dicha concentración la reacción biológica se paraliza. Durante los experimentos existen fenómenos de transporte del HC entre las distintas fases. Desde el punto de vista práctico, debido a las características del sistema y a la diferencia de densidades del agua y NAPL, se considera que el transporte de materia se lleva a cabo únicamente entre algunas de 117 Capítulo 5 las fases (Figura 5.5). Los equilibrios existentes entre las fases S-V y A-V, se consideran despreciables respecto al de NAPL-V y no han sido incluidos en el planteamiento del modelo. Por otro lado, no se considera la interacción entre la fase S-NAPL como un equilibrio, sino como un proceso de migración irreversible que por diferencia de densidades se separa. O2 CO2 Gas V Napl Agua K NAPL-V A NAPL Napl K NAPL-A Jn Suelo S K S-A (a) (b) Figura 5.5. (a) Fenómenos de transporte posibles entre las fases. (b) Esquema de los fenómenos de transporte establecidos en el sistema. (Simbología: flecha roja, transportes modelizados; flecha gris discontinua, transportes despreciados). b. Transferencia del HC entre las distintas fases del sistema Aplicando un balance de materia de HC global se obtiene que la concentración de HC total en el sistema, en un instante dado, será la suma de HC en cada una de las fases que lo componen: dCT dt dCS dt fA dC A dt dC Napl dt dCV dt [5.1] siendo CT, concentración de diésel total en el sistema referido a masa de suelo seco -1 -1 (mgTPH kgsuelo ); Cs, concentración de diésel en el suelo (mgTPH kgsuelo ); fA, es la relación entre la cantidad de agua y suelo seco existente en el sistema, que es -1 -1 constante (L kgsuelo ); CA, concentración de diésel disuelto en la fase acuosa (mgTPH L ); CNapl, concentración de diésel libre como fase orgánica por masa de suelo seco -1 (mgTPH kgsuelo ); CV, concentración de diésel volatilizado en la fase gas por masa de -1 suelo seco (mgTPH kgsuelo ); t, tiempo (h). 118 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio La modelización de los datos experimentales obtenidos en las pruebas realizadas en condiciones abióticas, experimentos NI, son útiles para obtener información sobre la velocidad de transporte de HC entre las fases y los equilibrios alcanzados en el sistema. De este modo, los parámetros cinéticos relacionados con estos procesos y, que no dependen del proceso de biodegradación en sí, fueron obtenidos mediante el seguimiento de los balances de HC parciales de cada una de las fases en dichos experimentos de control. dC S dt - Fase suelo: Jn f A KS A [5.2] * (C Ae CA ) donde: Jn (C Sd - Fase acuosa: dC A dt KS - Fase gas: dCV dt K Napl - Fase NAPL: dC Napl dt J n K Napl * (C A e A [5.3] CS ) C A ) K NAPL * (CV e V A [5.4] CA ) [5.5] CV ) * V (C Ae (CV e CV ) f A K Napl * A [5.6] (C Ae C A ) siendo Jn, flujo de migración irreversible del HC presente en el suelo que no se encuentra adsorbido sobre las partículas del suelo y tampoco está en equilibrio con ninguna de las fases (mgTPH kgsuelo -1 -1 h ); α, coeficiente de velocidad de migración -1 irreversible del HC no adsorbido y no en equilibrio (h ); CSd, concentración de saturación -1 de diésel adsorbido en la fase suelo (mgTPH kgsuelo ); KS-A, coeficiente global de -1 transferencia de materia entre la fase suelo y la fase acuosa (h ); KNapl-A, coeficiente -1 global de transferencia de materia entre la fase NAPL y la fase acuosa (h ); KNapl-V, -1 coeficiente global de transferencia de materia entre la fase NAPL y la fase gas (h ); * CVe , concentración de equilibro de diésel volatilizado en la fase gas referido a masa de -1 * suelo seco (mgTPH kgsuelo ); CAe , concentración de equilibrio de diésel disuelto en la fase -1 acuosa (mgTPH kgsuelo ). El resultado es un sistema de cuatro ecuaciones, [5.2], [5.4], [5.5], [5.6] y cuatro incógnitas, α, KS-A, KNapl-A y KNapl-V, que puede resolverse a través del ajuste de los datos experimentales obtenidos en los experimentos abióticos con la ayuda del algoritmo de Gauss-Newton. Para ello, un conjunto inicial de valores fue asignado a estos parámetros, α, KS-A, KNapl-A y KNapl-V, y después de varias iteraciones, fueron elegidos los 119 Capítulo 5 valores de los parámetros que condujeron al mínimo de la función objetivo φ (p) (Ecuación [5.7]). [5.7] siendo n, el número de datos experimentales; CAexp,i, CSexp,i, CNaplexp,i, CVexp,i, los valores experimentales de HC en fase acuosa, suelo, NAPL y gas medidos a tiempo igual a i; CAi(p), CSi(p), CNapli(p), CVi(p), los valores calculados por el modelo, correspondientes a la medición i. c. Modelo de biodegradación Una vez obtenidos los valores de los coeficientes de transferencia de materia, se plantean nuevamente cada uno los balances de HC parciales que tendrán lugar en las distintas fases del sistema pero considerando ahora que ya existe reacción biológica. Ésta comienza al añadir y activarse el inóculo de microorganismos. Para el tiempo inicial (t = 0), ya existe un reparto de HC previo entre las distintas fases, las cuales estarán a mitad de camino entre las condiciones iniciales (CA = 0, CV = 0, CNapl = 0) y las de equilibrio o finales. Para un tiempo t, la variación de concentración de diésel contenido en una determinada fase será consecuencia de los fenómenos de transporte con las demás (fenómenos ya comentados), además del consumo biológico de diésel en dicha fase. En el caso de la fase suelo, el balance parcial de sustrato es el siguiente: dC S dt * Jn f A K S A ·(C A e C A ) ·(C S C SI ) 1 ·X · K S C S C SI Yx s [5.8] max es decir, una ecuación similar a la ecuación [5.2] en la que, además, aparece un término de consumo de sustrato por reacción biológica, siendo μmax, velocidad específica de -1 -1 crecimiento máximo (h ); KS, constante de semi-saturación (mgTPH kgsuelo ); X, concentración de biomasa total capaz de degradar diésel en el -1 sistema -1 (mgCélulas kgsuelo ); Yx/s, rendimiento en masa celular del sustrato (mgCélulas mgTPH ); CSI, -1 concentración residual de HC diésel contenido en la fase suelo (mgTPH kgsuelo ). Para la fase acuosa, se establece el balance de HC diésel de forma análoga al caso anterior: 120 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio dC A dt * K 2 (C Ae CA ) ·(C A C AI ) 1 ·X · K S C A C AI Yx / s [5.9] max es decir, una ecuación similar a la ecuación [5.4] en la que además aparece un término de consumo de sustrato por reacción biológica, siendo CAI, concentración residual de -1 diésel en la fase acuosa (mgTPH kgsuelo ). En la fase NAPL el balance de diésel se expresa con una ecuación similar a la ecuación [5.6], en la que además aparece un término por consumo de sustrato por reacción biológica: dCNapl JN dt K Napl gas * ·(CVe CV ) * f A K Napl A ·(C Ae CA ) max ·(CNapl CNaplI ) K S CNapl CNaplI 1 ·X · Yx s [5.10] -1 siendo CNaplI, concentración residual de diésel en la fase NAPL (mgTPH kgsuelo ). Finalmente, se presenta el balance global de biomasa generada en el sistema, que vendrá dado por la suma de la biomasa generada a raíz del consumo de HC en cada una de las fases del sistema (acuosa, suelo y NAPL), y teniendo en cuenta además el posible descenso de concentración por el proceso de muerte celular: dX dt fA ·(C A C AI ) ·X k S C A C AI ·(C S C SI ) ·X k S C S C SI max max max ·(C Napl C NaplI ) k S C Napl C NaplI ·X K d X [5.11] -1 siendo Kd, constante cinética de muerte celular (h ). Una vez planteadas las ecuaciones parciales, el modelo se resolvió simultáneamente usando el algoritmo de Gauss-Newton con las ecuaciones [5.8], [5.9], [5.10] y [5.11]. Un conjunto inicial de valores fue asignado a estos parámetros, µmax, KS, YX/S, Kd, y después de varias iteraciones, fueron elegidos los valores de los parámetros que condujeron al mínimo de la función objetivo θ (p) (Ecuación [5.12]). [5.12] siendo n, el número de datos experimentales; Xexp,i y Cexp,i, los valores experimentales de biomasa y sustrato en cada una de las fases medidas a tiempo igual a i; Xi(p) y Ci(p), los valores calculados por el modelo, correspondientes a la medición i. 121 Capítulo 5 El modelo planteado hasta el momento parte de la hipótesis de la existencia de una única biomasa total en el sistema (X) capaz de degradar diésel indistintamente en cualquiera de sus formas: disuelto (A), adsorbido (S) o en forma libre (NAPL). Además, tiene en cuenta también, que esa biomasa metabolizará a la misma velocidad (μmax) el sustrato en cualquiera de sus formas, con el mismo rendimiento (YX/S) e incluso tendrá la misma afinidad (KS) por el sustrato, independientemente de la forma en la que se encuentre. Actualmente, éstas son las hipótesis más aceptadas que se plantean en la mayoría de las investigaciones que se encuentran en bibliografía. Sin embargo, otros autores han introducido algunas variantes (Guo y col., 1999; Woo y col., 2001). Por este motivo, y con el objetivo de saber si otras hipótesis pueden ser válidas, se plantean varios cambios en el modelo basados en las siguientes premisas o hipótesis: HIPÓTESIS A. Parte de la biomasa está especializada en metabolizar diésel en cada una de las fases del sistema. Es decir, se reconoce la existencia de una biomasa encargada de metabolizar exclusivamente el diésel adsorbido en la matriz suelo (XS), otra biomasa exclusiva para metabolizar el diésel disuelto en la fase acuosa (XA) y, por último, una biomasa capaz de metabolizar el diésel en fase libre (XNAPL). HIPÓTESIS B. La velocidad de degradación, impuesta por el coeficiente μ max, es distinta dependiendo de la fase en la que se encuentre el HC (Guo y col., 1999). Es decir, se reconoce la existencia de distintas velocidades de degradación del HC según la forma en la que sea metabolizado: directamente adsorbido del suelo, μmax,S; disuelto en la fase acuosa, μmax,A; o en forma libre, μmax,NAPL. HIPÓTESIS C. La afinidad por el HC, medida con el coeficiente K S, depende del estado en el que se encuentre el HC en el sistema (Woo y col., 2001). Por este motivo, se plantean distintos coeficientes dependiendo de la fase: disuelto en el agua, KS,A; en forma libre, KS,NAPL; o adsorbido en la matriz suelo, KS,S. HIPÓTESIS D. El rendimiento con el que se realizará la conversión del HC en biomasa (YX/S) dependerá también de la disposición del mismo en el sistema, así como, de la cantidad de biomasa que lo degrada; definiéndose distintos rendimientos para el proceso de biorremediación según el estado del HC: disuelto en la fase acuosa, YX/S,A; adsorbido en el suelo, YX/S,S; o en forma libre, YX/S,NAPL. 122 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio Una vez descritas estas nuevas hipótesis, el modelo puede plantearse con hasta seis opciones distintas, dependiendo de qué hipótesis sean o no consideradas (Tabla 5.5). Así, mediante el análisis de los ajustes y sus correlaciones se puede observar qué hipótesis son ciertas, cuáles tienen un efecto despreciable, cuáles podrían ser descartadas o cuáles no pueden analizarse. Tabla 5.5. Hipótesis analizadas en el planteamiento del modelo. 1 2 OPCIÓN 3 4 5 6 A B x x √ x x √ √ √ x √ √ √ C D x x x x √ x √ x √ √ √ √ HIPÓTESIS Nota: x, hipótesis que no se ha tenido en cuenta; √, hipótesis tenida en cuenta. 5.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.4.1. Distribución de diésel en los experimentos abióticos Los análisis de TPH en los experimentos de control abiótico mostraron que la distribución de diésel en el sistema fue diferente dependiendo del tipo de suelo estudiado (Figura 5.6). Cs exp Ca exp Cnapl exp Cv exp TPH (mg kg-1 ) 16000 14000 Cs mod Ca mod Cnapl mod Cv mod 12000 10000 8000 18000 14000 10000 8000 6000 4000 4000 2000 2000 0 30 60 90 Tiempo (h) (a) 120 Cs mod Ca mod Cnapl mod Cv mod 12000 6000 0 Cs exp Ca exp Cnapl exp Cv exp 16000 TPH (mg kg-1 ) 18000 0 0 50 100 150 200 250 Tiempo (h) (b) Figura 5.6. Distribución de diésel en los experimentos abióticos de suelos en suspensión acuosa. (a) Suelo arcilloso. (b) Suelo limoso. 123 Capítulo 5 En general, en las primeras 23 h se produjo la migración de diésel de ambos suelos, a una velocidad decreciente hasta alcanzarse un estado de equilibrio. Dicha concentración de diésel iría acumulándose en la fase NAPL hasta mantenerse constante. En el suelo arcilloso esta migración fue más elevada, y alrededor de las 48 horas de experimentación cerca del 55% del HC inicial se detectó en la fase líquida (suma de la concentración medida en la fase acuosa y NAPL), mientras que en la fase líquida en el caso del suelo limoso sólo se detectó el 19% de diésel después del mismo tiempo de experimentación. Al final de la experimentación, el suelo limoso retuvo 11.447 -1 -1 mg kg frente a 6.954 mg kg que retuvo el suelo arcilloso bajo las mismas condiciones. Tras realizar el balance global de HC en los experimentos abióticos se calcularon las pérdidas de HC de bajo peso molecular por volatilización, resultando 8,11 y 7,60% para el suelo arcilloso y limoso, respectivamente, después de 11 días de tratamiento (Figura 5.7). 18000 800 18000 400 8000 6000 200 4000 600 12000 10000 400 8000 6000 200 4000 Biomasa (mg Kg-1) 10000 14000 Biomasa (mg Kg-1) 600 12000 TPH (mg Kg-1) 14000 TPH (mg Kg-1) 800 16000 16000 2000 2000 0 0 0 50 100 150 200 Tiempo (h) (a) 250 0 0 0 50 100 150 200 250 Tiempo (h) (b) Figura 5.7. Concentración de TPH y de biomasa en los experimentos abióticos. (a) Suelo arcilloso. (b) Suelo limoso. (Simbología: ● concentración de HC; concentración de biomasa). Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Los resultados de estos experimentos abióticos fueron ajustados a través del modelo planteado, despreciando las pequeñas concentraciones de biomasa detectadas. De esta forma, se obtuvieron los parámetros propios de los fenómenos de transporte: proceso de migración, solubilización y volatilización (Tabla 5.6), siendo todas las constantes de transferencia de materia del mismo orden de magnitud en los dos suelos, a excepción de α, que fue alrededor de 10 veces más rápido para el suelo arcilloso. 124 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio Tabla 5.6. Parámetros estimados en los experimentos abióticos. Suelo KS-A (h-1) KNapl-A (h-1) KNapl-V (h-1) α (h-1) Arcilloso Limoso 0,03 0,02 0,02 0,02 0,14 0,09 0,98 0,10 5.4.2. Resultados de los experimentos de biorremediación de suelos en suspensión acuosa Las Figuras 5.8 y 5.9 muestran los resultados de todos los experimentos de biorremediación del suelo arcilloso y limoso, respectivamente indicados en la Tabla 5.1. Se presentan cuatro partes en cada figura (a, b, c y d) correspondientes a cada una de las estrategias de biorremediación utilizadas: bioestimulación (X 0), bioaumento exógeno (XC), combinación de bioestimulación con bioaumento exógeno (X0+XC) y combinación de bioestimulación con bioaumento autóctono enriquecido (X 0+X0e). A su vez, se presentan dos figuras para cada experimento. En la figura de la izquierda, se representa el descenso temporal de la concentración de TPH en el sistema y la curva de crecimiento de biomasa. Por otro lado, en la figura de la derecha, se muestra la concentración del contaminante en las distintas fases presentes en el sistema y su evolución a lo largo del tiempo. Además, superpuestos a los datos experimentales, se presentan las curvas de modelización obtenidas con el modelo matemático planteado bajo la opción 1, es decir, aquella opción que no tenía en cuenta ninguna de las hipótesis (A, B, C o D) inicialmente planteadas. TPH exp Bio exp 16000 TPH mod Bio mod 250 8000 200 6000 150 4000 100 2000 50 0 0 0 50 100 150 200 8000 3000 2500 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 0 0 250 3500 C A ( mg L -1) 300 10000 10000 Biomasa (mg kg-1) 350 12000 Cs exp Cs mod Cnapl exp Cnapl mod Ca exp Ca mod 12000 450 400 14000 C T (mg kg-1) 4000 500 C S , C NAPL (mg kg-1) 18000 50 100 150 200 250 Tiempo (h) Tiempo (h) (a) (Continuación Figura 5.8) 125 Capítulo 5 18000 TPH exp Bio exp 16000 TPH mod Bio mod 4000 1400 Cs mod 1200 8000 600 6000 400 4000 200 2000 0 C S , C NAPL (mg kg-1) 800 50 100 150 200 Ca exp 8000 Ca mod 1500 1000 2000 500 0 250 0 0 50 16000 TPH mod Bio mod 150 1400 1200 10000 8000 600 6000 400 4000 200 2000 0 C S , C NAPL (mg kg-1) 800 8000 50 100 150 200 4000 3500 3000 2500 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 0 0 250 C A (mg L -1) 10000 Biomasa (mg kg-1) 1000 12000 200 Cs exp Cs mod Cnapl exp Cnapl mod Ca exp Ca mod 12000 14000 C T (mg kg-1) 100 Tiempo (h) (b) TPH exp Bio exp 2500 4000 Tiempo (h) 18000 3000 2000 6000 0 0 Cnapl mod 3500 C A (mg L -1) 10000 Cnapl exp 10000 1000 Biomasa (mg kg-1) C T (mg kg-1) 14000 12000 Cs exp 12000 0 0 250 50 100 150 200 250 Tiempo (h) Tiempo (h) (c) 18000 TPH exp Bio exp 16000 TPH mod Bio mod 1100 700 8000 6000 500 4000 2000 0 0 50 100 150 200 8000 3000 2500 2000 6000 1500 4000 1000 300 2000 100 0 250 3500 500 0 0 50 100 150 200 250 T iempo (h) Tiempo (h) (d) Figura 5.8. Concentración de TPH y de biomasa en los experimentos con suelo arcilloso. (a) Bioestimulación, X0. (b) Bioaumento, XC. (c) Bioestimulación + Bioaumento exógeno, X0+XC. (d) Bioestimulación + Bioaumento autóctono, X0+X0e. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. 126 C A (mg L- 1) 900 10000 10000 C S , C NAPL (mg kg-1) 12000 Cs exp Cs mod Cnapl exp Cnapl mod Ca exp Ca mod 12000 Biomasa (mg kg-1) C T (mg kg-1) 14000 4000 1300 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio 18000 TPH exp Bio exp 16000 1400 TPH mod Bio mod 16000 3500 Cnapl mod 14000 12000 800 8000 600 6000 400 4000 200 2000 0 50 100 150 200 Ca exp 10000 0 0 3000 Cnapl exp 2500 Ca mod 8000 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 250 C A (mg L -1) 10000 C S ,CNAPL (mg kg-1) 1000 12000 Biomasa (mg kg-1) C T (mg kg-1) Cs mod 14000 1200 4000 Cs exp 0 0 50 100 150 200 250 Tiempo (h) Tiempo (h) (a) 18000 TPH exp Bio exp 16000 1400 TPH mod Bio mod 16000 14000 1200 3500 Cs mod Cnapl mod 14000 12000 800 8000 600 6000 400 4000 200 2000 0 0 0 50 100 150 200 Cnapl exp Ca exp 10000 3000 2500 C A (mg L -1) 10000 C S ,CNAPL (mg kg-1 ) 1000 12000 Biomasa (mg kg-1) C T (mg kg-1) 4000 Cs exp Ca mod 8000 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 250 0 0 50 100 150 200 250 Tiempo (h) Tiempo (h) (b) 18000 TPH exp Bio exp 16000 TPH mod Bio mod 1400 16000 14000 1200 12000 800 8000 600 6000 400 4000 200 2000 0 0 0 50 100 150 Tiempo (h) 200 10000 3500 3000 2500 8000 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 0 0 250 4000 C A (mg L -1) 10000 C S ,CNAPL (mg kg-1) 1000 Biomasa (mg kg-1) C T (mg kg-1) 14000 12000 Cs exp Cs mod Cnapl mod Cnapl exp Ca exp Ca mod 50 100 150 200 250 Tiempo (h) (c) (Continuación Figura 5.9) 127 Capítulo 5 20000 TPH exp Bio exp 18000 TPH mod Bio mod 16000 1400 14000 1200 12000 800 10000 600 8000 6000 400 4000 200 2000 0 50 100 150 200 3000 2500 8000 2000 6000 1500 4000 1000 2000 500 0 0 0 10000 3500 0 0 250 Tiempo (h) 50 100 150 200 250 Tiempo (h) (d) Figura 5.9. Concentración de TPH y de biomasa en los experimentos con suelo limoso. (a) Bioestimulación, X0. (b) Bioaumento, XC. (c) Bioestimulación + Bioaumento exógeno, X0+XC. (d) Bioestimulación + Bioaumento autóctono, X0+X0e. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. -1 La alta concentración inicial de HC (17.000 mg kg ) no pareció producir un efecto inhibitorio, ni en la microbiota endógena ni en los tratamientos de bioaumento, y después de 11 días más del 90% del HC inicial fue biodegradado en la mayoría de los experimentos para los dos suelos estudiados. Además, en todos los casos se observaron dos etapas de biodegradación: una antes de las 100 h (aprox.) de tratamiento (1), en la que se produjo un rápido consumo del HC, correspondiente con la etapa de crecimiento exponencial y otra después de este tiempo (2), en la que se observó un consumo más lento en todos los experimentos, correspondiente a la fase estacionaria de crecimiento. Estos hechos sugieren la presencia de dos tipos de sustancias biodegradables, posiblemente relacionadas con bajos y altos pesos moleculares, y también la presencia de algunas sustancias recalcitrantes en el diésel, tales como alcanos ramificados y cíclicos (Penet y col., 2004). También se plantea la hipótesis de que se deba a la presencia de una fracción de contaminante no disponible, debida a la falta de accesibilidad por la interacción física con la matriz suelo (Hyun y col., 2008). En cuanto a la evolución de la concentración de biomasa, se observaron resultados diferentes dependiendo de la estrategia de biorremediación utilizada (Figura 5.10): por un lado, la concentración de biomasa final en los tratamientos de bioestimulación (X0) fue menor (alrededor del 66 y el 57%, para el suelo arcilloso y limoso, respectivamente) que los tratamientos con bioaumento en ambos suelos, hecho lógico puesto que la concentración inicial también era menor. Sin embargo, el crecimiento de la biomasa fue 128 C A (mg L -1) 12000 C S , C NAPL (mg kg-1) 1000 Biomasa (mg kg -1) C T (mg kg-1) 16000 14000 4000 Cs exp Cs mod Cnapl mod Cnapl exp Ca exp Ca mod Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio muy similar en todas las estrategias de bioaumento, alrededor de 900 mg por kg de suelo fue detectado en todos los experimentos, siendo el tiempo de adaptación a los 1050 1050 900 900 750 X0 XC X0+XC X0+X0e Control 600 Bi omasa (mg kg -1 ) Bi omasa (mg kg -1 ) microcosmos contaminados diferente en cada caso. 450 300 150 X0 XC X0+XC X0+X0e Control 750 600 450 300 150 0 0 50 100 150 Ti e mpo (h) (a) 200 250 300 0 0 50 100 150 200 250 300 Ti e mpo (h) (b) Figura 5.10. Evolución de la concentración de biomasa durante los experimentos de biorremediación de suelos contaminados en suspensión acuosa. (a) Suelo Arcilloso. (b) Suelo Limoso. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y las líneas indican tendencia. El bioaumento exógeno con el consorcio XC (aclimatado a la metabolización de diésel) necesitó un tiempo de adaptación mayor (Figura 5.10), posiblemente debido a que el consorcio no estaba adaptado a los suelos de estudio. Sin embargo, la combinación de las dos estrategias, bioestimulación y bioaumento (es decir, experimentos X0+XC y X0+X0e) resultó en una adaptación más rápida en ambos suelos, observándose una respuesta un poco más rápida de la opción X0+X0e, ya que además de ser microorganismos autóctonos del suelo en estudio, se aclimataron al consumo de diésel. A pesar de que el consorcio exógeno (opción XC) mostró una etapa de latencia mayor en comparación con el consorcio autóctono, éste alcanzó concentraciones similares que las combinaciones de estrategias al final de los experimentos, no mostrándose inhibición del crecimiento en ninguno de los dos suelos. El suelo arcilloso mostró una peor adaptación del consorcio autóctono que el suelo limoso, mostrando que posiblemente existieron algunas limitaciones o inhibiciones durante el curso del experimento del suelo arcilloso, a pesar de que estas hipótesis no pudieron demostrarse. 129 Capítulo 5 En la Figura 5.11 se muestran los datos de concentración de HC en cada una de las fases, por agrupación en estrategia simple o combinada. En general, se observa que la concentración de diésel en la fase suelo (sin hacer distinción del tipo de suelo) descendió en todo momento, sobre todo en las primeras horas de experimentación. Dicho descenso fue mucho más acusado cuando se utilizó una estrategia combinada de bioestimulación/bioaumento que con una estrategia simple (X0 o XC). 16000 14000 TPH (mg kg-1) 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0h 0 30 h S imple Combinada S UE LO S imple Combinada NA P L 70 h S imple Combinada A CUOSA Figura 5.11. Evolución de la concentración de TPH en las distintas fases de los experimentos de biorremediación de suelos en suspensión acuosa. Los datos son media de las estrategias de ambos suelos. En general, se observa en todos los casos que, en las primeras horas, se produjo la migración de diésel desde la matriz suelo y se observó un aumento de la concentración en la fase NAPL (Figura 5.11). Posteriormente, se observó un descenso de concentración en dicha fase entre las 30 y 70 h a consecuencia de la biodegradación del HC. Este aumento y descenso de la concentración en la fase NAPL, fue más o menos acusado según la estrategia llevada a cabo, pero en cualquier caso verifica una de las hipótesis inicialmente planteadas, es decir, que los microorganismos pueden acceder directamente a la fase líquida no acuosa. Este mismo comportamiento se observó también en la fase acuosa, existiendo una mayor concentración de HC al inicio de la experimentación, que fue disminuyendo a medida que la biodegradación iba sucediéndose en el tiempo, sobre todo en la opción combinada, es decir, usando conjuntamente la estrategia de bioestimulación y bioaumento. 130 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio En la Tabla 5.7 se recoge el porcentaje final de biodegradación alcanzado en cada una de las estrategias y también algunos datos relativos a la velocidad de consumo del HC. A excepción del experimento de bioestimulación del suelo arcilloso (X0) y el de bioaumento simple (XC) del suelo limoso, todas las estrategias alcanzaron valores de eliminación superiores al 95%. En cuanto a las velocidades de consumo máximas, éstas fueron ligeramente superiores en los experimentos con estrategias combinadas. Tabla 5.7. Resumen de datos relevantes de los experimentos de biorremediación de suelos en suspensión acuosa. Suelo Arcilloso Limoso Porcentaje de eliminación de diésel (%) Velocidad de consumo máxima (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Velocidad de consumo media (mgTPH kg suelo-1 h-1) X0 73,54 ± 5,15 398,80 ± 25,36 140,69 ± 9,77 Estrategia XC 96,08 ± 0,72 233,27 ± 14,77 140,58 ± 12,68 X0+XC 95,88 ± 1,43 614,38 ± 28,68 241,14 ± 9,67 X0+X0e 96,42 ± 2,03 306,98 ± 19,10 144,99 ± 6,24 X0 95,75 ± 0,73 279,61 ± 13,04 143,70 ± 5,39 XC 90,59 ± 2,03 X0+XC 98,12 ± 0,73 153,02 ± 32,09 264,79 ± 42,22 111,11 ± 11,41 171,47 ± 12,82 X0+X0e 95,97 ± 0,33 306,98 ± 24,41 145,76 ± 6,99 Como estudio de la significancia de los resultados obtenidos en este capítulo, se realizó un test ANOVA. Los resultados (Tabla 5.8) revelaron que con un nivel de significancia de p<0,05, se podía afirmar que para el suelo arcilloso, cualquiera de las estrategias combinadas resultaban beneficiosas con respecto a la bioestimulación. Sin embargo, para el suelo limoso no resultaron significativos y, por tanto, no estarían justificadas frente a un proceso de bioestimulación (X 0), aunque sí frente a un bioaumento exógeno simple. Tabla 5.8. Resultados del test ANOVA para el estudio de la significancia de estrategias en los experimentos de biorremediación de suelos en suspensión acuosa. Suelo Arcilloso Limoso Estrategia X0 XC X0+XC XC 0,191 - - X0+XC X0+X0e 0,001*** 0,002** 0,084 0,052 0,200 XC X0+XC 0,021* 0,158 0,037* - X0+X0e 0,069 0,024* 0,071 Nota: *, significación estadística al nivel de 0,05; **, nivel de 0,01; ***, nivel de 0,001. 131 Capítulo 5 5.4.2.1. Validación del modelo y estimación de parámetros A fin de predecir el proceso de biorremediación ocurrido en los experimentos de suelos en suspensión acuosa, los datos obtenidos en los ocho experimentos de bioestimulación y bioaumento (Tabla 5.1) y mostrados en las Figuras 5.8 y 5.9, se ajustaron a las ecuaciones [5.8]-[5.11], teniendo en cuenta las distintas hipótesis planteadas inicialmente (A, B, C y D) en el apartado 5.3.4 de este capítulo. En la Tabla 5.9 se recoge un resumen del coeficiente de correlación de Pearson utilizado para medir el ajuste entre todos los datos experimentales y los obtenidos por el modelo teniendo en cuenta todas las fases del sistema. Para todos los experimentos, el mejor ajuste se observó con la opción 6, es decir, la opción que consideraba ciertas todas las posibles hipótesis planteadas en este capítulo, que se recuerdan a continuación: existen varios grupos de microorganismos especializados en metabolizar diésel en cada una de las fases del sistema; la velocidad de degradación y la afinidad por el HC, impuestas por los coeficientes μmax y Ks, son distintas dependiendo de la fase en la que se encuentre el HC; y el rendimiento con el que se realizará la conversión del HC en biomasa (Y X/S) depende también de la disposición del mismo en el sistema, así como, del tipo de biomasa que lo degrada. Tabla 5.9. Coeficiente de correlación de Pearson para las distintas hipótesis planteadas. Suelo ARCILLOSO LIMOSO Estrategia Opción 1 2 3 4 5 6 X0 XC 0,9234 0,9589 0,9793 0,9566 0,9787 0,9596 0,9797 0,9603 0,9787 0,9601 0,9799 0,9617 X0+XC 0,9688 0,9705 0,9753 0,9757 0,9757 0,9785 X0+X0e 0,9665 0,9697 0,9816 0,9848 0,9831 0,9856 X0 0,9569 0,9702 0,9629 0,9715 0,9669 0,9719 XC 0,9544 0,9565 0,9545 0,9592 0,9546 0,9603 X0+XC X0+X0e 0,9802 0,9923 0,9850 0,9882 0,9827 0,9954 0,9858 0,9971 0,9843 0,9967 0,9866 0,9973 Existe un alto grado de error si sólo se analiza el valor más alto del coeficiente de correlación de Pearson puesto que el modelo ajustado con la opción 6 (hipótesis A, B, C y D) presenta nueve parámetros por fijar, hecho que aumenta los grados de libertad del modelo planteado. Por este motivo, y viendo que el modelo no es altamente sensible con las hipótesis planteadas, se concluye que el modelo planteado bajo la opción 1 es más robusto puesto que se disminuyen los grados de libertad. Además, se ajustó con unos coeficientes de correlación de Pearson superiores a 0,95 en la mayoría de los casos, lo que indica que el modelo planteado podría predecir de manera apropiada la 132 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio biorremediación del suelo bajo estas condiciones de operación sin necesidad de aumentar el número de parámetros a calcular, y además los parámetros obtenidos son coherentes. La Tabla 5.10 muestra los parámetros estimados en la modelización de los datos experimentales mediante el modelo bajo la opción 1. Por un lado, para el suelo arcilloso, los mayores valores de µmax se obtuvieron para las estrategias combinadas de bioestimulación y bioaumento (X0+XC y X0+X0e); sin embargo, para el suelo limoso, el mayor valor se obtuvo para el experimento de bioestimulación (X0). La peor estrategia desde este punto de vista fue el bioaumento exógeno simple (XC) para los dos suelos. Por otro lado, se obtuvieron valores muy similares en ambos suelos para la constante de -1 semi-saturación, que osciló entre 4.162-9.300 mg kgsuelo para el suelo arcilloso y 3.758-1 9.070 mg kgsuelo en el caso del suelo limoso. Con respecto a los rendimientos (YX/S) estimados, todos estuvieron dentro del mismo orden de magnitud, siendo relativamente superiores para el caso del suelo limoso. Tabla 5.10. Parámetros estimados del modelo de biorremediación. µmax KS YX/S Suelo Estrategia (h-1) (mg kgsuelo-1) (mgCélulas mgTPH-1) 0,0096 X0 4.162,4 0,011 0.0 XC 0,0031 5.898,5 0,010 Arcilloso X0+XC 0,0114 5.678,0 0,013 0,0146 X0+X0e 9.300,0 0,031 0 X 0,0183 8.541,4 0,018 0 Limoso XC X0+XC X0+X0e 0,0084 0,0111 0,0110 9.070,5 0,032 3.758,4 6.950,6 0,031 0,020 5.4.2.2. Influencia del tipo de suelo Aunque el tamaño de partícula de una arcilla, por definición (Nemes y Rawls, 2004), es menor que el de un limo y, en consecuencia, la capacidad de retención de los contaminantes se espera que sea superior, se ha observado por el contrario que la capacidad de retención en el suelo limoso fue un 34% superior al de la arcilla. Hay que tener en cuenta que la movilidad de los contaminantes en el suelo también se ve afectada por la adsorción de las sustancias contaminantes en la materia orgánica presente en el suelo (Pignatello, 1998). En la Tabla 3.1 de caracterización del suelo (capítulo de Materiales y procedimientos comunes) se observó que el suelo limoso, SE, tenía el doble de contenido en materia orgánica que el suelo arcilloso, SD, por lo que era de esperar que tuviera una capacidad de retención más alta. Por otro lado, la mayoría de 133 Capítulo 5 los minerales de arcilla son hidrofílicos (Tschapek, 1984), tienen grandes áreas de superficie específica y una gran carga negativa, siendo capaces de formar enlaces con iones de carga positiva. Así, algunos tipos de arcilla tienen una capacidad de intercambio catiónico muy alta y, además, pueden ser fácilmente hidratadas bajo ciertas condiciones debido a que las moléculas de agua tienen un diámetro superior a los cationes que forman parte de la partícula (Boulding y Ginn, 2003). Por este motivo, a causa de la hidratación de las moléculas de arcilla, el diésel podría ser desplazado y quedar más disponible en el suelo SD. Por otra parte, en Warr y col. (2009) se menciona que una propiedad adicional de algunos minerales de la arcilla es su capacidad para aumentar la tasa de crecimiento de las bacterias y aumentar la degradación de compuestos de HC (Stotzky y Rem, 1966; van Loosdrecht y col., 1990; Chaerun y Tazaki, 2005). Se ha sugerido que la capacidad de amortiguación de las esmectitas y su capacidad para adsorber protones liberados durante la descomposición de HC juegan un papel importante en el mantenimiento de unas condiciones óptimas de pH y, por tanto, sostienen el crecimiento bacteriano (Stotzky y Rem, 1966). También se ha demostrado que algunas caolinitas aumentan la tasa de degradación del aceite por la digestión bacteriana (Chaerun y Tazaki, 2005). En este caso, la formación de enlaces complejos de C-O-Na-Si en las superficies de las paredes celulares bacterianas, asociadas con la disolución de partículas, sugiere una ayuda para la adsorción de nutrientes por la célula y, por lo tanto, estimulan la actividad bacteriana. Aunque hay acuerdo general en que las superficies minerales proporcionan condiciones favorables para la actividad de las bacterias, en muchos casos, los mecanismos precisos por los cuales esto se logra siguen siendo un enigma y las observaciones experimentales no siempre se consideran consistentes (van Loosdrecht y col., 1990). En el presente trabajo, aunque no se ha estudiado qué tipo de arcillas son las que forman parte del suelo, se ha observado (Tabla 3.1) una composición de naturaleza más mineral en el suelo SD y que, por tanto, estas interacciones podrían estar ocurriendo igualmente. Así, se ha comprobado por las tasas de desorción de los suelos en los controles abióticos (Figura 5.6) que sólo el 19% de diésel había sido desorbido del suelo limoso en las primeras 48 h comparado con el 55% del arcilloso. En consecuencia con estas razones, y tal y como se observó en la Figura 5.6, a las 48 h de tratamiento la disponibilidad de diésel en los experimentos del suelo limoso fue limitada en comparación con los del arcilloso, y también la eliminación de diésel fue menor a este mismo tiempo (alrededor del 28% menos en promedio en todos los experimentos, Figura 5.12a). Sin embargo, la disponibilidad de diésel aumentaría con el tiempo por la presencia de bacterias (Park y col., 2001) y la eficiencia en la eliminación se igualaría al 134 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio final de los experimentos (Figura 5.12b), observándose una eliminación final alrededor 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TPH biodegradado (%) TPH biodegradado (%) del 90% de diésel en la mayoría de las estrategias. X0 XC X0+XC Suelo Arcilloso X0+X0e Suelo Limoso (a) Control X0 XC X0+XC Suelo Arcilloso X0+X0e Control Suelo Limoso (b) Figura 5.12. Porcentaje de eliminación de diésel en los experimentos de biorremediación de suelos en suspensión acuosa. (a) Después de 48 h de tratamiento. (b) Después de 11 días de tratamiento. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Atendiendo al análisis físico-químico de los suelos, el pH medido en ambos casos mostró niveles ligeramente alcalinos; se detectaron concentraciones normales de metales, no superando los valores normales de concentración en que una determinada sustancia se encuentra de forma natural en el suelo y, además, en los dos suelos se determinó una población adecuada de microorganismos heterótrofos (más de 10 6 microorganismos cultivables por gramo de suelo), por lo que no se observó evidencia de que la biomasa endógena de ambos suelos sufriera algún tipo de inhibición inicial. Aunque los suelos no presentaban contaminación inicial por HC, la caracterización reveló la presencia de microorganismos endógenos HiC: cerca del 2% de la concentración total de las bacterias aisladas del suelo limoso fueron capaces de metabolizar diésel y 0,03% en el caso del suelo arcilloso. El porcentaje de microorganismos HiC en el suelo limoso podría ser un índice sensible de exposición ambiental a contaminación por HC según Youssef y col. (2010), aunque éste no era el caso pues el análisis de TPH fue negativo (Tabla 3.1 de Materiales y procedimientos comunes). En el suelo arcilloso el porcentaje de microorganismos HiC fue relativamente bajo, demostrándose que éste no había estado expuesto a este tipo de contaminantes. Boochan y col. (2000) indicaron que una concentración de biomasa de 6 aproximadamente 10 células por g de suelo sería suficiente inóculo para asegurar el éxito de un tratamiento de biorremediación de suelos contaminados con HC mediante 135 Capítulo 5 bioestimulación, niveles que existían en ambos suelos en este trabajo. Por ello, existían buenas perspectivas, a pesar de no haber estado expuestos a contaminación inicialmente. El único requisito sería adoptar una estrategia de trabajo adecuada, tal y como indicaron El Fantroussi y Agathos (2005). 5.4.2.3. Elección de la estrategia de biorremediación La Figura 5.10 muestra que la concentración de biomasa en todos los experimentos aumentó con el tiempo, por lo que, a priori, se podría afirmar que los consorcios utilizados en este trabajo se adaptaron bien a los microcosmos. Por el contrario, Bento y col. (2005) observaron que, después de la primera semana, el número de microorganismos degradadores de HC disminuía con el tiempo. En términos generales, en los experimentos que aquí se presentan, una mayor concentración de biomasa produjo un aumento en la eliminación de diésel y, en principio, la adición de un consorcio exógeno no inhibió o impidió la capacidad de degradación de los microorganismos autóctonos, como fue señalado por Moller y col. (1995) en su estudio. Además, en contradicción con Ueno y col. (2007), estos resultados sugieren que, en principio, las bacterias exógenas no entraron en competencia con las bacterias autóctonas presentes en los suelos. En las primeras 48 h, más del 60% de diésel fue eliminado en todos los experimentos del suelo arcilloso, y además el proceso de biorremediación fue más rápido que en el suelo limoso, en el que aproximadamente un 28% menos de diésel fue eliminado (Figura 5.12a), probablemente debido a las limitaciones de disponibilidad del contaminante ya discutidas. En este mismo tiempo de experimentación, los consorcios autóctonos (citados como X0), cuya concentración de biomasa era claramente inferior que en el resto de experimentos (XC, XC+X0 y X0+X0e), fueron más eficientes en ambos suelos, es decir, existía una concentración de biomasa menor, pero parecía ser más eficiente en cuanto a velocidad específica de consumo de diésel (Figura 5.13). En un trabajo anterior, Ueno y col. (2006) observaron, durante los primeros días de tratamiento, una velocidad más alta de degradación de diésel con una cepa exógena. En el presente estudio, el uso individual del consorcio exógeno (sólo XC) fue la peor opción en las primeras horas, posiblemente porque fue necesario un tiempo de aclimatación más prolongado. 136 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 X0 X0+XC 0 50 100 150 XC X0+X0e 200 1,3 Ve locidad específica de consumo de d i ésel (gdiesel gBiomasa-1 h-1 ) Ve locidad específica de sonsumo de d i ésel (gdiésel gbiomasa-1 h-1 ) Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio X0 X0+XC 1,2 1,1 XC X0+X0e 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 250 0 50 T i empo (h) 100 150 200 250 T i empo (h) (a) (b) Figura 5.13. Velocidad específica de consumo de diésel. (a) Suelo arcilloso. (b) Suelo limoso. Al final de 11 días de tratamiento se observaron porcentajes altos de eliminación de diésel en todos los experimentos. Por un lado, las mayores eficiencias de eliminación y velocidades máximas se observaron con una combinación de estrategias de bioestimulación y bioaumento en ambos suelos (Tabla 5.7). En el suelo limoso, la mayor eficiencia se observó con el bioaumento autóctono (X0+X0e), como Ueno y col. (2007) propusieron; mientras que en el suelo arcilloso fue mayor la opción exógena (X0+XC). Además, en este último caso, la estrategia X0+XC del suelo arcilloso obtuvo la mayor -1 -1 velocidad de consumo máxima (614,4 mg kg h ) de todos los experimentos. Por otro lado, los microorganismos autóctonos (experimento X0) de la tierra arcillosa no resultaron tan eficientes como los del suelo limoso (73% de degradación de diésel en comparación con 96%); este hecho podría explicarse probablemente debido a la menor concentración de microorganismos HiC. Resumiendo y atendiendo a la velocidad máxima de consumo de diésel, a la concentración residual de TPH en los microcosmos y al estudio de significancia llevado a cabo, se puede concluir que la opción más eficiente para biorremediar el suelo arcilloso sería la estrategia combinada de bioaumento exógeno (X0+XC); a pesar del hecho de que los microorganismos autóctonos en el suelo arcilloso fueron muy eficaces en las primeras horas, al final no se alcanzó más del 73% en la eliminación de diésel. Por otro lado, un tratamiento de bioestimulación, que promueva el crecimiento de microorganismos autóctonos degradadores de HC, sería suficiente para biorremediar el suelo limoso y también sería la opción más barata; el tratamiento de bioaumento (X0+X0e) no estaría justificado puesto que no aumentó significativamente el porcentaje final de la biorremediación en este suelo y además, la velocidad máxima de consumo de 137 Capítulo 5 diésel a través de la estrategia de bioestimulación fue muy similar a los obtenidos a través del bioaumento (Tabla 5.7). Estas conclusiones se derivan del análisis de las características del suelo, la eficacia de los consorcios en la eliminación de diésel y la capacidad de los consorcios para adaptarse a los microcosmos contaminados. Sin embargo, en la actualidad existe demasiada controversia en la literatura acerca de los beneficios de las estrategias de bioaumento, tanto autóctono como exógeno (Hosokawa y col., 2009; Silva y col., 2009; Mrozik y Piotrowska-Seget, 2010) e incluso algunos resultados indican que el bioaumento no siempre es la mejor opción para la descontaminación de suelos. Sin embargo, este estudio muestra que el éxito del bioaumento podría ser posible, aunque continua siendo un proceso poco conocido que depende claramente de la biodisponibilidad del contaminante: cuando el contaminante es de fácil acceso, el bioaumento podría ser exitoso, mientras que cuando la disponibilidad es limitada, como en el caso del suelo limoso, una estrategia de bioestimulación a través de la promoción de consorcios autóctonos podría ser más eficiente. 5.4.3. Optimización del grado de humedad En este apartado se estudia la influencia de la humedad en la biorremediación del suelo arcilloso, concluyéndose que el nivel de saturación de agua del medio contaminado, como variable de estudio, afectó considerablemente la tasa de biodegradación del contaminante (Figura 5.14). 18000 6,34% 18,71% 33,47% Saturado 16000 T PH (mg kg- 1) 14000 11,03% 26,80% 40,26% 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 100 200 300 400 500 Tiempo (h) Figura 5.14. Evolución de la concentración de TPH en los experimentos de biorremediación del suelo arcilloso con distintas humedades. 138 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio Tras un tiempo de 3 semanas, el mayor descenso de HC se observó para el mayor contenido de agua, confirmándose las ventajas de llevar a cabo este proceso en su estado de saturación, es decir, en las condiciones más ideales posibles. El descenso más pequeño de diésel fue observado para una humedad del 6,34%, la menor de las experimentadas. Se deduce, por tanto, que el grado de humedad en el sistema fue un factor decisivo en el rendimiento del proceso. Si bien es cierto que la presencia de más agua en el medio contaminado mejoró la biodegradación del HC, existe un rango de humedades que no cumplió estrictamente esta tendencia. El incremento de humedad del 11 al 18% mejoró con cierta relevancia la biodegradación desde el 65 al 75%, apareciendo un valor óptimo parcial (Figura 5.15) pero, posteriormente, no se observó una tendencia ascendente de biodegradación a mayor presencia de agua. Así, para el rango comprendido entre el 26 y el 40% de humedad se observó un ligero descenso en la biodegradación. Esta disminución podría explicarse porque, a partir de un determinado contenido de humedad intermedio, el suelo se encuentra muy compactado, ocurriendo aglomeración de las partículas de arcilla. En esta situación, el contaminante queda retenido en los poros y se dificulta su biodisponibilidad. A esto hay que añadir la complicada difusión de oxígeno a través de esa masa compactada (Leeson y Hinchee, 1997), lo que limita su biodisponibilidad y reduce, de forma muy significativa, la actividad biodegradativa (Young-Gyun y col., 2000). 100 Óptimo 1 90 Óptimo 2 Degradación (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,34 11,03 18,71 26,80 33,47 40,26 Saturado Humedad (%) Figura 5.15. Elección de óptimos de humedad para llevar a cabo un proceso de biorremediación. 139 Capítulo 5 En la Figura 5.15 se aprecian dos óptimos de humedad; el mejor de ellos corresponde al estado de saturación (óptimo 1) con un porcentaje de eliminación de diésel del 87% con respecto a la concentración inicial, y un óptimo parcial 2 correspondiente a una humedad aproximada del 20% (aproximadamente tres veces menor que la capacidad de campo) con una eliminación del 75% del HC inicial. La diferencia entre ambos valores de humedad es importante (un 34,6%) para un incremento de degradación obtenido tan sólo del 12%, por lo que cabría preguntarse si merecería la pena ese mayor gasto de agua para una mejoría relativamente pequeña en la eliminación del contaminante. En conclusión, el ajuste del contenido de humedad es necesario para una exitosa y rentable descontaminación del suelo, ya que, para cierto intervalo intermedio de humedad, la adición de más cantidad de agua es contraproducente para la eliminación del HC y este hecho es muy importante a tener en cuenta en la operación de procesos de biorremediación a gran escala. Por tanto, estos resultados sirven para rechazar un intervalo de humedad del suelo en el que los experimentos a gran escala no se deberían llevar a cabo con este tipo de suelo. 5.4.4. Optimización de la concentración de inóculo En este apartado se estudia la influencia de la concentración de inóculo en el proceso de biorremediación del suelo arcilloso contaminado con diésel en suspensión acuosa. Nuevamente, se observaron algunas diferencias al utilizar el consorcio XC y el XD como inóculos para bioaumento. Cuanto menor fue la concentración de inóculo utilizada con el consorcio XC, consorcio exógeno para el suelo arcilloso, mayor fue el rendimiento observado en la biodegradación de diésel (Figura 5.16a). Este hecho podría estar relacionado con la competencia que surge entre el propio consorcio presente en el suelo, el endógeno, y el enriquecido exógeno (Philp y Atlas, 2005), y, por ese motivo, al aumentar la concentración de exógenos en el medio contaminado, el rendimiento resultó peor. Al observar la experiencia con el consorcio XD (X0e del propio suelo después de haber sido enriquecido), se observó que para una concentración de inóculo mayor, se producía un beneficio también mayor en la biorremediación (Figura 5.16b), obteniéndose mayores rendimientos y de forma más rápida. Sin embargo, la diferencia observada en la descontaminación del suelo con este consorcio (X D) en una concentración 1:1,35 (v/v) y -1 1:0,68 (v/v) de inóculo, fue menor de 600 mgTPH kgsuelo . Este intervalo se considera muy pequeño, por lo que no se vería justificado el incremento de la concentración de inóculo a partir de un cierto valor. 140 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio 70000 60000 50000 40000 30000 20000 1:1,35 (v/v) 1:0,68 (v/v) 1:0,33 (v/v) 60000 TP H (mg kg -1) TP H (mg kg -1) 70000 1:1,35 (v/v) 1:0,68 (v/v) 1:0,33 (v/v) 50000 40000 30000 20000 10000 10000 0 0 0 100 200 300 400 500 0 100 200 (a) 300 400 500 Tiempo (h) Tiempo (h) (b) Figura 5.16. Evolución de la concentración de TPH en los experimentos de biorremediación con distintas concentraciones de inóculo. (a) Consorcio XC. (b) Consorcio XD. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y las líneas indican tendencia. Se puede concluir que, con una relación 1:0,68 (v/v) de inóculo, sería suficiente para obtener unos buenos resultados finales con el consorcio endógeno enriquecido X D y, una relación más pequeña de 1:0,33, sería más ventajosa cuando se utilice el consorcio exógeno enriquecido, XC en este caso. En la Tabla 5.11 se recoge un resumen del porcentaje final de biodegradación alcanzado para cada una de las concentraciones de inóculo experimentadas y también algunos datos relativos a la velocidad de consumo de diésel. Un hecho relevante en estos experimentos es la elevada concentración de HC adicionada inicialmente, la cual es casi cuatro veces superior a la concentración utilizada en los experimentos en apartados anteriores. Respecto a este hecho, se ha observado que el diésel ha sido igualmente metabolizado por los microorganismos, alcanzándose rendimientos de más del 70% en la mayoría de los casos, con la excepción del experimento en el que se utilizó el consorcio exógeno XC en su mayor proporción. Por ello, se deduce que los consorcios utilizados no sufren inhibición aparente por la alta concentración de sustrato en el suelo; sin embargo, es de especial atención, la elevada concentración residual en el medio contaminado. En cuanto a las velocidades de consumo, los mejores resultados se obtienen para la menor concentración en el caso del consorcio XC y la intermedia para el XD (aunque en este último caso, la velocidad es prácticamente la misma para las tres concentraciones). Por media, las mayores velocidades máximas de consumo de HC diésel (alrededor de 2.040 mgTPH kgsuelo -1 -1 h ) se obtienen para el caso en el que se utiliza el consorcio endógeno enriquecido, XD. Por otro lado, cabe destacar unas velocidades máximas muy 141 Capítulo 5 elevadas en todos los experimentos, siendo incluso de distinto orden de magnitud que los hallados en los experimentos de microcosmos discutidos anteriormente en este capítulo. En bibliografía tampoco no se han encontrado velocidades tan elevadas (Yang y col., 2000; Davis y col., 2003), pudiéndose concluir que quizá, en este caso al existir mayor cantidad de diésel disponible, las velocidades podrían verse alteradas debido a la volatilización de ciertos HC. Sin embargo, este efecto no ha sido comprobado. Tabla 5.11. Resumen de datos relevantes para la optimización de la concentración de inóculo. Consorcio XC XD Concentración de inóculo (%) Porcentaje de eliminación de diésel (%) Velocidad de consumo máxima (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Velocidad de consumo media (mgTPH kg suelo-1 h-1) 1,35 53,07 ± 3,64 1722,60 ± 119,81 548,52 ± 62,11 0,68 75,06 ± 2,41 1319,48 ± 271,79 470,76 ± 66,27 0,33 88,64 ± 3,03 2025,12 ± 120,00 580,95 ± 64,19 1,35 89,23 ± 2,72 2021,41 ± 120,09 676,65 ± 65,23 0,68 88,22 ± 5,01 2044,96 ± 266,46 742,34 ± 66,13 0,33 72,08 ± 4,33 2042,62 ± 247,82 644,85 ± 64,12 Como conclusión de este apartado se puede decir que los mejores resultados cabe esperarlos con el consorcio endógeno del propio suelo (XD) utilizándolo para bioaumento. Por este motivo, se escoge la estrategia de bioaumento endógeno para realizar los siguientes experimentos a una escala mayor. 142 Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio 5.5. CONCLUSIONES Las principales conclusiones que se derivan del estudio de biorremediación de suelos en microcosmos son las siguientes: 1. Los sistemas en microcosmos diseñados para la biorremediación de los dos suelos contaminados con 17.000 mg kg -1 de diésel permiten obtener altos porcentajes de biorremediación. Más del 90% de la concentración inicial de TPH es eliminado en la mayoría de los experimentos en tan sólo 11 días de tratamiento. 2. Los experimentos abióticos realizados con ambos suelos revelan las dificultades de biodisponibilidad existentes en el suelo de tipo limoso debido, principalmente, al contenido en materia orgánica y su capacidad de retención del contaminante. 3. La estrategia más eficiente para biorremediar el suelo arcilloso es una combinación de la técnica de bioestimulación y bioaumento exógeno (X 0+XC), la cual obtiene un porcentaje de eliminación superior al 95% y la mayor velocidad de consumo de HC. Por otro lado, el estudio de significancia revela que un tratamiento de bioestimulación es la opción más óptima para biorremediar el suelo limoso. 4. El proceso más importante que determina la estrategia a seguir, es la biodisponibilidad, pudiendo concluirse que, cuando el contaminante es de fácil acceso, el bioaumento podría resultar exitoso, mientras que cuando la disponibilidad es limitada, como en el caso del suelo limoso, una estrategia de bioestimulación a través de la promoción de consorcios autóctonos podría ser más eficiente. 5. El modelo matemático propuesto, así como las hipótesis planteadas para su desarrollo, son verificadas con los altos coeficientes de correlación de Pearson hallados entre los datos experimentales y los propuestos por el modelo; además, los parámetros cinéticos calculados por el modelo, contrastados en bibliografía, resultan coherentes y de gran interés. 6. La cantidad de agua presente en el suelo influye de manera importante en el rendimiento de la biodegradación de diésel. Se detecta un rango intermedio de humedades para el que se sucede la compactación del suelo, limitándose la biodisponibilidad del contaminante, y se disminuye, por tanto, la efectividad del tratamiento. 7. La obtención de un intervalo de humedad óptimo es necesario para una exitosa y rentable descontaminación del suelo a gran escala. 143 Capítulo 5 8. El uso de un consorcio exógeno enriquecido (XC) presenta mayor eficiencia en el suelo arcilloso (SD) cuanto menor concentración de inóculo es experimentado en la estrategia de bioaumento. Este hecho podría estar relacionado con la competencia que surge entre el propio consorcio presente en el suelo y el enriquecido exógeno. Sin embargo, la experiencia sobre el mismo suelo con el consorcio XD, consorcio endógeno enriquecido, revela lo contrario, una mayor concentración de inóculo podría producir un mayor beneficio en biorremediación, obteniéndose mayores rendimientos y de forma más rápida. 144 la Biorremediación de suelos contaminados con diésel en laboratorio 5.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agarry, S., Latinwo, G. K. (2015). Biodegradation of diesel oil in soil and its enhancement by application of bioventing and amendment with brewery waste effluents as biostimulation-bioaugmentation agents. Ecol. Eng. 16: 82–91. Alshafie, M., Ghoshal, S. (2003). Naphthalene biodegradation from non-aqueousphase liquids in batch and column systems: comparison of biokinetic rate coefficient. Biotechnol. Prog. 19:844-852. ASTM E 1755-01. (1991). Standard Test Method for Ash in Biomass. ASTM International, West Conshohocken, Pennsylvania, USA. Atlas, R., Bartha, R. (1998). 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Se evalúa el efecto de las diferentes variables con el objetivo de llevar a cabo el escalado de la tecnología de biorremediación de la manera más satisfactoria. 150 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 6.1. INTRODUCCIÓN Las técnicas de biorremediación más desarrolladas a gran escala son aquellas que se realizan ex situ, es decir, en las que previamente el suelo ha sido excavado y luego tratado. Entre estas técnicas, las más destacadas para utilizar la estrategia de bioaumento son (Jørgensen y col., 2000): tratamiento en biorreactores slurry, donde se añade una importante cantidad de agua para disponer el suelo en una suspensión acuosa y así favorecer el mezclado físico; formación de biopilas, es decir, acumulación del suelo a tratar en montones o hileras; tratamiento en tambor giratorio cerrado; landfarming, que incluye los procesos de labranza del suelo a partir de prácticas agrícolas comunes; tratamiento en camas o lechos, que consiste en añadir nutrientes a un lecho de suelo contaminado (menor de 1 m de altura) y aplicar una agitación con un dispositivo de mezcla de forma continua o a intervalos. El tratamiento mediante la formación de biopilas ha sido el más estudiado tanto a escala planta piloto como a escala real (Samson y col., 1994; Puustinen y col., 1995; Filauro y col., 1998; Koning y col., 1998; Sanscartier y col., 2009; Baldan y col., 2015). Entre las prácticas que más comúnmente se realizan están la adición de nutrientes, que sirven de bioestimulación a la microbiota del suelo a tratar, y la aireación, para aumentar la concentración de oxígeno en su interior. Por lo general, las biopilas suelen tener una altura de entre 2 y 4 m y pueden ser estáticas, normalmente con una tubería de aireación instalada en su interior, o pueden ser agitadas a intervalos de tiempo con dispositivos mecánicos especiales para este propósito. Además, el suelo tratado mediante las biopilas suele ser mezclado con distintos residuos orgánicos, fácilmente biodegradables o ya compostados, aumentando su porosidad y sirviendo de bioestimulación del proceso de biorremediación. Esta última opción presenta algunas ventajas respecto del resto de estrategias (USEPA 540-S-96-502, 1996; Anastasi y col., 2009; Sayara y col., 2010; Lin y col., 2012). Otra opción muy utilizada en el tratamiento de suelos contaminados, como se ha dicho, y que responde a un mayor grado tecnológico, es el tratamiento en biorreactores slurry. En estas instalaciones, el suelo contaminado se encuentra suspendido en agua y en continua agitación, lo que permite un mayor control de las variables de operación. El uso de equipamiento industrial es más complejo pero por lo general los tratamientos son más eficaces. Por este motivo, son muy utilizados para eliminar contaminantes problemáticos y recalcitrantes o residuos muy concentrados (Bhandari y col., 1996; Robles-González y col., 2008). 151 Capítulo 6 Uno de los factores más importantes, y que es necesario considerar al elegir el método de biorremediación más apropiado en un proceso de descontaminación real, es el coste económico. Forsyth y col. (1995) afirmaron que la estrategia de bioaumento se debe aplicar sólo en aquellos casos en los que se observen concentraciones muy bajas de microorganismos autóctonos degradadores del contaminante, y para los emplazamientos pequeños en los que los costes de las técnicas no biológicas sean superiores a los costes de un proceso de bioaumento. A priori, el método de bioestimulación parece ser más simple y más económico, pero el elevado tiempo necesario de tratamiento puede ser en este caso el factor decisivo, ya que si una comunidad microbiana especializada no está presente, éste se prolongará mucho (de Jesús y col., 2015). El bioaumento puede acortar el tiempo de tratamiento, pero también aumentar de forma importante los costes finales de operación. Encontrar el óptimo en la relación eficiencia-coste es la tarea más importante a la que se enfrentan los técnicos. Para corregir verdaderamente el daño medioambiental que se ha causado al suelo, también es necesario tener en cuenta las condiciones finales en las que éste queda tras el proceso de biorremediación. En algunos casos, el proceso de biodegradación de los HC podría causar un incremento de toxicidad en el suelo en lugar de disminuirlo, lo cual tiene que ser considerado (Philips y col., 2000). Por este motivo, para completar el estudio de las diferentes estrategias utilizadas en la biorremediación del suelo, se debe valorar la calidad final del mismo tras su tratamiento. Entre los métodos más comunes se incluyen varios test de toxicidad: germinación de semillas, crecimiento de plantas, lombrices, microorganismos, elongación de raíz, Toxscreen, nematodos y moluscos terrestres (van Straalen y van Gestel, 1993; Kapustka y Reporter, 1993; Jennings y col., 1996; Salanitro y col., 1997; Marwood y col., 1998). La elección de cualquiera de ellos vendrá dada, principalmente, por el análisis de riesgo que se quiera realizar. 6.2. OBJETIVO El objetivo que se persigue en este capítulo es estudiar el cambio de escala del proceso de biorremediación, desde laboratorio a planta piloto, atendiendo al efecto de tres variables: 1. Efecto de la estrategia de biorremediación utilizada (Bioaumento o bioestimulación en sus diferentes modalidades). 2. Efecto de humedad del suelo. 152 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 3. Efecto del procedimiento de agitación/aireación utilizado durante el proceso de descontaminación. Finalmente, se pretende evaluar las propiedades del suelo tras los diferentes tratamientos de biorremediación a través de un ensayo fitotóxico sencillo. 6.3. PROCEDIMIENTOS 6.3.1. Preparación del suelo En todos los experimentos realizados a escala planta piloto se utilizó el suelo S D, previamente secado a temperatura ambiente y tamizado a través de un tamiz de 2 mm de diámetro de luz de paso. El suelo fue contaminado con diésel un día antes de empezar cada uno de los experimentos y éste se adicionó de la manera más -1 homogénea posible hasta alcanzar una concentración de 13.867 mg kg . Los tratamientos se realizaron por duplicado y se partió como hipótesis de que el suelo en todos los casos tenía las mismas condiciones iniciales. 6.3.2. Instalaciones experimentales a. Tratamiento estático La instalación experimental utilizada para realizar los experimentos con el suelo en modo estático estaba formada, principalmente, por cuatro cubetos de plástico de 40 L de capacidad cada uno y un sistema de aireación continuo, dotado con 4 compresores de diafragma pequeños tipo acuario (Clearseal Air Pump AC-9903 de 6 W de consumo y un -1 caudal de aire de 4,5 L min ), un humidificador, cuatro rotámetros, cuatro válvulas y cuatro mangueras de goma perforadas que serían enterradas en los suelos (Figura 6.1). El sistema de aireación continuo fue instalado con la finalidad de aportar una correcta concentración de oxígeno al sistema y favorecer así la degradación del HC. Además, el aire suministrado era humedecido en un frasco lavador antes de ponerse en contacto con la tierra, evitando así una disminución de la humedad debido a un fenómeno de secado. 153 Capítulo 6 Válvula Rotámetro Humidificador Suelo Aire Cubeto Compresor (a) (b) Figura 6.1. Instalación experimental para tratamiento estático en cubetos. (a) Esquema de la instalación. (b) Vista de la instalación. b. Tratamiento dinámico El tratamiento en modo dinámico se realizó a través de unas hormigoneras giratorias abiertas, en adelante biorreactores, en los que el suelo estaba continuamente mezclándose. Esta instalación consistió en dos hormigoneras (Guy Noel de 690 W de consumo) convencionales de obra civil para la mezcla de cemento, provistas de unas palas mezcladoras que permitían una mejor homogeneización del sistema. La agitación que se conseguía con ellas era del tipo rotacional, con una velocidad de giro de 28 rpm. Palas mezcladoras (a) (b) Figura 6.2. Instalación experimental para tratamiento dinámico en biorreactores. (a) Esquema de la instalación. (b) Vista de la instalación. 154 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 6.3.3. Descripción de las estrategias utilizadas a. Atenuación Natural Los experimentos realizados bajo la estrategia de atenuación natural consistieron en disponer 15 kg de suelo contaminado para tratamiento en modo estático en cubetos. En estos experimentos no se realizó ningún tipo de adición de nutrientes o de agua, y tampoco estuvieron expuestos a agitación o aireación, de tal forma que se pretendía reproducir las mismas condiciones experimentales en las que se encontraba inicialmente el suelo, sin favorecer la biodegradación del HC. Por este motivo, esta estrategia no fue llevada a cabo en los biorreactores giratorios, ya que simplemente la agitación que en ellos se realizaba podría ser considerada como tratamiento de bioestimulación. b. Bioestimulación Estos experimentos se realizaron tanto en cubeto como en biorreactor giratorio. La bioestimulación consistió en favorecer la biodegradación del HC mediante cuatro acciones: - Aporte de oxígeno. - Homogeneización del medio de reacción. - Aporte de una humedad óptima. - Aporte de nutrientes inorgánicos. La forma de llevar a cabo las tres primeras acciones dependía de la instalación que en cada caso se usaba: para el caso de los experimentos en biorreactor, la bioestimulación se llevó a cabo mediante la agitación-aireación que proporcionaba la propia hormigonera, así como, mediante la adición de la cantidad de agua correspondiente, bien hasta saturación, o hasta llegar al 18% de humedad optimizado. Para el caso de los experimentos en cubetos, la bioestimulación se llevó a cabo mediante la oxigenación que proporcionaba el sistema de aireación, una agitación manual de todo el suelo del cubeto una vez por semana y adición de agua para mantener el grado de humedad óptimo. Finalmente, en lo que respecta a la adición de nutrientes, ésta se realizó mediante una de las siguientes opciones: 155 Capítulo 6 - Adición de medio de cultivo BHB. Los nutrientes adicionados para realizar este tipo de bioestimulación fueron los presentes en el medio nutritivo Bushell-Hass, cuya composición se recoge en el capítulo de Materiales y procedimientos comunes de la presente memoria. Su dosificación fue calculada en una relación de 1,09 g de BHB por kilogramo de suelo, de tal manera que la relación final C/N/P fuera 100/6,84/1,29. La dosificación de estos nutrientes se llevó a cabo en estado líquido, al inicio del experimento, mediante un dispensador de spray. Para ello, se abrieron surcos en la tierra y se mezcló hasta alcanzar un aspecto homogéneo de humedad. - Adición de compost maduro. En este caso se quería evitar el aporte de nutrientes obtenidos comercialmente y se pensó en el compost como compuesto barato y rico en micronutrientes, como sustituto del medio de cultivo nutritivo. Se utilizaron dos tipos de compost en su fase de maduración, el primero de ellos denominado compost A, producido a partir de estiércol de gallina y el segundo, compost B, desarrollado a partir de estiércol de cordero. Las características químicas de ambos se recogen en el Anexo III. La adición consistió en realizar la mezcla compost/suelo en una proporción 16,7/83,3, de tal manera que la proporción final C/N/P fuera 100/0,18/0,7 para el caso en el que se utilizó el compost A y 100/0,35/0,66 cuando se usó el compost B. c. Bioaumento Para llevar a cabo el bioaumento era necesario preparar una cantidad suficiente de inóculo para dispensarlo en las diferentes instalaciones. El consorcio microbiano utilizado como bioaumento fue el consorcio XD (igualmente denominado X0e del propio suelo arcilloso en el capítulo 5), que fue cultivado en botellas de 3 L de capacidad con 800 mL de medio nutritivo BHB al 1% (v/v) de inóculo inicial y suplementado con diésel como única fuente de carbono bajo una concentración del 1% (v/v). Las botellas se taparon con un tapón comercial de celulosa, de la marca Selecta, y se dispusieron en un baño agitador (GFL Modelo 1083) a 30 °C y una velocidad de agitación de 140 rpm. De acuerdo con las condiciones óptimas obtenidas en el capítulo 4 de la presente memoria, tras 2 días de incubación los microorganismos estaban listos para realizar la inoculación en el suelo. Dicha inoculación se realizó mediante una de las siguientes opciones: - Adición de inóculo al inicio del experimento. Al día siguiente de realizar la contaminación del suelo se añadió el inóculo en una relación 1:1,35 (v/v) 156 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto con respecto a la cantidad de diésel adicionado (la mayor concentración de las optimizadas en el capítulo 5). El inóculo se adicionó por todo el suelo con un dispensador de spray ayudado de una pala, asegurando una distribución homogénea por todo él. - Adición de inóculo semanalmente. La inoculación se realizó de manera similar al apartado anterior, con la salvedad de que el proceso se realizó de manera repetida cada semana hasta la finalización del experimento. El objetivo de esta variante era mantener inóculo activo en el suelo de manera continua. 6.3.4. Diseño de experimentos a escala planta piloto En todos los experimentos realizados a escala planta piloto se utilizó el suelo arcilloso, nombrado en este trabajo como SD, que fue seleccionado a partir de los resultados obtenidos en el capítulo 5 para llevar a cabo los experimentos con la estrategia de bioaumento. Principalmente, se llevaron a cabo dos tipos de experimentos según las condiciones óptimas de humedad seleccionadas en el capítulo 5. Por un lado, se realizaron experimentos en fase suspendida o saturada en agua (es decir, fase slurry) con 30 kg de suelo, en los biorreactores de 134 L de capacidad (condiciones correspondientes al óptimo 1 en el estudio del grado de humedad del apartado 5.4.3) y, por otro lado, experimentos en fase sólida o insaturada de agua, con un 18% de humedad (condiciones correspondientes al óptimo 2). En este segundo caso, los experimentos se realizaron tanto en modo estático, en los cubetos de plástico de 40 L de capacidad con 15 kg de suelo, como en los biorreactores de 134 L, en los que se trataron 30 kg de suelo contaminado. En total se llevaron a cabo 10 experimentos distintos por duplicado en planta piloto. Sus características se recogen en la Tabla 6.1. Tabla 6.1. Diseño de experimentos para el estudio de viabilidad a escala planta piloto. Fase Saturada (slurry) Insaturada Instalación Dinámica (Biorreactor) Dinámica (Biorreactor) Estática (Cubeto) Estrategia Bioestimulación con medio BHB Bioaumento al inicio Bioestimulación con medio BHB Bioaumento semanal Atenuación Natural Bioestimulación con medio BHB Bioestimulación con compost A Bioestimulación con compost B Bioaumento al inicio Bioaumento semanal Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 157 Capítulo 6 El objetivo con estos experimentos era estudiar la influencia de determinadas variables, concretamente: a. Influencia de la estrategia de biorremediación en planta piloto comparando los resultados de los experimentos 1 y 2, 3 y 4, 5 al10. b. Influencia de la humedad en planta piloto comparando los resultados de los experimentos 1 y 3. c. Influencia del modo de operación comparando los resultados de los experimentos 3 y 6, 4 y 10. 6.3.5. Procedimiento experimental y muestreo En el caso de los experimentos realizados en cubeto, se fijó un flujo de aire de 3 -1 0,27 m h por cubeto. Para los biorreactores se establecieron ciclos intermitentes de mezclado que consistieron en volteos continuos durante 15 min cada dos horas. En el caso de las estrategias de bioestimulación y bioaumento se adicionaron las cantidades pertinentes de nutrientes, agua o inóculo, con el fin de conseguir las condiciones de operación ya indicadas. Una vez iniciados los tratamientos, se llevó a cabo un control de humedad cada 2-3 días, estableciéndose riegos semanales para mantener el grado de humedad deseado. Este riego se realizó mediante un dispensador de spray ayudado de una pala para asegurar así mayor homogeneidad en la humectación del suelo. Al mismo tiempo se volteó y mezcló el suelo presente en todas las zonas de la instalación, garantizando el mismo proceso de biorremediación en todo él. El pH del suelo, inicialmente de 8,32, se mantuvo en condiciones neutras durante los tratamientos debido a los reguladores tampón del medio BHB y el compost. La temperatura media a la que los experimentos se llevaron a cabo fue de 22 ± 3°C. Todas las muestras de suelo se tomaron por duplicado para cada uno de los experimentos con el fin de obtener resultados representativos y, además, los experimentos fueron llevados a cabo por duplicado. Los resultados mostrados en este capítulo corresponden a la media aritmética de estas cuatro mediciones. 158 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 6.3.6. Análisis de muestras 6.3.6.1. Medida de la concentración de biomasa Al igual que en el capítulo anterior, se prestó atención, exclusivamente, a la concentración de biomasa HiC. Para ello se tomaron semanalmente muestras de 15 g de suelo de cada uno de los experimentos realizados y se depositaron en matraces Erlenmeyer de 150 mL de capacidad con 50 mL de agua destilada grado Milli-Q. A continuación, los matraces fueron mantenidos en una agitación de 150 rpm durante 3 h. De este modo, los microorganismos existentes en la muestra quedaban suspendidos en el agua. Finalmente, se tomaron los sobrenadantes de estas suspensiones para la cuantificación de la biomasa HiC a través de la técnica NMP descrita en el apartado 3.7 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes, utilizando diésel como única fuente de carbono. Para expresar la concentración de biomasa en unidades de masa se utilizó la recta de calibrado obtenida en el apartado 5.3.1.3 del capítulo 5, mostrada en la Figura 5.3. 6.3.6.2. Medida de la concentración de TPH El estudio de la biodegradación del contaminante se realizó mediante medidas de la concentración de los TPH presentes en el suelo cada 3 días a lo largo de todo el tiempo de experimentación. Cada muestra consistía en tomar 15 g de suelo en un tubo Falcon. A continuación se añadían 2 g de sulfato de sodio, dejándolo en contacto con el suelo durante 12 h a una temperatura de 4 °C. Pasado este tiempo, se añadieron 15 mL de n-hexano como agente extractor, agitando la muestra en vortex por un periodo de 10 min. Posteriormente, las muestras fueron introducidas en un baño de ultrasonidos durante 15 min y finalmente se separó el suelo de la fase orgánica por centrifugación a 4.000 rpm durante 15 min. Una vez realizada la extracción tal y como se ha explicado, el extracto se depositó en viales con cierre hermético y se conservó a 4 °C hasta su posterior análisis por cromatografía gaseosa con GC-FID, tal y como se recoge en el apartado 3.4 del capítulo de Materiales y procedimientos comunes de la presente memoria. 6.3.7. Preparación de los ensayos de fitotoxicidad Se realizó un bioensayo de toxicidad con semillas de cebada (Hordeum vulgare) y trigo (Triticum aestivum) como prueba de toxicidad aguda en la que evaluar los efectos fitotóxicos de los compuestos residuales de la biodegradación de diésel en el suelo. Se 159 Capítulo 6 sabe que estos compuestos pueden afectar seriamente al proceso de germinación de las semillas y al desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento (Wang y Freemark, 1994). De este modo, como puntos finales para la evaluación de estos efectos fitotóxicos, se determinó la inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación del tallo para los suelos descontaminados con las estrategias de bioestimulación con compost (Experimentos 7 y 8) y bioaumento semanal (Experimento 10), es decir, se seleccionaron los experimentos en los que se obtuvieron los mejores resultados de biorremediación en cubeto. Además, se hizo lo mismo con el suelo arcilloso inicial sin contaminar y contaminado con diésel, como experimentos de control. La primera parte experimental consistió en una prueba previa de germinación de semillas de cebada en placa de Petri de acuerdo con Wan y col. (2003). Esta prueba se realizó directamente sobre el suelo (suelo inicial limpio, suelo contaminado con diésel y suelo descontaminado en los distintos experimentos mencionados anteriormente), o bien interponiendo papel de filtro entre la semilla y cada uno de estos cinco suelos. Esto último se realizó con la finalidad de comprobar si los vapores emitidos por los suelos podrían afectar al desarrollo de las semillas. Una vez que las semillas se pusieron en las placas (Figura 6.3), éstas se mantuvieron en oscuridad dentro de un equipo Ecotrón a 27 °C y a una humedad inicial del 18% durante 5 días. Figura 6.3. Vista del desarrollo de semillas en placa de Petri para los ensayos de fitotoxicidad. Una vez confirmada la viabilidad de germinación de las semillas bajo las condiciones finales de los suelos descontaminados, se procedió a la siembra de nuevas semillas en semilleros comerciales de vivero siguiendo las siguientes pautas: Se utilizaron cinco semilleros independientes para el estudio de los cinco casos que se quería evaluar: el suelo descontaminado después del proceso de biorremediación a través de las estrategias de bioestimulación con 160 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto compost A y B (Experimentos 7 y 8) y bioaumento semanal (Experimento 10), y los dos experimentos de control, es decir, el suelo inicial limpio y el suelo contaminado con diésel sin tratar. Se realizaron siete réplicas por cada una de las cinco pruebas anteriores y en cada una de ellas se sembraron tres semillas por semillero, para asegurar el crecimiento de, al menos, una de ellas. Se realizó un seguimiento diario durante 3 semanas de la cantidad de semillas germinadas, y se observó el desarrollo de la plántula a través de la medición de la longitud del tallo y su grosor con la ayuda de un calibre. 6.4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.4.1. Evaluación de la degradación alcanzada en los distintos tratamientos de biorremediación en planta piloto A continuación se evalúan los resultados obtenidos en los diez experimentos de biorremediación realizados en planta piloto, los cuales han sido especificados en la Tabla 6.1. La finalidad de los mismos es estudiar, a escala planta piloto, la influencia de la humedad, las distintas estrategias en la biorremediación del suelo y, además, comparar los resultados con aquellos obtenidos en laboratorio (capítulo 5). 6.4.1.1. Influencia de la estrategia de biorremediación utilizada Una de las principales discusiones que se encuentran en bibliografía a la hora de realizar un proceso de biorremediación real es elegir el tipo de estrategia a aplicar. Para ayudar a tal fin, a continuación se comparan los resultados de los distintos experimentos llevados a cabo bajo las mismas condiciones de operación y variando en ellos, únicamente, el tipo de estrategia de biorremediación. En los siguientes apartados se presentan siempre dos figuras para mostrar los resultados de cada experimento: la figura de la izquierda, en la que se representa la concentración media de TPH residual y de biomasa a lo largo del tiempo, y la figura de la derecha, en la que se muestra la evolución de la humedad media. a) Comparación de los experimentos 1 y 2 En la Figura 6.4 se presentan los resultados de los experimentos de bioestimulación con medio BHB (Experimento 1) y de bioaumento inicial (Experimento 2), llevados a 161 Capítulo 6 cabo en fase saturada en biorreactor. El proceso de biorremediación tuvo lugar de manera satisfactoria en ambos casos, sin quedar claras las ventajas que supone la utilización de la estrategia de bioaumento con respecto a la bioestimulación bajo estas condiciones, puesto que la tendencia observada en las dos estrategias fue muy parecida. 16000 14000 12 70 10 60 12000 6 6000 4 4000 50 Humedad % T PH (mg kg- 1) 8000 Biomasa (mg kg-1) 8 10000 2 2000 0 0 400 800 1200 40 30 20 10 0 1600 0 0 500 1000 1500 Tiempo (h) T iempo (h) (a) 14000 12 60 10 50 TPH (mg kg - 1) 8 10000 8000 6 6000 4 4000 2000 0 0 400 800 1200 1600 Bioamasa (mg kg -1) 12000 Humedad % 16000 40 30 20 2 10 0 0 2000 0 Tiempo (h) 400 800 1200 1600 2000 Tiempo (h) (b) Figura 6.4. Experimentos en fase saturada en biorreactor. (a) Bioestimulación con medio BHB (Experimento 1). (b) Bioaumento inicial (Experimento 2). Simbología: , concentración de TPH; ○, concentración de biomasa. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y las líneas indican tendencias. La concentración de biomasa en ambos experimentos aumentó durante el tratamiento hasta las primeras 400 h, aproximadamente. A partir de ese momento, la concentración de biomasa se estabilizó en un valor constante a pesar de que continuó eliminándose TPH. Se considera que pudo existir una elevada tasa de mortalidad 162 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto microbiana que se hizo notar cuando se habían eliminado las fracciones más biodegradables de diésel. La Tabla 6.2 muestra los porcentajes de eliminación y las velocidades de consumo calculados a partir de los resultados de los experimentos 1 y 2. Se observa que las eficacias de eliminación de TPH al final de los experimentos fueron similares, siendo ligeramente superior para la estrategia de bioestimulación con medio BHB. Además, la velocidad de consumo calculada para el tratamiento de bioestimulación fue alrededor del 55% superior con respecto al bioaumento inicial. Publicaciones recientes han demostrado claramente que si la disponibilidad del HC es alta, se requiere una gran cantidad de nutrientes esenciales, como Nitrógeno y Fósforo, para aumentar la eficiencia del proceso de biorremediación (Ławniczak y col., 2013). Por todo ello, bajo estas condiciones de operación, la estrategia de bioaumento inicial, tal y como se realizó, no supondría una gran ventaja para el proceso de descontaminación. Tabla 6.2. Resumen de datos relevantes para el estudio de la influencia de la estrategia de biorremediación a escala piloto en experimentos en fase saturada en biorreactor. Estrategia Experimento Bioestimulación 1 con medio BHB Bioaumento 2 inicial Eliminación final de diésel (%) Eliminación de Vmax de Vmed de diésel a 2 consumo consumo meses (%) (mgTPH kgsuelo-1 h-1) (mgTPH kgsuelo-1 h-1) 93,40 ± 0,51 90,82 ± 1,98 42,37 ± 3,82 15,26 ± 2,27 86,63 ± 0,72 85,10 ± 7,21 23,59 ± 1,89 10,21 ± 1,22 b) Comparación de los experimentos 3 y 4 En la Figura 6.5 se muestran los resultados de los experimentos llevados a cabo en biorreactor en fase insaturada (18% de humedad) bajo las estrategias de bioestimulación con medio BHB (Experimento 3) y bioaumento semanal (Experimento 4). Al igual que ocurriera en los experimentos realizados en fase de saturación (apartado 6.4.1.1. a), el proceso de biorremediación se llevó a cabo sin ningún problema bajo las condiciones de operación de estos experimentos. La concentración de biomasa siguió una tendencia similar a la comentada anteriormente, es decir, un aumento inicial de concentración hasta alcanzar un máximo. En esta ocasión, en el experimento 3 (Figura 6.5.a) se produce un descenso de concentración de biomasa a tiempos elevados indicando que la mortalidad microbiana en este experimento fue mayor. 163 Capítulo 6 16000 12 22 14000 10 8000 6 6000 4 4000 2 2000 16 Humedad % 10000 18 14 12 10 8 6 4 2 0 0 300 600 900 1200 0 1500 Tiempo (h) 0 0 300 16000 600 900 1200 1500 1200 1500 Tiempo (h) ( a) 24 12 22 14000 20 10 8 10000 8000 6 6000 4 4000 Biomasa (mg kg -1) 12000 Humedad % TPH (mg kg -1) 8 20 Biomasa (mg kg -1) 12000 TPH (mg kg -1) 24 16 14 12 10 8 6 4 2 2000 18 2 0 0 300 600 900 Tiempo (h) 1200 0 0 1500 0 ( b) 300 600 900 Tiempo (h) Figura 6.5. Experimentos en fase insaturada en biorreactor. (a) Bioestimulación con medio BHB (Experimento 3). (b) Bioaumento semanal (Experimento 4). Simbología: , concentración de TPH; ○, concentración de biomasa. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y las líneas indican tendencias. Se observó un descenso brusco de la concentración de TPH en la etapa inicial en ambos casos. Este hecho podría deberse a la evaporación de las cadenas cortas de HC lineales (Lin y col., 2011) o a la rápida biodegradación de compuestos ligeros más fácilmente biodegradables. Dado que el diésel se mezclaba con el suelo durante la preparación de los experimentos, se considera que la posible evaporación de HC volátiles ya tuvo lugar en ese momento. Por ello, el descenso brusco de concentración de TPH se considera que es debido a la biodegradación de compuestos ligeros y no a fenómenos de volatilización. Después de esta primera etapa de biodegradación más rápida, a partir de aproximadamente las 100-200 h de tratamiento, se observó progresivamente un 164 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto descenso más lento hasta las situaciones finales. Es en esta etapa final en la que se observaron importantes diferencias entre utilizar una estrategia de bioestimulación y una de bioaumento (en este caso semanal). Tal y como indica la Tabla 6.3, se alcanzó una mayor eliminación de HC diésel en el tratamiento de bioaumento, y la velocidad de consumo fue en torno al 41% superior con respecto al de bioestimulación. Tabla 6.3. Resumen de datos relevantes para el estudio de la influencia de la estrategia de biorremediación a escala piloto en experimentos en fase insaturada en biorreactor. Experimento Eliminación de diésel a 2 meses (%) Bioestimulación con medio BHB 3 89,15 ± 0,49 90,23 ± 5,16 21,62 ± 0,61 Bioaumento semanal 4 97,14 ± 0,30 150,83 ± 9,5 25,66 ± 1,06 Estrategia Vmax Vmed de consumo de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) (mgTPH kgsuelo-1 h-1) c) Comparación de los experimentos 5 a 10 En la Figura 6.6 se muestra los resultados de los experimentos realizados en cubeto y fase insaturada al 18% de humedad, es decir, los experimentos del 5 al 10. En estos experimentos la única variable que se ha ido modificando es el tipo de estrategia utilizada en la biorremediación. En el experimento 5 (Figura 6.6.a) se presenta el tratamiento de atenuación natural que se llevó a cabo a escala planta piloto, es decir, el experimento control a gran escala al cual no se le realizó ningún tipo de bioestimulación (aireación, adición de agua, adición de nutrientes, etc.) ni bioaumento. En estas circunstancias se alcanzó una disminución de la concentración de TPH en el suelo del 38%. Este descenso se debe, únicamente, al proceso de biodegradación por parte de los microorganismos endógenos (Figura 6.6.a), ya que, aunque éstos no fueron estimulados y se observó una concentración de biomasa muy pequeña, podrían haber intervenido en el proceso de biorremediación. 165 Capítulo 6 14 14000 12 9 8 10 10000 Biomasa (mg kg -1) 8 8000 6 6000 4 4000 2000 2 0 0 0 300 600 900 1200 4 10 5 0 0 16 14000 14 12000 12 10000 10 8 6000 6 4000 4 2000 2 0 400 800 1200 1600 2000 2400 Tiempo (h) 25 20 Biomasa (mg kg-1) 16000 0 400 (b ) 8000 1500 15 0 1200 1600 2000 2400 Tiempo (h) 1200 Tiempo (h) 2 800 900 Humedad % TP H (mg kg -1) 6 400 600 20 B iomasa (mg kg-1) 8 8000 0 300 25 10 0 T PH (mg kg- 1) 2 (a ) 12 2000 3 0 14000 4000 4 0 14 6000 5 1500 16000 10000 6 1 T iempo (h) 12000 7 15 Humedad % T PH (mg kg- 1) 12000 10 Humedad % 16000 0 800 1200 1600 2000 2400 10 5 0 0 T iempo (h) 400 800 1200 1600 2000 2400 T iempo (h) (c) Figura 6.6. Experimentos en fase insaturada en cubeto. (a) Atenuación natural (Experimento 5). (b) Bioestimulación con medio BHB (Experimento 6). (c) Bioestimulación con compost A (Experimento 7). Simbología: , concentración de TPH; ○, concentración de biomasa. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y las líneas indican tendencias. 166 16 14000 14 12000 12 10000 10 8000 8 6000 6 4000 4 2000 2 0 400 800 5 12 10000 8 8000 6 6000 4 4000 800 T iempo (h) 20 2 2000 15 10 5 0 0 1200 1600 2000 2400 0 Tiempo (h) 14 30 14000 12 25 10 8000 6 6000 4 4000 2 2000 0 400 800 1200 Humedad % 8 Biomasa (mg kg-1) 10000 0 1600 800 1200 1600 2000 2400 Tiempo (h) 16000 0 400 (e ) 12000 800 1200 1600 2000 2400 25 B iomasa (mg kg-1) 10 400 400 (d ) 14000 0 10 0 14 0 15 0 16000 12000 TPH (mg kg -1) 20 0 1200 1600 2000 2400 T iempo (h) TPH (mg kg- 1) 25 Humedad % 0 30 Humedad % 16000 Biomasa (mg kg-1) T PH (mg kg- 1) Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 20 15 10 5 0 0 T iempo (h) (f) 300 600 900 1200 1500 Tiempo (h) Figura 6.6 (Continuación). Experimentos en fase insaturada en cubeto. (d) Bioestimulación con compost B (Experimento 8). (e) Bioaumento inicial (Experimento 9). (f) Bioaumento semanal (Experimento 10). Simbología: , concentración de TPH; ○, concentración de biomasa. Las barras de error representan la desviación estándar de la media y las líneas indican tendencias. 167 Capítulo 6 En el resto de tratamientos se observaron varios hechos importantes. En primer lugar, la concentración de biomasa evolucionó de forma similar a lo observado en los apartados a) y b) anteriores. Tras una primera etapa de crecimiento se alcanzó una etapa estacionaria en la que se mantuvo una concentración aproximada en torno a 12 mgBiomasa kgSuelo -1 en todos los casos, a excepción de los experimentos 7 y 8, de bioestimulación con compost, en los que se alcanzaron valores de 14 mg Biomasa kgSuelo -1 (Figuras 6.6.c y 6.6.d). En este caso cabría pensar que la microbiota del suelo se vio favorecida por estas estrategias de bioestimulación, o bien que estos compost aportaron una mayor concentración de microorganismos capaces de biodegradar diésel. Por otro lado, la evolución en la degradación de TPH fue diferente según el tratamiento realizado. Se observó un descenso más pronunciado en las estrategias de bioestimulación con compost A y B y bioaumento semanal que en las estrategias de bioestimulación con medio BHB o bioaumento inicial. Con estos resultados cabría pensar que para hacer un proceso de biorremediación más efectivo sería necesario aportar continuamente nuevos nutrientes o inóculo fresco. Toda esta evolución se puede apreciar mejor en la Figura 6.7, en la que, a modo resumen, se ha representado la variación de la concentración de TPH para cada una de las estrategias realizadas en cubeto en fase insaturada con el fin de poder compararlas mejor. Atenuación Natural Bioestimulación medio BHB Bioestimulación compost A Bioestimulación compost B Bioaumento inicial Bioaumento semanal 16000 14000 TPH (m g kg-1 ) 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 300 600 900 1200 1500 Tiempo (h) Figura 6.7. Comparación de la biodegradación alcanzada en los experimentos realizados en cubeto en fase insaturada para el estudio de la influencia de la estrategia de biorremediación. 168 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto Si se observa la concentración final de TPH alcanzada en estos experimentos (Tabla 6.4), se puede concluir que resultó más beneficioso el uso de una estrategia de bioestimulación por cualquiera de los tratamientos con compost (92% de eliminación), ya que éstos, en menos de 2 meses, aumentaron la eficiencia del proceso en un 20% con respecto al resto de estrategias. Teniendo en cuenta este hecho se podría pensar que la materia orgánica que aporta el compost puede estimular la actividad microbiana y, consecuentemente, acelerar la degradación del diésel (Barker y Bryson, 2002). Respecto a la velocidad máxima de consumo de diésel (Tabla 6.4), las estrategias más rápidas fueron las (42,76 ± 8,82 mgTPH kgsuelo -1 h -1 de bioestimulación con compost A ) y compost B (48,33 ± 18,41 mgTPH kgsuelo h ). El -1 -1 tratamiento de bioaumento semanal, con un valor de velocidad máxima de consumo de -1 -1 24,04 ± 0,08 mgTPH kgsuelo h , ocupó el tercer lugar. Tabla 6.4. Resumen de datos relevantes para el estudio de la influencia de la estrategia de biorremediación a escala piloto en experimentos en cubeto y fase insaturada. Estrategia Experimento Eliminación final de diésel (%) Eliminación de diésel a 2 meses (%) Vmax de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Vmed de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Atenuación Natural Bioestimulación con medio BHB 5 38,21 ± 0,27 38,21 ± 0,27 21,27 ± 0,01 7,04 ± 0,03 6 87,99 ± 4,47 69,63 ± 3,94 12,24 ± 0,91 8,53 ± 0,51 Bioestimulación con compost A 7 95,97 ± 0,41 92,37 ± 2,89 42,76 ± 8,82 16,58 ± 1,27 Bioestimulación con compost B 8 96,00 ± 0,23 92,76 ± 0,40 48,33 ± 18,41 18,50 ± 1,73 Bioaumento inicial 9 (90,82 ± 1,53)* 75,35 ± 0,52 14,97 ± 5,15 9,54 ± 3,00 Bioaumento semanal 10 81,39 ± 1,38 81,39 ± 1,38 24,04 ± 0,08 13,65 ± 2,66 Nota: * Dato fuera de tendencia. En la Tabla 6.5 se presenta el resultado del test ANOVA realizado para analizar estadísticamente los resultados de los experimentos de biorremediación en cubeto. Para ello, se muestra el valor p que marca el valor por debajo del cual la hipótesis nula es rechazada, es decir, valor por debajo del cual la diferencia entre las estrategias comparadas no es debida al azar. Generalmente, se toma como valor de referencia p<0,05 para determinar la significancia estadística, sin embargo, existen referencias más restrictivas que se han fijado en valores p<0,01 y p<0,001. Como era de esperar, todas las estrategias resultaron significativamente más beneficiosas que el proceso de atenuación natural (Experimento 5). De este hecho se concluye que cualquier alteración 169 Capítulo 6 (de bioestimulación o bioaumento) realizada sobre el suelo contaminado conduce a una mejora en su descontaminación. Respecto a la estrategia de bioaumento semanal, ésta fue significativamente (p<0,05) más beneficiosa que el tratamiento de bioestimulación con medio BHB y el bioaumento simple. Es importante indicar que de los apartados a) y b) anteriores se podía extraer la misma conclusión, es decir, el bioaumento simple no mejora a la bioestimulación con medio BHB, pero el semanal sí lo hace. Además, en principio, parece que este comportamiento es independiente de las demás variables (humedad o tipo de instalación). Tabla 6.5. Resultado del test ANOVA en el análisis estadístico de los experimentos en cubeto para el estudio de la influencia de la estrategia de biorremediación. Fase Insaturada Instalación Cubeto Bioest. BHB (Exp. 6) Estrategia Atenuación 0,017* Natural (Exp. 5) Bioest. BHB (Exp. 6) Bioest. Compost A (Exp. 7) Bioest. Compost B (Exp. 8) Bioaum. inicial (Exp. 9) Bioest. compost A (Exp. 7) Bioest. compost B (Exp. 8) Bioaum. inicial (Exp. 9) Bioaum. semanal (Exp. 10) 5,3E-07*** 4,7E-08*** 0,007** 2,86E-06*** 0,010** 0,002** 0,885 0,019* 0,605 0,012* 0,865 0,003** 0,502 0,022* Nota: *, significación estadística al nivel de 0,05; **, nivel de 0,01; ***, nivel de 0,001. Por este motivo, en caso de optar por una estrategia de bioaumento, la recomendación final sería la de utilizar el inóculo propio del suelo, que tras un paso previo de aislamiento y enriquecimiento bajo las condiciones optimizadas en el capítulo 4, se introduzca de nuevo en el medio contaminado de manera periódica, manteniendo, de este modo, activa la población microbiana específica y acelerando el proceso de biorremediación. Al contrario de lo obtenido por Cunningham y Philp (2000), se ha visto que las estrategias de bioestimulación con compost pueden ser significativamente más beneficiosas para el proceso de biorremediación que otras estrategias (Tabla 6.5). Los beneficios del uso de compost en la biorremediación de suelos han sido demostrados con anterioridad tanto a escala de laboratorio como a mayor escala, especialmente para la biodegradación de HC (Jørgensen y col., 2000; van Gestel y col., 2003; Hesnawl y McCartney, 2006; Gandolfi y col., 2010). En general, la adición de compost lleva consigo la adición de agentes estructurantes (astillas de corteza arbórea, salvado de trigo y 170 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto serrín, entre otros) que aumentan la porosidad de los suelos (Cookson, 1995) y enmiendas orgánicas, como ejemplos de residuos orgánicos municipales. Estos compuestos, además de aportar nutrientes, favorecen la aireación y la actividad microbiana y, en consecuencia, aumentan la tasa de biodegradación de los contaminantes. Por este motivo, los resultados obtenidos en este trabajo para los tratamientos de bioestimulación son alentadores, pues es posible y viable la sustitución de nutrientes inorgánicos comerciales (Medio BHB o fertilizantes industriales) (Cunningham y Philp, 2000), cuyo uso supone un coste adicional importante. La posible aplicación de estas estrategias estará condicionada por el tipo de proceso de biorremediación. La estrategia de bioestimulación con compost se podrá realizar en los tratamientos ex situ sin problema y también en los tratamientos in situ en los que el vertido sea muy superficial, de forma que tras una simple roturación de la superficie, se pudiera mezclar el suelo contaminado con el compost. Sin embargo, en aquellos casos en los que se precise un tratamiento in situ a cierta profundidad, la estrategia de bioaumento periódico sería la más apropiada. En cuanto al tipo de compost utilizado, no se observaron grandes diferencias entre los dos empleados. Aparentemente se obtuvo una respuesta ligeramente mejor cuando se empleó compost formado a partir de estiércol de cordero, pero sin llegar a ser estadísticamente significativa la diferencia entre ambos. Se podría proponer la utilización indistinta de ambos dependiendo de la disponibilidad de estos residuos a nivel industrial. 6.4.1.2. Influencia del grado de humedad del suelo La mayoría de los procesos de biorremediación que se llevan a cabo en la actualidad se realizan con suelos en estado insaturado; bien en procesos ex situ mediante tratamientos landfarming, biopilas, etc. (Cunningham y Philp, 2000; Lin y col., 2011), o en procesos in situ mediante la realización de perforaciones utilizadas para inyectar nutrientes líquidos, microorganismos especializados o simplemente aire para oxigenar el suelo. Sin embargo, cuando existen sustancias muy recalcitrantes, los procesos de descontaminación se suelen llevar a cabo ex situ en biorreactores industriales en fase saturada (Robles-González y col., 2008). Para estudiar la influencia de la humedad en el proceso de biorremediación del suelo contaminado con diésel a escala planta piloto, en este apartado se comparan los experimentos 1 y 3, experimentos en los que la única variable que se ha modificado es la humedad. 171 Capítulo 6 En la Figura 6.8 se comparan los resultados obtenidos en los experimentos 1 y 3. Se observa que la concentración de biomasa (Figura 6.8.b) siguió inicialmente la misma tendencia en los dos experimentos: un rápido ascenso desde el tiempo 0 hasta las 200 h -1 de tratamiento, alcanzando un valor de 9 mgBiomasa kgSuelo en ambas estrategias. A partir de ese momento, la concentración de microorganismos en el experimento en fase saturada siguió aumentando hasta alcanzar una concentración máxima en torno a 10 -1 mgBiosama kgSuelo , la cual se mantuvo constante en esos valores durante el resto del tiempo. Sin embargo, en el experimento en fase insaturada, se observó un progresivo descenso de la población microbiana durante el resto del tratamiento. Cabe pensar que este descenso de biomasa podría deberse a la menor concentración de humedad, de tal manera que aumentaría la mortalidad microbiana al no estar lo suficientemente estimulada. 18000 12 TPH Fase insaturada TPH Fase saturada 16000 11 10 9 12000 Biomasa (mg kg-1) T PH (mg kg- 1) 14000 10000 8000 6000 4000 8 7 6 5 4 3 2 2000 Biomasa Fase saturada 1 Biomasa Fase insaturada 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 T iempo (h) (a) 800 1000 1200 1400 T iempo (h) (b) Figura 6.8. Estudio de la influencia del grado de humedad en la biorremediación a escala planta piloto (Experimentos de bioestimulación con medio BHB realizados en biorreactor). (a) Comparación de la concentración de TPH, (b) Comparación de la concentración de biomasa. Los puntos son datos experimentales. Las líneas indican tendencias. Con respecto a la concentración de TPH (Figura 6.8.a), se observa una respuesta ligeramente mejor del tratamiento realizado en condiciones de insaturación al 18% de humedad que en condiciones saturadas. Esta tendencia puede observarse durante todo el tiempo de experimentación, si bien, al final se alcanzan concentraciones muy 172 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto parecidas. La velocidad media de consumo de diésel en el tratamiento insaturado fue superior que en condiciones saturadas (Tabla 6.6). Tabla 6.6. Resumen de datos relevantes para el estudio de la influencia del grado de humedad en la biorremediación a escala planta piloto (Experimentos de bioestimulación con medio BHB realizados en biorreactor). Experimento Eliminación de Vmax diésel a 2 de consumo meses (%) (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Vmed de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Bioestimulación con medio BHB en fase saturada 1 90,82 ± 1,98 42,37 ± 3,82 15,26 ± 2,27 Bioestimulación con medio BHB en fase insaturada 3 89,15 ± 0,49 90,23 ± 5,16 21,62 ± 0,61 Atendiendo al análisis de la varianza realizado a través del test ANOVA para el estudio de la significancia (Tabla 6.7), se observa que el experimento de bioestimulación con medio BHB realizado en fase saturada no resultó significativo respecto al llevado a cabo bajo las mismas condiciones en fase insaturada. Tabla 6.7. Resultado del test ANOVA en el análisis estadístico de la influencia del grado de humedad en los experimentos de bioestimulación con medio BHB en biorreactor. Insaturada Instalación Fase Estrategia Biorreactor Saturada Bioest. medio BHB (Exp.1) Bioest. medio BHB (Exp. 3) 0,284 Nota: el mínimo nivel de significación estadística es 0,05 En las condiciones en las que se han realizado estos experimentos, el tipo de suelo que se ha utilizado y el HC elegido, un tratamiento en fase saturada no mejora el proceso de biorremediación con respecto a ese mismo experimento realizado en fase insaturada, es decir, no se obtienen mejores eficiencias finales y tampoco se consigue aumentar la velocidad de consumo de diésel. Por ello se rechaza el estado saturado como óptimo de humedad en el que llevar a cabo el tratamiento de biorremediación del suelo contaminado con diésel a escala industrial. Los beneficios que supondría utilizar este tipo de tecnología en estado insaturado a escala industrial son muy importantes a la hora de plantear un proceso de biorremediación viable. Por un lado, se reduce el gasto 173 Capítulo 6 de agua a utilizar y, por otro, se conservan las propiedades fundamentales del suelo, no destruyéndose su estructura física y quedando disponible para un uso posterior. 6.4.1.3. Influencia del modo de operación Tal y como se ha comentado anteriormente, una práctica muy común para tratar los suelos contaminados con sustancias muy recalcitrantes suele ser el uso de biorreactores industriales (Piskonen y col., 2005; Filonov y col., 2006). Estos equipos favorecen, generalmente, la aceleración de la degradación de los contaminantes, permitiendo además un mayor control de ciertas variables de operación. Los experimentos que en esta investigación se han realizado en las hormigoneras convencionales (Experimentos 1 a 4) pretenden equipararse a aquéllos que se realizan en biorreactores inventados para tal fin. Por otro lado, los experimentos 5 a 10 realizados en cubeto pueden asimilarse a aquellos tratamientos que se realizan en biopilas o hileras a escala industrial. Además, la instalación que aquí se ha propuesto tiene situados en su interior unos aireadores que aumentan la concentración de oxígeno por todo el suelo, metodología empleada también habitualmente para aumentar el rendimiento en estas instalaciones a escala industrial. Para comprobar la influencia del modo de operación y el uso de una instalación u otra, se comparan en fase insaturada (18% de humedad) los resultados de los experimentos 3 y 6 (Figura 6.9.a), y los experimentos 4 y 10 (Figura 6.9.b), llevados a cabo bajo las mismas estrategias de biorremediación pero en un modo de operación distinto. En ambas figuras se observa siempre que la concentración de TPH es inferior en todo momento en los experimentos realizados en biorreactor, a pesar de que la concentración de biomasa es inferior. Este hecho podría deberse a que en la instalación dinámica de los biorreactores la biomasa se encuentra más activa y con un rendimiento mayor, o bien, que existen otros factores ajenos a la biodegradación que se ven favorecidos en este tipo de instalaciones. 174 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 18000 16 TPH Biorreactor 16000 14 TPH cubeto 12 Biomasa (mg kg-1) TPH (mg kg-1 ) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 10 8 6 4 2000 2 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Biomasa Biorreactor Biomasa cubeto 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 T iempo (h) T iempo (h) (a) 16000 16 TPH biorreactor 14000 14 TPH cubeto 12 Biomasa (mg kg-1) TPH (mg kg-1) 12000 10000 8000 6000 4000 10 8 6 4 2000 2 0 0 0 Biomasa cubeto 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Tiempo (h) Biomasa biorreactor 200 400 600 800 1000 1200 1400 T iempo (h) (b) Figura 6.9. Comparación de los experimentos realizados en biorreactor y cubeto para el estudio de la influencia del modo de operación en la biorremediación a escala planta piloto. (a) Comparación de los experimentos 3 y 6, Bioestimulación con medio BHB. (b) Comparación de los experimentos 4 y 10, Bioaumento semanal. Los puntos son datos experimentales. Las líneas indican tendencias. La Tabla 6.8 muestra el resumen de las eficacias y velocidades alcanzadas en los experimentos 3 y 6, y 4 y 10. Respecto a la velocidad de consumo de diésel, se observaron unas velocidades inferiores en las estrategias en modo estático frente a los tratamientos en dinámico llevados a cabo en biorreactor. 175 Capítulo 6 Tabla 6.8. Resumen de datos relevantes para el estudio de la influencia del modo de operación en la biorremediación a escala planta piloto (Experimentos 3 y 6, 4 y 10). Estrategia Experimento Eliminación de diésel a 2 meses (%) Vmax de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Vmed de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Bioestimulación con medio BHB en biorreactor 3 89,15 ± 0,49 90,23 ± 5,16 21,62 ± 0,61 Bioestimulación con medio BHB en cubeto 6 69,63 ± 3,94 12,24 ± 0,91 8,53 ± 0,51 Bioaumento semanal en biorreactor 4 97,14 ± 0,30 150,83 ± 9,5 25,66 ± 1,06 Bioaumento semanal en cubeto 10 81,39 ± 1,38 24,04 ± 0,08 13,65 ± 2,66 En principio, de acuerdo con los resultados obtenidos, se puede considerar que el tratamiento con biorreactores giratorios es más adecuado, ya que supondría una aceleración del proceso frente al uso de reactores estáticos aireados. Sin embargo, el test de significancia ANOVA (Tabla 6.9) indica que únicamente existen diferencias significativas (p<0,01) al comparar los resultados de los experimentos 3 y 6. De esta forma, el uso de biorreactores no estaría completamente justificado debido a la alta relación coste/eficiencia. Sin embargo, el factor tiempo podría justificar su uso (Cunningham y Philp, 2000). Tabla 6.9. Resultado del test ANOVA en el análisis estadístico de la influencia del modo de operación de los experimentos en fase insaturada y misma estrategia de biorremediación. Biorreactor Instalación Cubeto Estrategia Bioest. medio BHB (Exp. 6) Bioaum. semanal (Exp. 10) Bioest. Bioaum. semanal medio BHB (Exp. (Exp. 4) 3) 0,002** 0,342 Nota: *, significación estadística al nivel de 0,05; **, nivel de 0,01. 6.4.1.4. Influencia del cambio de escala En la bibliografía se encuentran numerosos casos en los que los tratamientos realizados en laboratorio pretenden asemejarse a aquellos a mayor escala (MachinRamirez y col., 2008; Nikakhtari y col., 2009), por lo que este paso intermedio en planta piloto es esencial para el buen entendimiento del escalado de estos procesos. A partir de los experimentos realizados en suspensión acuosa en laboratorio se llegó a la conclusión de que el tipo de estrategia está condicionado por la biodisponibilidad del 176 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto contaminante, de ahí que para distintos tipos de suelo la estrategia recomendable no fuera la misma. Sin embargo, una vez realizado el proceso a una escala mayor con uno de esos suelos, suelo arcilloso SD, se han observado otros efectos. En primer lugar, es necesario remarcar el éxito de todas las estrategias de biorremediación utilizadas en este trabajo al cambiar a escala planta piloto. Se consiguieron rendimientos de eliminación del mismo orden que los experimentos en suspensión acuosa en laboratorio (realizados bajo unas condiciones de tratamiento más controladas), aunque en planta piloto se ha observado una velocidad de consumo menor. En la Figura 6.10 se puede observar tal efecto al comparar los experimentos de bioestimulación con medio BHB y bioaumento inicial realizados en fase saturada en laboratorio y en planta piloto. En la figura de la izquierda se representa la concentración de TPH a lo largo del tiempo y en la derecha la concentración de biomasa. Atendiendo a las curvas de concentración de TPH de los experimentos de biorremediación realizados en laboratorio, se observa un descenso más pronunciado del HC. Sin embargo, en los experimentos realizados en planta piloto se aprecia la ralentización del proceso al cambiar de escala. Este efecto se puede observar claramente en la Figura 6.10.b para el tratamiento mediante bioaumento inicial. Por otro lado, y atendiendo a la concentración de biomasa, ésta es muy superior en los tratamientos realizados en laboratorio, mostrándose verdaderamente los efectos del escalado como consecuencia del menor control de ciertas variables de operación, como por ejemplo, la temperatura y la homogeneización. Los experimentos realizados en planta piloto mostraron unas velocidades de consumo de diésel en torno a un 94% menores que aquellas obtenidas en los experimentos en laboratorio; sin embargo, se consiguieron mayores eficiencias en un tiempo menor que los reportados en la bibliografía para otros experimentos a gran escala (Lin y col., 2011). 177 Capítulo 6 400 18000 16000 Laboratorio 350 Laboratorio 14000 Planta Piloto 300 250 Laboratorio Biomasa (mg kg-1) 12000 10000 8000 6000 4000 40 30 200 20 150 100 10 Planta Piloto Biomasa (mg kg -1) T PH (mg kg- 1) 50 Planta piloto 50 2000 0 0 200 400 600 0 800 1000 1200 1400 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 T iempo (h) Tiempo (h) (a) 18000 50 Planta Piloto 16000 Laboratorio Planta piloto 14000 750 Laboratorio Biomasa (mg kg-1) 12000 10000 8000 6000 4000 600 30 450 20 300 10 150 2000 0 0 0 400 800 1200 1600 40 0 0 2000 Planta Piloto Biomasa (mg kg-1) T PH (mg kg- 1) Laboratorio 900 200 400 600 800 1000 1200 1400 T iempo (h) T iempo (h) (b) Figura 6.10. Comparación de los experimentos de biorremediación realizados en laboratorio y planta piloto para el estudio del cambio de escala. (a) Comparación del tratamiento de bioestimulación con medio BHB, (b) Comparación del tratamiento de bioaumento inicial. Los puntos son datos experimentales. Las líneas indican tendencias. A continuación, como resumen de esta etapa de estudio en planta piloto, se presentan los datos más interesantes obtenidos en los experimentos en esta fase (del 1 al 10). Tal y como se ha comentado, y puede observarse en la Tabla 6.10, el experimento en biorreactor en fase insaturada mediante la estrategia de bioaumento semanal alcanza la mayor tasa de eliminación de HC y una velocidad media de consumo más elevada. Se trata, por tanto, de la estrategia de biorremediación más adecuada para la descontaminación de suelos con HC diésel, de las planteadas en esta memoria. Sin embargo, los buenos resultados obtenidos por estrategias más sencillas como la bioestimulación con compost o el bioaumento semanal realizados en fase insaturada en cubeto, de menor coste económico, inclinan la balanza hacia este tipo de 178 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto estrategias en un proyecto de descontaminación de suelos con HC tipo diésel a escala real. Tabla 6.10. Resumen de datos obtenidos de los experimentos realizados en planta piloto. Instalación Fase Tratamiento Experimento Eliminación de diésel a 2 meses (%) Vmed de consumo (mgTPH kgsuelo-1 h-1) Saturada Bioestimulación medio BHB 1 90,82 ± 1,98 15,26 ± 2,27 Bioaumento inicial 2 85,10 ± 7,21 10,21 ± 1,22 Bioestimulación medio BHB 3 89,15 ± 0,49 21,62 ± 0,61 Bioaumento semanal 4 97,14 ± 0,30 25,66 ± 1,06 Atenuación Natural 5 38,21 ± 0,27 7,04 ± 0,03 Bioestimulación medio BHB 6 69,63 ± 3,94 8,53 ± 0,51 Bioestimulación con Compost A 7 92,37 ± 2,89 16,58 ± 1,27 Bioestimulación con Compost B 8 92,76 ± 0,40 18,50 ± 1,73 Bioaumento inicial 9 75,35 ± 0,52 9,54 ± 3,00 Bioaumento semanal 10 81,39 ± 1,38 13,65 ± 2,66 Biorreactor Insaturada Cubeto Insaturada 6.4.2. Evaluación del estado del suelo después del proceso de biorremediación: resultados del test de fitotoxicidad La evaluación de la toxicidad en procesos de biorremediación es de gran importancia debido a que en algunos procesos metabólicos asociados a la biodegradación se pueden generar productos de oxidación parcial, que pueden presentar una mayor toxicidad que los productos parentales (Philips y col., 2000). Es importante conocer la evolución de la toxicidad tanto para estudios de riesgo como para la mejora del conocimiento de los procesos de biodegradación y, en consecuencia, certificar que el proceso de biorremediación ha sido beneficioso más allá de la disminución en la concentración de contaminantes (Rahman y col., 2002). Los resultados del test previo en placa de Petri (Tabla 6.10) revelaron que la germinación de las semillas de cebada en el suelo limpio fue cercana al 90%, tanto si éstas eran depositadas sobre el propio suelo, como si se hacía interponiendo papel de filtro entre ellas. Cuando se aplicó el test a los suelos descontaminados mediante 179 Capítulo 6 biorremediación, o al suelo sin descontaminar, se comprobó que la cantidad de semillas germinadas fue menor. Además, se corroboró que los vapores de diésel afectaron a la germinación de las semillas cuando éstas no estaban en contacto directo con el suelo. Tabla 6.10. Test de germinación previo de semillas de Cebada (Hordeum vulgare) en placa de Petri. % semillas germinadas Estrategia Suelo limpio (S.L.) Suelo contaminado (S.C.) Suelo tratado (Bioest. Comp. A) Suelo tratado (Bioest. Comp. B) Suelo tratado (Bioaum. Semanal) Sin papel de filtro Con papel de filtro 93,3 23,1 73,3 88,2 67,6 89,5 15,8 58,8 85,7 59,3 Es importante destacar que durante el periodo de germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica, en este caso derivada del diésel, puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos (Rahman y col., 2002). Entre otras cosas, el HC puede afectar a la raíz de la plántula y alterar su capacidad de absorción de agua y nutrientes (Kuhn y col., 1998). Además, ciertas moléculas de HC pueden penetrar en la planta y dañar las membranas de las células produciendo la ruptura y el bloqueo de los espacios intersticiales y reduciendo la capacidad de transporte de metabolitos y la tasa de respiración (Xu y Johnson, 1995). Este efecto negativo sobre el crecimiento podría ser la causa de que para el suelo contaminado (S.C.), el número de semillas germinadas, y la altura y grosor del tallo, tanto para la cebada como para el trigo, fueran menores que para el resto de pruebas. Muchas de las reacciones y procesos involucrados en la germinación son generales para la gran mayoría de las semillas, por lo que la respuesta de las especies y los datos obtenidos a partir de la aplicación de estas pruebas pueden representar los efectos de la presencia del HC en el suelo (Kuhn y col., 1998). Se observó una respuesta bastante buena en el número de semillas germinadas para los suelos que habían sido tratados mediante cualquiera de los procesos de biorremediación (Figura 6.11), obteniéndose además porcentajes mayores de germinación que en algunos ejemplos encontrados en bibliografía (Molina-Barahona y col., 2005). 180 n º semillas germinadas Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 S. L. S. C. Bioaum. Semanal 1ª semana 2ª semana Bioest. Comp. A Bioest. Comp. B 3ª semana n º semillas germinadas (a) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 S. L. S. C. 1ª semana Bioaum. Semanal 2ª semana Bioest. Comp. A Bioest. Comp. B 3ª semana (b) Figura 6.11. Resultado del test de germinación en el ensayo de fitotoxicidad. (a) Cebada. (b) Trigo. La evaluación del desarrollo del tallo en su longitud y grosor también constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la plántula, lo que puede proporcionar una idea del éxito en la descontaminación del suelo (Molina-Barahona y col., 2005). Este hecho se observó en los datos obtenidos durante la experimentación (Figuras 6.12 y 6.13). Los valores de mayor grosor y longitud del tallo, para los dos cereales, se obtuvieron en los experimentos realizados con el compost A y B, siendo incluso mayores que en los casos en los que se utilizó suelo limpio. Por este motivo, y de acuerdo con Cole y col. (1995), se puede decir que la biorremediación mediante la utilización de compost como agente 181 Capítulo 6 bioestimulante, no sólo ayudó a la descontaminación del suelo, sino que lo enriqueció y le proporcionó unas propiedades finales mejores. 18 Longitud del tallo (cm) 15 12 9 6 3 0 S . L. S . C. 1ª semana B ioaum. S emanal 2ª semana B ioest. Comp. A B ioest. Comp. B 3ª semana (a) 18 Longitud del tallo (cm) 15 12 9 6 3 0 S. L. S. C. 1ª semana Bioaum. Semanal 2ª semana Bioest. Comp. A Bioest. Comp. B 3ª semana (b) Figura 6.12. Resultados de la longitud del tallo en el ensayo de fitotoxicidad. (a) Cebada. (b) Trigo. 182 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 0,4 Esp esor d el tallo (mm) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 S. L. S. C. Bioaum. Semanal 1ª semana 2ª semana Bioest. Comp. A Bioest. Comp. B 3ª semana (a) 0,4 Esp esor d el tallo (mm) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 S. L. S. C. Bioaum. Semanal 1ª semana 2ª semana Bioest. Comp. A Bioest. Comp. B 3ª semana (b) Figura 5.13. Resultados del espesor del tallo en el ensayo de fitotoxicidad. (a) Cebada. (b) Trigo. El hecho de que se produjera una mejora en las condiciones del suelo al final de los tratamientos de biorremediación mediante bioestimulación con compost no resulta extraño, pues son de sobra conocidas las mejoras que el uso de compost supone para el suelo (Haderlein y col., 2006; Gandolfi y col., 2010). Por este motivo, y como conclusión de estas pruebas fitotóxicas, se propone este tipo de bioestimulación para acelerar el proceso de biorremediación del suelo contaminado. Además, la aplicación de este proceso será posible tanto en los casos de tratamiento ex situ como en los casos in situ cuando el vertido sea muy superficial (tratamiento de landfarming); dando salida a ciertos residuos ganaderos industriales que, tras un sencillo tratamiento de compostaje, pueden transformarse en un producto valioso para el proceso de biorremediación de suelos contaminados con HC. 183 Capítulo 6 6.5. CONCLUSIONES Las conclusiones que se derivan de los experimentos de biorremediación realizados en planta piloto se resumen en los siguientes puntos: 1. De manera general los rendimientos de descontaminación observados al cambiar de escala de laboratorio a planta piloto se mantienen en valores similares en porcentaje. Este hecho indica que las condiciones fijadas en los pasos previos son importantes para garantizar el éxito a mayor escala. 2. Todas las estrategias de biorremediación acelerada llevadas a cabo en planta piloto aumentan el rendimiento más del 70% respecto a un simple proceso de atenuación natural tradicional. 3. La estrategia de bioaumento inicial único no mejora el proceso de biorremediación con respecto a las estrategias de bioestimulación convencional. Sin embargo, el continuo aporte de inóculo fresco (bioaumento semanal) aumenta el rendimiento respecto a un tratamiento de bioestimulación con BHB. 4. El uso de compost maduro, como método de bioestimulación, aumenta un 20% los rendimientos de descontaminación con respecto al resto de estrategias. 5. Los experimentos de biorremediación realizados en estado saturado no mejoran significativamente el proceso de descontaminación respecto a los realizados en fase insaturada al 18%. Por ello, se rechaza el estado saturado como óptimo de humedad en el que llevar a cabo los procesos de descontaminación a escala industrial. 6. La utilización de biorreactores giratorios sólo resulta significativamente beneficiosa en la estrategia de bioestimulación respecto al uso de reactores estáticos aireados. De esta forma, la operación en biorreactores giratorios no estaría completamente justificada en un proceso industrial debido a la alta relación coste/eficiencia. 7. El uso de compost maduro, como agente bioestimulante para la biorremediación, ayuda a reducir la toxicidad del suelo tras su tratamiento. Las plántulas de cebada (Hordeum vulgare) y trigo (Triticum aestivum) desarrolladas en el suelo descontaminado con compost presentan un grosor y longitud de tallo mayor que el resto de casos estudiados. Este hecho podría indicar que la descontaminación del suelo con compost es exitosa. 184 Viabilidad de las diferentes estrategias de biorremediación a escala piloto 6.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Anastasi, A., Coppola, T., Prigione, V., Varese, G. G. (2009). Pyrene degradation and detoxification in soil by a consortium of basisiomycetes isolates from compost: role of laccases and peroxidases. J. Hazard Mater. 165:1229-1233. Baldan, E., Basaglia, M., Fontana, F., Shapleigh, J. P., Casella, S. (2015). Development, assessment and evaluation of a biopile for hydrocarbons soil remediation. International Biodeterioration & Biodegradation, 98:66-72. Barker, A. V., Bryson, G. M. (2002). Bioremediation of heavy metals and organic toxicants by composting. The Sci. W. J. 2:407-420. 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Root growth, microbial activity and phosphatase activity in oil-contaminated, remediated and uncontaminated soils planted to barley and field pea. Plant Soil. 173:3-10. 187 188 Capítulo 7 ••••••••• Viabilidad técnica Viabilidad ambiental Viabilidad económica ••••••••• Sostenibilidad integral de la estrategia de biorremediación desarrollada 189 Capítulo 7 Dado el reciente interés en reducir el uso de vertederos como destino final de los suelos contaminados o sus residuos de tratamiento, se evalúa en este capítulo la viabilidad ambiental, técnica y económica de la implementación, a escala industrial, de los procesos de biorremediación propuestos en un Centro de Tratamiento Especializado. 190 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada 7.1. INTRODUCCIÓN Los experimentos realizados en planta piloto confirmaron la posibilidad de recuperación del suelo contaminado con diésel hasta valores superiores al 95%, bajo las estrategias de bioestimulación con compost y bioaumento semanal, en periodos de tiempo relativamente pequeños y, en los casos más desfavorables, hasta el 80%. Por este motivo, se plantean en el presente capítulo dos posibilidades de extrapolación del tratamiento de biorremediación a escala industrial. Por un lado, se evalúa la posibilidad de realizar la descontaminación del suelo mediante la estrategia de bioestimulación utilizando compost maduro como agente estimulante y, por otro, utilizar una estrategia de bioaumento semanal endógeno. Con este análisis se pretende demostrar la conveniencia de realizar una inversión para llevar a cabo la recuperación sostenible de un emplazamiento contaminado mediante su descontaminación en un Centro de Tratamiento Especializado (CTE). Todo ello a través de la evaluación de la sostenibilidad integral de las dos estrategias propuestas. Se entiende por recuperación sostenible aquélla cuyos beneficios netos para la salud humana y el medioambiente son maximizados a través del uso juicioso de los limitados recursos existentes (Conama, 2010). Según distintos grupos de expertos en el ámbito de la gestión y recuperación de suelos contaminados (Conama, 2010), las diferentes aproximaciones a la sostenibilidad en la recuperación de suelos contaminados deben: 1. Minimizar o eliminar el consumo energético, o el de otros recursos naturales. 2. Reducir o eliminar las emisiones al medioambiente, especialmente a la atmósfera. 3. Aprovechar o imitar un proceso natural. 4. Promover la reutilización o reciclaje de los suelos o materiales afectados. 5. Fomentar el uso de técnicas de recuperación que destruyan permanentemente los contaminantes. Sin embargo, la conveniencia de realizar una inversión para el desarrollo de esta actividad sólo será posible si se dispone de los elementos de juicio necesarios para tomar la decisión. En términos generales, son cinco los estudios de viabilidad que deben realizarse para evaluar un proyecto de este tipo (de Lucas y col., 2011): viabilidad 191 Capítulo 7 comercial, técnica, legal, organizacional y financiera. Cualquiera de estos estudios que llegue a una conclusión negativa determinará que el proyecto no se lleve a cabo. La viabilidad comercial de la técnica que se propone viene fijada, principalmente, por la alta demanda de tecnologías sostenibles para la descontaminación de suelos. Las propuestas de biorremediación que se recogen en esta memoria tienen un amplio campo de aplicación, ya que el porcentaje de terreno contaminado por HC es elevado en todos los países industrializados (COM/2006/0231). Tal y como se comentó en el capítulo de Introducción, sólo en España existen más de 4.000 emplazamientos potencialmente contaminados. Actualmente existen algunas empresas que a nivel industrial se dedican a la descontaminación de suelos en España, pero aún pocas tienen implementado el proceso de biorremediación entre sus tecnologías de descontaminación. Esto es debido, principalmente, a que existen limitaciones con respecto a la biodegradación de ciertos compuestos contaminantes y, además, el tiempo de actuación puede ser muy prolongado si no se realiza una optimización previa. Por tanto, se puede decir que la implantación de esta tecnología para la descontaminación de suelos con HC, a escala industrial, puede cubrir un mercado potencial aún por desarrollar. En cuanto a los aspectos legales a tener en cuenta en la implantación de esta tecnología, se destaca un punto importante: la caracterización administrativa del CTE y los permisos necesarios para la instalación y explotación de estas infraestructuras. Actualmente toda la caracterización administrativa está regulada por las comunidades autónomas, así como, los permisos para el transporte de los suelos contaminados. Una vez pasados estos trámites, existe otro aspecto relevante a tener en cuenta: la incorporación al suelo de compuestos perjudiciales para la salud humana o el medioambiente. En este sentido, ninguna de las dos estrategias que aquí se plantean para el tratamiento industrial añade sustancias nocivas al suelo. La estrategia de bioaumento desarrollada no utiliza microorganismos genéticamente modificados y, con respecto a la estrategia de bioestimulación con compost, el único requisito que se debe cumplir es la higienización y el contenido en metales del propio compost (recogido en el RD 865/2010), que fijará su posibilidad de aplicación. Respecto a la viabilidad organizacional se destacan varios puntos: la implementación de ambas estrategias precisa de un conocimiento previo y profundo de diversos ámbitos medioambientales y técnicos, por lo que se necesitarán recursos humanos cualificados que formen parte de un equipo multidisciplinar. También se deben tener en cuenta los recursos materiales: las instalaciones donde se llevarán a cabo los procesos de 192 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada descontaminación, la maquinaria, etc., no destacándose ningún otro punto relevante en este aspecto. Una vez analizada la tecnología de biorremediación desde el punto de vista comercial, legal y organizacional, se concluye que la selección de la mejor tecnología de biorremediación, que permita una recuperación óptima del suelo, debe surgir como consecuencia de los estudios ambientales y técnicos, y de una valoración de los costes del proyecto. Sólo así, se podrá conocer la sostenibilidad real de las estrategias a implantar. 7.2. OBJETIVO El principal objetivo de este capítulo es evaluar la viabilidad de la implementación, a escala industrial, del proceso de biorremediación a través de las estrategias de bioaumento semanal y bioestimulación con compost maduro propuestas. Las etapas planteadas son: 1. Diseñar un proceso de biorremediación a escala industrial mediante las dos estrategias de biorremediación propuestas y estudiar su viabilidad técnica. 2. Evaluar los daños más importantes que el desarrollo del proyecto puede causar al medio ambiente y cómo, a su vez, éste puede influir sobre el (1) proyecto . 3. Evaluar la viabilidad económica de la implantación industrial de la técnica de biorremediación a través de cualquiera de las dos estrategias. 7.3. VIABILIDAD TÉCNICA Antes de decidir si se ha de proceder a la descontaminación de un suelo mediante la tecnología de biorremediación, se debe demostrar primero la efectividad de esta técnica sobre el terreno. Para ello, siendo rigurosos, deberían llevarse a cabo las siguientes fases (Sánchez y Gallego, 2005): 1 No es objeto de este estudio evaluar todos los daños y sus consecuencias, siendo eso objeto de la Evaluación de Impacto Ambiental a la que este tipo de proyectos estaría sujeta. Sólo se pretende realizar una breve descripción de los puntos más sensibles. 193 Capítulo 7 Fase 1: Realizar una revisión bibliográfica para obtener datos sobre la biodegradabilidad potencial de los contaminantes del emplazamiento y conocer la existencia de casos similares. Fase 2: Tomar muestras y analizar la presencia de microorganismos con capacidad degradadora de la contaminación del emplazamiento, analizar el tipo de suelo, realizar un estudio geotécnico e hidrogeológico y un análisis de riesgos. Fase 3: Desarrollar ensayos de trazabilidad a escala de laboratorio que permitan predecir las posibilidades de biorremediación, diseñar las condiciones experimentales óptimas y evaluar la tecnología a aplicar más recomendable. Posteriormente, realizar ensayos a escala planta piloto para comprobar la validez del escalado de la estrategia propuesta. Fase 4: Realizar un estudio previo de campo para controlar al máximo las condiciones ambientales, que siempre diferirán de las del laboratorio. Diseñar e implementar métodos de muestreo adecuados para poder realizar evaluaciones estadísticas fiables y evaluar los riesgos de la metodología a implantar para el medio aceptor. Fase 5: Finalmente, hay que llevar a cabo el seguimiento y análisis cuantitativo del proceso de biorremediación durante todo su desarrollo para evaluar la efectividad de la técnica escogida. Es necesario remarcar que, el nivel de descontaminación que el proceso debe alcanzar, vendrá fijado por el resultado del análisis de riesgos que se haya llevado a cabo previamente. Las técnicas más recientes de evaluación de suelos contaminados se fundamentan en la metodología de análisis de riesgo ASTM E1739/95, basada en el riesgo que presentan para la salud humana y el medio ambiente la sumatoria de riesgos individuales que exhiben los agentes químicos presentes en el sitio contaminado. El resultado de este análisis es la cantidad de contaminante por debajo del cual no existe daño, que vendrá estipulado, principalmente, por los valores de referencia y la legislación ambiental correspondiente. Una vez conocida realmente la posibilidad técnica de aplicación de la tecnología, el modelo de explotación que se propone considera la opción de una empresa que empieza a desarrollar esta actividad a escala industrial y, para tal fin, construye un CTE de suelos contaminados con una capacidad para descontaminar de 2.250 t de suelo al año. Es necesario apuntar que, en el caso de la estrategia de bioestimulación con 194 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada compost, la capacidad de tratamiento se ve reducida a 1.875 t de suelo, considerando el volumen y peso del propio compost y también que ambas estrategias muestran rendimientos muy similares para un periodo de 4 meses de tratamiento. Respecto a la construcción del CTE, éste deberá estar situado en un polígono 2 industrial y consistirá en un recinto cerrado con una zona de 1.000 m , impermeabilizada acorde a legislación, evitando una posible propagación de los contaminantes por lixiviación al terreno. Entre los pasos previos a seguir en el tratamiento de descontaminación, y que también es común para las dos estrategias propuestas, se recogen los siguientes: 1. Excavar el suelo a tratar sin perjuicio de las zonas aledañas e invirtiendo los mejores medios disponibles. Para ello es recomendable delimitar bien la zona afectada y señalar aquellos puntos de mayor sensibilidad (especies de fauna y flora protegidas, puntos de accesos a otras instalaciones, pozos para extracción de agua subterránea, etc.). 2. Transportar el suelo excavado al CTE mitigando, en la medida de lo posible, los impactos ambientales que pudieran surgir de esta actividad. 3. Formar biopilas con el suelo excavado en el CTE según el esquema de la Figura 7.1. Las dimensiones recomendadas de las biopilas, según bibliografía (Toffoletto y col., 2005), son: 10-20 m de largo, 4-6 m de ancho y 3-4 m de alto. Agua Sistema dispensador de líquidos Suelo contaminado Aire Sistema de aireación 10-20 m Membrana impermeable (asfalto, grava, arcilla) Figura 7.1. Esquema de formación de una biopila para tratamiento por biorremediación. Modificado de Toffoletto y col. (2005). 195 Capítulo 7 A continuación, se presentan los puntos más importantes y los equipos necesarios en la implementación de las dos estrategias elegidas para llevar a cabo el tratamiento mediante biorremediación. En el Anexo IV se recoge el dimensionamiento realizado para el CTE, así como, la estimación de los consumos auxiliares. 7.3.1. Implementación de la estrategia de bioaumento semanal (Estrategia A) El bioaumento que se propone en esta memoria es un bioaumento semanal, de tal manera que el cultivo inoculado se mantiene activo en el suelo al ir repoblándolo periódicamente. Tal y como se seleccionó en el capítulo 5 de esta memoria, el cultivo utilizado como bioaumento debe ser el endógeno del propio suelo contaminado, es decir, se debe realizar un paso previo de aislamiento del cultivo microbiano presente para enriquecerlo, posteriormente, en el sustrato contaminante. Por este motivo, la implementación de esta estrategia conlleva tres pasos importantes: 1. Aislar y extraer el cultivo microbiano del propio suelo contaminado. Siguiendo con la metodología llevada a cabo en esta investigación, el aislamiento se realizaría a partir de una muestra de 30 kg del suelo 3 contaminado en un tanque de mezcla de 0,4 m de capacidad, al que se le 3 añaden 0,3 m de agua a temperatura ambiente (20-25 °C). Tras un tiempo de mezcla de 24 h, se dejará reposar la suspensión, y el agua sobrenadante 3 (aproximadamente 0,03 m ) se utilizará como inóculo inicial para el proceso de enriquecimiento. 2. Enriquecer el inóculo inicial en el sustrato contaminante. Esta fase se corresponde con la de aclimatación y adaptación al consumo del contaminante, con la finalidad de potenciar la capacidad biodegradadora del cultivo. Para ello, en un biorreactor tipo fermentador de mezcla continua con burbujeo de aire y aislado del exterior (temperatura interior mínima de 20 3 °C), se adicionarán los 0,3 m de inóculo inicial. Además, es necesario 3 añadir agua (4 m ) enriquecida en N y P (se propone añadir KNO3 y (NH4)2HPO4 o un agua residual rica en estos compuestos). Por último, es necesario adicionar el sustrato contaminante. 3. Re-inocular el cultivo enriquecido en el suelo contaminado. Una vez crecido y aclimatado el cultivo durante una semana, se detienen el burbujeo y la agitación y se deja reposar el cultivo, de tal manera que, por diferencia de densidades, el HC residual quedará en la parte superior del líquido, y servirá de inóculo para la siguiente tanda de inoculación. A continuación, se vaciará 196 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada el biorreactor por la parte de abajo y se procederá al regado de la superficie de la pila mediante un sistema de riego como el que se propone en la Figura 7.2. Las instalaciones necesarias para llevar a cabo todo el proceso de aislamiento y enriquecimiento consisten principalmente en: un tanque de mezcla suelo-agua (C-02) con agitación rotacional y palas mezcladoras para realizar el aislamiento, un sedimentador (S-01) donde realizar la separación de las partículas de suelo del sobrenadante con el inóculo, y uno o varios biorreactores (R-01, R-02, R-03) de mezcla continua para cultivo microbiano. Aire Soplante K-02 Agua de red S-01 Sedimentador Aire Batería de Biorreactores Soplante K-01 Bomba inoculación P-02 Suelo contaminado Rechazo R-01 R-02 R-03 P-03 Bomba trasiego C-02 Tanque de mezcla Bomba alimento P-01 Membrana impermeable (asfalto, grava, arcilla) P-04 Bomba recogida lixiviados Figura 7.2. Diagrama simplificado de la planta industrial para tratamiento de suelos contaminados por biorremediación bajo la estrategia de bioaumento semanal (Estrategia A). 7.3.2. Implementación de la estrategia de bioestimulación con compost maduro (Estrategia B) La implementación de esta estrategia conlleva una fase previa de adquisición del compost que se va a utilizar en el proceso de descontaminación. Actualmente, existe un 197 Capítulo 7 mercado bastante amplio en torno a este producto de procedencia ecológica como el utilizado en el capítulo 6 de la presente memoria. Un compost con las características deseadas, producido a partir de restos vegetales y residuos agroindustriales tiene un precio alrededor de 30 € t -1(2) . La cantidad de compost necesaria para llevar a cabo el proceso de biorremediación, fijada en el capítulo 6, es de, aproximadamente, 1 t de compost por cada 5 t de suelo a tratar. A todo ello hay que sumar el transporte de este producto hasta el CTE, para lo cual se debe hacer un estudio de mercado de los puntos de producción más cercanos. Al no existir inoculación directa de un cultivo, la planta de tratamiento quedaría más simplificada que la anterior (Figura 7.3). Aire Soplante K-01 Agua de red Bomba alimento P-01 C-01 Tanque pulmón Membrana impermeable (asfalto, grava, arcilla) P-04 Bomba recogida lixiviados Figura 7.3. Diagrama simplificado de la planta industrial para tratamiento de suelos contaminados por biorremediación bajo la estrategia de bioestimulación con compost (Estrategia B). Puede decirse que, aparte de las especificaciones técnicas comentadas, no existen otras especificaciones finales para el proceso de biorremediación por cualquiera de las dos estrategias planteadas. La única exigencia consistiría en prestar especial atención a la distribución y mezcla de los productos (inóculo o compost) por todo el suelo a tratar, la 2 www.cogersa.es. Accedido el 15 de Octubre de 2015. 198 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada cual debe realizarse de una manera homogénea. En base a esto último, se hace necesario disponer de una máquina tractora que voltee semanalmente las biopilas formadas. Con el fin de determinar la evolución en la descontaminación del suelo, se plantea el envío semanal de doce muestras de suelo, tres de cada biopila, a un laboratorio acreditado para la determinación de la concentración de TPH. 7.4. VIABILIDAD AMBIENTAL Los rigurosos análisis ambientales actuales y las Evaluaciones de Impacto Ambiental a la que están sometidos estos proyectos, permiten identificar medidas de control para eliminar, mitigar o compensar los impactos negativos de la actividad que se plantea desarrollar. Con ellos, se busca una armonía o equilibrio aceptable desde el punto de vista de carga ambiental, entre el desarrollo y ejecución del proyecto, la salud pública y el medio físico, biótico y socio-cultural del espacio geográfico donde se desea implementar el proceso. Cada proyecto de descontaminación que se plantea requiere de una Evaluación de Impacto Ambiental (EIA) propia, que abarque y estudie todas las peculiaridades de su entorno. No es objeto de este estudio realizar o sustituir a una EIA, sino que, de manera general, se pretende plantear unos aspectos comunes y sensibles de este tipo de proyectos. Así, en este apartado se identifican, de forma muy simplificada, tres puntos sensibles atribuidos a un proyecto de biorremediación de suelos que pueden producir impactos potenciales en el entorno. a. Requisitos ambientales específicos para el Centro de Tratamiento Especializado Entre los diversos requisitos merecen una atención especial: - Ubicación del CTE. - Riesgos de afección y dispersión de la contaminación en el subsuelo. Atendiendo a una geología e hidrogeología adecuada, definiendo las barreras de contención secundaria, canalizando los lixiviados, etc. Deben garantizarse oficialmente las medidas tomadas para su impermeabilización. 199 Capítulo 7 b. Regulación del transporte Inicialmente el suelo contaminado está calificado como residuo peligroso y, como tal, el transporte debe realizarse bajo una serie de precauciones (lixiviados, derrames, impactos sobre zonas sensibles, etc.) desde el lugar de origen hasta el propio CTE. Éste, además, debe estar próximo o bien comunicado con los lugares de origen, tanto del emplazamiento contaminado como del productor del compost, minimizando, en la medida de lo posible, la huella ecológica del proceso. c. Ubicación de los suelos tratados Una vez conseguidos los objetivos para su desclasificación como suelo contaminado, es necesario buscar una ubicación a esas tierras. Será indispensable identificar, regular y fomentar nuevos usos para dar salida a estas tierras descontaminadas, contemplando, asimismo, la posible devolución al lugar de origen o su reutilización en lugares distintos (cementeras, material de relleno en canteras, etc.), para, en la medida de lo posible, minimizar su disposición en vertedero. 7.5. VIABILIDAD ECONÓMICA Una vez diseñadas las estrategias desde el punto de vista técnico y ambiental, el aspecto económico adquiere un papel fundamental. En su análisis es necesario prestar atención tanto a la inversión (todos aquellos gastos anteriores a la puesta en marcha de la actividad) como a los costes de operación y mantenimiento (derivados del funcionamiento de la misma), pues de todos ellos dependerá la economía global del proceso. El procedimiento que seguidamente se presenta tiene en cuenta las dos alternativas de tratamiento propuestas, bioaumento semanal (Estrategia A) y bioestimulación con compost (Estrategia B). Sin embargo, previo a la aplicación del método de estimación, es necesario evaluar el coste de los equipos del proceso, tanto de las partes comunes como los específicos de cada estrategia. A continuación, se citan (Tabla 7.1) los equipos implicados en el proceso de tratamiento, para las estrategias A y B, y su coste. En el Anexo IV se detallan las características de cada uno de ellos, considerando un dimensionamiento para una planta de tratamiento de 2.250 y 1.875 t de suelo contaminado al año para la Estrategia A y B, respectivamente. 200 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada Tabla 7.1. Listado de equipos utilizados en la planta de tratamiento de suelos contaminados. Estrategia Identificación equipo Descripción de equipo Coste (€2015) B C-01 Tanque pulmón 1.000 € A C-02 Tanque de mezcla suelo-agua 1.250 € A/B K-01 Compresor 1.320 € A K-02 Compresor 550 € A/B P-01 Bomba alimento 500 € A P-02 Bomba de inoculación 500 € 540 € A P-03 Bomba de trasiego A/B P-04 Bomba de lixiviados 160 € A R-01/02/03 Batería de Biorreactores 1.800 € A S-01 Sedimentador 500 € 7.5.1. Estimación del importe total de la inversión El importe de la inversión engloba todos los gastos derivados de la inversión inicial, pudiendo establecer una división entre el activo fijo o inmovilizado y el capital circulante. La suma de ambos proporciona el capital total de inversión. El capital inmovilizado está constituido por las inversiones necesarias para disponer de los bienes de producción. Se distingue entre el inmovilizado tangible, el material y las inversiones financieras a largo plazo, encontrando partidas como las destinadas a la instalación de equipos de proceso y de los elementos necesarios para la operación, es decir, tuberías, instrumentación y soportes, servicios auxiliares, precio del suelo, gastos de ingeniería, licencias y permisos, y gastos de construcción, entre otras. Por su parte, el circulante es el capital destinado a poner en movimiento y asegurar el rendimiento del capital inmovilizado, más la provisión del dinero necesaria para hacer frente a cualquier eventualidad (Vian, 1975). En la presente memoria, la inversión se estima mediante el método de los porcentajes, que se basa en una estimación de la partida de los equipos a instalar y, a partir de ésta, calcular cada una de las partidas del inmovilizado como un tanto por ciento de la de equipos. Es necesario recalcar que, la fiabilidad de este método se encuentra en torno al ± 20-30% (Peters y Timmerhaus, 1991). En la Tabla 7.2 se recogen las diferentes partidas analizadas, así como, el porcentaje respecto al coste de los equipos que debe aplicarse a cada una de ellas. En este caso de estudio, se decide hacer dos apartados de obra civil, edificios e impermeabilización, fuera de la partida de materiales, y se reflejan en base a presupuesto. Esto es debido a que significan un coste elevado respecto al de equipos. 201 Capítulo 7 Tabla 7.2. Método de los porcentajes basado en el coste de los equipos de proceso. Partida Porcentaje establecido Coste de equipos (E) Materiales (M) Estrategia A Inversión (€) Estrategia B Inversión (€) 100 7.120 € 2.980 € 70% E 4.984 € 2.086 € Tuberías y estructuras 55% 2.741 € 1.147 € Instrumentación 20% 997 € 417 € Electricidad 20% 997 € 417 € Aislamiento 15% 748 € 313 € 598 € 250 € Obra civil: edificios Otros (150 € m-2) 12% 225.000 € 225.000 € Obra civil: impermeabilización (100 € m-2) 100.000 € 100.000 € Suelo (20 € m-2) 34.000 € 34.000 € Ingeniería de detalle 45% (E+M) 5.447 € 2.280 € Construcción Supervisión de la construcción 60% (E+M) 10% (E+M) 7.262 € 1.210 € 3.040 € 507 € TOTAL ÁREA DE PROCESO ISBL (Inside Battery Limits) 391.104 € 372.437 € Servicios auxiliares 4% ISBL 15.644 € 14.897 € Off sites 8% ISBL 31.288 € 29.795 € Gastos de puesta en marcha 3,5% ISBL 13.689 € 13.035 € Contingencias e imprevistos 5% Total 19.555 € 18.622 € 471.280 € 448.786 € CAPITAL INMOVILIZADO A continuación se recoge una tabla resumen (Tabla 7.3) con el cálculo del capital total de inversión, detallando el coste de los equipos, el capital inmovilizado y el circulante para las dos alternativas de tratamiento: bioaumento semanal (Estrategia A) y bioestimulación con compost (Estrategia B). El capital circulante, necesario para iniciar la actividad industrial, suele oscilar entre el 10 y el 30% del inmovilizado (de Lucas y col., 2011). Tabla 7.3. Evaluación de la inversión de acuerdo al método de los porcentajes. Partidas - Estrategia A - Estrategia B 2.980 € - Estrategia A 471.280 € - Estrategia B 448.786 € Capital Circulante (15 % Cap. Inmov.) - Estrategia A 70.692 € - Estrategia B 67.318 € CAPITAL TOTAL DE INVERSIÓN - Estrategia A 541.972 € - Estrategia B 516.104 € Costes de equipo Capital inmovilizado 202 (€2015) 7.120 € Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada 7.5.2. Costes de operación Los costes de operación pueden dividirse en costes directos e indirectos. Dentro de los primeros se encuentra el precio de las materias primas y de la mano de obra directa, mientras que los segundos pueden resumirse en los que se detallan a continuación: - Electricidad para los equipos: compresores, bombas y biorreactores. - Alquiler de máquina tractora para volteo. Se estima su utilización durante 10 h semanales. - Mantenimiento, reparaciones y suministros. Calculado como un 3% del capital inmovilizado. - Transporte del suelo contaminado y el compost al CTE. Se estima un radio de trabajo de 200 km. En la Tabla 7.4 se resumen los costes de operación para las estrategias propuestas haciendo referencia a las toneladas de suelo contaminado alimentado a planta y también al coste operativo durante el segundo y tercer año y resto de años sucesivos. Tabla 7.4. Resumen de los costes de operación. (€ t-1) Partidas 2016-2017 (€ año-1) 2018-2022 (€ año-1) 2023-2030 (€ año-1) Materias auxiliares - Estrategia A Estrategia B 1,74 € 7,60 € 2.937 € 10.254 € 3.917 € 13.671 € 3.917 € 13.671 € Mano de obra directa - Estrategia A Estrategia B 25,34 € 30,41 € 57.024 € 57.024 € 57.024 € 57.024 € 57.024 € 57.024 € Transporte (200 km) - Estrategia A Estrategia B 8,00 € 9,60 € 13.500 € 13.505 € 18.000 € 18.007 € 18.000 € 18.007 € Alquiler máquina de volteo - Estrategia A Estrategia B 3,47 € 5,20 € 7.800 € 9.750 € 7.800 € 9.750 € 7.800 € 9.750 € Análisis en laboratorio externo - Estrategia A Estrategia B 13,87 € 16,64 € 23.400 € 23.400 € 31.200 € 31.200 € 31.200 € 31.200 € Electricidad - Estrategia A Estrategia B 6,98 € 3,94 € 11.785 € 5.538 € 15.713 € 7.384 € 15.713 € 7.384 € Mantenimiento (3 % Inmov.) - Estrategia A Estrategia B 6,28 € 7,18 € 10.604 € 10.098 € 14.138 € 13.464 € 14.138 € 13.464 € Impuestos - Estrategia A Estrategia B 1,05 € 1,20 € 2.356 € 2.244 € 2.356 € 2.244 € 2.356 € 2.244 € TOTAL - Estrategia A Estrategia B 66.73 € 81,46 € 129.407 € 131.813 € 150.149 € 152.744 € 150.149 € 152.744 € 203 Capítulo 7 Se entiende que el primer año la planta se encontrará en construcción y no existirán costes de operación, y que durante el segundo y tercer año la planta trabajará al 75% de su capacidad, aumentando al 100% los años sucesivos. Además, se ha incluido una nueva partida correspondiente a los impuestos, como son la contribución urbana y los arbitrios sobre la riqueza provincial, que se estima como el 0,5% del inmovilizado. En el Anexo IV se recoge el cálculo detallado de cada una de las partidas referentes a los costes de operación. 7.5.3. Análisis de Rentabilidad. Calculado el capital total de inversión y el coste operativo de la planta, es necesario determinar el precio mínimo del tratamiento de descontaminación en el que el proceso sea rentable. Para su determinación se consideran los siguientes criterios económicos: - La cantidad total a financiar, suma del capital inmovilizado y el circulante, se soporta por un socio o socios capitalistas, que contribuyen con una inversión del 25% del total, siendo necesario el apalancamiento con una entidad financiera del 75% restante. La financiación del crédito se realizará durante 7 años con un interés del Euribor (6 meses) + 2,35%, con dos años de carencia para la construcción y puesta en marcha del proyecto. - Amortización de 15 años para maquinaria e instalaciones. - IVA soportado por gastos de explotación y por inversiones posteriores a las de partida del 21%. - Porcentaje de tratamiento del suelo de un 75% de las posibilidades totales de la instalación durante el segundo y tercer año, que aumenta al 100% el cuarto. - i. Tipo impositivo medio del 35% para la Hacienda Pública. Cuenta de resultados Atendiendo a las dos estrategias propuestas y de acuerdo a los criterios económicos anteriormente expuestos, la cuenta de resultados de los procesos de descontaminación de suelos descritos en esta memoria se detallan en la Tabla 7.5. De sus resultados puede identificarse la situación económica de la empresa para ambas estrategias y su evolución a lo largo de 15 ejercicios económicos. Se observa que a partir del cuarto año se empieza a recuperar la inversión para ambas estrategias de biorremediación. 204 Es tr ategi a A Es tr ategi a B 2015 € - € - Fondos generados - € € 44.193 € 12.774 € € - - RESULT ADO NET O Fondos generados € € € - - - - 61.145 € 42.175 € 29.919 € 72.094 € 131.813 € 203.906 € 44.193 € 44.193 € 12.774 € 6.878 € 19.652 € 64.210 € 83.862 € 31.419 € 115.281 € 129.407 € 244.688 € 2018 6.640 € - 6.640 € € 17.588 € 17.588 € 17.588 € € - 12.331 € - 12.331 € € - € - 18.970 € - 18.970 € - 89.757 € - 179.515 € - 229.244 € - Movimiento de fondos - Impuestos 61.145 € Gastos financieros EBT 42.175 € 29.919 € Amortización EBIT 72.094 € EBITDA € 131.813 € - 203.906 € € Costes - Ventas 67.318 € 179.515 € 179.515 € 246.833 € 89.757 € 179.515 € Fondos invertidos 89.757 € - 94.256 € - 188.512 € - 215.012 € € € Capital circulante Capital inmovilizado Movimiento de fondos - 6.878 € RESULT ADO NET O € - Impuestos - 19.652 € EBT € 64.210 € - Gastos financieros 83.862 € EBIT 115.281 € EBITDA 31.419 € 129.407 € Costes Amortización 244.688 € Ventas 70.692 € 188.512 € 2017 188.512 € 259.204 € 94.256 € 2016 188.512 € Fondos invertidos 94.256 € Capital circulante Capital inmovilizado Ejerc ic io ec onómic o 48.162 € 48.162 € 18.243 € 9.823 € 28.067 € 61.145 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 152.744 € 271.875 € 83.726 € 83.726 € 52.307 € 28.165 € 80.472 € 64.210 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 150.149 € 326.250 € 2019 48.162 € 48.162 € 18.243 € 9.823 € 28.067 € 61.145 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 152.744 € 271.875 € 83.726 € 83.726 € 52.307 € 28.165 € 80.472 € 64.210 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 150.149 € 326.250 € 2020 2022 31.419 € 83.726 € 83.726 € 52.307 € 28.165 € 80.472 € 64.210 € 48.162 € 48.162 € 18.243 € 9.823 € 28.067 € 61.145 € 89.212 € 29.919 € 48.162 € 48.162 € 18.243 € 9.823 € 28.067 € 61.145 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 119.131 € 152.744 € 152.744 € 271.875 € 271.875 € 83.726 € 83.726 € 52.307 € 28.165 € 80.472 € 64.210 € 144.682 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 176.101 € 150.149 € 150.149 € 326.250 € 326.250 € 2021 48.162 € 48.162 € 18.243 € 9.823 € 28.067 € 61.145 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 152.744 € 271.875 € 83.726 € 83.726 € 52.307 € 28.165 € 80.472 € 64.210 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 150.149 € 326.250 € 2023 87.907 € 87.907 € 57.988 € 31.224 € 89.212 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 152.744 € 271.875 € 125.462 € 125.462 € 94.044 € 50.639 € 144.682 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 150.149 € 326.250 € 2024 87.907 € 87.907 € 57.988 € 31.224 € 89.212 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 152.744 € 271.875 € 125.462 € 125.462 € 94.044 € 50.639 € 144.682 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 150.149 € 326.250 € 2025 … 87.907 € 87.907 € 57.988 € 31.224 € 89.212 € 89.212 € 29.919 € 119.131 € 152.744 € 271.875 € 125.462 € 125.462 € 94.044 € 50.639 € 144.682 € 144.682 € 31.419 € 176.101 € 150.149 € 326.250 € 2030 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada Tabla 7.5. Cuenta de resultados en el análisis económico de las estrategias de bioaumento semanal (Estrategia A) y bioestimulación con compost (Estrategia B). 205 Capítulo 7 Los resultados mostrados en la Tabla 7.5 hacen referencia a un precio de servicio de 145 € por tonelada de suelo contaminado. Se propone el mismo precio de servicio para ambas estrategias con el fin de comparar su rentabilidad. En la Figura 7.1 se representan los flujos de fondos para las Estrategias A y B, mostrando su evolución durante 15 años de ejercicio económico. En ambos casos se observa la misma tendencia de flujos; todo ello debido a las condiciones financieras establecidas. El análisis del flujo de fondos muestra una mayor recuperación de la 150.000 € 100.000 € 100.000 € 50.000 € 50.000 € -50.000 € Año -100.000 € -150.000 € 0€ -50.000 € Año -100.000 € -150.000 € -200.000 € -200.000 € Estrategia B Estrategia A -250.000 € 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022 2023 2024 2025 2026 2027 2028 2029 2030 0€ Flujo de fondos (€) 150.000 € 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022 2023 2024 2025 2026 2027 2028 2029 2030 Flujo de fondos (€) inversión en el desarrollo de la Estrategia A. -250.000 € Figura 7.1. Flujo de fondos actualizados para las Estrategias A y B. Conocidas las cuentas de pérdidas y ganancias de ambas estrategias, se recurre al análisis de los métodos actualizados en el tiempo. Los más comúnmente empleados para la evaluación de la rentabilidad de las inversiones son: el Valor Actual Neto (VAN) y la Tasa Interna de Retorno (TIR). ii. VAN El Valor Actual Neto (VAN) de una inversión es el valor actualizado de todos los flujos esperados (Ecuación 7.1.). [Ecuación 7.1] Donde Ft son los flujos de fondo (diferencias entre cobros y pagos) existentes en cada uno de los n años de duración del proyecto y k es el tipo de interés de referencia. 206 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada Para el cálculo del VAN es importante definir bien el tipo de interés de referencia “ k” utilizado. Su valor debe estar relacionado con el uso alternativo o el coste de utilización del dinero por parte del inversor (de Lucas y col., 2011): - Si el proyecto se financia con fondos propios: mínimo retorno esperado por los accionistas. - Si el proyecto se financia con fondos externos: tipo de interés medio de las fuentes de financiación de la empresa. Conocidos estos criterios, el tipo de interés “k” seleccionado es del 5,5%. En base a esto, el valor del VAN para cada una de las estrategias, calculado según la ecuación [7.1], se recoge en la Tabla 7.6. Tabla 7.6. Valor Actual Neto para cada una de las estrategias propuestas. Estrategia VAN A: Bioaumento semanal 340.585 B: Bioestimulación con compost 49.768 Por debajo de un precio de servicio de 145 € por tonelada de suelo contaminado, el VAN es negativo para la Estrategia B y, por tanto, la inversión no tendría sentido. iii. TIR La Tasa Interna de Retorno (TIR) mide la bondad económica de un proyecto en términos relativos; es decir, plantea el cálculo del excedente monetario que produce un proyecto como porcentaje. Equivale al tipo de interés anual con que los fondos generados retribuyen a los fondos invertidos (Ecuación 7.2). n Σt=0 0 [Ecuación 7.2] Donde Ft son los flujos de fondo (diferencias entre cobros y pagos) existentes en cada uno de los n años de duración del proyecto e “i” es la TIR. La viabilidad de ambos proyectos queda demostrada al obtener un valor de la Tasa Interna de Retorno del 13,51 y 6,81% respectivamente, para las Estrategias A y B. En 207 Capítulo 7 caso de elegir una estrategia para realizar la inversión, la más recomendable, por su mayor rentabilidad, es la Estrategia A, aquella que realizaba el bioaumento semanal. iv. Análisis de sensibilidad Existen numerosos factores que pueden modificar la rentabilidad de los procesos planteados. Por tanto es recomendable estudiar cómo afectan éstos a la economía del proyecto, en lo que se denomina análisis de sensibilidad. Dicho análisis aporta información sobre lo que ocurriría en el caso de que determinadas partidas sufran variaciones sobre las estimaciones inicialmente realizadas. En este estudio económico se analiza el efecto de la variación de ± 10% del coste del capital inmovilizado, ± 10% del coste operativo y ± 5% del tipo de interés de devolución del préstamo. En la Figura 7.2 se muestra la evolución del TIR respecto a la variación porcentual de los factores antes mencionados. Se observa que la variación del tipo de interés no ejerce un peso importante en la estimación del proyecto; sin embargo, los costes operativos del proyecto pueden alterar de manera sensible la rentabilidad del mismo, así como, algún cambio en el capital inmovilizado. 20 Estrategia B 15,4 14,5 13,8 10 14,713,6 13,913,6 13,6 13,5 13,5 13,5 13,5 13,5 13,1 13,2 12,4 12,6 11,6 12,1 15 13,4 TIR (%) 15,2 15 TIR (%) 20 Estrategia A 9,1 10 8,1 8,2 7,6 5 7,1 5 6,9 7,3 6,8 Coste Operativo -10% -6% -2% Tipo de Interés 0% Desviación 2% 6% 6,8 6,8 6,8 6,4 5,7 0 Capital Inmovilizado 4,5 Coste Operativo -10% -6% -2% Tipo de Interés 0% 2% 6% 10% Figura 7.2. Evolución del TIR calculado a partir del análisis de sensibilidad para las Estrategias A y B. 208 6,8 5,4 6,1 Desviación 10% 6,8 6,8 6,6 Capital Inmovilizado 0 6,9 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada 7.6. CONCLUSIONES Previo a la implantación de un proceso industrial, es necesario evaluar todos los aspectos que influyen en su desarrollo. En este capítulo se han analizado aquellos aspectos considerados como los más relevantes en la sostenibilidad integral de la técnica de biorremediación, bajo dos estrategias propuestas, bioaumento semanal y bioestimulación con compost maduro. Desde el punto de vista comercial, legal y organizacional, no se han observado impedimentos relevantes en la implantación de cualquiera de las dos estrategias de biorremediación planteadas. Se han considerado los aspectos técnicos, ambientales y económicos, como los determinantes para la evaluación integral. Respecto a los aspectos técnicos se concluye: 1. Es necesario demostrar la efectividad de la técnica previo a la implantación para asegurar el éxito del proceso de biorremediación. 2. La realización del análisis de riesgos determinará el grado de descontaminación. 3. La implantación de cada estrategia de biorremediación debe plantearse individualmente para valorar sus posibilidades técnicas y evaluar los recursos necesarios. Es en este sentido en el que, la estrategia de bioaumento semanal requiere mayores medios y recursos. Respecto a los aspectos ambientales especificados, sin ser objeto de sustituir la EIA, se concluye: 4. Los impactos ambientales derivados de la actividad deben estudiarse y evaluarse con minuciosidad para ser reducidos al máximo, así como, todos los riesgos de afección y dispersión de la contaminación posibles. 5. La construcción de un CTE debe realizarse con garantías oficiales y probadas de impermeabilización, atendiendo a una geología e hidrogeología adecuada, definiendo las barreras de contención secundaria, canalizando los lixiviados, etc. 6. El riesgo que supone el transporte del suelo inicialmente contaminado, obliga a tomar una serie de precauciones. El CTE debe estar próximo y bien comunicado con los lugares de origen, para minimizar, en la medida de lo posible, la huella ecológica del proceso. 209 Capítulo 7 Respecto a los aspectos económicos se concluye: 7. El precio de servicio establecido debe ser de 145 € por tonelada de suelo contaminado. Por debajo de esta cifra, el VAN es negativo para la Estrategia B y por tanto, la inversión no tendría sentido. 8. La viabilidad económica de ambos proyectos se verifica al obtener un valor de la Tasa Interna de Retorno del 13,51 y 6,81% respectivamente, para las Estrategias A y B. En caso de elegir una estrategia para realizar la inversión, la más recomendable, por su mayor rentabilidad, es la Estrategia A, aquella que realiza un bioaumento semanal. 9. Del análisis de sensibilidad financiera se concluye que la variación del tipo de interés no ejerce un peso importante en la estimación económica del proyecto; sin embargo, el capital inmovilizado y los costes operativos de las técnicas planteadas pueden alterar de manera sensible la rentabilidad del proyecto. 210 Sostenibilidad integral de la tecnología de biorremediación desarrollada 7.7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASTM E1739/95. (2010). Standard Guide for Risk-Based Corrective Action Applied at Petroleum Release Sites. West Conshohocken, Pennsylvania, USA. Conama. (2010). Memoria grupo de trabajo de suelos contaminados: Estado de la gestión de los suelos contaminados en España y necesidad de mejoras . X Congreso Nacional de medio ambiente. Madrid, España. 15 de Noviembre de 2010. www.conama10.es COM/2006/0231. 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El pronóstico económico en química industrial. Alhambra. Madrid, España. 211 212 Capítulo 8 ••••••••• ••••••••• Conclusiones generales 213 Capítulo 8 214 Conclusiones generales De los resultados obtenidos en esta investigación, se pueden extraer las siguientes conclusiones generales: 1. Los consorcios microbianos aislados de suelos, ya sea contaminados o sin contaminar, muestran eficacias altas y muy similares en los experimentos de biodegradación de diésel en fase líquida, dando a entender que el proceso de adaptación y aclimatación utilizando medios de cultivo con diésel, como única fuente de carbono, permite desarrollar consorcios parecidos y con alta capacidad hidrocarburolítica. En la mayoría de estos experimentos se alcanzan porcentajes de eliminación superiores al 80% en un tiempo de tratamiento aproximadamente de 40 h. El modelo matemático desarrollado reproduce aceptablemente los resultados obtenidos. 2. Los consorcios microbianos desarrollados a partir de medios de cultivo con diésel, como única fuente de carbono, son capaces de producir biosurfactantes durante la etapa exponencial del crecimiento microbiano para favorecer la biodisponibilidad. Se observa que una mayor producción de biosurfactantes da lugar a un mayor porcentaje de eliminación de diésel y una mayor velocidad de consumo. 3. El estudio del proceso de biorremediación en laboratorio revela que la disponibilidad del contaminante es un factor determinante en la elección de la estrategia a seguir. La estrategia de bioaumento resulta exitosa cuando el contaminante es de fácil acceso (lo que ocurría en el caso del suelo arcilloso) mientras que, cuando la disponibilidad es limitada (caso del suelo limoso), una estrategia de bioestimulación a través de la promoción de consorcios endógenos puede ser más eficiente. Por otro lado, la obtención de un intervalo de humedad óptimo es necesario para garantizar la descontaminación a una mayor escala para cada tipo de suelo. En el caso del suelo arcilloso existe un rango intermedio de humedades en el que se limita la disponibilidad del contaminante y disminuye la efectividad de la biorremediación. 4. La experiencia con la estrategia de bioaumento no siempre sigue el mismo patrón en los experimentos de laboratorio. La concentración de inóculo que conviene utilizar para realizar el bioaumento depende del tipo de consorcio que se vaya a aplicar. El uso de un consorcio endógeno da lugar a una mayor 215 Capítulo 8 eficiencia cuanto mayor concentración de inóculo inicial es depositada. Sin embargo, cuando se aplica un consorcio exógeno, a mayor concentración de inóculo inicial, se obtienen menores rendimientos y de forma más lenta. Este hecho puede estar relacionado con la competencia que surge entre el propio consorcio presente en el suelo y el exógeno inoculado. 5. El modelo matemático, desarrollado para reproducir los resultados de los experimentos de biorremediación en laboratorio, considera los fenómenos de transporte de diésel entre las cuatro fases existentes (sólida, líquida acuosa, líquida orgánica y gaseosa) y el equilibrio que se alcanza entre ellas. La validez del modelo se ve confirmada por los altos coeficientes de correlación y la obtención de unos parámetros cinéticos coherentes. 6. Los rendimientos de descontaminación se mantienen en el mismo orden de magnitud al cambiar de escala de laboratorio a planta piloto. Este hecho indica que, manteniendo las condiciones óptimas seleccionadas en laboratorio, se puede esperar éxito a mayor escala. Todas las estrategias de biorremediación acelerada llevadas a cabo en planta piloto aumentan el rendimiento más del 70% respecto a un simple proceso de atenuación natural tradicional. 7. La experiencia en planta piloto revela que la estrategia de bioaumento debe desarrollarse en condiciones especiales para tener efectividad: un bioaumento inicial único no mejora el proceso de biorremediación con respecto a una estrategia de bioestimulación convencional; sin embargo, el continuo aporte semanal de inóculo fresco (bioaumento semanal continuado) aumenta el rendimiento un 15% respecto a un tratamiento de bioestimulación convencional. Por otro lado, la opción que considera el uso de compost maduro, como método novedoso de bioestimulación, aumenta los rendimientos de descontaminación con respecto al resto de estrategias. Por todo ello, tanto el bioaumento semanal continuado como la bioestimulación con compost maduro pueden considerarse como las mejores estrategias, aptas para desarrollarse en un hipotético caso a escala industrial. 8. Los experimentos de biorremediación realizados en estado saturado de humedad en planta piloto no mejoran el proceso de descontaminación respecto a su realización en estado insaturado. Por ello, se rechaza el estado saturado como óptimo de humedad en el que llevar a cabo los procesos de descontaminación a escala industrial. Por otro lado, la utilización de 216 Conclusiones generales biorreactores giratorios tampoco estaría completamente justificada debido a la alta relación coste/eficiencia en un hipotético proceso industrial. 9. La implementación de un proceso industrial de biorremediación bajo las estrategias planteadas de bioestimulación con compost y bioaumento semanal, cobra sentido técnica, ambiental y económicamente bajo un análisis de viabilidad integral previo. En este análisis se deben definir y considerar los aspectos más sensibles e importantes que determinan la viabilidad industrial. La construcción de un Centro de Tratamiento Especializado resultaría de interés siempre y cuando el precio de servicio fuera superior a 145 € por tonelada de suelo contaminado. 217 218 Anexos 219 220 Anexo I ESTIMACIÓN DE LAS FRACCIONES DEL DIÉSEL UTILIZADO i Anexo I ii Estimación de las fracciones del diésel utilizado A continuación, se desarrolla el procedimiento para la obtención de la curva de destilación para la determinación de la composición del HC diésel utilizado en este trabajo. Para la realización de este ensayo se empleó un equipo de destilación a presión 1 atmosférica (ASTM-D86, 2004) . Brevemente, se introdujeron 100 mL de diésel en un matraz de destilación, obteniéndose los datos de volumen de destilado recogido frente a la temperatura de destilación (Tabla A.I.1). Las condiciones ambientales en que se realizó el ensayo fueron de 15 °C y 701,71 mmHg de presión. Tabla A.I.1. Datos de destilación del diésel utilizado. Volumen recogido (mL) 5 10 15 20 30 40 50 60 70 80 85 90 100 Tiempo (min) 4,24 9,20 12,59 17,36 29,09 42,00 51,00 65,20 74,00 81,00 84,10 87,00 craqueo T(°C) 191 211 219 226 242 258 273 289 282 316 326 311 craqueo 2 El gasóleo cumple con la normativa UNE EN-590 en cuanto a destilación y que establece los límites que se muestran en la Tabla A.I.2. Tabla A.I.2. Límites de temperatura exigidos para un diésel. Pr (% v/v) 65 85 95 Especificación(°C) Tc ensayo(°C) Mínimo 250 Máximo 350 Máximo 360 298,60 333,82 353,95 1 ASTM D86. (2004). Standard Test Method for Distillation of Petroleum Products at Atmospheric Pressure. Book of Standards, American Society for Testing and Materials, West Conshohocken, Pennsylvania, USA. 2 UNE-EN 590. (2009). Combustibles para automoción. Combustibles para motor diésel (gasóleo). Requisitos y métodos de ensayo. International Organization of Standardization, Geneve. Italy. iii Anexo I Las fracciones que componen el gasóleo obtenidas mediante el programa de simulación Hysys® se recogen en la Tabla A.I.3. Asimismo, en la Figura A.I.1 se muestra gráficamente dicha distribución. Tabla A.I.3. Distribución de las fracciones del diésel utilizado. Nombre Naphtha Kerosene Light Diesel Heavy Diesel Atm Gas Oil Residuo Tinicial (°C) 96 180 240 290 340 370 Tfinal (°C) 180 240 290 340 370 451 Fracción molar 0,075 0,232 0,238 0,291 0,096 0,067 Figura A.I.1. Distribución gráfica de las fracciones del diésel utilizado. Los datos obtenidos de la distribución se emplearon para dividir el gasóleo diésel en pseudocomponentes mediante la herramienta Oil manager del programa Hysys®. En la Tabla A.I.4 se muestran los pseudocomponentes establecidos y sus propiedades. Mediante esta simulación se pueden destacar aspectos importantes sobre el diésel empleado: - Todos los pseudocomponentes tienen un valor del factor de caracterización de Watson, k, muy cercano a 12, lo que indica que este carburante está compuesto mayoritariamente por hidrocarburos mixtos con ciclo y cadena equivalente (poca presencia de compuestos aromáticos y parafinas iv Estimación de las fracciones del diésel utilizado normales o isoparafinas). Esta composición rica en nafténicos es típica de un gasóleo. - Observando las fracciones molares de cada componente se puede deducir que no existen apenas compuestos (2,06 %) con cadenas de longitud superior a un C24, que podrían ser los más problemáticos en cuanto a la biodegradación. Tabla A.I.4. Propiedades de los pseudocomponentes del diésel utilizado. NBP_104 NBP_118 Teb normal (°C) 103,8 118,3 99,74 104,1 ρ (k m-3) 733,4 738,7 Tc (°C) 282,0 296,9 Pc (Kpa) 3.010,12 2.828,03 Watson K 11,982 12,045 NBP_133 NBP_148 NBP_161 132,8 113,4 749,4 311,0 2.706,30 12,019 0,017 147,8 160,8 123,6 132,6 760,4 769,4 327,9 341,4 2.591,09 2.249,60 11,989 11,971 0,025 0,032 NBP_176 NBP_192 175,9 191,6 142,4 153,7 778,3 787,9 356,6 372,2 2.373,43 2.261,41 11,968 11,959 0,033 0,055 NBP_204 NBP_218 204,0 218,3 162,4 172,9 794,7 802,4 384,2 398,0 2.173,61 2.075,77 11,961 11,964 0,089 0,075 NBP_233 233,0 184,6 810,3 412,0 1.982,74 11,964 0,069 NBP_247 NBP_262 247,4 261,8 196,8 209,8 818,0 825,7 425,6 439,1 1.897,62 1.816,45 11,962 11,960 0,070 0,072 NBP_276 NBP_291 275,8 290,7 222,8 237,1 832,8 840,3 452,1 465,7 1.740,64 1.663,87 11,959 11,960 0,067 0,063 NBP_305 305,1 252,5 847,7 478,9 1.595,36 11,954 0,078 NBP_319 NBP_334 318,9 333,9 266,9 282,3 854,4 861,3 491,3 504,7 1.530,90 1.461,87 11,954 11,959 0,073 0,056 NBP_347 NBP_363 347,0 362,8 297,2 313,4 867,8 874,7 516,4 530,2 1.408,27 1.341,74 11,954 11,960 0,037 0,026 NBP_375 NBP_391 375,4 390,5 325,4 337,9 879,8 885,4 540,9 553,5 1.289,98 1.228,17 11,968 11,984 0,015 0,009 NBP_405 404,7 351,1 890,5 565,4 1.172,63 12,000 0,006 NBP_421 420,6 365,8 895,2 578,2 1.109,56 NBP_439 439,3 387,9 902,4 593,8 1.046,21 Nota: NBP, normal boiling point (Punto de Ebullición Normal). 12,029 12,040 0,004 0,006 Componente PM Comp. Molar 0,012 0,014 v Anexo II PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN Y TÉCNICA DE DGGE i Anexo II ii Procedimiento para la extracción de ADN y técnica de DGGE A.II.1. EXTRACCIÓN DE ADN Se llevaron a cabo dos extracciones de ADN, por un lado la extracción del ADN directamente del suelo A (SA), es decir, de todos los microorganismos presentes en el suelo contaminado, y por otro el ADN del consorcio XA crecido y enriquecido en diésel en el laboratorio a partir del aislamiento del propio suelo. Para ambas extracciones se utilizó el Kit comercial de extracción Fast DNA Spin Kit for Soil, diseñado especialmente para realizar extracciones de ADN a muestras de suelo, siguiendo los pasos que en el kit se especificaron. La extracción de ADN del consorcio XA cultivado fue prácticamente igual salvo que previamente fue necesario concentrar las muestras mediante la centrifugación de 10 mL de cultivo hasta observar formación de pellet (10.500 xg, 10 min), y una vez formado se resuspendió en 1 mL de Agua Milli-Q. Verificación del ADN mediante electroforesis Antes de empezar a trabajar con las muestras de ADN extraídas fue necesario verificar la calidad de dicho ADN, es decir, si la extracción había sido correcta y existía una cantidad de ADN suficiente para trabajar y amplificar posteriormente. Para ello se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,2 %. La preparación del gel consistió en disolver 0,6 g de agarosa en 50 mL de TAE 1x, aplicando calor para la disolución y homogeneización completa de esta mezcla. Después de lavar el molde y los peines que se iban a utilizar en la electroforesis, se montó el sistema tal y como se observa en la Figura A. II.1 con una mini-sub® cell GT de BIO-RAD. Una vez montado, el siguiente paso fue verter el gel en caliente y esperar 30 min hasta su solidificación. Figura A.II.1. Esquema para la preparación del gel de agarosa para comprobación del ADN extraído. iii Anexo II Una vez que el gel se había formado, se retiraron los marcos y los peines y se colocó dicho gel en una cubeta horizontal de electroforesis con TAE 1x hasta cubrirlo (Figura A.II.2). A continuación se rellenaron los pocillos formados con las muestras de ADN preparadas. Dichas muestras comprendieron: 4 µL de la muestra inicial de ADN 1 extraído, 3 µL de TAE 1x y 2 µL de solución de carga de gel Loading dye (LD) . El primero de los pocillos se rellenó con un marcador de pesos moleculares para asegurar que la electroforesis fuera correcta por comparación del tamaño de los pares de bases. Dicho marcador fue Hyperladder II de Bioline. Una vez cargadas todas las muestras se acoplaron los electrodos a la fuente de alimentación Power Pac Basic de BIO-RAD y se corrió el gel a 77 V durante 40 min, así el ADN, cargado negativamente, migra hacia el polo positivo del campo eléctrico generado por la fuente de alimentación, con una velocidad que depende de varios parámetros: el tamaño y la conformación de la molécula, la concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado. Figura A.II.2. Esquema de cubeta horizontal para electroforesis en gel de agarosa. Una vez corridas las muestras, se trasladó el gel a una bandeja y se tiñó con una disolución de bromuro de etidio durante 30 min en un balancín. Pasado este tiempo se depositó sobre la superficie de un transiluminador de UV G El Logic 100 Imagen System de Kodak para observar el gel. El bromuro de etidio es un agente intercalante que emite fluorescencia cuando es expuesto a la luz ultravioleta, lo que posibilita la visualización de las moléculas de ADN en el gel (Figura A.II.3). 1 LD: Solución de carga de gel al 0,25% en bromofenol, 0,25% en xilencianol y 20% en Ficoll. iv Procedimiento para la extracción de ADN y técnica de DGGE Figura A.II.3. Vista del gel de agarosa para verificación de ADN extraído. A.II.2. AMPLIFICACIÓN DEL ADN POR LA TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La PCR puede amplificar moléculas de ADN de forma rápida y sencilla. Para ello se realizan una serie de ciclos o repeticiones en los que se duplica el contenido original del ADN diana. Así, cada ciclo de PCR implica las siguientes etapas: - Desnaturalización por calor del ADN bicatenario diana. - Enfriamiento para acoplar los iniciadores específicos con el ADN diana. - Extensión de los iniciadores por acción de la ADN polimerasa . 2 a. Preparación de las muestras para PCR En tubos Eppendorf de 100 µL de capacidad se mezcló 1 µL de los primers específicos que se querían usar, en este caso el 1401R y el 0968F, que son generales del dominio bacteria. Se adicionaron 10 µL de la Taq polimerasa y 35 µL de agua Milli-Q. Se mezcló suavemente con la ayuda de una pipeta y se adicionaron 3 µL de la muestra de ADN. A continuación, se metieron los tubos en un termociclador de PCR i cycler de la casa Bio-Rad. b. Programa de PCR El programa utilizado para la amplificación del ADN consistió en 35 ciclos y se detalla a continuación: 2 La enzima ADN polimerasa que se utilizó es una enzima termoestable, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, conocida como Taq polimerasa (estable hasta 95 °C). v Anexo II - Desnaturalización inicial 95 °C, 3 min. - Desnaturalización 95 °C, 1 min. - Annealing temperatura 48 °C, 1 min. - Extensión temperatura 72 °C, 1 min. - Extensión Final 72 °C, 5 min. c. Verificación de la amplificación de ADN Se realizó de nuevo la electroforesis en un gel de agarosa al 1,8 % para comprobar si la amplificación de ADN había sido correcta. Para ello se preparó el gel y se montó la instalación de la misma forma que la vez anterior. En este caso se rellenaron los pocillos con una mezcla de 4 µL de la muestra de PCR, 4 µL de TAE 1x y 2 µL de LD, y el gel se corrió a 75 V durante 50 min (Figura A.II.3). Figura A.II.4. Vista del gel de agarosa para verificación de ADN amplificado por PCR. A.II.3. TÉCNICA DE DGGE La técnica de DGGE se utilizó para discernir la complejidad de secuencia en las amplificaciones con PCR, pudiendo de esta forma comparar varias muestras en un mismo gel. Por tal motivo la técnica de DGGE es una forma indirecta de separar los fragmentos de ADN con secuencias iguales o muy similares en la mezcla de fragmentos, como grupos (o bandas electroforéticas) que se detienen en el mismo punto de desnaturalización. a. Reactivos utilizados Tampón de electroforesis TAE 20x vi Procedimiento para la extracción de ADN y técnica de DGGE - Tris base 0,8 M.............................................96,91 g - Acetato sódico 0,4 M ....................................54,43 g - EDTA, pH 8, 0,02 M .......................................7,44 g El Tris base con EDTA se disolvió y el acetato sódico en agua Milli-Q hasta un volumen final de 1 L. Se ajustó el pH con ácido acético glacial. Solución stock de acrilamida al 40% - Acrilamida:bis-acrilamida 37,5:1 Se disolvieron 100 g de acrilamida y 2,7 g de bisacrilamida en agua Milli-Q hasta un volumen final de 250 mL. Solución stock de acrilamida al 6% Solución stock 6% desnaturalizante en tampón TAE. Se mezclaron 75 mL de acrilamida al 40% y 25 mL de TAE 20x en 400 mL de agua Milli-Q. Solución stock desnaturalizante al 80% - Acrilamida 6% - Formamida 32% - Urea 5,6 M - Tampón TAE 1x Se mezclaron 75 mL de acrilamida 40%, 160 mL de formamida desionizada (stock 100%), 170 g de urea de grado de electroforesis, 25 mL de TAE 20x y se añadió agua Milli-Q hasta 500 mL. Solución Stock de persulfato amónico (APS) al 10% Se disolvieron 10 g de persulfato amónico en un volumen final de 100 mL de agua Milli-Q. Esta solución normalmente se prepara en el momento, pero también puede almacenarse a –20 °C. TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina). Solución de carga de gel 5x - 0,25% bromofenol - 0,25% xilencianol vii Anexo II - 20% Ficoll Se disolvieron 10 g de Ficoll, 90 mg de azul de bromofenol y 90 mg de xilencianol en un volumen final de 100 mL de agua Milli-Q. Solución de teñir Se disolvió 1 g de bromuro de etidio en 100 mL de agua Milli-Q. b. Procedimiento La técnica DGGE es una electroforesis en gel de poliacrilamida convencional donde las moléculas de ADN migran a través de un incremento lineal de concentración de agente desnaturalizante (formamida y urea), que son vertidas con marcadores estándar de gradientes. Con objeto de permitir una reproducibilidad, la carrera de la electroforesis se produjo a la temperatura constante de 60 °C. Esta temperatura fue elegida empíricamente para exceder la Temperatura de desnaturalización de un fragmento de ADN rico en A-T en ausencia de agentes desnaturalizantes. Para asegurar el mantenimiento uniforme de la temperatura elegida durante la electroforesis del gel, se situó en un tanque de agua y se sumergió en tampón de electroforesis, el cual se mantuvo a la temperatura deseada. c. Preparación del gel Los geles paralelos contienen un gradiente de concentración de formamida y urea que se incrementa linealmente desde la parte alta a la parte baja gel, por tanto la preparación de dichos geles resulta un tanto compleja (ver Cuadro A.II.1). d. Electroforesis del ADN Una vez formado el gel, se procedió a realizar la electroforesis en una cubeta vertical (Figura A.II.4). Para ello: 1. Se situó el marco con el gel en el contenedor del baño TAE 1x calentado a 60 °C. Se ajustó el tampón para que subiera justo sobre el nivel de los pocillos y evitar el contacto del tampón con la cámara de electroforesis superior. Se conectó el termostato combinado para que el tampón circulara desde la cámara superior de tampón. 2. Se pre-corrió el gel durante unos 10 min a 200 V. viii Procedimiento para la extracción de ADN y técnica de DGGE 3. Se prepararon las muestras con solución de carga y se rellenaron los pocillos con un volumen de 30 µL. 4. Las carreras de DGGE se corrieron durante 16 h a 85 V. Figura A.II.4. Vista de cubeta de electroforesis vertical. Cuadro A.II.1. Preparación del gel para DGGE. A continuación, se describen las etapas a seguir durante la preparación del gel para DGGE: 1. Alinear los espaciadores a lo largo de los bordes del cristal más largo. Colocar el cristal pequeño en posición, sujetarlos juntos con pinzas de encuadernación y sellar los bordes y la parte baja. 2. Poner el peine en posición y colocar las placas de cristal en el marco formando la cámara de electroforesis superior. Cerrar las tuercas. 3. Situar el aparato de fabricación de gradientes encima de un agitador magnético, conectar el tubo de salida en lo alto del cristal cerca del peine y cerrar este tubo de forma que conecte los dos compartimentos del aparato para fabricar gradientes. Preparar dos soluciones de igual volumen (15 mL aproximadamente, el cual dará el rango de concentración deseado). Añadir 16 mL de TEMED y 160 mL de APS a cada solución y mezclar bien. 4. Verter 15 mL de solución con mayor concentración de desnaturalizante en la cámara del aparato para fabricar gradientes que está conectada a la cavidad de los cristales. Abrir y cerrar brevemente la llave entre los dos compartimentos para permitir que la solución llene el tubo de conexión. 5. Verter 15 mL de solución con menor porcentaje de desnaturalizante en el otro compartimento. 6. Mientras se agita la solución en el compartimento con mayor concentración de desnaturalizante, abrir la llave entre los dos compartimentos y la salida de los cristales. 7. A continuación, el líquido pasa por gravedad a través del tubo a la cavidad entre las dos placas de cristal. 8. Una vez vertido todo el gel, dejar polimerizar entre 30-60 min. 9. Retirar el peine del gel y la tapa de la parte inferior de las placas de cristal. ix Anexo II e. Tinción del gel El último paso en la técnica de la DGGE consistió en realizar la tinción del gel para observar las distintas moléculas de ADN. Los pasos a seguir para teñir el gel son: 1. Parar la electroforesis y sacar el marco del baño. Retirar las placas de cristal, levantar suavemente el cristal mayor y usar la otra placa para apoyar el gel durante el transporte. 2. Teñir el gel durante 20-30 min en 250 mL de TAE 1x, conteniendo 0,5 mg -1 mL de bromuro de etidio. 3. Examinar el gel bajo luz ultravioleta (254 nm) en un transiluminador y fotografiar para documentar. x Anexo III CARACTERÍSTICAS DEL COMPOST UTILIZADO i Anexo III ii Características del compost utilizado Para la realización de los experimentos de biorremediación mediante la estrategia de bioestimulación con compost, se utilizaron dos tipos de compost en su etapa final de maduración. La elaboración de ellos fue diferente utilizando distintos tipos de residuos orgánicos animales: Compost A: Se elaboró a partir de gallinaza de una granja en la localidad de Daimiel (Ciudad Real) utilizando, como agente estructurante, carrizo procedente del Parque Nacional de Las Tablas de Daimiel (Figura III.1.a). Compost B: Se elaboró a partir de estiércol de cordero, residuo animal procedente de una granja de engorde en la provincia de Ciudad Real, mezclado con carrizo procedente del Parque Nacional Las Tablas de Daimiel (Figura III.1.b). (a) (b) Figura III.1.Vista del compost utilizado. (a) Compost A. (b) Compost B. La elaboración de ambos compost se llevó a cabo utilizando carrizo del Parque Natural de las Tablas de Daimiel, como agente estructurante, y así mejorar la capacidad de aireación y mantenimiento de la humedad de la mezcla resultante, variables también imprescindibles para llevar a cabo una adecuada biorremediación. Los pasos más relevantes en la elaboración del compost son el cálculo de las proporciones de mezclado del residuo y el carrizo, y el seguimiento adecuado de las etapas mesófila, termófila, y madurez, la cual se alcanzó a los 45 días. En la Tabla III.1 se muestran las características más relevantes del compost A y B. Los dos tipos de compost utilizados presentan las propiedades idóneas para la biorremediación, entre las que cabe destacar el contenido de materia orgánica (> 50% en ambos casos). iii Anexo III Tabla III.1. Características físico-químicas del compost A y B. Parámetro Compost gallinaza (A) Compost estiércol de cordero (B) pH 8,4 8,1 Conductividad (µS/cm) 5,16 6,40 Humedad (%) 47 49 Materia orgánica (%) 55 68 Relación C/N N Amoniacal (%) Fósforo total (% P2O5 ) Potasio total (% K2O) Metales 34 27 0,33 5,08 0,60 0,02 4,72 0,80 Clase B(*) Clase B(*) Nota: Clase B*, sustratos de cultivo cuyo contenido en metales pesados no superan ninguno de los valores de la columna B del RD 865/2010, de 2 de julio1. 1 RD 865/2010, de 2 de Julio, sobre sustratos de cultivo. BOE nº 180 de 28 de julio de 2010, Sec. I, Pág. 58344. Ministerio de la presidencia. Madrid, España. iv Anexo IV DISEÑO DEL CENTRO DE TRATAMIENTO ESPECIALIZADO, EQUIPOS Y AUXILIARES i Anexo IV ii Diseño del Centro de Tratamiento Especializado, Equipos y Auxiliares A.IV.1. DIMENSIONAMIENTO DEL CENTRO DE TRATAMIENTO ESPECIALIZADO. El Centro de Tratamiento Especializado (CTE) se diseña para su emplazamiento en 2 una parcela de 1.700 m en un polígono industrial en la localidad de Daimiel. Se estima que podría existir un mercado potencial para el tratamiento de suelos contaminados con -1 HC de 2.250 t año . Se fija una contaminación máxima de HC en el suelo de 10.000 mg -1 kg . En la Tabla IV.1 se recogen los principales datos para el dimensionamiento de la instalación. Tabla IV.1. Dimensionamiento del CTE. Capacidad de tratamiento anual (t) Nº tandas año 2.250* 3 Capacidad de tratamiento por tanda (t) 750 Nº de biopilas formadas 4 Capacidad de biopila (t) 187,5 -3 Densidad suelo (kg m ) 1.500 Volumen ocupado por biopila (m3) 125 Dimensionamiento de biopila (LxAxH) (m) 15x3x2,8 Nota: * La capacidad de tratamiento para la Estrategia de bioestimulación con compost se ve reducida a 1.875 t. Otros parámetros a tener en cuenta en el dimensionamiento y estudio económico son los consumos en materias auxiliares, como son: el agua de planta, productos de enriquecimiento, etc. En la Tabla IV.2 se presentan estos consumos optimizados en los capítulos 4, 5 y 6 de esta memoria. Tabla IV.2. Consumos de productos auxiliares. ESTRATEGIA A Inóculo inicial (m3) 3 0,012 -1 Inóculo (m semana ) 12 Agua semanal (m3 semana -1) 12 3 0,090 -1 6,6 HC (sustrato en cultivo inicial) (m ) Fuente de Nitrógeno (kg semana ) -1 Fuente de Fósforo (kg semana ) 0,7 ESTRATEGIA B Compost (t tandas-1) 151 iii Anexo IV A.IV.2. ESTIMACIÓN DEL COSTE DE LOS EQUIPOS En la Tabla IV.3.a, IV.3.b y IV.3.c se detallan las principales características y el coste de los diferentes equipos considerando el dimensionamiento anterior. Tabla IV.3.a. Características y costes de equipos. TANQUE PULMÓN Identificación de equipo C-01 Servicio Almacén de agua de regadío. Capacidad requerida 5 m3 Dimensionamiento 2,55 m H x 1,70 m Ø Material de construcción Poliéster reforzado con fibra de vidrio Coste 1.000 € Proveedor propuesto Delf Grupo España S.L. TANQUE DE MEZCLA Identificación de equipo C-02 Servicio Realizar aislamiento del cultivo microbiano: mezcla de 30 kg de suelo y 300 L de agua. Capacidad requerida 0,4 m3 Tiempo de funcionamiento 24 h/tanda (Promedio anual 0,2 h/día) Dimensionamiento 1mHx1mØ Material de construcción Poliéster reforzado con fibra de vidrio Otras especificaciones Agitador de turbina. Velocidad de agitación: 130 rpm. Consumo eléctrico de agitador: 0,5 kW Coste 1250 €. Proveedor propuesto Delf Grupo España S.L. SEDIMENTADOR/DECANTADOR Identificación de equipo S-01 Servicio Obtención de inóculo sobrenadante libre de sólidos. Capacidad requerida 0,4 m3 Dimensionamiento 2,5 m H x 0,5 m Ø Material de construcción Poliéster reforzado con fibra de vidrio Coste 500 € Proveedor propuesto Delf Grupo España S.L. iv Diseño del Centro de Tratamiento Especializado, Equipos y Auxiliares Tabla IV.3.b. Características y costes de equipos. BATERÍA DE BIORREACTORES Identificación de equipos R-01, R-02, R-03 Servicio Enriquecimiento del cultivo en el sustrato contaminante Capacidad requerida 1 m3 /unidad Dimensionamiento 2,5 m H x 1,5 m Ø Tiempo de funcionamiento 24 h/día (Promedio anual 17,75 h/día) Material de construcción Poliéster Otras especificaciones Agitador de doble pala. Velocidad de agitación: 130 rpm. Consumo eléctrico de agitador: 0,75 kW Coste 600 €/unidad Proveedor propuesto Roblepol COMPRESOR Identificación de equipos K-01 Servicio Suministro de aire a las biopilas Necesidades del servicio 0,81 m3 min-1(1) Dimensionamiento Pimpulsión: 10 bar Tiempo de funcionamiento 24 h/día (Promedio anual 17,75 h/día) Material de construcción Acero Inoxidable Calidad AISI 316L Otras especificaciones Tipo: centrífugo. Consumo eléctrico: 7.5 kW Coste 1.320 € Equipo propuesto Marca: Kaeser. Modelo: SX-12 COMPRESOR Identificación de equipos K-02 Servicio Suministro de aire a los biorreactores Necesidades del servicio 0,68 m3 min-1(2) Dimensionamiento Pimpulsión: 7,5 bar Tiempo de funcionamiento 24 h/día (Promedio anual 17,75 h/día) Material de construcción Acero Inoxidable Calidad AISI 316L Otras especificaciones Tipo: centrífugo. Consumo eléctrico: 5,5 kW Coste 550 € Proveedor propuesto Marca: Kaeser. Modelo: SX-8 1 Caudal calculado en base a la cantidad de oxígeno necesaria para biodegradar 10.000 mg de HC presentes en 1 kg de suelo. 2 Caudal calculado en base a la concentración de saturación de oxígeno en el agua a la temperatura de 20 °C. v Anexo IV Tabla IV.3.c. Características y costes de equipos. BOMBA DE ALIMENTO Identificación de equipos P-01 Servicio Distribuir el cultivo o agua de regadío en las biopilas Capacidad 1 m3/h Dimensionamiento Pimpulsión< 6,5 bar Tiempo de funcionamiento 11 h/día (Promedio anual 0,85 h/día) Material de construcción Acero Inoxidable Calidad AISI 316L Otras especificaciones Tipo: Centrífuga vertical multietapa. Consumo eléctrico: 0,37 kW Coste 500 € Equipo propuesto Marca: ITT Modelo: SV2 4 POLOS BOMBA DE INOCULACIÓN Identificación de equipos P-02 Servicio Trasegar el inóculo desde el sedimentador a los biorreactores Capacidad 0,6 m3/h Dimensionamiento Pimpulsión< 6,5 bar Tiempo de funcionamiento 1 h/día (Promedio anual 0,86 h/día) Material de construcción Acero Inoxidable Calidad AISI 316L Otras especificaciones Tipo: Centrífuga vertical multietapa. Consumo eléctrico: 0,25 kW Coste 500 € Equipo propuesto Marca: ITT Modelo: SV2 4 POLOS BOMBA DE TRASIEGO Identificación de equipos P-03 Servicio Trasegar el inóculo desde el tanque de mezcla al sedimentador Capacidad 0,6 m3/h Dimensionamiento Pimpulsión< 3,5 bar Tiempo de funcionamiento 1 h/tanda (Promedio anual 0,01 h/día) Material de construcción Acero Inoxidable Calidad AISI 316L Otras especificaciones Tipo: Centrífuga de impulsión abierta. Consumo eléctrico: 0,75 kW Coste 540 € Equipo propuesto Marca: Elias. Modelo: Centix-SXM-MAT BOMBA DE TRASIEGO Identificación de equipos P-04 Servicio Trasiego de lixiviados a biorreactores Capacidad 0,6 m3/h Dimensionamiento Pimpulsión< 4,5 bar Tiempo de funcionamiento 1 h/día (Promedio anual 0,83 h/día) Material de construcción Acero Inoxidable Calidad AISI 316L Otras especificaciones Tipo: Autoaspirante. Consumo eléctrico: 0,44 kW Coste 160 € Equipo propuesto Marca: Salvador Escoda. Serie: JET vi Diseño del Centro de Tratamiento Especializado, Equipos y Auxiliares A.IV.3. ESTIMACIÓN DEL COSTE DE AUXILIARES A continuación, se detallan los consumos de auxiliares necesarios para desarrollar el proceso de biorremediación de manera satisfactoria en cada una de las estrategias. i.) Consumos de agua de red. - Estrategia A. Para abastecer la necesidad de realizar semanalmente un 3 bioaumento de 12 m de cultivo fresco a las biopilas, se requiere un 3 consumo semanal de 12 m de agua de red. - Estrategia B. Semanalmente se produce la humectación del suelo con 12 3 m de agua de red. ii.) Consumos de nutrientes. Los nutrientes necesarios en cualquier proceso de biodegradación son el nitrógeno y el fósforo principalmente; atendiendo a esta necesidad se propone: - Estrategia A. En ausencia de un agua residual rica en N y P, se propone añadir KNO3 y NH4HPO4, ambos a razón de 1 g por litro de agua de regadío. - Estrategia B. Se utiliza el compost como fuente rica en N y P. Se mantiene la relación utilizada en el capítulo 6 de la presente memoria de 83:17 (kg Suelo: Kg Compost). iii.) Combustible para la máquina tractora de volteo En ambas estrategias se estima un consumo de 70 L de gasoil semanal. Debido a la continua oscilación del precio del crudo de petróleo, los combustibles derivados, como el gasóleo A, tienen un precio que varía diariamente. En el momento de realizar esta estimación económica (fecha 15 de octubre de 2015), el litro de gasóleo A tiene un precio de 1 €. En la Tabla IV.4 se recoge el consumo estimado de cada una de las materias auxiliares, se calcula su coste anual y su coste por tonelada de suelo contaminado. vii Anexo IV Tabla IV.4. Consumos y precios de auxiliares. Consumo semanal Precio (€ t-1) Consumo (t año-1) Coste (€ año-1) Coste (€ t-1 suelo) Agua de red 12,00 m3 2,00 432 864,00 0,38 KNO3 12,00 kg 700,00 0,432 302,40 0,13 (NH4)2HPO4 12,00 kg 533,00 0,432 230,26 0,10 3 1.176,00 2,520 2.520,00 1,10 30,00 451,100 13.532,41 6,01 Gasoil 0,07 m Compost A.IV.4. ESTIMACIÓN DEL COSTE DE LA ELECTRICIDAD En la Tabla IV.5 se detalla el consumo eléctrico, las horas de funcionamiento y el coste de la electricidad por equipo instalado. Se utiliza un precio del kWh de 0,1509 € (a fecha de 15 de octubre de 2015). Tabla IV.5. Consumo de electricidad por equipos. Uso equipo (h/día) Potencia consumida (kW) (kW h) Consumo eléctrico (€) Identificación Descripción de equipo C-02 Agitador en tanque 0,20 0,50 0,100 5,4 K-01 Soplante 17,75 7,50 133,151 7.333,7 K-02 Soplante 17,75 5,50 97,644 5.378,1 P-01 Bomba de alimento 1,45 0,37 0,535 29,5 P-02 Bomba de inoculación 0,86 0,25 0,216 11,9 P-03 Bomba de trasiego 0,01 0,75 0,006 0,3 P-04 Bomba de lixiviados 0,86 0,44 0,379 20,9 R-01/R-02/R-03 Agitador en biorreactor 17,75 3,00 53,260 2.933,5 A.IV.5. ESTIMACIÓN DEL COSTE DEL TRANSPORTE DEL SUELO CONTAMINADO Y EL COMPOST Se escoge el transporte por carretera para el traslado de la tierra contaminada y el compost al CTE. La tarifa de transporte por carretera para mercancías a granel se cotiza en 1 €/ km + tasas. Tomando como referencia una distancia media de transporte de 200 km, se estima un gasto de 18.000 € año -1 -1 y 3.624 € año para el traslado de la tierra contaminada y el compost, respectivamente, al CTE. Estos costes suponen 8 y 1,60 € por tonelada de tierra contaminada tratada en el CTE. viii
