Diapositiva 1 - Departamento de Biodiversidad y Biología

Febrero-Marzo 2016
Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
“Histología Animal Comparada:
Técnicas Básicas para Microscopía Óptica
y Electrónica”
Curso de Postgrado
1. Conocer la metodología general aplicada al proceso histológico de los tejidos
animales.
Objetivos:
Métodos de estudio en Histología Animal
Sobre organismos VIVOS!
I) INMEDIATO
Es necesario la muerte previa
del elemento a estudiar
II) MEDIATO O POST
MORTEM
Procedimientos que permiten realizar estudios de células,
tejidos, órganos y organismos.
MÉTODOS DE ESTUDIO
In vitro
In vivo
cloruro de calcio, bicarbonato de sodio, agua destilada)
Líquido de Ringer (cloruro de sodio, cloruro de potasio,
Cultivos de tejidos en cámaras asépticas sobre plasma sanguíneo o extracto
embrionario.
Animales pequeños transparentes: Protozoos, Rotíferos, Crustáceos,
larvas, etc.
b) Membranas transparentes: mesenterios de sapos, cola de renacuajos,
branquias, atc.
c) Delgados cortes de órganos o tejidos como cartílago, hígado, riñón, etc.
d) Órganos opacos, observados con iluminación incidente: circulación
capilar, etc.
a)
Artificiales
Solución Fisiológica (cloruro de sodio al 9‰ o 7‰)
Humor acuoso
Líquido amniótico
B) CON COLORACIÓN VITAL (siguiente diapositiva)
Al estado
fresco
Líquidos
indiferentes
Naturales
Plasma sanguíneo
A) AL ESTADO FRESCO : Se utilizan líquidos indiferentes que permiten
mantener vivas a las células. No se recurre a reactivos modificadores.
I) ESTUDIO INMEDIATO:
SUPRAVITAL
INTRAVITAL
Ej. de Colorantes
vitales
Rojo Neutro
Verde Jano
Azul brillante de Cresilo
Azul de metileno
Se emplean colorantes que se aplican a células aisladas o porciones
de órganos extraídos de un animal recientemente sacrificado. Ej.:
mitocondrias (verde de Jano), ramificaciones nerviosas (azul de
metileno), DNA y RNA (naranja de acridina).
a) Por ingestión
b) Por inyección (endovenosa, linfático, subcutánea)
c) Por inmersión (animales acuáticos vivos como Protozoos,
Rotíferos, larvas, etc.)
B) CON COLORACIÓN VITAL: Se utilizan colorantes que actúan respetando la vida del
elemento sin imponer modificaciones estructurales, aumentando el contraste y facilitando la
observación microscópica. Se emplean soluciones muy diluidas de sustancias colorantes no
tóxicas (colorantes vitales).
Sangre humana coloreada con rojo neutro-verde jano.
Método in vitro. Microscopio de campo claro.
A=400x
Sangre humana: método in vitro. Microscopio de contraste por
interferencia diferencial o microscopio Nomarski.
II) ESTUDIO MEDIATO O POST MORTEM
COLORACIÓN
Fijadores: son sustancias químicas que coagulan o precipitan las
proteínas celulares, endurecen los tejidos y facilitan el
tratamiento ulterior.
Finalidad de la fijación: conservar la estructura y en algunos casos la
función del tejido, lo más parecido posible a su estado in vivo.
9 Facilitar técnicas de coloración o análisis posteriores.
9 Dotar al tejido de la consistencia necesaria para las manipulaciones posteriores.
9 Insolubilizar los componentes celulares, principalmente las proteínas, de modo
que se preserven en el corte, mediante enlaces cruzados o desnaturalización.
debido a un proceso de autólisis y putrefacción.
9 Detener procesos de degradación que ocurren durante o tras la muerte celular
¿ Por qué es necesario fijar un órgano?
Depende del tamaño de la pieza y del tiempo de
fijación y del fijador.
9 Debe de ser de fácil manipulación, económico, estable y con baja toxicidad.
9 Debe ser irreversible.
9 Evitar retracciones excesivas , ni volverlos friables o quebradizos a los
tejidos.
constituyentes celulares que se pretenden estudiar.
9 Impedir la desaparición de los elementos solubles o insolubilizar los
9 Alto poder de penetración
9 Velocidad de fijación
9 Preservar los detalles estructurales que presentaban in vivo así como su
composición química (Grizzle 2001, Grizzle et al, 2007).
9 Actuar con rapidez.
Grizzle WE. The use of fixatives in diagnostic pathology. J.
Histotechnol. 2001;24:151–152.
Grizzle WE, Fredenburgh J, Myers RB. Fixation of tissues. In:
Bancroft J, Gamble M, editors. Theory and Practice of Histological
Techniques. 6th ed. Edinburgh, UK: Churchill Livingstone; 2007.
pp. 53–74.
Condiciones que debe reunir un fijador
9 Evitar el uso de agentes que puedan disolverlos.
9 Fijador: formaldehído 4%, tetróxido de osmio.
¾ Sobre los lípidos
9 Se fijan pobremente.
9Monosacáridos y disacáridos se solubilizan.
9 Glucógeno: fijador alcohólico.
¾ Sobre los hidratos de carbono
9 El fijador desestructura las relaciones entre histonas y ácidos nucleicos.
¾ Sobre los ácidos nucleicos
¾ Sobre las proteínas
9 Puede combinarse químicamente con algún aminoácido. Se modifica la
estructura tridimensional y pierde solubilidad.
9 El fijador extrae el agua de los tejidos, se altera el enlace con las proteínas
entonces se vuelven insolubles. Si se hidrata las proteínas se solubilizan
(proceso reversible).
¿Cómo actúa un fijador?
5
4
100
Saturado
1.2 – 4.0
(a 4° C)
1.2 – 4.0
(T° amb.)
0.5 – 2.0
Ácido acético
Formaldehído
Etanol
Ácido pícrico
Glutaraldehído
Tetróxido de osmio
0.85
-------------
0.5 – 1.0
0.29 – 0.58
-------------
0.8
-------------
3.6
2.75
( bloque de gel)
K
0.33 – 0.5
0.5
1.0
0.78
1.2
K (tejido)
Tomado de Montuenga Badía, Esteban Ruiz y Calvo González (2009). Técnicas en Histología y
Biología Celular. Elsevier Masson, pág. 49.
[]%
d: distancia de penetración del fijador (mm)
K: constante de penetración (depende de cada fijador)
t: tiempo de fijación (horas)
Fijador
d= K √ t
Medawar, P.B. (1941). The rate of penetracion of fixatives. J. Royal Microscopical Society, 61: 46-57.
™Velocidad de penetración o difusión
Rápida
Formaldehído
4%
Lenta
Rápida
Velocidad
de
fijación
Poco
Mucho
Reducida
Relativamente
grandes
Tamaño de Tiempo de
las piezas
fijación
El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2
a 2 cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se emplean
fijadores con escaso poder de penetración y de difusión.
Tamaño de la muestra:
Lenta
Velocidad de
penetración
Tetróxido de
osmio
Fijador
El tiempo en que dure la fijación dependerá de la velocidad de fijación.
Velocidad de fijación: es la velocidad a la que se producen los fenómenos
químicos implicados en la fijación. Equivale al tiempo necesario para la
precipitación o insolubilización de los constituyentes celulares.
™Velocidad de fijación, tiempo de fijación y tamaño de las piezas
de fijación
Es recomendable efectuar la fijación a bajas temperaturas (4ºC) y con la solución
fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retarda las reacciones del fijador
pero alarga el tiempo de fijación aunque se disminuye de manera notable la autólisis.
Para M.E. o técnicas histoquímicas el rango de temperatura del fijador se extiende de
los 0-4°C.
Otras opciones: colocar el material a fijar en el fijador calentado (tibio). Ideal para
INVERTEBRADOS!!!! Para vertebrados no es recomendable.
Se propone para acelerar la difusión del fijador, efectuar la fijación durante la primera
media hora a temperatura superior a la ordinaria, para lo cual se pone el material en
estufa a 37-40°C.
Variable, dependerá del material a fijar y del fijador.
™ Temperatura
Atención!! Factores de contracción deben ser tenidos en cuenta cuando se realizan
comparaciones entre estructuras en preparados histológicos y material fresco, como
por ejemplo cuando se realizan estudios morfométricos.
Los núcleos observados en secciones congeladas son usualmente de tamaño más
grandes que los observados en material que fue procesado por métodos
convencionales de preparación histológica.
Ej. Tejido fijado en formaldehído 4% e incluido en parafina sufre una contracción
del 33% del tamaño original.
En general se produce una contracción del tejido, por ende una disminución del
volumen que se ve aumentado frecuentemente por los posteriores pasos en el
proceso de preparación del material para su coloración (deshidratación e
inclusión).
Durante la fijación los tejidos cambian de volumen, las retracciones no son
homogéneas y muchas veces conducen a distorsiones de las estructuras celulares.
™Variaciones del volumen del tejido
9 En M.O. se puede añadir a los fijadores cloruro de sodio (Ej. 0.9% para animales
terrestres) o utilizar soluciones tamponadas a un pH semejante al del tejido e
isosmótico con dicho tejido.
9 En MET se añade sacarosa a las soluciones fijadoras para ajustar su osmolaridad.
9 Órganos sensibles a la osmolaridad del fijador: riñón, órganos relacionados con
la osmorregulación del organismo, porción exocrina del páncreas (acinos).
9 Mejores resultados, corroborados para M.E. es usar soluciones fijadoras
ligeramente hiperosmóticas (alrededor de 400 mOsm, soluciones isotónicas en
mamífero es 340 mOsm).
9La presión osmótica de la pieza y del fijador tiene que ser lo más parecido al
suero fisiológico.
9 Soluciones fijadoras hipotónicas aumentan la turgencia de las células.
9 Soluciones fijadoras hipertónicas dan lugar a la contracción de las células.
™ Osmolaridad del fijador
Otros tampones reaccionan con enzimas y metabolitos del tejido, tener en cuenta
para la interpretación de resultados. Ej: tampón fosfato inhibe la glucosa-6-fosfato
Atención!!! Hay que tener cuidado que el tampón elegido no reaccione con el
fijador, de tal forma que reduzca el accionar del tampón (buffering power) y las
propiedades del fijador.
Ej: veronal y Tris reaccionan con los aldehídos.
Uso de soluciones tampones como disolventes del fijador.
Las más usadas: tampón fosfato, Tris, cacodilato, acetato de veronal.
Ej: mucosa gástrica para una óptima preservación, fijador a pH 5.5
Preservación de gránulos de adrenalina y noradrenalina, formaldehído 4% a pH 6.5
pH de la solución fijadora a pH fisiológico: entre 6-8. Fuera de este rango se
producen artefactos de fijación que son especialmente visibles a nivel
ultraestructural .
™ pH del fijador
9 Microondas
9Criosustitución (1° nitrógeno líquido o
isopentano a -50°C, 2° sustitución con una
mezcla de alcohol etílico –acetona y propilenglicol a -40°C).
9Criodesecación o liofiliación (1° congelación
en nitrógeno líquido, 2° desecación por
sublimación del agua).
9Congelación
o Criofijación (congelación
- 70°C, nitrógeno líquido o isopentano enfriado
previamente hasta su punto de congelación
(-170°C) en nitrógeno líquido.
9 Frío
9 Calor.
¾ FÍSICOS
Clasificación de los fijadores según su mecanismo de acción
Mezclas fijadoras
Simples
¾ QUÍMICOS
Carnoy, etc.
Líquido de Zenker
Líquido de Bouin
Tetróxido de osmio (para MET)
Glutaraldehído (para MET - MEB)
Cloruro mercúrico
Bicromato potásico
Alcohol etílico
Ácido crómico
Ácido pícrico
Ácido acético
Formaldehído
CH2=O
(Ver
o
Es necesario neutralizarlo porque contiene normalmente ácido fórmico.
Guía Curso, Pág. 9).
Pigmento formólico en tejidos que contienen mucha sangre: tinte negro
pardo oscuro. Se puede eliminar en los cortes sumergiéndolos en una
solución saturada de ácido pícrico en ROH 100º durante 24h.
Conserva los lípidos, mitocondrias y aparato de Golgi.
Lavado: 1 a 2 h con agua corriente. Si la fijación es reciente, acortar el tiempo de lavado.
Endurece considerablemente los tejidos.
Óptimo: 48 h.
Tiempo de fijación: variable, entre 12 y 24 h, depende del tamaño de la pieza.
Velocidad de penetración: rápida. Velocidad de fijación: lento.
Se lo utiliza en distintas concentraciones. Ej. 4% o 10% (Ver Guía Curso, Pág. 9)
Comercialmente: solución acuosa al 37- 40% de formaldehído (presenta impurezas de
metanol y ácido fórmico).
Fijador y conservador.
9 Formaldehído al 4%:
Fijadores simples
T: Tóxico
Frases R:
R 25: Tóxico por ingestión.
R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.
R 40: Nocivo
R 34: Provoca quemaduras.
S 23: No respirar los vapores.
Frases S:
S 36/ 37: Úsese indumentaria y guantas de protección adecuados.
S 26: En caso de contacto con los ojos, lávese inmediatamente con agua abundante y acúdase a
un médico.
Peligros que presenta el formaldehído según las hojas de Seguridad
Deja a los tejidos con carga negativa, por ende los tejidos se vuelven afín por aquellos
colorantes básicos (exponen cargas positivas).
No interfiere en la coloración ulterior de los preparados. Ideal para llevar en
campañas, luego en el laboratorio se puede re-fijar el material.
Ideal para el estudio del sistema nervioso y aplicación de técnicas de impregnación
argéntica.
Ideal para estudios histológicos topográficos (biopsias).
Puede post-fijarse las piezas utilizando otros fijadores como Bouin, Zenker.
Previamente se recomienda lavar las piezas durante 6 horas en agua corriente.
Recomendado para técnicas de inmunolocalización o hibridización in situ..
Paraformaldehído …….. 4g
Agua destilada ………...90 ml a 65 ºC (usar máscara y preparar bajo
campana)
2 gotas de NaOH 2N (1M).
Mezclar con agitador hasta disolver.
10 ml de PBS 10x , ajustar a pH 7.2
Filtrar y enfriar a 4 ºC antes de usar.
Se puede preparar alícuotas en tubos falcon y freezarlos a -20ºC.
Tiempo de fijación: toda la noche
Temperatura: 4 ºC
Lavado de las piezas en PBS 1x a 4ºC, 20-30 min (2 veces).
Lavado de las piezas en 0.85% NaCl a 4ºC, 20-30 min (2 veces).
Lavado de las piezas en 0.85% NaCl en ROH 50% a Tº ambiente, 20-30 min, 2
veces.
Lavado de las piezas en ROH 50% a Tº ambiente, 20-30 min, 2 veces.
Lavado de las piezas en ROH 70% a Tº ambiente, 20-30 min, 2 veces. Conservar
hasta su procesamiento.
9 Paraformaldehído (PFA) 4% (CH 2 O) n (n tiene un valor entre 6 y100)
Frases S:
S 16: Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar.
S 22: No respirar el polvo.
S 25: Evítese el contacto con los ojos
XI Irritante
Frases R:
R 22: Nocivo por ingestión.
R 36/37: Irrita los ojos y las vías respiratorias.
R 40: Posibles efectos cancerígenos.
Peligros que presenta el paraformaldehído según las hojas de Seguridad
CH3-CH2-OH
Buen fijador para técnicas inmunocitoquímicas ya que casi no altera la estructura
antigénica de los tejidos. Ideal para estudios de ácidos nucleicos.
Se lo utiliza hirviendo (2-10 min) para la fijación de invertebrados. (Ver próxima
teórica).
Se conserva en los tejidos: sustancias albuminoideas, gránulos de mucina, gránulos
de mastocitos, glucógeno, algunos pigmentos, hierro, calcio, etc.
Si la pieza tiene que conservarse en alcohol, es necesario pasarla a ROH 90° y
después a 80°.
Penetración: lenta en el caso del ROH 100º
Tiempo de fijación: rápido. Piezas pequeñas (1-2 mm): 20 y 30 min.
(2-3 mm): 1- 3 horas.
Líquido claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor agradable.
Como fijador se lo utiliza en las concentraciones entre el 70 y 100%.
9Alcohol etílico
Puede dar origen a fenómenos de desplazamiento de sustancias.
Prepara mal a los cortes para su ulterior coloración porque carece de efecto
mordiente.
A medida que realiza la fijación se va diluyendo al incorporar el agua que extrae
de los tejidos por lo cual pierde actividad progresivamente.
Para piezas mayores NO ES RECOMENDABLE.
Una acción prolongada en ROPH 100°, dificulta la confección de buenos cortes
histológicos, además de provocar la contracción y endurecimiento del material.
No fija adecuadamente la cromatina porque disuelve los ácidos nucleicos y además
disuelve parcialmente las grasas, compuestos de colesterina, sustancia cromafín,
etc.
Es incompatible con muchos fijadores: como el bicromato potásico o el tetróxido
de osmio. lo que limita su participación en muchas mezclas fijadoras.
Altera considerablemente la morfología del tejido, produciendo retracción.
Mitocondrias no se conservan.
Entre sus inconvenientes:
Utilizar guantes para su manipulación y anteojos de protección.
Inflamable. Se evapora fácilmente.
Piel: Resequedad. Irritación.
Ojos: Irritación, enrojecimiento, dolor, sensación de
quemadura.
Afecta el tracto respiratorio, sistema nervioso central causa dolor
de cabeza.
Ingestión: Sensación de quemadura. Actúa al principio como
estimulante seguido de depresión, dolor de cabeza, visión borrosa,
somnolencia e inconsciencia.
Peligros que presenta el alcohol etílico según las hojas de Seguridad
3
Frases S:
S1/2: Consérvese bajo llave y manténgase fuera del alcance de
los niños.
S23: No respirar los vapores / aerosoles.
S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y
abundantemente con agua y acúdase a u
R10: Inflamable
R34: Provoca quemaduras
R35: Provoca quemaduras graves.
Frases R:
Peligros que presenta el ácido acético según las hojas de Seguridad
Penetración: rápida
CH COOH
Produce aumento del volumen del tejido, pero no endurece al tejido.
No fija proteínas citoplasmáticas, pero precipita las del núcleo, por ende resalta
claramente los núcleos.
Destruye las mitocondrias y no fija bien las membranas.
Inhibe actividad enzimática.
Reporta grandes ventajas cuando se lo utiliza formando parte de otras mezclas
fijadoras, en soluciones diluidas entre el 0.3 y 5% o en soluciones descalcificantes.
9Acido acético 1% - 5%
NO LAVAR EN AGUA, porque los picratos se solubilizan en el agua, además de
producir un gran hinchazón de las piezas.
Conservación: en ROH 70°, debe ser renovado varias veces.
Acción ligeramente descalcificante, entonces CUIDADO con los órganos que
contienen calcio.
Se trata de un compuesto con propiedades precipitantes al formar sales (picratos)
con algunas proteínas con grupos básicos que las hace insolubles.
Tiempo de fijación: 1 a 24 h (depende del tamaño de la pieza).
Tiene penetración lenta, pero buena velocidad de fijación.
Es un excelente fijador estructural que conserva adecuadamente la composición
proteica de los tejidos.
Se lo utiliza en solución saturada, preferentemente acuosa al 0.5-5%.
Es muy recomendable sobre todo en compañía del formaldehído y el ácido acético.
9Acido pícrico
Consérvese el recipiente bien cerrado y en lugar fresco.
Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado.
Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las
precauciones posibles.
Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).
Explosivo en estado seco. Muy tóxico.
Riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición.
Forma compuestos metálicos explosivos muy sensibles.
Tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
Peligros que presenta el ácido pícrico según las hojas de Seguridad
La utilización de soluciones de ácido pícrico muy diluido ejerce una acción maceradora.
Colorea los tejidos/órganos de color amarillo. Se recomienda eliminarlo, previo a la
coloración porque en algunos casos puede interferir con la técnica.
Si se prolonga el tiempo de fijación pueden aparecer una excesiva retracción tisular.
Inconvenientes
R 49: Puede causar cáncer por inhalación.
R 8: Peligro de fuego en contacto con materias combustibles.
R 25: Tóxico por ingestión.
R 35: Provoca quemaduras graves.
R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.
R 50/53: Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en
el medio ambiente acuático.
Frases S:
S 53: Evítese la exposición –recábense instrucciones especiales antes de su uso.
S 45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico
S 60: Elimínese el producto y su recipiente como residuos peligrosos.
S 61: Evítese su liberación al medio ambiente.
Peligros que presenta el ácido crómico según las hojas de Seguridad
Se emplea en diluciones acuosas entre el 0.5 y 2%.
Es un fuerte oxidante, por lo que es incompatible con el formol y el alcohol.
Velocidad de penetración lenta, por lo que las piezas deben ser de pequeño tamaño y el
tiempo de fijación algunas horas. Para piezas grandes varios días o semanas, renovando
repetidas veces el fijador.
Precipita todas clases de proteínas.
Actúa como mordiente en coloraciones que emplean colorantes básicos.
Debe eliminarse totalmente, lavando con abundante agua ya que impregna a los tejidos de
una coloración amarillenta/verdosa.
Sólo es empleado muy pocas veces, generalmente se lo utiliza combinado con otros
fijadores como ácido acético 5%.
9Acido crómico
Se forman frecuentemente pigmentos de color verde debido a la acción de la luz
durante la fijación, suelen confundirse con pigmentos naturales. Por eso durante la
fijación las piezas se mantienen en oscuridad.
Combinado con otros líquidos fijadores da muy buenos resultados, como con el ácido
acético. Es incompatible con el formaldehído 40% y el alcohol.
Se utiliza para el estudio del sistema nervioso y de ojo.
La forma de las células se conserva pero se pierde detalles estructurales de los
núcleos.
Poco endurecimiento del tejidos lo que dificulta la obtención de buenos cortes.
No se producen cambios en el volumen del tejido.
Velocidad de Penetración: baja
No se recomienda que se lo utilice solo. Si se lo utiliza como único fijador, se deben
poner las piezas en una solución acuosa al 1-2%.
9Bicromato Potásico (cromato ácido de potasio, cromato doble de potasio, dicromato de potásico)
Frases S:
S 53: Evítese la exposición-recábense instrucciones especiales antes de su uso.
S 45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible,
muéstrele la etiqueta).
S 60: Elimínese el producto su recipiente como residuos peligrosos.
S 61: Evítese su liberación al medio ambiente.
Frases R:
R 45: Puede causar cáncer por inhalación.
R 46: Puede causar alteraciones genéticas hereditarias.
R 21: Nocivo en contacto con la piel.
R 25: Tóxico por ingestión.
R 26: Muy tóxico por inhalación.
R 37/38: Irrita las vías respiratorias y piel.
R 41: Riesgo de lesiones oculares graves.
R 43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.
R 50: Muy tóxico para los organismos acuáticos.
R 53: Puede provocar a largo plazo efectos negativas en el medio ambiente acuático.
Peligros que presenta el bicromato potásico según las hojas de Seguridad
Provoca artefactos tisulares como la aparición de vacuolas citoplasmáticas, retracciones u
cambios en la morfología nuclear.
Lavar con abundante agua.
No lavar con agua. Pasar el material directamente a ROH 70°.
Se forman en las piezas precipitados metálicos de mercurio de color pardo, lo cual dificulta
la observación. Se pueden eliminar, durante el proceso de deshidratación, colocando en el
ROH 70° o 80° algunas gotas de una solución alcohólica de yodo e ioduro potásico. Se
deja en esta solución hasta que el alcohol tome un color pardo (color del coñac) (Ver Guía
del Curso, Pág. 16).
Tiempo de fijación: 4 a 6 h. Cuando las piezas se tornan de color blanco, entonces deben
ser retiradas del fijador. No prolongar el tiempo porque se contrae y endurece el tejido.
Tiene una velocidad de penetración muy rápida, pero una velocidad de fijación lenta
entonces el tamaño de las piezas no debe exceder de 3-5 mm.
Es un excelente mordiente por lo que produce una intensa y brillante coloración nuclear y
citoplasmática.
Es un excelente fijador de los caracteres morfológicos celulares por lo que es el de elección
para patologías hematopoyéticas y renales.
Se lo utiliza en soluciones del 5-6% o formando parte de mezclas fijadoras como el líquido
de Zenker.
9 Sublimado o cloruro de mercurio
Frases S: 36/37/39-45-60-61
Utilizar indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos-la cara.
En caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al médico.
Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos.
Evítese su liberación al medio ambiente.
Frases R: 28-34-48/24/25-50/53
Muy tóxico por ingestión.
Provoca quemaduras.
Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por contacto con la piel e ingestión.
Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos
negativos en el medio ambiente acuático.
Peligros que presenta el cloruro mercúrico según las hojas de Seguridad
Evitar utilizar instrumentos metálicos cuando se manipula fijadores que contienen
sublimado.
Otra dificultad: hay que eliminar el iodo de las preparaciones porque puede interferir con
las coloraciones, especialmente con las anilinas. Para decolorar los cortes, utilizar una
solución de hiposulfito sódico 0.25%, durante algunos minutos.
Formaldehído 37-40% ….…… ………. 10 ml
Cloruro de calcio anhidro10%.............. 10 ml
Agua destilada………………. . ………80 ml
Transferir el material a ROH 70° o 50°
Tiempo de fijación: 24 a 72 h. Si se prolonga el tiempo de fijación puede debilitarse
la coloración de fosfolípidos, por ejemplo.
Cortes por congelación.
Ideal para la preservación de lípidos y estudios histoenzimáticos. La presencia de
iones calcio aumenta la preservación de algunos tipos de lípidos, por ejemplo
fosfoípidos.
9 Formol Calcio o Líquido de Baker (1944) (Ver Guía del Curso, Pág. 9)
™ Mezclas que contienen principalmente formaldehído en su composición
Mezclas fijadoras
Ideal para estudios inmunohistoquímicos.
Tiempo de fijación: no inferior a 18 h
Velocidad de penetración: lenta (1mm/h) para una pieza de 0.5 cm.
Ideal para prevenir choques osmóticos cuando se prepara la solución de
formaldehído al 10% en agua destilada y los pigmentos formólicos que
ocurren a un pH inferior a 6.
9 Formaldehido Tamponado al 10%
El material no puede conservarse ahí por más de una semana porque pueden formarse
pigmentos formólicos.
Puede guardarse por varios meses.
Esta solución debe ser hecha al menos un día antes de usar para dar tiempo a la
depolimarización de polímeros del formaldehído.
Formaldehído 37-40%............ 100 ml
Cloruro de Sodio………… 9 g
Agua destilada……….. …….900ml
Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de disoluciones
de formaldehído en agua destilada.
9 Formol Salino
Desventaja: produce retracción de los tejidos, hemólisis masiva de eritrositos, pobre
conservación del ADN.
Dan buenos resultados las coloraciones topográficas.
Los lípidos son disueltos. Fijador ideal para conservación de glucógeno.
Es un buen fijador de la cromatina. Es un eficiente fijador para técnicas histoquímicas.
Transferir directamente a ROH 100° o una mezcla de ROH 100 – cloroformo (1:1).
Tiempo de fijación: corto, de 2 a 4 h. Para piezas de 5 mm de grosor como máximo 6 h.
Velocidad de fijación: rápida.
Acción rápida.
ROH 100°………………..60 ml
Cloroformo ……………...30 ml
Ác. acético glacial……….10 ml
9 Líquido de Carnoy (1886) (Ver Guía del Curso, Pág. 10)
™Mezclas que contienen alcohol
Ácido acético glacial…………………….
Formaldehído 37-40% ………………
Color amarillento de las piezas.
Contrae y
ablanda
Endurece
Hincha y
ablanda
Ác. Pícrico
Formaldehído
40%
Ác. acético
Penetración
Se trasladan las piezas directamente a ROH 70º y se las conserva hasta el momento de su
procesamiento.
Poder de
Efecto
No se lavan las piezas con agua (las proteínas coaguladas por la acción del ácido pícrico,
se solubilizan en el agua de lavado).
De empleo fácil, no exige cuidados especiales.
Tiempo de fijación: 12 a 18 h., aunque una permanencia de hasta 8 días no perjudica a las
piezas. Recordar que no es un líquido de conservación.
Las piezas pueden ser relativamente voluminosas hasta 1 cm de espesor.
Es muy penetrante ( por acción del ácido acético y el formaldehído 40%).
5 ml
25 ml
Sol. acuosa saturada de ácido pícrico …. 70 ml
Ideal para estudios morfológicos y de anatomía microscópica.
9 Líquido de Bouin (1902) (Ver Pág. 9)
™ Mezclas que contienen ácido pícrico
Para órganos que contienen glucógeno 4 h de fijación a temperatura ambiente da muy
buenos resultados.
Ideal para la conservación de glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina.
Realizar varios lavados con ROH 96º, conservar en ROH 100°.
Este fijador tiene que ser enfriado a -73°C antes de usar.
Tiempo de fijación : 1 a 12 h a temperatura ambiente o de 18 a 24 h en heladera.
Ácido acético glacial……………………. ….. 5 ml
Formaldehído 37-40% ………………………10 ml
Sol. saturada de ácido pícrico en ROH 96°…. 85 ml
9Líquido de Gendre (1937) (Ver Guía del Curso, Pág. 10)
Poder de
Penetración
Bicromato de K: Las piezas fijadas deben
lavarse durante 24 h. en agua corriente
con circulación continua para evitar la
formación de precipitados de óxido crómico.
Ácido acético glacial….….. …5 ml
Agua destilada……………100 ml
Sulfato de sodio……………..1g
Bicromato potásico……….....5 g
Cloruro mercúrico…………5 g
Tamaño de las piezas: pequeño
Tiempo de fijación: de 4 a 24 h.
Es necesario eliminar el precipitado de mercurio metálico o de cloruro mercurioso en
los tejidos, entonces debe lavarse las piezas con alcohol iodado. El mercurio precipita
como ioduro de mercurio. Luego tratar los cortes con una solución de hiposulfito de sodio
al 0.25% para eliminar el iodo.
Usar para manipular las piezas espinas de cactus .
Cl2Hg (sublimado corrosivo): Es muy tóxico, se absorbe por piel USAR GUANTES!!!!
Ácido Acético
Bicromato de K
Cl2Hg
Componentes
9 Líquido de Zenker (1884) (Ver Guía del Curso, Pág.10)
™Mezcla que contiene sublimado
Se lo utiliza combinado con el paraformaldehído 8% (Fijador de Karnovsky .Ver Guía del
Curso, Pág. 11).
Tiene una excepcional capacidad para preservar la morfología celular.
Gran capacidad de retracción y endurecimiento tisular, por ende el tiempo de fijación no
debe superar las 4 h, si se trabaja a 4°C. Se prolongan los tiempos si se realiza a
temperatura ambiente.
Velocidad de penetración: baja, por ende los fragmentos de tejidos tiene que ser muy
pequeños, pocos milímetros cúbicos.
Se emplea al 1-3% diluido en soluciones tampón, (pH 7.2-7.4) debido a la baja
osmolaridad que tiene.
Se lo suele comprar concentrado al 25% en solución acuosa a pH 3. Se conserva en la
heladera.
9 Glutaraldehído (Ver Guía del Curso, Pág. 11)
Fijadores simples: glutaraldehído, paraformaldehído,
tetróxido de osmio.
Fijadores para Microscopía Electrónica
Frases S: 26-36/37/39-45-61
En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua
y acúdase a un médico.
Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. En
caso de
accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico.
Evítese su liberación al medio ambiente.
Frases R: 22-23-34-42/43-50
Nocivo por ingestión. Tóxico por inhalación.
Provoca quemaduras. Posibilidad de sensibilización por inhalación y en
contacto con la piel. Muy tóxico para los organismos acuáticos.
Peligros que presenta el glutaraldehído según las hojas de Seguridad
Afecta vías respiratorias al inhalarlo. Irrita garganta, nariz, pulmones.
En contacto con la piel causa irritación, salpullido, quemaduras.
En los ojos ocasiona irritación, quemaduras e incluso pérdida de visión
(opacidad córnea).
Puede causar daño en el riñón.
Usar guantes, ropa de protección y anteojos de protección.
Peligros que presenta el tetróxido de osmio según las hojas de Seguridad
No facilita las tinciones nucleares, por eso es necesario lavar abundantemente.
Debe ser cuidadosamente eliminado mediante un lavado con agua.
Fija adecuadamente las mitocondrias, aparato de Golgi y las grasas.
No contrae.
Velocidad de penetración: baja por ende las muestras deben tener un pequeño
volumen.
Se lo utiliza en la MET como 2° fijador o post-fijador.
Solución óptima de trabajo al 1-2% en tampón fosfato (Ver Guía del Curso Pág. 11).
9 Tetróxido de Osmio
c) Según el tipo de animal y/o tipo de órgano.
b) Según la coloración que se piensa realizar
a) Según el tipo de estudio a realizar
1. Elección del fijador:
Topográfico
Histoquímico
Inmunocitoquímico
Microscopía electrónica
LA FIJACIÓN … EN LA PRÁCTICA
Muestras pequeñas. Tener en cuenta la morfología interna
del órgano (macizo o hueco).
PERFUSIÓN (Ver Guía del Curso, Pág. 12-13)
INMERSIÓN
Para fijación con glutaraldehído se pueden utilizar
Frascos extremadamente limpios (sobre todo en las fijaciones a base de osmio), de vidrio.
4. Preparación de recipientes:
Los fijadores sólo se emplean una vez.
¾ Soluciones fijadoras: Formol-Ca, Líquido de Bouin, Líquido de Gendre, Zenker
(Ver Guía del Curso, Pág. 8-13).
¾ Fijador simple: Formaldehído 4% previa neutralización (Ver Guía del Curso,
Pág. 21) y Glutaraldehído 3% en tampón fosfato pH 7.2 (para MET).
Tener en cuenta que el volumen del fijador sea por lo menos 20 veces el de la pieza.
3. Preparación de fijadores:
FIJACIÓN
DE
MÉTODOS
2. Elección del tipo de procedimiento de fijación: inmersión o perfusión
VERTEBRADOS
Desmedulación.
Hipotermia.
Inyección intraperitoneal, intramuscular o endovenosa:
nembutal sódico.
Inhalación de vapores. Para organismos terrestres: éter,
cloroformo, tetracloruro de carbono.
Dilución en el medio para peces y anfibios: benzocaina,
MS222.
INVERTEBRADOS (Ver explicación teórica de la tarde)
6. Narcotización o anestesia del animal:
Con el líquido de Zenker, poner un papel adentro y otro afuera (alcohol iodado ennegrece la
etiqueta).
Los fijadores a base de ácido ósmico no permite la colocación de etiquetas en los frascos
porque las ennegrece, por lo que se puede pegar provisoriamente una etiqueta en el exterior.
Escribir con lápiz o tinta china: Nº de grupo, órgano; animal, sexo, fijador.
5. Preparación de etiquetas. Datos del espécimen.
Órgano
blando
Gota de fijador
Los órganos no deben sufrir ninguna lesión mecánica, ni ser aplastados con la pinza.
1° con una tijera obtener el órgano. Sobre una placa de cera con una Gillette afilada
o una cuchilla de descarte u hoja de bisturí fraccionar el material en porciones menores.
Los extremos que fueron cortados con tijera, se seccionan y se desechan.
Placa de cera
8. Extracción de órganos:
Cuando los animales son fijados in toto, es conveniente hacer incisiones en la pared
del cuerpo, sin ser destruida conexiones anatómicas importantes, para que el fijador
pueda penetrar. Sino lo mejor es perfundir y luego sumergir el animal en el fijador.
RECORDAR tener en cuenta más que el volumen de la pieza, su grosor.
Conocimiento previo de la anatomía. Consulta de bibliografía.
Tener en cuenta qué órganos se quieren fijar.
7. Disección:
Músculo esquelético
9 Ganglios nerviosos
9 Médula espinal
9 Encéfalo
9 Piel
9 Hueso
9
9 Hígado
9 Estómago
No deben extraerse más allá de los 20 min. post-mortem.
No más allá de los 15 min.
5 a 10 min. post-mortem
Intestino delgado
9 Intestino grueso
9
9 Adrenal,
9 Páncreas
9 Riñón,
9 Glándulas endocrinas y exocrinas (lo más rápido posible)
A. Para la extracción de los órganos/ tejidos considerar las siguientes prioridades:
F) Piel: Se depilan los pelos y se adhiere su cara externa a un papel de filtro. Se sumerge
en el fijador.
E. Órganos macizos (Ej: hígado, testículo): Se sumerge el órgano entero en el fijador 5
min y luego se lo corta en pequeños pedacitos.
D. Pulmón: Se inyecta el fijador por la tráquea.
Para evitar la contracción se estira un pedacito del órgano (un cuadrado) sobre un papel
de filtro y se introduce dentro del recipiente con el fijador.
C. Órganos con gran desarrollo de la musculatura (Ej: estómago):
5) Se fija por inmersión.
4) Se ata el otro extremo.
3) Se agrega fijador en el interior.
2) Se ata un extremo.
1) Lavado del interior con solución fisiológica.
B. Órganos con contenido (Ej: intestino): tener en cuenta orientación (A-P)
10. Las piezas serán depositadas en el fijador con la ayuda de un pincel. Recordar que si
la mezcla fijadora contiene sublimado no se puede manipular el material con instrumental
metálico.
9. Sumergir la pieza directamente en el fijador y no en un recipiente vacío, en el que luego
se pondrá el fijador, a fin de evitar cualquier adherencia de una superficie de la pieza al
vidrio.
Asegurarse que todas las caras de la pieza estén en contacto con el fijador, sino envolverla en
una gasa y colocarle un hilo sujeto a la tapa para que quede suspendida o bien colocar en el
fondo del recipiente una capa de algodón .
EN LA TÉCNICA HISTOLÓGICA UN DEFECTO DE
FIJACIÓN NO PUEDE SER SUBSANADO;
ES INÚTIL PRETENDER HACER UN ESTUDIO
HISTOLÓGICO DE UN MATERIAL CON DEFECTOS
DE FIJACIÓN.
“NO EXISTE EL FIJADOR IDEAL; TODOS TIENEN SUS
FORTALEZAS Y DEBILIDADES”
RECORDAR