Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre

Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
r
1116
05+
TESISDOCTORAL
FACULTAD DE MEDICINA
UMVERSIDAD DE ALICANTE
EFECTOSrN VITRO DE ANAPSOS(POLYPODIUM
LEUCOTOMOS)SOBREFENOTTPOCELULAR Y
pRoDUCCTóNDE cITocINAS EN cÉr,ur¿.s
M ONOI\UC LEARES HUMAI{AS
por: JoséMiguel SempereOrtells
Presentada
MedicoInmunólogo.
Dirigida por: Prof. Dr. D. Adolfo CamposFerrer
Departamento
de Medicinay Psiquiatría
idad de Alicante.
ffi
pos Ferrer
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
DEDICATORIA
A Amparo y a Roberto,por su paciencia,comprensióny conslanteestímulo
y apoyo.
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
AGRADECIMIENTOS
Al Prof. Dr. D. Adolfo CamposFerrer, por su permanenteestímulodurante
la direcciónde estatesisy su ayudaen la realizaciónde la misma.
A Dña. Clara RodrigoMollá, por su inestimablecolaboracióndurantela
elaboraciónde estetrabajo.
A D. Eliseo Quintanilla Aimagro, por habermedado la oportunidad y
proporcionadolos mediosnecesarios
parainvestigarcon el productoAnapsos.
Al D¡. D. JoséMaría Zabay Becerril, por haberintervenidode un modo
decisivoen mi formacióncomoinmunólogo.
Al Prof. Dr. D. Juan José Bayonade Perogordo,por su magisterio
interdisciplinar.
A aquelloscompañeros
de A.S.A.C, que desinteresadamente
donaronsu
sangreparapoder redizar el presentetrabajo,y a D. Miguel Angel Carrión por su
asesoramiento
informático.
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TABLA DE ABREVIATURAS
c-MSH: alfa-melatohormona
aa:aminoácidos
AcMo: anticuerpos
monoclonales
ACTH: hormonaadrenocorticotropa
ADCC: citotoxicidaddependiente
de anticuerpo
monofosfato
AMPc: adenosfn
ciclfco
ANP: anapsos
APC: célulapresentadora
de antfgeno
C3: t'actor3 del sistemadel Complemento
C5a: factor5 del sistemadel Complemento
(clusterditl-erentiation)
CD: antfgenos
de dit'erenciación
intravascular
CID : coagulación
diseminada
Con A: concanavalina
A
CRF: f'actorde liberacionde ACTH
CSF:tactorestimulante
de colonias
CSIF: t'actorinhibidorde la sfntesisde citocinas
DTH: hipersensibilidad
retardada
EBV: virus de Epstein-Barr
e.s.m:errorestandar
de la media
FITC: isotiocianato
de t'luoresceína
G-CSF:t'actorestimulante
de coloniasgranulocíticas
GM-CSF: t'actorestimulante
de coloniasmielomonocíticas
H2O2: peróxidode hidrógeno
ICAM: moléculade adhesiónintercelular
Ig: inmunoglobulinas
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de superticie
IgS: inmunoglobulinas
IL: interleucinas
IL-lR: receptorparala interleucina-1
del receptor
de la IL-l
IL-lRa: antagonista
IL-2R: receptorparala interleucina-2
INF: intert'erón
Kd: kilodaltons
por linfocinas
activadas
LAK: célulasasesinas
LB: lintbcito B
LCR: lfquidocefaloraquideo
LGL: linfocitosgrandesgranulares
LH: hormonalutea
LPS: lipopolisacárido
bacteriano
LT: lintbcitoT
LTB4: leucotrieno84
LTc: lintbcitoT citotóxico
(helper)
LTH: lintbcitoT cooperador
LTs: lintbcitoT supresor
M-CSF: factorestimulante
de coloniasmonocíticas
MHC/HLA : complejomayorde histocompatibil
idad
MIF: factorde inhibiciónde los macróf'agos
NGF: t-actorde crecimientonervioso
NK: célulasasesinas
naturales(naturalkiller)
NO: oxido nftrico
PAF: t'actorde activaciónplaquetaria
PBMNc:célulasmononucleares
de sangreperiférica
PDGF: productoscledegradación
del tibrinógeno
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PE: ficoeritrina
PGE2: prostaglandina
E2
PHA: titohemaglutinina
PKC: proteíncinasaC
Pm: pesomolecular
PMA: ésteresde tbrbol
PMN: leucocitospolimorfbnucleares
PWM: pokeweedmitogen
inmune
RI: respuesta
SI: sistemainmune
SMF: sistemamononuclear
tagocftico
SMM: sistemamonocito/macrót'ago
SNC: sistemanerviosocentral
SNP: sistemanerviosoperitérico
(hormonadel crecimiento)
STH: somatotropina
Tac: cadenaalt'adel receptorde la IL-2
TC: tercercolor
TCR: receptordel lintbcitoT
TGF-p: t'actorde transtbrmación
del crecimiento
beta
TIL: linfbcitosint'iltradores
de tumor
TNF: tactorde necrosistumoral
(hormona
TSH: tirostimulina
estimulante
del tiroides)
VLA: antígenos
muy tardfos
x: mediaaritmética
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
INDICE
.,..1
I. INTRODUCCIÓN
.....7
r.1.
CÉLULAS DE LA RESnUESTA INMUNE: LINFocITos,
MONONUCLEARESYFAGOCITOSPOLIMORFONUCLBARES
r.2. cARAcrEnrzacrÓN npxorÍprca
DE LrNFocrros y
MoNoNUCLEARas.ruNcróNDELARESpUESTAINMT.TNB
FAGocITos
......7
FAcocrros
......
t0
r.2.r. ¿.NrÍcBNosDGRESADos
ENLos LT
10
1.2.2.a,wrÍcnNosDpRESADosENrrosLB
l3
1.2.3.e¡vrÍcBNosB>rpREsADos
ENLAscÉlwns NK . .
t4
1.2.4.¡.¡¡rÍcnNos n>rpRESADOS
ENLAScÉl,ul,¡,sMIELOIDES
r6
I.2.5. A.NTÍCBNOS
E)(PRESADOS
EN LOS LEUCOCITOSACTIVADOS
t7
1.3. crrocINAS. ruNcróN EN LA RESpUESTA
INMLJNE
18
I.3.1. INTERLEUCINA 1
1 . 3 . 1 . 1E. S T R U C T U R A
20
. .. . 20
t.3.t.2.cÉlules SECREToRAS
. . zo
1 . 3 . 1 . 3I N
. DUCTORES...
..21
glI,oI-ócrcAssoBREEL sIsrEMATNMUNE. . . . 22
1.3.r.4.
ACCIoNES
1 . 3 . 1 . 4 .S
1 .o b r e l oLsT H e l p e r
...,.22
L3.1.4.2.Sobrelos LT citotóxicos
. . . Zg
1.3.1.4.3.
Sobrelos LT supresores
. . . 23
1 . 3 . 1 . 4 .S
4 .o b r e l o s l B
.....23
1 . 3 . 1 . 4 .S
5 .o b r e l a c é l u lNaKs . .
....23
1.3.1.4.S
6 .o b r e l o s m o n o c i t o / m a c r ó f a g o
....23
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I.3.I.5. ACCIONESGENERALES
24
1.3.1.5.1.Secreción
de otrascitocinas
y mediadores
...
24
1.3.1.5.2.Actividadantitumoral
25
1.3.1.5.3.Inte¡acción
conel sistema
nervioso
26
1.3.1.5.4.
En la hematopoyesis
27
1.3.1.5.5.
En la inflamación
28
1.3.1.5.6.CIrasacciones
29
1.3.I.6.INHIBIDORES
I.3.I.7. RECEPTORES
I.3.2. FACTOR DE NBCROSISTUMORAL
1.3.2.1
E.S T R U C T U R A
29
30
3r
....31
1.3.2.2.CÉLULASSECRETOMS
. . 32
|.3.2.3.INDUCTOR
..E
. S
..32
1.3.2.4.ACCIONES
BIOLÓGICAS
SOBREEL SISTEMAINMUNE . . . . . 33
1.3.2.5.
ACCIONES
GENERALES
. . 35
1.3.2.5.1.Secreción
de otrascitocinas
y mediadores
...
35
1.3.2.5.2.Actividadantitumoral
35
1.3.2.5.3.lnteracción
conel sistema
nervioso
36
1.3.2.5.4.En la hematopoyesis
36
1.3.2.5.5.
En la inflamación
36
1.3.2.5.6.
Caquexia
37
1.3.2.5.7.En la resistencia
a infecciones
37
| .3.2.5.8. Otrasacciones
38
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I.3,2.6,INHIBIDORES..
...38
1.3.2.R
7 .E C E P T O R E S . . .
..39
1.3.3. INTERLEUCINA 2
I.3.3.I.ESTRUCTURA
....40
1 . 3 . 3 .c2É. t - u l e ss E C R E T o R .A. .S
.... 4r
I.3.3.3.[NDUCTORES...
..4r
1.3.3.4.
ACCToNES
slolócrces
. . 42
1 . 3 . 3 . 4 .S
1 .o b r e l o s l T
.....42
l.3.3.4.2.Sobrelosl-B..
...43
1 . 3 . 3 . 4 . 3S.o b r el a sc é l u l aN
sK . .
...
I . 3 . 3 . 4 . 4 . S o b r e l o s m o n o c i t o s / m a c. .r .ó f a g o s
1.3.3.4.5.Sobrela red de citocinas
.....
43
43
. , . 44
I.3.3.5,INHIBIDORES
44
1.3.3.6.RECEPTORES
44
1.3.4. INTERFERÓ¡.VCAIUUA
....47
1.3.4.1.
ESTRUCTURA
47
1 . 3 . 4 . 2C. É L U L A SS E C R E T O R A .S. .
48
T.3.4.3.
INDUCTORES
49
1.3.4.4.ACCIONESBIOLÓGICAS
1.3.4.4.1.
Sobrelos LT y los LB
l.3.4.4.2.SobrelascélulasNK..
l . 3 . 4 . 4 . 3 . S o b r e l o s m o n o c i t o s / m a c. r. .ó f a g o s
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. . 49
. . . . S0
...52
.....
Sz
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1,.3.4.4.4.Sobrelos leucocitos
polimorfonucleares
53
1.3.4.4.5.Sobrela redde citocinas
53
1..3.4.5.
INHIBIDORES
54
1,3.4.6.RECEPTORES
SS
1.3.5. INTERLEUCINA 4
56
I.3.5.I.ESTRUCTURA
56
1.3.5.2.CÉLULASSECRETORAS
56
I.3.5.3.INDUCTORES
57
1.3.5.4.ACCIONESBIOLÓGICAS
57
1.3.5.4.1.
Sobrelos LT y lascélulas
NK . .
. . Sg
1.3.5.4.2.
Sobrelos LB
l.3.5.4.3.Sobrelascélulasmielomonocitarias
1.3.5.5.INHIBIDORES
I.3.5.6.RECEPTORES
13.6. INTERLEUCINA 10
1.3.6.I,ESTRUCTURA
......
60
6l
6l
63
63
1.3.6.2.CÉLULASSECRETORAS
E INDUCTORAS
64
1.3.6.3.ACCIONESBIOLÓGTCAS
64
I .3.6.3.I . Propiedades
inmunosupresoras
" in vitro"
| .3.6.3.2.Propiedades
inmunoestimulantes',
in vitro,,
1.3.6.3.3.
Propiedades
"in vivo"
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INHIBTDORES
..
T.3.6.4.
69
..
1.3.6.5.RECEPTORES
69
I.4.LARESPUESTAINMUNB
T,4.I. LA ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T HELPER . .
I.4.2. LA ACTIVACIÓN DB LOS LINFOCITOS T CITOTÓXICOS
....70
. . 72
. . . . 74
r . 4 . 3 .L A A C T I V A C I Ó N D E L O S L I N F O C I T O S B .
...,,74
I.4.4. LA ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T SIJPRESORES
. . . . . 75
E
INMI.JNE. INMUNOSTJPRESORES
1.5. MODIFICACIÓN DE LA RESPI.JESTA
INMI.JNOMODULADORES
...76
1.5.1.TNMUNOSUPRESORES
....76
1.5.I. I. CORTICOSTEROIDES
76
1.5.1.2.DROGASCITOTÓXICAS
80
1.5.I.3.CICLOSPORINA
81
T.S.2.INMUNOMODULADORES
. . 84
1.6. ANAPSOS: EXTRACTO DE POLYPODILIM LEUCOTOMOS
. . . . . 87
I I . O B J ET IV OS
..90
III.MATERIALYMÉTODOS
..91
3.I. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO
3 . 2 .M U E S T R A D E L E S T U D I O
3.3. TESTS DE LABORATORIO
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. . . 9I
....92
. , . 92
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33.T. RESPI.'ESTA
PROLIFERATIVAFRENTEA MITÓGBNOS
92
3.3.2. DETERMINACIÓN DE CITOCINAS
93
3.3.3. ANÁLISIS FENOTÍPICO
94
3.4.FsrADÍsrlce,
9s
IV. RBSULTADOS
96
4.l. PRoLrrBnnctóN LINFocrrARrA
4.2.DETERMINIcIóNDE cITocrNAS
¿.s.lNÁrrsIS FnNorÍprco
96
97
l0l
v. olscusróN
104
VI. CONCLUSIONES
.. rt7
vrr. BrBlrocnnrÍa
l19
Íuorcn DEFrcuRAS
145
Írvucr DETABLAS
t47
6
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r.- INTRODUCCION
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I. INTRODUCCIÓN
1.1 CÉLULAS DE LA RESPUESTAII\MUNE: LINFOCITOS,
FAGOCITOS
MONONUCLEARES Y FAGOCITOS POLIMORFONUCLEARES.
El SistemaInmune(SI) comprendediferentestiposde células,
incluyendolos
linfocitos, fagocitos mononucleares (monocitos, macrófagos)
y
fagocitos
polimorfonucleares
(granulocitos).Estascélulasmedianfuncionesinmunes
distintas
y secretanuna gran variedadde sustancias
solublesque regulanel
SI así como la
inflamacióny las funcionesde otrostejidosy órganos(1).
Existentrestiposdiferentesde linfocitos:linfocitosT (LT),
linfocitos B (LB)
y célulasNaturalKiller (M() (l).
Los LT y LB puedenreconocermásde 10" antígenosdiferentes
mediantesus
receptoresglicoproteicosde membrana,que sonel receptor
antigénicodel LT (TCR)
y ias inmunoglobulinas
de superficie(Igs), respectivamente.
Estosreceptoresdel LT
y LB se generanrespectivamente
mediantela recombinaciónsomáticade elementos
genéticos,
duranteel desa¡rollodedichascélulasenel timo y enla
médulaósea(2,3).
Las IgS de los LB se unen "direcüamente"
a muchostipos de antígenos,
incluyendoproteínas,carbohidratoso lípidos. por
el contrario,ei receptorantigénico
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de Ia célulaT' solamente
se unea antígenos
peptídicosque a su vez esténunidos
a
moléculasdel ripo I o II dercompiejo
Mayorde Hisrocomparibilidad
(MHC/HLA),
dispuestas
a lo largode la membrana
de lascélulaspresentadoras
de antígeno(Apc).
La unión de estosreceptoresde ros
LT o LB con er correspondiente
antígeno,se
traduceen una activacióny proliferación
de dichascélulas,y en la consiguiente
liberaciónde factoressoiubles(citocinas)
que inhibeno aumenhnotrosaspectos
de
la Respuesta
Inmune(RI) (3,4).
una ca¡acte¡ística
importantey probablemente
exclusivade los linfocitosT y
B es la "memoriainmunorógica,,,
a travésde la cuai, son capacesen
un momento
dado de recordarla exposiciónprevia
a un antígenodeterminadoy de responder
rápiday enérgicamente
tras la reexposiciónar mismoantígeno
(t).
EI tercertipo de rinfocitos,Ia célura
NK o agresoranatural, al contrario
que
el LT y LB no tiene memoriainmunológica
y no expresaun receptorantigénico
resultantedel reordenamiento
génico(no sufrenreordenamiento
de los genesde las
inmunoglobulinas
ni del receptorderLT). A diferencia
de ros LT,Iacérula NK no
requierede la presenciader MHC para
reconocera susdianas(5).
Losfagocitosmononucleares
(monocito/macrófago)
soncéluiasfundamentales
para la
, encargiíndose
principalmentede la fagocitosis
de aquellosagentespatógenosde-crecimiento
intracelular(determinadas
bacterias,hongosy parásitos).su capacidad
de ingestión
y de adherencia
seve intensificada
cuandoseunena los microorganismos
a travésde
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receptoresespecializados
para ciertos carbohidratos,inmunoglobulinas(Ig) y
Complemento.
Los monocitosy macrófagospueden también comportarse
como células
presentadoras
de antígenoa linfocitosT específicamente
sensibilizados,
y de esta
forma responderde manera rápida a la eliminación
del antígeno extraño, y
postenormente
regularla respuesta
unavez queel antígenohayasidoeliminado.En
determinadas
circunstancias,
tambiénadquieren
actividadtumoricida(6_s).
Los
y eosinófilos,recibenestosnombresde acuerdo
con la tinción histológicade los
gránulosqueposeenen su citoplasma.
Aunqueestascélulasno muestranningúntipo
de especificidad
paralos antígenos,
desempeñan
unpapelimportanteen la inflamación
aguday en la proteccióncontralos microorganismos,
especialmente
aquellosde
crecimientoextracelular(dete'minadasbacterias,hongos
y parásitos)(9). Los
neutrófilosrepresenüan
másdel 90vo d,elos granulocitoscirculantesy su función
primariaes la fagocitosis
(10). Los eosinófilosrepresenüan
el2-5%
de losleucocitos
sanguíneos;
aunquetambiénsoncapacesde fagocitar,su funciónprimaria
radicaen
el papelespecializado
queejercencontralas infecciones
por
helmintos(11,12). Los
basófilosrepresenüan
menosdel0'2vode losleucocitossanguíneos,
y junto con los
mastocitosposeen griínulos en su interior que contienen
diversos mediadores
farmacológicos,quetrasla estimulaciónantigénica(aiergeno)
sonliberadosal plasma
desencadenando
lossíntomas
advei.sos
dela alergia;tambiénpuedenfagocitar(13,14).
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1.2 CARACTERIZACIÓNFENOTÍPICA
DE LINFOCITOS Y FAGOCITOS
MONONUCLEARES. FT.INCIÓNEN
LA RESPUESTAINM{.INE.
Las céiulasdet SI vana reaJizar
su funcióna travésdel contactocérura-céiura,
medianteuna seriede receptoreso antígenos
de membranaque se expresanen gran
número a lo largo de su superficie.
Algunas de estas moléculasaparecen
en
determinados
estadiosde la diferenciación
o en la activacióncelular,durantebreves
períodosde tiempo'mientrasqueot,as
soncaracterísticas
dedistintaslíneascelula¡es.
Muchosde ellos son identificables
desdehacetiempoen el laboratorio,
mediante
anticuerposmonoclonaies
(AcMo). En un intentode clasificar
a los antígenosde
superficiecelularde los leucocitos
humanos
y de proveerunanomenclatura
uniforme
para dichas estructuras,se cerebró
en el año rggz en paris, un workshop
Internacionalsobreantígenosde diferenciación
de leucocitoshumanos,donde se
acordódenominara estosantrgenos
con las siglas"cD' (Clusterof Differentiation)
(1 ) .
1.2.1
Los cuatro genesdel receptorantigénico
de las célulasT (q, g, y, ü),
codificanglicoproteínas
queformanheterodímeros
de lassubunidades
a y g o y y 6.
TCR ap seexpresaen aproximadamenteerg5%
de rascéiulasT humanas,
y es er
responsabledel reconocimiento
de los péptidosext¡añosasociados
con antígenos
propiosdel MHC decraseI o II (15-rg).
Estoshererodímeros
deTCR cuFo y6, pffB
r0
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
poder expresarseen la superficie
de la célula requierensu asociación
a cD3, un
complejocompuesto
por variascadenas
de proteínas
diferentes(4). Así, mient¡asros
heterodímeros
TCR se unenal antígeno,las proteínas
cD3 medianlas señares
de
transducción
celular,resultando
en la acüvaciónsubsecuente
derLT. La expresiónde
las diferentesproteínasquecomprenden
ei cD3 parecenserrinaje_específicas,
por lo
que el anticuerpomonoclonar
anti-cD3 constituyeel marcador
más fiabre para la
identificacióny cuantificación
de los LT (4,1g).Los LT representan
el 65_75vodel
total de linfocitosen sangreperiférica.
El antígenocD4 es unaglicoproteína
de membranade 59 Kilodaltons
(Kd)
que interactúaespecíficamente
con moréculas
MHC de craseII (DR, Dp, DQ)
(20).
EI antígenocD8 es una estructura
de dos cadenas,
compuesta
de heterodímeros
de
subunidades
c y p y de homodímeros
de subunidades
c; ra mayorpartede los AcMo
disponiblescomercialmente,
reaccionan
solo con la subunid
ad u. La glicoproteína
cD8, reaccionacon moréculas
MHC de claseI (A, B, c) (2r_23).
La interacción
entrecD4 o cD8 y las moléculas
MHC, facilitala activacióndel
LT iniciadapor ra
unión del complejoTCR al antígeno
específico(24_26\.
Los LT inician la RI, median
respuestas
efectorasespecíficasde anÍgeno,
y
regulanla actividaddeot¡osleucocitos
mediantera secreciónde factores
solubles.Las
funcionesefectorasde los LT incluyen
la citotoxicidadmediadapor
célulasy Ia
inmunidad mediada por
células (respuestade hipersensibilidad
retardada o
DTH)' El aurnentode la
activacióny diferenciaciónde
offos LT y de LB, la
supresiónde la RI (función
supresora)y la secreciónde potentes
citocinascomo er
11
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Interferóngamma(INF-y) y determinadas
interleucinas
(IL),
constituyen
lasfunciones
reguladorasde las célulasT sobre
muchosleucocitosy sobre otras células
der
organismono inmunes(27). Pueden
distinguirsedossubpoblaciones
principalesde
LT madurossegúnla expresiónde
rosantígenos
de diferenciaciónCD4 ycDs (2g_
32\:
- "La subpoblación
de LT cD4+cD8-, recibeel nombre
de cooperadora
o inductora
(TH' o helper/inducer),debidoa
su capacidad
paraaumentarlas respuesLas
mediadas
por LB y paraamplificarla respuesta
mediadapor célulasefectorascD4-cDg
+. En
sangreperiférica, represent¿nun
65-70%del totar de LT. Tras ra
exposiciónal
antígeno-MHc II, las cérulascD4+cDgse activan y proliferan. Las cérulas
activadassecretanfactoressolubles
o citocinas(rL-2 y otrasinterleucinas,
factores
estimulantes
de colonias,factorde necrosistumoral
alfa, e INF-y), que modulanlas
funcionesefectorasejercidaspor
otros leucocitoscomo los LB,
célulasNK y
monocitos,estimurandosu crecimiento,
activacióny proriferaciónde un
modo
policlonal,independiente
de antígeno.
- La poblaciónde
LT cD4-cD8 * mediaIa mayoría
de ras respuestas
citotóxicas
antígeno-específicas,
ejerciendo
sucapacida
d paramatar
a offascélulas,especialmente
célulasinfectadas
por virus, célulastumorales,
o
célulasarogénicas
provenientes
del
transplante
de un órganoo tejido. Las células
cD4-cDg+, reconocenal antígeno
peptídicoexpuestoen la superficie
de la céluladianay asociadoa moléculas
MHC
propiasde claseI' Trasel reconocimiento
del antígeno,los linfocitosT citotóxicos
(LTc) cD8+ se activany destruyen
a la céluradiana; tambiénpueden
secreüar
L2
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determinadas
citocinascomo ra rL-2 o el INF-y, las
cualespuedenaumentarras
respuestas
inmunesmediadaspor otros leucocitos.pero
ademásde la función
citotóxica, la subpoblaciónde céluras
T cD4-cDg+ puede también
suprimir
respuestas
inmunesmediadaspor otros reucocitos,
a partir de la secreciónde
determinados
factoressupresores
solublesque interfierencon ia función
de o,.as
célulasinmunes.Es por eilo por
lo que se denominaa dicha subpoblación
de
linfocitosT, citotóxica/supresora.
Si bien lo desc¡itoanterio¡men
te paralos linfocitos T cooperadores
o los
citotóxicos/supresores
es la norma,tambiénes ciertoque
la poblaciónde linfocitos
T cD4+cD8-' puede en determinadas
circunstanciasmediar citotoxicidad
e
inmunosupresión".
El antígenocD5 es unaglicopro
teínade 67 Kd,queseexpresaen
la mayoría
de las célurasT, y con una intensidad
menoren una subpoblación
de LB. Es otro
antígenocomúnmenteusadopara
fenotipar(identifica¡y cuantificar)
a los LT
(32,33).
r.2.2
El marcadormásclásicode las
célulasB lo constituyen
las inmunoglobulinas
de superficie(IgM e IgD). Sin embargo,
hay que renerespecialcuidadocuando
se
usan reactivosespecíficoscontra
Ia IgM o la IgD para Ia identiñcación
de dichos
linfocitos,ya que muchascélulas
no B queexpresan
receptoresparueIFcde Ia IgG,
t3
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puedenfijar inespecíficamente
estosreactivosy de estaforma ser inapropiadamente
enumeradas
comocélulasB (34).
El antígenocD19, es unaglicoproteína
de 90 Kd que
apareceen las células
pre-B antesde que éstasadquieran
las inmunogrobulinas
de superficie,y que sigue
presenteen la mayorparte de la
secuencia
de maduraciónde las célulasde la línea
B' Por ello constituye
el ma¡cadormásfiableparaidentificary
cuantificaral LB (34).
otro antígenocomúnmente
utilizadoparafenotiparal LB es el cD20,
ya que
se encuentraen cantidadesmás altasque
el cDlg en la superficiecelurar. No
obst'ante,este anÍgeno aparecemás tarde
en ia diferenciacióncerular, y además
t¿mbiénpuedeexpresarse
en cantidades
másbajasen unasubpoblación
de linfocitos
r (34).
Trasseractivados
por el antígeno,setransforman
en
célulasplasmáticas,
que
sonlas quevana secreta¡los anticueqpos
especíñcos
frentea los distintosantígenos.
son pueslos responsables
de la inmunidadhumoral.Tambiénpueden.actuar
como
APC a los linfocitosT (1,34).
r.2.3
Lascéruras
NK expresan
rosantígenos
dediferenciación
cD16y cD56,pero
no expresan
cD3' Encélulas
NK enreposo,
el cDl6 esexpresado
enniveres
mucho
másaltosqueel cD56,porlo queconstituye
unodelosmarcadores
deelección
para
L+
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identificar y cuantificara dichascélulas;no obstante,hay que tener en cuentaque
aproximadamente
un I\Vo de NK de sangreperiféricapuedenno expresarel CD16.
El fenotipo de la poblaciónNK será pues cD3-cD16+ ylo cD56+.
son
responsables
de mediarcitotoxicidadcontraalgunascélulasinfectadaspor virus
o
contracéiulastumorales.A diferenciadel LTc, los linfocitosNK
son capacesde
reconocery matartantoa las célulastumoralesautólogas
comoa las alogénicas,
sin
necesidad
del reconocimiento
de moléculas
MHC en la superficiede la céluladiana:
su capacidad
citotóxicano estiípuesrestringidas
por el MHC (35). No obst¿nte,su
papelfundamental
esprobablemente
en la defensacontrala infecciónviral. A causa
de que no requierenuna exposiciónprevia al antígenopara responder(carecen
de
memoriainmunológica),puedenproporcionarla defensainicial contra
los virus,
duranteel períodode latenciaquetienelugar antesdel desarroliode anticuerpos
y de
los LTc específicos
contrael antígeno.Representan
un l0-15% deltotalde linfocitos
de sangreperiférica(5).
Ademásde su actividadNK, dichascélulasmediantambiénia citotoxicidad
dependiente
de anticuerpo(ADCC), mecanismo
a travésdel cual unacélulaefectora
citotóxicapuedematara unacéluladianarecubierta
en su superficiepor anticuerpos.
La unióncon el anticuerpohjadoa la céluladianay la consiguiente
transducción
de
señales,
tienelugara travésdelantígenocDl6. EstaglicoproteÍna
esun receptorpara
el fragmentoFc de las inmunoglobulinas,
especialmente
de la IgGl
e IgG3, y esta
presenteen las células NK y en una pequeñasubpobración
de LT que también
expresan
el CD16y quepor tantomedianigualmente
ADCC; dichomarcadortambién
puedeserexpresado
en neutrófilosy en monocitos
activados.La ADCC proporciona
15
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a las célulasNK un mecanismo
para,usandola especificidad
de los anticuerpos
por
el antígeno,poderdirigir su actividadcitotóxica(35).
Tras su activación,son tambiéncapacesde secretardeterminadascitocinas,
como laIL-2 o el INF-y, pudiendode estaforma ejercerun efectomoduladoren el
crecimiento,proliferacióny activaciónpoliclonalde otrosleucocitos(5).
Otros antígenosque puedenexpresarlas NK son poco específicosde las
mismas,ya que se hallantambiénpresentes
en otraslíneascelulares.Es el casodel
cDz, cD7, cD8, cDllb
o cD57. concretamenteel cDg se expresaen
aproximadamente
un terciode lascélulasNK, perocon menorintensidadqueen los
LT citotóxicos/supresores
(5,35).
1.2.4 Antígenosexpresados
en las célulasmieloides:
Ai contrariode lo que ocurre con los linfocitos, dondelos antígenosde
superficiese han usadoparadefinir un númerode subpoblaciones
funcionaimente
distintas,los monocitosmadurosy losgranulocitos
sonmáshomogéneos.
Los niveles
de la mayoríade los antígenosde membranadetectados
en las célulasmieloides,
indicansu estadiode diferenciación,
másque delinearpoblaciones
funcionatmente
distintas.Así, las célulasprogenitoras
mieloidesexpresaninicialmenteCD34. una
glicoproteína consideradacomo un marcador de todas las células
madre
hematopoyéticas,
y cD33, una glicoproteínaque se expresacomúnmenteen las
leucemiasmieloidesagudas(36). La maduración
en la líneamonocíticatienelugar
1,6
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con la pérdidadel CD34 y la adquisición
del CDllb (receptorparael complemento
de tipo 3) y del cD14. La pérdidade cD34 y cD33
también acompañala
diferenciación
a neutrófilosmaduros,conla ganancia
del CD11b,y de
otrosantígenos
como el cD15 y el cDl6-I durantelos ríltimosestadios
de desarrolto(36).
r.2.5
I
Los leucocitos,y de un modoespeciallos LT, sufren
cambiossustanciales
en
la expresiónde losantígenos
de membrana,
trasla estimulación
inmune.Esteproceso
seacompaña
de unaregulacióna la bajao a la altadeciertosantígenos
preexistentes,
asícomode Ia expresiónde novode otrasestructuras.
Antígenospreexistentes
como
el cD38 (una antígenode funcióndesconocida,
tambiénexpresadoen timocitos,
célulasNK y célulasplasmáticas),
aumentan
su expresióndespués
de la estimulación
(37)' Tambiénaparecenotrosantígenosquehabitualmente
estánausentes
o presentes
en bajascantidadesen los LT en reposo;así, en las
dos primerashoras tras Ia
activacionde Ia célulaT, apareceel CD69, seguido
variashorasmás tardede la
apariciónde HLA-DR, cD25 (subunidad
p55 del receptorde baja afinidadde la
interleucina-2)
y cD71(receptorparalatransferrina)
(37). Las diferentesisoformas
del antígenoCD45,unafosfatasa
demembrana,
permitediscriminarcélulasT ,,naive,,
(o vírgenes;aquellasque no han tenidocontactoprevio
T de memoria;asíla isoformaCD45RA(220Kd)
se
con el antígeno),de células
expresapreferentemente
en las
célulasT "naive",mientrasquetrasla activación,hay
conversión
haciaotraisoforma.
el CD45RO(180 Kd), que es la quepersisreen las
cérurasde memoria (37).
I/
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I.3.. CITOCINAS.FT.NCIÓNEN LA RESPUESTA
INMUNE.
Todas estascélulas,apartede realizarsus funciones
por contactodirecto
céiula-célula,a través de sus receptoresespecíficos,
secretran
diversosfactores
solubles,denominados
citocinas.constituyenun grupode mediadores
peptídicosque
actúan como señalesintercelulares"regulando"
las respuestasinmunológica,
inflamatoriao reparadoradel huéspedfrentea una
noxade cualquiertipo. Sonpues
inmunomoduladores
(1). Muchas de estas glicoproteínas,,hormone-like,,
son
secretadas
en el cursode respuest¿s
inmunológicas
e inflamatorias.Las producidas
por los linfocitos son llamadaslinfocinas,
mientrasque
las producidaspor los
monocitos-macrófagos
son llamadasmonocinas (38). se diferencian
de las
inmunoglobulinas
enla falt¿deespecificidad
por los antígenos
y enquesonoperantes
a concentraciones
muchomásbajas(nivelesde picogramos),similares
al rangode
actuación de las hormonasendocrinas.Perose
diferenciande éstasen que por regia
generalactúanlocalmente,de maneraparacrina
(en célulasvecinasdentro
de un
tejido; asíes comoactúantambiénlos neurotransmisores)
o autocrina(directamente
sobrelas propiascélulasproductoras),
másque de
un modo endocrinoen células
diana a distancia' se diferenciande los neurotransmisores
en que no es&ín
previamente
preformados
esperando
,,denovo,,
serliberados,sinoquesonsintetizados
trasla estimulación.
Setratadepéptidoso glicopéptidos,
cuyopm oscilaentre10.000
y 200'000 daltons,y cuya acciónes ejercicla
a travésde la unión-a receptores
celularesde superficiede altaafinidad.Lascélulas
normalesen reposoy la mayoría
de las líneascelularesdebenser po¡ tantopreviamente
estimuladas
(activadas)
para
18
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producirias(38)' Son muchaslas citocinas
secretadas
por las célulasactivadasy es
difícil aislarunasde otras'asícomodelimitar
claramente
susfunciones,sobretodo
teniendoen cuentaque citocinascon actividades
biológicasdistintasper se, pueden
tenerefectossimilaresal poneren marcha
la producciónde una cascadao red
de
citocinasidénticas,quea suvezpueden
activara otrascitocinas,y asísucesivamen*,
formandouncomplejoentramado
difícil deinte¡pretar
(1,3g).podríamossubdividirlas
en varlosgrupos:Factores
de crecimiento.-sonsegregados
sobretodopor célulasno
rnmunes'normaleso neoplásicas,
procedentes
de muchostejidos,aunquealgunosde
e l l osta mb i é n p u e d e n se rsegr egadospor losmacr ófa8os;@
csF)'- actúansobremedulaósea,favoreciendo
la producciónpor partede ésta.de
célulasdel SistemaMieloide;
.
es el responsablede la mayor parte
de la actividadtumoricidade los monocitos
humanos;poseemuchosefectos
en comúncon la IL-l, tanto sobrelos
leucocitos
como sobreotros tejidosdel Organismo);
y y)'- presentanacdvidad anti-vírica,
anti-tumo¡are inmunomoduladora)
e
Interleucinas
(de ta IL_l a la IL_17)(3S).
El papelde ias citocinasen la respuesta
inmunita¡iase conocesobradamente
desdehacedempo (39). Así, citocinas
como la IL-lp o el rNF_a, juegan
un
importantepapeien la regulación
de las funcionesdel monocito,la célula
B y la
célula T (40) y entre otras funciones,
constituyenmediadoresimportantes
en ia
inflamación,compartiendo
multitudde efectos(4I_43).
19
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1.3.1 INTERLEUCINA.I
1.3.r. r ESTRUCTURA:La IL-r (tanto
humanacomomurina),existeen dos
formasfuncionalmente
activas:IL-la e IL-lp, codificadas
por dosgenesseparados
situadosen el cromosoma2 y sintetizadas
como precursoresde 30 Kd que,
posterio¡mente,
sefragmentan
paradar las molécuras
activascon pm de r7y 1gKd;
ambastienenuna homologÍaen su
secuencia
del 45vo (44-46).La actividadIL-l
puededetectarse
en lisadoscelulares(en su formaintracelular),
en célulasfijadas(en
su formade unióna la membrana;
solola formaIL-la seencuentra
en la membrana,
ancladacomo forma glicosiladafijada
a ras recitinasy con un pm de 23
Kd) y
tambiénen fluídosco¡poralesy
sobrenadantes
(en su forma secretada),
aunquea
concentraciones
muy bajas(47_49).
Al contrarioque otrascitocinas,la
IL-r puedealmacenarse;
es decir, puede
habe¡inducciónintracelular
y no secreción.
Lasformasintracelulares
sonbásicamente
las precursorasde 30 Kd y parala
secreción(no para la síntesis)se requiere
de la
presenciade proteíncinasa
c (PKC). La formaproIL-lB es inactiva
y al salir de la
célula,liberala IL-lp acrivade lj
Kd (4g,49).
r'3'1.2 cÉt-ules sgcR¡rones:
Muchostipos celulares,normares
y
transformados,
soncapaces
de producirla IL_1 "in vitro"; los
monocito/macrófagos
(monocitos circulantes,alveolares,
peritoneales.
esplénicos,
placentarios,
célulasde
2A
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Kupffer' microglía),queratinocitos,
célulasmesangiales
delriñón, célulasdel epitelio
corneal'linfocitosT, linfocitosB, NK,
astrocitos,célulasendoteliales,
célulasde
Langerhans'célulasdendríticas,
ñbroblastos,
neutrófilosy célulasmusculares
lisas
(50)' De todasellas,las célulasdel
sistemamonocito/macrófago
(sMM) (secreran
predominantemente
IL-1p) (51)y losqueratinocitos
(52)sonlos mayoresproductores
"in vivo".
1 .3 .1 .3IN D U C T ORES:
- algunascélulasy líneas
celularessoncapaces
de producirconstitutivamente
bajos nivelesde IL-l, en ausenciade
cuaiquierestímulo.Tal
queratinocitos
y las célulasepidérmicas
tímicaspor
es el caso de los
ejemplo(53).
- la mayorpartede
célulasnormales
necesitan
serpreviamente
estimuladas
por
distintosagentes
paraproduci¡IL-r. Así por ejemplo,
ros monocitosno la producen
constitutivamente,
sinoa travésde diversosestímulos:
" " Externos:comopuedenserproductosmicrobianos
comoel lipopolisacií¡ido
bacteriano
(LPs) u otrasendotoxinas,
exotoxinas,
hemaglutininas
víricas,radiaciones
ultravioleta,cristalesde uratoo de sflice
(50,54).
... Endógenos:
como el factor 5 del complemento(c5a),
neuromediadores,
TNF-a (55), factdorde transformación
der crecimiento(TGF_B)(56), rL_2(57)
inclusola propiaIL-l (efectoautocrino)
(5g).
2l
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e
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
.. Los linfocitosT tambiénpuedeninducir la producciónde IL-l por los
macrófagos,duranteel contactocelularque se da en la presentación
antigénica
restringidapor el MHC (57).
. Puedetambiénproducirsefisiológicamente
en algunostejidos normales,
comoen el líquidoamniótico(59)y en la orina(60),piel (61), cerebroen desarrollo
(62) e inclusoen el cerebroadulto(63).
t.3.t.4
Aunqueactúabásicamente
a nivel local, en el sitio de producción,también
puedeactuarde forma autocrinao inclusoendocrina.Es una de las
citocinasmás
pleiotrópicas(64).
1.3.I.4.1 Sobrelos linfocitosT cooperadores(TH): pareceser que
actúa
más sobre aquellosque presentanARNm paru rL-4 (son los que presentan
más
receptores
parala IL-l) que sobrelos quesoncapaces
de segregar
IL_2 (THl) (65).
Su forma de actuarsobrelos LT consistenen aumentarla producción
de linfocinas
y receptoresparadichaslinfocinas,comoesel casode rL-z e IL-2R, y
de estemodo
induci¡la proliferaciónlinfocitaria;no inducepor sí mismala proliferación,
sinoque
lo haceen sinergiacon linfocinasy otrasseñales,
talescomomitógenoso antígenos.
Es en realidadla IL-2 secretadapor los LT quien inducela síntesis
de ADN v ta
divisiónde la célulasT, al unirsea su recept
or (57,66).
22
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L.3.I.4.2Sobrelos linfocitosT citotóxicos:Probablemente
su acciónsobre
los LTc, másque directa,es productode la activaciónpreviade los linfocitosTH.
El casoes que tambiéninducela proliferacióna rravésde larL-2 (50).
I'3'I.4.3 Sobre los LT supresores(LTs)¡ Hay menosestudiospero podría
actuarsobrelos LTs antagonizando
su desarrollo(50).
1.3.1.4.4Sobrelos linfocitosB:
- Tantoindividuaimente
comoen sinergiacon otrascitocinasproducidaspor
LT, talescomo rL-2, rL-4,IL-5 e IL-6, aumentala secreción
de anticuerpos
(67).
- Aumentala maduración
delosLB; aumenta
la expresión
de IgS (sesintetizan
las cadenasligeras)(67).
- Aumentala proliferación(68).
1'3.1.4.5 Sobre células NK: Los linfocitosgrandesgranulares(LGL)
aumenüan
moderadamente
suactividadNK enpresencia
deIL- 1, probablemente
como
respuestaa un efectoindirectode cascada(5)
I .3.1.4.6 Sobrelosmonocitos/macrófagos:
Aumentala capacidád
delasApC
paraactivarlas respuestas
inmunesdependientes
de la célulasT (69,70).
¿J
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l'3'L'5'1 Estimulala secreciénde citocinasy
otros mediadoresal actuar
sobre diferentestipos de células:
* Sobrelinfocitos:
TGF-0 (56),IL_2(57),IL_3(7t),IL_4 (65),
IL_6(7i).
* sobrecélulasendoteliares
y del músculorisovascur
ar (72,73):
- "IL-l , rL-6,IL-8, prostaglandina
E2 (pGE2), factorde activación
plaquetaria(pAF), GM_CSF.
- Aumentala adhesión,aumenúando
la expresiónde la moléculade
adhesióninrercelular1 (ICAM_1).
- Actúacomomitogénicay
angiogénica.
- Actividadprocoagulante".
x Sobre monocitos/macrófasos:
- pAF (74), GM_CSF,pGE2,
rL_6,IL_1,IL_g (75).
- Aumentasu funcióncitocida(75).
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* Sobreneutrófilos(72,75):
- "Aumentala adhesión,
fagocitosis,
y Ia ADCC.
- Causadegranulación
y liberaciónde enzimas,,.
* Sobrecondrocitos:
- IL-6, PGE2(71).
- Aumentael turnover
del cartílago(71).
* Sobrefibroblastos
(7I,72,75):
- "IL-6,IL-S, TNF-p,
(M, G, GM)_CSF,pGE2, producros
de
degradacióndel fibrinógeno (PDGF),
IL_l.
- Aumenta la colagenasa.
- Actúa como mitógeno".
1.3.1.5.2Actividadantitumoral:(g9,90)
- Accióncitostática
directaen algunoscasos(64,75).
- En otroscasosactúajunto
arL-2 o INF-y, aumentando
la actividadNK y
la de célulasasesinas
activadas
por linfocinas(LAK o lymphokine
activatedkiller).
Juntoal TNF, potencianla ADCC inducida
por la IL_2(r.
25
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- Muchaslíneastumorales
son sin embargoinsensibles
a la IL-l e incluso
algunasde ellasaumentansu crecimiento(75,76).
1'3' 1'5'3 rnteraccióncon el sistemaNervioso:
A nivel del sistemanervioso
periférico(sNP), activarosnerviossimpáticos
(bazo,pulmón,riñón, suprarrenares)
y vía PGE2 aument¿los reflejosdolorosos.
Tambiénactúasobreel sistemanervios
central (sNC), donde puede ilegar vehicurada
en ra sangre o bien producirse
localmente(77,78)y su acciónse manifiesta
en:
Fiebre: "Importanteen los mecanismos
de
defensafrentea infecciones:
. '. porqueinhibela multiplicación
de microrganismos.
una temperaturamayor de 3g'5 0C,
aumentala capacidad
microbicidadePMN, aumenhla actividad
antiviraldel INF,
aumentia
la proliferación
linfocita¡ia,aumenlala respuesta
frentea antígenostimodependientes,
la acciónde los
LTc y la activaciónde la vía alternadel complemento.
La actividadde los macrófagos
no se modificapor temperaturas
elevadas,,
(79).
Sueño:IL-l inducela faselentadel sueño(g0).
Nutrición:IL-l est¿í
implicadoen la anorexia(79,g1,g2).
- Regulación:
26
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"'Actúa sob¡ehipotiílamoaumentando
el factor de liberaciónde la
corticotropina(cRF), que actúa sobre ra
hipóñsis aumentandola hormona
adrenocorticotropa
(ACTH), que a su vez aumentará
los nivelesde corticoides.los
cualesfrenaránra secreción
de IL-1 por rosmacrófagos
(feedbacknegativo)(g3-g5).
..Aumentala somatotropau hormona del
crecimiento (STH), la
hormonagonadotropaluteoestimulante
(LH) y la
tirotropa u hormona drostimulante
(rsH)(86).
.Aumentael factorde crecimientonervioso(NGF)
que
las neuronasinduciendoun aumentode la
actúasobre
p que a su vez incrementa
sustancia
la
producciónde IL-l por los macrófagos
(regulación
positiva)(g7).
1.3.1.5
.4 Hematopoyesis
- Prolongala supervivencia
de lascélulasmadrehematopoyéticas
y aumenta
su proliferación'De ahí quelos animalestratados
con IL-i sobreviven
a dosisietales
de irradiación(75).
- Aumentala mielopoyesis
por inducciónde G-CSF,GM-CSF,IL_3
e IL_5,
y a su vez muchosde estosfactoresinducen
la producciónIL-l (potenciación)
(gg).
,)
I
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
- Inhibela eritropoyesis
y la
iinfopoyesis
B, probablemente
por neutralizarla
acciónde la IL-7 (3g).
1.3.1.5.5Inflamación:La IL-l junto
con otras citocinas (muchas de
ellas
estimuladas
por la IL-l: IL_6,IL_g,TNF e INF-y)
aumenta
la inflamación articular
(89), lo cual se traduceen:
- "proliferaciónde fibroblastos,
con producciónde colágeno.
- In vitro inducela resorción
del huesopor activaciónde los osteoclastos.
- lnducela secreción
de colagenasa
por las cérulassinoviares.
- Inducela secreción
de proteasas
y proteoglicanasas
por los condrocitos,,
(71,75,90).
- Participaen la inflamación
aguday crónica:
" 'La inyecciónde IL-1 inducerespuestas
inflamatorias
agudasiocales
que comienzana la hora y pican
a las 3-4 ho¡as.Iniciarmentelos neutrófilos
se
adhierena las célulasendoteliales
(quehanaumentado
la expresiónde moléculasde
adhesión'comoel ICAM-I) y se marginan
a lo largode la paredde ios vasos.Esto
es seguidode unainfiltraciónpor neutróñros,
y de edema(g1,g2).
"En contra, la liberación lenta de IL-l de discos
de acerato
implantadossubcuüíneamente,
resurtaen una reacciónDTH con
fórmación de
granulomaconinfilt¡aciónmononuclearpredominante,
fibrosisy formacióndenuevos
vasossanguíneos
(9I,92\.
28
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
1.3.1.5.6Otrasacciones:
- En Hepatocitos:Induce
reactantesde fase aguda que aumenran
Ia
inflamación;decreceer citocromop450;
aumen[aer componente
3 del complemento
(c3); aumentaer cobreplasmático
y disminuyeel hierroy zincplasmáticos
(75,g3).
- célulasbetapancre¿íticas:
Aumentala secreción
de insurina (75.¡.
i .3.1.6 INHIBIDORES.
- corticoides:Impiden
la producción(94). sin embargo,tiene
ra capacidad
de aumentarla expresiónder recepto¡pa¡a
Ia IL-l (L-iR) en LB humanos.Ero
sugiereque Ia IL-1 puedeparticipar
en Ia capacidadreferidade los esteroides
para
actuarcomo activadores
policlonales
de los LB "in vitro,, e ,,in vivo,, (6g). pl
paradójico aumento de expresión
de IL-lR en LB por drogas que
son
inmunosupresoras,
puedeservirparasuprimirla inflamación,
divergiendola respuesta
inmunehumo¡alde la inmunidad
celular.Así, los esteroides
parecenfavorecerla
inmunidadhumorala expensas
de la inmunidadcelular,disminuyendo
con ello la
inflamación(95-97).
- Alfa-melarohormona
(c_MSH)(95).
- CiclosporinaA (95).
- PGE2(95,98).
29
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
- Dieta rica en ácidosgrasosomega-3poliinsaturados
(99).
- rL-4,IL-10 (100),IL-13, TGF-p (citocinas
antiinflamatorias)
(101).
- IL-IR antagonista(IL-1Ra): secretada
tambiénpor macrófagos,células
epitelialesy queratinocitos.
Compitecon la IL-l paraunirseal receptor;ha de haber
mayorconcentración
de IL-lRa quede IL-1 paranotarunareducciónsignificativade
la actividadde estaúltima (102).
T .3 .T .7
R E C E P T OR ES.
Sondominiosde la superfamilia
de las inmunoglobulinas
(103). Los mismos
receptores
seunena IL-la, IL-l0, y proll--lc, perono a proll--lp. Trasla unión
el complejoseinrernaliza(104).Hay dosclonados(105):
- Tipo I: En linfocitosT, fibroblastos,
célulasdel músculoliso y endoteliales.
- Tipo II: En monocitos,LB, LT activados,
placentay neutrófiros.
Los receptores
cerebrales
y de órganosendocrinos
sonde tipo I. La IL-lp se
fija con mayorafinidady selectividad
al tipo II (105).Las señales
intracelulares
rras
la unión lL-7/receptor,sonmúltiples(activaciónde la pKC, elevación
del adenosín
monofosfatociclícointracelularo AMpc) (106_10g).
30
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
r.3.2 FACTOR DE NECROSISTLMORAL
1 .3 ,2 .1E S T R U C T U RA:
- TNF-a (cachectina)
y TNF-B Qinfotoxina)sonmiembrosde unafamilia
genesmuy próximos(6000paresde bases),situados
en el
de
MHC (109,110).
- Presentan
unaseriede funciones
comunes"in vitro" y seunena los mismos
receptores'por lo que tienenlas mismasactividades
biológicas(r09).
- En cambio,su homología
es muy limitada(34%)(110).
- Ambossonglicoproteínas
y su origencerulares diferente(ilO).
- El ARNm del TNF-a es
en ocasiones
detectableen condicionesbasales,sin
estimulación,
y su transcripción
aumenlatrasla activación,con unavida mediacorta
de aproximadamente
30 minutos(r 11). En cambio,el ARNm del TNF-F
tieneuna
transcripción
basalindetectable,
queaumenta
trasla estimulación
inespecífica,
aunque
no tantocomola del ARNm del rNF-a; suvida media
esmásaita(aproximadamenp
5'5 horas)'Estosdatosindicanlas diferenciasen
la regulaciónmolecularde estos
genes' que se manifiestanen la misma
célula y en las mismascondicionesde
activación
(I 12,lj,3).
3I
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
r.3.2.2
cÉLuLRs
sscRproRes:
- El TNF-p soloseproducepor
los linfocitosT (114).
- El TNF-a seproducepornumerosas
fuentescelulares:
monocitos/macrófagos
(i 15)'neutrófilos
(116),linfocitosB (117),rinfociros
T (TH1-like)(11g),céluras
NK
(LAK) (5,119),timocitos,queratinocitos,
célulasmesangiales,
trofoblastos,células
del músculoliso, ñbroblastos
(120),astrocitos,
céiulasepiteliales,mastocitos,
células
de la microglía,célulasendoteliales,
célulasde Langerhans
y
célulasgranulosas
del
ovario (121,122).
1.3.2.3INDUCTORES:
- La mayoríade los inductores
de IL-l tambiénlo son de TNF-a y, si son
activadores
de los LT, tambiéninducenTNF-p, aunqueesteúltimo
es máslenb en
su secreción(75).
- citocinasy mediadores:
IL-3 (paralos mastocitos)
(140),IL-I (75),IL_2
(118),TNF (efectoautocrino),
GM_CSF(124),ACTH(125),leucotrieno84 (LTB4),
PAF, e INF-y junto con LpS (126,127).
- Productos microbianos:
bacterias (Lps) (12g), parásitos, hongos,
micoplasmas,
virus (129-I3l).
32
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
- Estímulos
inrnunológicos:
tumores(120),GvH (132),rechazos
(133),anti_
CD3 (134),fragmentos
de fibronectina
(135).
- otros: ejercicio,partículasde
ratex,zimosán,mitógenos,IgA porimérica
(136), ésteresde forbol (pMA), ionóforosdet Ca* + (f37\.
- Puedeproducirsefisiológicamente
duranteel ciclo menstrualy la gestación,
y tambiénen la lechehumana(13g).
"rn vivo" seencuentra
en plasmao líquidocefaloraquídeo
(LCR)
durantelas
infecciones;por ejemplo,en las meningitishay unabuena
correlaciónentrelas tasas
de LPS y TNF-' en el LCR (139),y en las septicemias
entrelos nivelesplasmáticos
de TNF-C, la gravedaddel procesoy las posibilidades
de supervivencia
(i40).
r.3.2.4
Los múltiplesefectosde los dos mediadores
inflamatoriosde más amplio
espectro'la IL-l y el TNF, puedenrevisarse
conjuntamente.
Aunquesusreceptores
específicosde alta afinidad han sido detectados
en virtualmentetodas las células
nucleadas,
y sonestructuralmente
distintos,lasdoscitocinascompaften
un alto grado
de solapamiento
en susactividades
inmunorógicas
y
no inmunológicas,,,in vitro,,.
Aunquesusefectos"in vivo" tambiénmuestran
muchassimilitudes,el TNF
33
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
exhibe
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
mayoresefectostóxicos,de oclusiónvasculary anti-tumoral,mientrasquela IL-1
es
másprotectoracontrala radiaciónletal y provocamásturnoveróseo(75).
* Linfocitos T:
- Es un factorde activaciónde LT y timocitos,
actuandocomo
comitógeno
e induciendo
la expresión
de citocinas
e IL-2R (141-143).
* Linfocitos B:
- puedecoparticiparen la proliferación
de los linfocitos activados.
pero no en reposo.
- aumenüa
la producciónde anticuerpos.
- aumentala expresiónde IgS (L44,145).
x monocitos/macrófagos
:
- es un activadorde los mismos;induce
la producción
de pGE2,IL_l,
IL-6, IL-8, GM-CSF,lisozimay del propioTNF.
- aumenüa
la capacidad
citociday microbicidade éstos.
- al contrarioque la IL-l, es quimioatÍactante
(55,106).
34
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
1.3.2.5 ACCIONESGENERALES:
1.3.2.5.1
Los efectos"in vitro" del TNF sobrelos neutrófilos,
célulasendoteliales
y del
músculoliso vascular,monocitos,condrocitos
y fibroblastos
sonsimilaresa los de la
rL-L y en algunoscasos(neutrófiios,monocitos
y célulasendoteliales)
máspotentes.
Ademásel TNF es quimioatractante
paraneutrófilosy monocitos,y no la
IL_r, y
favoreceuna mayoradhesión
de los neutrófiiosa los vasospor una mayor
expresión
de integrinas
(en sinergiacon el INF_y)(146_14g).
1.3.2.5.2Actividadanti_tumoral
Actividadtumoricidapor mecanismos
necrosantes
o de apoptosis,mayora la
observada
con IL-l (106).Dichaacciónesincrementada
por la IL_l y el INF_y, por
efectodirecto(r49), o por esrimuración
de las célulasNK o LAK (150).
No obstante,su utilizacióncon ñnesprofilácticos
en el cáncerestií siendo
decepcionante
y con numerosos
efectossecundarios,
ya seasoloo asociadoa rL-2o
LAK (ls1).
35
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
r.3.2.5.3
similar a ra IL-i, pero ar contrario
que ésta, no es capazde inducir la
producciónde cRF enhipotáamo,
ni por tantode esteroides.
Sí inducela producción
de PGE2y de IL-l (55,t22\.
1,.3.2.5.4Sobrela hematopoyesis
- In vitro: inhibela
eritropoyesis
y la
mielopoyesis
(152).
- In vivo: favorece
la reconstituciónhematopoyética
tras la quimioterapiao
radioterapia'aunquemenosquela IL-l
(efectosinergísticomayorque
el de cadauna
por sepalado)'y ello debidoa fenómenos
indirectosvía producciónde csF (153).
1.3.2.5.5 Sobrela inflamación
Es responsable
de la inducciónde un gran número
de mediadores;
en este
sentidotienenumerosas
acciones
comunes
con la IL-1 (ya descritas)
y con frecuencia
tienenacciónsinérgica
(154_
156).
A nivel sistémicoinducecoagulación
intravascular
diseminada
(cID) (157),
hiperpermeabilidad
vascular(origende edemapulmonar)
e inhibe la angiogénesis
in
vitro (158); in vivo esto se confirma
para dosisartas,mientrasque
ras baiasla
36
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
favorecen.La sobreproducción
induce fiebre. hipotensióne hipertrigliceridem
ia,
signoscaracteísticos
del shockséptico(159).
1 .3 .2 .5 .6C a q u e xi a
- acompañando
a las infeccionescrónicasde origen
viral y parasitario.así
comoa los procesos
malignos(151).
- actúa sobre los
adipocitos,inhibiendoal Enzima
lipoproreín-lipasa
aumentando
de estemodola lipolisis,másintensamente
que la r L - 1( l s 1 ) .
r.3.2.5.7
- aumentala respuesta
"in vitro" frente a antrgenostimo
dependientes
e
independientes'
La adiciónde TNF-' aumentala
actividadcitotóxicade macrófagos
y PMN frentea bacteriasy parásitos
(147,14g).
- "rn vivo" aumenta
la supervivencia
deratonescondistintasinfecciones
(151).
- Potenciala citotoxicidad
de los eosinófilos(160).
su efectoantivíricoparecemediado
por la inducciónde INF-y (i51).
37
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1.3.2.5.8Otrasacciones
- mlsmosefectos
sobrelos hepatocitos
quela IL_1 (161)
- no moduralos niveles
de insulinaar contra¡io
quera rL-r (162,)
1,.3.2,6
INHIBIDORES
- el receptorsoluble
para el TNF: es un inhibido¡
fisiorógicoque
identificadoen plasma,orina y
sobrenadantes
celulares(163,164).
se ha
- esteroidesy
otros f¿írmacos
como la serotonina,histamina,
adrenarina,
quinolonas,pentoxifilina,cloroquina,
talidomida(165).
- catepsinaG, erastasa
reucocitaria
y otrosenzimasproducidospor
los pMN
activados,soncapaces
de degradarlo(151).
- rL-4 inhibe ra
síntesispor los monocitosactivados,
pero no sobre ros
linfocitosactivados
(166).
- TcF_p(101),IL_10
(167).
38
Yr
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
1,3.2.7RECEPTORES:
- se hanclonadodos
receptores
(16g),el p55 (tipo I) y el p75 (tipo
II).
- están codificados
por genes diferentes.en los
cromosomas12 y 1
respectivamente
(l 69).
- el p75 actúa como
mediadorde
la proliferacióncelular y el p55
estií
implicadoen los fenómenos
de muertecelular(16g).
- ambosreceptores
f¡-ana ambosTNF (16g,169).
- er tipo I se encuentra
en ra superficiede los
LB y LT, mientrasque er dpo
II estáenlos monocitos,aunque
la mayoríadelascélulasexpresan
los dosreceptores.
Se handemosfadoformassolubres
de los dostiposde receptores
(163,164,16g).
39
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1.3.3 INTERLEUCNA-2
I.3.3.1 ESTRUCTURA
LarL-2 es un péptidode pesomolecular
15400daltons,constituídopor 133
aminoácidosy una unión disulfuro interna
esencial.Ejerce numerososefectos
inmunológicos,estimulandola proliferación
y la producciónde linfocinaspor
las
células T' céiulas B y células NK.
La presenciade cantidadesvariables
de
carbohidratos,
resultaen formasde rL-2de mayorpeso
molecurar;no obstante,estos
carbohidratos
no sonnecesarios
parala actividadde la morécura(L70_r72).
Estudiosmoleculares
con el ADN complementario
clonadode variasfuentes
humanasy otrasespecies,indicanque
hay un sologen para rarL-2,rocalizado
en er
cromosoma4' Hay pocao ningunahomología
entrela secuencia
de dichacitocinay
la de otrosfactoresde crecimiento(171
,172).
Tras la activaciónde las célulasT,
la transcripción
y la raducciónde novo
precedena la secreciónde la citocina.
En linfocitoshumanosnormalesestimurados
con fitohemaglutinina
(pHA), el ARN* derarL-2seacumura
a las 4 horas, afcanza
un miíximoa las 12 horasy después
decaenípidamente.
La expresiónm¿íxima
de la
proteínase da a las 24-48horaspostactivación,
y va disminuyendo
paulatinamente
paracasino detectarse
a partir de los 3 días(173).
40
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1.3.3,2CELULASSECRETORAS
células T frescasaisradas,en reposo,no expresan
ARN* d,e rL_Z, ni
contienenproteínarL-2. La producciónde rL-2 por
linfocitosT normales,requiere
quelascélulasseactivenpreviamente
por antígenos
o por activadores
policlonales
de
célulasT (r74)' otras víasdeactivación
de linfocitosT y
timocitos,comoesla unión
del ligandoal receptorde superficiecD2, también
estimulala producciónde IL-2
(175,176)' Estudiosde subpoblaciones
aisladas
delinfocitosy timocitos,muestran
que
la producciónde rL-2 en célulasactivadaspor
el antígenose dá sobretodo en las
célulasT cooperadoras
cD4* (2a). Sin embargo,mitógenos
policlonalespotentesy
aloantígenos
MHC de claseI, puedenestimurara ros rinfocitos
T cDg+ a que
produzcanrL-2 (26). Además,una subpoblación
de LGL que compartencon el
linfocito T los receptoresde membran
a CD2 y cD6 y a los que se refiere como
células NK, puedenser inducidaspor lectinas
como la pHA o por factores
estimulantes
de coloniaso INF_y, paraproducirIL_Z(177\.
1.3.3,3INDUCTORES
Pa¡ala induccióny secrecióndelarL-2 senecesita
la activaciónpreviade las
célulasT con mitógenos
paraquela producciónde
o antígenos.
rL-2seamáxima,se
requierela presenüación
previadel antígenopor célulasaccesorias
a los linfocitos T
(15-19,24,26).
41
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r.3.3.4
eccloNpsslolócrces
El papelprincipalde larL-2 esla expansión
clonarde las célulasT maduras.
La inducciónde la proliferaciónlinfocitariaincruye
dos pasos.El primer pasoes
iniciadopor unaseñalexógena,suministrada
al linfocitoT quiescente
por el antígeno
o el mitógeno(24,26);ello llevaa unaactivaciónparcial
del linfocitoT, que result¿
en un incremento
del tamañodel mismo,en la inducciónde la transcripción
deciertos
genes'y en el pasode la faseGoa la fase
G, del ciclo
celular.una segundaseñal,
endógena,es necesaria
parainducirprogresióndel ciclo
celularcon transicióna la
fases del ciclo y finalmentea la divisióncelular;para
estesegundopaso,senecesita
la uniónde la IL-2 a su receprorde ah¿afinidad
(17g_1g0).
Aunquesu papelen la fisiologíadel sistemainmune
es
muy importante,sus
efectossobrelascélulasdeotrossistemas
sonmarginares
y, desdeestepuntodevista.
es la menospleiotrópicade las citocinas.
favorecesobre todo la expansiónde células
cDg+ citotóxicasy aumentasu
citotoxicidad;las célulasT cooperadoras
y unaspocaslíneasde célulassupresoras
también crecen en presenciade rL-2. Además
de la capacidadde estascélulas
clonadaspara liberar ellas mismas la rL-2,
cooperancon células adherentes
histocompatibles
en presenciadel antígenoespecífico,para liberar
otras linfocinas
(i81-182).
+L
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
l'3'3'4'2 Sobrelos linfocitosB: Al igual que
ocurrecon las célulasT
activadas, los linfocitos B activadosy determinadas
líneas de linfoblastos B
transformados
puedentambiénexpresarel receptorde alta afinidad
para la rL-Z, y a
estenivel, dichacitocinapuedeactuarcomofactor proliferación,
de
asícomoinducir
la diferenciación del linfocito B a célula productora
de inmunoglobulinas
(principalmenre
IgM, aunquetambiénIeG) (1g3).
L'3'3'4'3 SobrelascélulasNK: LGL (conactividad
NK) frescasaisladasy en
reposo'no expresanla cadenaarfadet receptorderarL-2
(p55
0 antígenoTac), pero
sí la cadenabeta (p75), la cual es necesariapara que
célulasLGL sin estimula¡
puedanresponderalaIL-2. Trasla activación
in vitro conIL-2,las LGL adquieren
el p55 y el receptorde alta afinidadparala dicha
citocina. En estesentido,la rL-2
estimula la proliferacióny aumenüala actividad
citotóxica de dichas células.
induciendoen ellasademás
la produccióndeotrascitocinascomoet INF_gamma
(5).
l'3'3'4'4 sobrelos monocitos/macrófagos:
lascélulasmieloides(precursores
macrofágicosen la médula ósea y monocitos/macrófagos
periféricos), expresan
normalmente
el antígenoTac, aunqueconbajadensidad;lo habitual
espor tantoque
expresenreceptoresde bajaafinidadparala IL-2.
sin embargo,la activaciónde los
macrófagospor INF-y o LPS, resultaen un incremento
en Ia expresiónde receptores
de alta afinidad para dicha citocina. La adición
posterior de rL-2 a estascélulas
activadas,resulüaen la activaciónde los genesTac,
GM_csF y G_GSF,y también
aumenhla actividadcitotóxicay tumoricidade las
mismas(rg4).
43
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
l'3'3'4.5- Sobrela red de citocinas:los linfocitosT activados
por la IL-2,
puedenproducirotrascitocinascomoel INF-y, la
linfotoxina,rL_4,IL_6,IL_3, IL_5.
GM-CSFy TGF-B (72,185,196).
Fund¿índose
en los efectos mencionados,esta citocina se utiliza
como
inmunomoduladoren la terapia de determinadostumores,
inmunodeficiencias
e
infeccionescrónicas(186).
1.3.3.5INHIBIDORES
- corricoides(94)
- ciclosporina
A (197)
- rL-4' Los efectosdelarL-2 pueden
amplificarsepor IL-4
cuandosetratade
la proliferaciónde célulasT, peroambascitocinasactúan
antagónicamente
cuandose
tratade las célulasNK y de los linfocitosB humanos(1gg,ig9).
- IL-10 (100)
1.3.3.6RECEPTORES
(rL_2R)
La expresiónde los IL-2R es muy específica
de las
célulasimplicadasen la
respuestainmune; todoslos linfocitos,seanT
o B, expresanel IL:2R en algún
momentode su diferenciación
o activación.Además,lascélulasNK y lasde la línea
monocito/macrófago
(incluyendocélulasde Langerhans
y célulasde Kupffer) poseen
44
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
IL-2R, y también pueden expresarlolas células precursoras
hematopoyéticas.
Actualmenteseconocentrestiposde receptores:
el de bajaafinidad(constituidopor
una cadenaalfa), el de afinidadintermedia(constituidopor
una cadenabetay otra
gamma)y el de alta afinidad(constituidopor la unión
no covalentede los tres tipos
de cadena(190,191).
La cadena arfa (antígeno Tac) se corresponde
con el marcador de
diferenciacióncD25; es una glicoproteínade peso molecular
55000 daltons,
que
ademásde en la membranapuededetectarse
en forma solubleen el plasma,tras la
activaciónde las célulasT in vivo. Su papelen la transmisión
de señalesinducidas
por IL-Z es muy escaso(192,193).
ra
cadena beta pertenece a la familia de receptores
de factores
hematopoyéticos.
Es unaglicoproteína
de 75000daltonsde pesomolecular,y posee
unaregiónrica en serinaquejuega un papelfundamental
en la transmisiónde señales
durantela proliferación
(194,195).
La cadenagamma'identificadaen r992,esunaglicoproteína
de 64000daltons
que tambiénpertenecea la familia de receptores
de factoreshematopoyéticos.
Su
expresiónes necesariapara la formaciónde receptores
de afinidad intermediav de
altaafinidad(i91).
El IL-2R de alta afinidadcontienelas trescadenas.
La afinidadlat o.
"rt"
receptorpor la IL-2 esconsecuencia
de suasociaciónrápidayde su diso[iacióntenta
45
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
a dichacitocina,y es capazde transmitirtodos
los efectosbiológicosinducidospor
larL-2' La expresiónúnicade rascadenas
alfa no ffansmiteningúnimpulso,lo que
demuestrala necesidadde las cadenas
beta y gammapafa que exista un receptor
funcional(196)' Tras su fijaciónal IL-2R
de alta afinidad, larL-2se interiorizay
degradaen el interior de la célula. Las etapas
posterioresde la transducción,est¡ín
fundamentalmente
asociadas
a unaacüvidadtirosín-quinasa
(r7g).
46
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1.3.4 INTERFERON GAMMA
T.3.4.1ESTRUCTURA
- Pesea no presentarhomología
con los otrosdos interferones(c
Y 9), muy
distintos desde el punto de vista estructural,comparte los
efectos antiviraly
antiproliferarivo(197).
- Su función principal es la
de mediadordel sistemainmunitario.
profundosefectosinmunomoduladores
e inflamatorios(197).
- Est¿ícodificadopor un solo gen, y
el aniílisisen SDS-pAGEda dos bandas
menoresde Pm 20 y 25 Kd y otra mayor,de 45 Kd, todas
ellasfuncionalesdesdeei
puntode visrabiológico(199).
- Es muy lábil a pH 2, propiedad
usadaa menudoparaidentificarro(rg7).
- Tras la inducción,la aparición
der ARNm es muy rápida(30_60minutos)y
el nivel miíximode transcripción
se obtieneentreras 6 y las 1g horas.aunquesu
secreciónes máslenta(19g).
A-
+t
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I .3.4.2CÉLULASSECRETORAS
- A diferenciade los otros interferones,que puedenproducirsepor múltiples
céluiasdel organismo,la síntesisde INF-y estálimitada a LT activadosy a células
NK (199).
- Entre los LT, lo producentanto los CD4* como los CD8* tras la
activaciónpor aloantígenos
o mitógenos,mientrasquelosantígenossolublesestimulan
preferentemente
su producciónpor los CD4+, y dentrode ellos por los TH tipo I
(I93,194).Los LT de memoriaproducenmáscantidady másnípidamente
INF-y que
las no sensibilizadas;la síntesisdependede la producciónprevia de IL-1 por las
célulasaccesorias,e IL-2 por las célulasT auxiliares,lo que a su vez lleva a la
producciónde INF-y que amplificala secreción
de IL-l (200).
- LascélulasNK sin embargo,solorequierenuna señalparaproducirel INFla IL-2 ylo laIL-L2
Y: un mitógeno,un ésterde forbolo unacitocina,especialmente
(200,201).
- Otras célulasdistintasa los leucocitostambiénpuedensegregarINF-y en
cantidades
importantes,
comoes el casode las célulasepitelialesde la capaexterna
(trofoblasto)del embriónde cerdo,en el momentode su implantación
en la mucosa
uterina(202).
48
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1.3.4.3INDUCTORES
Para la induccióny secrecióndel INF-y
se necesitala activación con
mitógenos
o antígenos,
junto conraproducciónsimultiínea
deIL_1por las APC, e IL2 por los LT (199,200).
1.3.4,4ACCIONESBIOLÓGICAS
Lasrelaciones
entreinmunidadmediadapor
anticuerpos
e inmunidadcelular,
y la resistenciao susceptibilidad
a ciertasinfecciones,puedenexplicarsepor
la acción
de los distintossubtiposdecélulasTH, que
secaracterizan
por los diferentespatrones
de producciónde citocinas(1s5).En el hombre,
la mayoríade los LT cD4+ ,,naive,,
obtenidosde donantessanos'trasla primera
activaciónsolo soncapacesde producir
inicialmentelL-2' Tras variosdíasde activación,
se transformanen THg y pueden
producirsimurtáneamente
INF-y, rL-z,rL-3,IL-4, IL-5, rL-6,rL_g,TNF,
GM_CSF,
L-10 e rL-r2 o combinaciones
de varias de elras (203). Sin embargo,
rras
exposicionesprolongadasat antígenoy
dependiendo
del antígenocon el que estas
célulashayan sido estimuladas(no estií
claro si las THO contienenprecursores
comprometidosde THI y THz), las THO
se convertiránen TH dpo I secretoras
fundamenhlmentede rL-2 e INF-' y
que mediar¡ínsobre todo respuestas
de
inmunidadcelular,o en TH tipo II, secretoras
fundamentalmente
de rL_4e IL_rg y
que mediariínrespuestas
mediadas
por anticuerpos.
De estemodo las THl y THZ
representan
cronesterminalmente
diferenciados
(i g5,1gg,203).
49
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se ha comprobado
queer INF-1, inhibela proliferación
de TH2 (ypor tanto
de las citocinasqueestosproducen)
perono de THl. por tanto,Ia mayoría
de células
esplénicas
seleccionadas
en presencia
de INF-y sonTHl y, además,ra presencia
de
dichacitocinadurantela respuesta
inmunedeberesultaren la expansiónpreferente
de linfocitosTHl (204).
Induceun estadoantiviral quecomparte
con otrosinterfe¡ones,y queprotege
a las célulascontrala mayorpartede los
virus (lg7,Igg,20S\.
Tambiénejerceuna acciónde inhibición
de la proliferacióncelular (función
compartidacon otros INF) y del crecimiento
de tumores.puedenaumentiar
o inhibir
la diferenciacióncerular,dependiendo
der tipo de célula y de ra dosis de
INF
(r99,205).
Poséeefectoinmunomodulador:
actúasobrelas célulasdel SistemaInmune,
estimul¿índolas
parasintetizarmediadores,
molécuras
desuperñcie,etc,desempeñando
con ello un importantepapel en las
defensasdel huésped(205-207).su
efectoes
pleiotrópico,ar igualquera IL-l y
er TNF, y del mismomodoqueéstas,
es también
unacitocinade la inflamación,aunque
se segregamástardíamente
(206-209).
Puedeactuaraumenhndoo disminuyendo
ra inmunidadcelulary humorar,
dependiendo
de la dosisy del momentodeadministración
a lascélulas.,,rnvitro,,.la
s0
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adición de artas dosis de INF-y a ras céluras
antes de ponerrasa cultivff, o
simultiíneamente,
suprimeia proliferaciónlinfocitariay la producción
de anticuerpos,
mientrasque bajasdosisde INF o la adición
tardíaa las célulasen cultivo, aumenta
la proliferaciónlinfocitariay la producción
de anticuerpos.
Los mecanismos
por ros
cualesel INF-y puedeaumenta¡la inmunidad
celulary humoralson los siguientes
(205-209,210,211):
- aumentode la expresión
de MHC ripo II en los LB (2lI).
- induceselectivamente
la producciónde IgG2ae inhibe otros isotipos
(especialmenre
la IgE) en los LB (21D.
- aumentala expresión
de IL-2R en LTH (especialmente
THl), así como
la secreciónde IL-2. Del mismomodo,
aumenüa
la actividadde los LT
cD8+ citotóxicos,jugandoun papelfundamental
en la activaciónde los
linfocitosinfiltradoresde tumor (TIL) (210),
- aumenüa
la expresiónde moléculasMHC tipo I
en las célulasdianade
los LTc, lo que favoreceel reconocimiento(210\.
- favorecela producción
de otrascitocinas,comola IL-i, TNF e rL-2
por partede LT y LB (210,211).
51
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1.3.3.4.2Sobrelascélulas
NK
Aumenh la actividadNK de rasLGL,
asícomode las LAK.
Sin embargo,y
paradójicamente,
el pretratamiento
de algunostumorescon INF in vifio,
los hizo
menossensiblesa ra acciónde ras
NK, lo cuar refleja la enormecomplejidad
de
accionesdel INF en el SistemaInmune
(201,207_209).
1.3.4.4.3
Es un factor activador e inhibidor
de la migración de ios macrófagos,
aumentando
susfuncionesbactericida
y fumoricidaasícomosusfunciones
accesorias;
digamosque preparaa los macrófagos
paraque puedanlleva¡ a cabo las
reacciones
de inflamacióncrónicao hipersensibilidad
retardada,que
los hacemáseficacesen la
eliminaciónde tumoresy de bacterias
y parásitosde crecimientono soro
extra sino
también"intracerular";todo ello
de la siguientemanera(212\:
_ aumenta la expresión
de receptores para la porción
Fc de las
inmunoglobulinas,lo que se
faduce en un aumento de la
fagocitosis de
rnmunocomplejos
y en unacapacidad
aumentada
de lisar bacterias,parásitosy céluras
tumoralesrevestidasde anticuerpos
(ADCC); por tanto aumentan
también su
capacidadcitotóxica(212),
52
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- aumentala expresiónde MHC tipo II en la
membranade los macrófagos,
e incluso inducela expresión"de novo". Ello se traduceen un aumento
de las
funcionesaccesorias
del macrófago(presentación
antigénica),que le permiteactivar
LT máseficazmenre
(212,213).
- aumenüa
la expresiónde receptores
de IL-2
dealtaafinidaden la membrana
del macrófago,lo cual favoreceráel queestosmacrófagos,si existelL-2 enel medio.
veanaumentada
su capacidad
tumoricida(212,213).
- inducela secreción
por partedel macrófagode otrascitocinas,comoIL-1.
IL-6, TNF, así como de moléculasdel complementoy prostaglandinas;
también
aumentala expresiónde moléculas
de adhesión(212,213).
- uno de los mecanismos
que intervienenen la eliminaciónde los gérmenes
intracelulareses la destruccióndel triptófano constitutivo de dichos
gérmenes,
mediantela activacióndel enzimaindolamina2,3 dioxigenasa
(212).
I.3.4.4.4Sobrelos pMN
Actúa de modo similar a como lo haceen los macrófagos,aumentando
la
fagocitosisy la citotoxicidad(209,214\.
53
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1.3.4.4.5 Sobrela red de citocinas:
- es antagónicode la
rL-4. El tratamientode monocitosde
sangreperiférica
con INF-y' inhibe la expresióndel receptor
de bajaafinidadparael fragmentoFc de
la IgE, cuya síntesisse inducepor laIL_4
(204).
- en los macrófagos,
aumentala síntesisde
IL-l inducidapor LpS (2r5).
- actúasinérgicamente
con la IL-l parainducirla sÍntesisde
TNF_a por ros
astrocitos(122).
- actúasinérgicamente
conel TNF-a en Ia actividadantivírica
frentea algunos
virus(151).
- es antagónicode la
IL_10(216)
- favorecela producción
de IL-r e rL-2 pormacrófagos,
LT y LB (206,215\.
1.3.4.5INHIBIDORES
- corticoides(217)
- ciclosporinaA (1g7)
- IL-4 e IL-10 (100)
54
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- er humanoreciénnacido
tienedisminuidasu capacidad
parasintetizarINF_v
(200).
- el receprorsoluble(dominio
extracelula¡)
del INF_y (2Ig).
1.3.4.6RECEPTORES
- Se tratade unagricoproteína
específicade especie,de pm g0 Kd, que
dene
ungrandominioextracelular
(228aminoácidos),
unotransmembrana
e3 aminaácidos)
y un dominio intracelular(22r aminoácidos),
y cuyo gen estructuralse haila en
el
cromosoma6 (219)' Paraqueel receptor
seafuncionante,serequierela presencia
de
al menosdos componentes:
la proteínadescrita,junto con una proteína
accesoria
codificadapor un gendelcromosoma
21; estaúltimaproteínaesun factor
transductor
de señales,que tambiénactúade modo
específico
de especie(2rg_220\.
- el dominioextracelular
seestiíprobandoen forma sorublecomo
antagonista
del INF-y (en lugar de los AcMo) (2iS).
55
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1.3.5 INTERLEUCINA 4
1.3.5.i ESTRUCTURA
- Glicoproteínade r53 aminoácidos,
que incluye un péptido señarde 24
aminoácidos
(221).
- Se han aisladotresvariantes
de 15, 1g y 19 Kd (222).
- Es un monómerocompacto
de aspectocasiesféricograciasa la presenciade
3 puentesdisulfuro cuya integridades indispensable
para la acción biológica
( 2 2 1 , 2 2 2 ).
- su estructurase compone
de 4 grandeshéiicesalfu, y la sustituciónde la
tirosina 124 por ácidoaspiírticogene¡aunaantagonista
de la rL-4de fuerteafinidad
(223).
1.3.5.2 CÉLULASSECRETORAS
- Subpoblaciones
de LT cooperadores
(TH0 y TH2) (1g5,rgg,203).
- Líneamastocitos/basófilos
(224).
- Grupode célulascD8+;rarL-4
seríaen estecasola responsable
de ras
propiedadessupresoras
de estapobiación(225).
56
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1.3.5.3INDUCTORES
- Estimulacióninespecífica
(mitógenos)y específica(antrgenos,
especialmente
alergenos)(226).
- rL-2(188,189).
- Ia propiaILe27).
T.3.5.4ACCTONES
BIOLÓGICAS
Recordemosque ros linfocitos TH tipo 2,
se asociancon la producciónde
anticuerposy con la alergia(226). Lascitocinas
segregadas
por los TH tipo 2sonIL3, rL-4, IL-5, IL-6, rL-g, IL-10, TNF-c,
GM-csF (rgs). una característica
importantede los THl y TH2 es su
capacidadpara inhibi¡serecíprocamente
y esta
inhibiciónse manifiestaa nivel de las
célulasefectorasactivadas
por estasdistintas
subpoblaciones
como,por ejempro,ra inhibiciónpor el
INF-y de la producciónde
IgE inducidapor rL-4 o la inhibiciónpor
IL-4 de la proliferaciónlinfocit¿riainducida
por la rL-z (203); es más,los efectos
inhibidoressemanifiestana nivel de laspropias
subpoblaciones:
INF-y inhibela proliferaciónde las
TH2, mientrasqueIL_4e IL_10
inhibenla producciónde INF-y por
las THl. Se conocenmar ros mecanismos
que
controlanel desarrollode las THl y
TH2, peropareceque INF-y erL-4iuegan
un
papel crucial en el desa¡roltode
las respectivassubpoblaciones;
para ello, la rL-4
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puedeser producidapor rascélurasde ra línea
mastocitos/basófiros,
y el INF_y por
las célulasNK (204).
La respuesta
inmunenormalsecaracteri
za porun equilibrio tre los tipos de
respuesta
TH1 y TH2. ElpredominiodeTHI setraducirá
en
inflamatorios
crónicos (hipersensibiiidadretardada),mientras
que er de las TH2 se manifesta¡á
mediantefenómenos
arérgicose hipergammagloburinemias
(1g5).
IÁ IL-4 estádotadade numerosas
propiedades
biológicas,lo
ue concuerda
con la existenciade receptoresespecíficos
sobre prácticamente
los tipos
celulares.una granpartede los efectos
biológicosderarL-4pueden
también
a su potenteefectoreguladorsobrela producción
de citocinas(227).
I.3.5.4.1Sobrelos LT y lascélulas
NK
- en coestimulación
con
un mitógeno,induceraproliferación
LT madurosy cérulasNK; actúapor tanto
comocomitógeno(22r,2
los timocitos,
,229).
- intervieneen la maduración
de los timocitos,induciendora desaparición
de
lascélulasCD4+CD8+ y la aparición
de CD4+CD8_y de CD4_CDS+(225_Z2g).
- parece capaz de inducir
la diferenciaciónde las células
CD4+ THO
(productoras
de IL-2, IL-4 e INF-') en cD4* TH2,
conaumentoen ra secreción
de
las citocinascaracterísticas
de estascélulas(203,204,229).
s8
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- aumentala citotoxicidad
en LT CD8+
activados,
y estimulael desarrollode
célulascitotóxicasespecíficas
paracélulasalogénicaso infectadaspor virus (230).
1 .3 .5 .4 .2S- o b rel o sL B
- Favorecela linfopoyesisB:
estimulala proliferaciónde las célulaspro-B
murinase inhibe el crecimientode los progenitoresB más
diferenciados(lg9);
también inhibe la proliferación espontiíneade las células
de la leucemia asuda
linfoblásticadel tipo pre-B (231).
- Activación de célulasB en reposo:
aumentael volumen de las mismas,
aunquesin inducir la síntesisde ADN, y modificade forma
importantela expresión
de antígenosde superficie;aumentaespecialmente
la expresiónde IgM y la del
antígenocD23 (receprorde bajaafinidadparaer Fc de ra IgE
y rigandodel cD2r).
Tambiénaumentala expresiónde los antígenosCD40 y B7IBB1,
que representan
los
receptorespara dos moléculasexpresadas
específicamente
en los
LT (el ligandode
CD40 y el CD28), así como la expresiónde moléculas
DR. Lógicamente,estos
efectosde IL-4 van a favorecerla interacciónLT/LB; asípor
ejemplo,el aumentode
la IgM y eI cD23 permitenunamejor captaciónde los
antígenos,libres o formando
partedeinmunocomplejos
respectivamente;
el aumentodeB7IBB1favorecerála unión
al cD28 del LT, y el aumentode DR incrementará
su capacidad
como Apc (lg9).
- Proliferación de LB activados:
induce la proliferación de los LB
coestimuladoso preactivadoscon anticuerposanti IgM;
actúa por tanto como
59
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comitógeno.Curiosamente,
no es capazde inducir la proliferaciónde las
célulasB
estimuladas
por célulasT activadas,e inclusopuede
bloquearla proliferación de
célulasB inducidapor IL-2; pareceser que
en estecaso actuaríabloqueandola
expresiónde CD25 (199).
- Favorecela transformación
de los LB a plasmocitos;en el ratón los induce
a producirIgGl e IgE, mientrasqueen el humano
los inducea producirIgG4 e IgE,
y disminuyela producciónde IgG2be IgG3 (232,233\.
1.3.5.4.3
- Estimulala Hematopoyesis,
favoreciendo
la proliferacióny diferenciación
de
los progenitores
granulocíticos
dependientes
de G-GSF(224).
- En combinacióncon
la rL-3, y ra IL-5, juega un paperimportante
en ra
generación
deeosinófilos
y delosbasófilos/mastocitos.
sobrelos
eosinófilosmaduros,
actúaaumentando
la expresiónde cD23 e inhibiendoIa expresión
de receptorespara
la IgG (234)' La administración
conjuntade anticuerpos
anti rL-4eIL-3, se traduce
en la desapariciónde basófilos y mastocitos
y en una mayor predisposicióna
infeccionespor nemátodos(223,235).
sobrelos monocitos/macrófagos:
60
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quedisminuyela ADCC (166).
. inhibela produccióndecitocinasproinflamatorias
(IL-1, IL_6,TNF, IL_
8, GM-CSF,INF-y) y de PGE2e ionessuperóxido,y estimulala producción
de ILlRa, al igual que el restode citocinasantinflamatorias.Tambiéninhibe
la
adhesión
de los mismosa las célulasendoteliales
(166,236,237).
- Sobre los neutrófilos estimula la
fagocitosisy la actividadmetabólica
respiratoria(236).
1.3.5.5INHIBIDORES
- Antícuerposanti IL-4 o receptorsoluble(223).
- CitocinasTHI (204).
1.3.5.6RECEPTORES
- Es de altaafinidad(97 Kd), y seexpresa
en escasonúmero(de
100a 1000)
sobreprácticamente
todoslos tiposceluiares(23g).
- Presenta
homología
significativa
conlosdominiosextracelulares
deIL-2. IL3, rL-s, rL-6, rL-7, rL-9,G-csF, cM-csF, STHy eritropoyetina
(superfamlia
de
lashemopoyetinas)
(238).
- Hay otrosdos polípéptidos
de 65-70y 75-g0Kd, que no intervienenen la
61
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fijación de la IL-4, pero podríanintervenir
en la transducciónde señales(23g).
- como muchasotras
hormonaspeptídicas,IL-4 se internalizatras
fijarse al
receptory se degrada(239).
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1.3.6INTERLEUCINArO
1.3.6.1ESTRUCTURA
- se designóinicialmente
como cSIF o factor inhibidor de la síntesis
de
citocinasproducidaspor los LTH tipo I (23g).
- Se comprobómástardeque
realizabaotrasdos
actividades,que eran la de
coestimulara los timocitos(240)y a los mastocitos;
con respectoa estosúltimos.su
acciénse distinguíade la ejercidapor IL_3 e
IL_4(241).
Glicoproreína
de 178aminoácidos
y pm de lg Kd (23g).
- una proteínaproducidapor
un gen del virus de Epstein_Barr(EBV),
el
BCRF1' ha mostradounafuefiehomología
en suestructura
conla de la IL-10 murina
y humana'Los datosen conjuntosugierenque
BCRF1corresponde
a un genancestral
de IL-10' queen un momentodadohabríasido
capturado
por el virus. por esoseha
llamadoa su productoIL-10v (242).
- Especificidad
de especie:la IL-10 murinano tieneefectosobre
los linfocitos
humanos'pesea presentarambasuna homología
en su estructuradel 73vo. sin
embargo,la IL-10 humanay la IL-10v
sí son capacesde inhibir la síntesisde
citocinastantode los clonesTHl murinos,
como de las céiulasmononucleares
de
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sangreperiférica(pBMNc) humanas(242,243).
1..3.6.2
- En humanos,rinfocitos
THO y TH tipo II activadospreviamentepor pMA
y anticuerpos
anti-cD3(243),asícomociertaslíneaslinfocitarias
B transformadas
por
el EBV (244), en argúnlinfoma B (240),
en cierrasríneasmasrocitari
as (24r) y en
célulasdel sMM estimuladas
por Lps (167,245).Los LB CD5+ son
tambiénunos
potentesproductore
s eae.
- En murinos,clonesTH2
activados
por concanavalina
A (ConA) y en algún
clon TH2 sin estimular,así como constitutivamente
en todosl o s l i n f o m a s B y e n
monocitos/macrófagos
estimulados
por LpS (242,243\.
1.3.6.3ACCIONESBIOLÓGICAS
1.3.6.3.r
- rnhibición de la sÍntesis
de citocinasmonocito/macrófagodependientes
por PBMNc, NK y clonesTHl:
... Inhibiciónintensade raproducciónde
INF_y, GM_csF, TNF_a
en PBMNcestimuladas
conPHA, anti-cD3
y TI.[F_p
orL-2. Dichainhibiciónseobserva,unrc
en clonesTHl murinoscomoen PBMNc
humanas
y es ejercidatantoa nivel de la
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proteínacomo del ARNm (242,243).Ello no se
debea un efectodirectode la IL-10
sobrelas célulasefectoras,sino a la inhibición
de la funciónpresentadora
de los
monocitos/macrófagos
(2a\.
si las células presentadoras
son LB esplénicos
purificadosen vezde los monocitos,la producción
de las
citocinasno seve afectada
(lo mismo ocurre en líneasB ransformadaspor
el EBv) (243). El fallo no estáa
nivel del procesamiento
antigénico,puestoquesi
los clonesTHI seestimulancon la
enterotoxinaB derEstafilococoAureoque secomporta
como
ianto no necesita
procesamiento,
la inhibiciónde
un superantrgeno
y por
las citocinaspor la IL-10 se sigue
dando (247)- El fallo radicaa nivel de la presenüación,
y es posible que
parcialmenteelio seadebidoa la fuertedisminución
de la
al menos
expresiónde MHC clase
II sobrela superficiede los monocitos,por acción
de la IL-10; estacitocinaademás,
vuelverefractariosa los macrófagos
a la expresiónde MHC tipo II inducidapor IL-4
e INF-1 Q48).
" Seobservanresulta'dos
simila¡esen NK estimuladas
con célulasaccesorias
(monocitospurificados)másrL-2, en cuanto
a la inhibición en la síntesisde INF-y
por dichasNK' sin embargo,la IL-10 no
escapazde inhibir la síntesisdel INF por
célulasNK estimuladas
con IL-2 sin la presencia
de monocitos.por ranto,el modo
de actuarde la IL-10 en estecasoseríael
mismoqueen el casode los TH.I(24g).
-
rnhibición
de
Ia
proriferación
inducida
por
mitógenos
(monocito/macrófagodependiente)
de LTIIO, THI y TflI2 enhumanosy de
THl
en ratones:
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El efectoinhibidorsobrela funciónAPC de los macrófagos
por la IL-10,
descritoanteriormente'no selimita a la presentación
del antígenoespecífico,sinoque
afectaigualmentea la respuesta
proliferativade los LT inducidapor mitógenos(pHA,
conA) o anti-cD3. La supresión
afectatantoa los cD4
comoa los cDg, y sorose
observasi las células T purificadasse cultivan
en presenciade macrófagos,no
observ¿índose
ningún efecto inhibidor si el cultivo es con
LB activados,células
dendríticaso fibrobtastoscomo APCs. Por tanto,
el efectoinhibidores específico
sobreel macrófagoy no sobrelascélulasefectoras.
La IL-10 pues,másqueimpedir
la proliferación, previenela presentacióny
con ello la activaciónde las células
efectoras'Dicha inhibiciónessoloparcialmente
¡evertidasi seañadenal medioaltas
concentraciones
de IL-2, lo cual sugiereque la causade la
disminuciónde la
proliferaciónno es simplementeuna bajaproducción
de rL-z (250).
- rnhibicidn de la fonnación
de LT citotóxicosaloespecÍficosen cultivos
mixtos de linfocitos: no esüíclaro si la IL-10
inhibedirectamentea la generaciónde
LT cD8+ citotóxicos,o si por el contrario
afectaa ra activaciónde los LT cD4+,
necesarios
parala generación
de los CDg citotóxicos(100).
- sobre ros monocitos/macrófagos,
además de inhibir
la funcirín
presentadora de antígeno y ra expresión
de MHC tipo rr, va a ejercer los
siguientesefectos¡
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.... Modificaciónen la morfoiogíay en la adhesión, aunque
no altera la
expresiónde CDl l abc,CDlg, CD54, CD5g,ni antígenos
muy tardíos (VLA-4 v
VLA-5), en monocitoscultivados(24g).
" ' Inhibiciónde la síntesis
decitocinaspor macrófagos
murinosperitoneales,
líneasde macrófagos
y monocitoshumanos,estimulados
con Lps, INF_y o Lps
masINF-y: IL-10 inhibela producción
deIL-1, IL-6, IL-g,
GM_csF,G_csFy TNF
(7w,167,245)'Si seañadeal cultivoanticuerpos
anti IL-10 neutralizantes,
seda un
aumentoimportantede todasestascitocinasen el medio,
asícomo un aumentoen la
expresiónde MHC tipo II (L67). Es interesanteresaltar
que IL-10 no suprime
completamente
la síntesisproteicade los macrófagos,
puesno tieneefectosobreTGFP (167),y queregulapositivamente
la expresiónde IL-1Ra,al igual que
la mayoría
de citocinasantiinflamatorias
(100).
.. Inhibiciónde peróxidode hidrógeno(Hzo2) y de
óxido nírrico (No) por
los macrófagos
activados(100,251).
' Inhibiciónde la capacidad
citocidade los macrófagossobrepatógenos
intra
y extracelulares
(Toxoplasma,
Leishmania,Schistosoma)
( I 00).
r.3.6.3.2
- Aumentala expresiónde
moleculasMHC tipo II en LB
üusto al contrario
que en los macrófagos)
(100,252).
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- Aument¿la viabilidadde los
LB (253\
- Aumentala proliferación
de LB activadoscon IL-2 (no en reposo) y
, la
secreciónde inmunoglobulinas
(G, A y M) (253,254).
- Actúa como factor coestimulante
(con rL-2 e IL-4) en el crecimientode
timocitos (240,255).
- Factor coestimurante
en la diferenciacióny proliferación de LT
CD8+
citotóxicos:soloen presenciadeIL-2 (256).
- Actúa como factor coestimulante
(con IL-3 e IL-4) en el crecimiento
v
proliferaciónde los mastocitos
(241).
1.3.6.3.3
- r'a' elevación de las
citocinas inflamatorias en ratones tratados
con
anticuerposanti IL-10, sugiereque dicha
citocinaspuedeser un potenteagente
antiinflamatorio'Datospreliminaressugierenque
es capazdirectamente
de proteger
de la muertea ratonescon shockendotóxico(257).
- La administración
de anttcuerposanti IL_10 a ratones,produce
una
deplecciónde célulasB CD5+. Parece
ser que dicha población, por otro lado
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numéricamente
muy pequeñay aúnbastante
desconocida,
podríaejercerlassiguientes
funcionesen el sistemainmune:
... Inmunidadantibacteriana
" Aclaramientode debriscelulares,como ros hematíes
senescentes
' Modulacióndel repertoriode anticuerpos
duranteel desarroto
Todo elro sugiereun posiblepapel
de ra IL-10 como incremenhdora
de la
inmunidadanti-bacteriana
mediadapor anticuerpos(257).
T.3.6.4INHIBIDORES
- INF-y (258).
1.3.6.5RECEPTORES
El receptor pa-rala IL-10 ha
sido recientementecaracterizado.
Er gen
codificadordel receptorparadicha
citocina,sehalla localizadoen el
cromosoma11
(zsr).
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1.4. LA RESPTIESTAINMI.INE
Hay dos niveles de defensacontra la invasión por agentesexternos: la
inmunidadinnatao inespecífica,y la inmunidadespecífica(adaptativao adquirida).
La diferencia principal entre las dos estriba en la especificid
ad y la memoria
inmunológica,ambaspropiedades
exclusivasde la inmunidadadquirida(1). para
simplificar, podemosdecir que cuandoun agenteinfecciosoentraen el Organismo,
encuentraprimero los elementosefectoresde la inmunidad innata inespecífica
(barrerascut-¿ínea
y mucosas,lisozima y otros enzimas,proteínasde fase aguda,
fagocitos,célulasNK y Complemento).
Estospuedensersuficientesparaprevenirla
enfermedad,pero, si no es así, entoncesse activa ademásel sistemainmunitario
adaptativoo específico(linfocitos T, linfocitos B y anticuerpos),que permite la
recuperaciónde la enfermedady estableceunamemoriainmunológicaespecífica;se
dice entoncesque el individuo ha adquiridoinmunidadcontra el agenteinfeccioso
(38).
Es obvio que ambostipos de inmunidad,la innatay la adquirida,no actúan
separadani secuencialmente,
sino en íntima ¡elación.Por ejemplo,los anticuerpos
producidospor los linfocitosayudana que los fagocitosreconozcansus dianas.
Despuésde la activaciónclonal por el antígeno,los LT producenlinfocinas que
estimulana los fagocitosparadestruircon mayorefectividadlos agentesinfecciosos.
Los macrófagos,a su vez, ayudana los linfocitostransportando
el antígenodesdela
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periferia hastalos gangiioslinfáticosy
otrosórganosrinfoides,dondees presentado
a esoslinfocitosen una formaque puedan
reconocer(1,3g).
Las respuestasfrente a la mayoría
de ros inmunógenosrequierenpues
procesamiento
previo de dicho inmunógenopor la
er
célulaencargadade presentarroa
los linfocitosT, y la expresiónuiterior
del mismoen la superficiecelular,junto
a
otras morécurastambiénde membrana,que
se agrupanbajo er nombrede Sistema
Mayor de Histocompatibilidado MHC,
y desempeñan
un paperfundamentalen Ia
distinciónentrelo propio y lo no propio, ya
quecualquierantígenoes reconocidopor
el receptorde las célulasT sólo cuando
ésteles es presentadoen conjunción
con
moléculasMHc' ros genesquecodifican
estasmoléculas
seclasificanen claseI. II
yIII,ysehallanenelbrazocortodelcIomosoma6(38).@
penenecen
a la familiadel "supergen
de lasinmunoglobuiinas,,.
Estafamiliacodifica
una amplia variedadde moleculasde
la superficiecelular, que abarcatambién
a las
inmunoglobulinas,
al TCR, al cD4 y al cDg (25g). Las
moléculasde clase r
incluyen los genesHLA-A, HLA-B y
HLA-C, y se encuenffanpresentes
en Ia
superficiede todaslas célulasdel organismo.
Las moléculasde claserr incl,uyen
a
los genesHLA-DR, HLA-D', y
HLA-De, y sólo se expresanen células
del SI.
especialmenteenmacrófagosylinfocitosB(259).@codifican
a los componentesC2 y C4 de la
vía clásicadel Complemento,al
Factor B
(Properdina)de la vía albrna,
al TNF_a y F, y alos enzimas2l-hidroxiiasa
A yB
Q6U.
7I
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1.4.1
Los linfocitos T cooperadores
(cD4+) son los principalesorquesüadores
de
la respuesta
inmuneporquesu ayudaes necesaria
para la activaciónde
efectorasprincipalesde estarespuesta,
esdecir,los linfocitosT
las células
citotóxicos(CDg*)
y los linfocitosB productores
de anticuetpos
(1,38).Tambiénmediala respuesta
de
hipersensibilidadretardada,útil sobre todo
frente a la infección por parásitos
intracelulares
comola tuberculosis,
y frentea algunosvirus (261).
La activaciónde los linfocitos T cooperado¡es
ocurre tempranamente
en el
curso de la respuestainmune, y requiere
al menosdos señales.una primera señal
provienede la unión del receptorpara
el antígenodel linfocito T con el complejo
antígeno-MHCde claseII de la célulapresentadora
(sistemamonocito/macrófago)
(262)' La segunda
señalderivade la IL- 1, unacitocinaproducida
por ia Apc activada
cuyaprincipalfunciónes la de inicia¡ la
respuesta
inmune.Estasdos señales
juntas
inducenla expresiónde receptores
paraotra linfocina,la rL-2, asícomola producción
de la propiarL-2 (57)' raprincipal función
delarL-zes la de amplificarla respuesta
iniciadapor el conüacto
del linfocitoT cooperador
con la Apc. Ello lo va a llevar a
caboinduciendoel crecimientoy la activación
de las célulasque expresenreceptores
para la rL-2, incluyendoras propias
célurasT cooperadoras
(65), que son ras que
principalmente la producen (efecto
autocatalítico),los linfocitos T citotóxicos
(181,182)y las célulasNK (5). Estas
cérurasactivadaspor ra IL-2 son capaces
de
producira su vezotrascitocinascomo
factoresde crecimiento
y diferenciación
de los
linfocitos B (IL-4, IL-5, IL-6), factores
hemaropoyéticos
(IL-3, GM_csF) que
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estimulanla producciónen medulaóseade nuevascélulasinmunes
mieloidesque
pasana la circulación,o INF-y (72,195,196).El INF-y (secretado
por rinfocitosT
y célulasNK) tiene,entreotrasfunciones,la de aumentar
la actividadde las propias
célulasNK (201), aumentarla expresiónde receptoresde alta
afinidad
para la IL-2
en célulasdel SMM, aumenhr el númerode moleculasMHC
de clase II y de
receptorespara Fc y Complementoen la membrana
de células del sistema
mononuclearfagocítico(SMF) (212,213),y aumentarlos MHC
de claseI
de cétulas
dianade los linfocitosT citotóxicos(209). Todo ello se traduce
en un incremenro
final en la actividadde las NK, de los LTc y de las funciones
principalesde las
célulasdel SMM (fagocítica-bactericida,
preseniadora
de antígeno,tumoricida)(3g);
estascélulasmacrofágicas,reclutadasy potenciadas
enormementeen sus funciones
por la actívacióninicial de los linfocitosT cooperadores,
seránlasprincipalescélulas
efectorasque medien las respuestasde hipersensibilidad
retardada(inflamación
crónica) (263)' Los macrófagosque van siendo reclutados
al foco inflamatorio
presentan
el antígenoa otroslinfocitosT cooperadores,
y segregan
másIL-1 y otras
citocinascomoel rNF-c, perpetuando
la respuesta
(r,3g). Ambascitocinas,apane
de inducir la formación de rL-2 por los linfocitos T y
otras células del sistema
inmune, son tambiénactivadorasde las prostaglandinas
en diferentestejidos del
organismo,y por tantoresponsables
directasde muchosde los síntomas
y signosdel
procesoinflamatorio'como sonel aumentode las proteínas
de faseagudapor
los
hepatocitos,la neutrofiiiay la fiebre. Susefectosen ce¡ebro
apartede la fiebre, son
fundamentalmente
somnolencia,anorexiay aumentode la secreciónhipotalámica
de
cRF, con el consiguienteestímulodel eje hipófiso-suprarrenar
y aumentode
esteroides
(154).
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1.4.2 La activaciónde los linfocitosT citotóxicos
Requiere,al igual que los T cooperadores,
dos señalesde activación.Una
provienede la interaccióndel receptordel linfocito
T conel complejoantígeno-MHC
de claseI presenteen la membranade la célula diana (célula
infectadapor virus,
célulatumoralo injerto de tejido extraño)
Q64). La segundaseñalla proporcionala
IL-2 producidapor el rinfocitoT cooperador
activado(1g1,1g2).
El linfocitoT citotóxicoactivadoliberaráentonces
suscitotoxinas,quesonlas
encargadas
de eliminara la céluladiana(3g).
1.4.3 La activaciónde los linfocitosB
La producciónde anticuerposrequiere,por un
lado, la activaciónde ros
linfocitos B (265), y por otro su dife¡enciaciónen
célulasplasmáticas,que ser¿ín
las
que secretenlas inmunoglobulinas
(266,267).Mientrasel linfocito T cooperador
es
activadopor un antígenoconcreto,los LB específicos
para ese mismo antígenolo
reconocena travésde susreceptores
de membrana(inmunoglobulinas
de superficie).
La unión con el antígenoes seguidade la internalización
receptor-antígeno,
y ello
constituyela primeraseñalen la activación;sin
embargoes insuficiente,por io que
la activacióncompletay posteriordiferenciación
a célulaplasmáticaespioporcionada
por los linfocitosT cooperadores
a travésde la secreciónde factoresde crecimiento
(268) y diferenciaciónde LB (269-270\.
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Los LB tambiénpuedenactuar como APC. Paraello, tras internalizarel
antígeno,éstees procesadoy expresadoen la superficiede la membranaiunto con
moleculasMHC de claselI (27t).
1.4.4 La activaciónde los LinfocitosT Supresores
No estiítan claramentedefinidacomo en el casode los T cooperadores
o los T
citotóxicos.A1 contrario que ellos, numerososhallazgossugierenque algunas
poblacionesde Linfocitos T supresores
soncapacesde reconocerantígenosnativos,
sin necesidadde que éstos sean procesados
por la Apc. Sin embargo,otras
poblacionesseríanMHC-restrictas,al igual que los T cooperadores
o T citotóxicos.
Ejercen su acción a través de FactoresSupresores,que parecenser capacesde
sustituira las propiascélulasen su funciónsupresora
específicade antígeno.Al igual
que los LT cooperadores,su misión principal es la de regular la intensidadde la
respuesta
inmune,peroen estecasoen sentidonegativo.Ello lo hacena travésde dos
víasgenerales:o bien ejerciendounaaccióndirectanegativasobrelaspropiascélulas
efectorasdel sistemainmune, o bien inhibiendola función de las células T
cooperadoras,
quede estamanerano puedendesempeñar
su funciónestimuladorade
célulasefectoras(38).
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1.5. MODIFTCACIÓN DE LA RESPUESTAINMTINE.
INMTNOSUPRESORES
E INMUNOMODULADORES.
1.5. 1 IT{NII.INOSUPRESORES.
El crecimientode la Inmunología
clínica hapuestoal descubierto
un
número
crecientede enfermedades
que sondebidasa respuesüas
inmunesaberrantes.Ello ha
resultadoen la búsquedade drogascapaces
de inhibir esasrespuestas
no deseadas.
A
lo largo de las dos pasadasdécadas,se han hecho
considerablesprogresosen la
identificaciónde un grupo de compuestoscapaces
de alcanzar t)na inhibición no
especfficade la respuesta
inmune(27D.
1.5.1.1 Corticosteroides
Las hormonasesteroideas
glucocorticoideas
son
ampliamenteusadaspara
suprimir de modo eftcazlas manifestaciones
de numerosasreaccionesinflamatorias
e inmunes' Las actividadesantiinflamatorias
e inmunosupresorasde los
corticosteroides
puedenagruparseen tres categorías:el efecto
de estasdrogasen la
circulaciónleucocitaria,su capacidadpara alterar
funcionescelularesespecíficasy
otra miscel¿ínea
de actividades
antiinflamatorias
(273\.
Trasla administración
intravenosa
de unasolainyecciónde glucocorticoides.
se produce un rrípido aumentoen el númerode
neutrófilosy una disminución
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concomitante
del númerototal de linfocitos,monocitos,eosinófilosy basófilos;los
cambiosm¿íximosseobservana las 4-6 ho¡asde la inyección,y al cabo
de 24 horas
todaslas cifras han retornadoa susvaloresnormales(274).
La neutrofiliaresultantede la administ¡aciónesteroidea,parece
ser debidaal
menosa dosactividades
distintas:liberaciónde neutrófilosmadurosdesdela reserva
en la médulaósea,y disminucióndel pasode los neutrófilosdesde
los espacios
intravascul¿Ires
a los exudadosinflamatorios.Ello se traduceen un incrementoen la
vida mediade los neutrófiloscirculantes.Las actividadesde los neutrofilos
como la
quimiotaxisy la liberaciónde enzimaslisosómicos,no se ven
afectadaspor los
esteroides;sin embargo,la liberaciónde enzimasproteolíticasno lisosómicas
como
la colagenasa
y el activadordel plasminógeno,
sí disminuyenpor la acciónde los
esteroides(274).
El númerode eosinóñlos
y de basófiloscirculantes,
tambiénsereducea causa
de la redistribución(275).
La reducciónen el númerode linfocitos ci¡culantes,resulüadel
secuestrode
las célulaslinfoidesen los tejidoslinfoides,incluyendola propia
médulaósea.El
númerototal de linfocitosT circulantesdisminuyemarcadamente,
mientrasque la
reduccióndel númerode linfocitosB es solo moderada;el número
de célulasno T
no B, no sufreningúncambio.Entrelas subpoblaciones
de linfocitosT,
el número
de célulascD4+ sereduceen un mayorgradoqueei número
de célulasCDg+. Las
actividades
deloslinfocitosT sealteranconsiderablemente;
así,losesteroides
inhiben
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la respuestalinfoproliferativain vitro, en partedebido
a una lesiónen la síntesisy
secreciónde interleucina-2,que másprobablemente
es el resultadoindirectode una
producciónsuprimidade la IL-1 por los monocitos.
La expresióndel receptorde IL-2
no se ve afect¿da(276). Los corticosteroides
puedentambiénbloquearla progresión
de los linfocitosestimulados
por PHA a travésdel ciclo mitótico, inhibiendo
la
entradade célulasen la faseG' del ciclo, y parando
la progresiónde los linfocitos
activadosdesdela fase G, a la fase S. El efecto
de los corticosteroidessobrelos
linfocitosB es menor;dosisaltasde corticosteroides
reducenmodestamente,
tras2-3
semanas
de administración,
las concentraciones
séricasde IgG e IgA, pero no de
IgM' La terapiaesteroideano alterani la actividad
de las célulasNK, ni la ADCc
(e4).
uno de ros cambiosimportantesinducidospor
ros esteroides,es una
monocitopenia
pronunciada.
La cuentade monocitosfrecuentemente
caepor debajo
de 50 célulasi¡r,ly ello seha postuladocomo
de m¿íximaimportanciaen la capacidad
de los esteroidespara mediar su actividad
antiinflamatoria(275). Los esteroides
producennumerososcambiosen las funciones
del moriocito-macrófago;
así, son
capaces de suprimir la actividad bactericida
de dichas células fagocíticas,
traduciéndose
ello en unamayorsusceptibilidad
a determinadas
infecciones.
También
interfierenen la funciónde presentación
del antígenode dichascélulas.otros efectos
inciuyenun dañoen la migracióndel monocito
en respuesta
a factoresquimioüicticos,
una respuestiadisminuída al factor de
inhibición (MIF), un broqueo de ra
diferenciaciónde los monocitosa macrófagos,
y unasupresiónde la capacidadde los
monocitosparaexpresarreceptores
paraer Fc y receptores
parael complemento,ro
78
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
cualpuedecontribuiral dañode Ia actividad
fagocítica(274).Suprimenigualmente
la capacidadde las célulasreticuloendoteliales
parafagocitarantígenosrevestidos
de
anticuerpos,probabremente
a causa de ra disminuciónde ra
unión de ros
inmunocomplejos
a rosreceptores
de membrana
paraer Fc y el c3b, cuyaexpresión
se halla disminuídapor la accióndirecta
de los esteroides;
ello puedejustificar su
efectobeneficiososobreenfermedades
como la púqpuratrombocitopénica
idiopática
y la anemiahemoiíticaautoinmune'
Los testscutáneos
dehipersensibilidad
retardada.
tambiénse inhibenen el tratamiento
prorongado
con esteroides(277.
Los efectosdescritosde los esteroides
sobreel sistemainmune,permitensu
aplicaciónen la Clínicabajo tresprotocolos
diferentes.segúnlas circunsüancias:
- "administrarla cantidad
más pequeña capazde suprimir las
manifestaciones
de
enfermedad,durantelargosperíodos
de tiempo.Por ejemplo,7,5-10mg diarios
de
prednisonap¿rratratar Ia artritis reumatoidea.
- cantidades
másgrandes,en un intentode suprimir
completamente
y de un modo
rápido' las manifestaciones
de unaenfermedad
mediadapor el sistemainmune.por
ejemplo r-2 mg/kg diarios,en dosis
única o repartidoen variasdosis;
se usa a
menudo en enfermedades
como la anemiahemoríticaautoinmune,
la púrpura
trombocitopénicaidiopática y varios
tipos de glomerulonefritisinducidaspor
el
sistemainmune.
79
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
- cantidades
muyelevadas
decorticoides
(porejemplometilprednisolona
intravenosos
a 10-30mg/kg).Esteprotocolosereservaparaaquellasenfermedades
gravesqueen
un momentodado amenazan
la vida del paciente"(273,278).
La terapiaprolongadacon corticosteroides
no es inocua;estasdrogastienen
numerososefectossecundarios,
potencialmente
graves.Es importanteteneren cuenta
que la terapia crónica con dosis elevadasde esteroides,puede causar mayor
morbilidadque la originadapor la propiaenfermedadde base(279,280).
1.5.1.2Drogascitotóxicas
Lasdrogascitotóxicassonun grupode compuestos
químicosconia propiedad
farmacológica de matar células capaces de autoreplicarse. Los linfocitos
inmunológicamente
competentesrepresentan
pues un pobtaciónsusceptiblede ser
atacadapor estasdrogas(281).
Inicialmentefueronintroducidasparasu usomedicina,en la terapiacontrael
ciíncer (282); sin embargo,estudiosposterioresrevelaronque muchasde estas
sustancias
tambiénposeíanpropiedades
inmunosupresoras
(2S3).De estemodo, su
uso se extendióal tratamientode enfermedades
causadaspor respuestasinmunes
aberrantes,y a la inhibición de la reacciónde rechazoen los transplantes.Hay 4
drogascitotóxicasutilizadasrutinariamente
en Clínica para la inmunosupresión:
ciclofosfamída, azatioprina,metrotexatey clorambucil (213).
80
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Estasdrogaspuedenejercerunatoxicidaddiferenteparalos linfocitos
T y B.
La ciclofosfamida
causaunareducciónproporcionalmente
muchomayordel número
de linfocitosB, qué de las célulasT; ello se correlaciona
bien con su mayorefecto
supresorde las respuestas
inmunesmediadas
por anticue{pos,
que
de las reacciones
mediadaspor células(2s4). Es por ello queen clínica, la
ciclofosfamidase usapara
trataraquellasenfermedades
en ias quehayunarespuesta
inmunehumoralaberrante.
como sucedepor ejemploen la púrpuratrombocitopénica
idiopática,mientrasque es
poco eficaz en la inhibición de la reacciónde rechazo
en los transplantes.La
azatioprinapor el contrario, pareceser máspotentecomo
inhibidor
de las respuestas
mediadaspor célulasT y tambiénparecereducireficazmente
el númerode célulasNK
ci¡culantes'aunquepuedesuprimirtantola respuesta
inmunecelularcomola humoral
(273,283).
La toxicidadde las drogascitotóxicasno es selectivapara
los linfocitos;
t¿mbiénpuedenmatarcélulasproliferadorasno linfoideas,
incluyendoprecursores
hematopoyéticos,
célulasmucosasgastrointestinales
y céIulasgerminalesen las
gónadas'Espor ello quelosefectossecundarios
predecibles
deestasdrogas,incluyen
pancitopenia,toxicidadgastrointestinal
e infertilidad (2g5,2g6).
1.5.1.3Ciclosporina
La ciclosporinaes un agenteinmunosupresor
derivadode la fermentación
de
ciertoshongos,conpropiedades
distintasa lasde los anteriores
compuestos
y mucho
más selectiva'Así es capazde modificarla actividad
inmunoreguladora
de los
81
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
iinfocitos T cooperadores,sin afectar a las
células T supresoras,T efectoras,
linfocitosB, granulocitos
o macrófagos
(273).De estemodo,bloqueaselectivamente
aquellasrespuestas
inmunes,incluyendoel rechazode los
aloinjertos,que son
dependientes
de los linfocitosT cooperadores.
Al contrarioquelas drogascitotóxicas,
es capaz de producir inmunosupresión
sin producir linfolisis. Actúa en la fase
tempranade desarrollode la respuesta
inmune; su mayor actividadpareceser
una
inhibición de la síntesisy secreciónde larL-2.
Tambiénpuededañarla capacidadde
los linfocitos T coope¡adores
activadospara respondera la rL-2, Ál vez,limitando
la expresióndel receptorparadichacitocina(2s7).A
causade supotencia, hatlegado
a ser una drogade uso estandaren la clínica
para inhibir las reaccionesde rechazo
a aioinjertos,así como para preveniria reacción
de injerto frente al huéspeden el
transplantede médulaósea. su eficacia inmunosupresora
puedeaumenüarse
si se
administrasimultáneamente
condosismoderadas
de esteroides,ya queambasdrogas
parecen actuar sinergísticamente;la
ciclosporina inhibiendo directamente
Ia
producciónde rL-2, y los esteroides
suprimiendoindirectamente
la síntesisde dicha
citocina, a partir der bl0queo en la liberación
de IL-l por paÍe der monocito_
macrófago(288).
El tratamientocon ciclosporinatieneefectos
secundarios
que incluyen entre
otros hipe¡plasiagingival, hirsutismoy
manifestaciones
del sistemanerviosocentrar
(187).
En ciertascircunstancias,
puededarseun
efectoparadójicocon ei tratamiento
inmunosupresor
engeneral,comoesel casodeaumentar
unarespuesta
específica.Así
82
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
por ejemplo'el efectode la ciclofosfamida
sobrelasreacciones
mediadas
por células
es variable;algunasreaccionessoninhibidas
mient¡asque otraspor el contr¿*ioson
por elro ra ciclofosfamida,
aumentadas.
a causade su mayor toxicidadpara
los
linfocitos B, es capazde suprimir eftcazmente
las
respuestas
humoralesfrente a un
determinadoantígenoy simultiíneamente
de aumenta¡por ejemplolas respuestas
de
hipersensibilidadtetardadafrente
al mismoantígeno,probabremente
debidoen parte
a una toxicidaddirectade la drogasobre
ros linfocitosT supresores
(2g3,2g4).
Por otro lado, la capacidad
delos inmunosupresores
parainhibir unarespuesta
ínmune, puede resultar de una
actividad farmacológicadistinta a
la propia
inmunosup¡esión'
En este sentido,la expresiónde
muchasrespuesras
inmunes
comprendetanto la participaciónde
céluiasde la inmunidadespecífica
como de
célulasefectorasno específicas,
como es el casode neutróñlosy monocitos.
El
número o la función de dichascélulas
efectorasno específicaspuedetambién
ser
alteradopor drogas inmunosupresoras.
En consecuencia,
una inmunosupresión
aparentepuedeser másbien el resultado
de las propiedades
anti-inflamabriasde un
agenteespecífico'Por ejemplo,los
co¡ticosteroides
sonpotentessupresores
del asma
alérgicamediadapor IgE y de la dermatitis
por contactomediadapor células
T, y en
ambasenfermedades
su principalmecanismo
de acciónesa partir de una inhibición
de la inflamación,sin afectarlas respuestas
inmunessubyacen
tes(274,275,277\.
83
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
1.5.2INMUNOMODULADORES.
Los inmunomoduladores
(modificadores
de la respuesta
biológica)sondrogas
quemodificandirectamente
unafuncióninmuneespecífica,
o tienenun efectopositivo
o negativosobre la actividaddel sistema
inmune. Los usospotencialesde los
inmunomoduladores
en clínica, incluyenla reconstitución
de una función inmune
deficientey la supresiónde una funcióninmune
normal, o excesivacomo ocuffe en
el casode las enfermedades
autoinmunes.
Existennumerosas
sustancias
capacesde
modularla reaccióninmune; estassustancias
incluyenlas citocinas,anticuerpos
monoclonalese inmunomoduladores
no específicoseSg).
r'a tecnologíadelADN recombinante
ha proporcionadocantidadesilimitadas
de citocinasaltamentepurificadas,permitiendo
la evaluaciónclínica de dichas
sust'ancias
en ausencia
de contaminantes
biológicamente
activos.La mayorpartede
las citocinashan sido estudiadasen ensayos
clínicosen FaseI para determinarsu
seguridady farmacología, y en ensayos
en Fase II para determinarsu actividad
inmunomoduladoraen situacionesclínicas
específicasy para definir regímenes
de
tratamiento'Las clasesmayoresde citocinas
que han sido evaluadasclínicamente,
incluyen interferones,algunasinterleucinas,
factoresestimulantesde coloniasy
factoresde nec¡osistumoral.En general,
sonsustancias
carasy de difícil manejo;en
ocasiones
las dosisquehayquesuministrar
paraconseguirel efectodeseado,
causan
efectossecundarios
que si bien no suelenseÍ graves,sí
sonmolestosparael paciente
(r,39,273).
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Los anticuerposmonoclonares son
producidos por hibridomas, uo
procedimientoen el cual un ratón
es inmunizadocon un antígenoespecífico
y sus
céiulasde bazoposteriormente
fusionadascon una líneainmortal de
célulasB, para
producir una célula híbrida con
capacidadde secretarde un modo
indefinido,
anticuerposcon especificidad
clonal para ese antígeno(l). Ello permite
ob*ner
grandescantidadesde anticuerposf¡ente
a un epítopoconcretodel antrgenodeseado.
Los ensayosclínicos iniciales se realiza¡on
en pacientescancerososa los que
se
administrabaanticuerposmonoclonales
murinos frente a determinadosantígenos
tumorales'surgiendonumerososproblemas
que incluíanla enormeheterogeneidad
tumoral' la capaciónno específica
de los anticuerpos
en sitiosno tumorales,el acceso
vascularlimitado de muchosde los
tumoreso la apariciónde anticuerpos
humanos
frentea los anticuerpos
murinos,problemastodosellosque
siguenlimitandoel uso
de estaterapiaen el cáncer,sobretodo
en los tumoressólidos.No obstante,
el uso
de Ac Mo conjugados
a radioisótopos,
toxinascelularesu otrasdrogas,sigue
siendo
hoy en día una de las numerosaslíneas
de investigaciónmásde modaen la
terapia
contrael c¿íncer
(1,290)'Del mismomodo,anticuerpos
monoclonales
comoel oKT3,
queposeeespecificidad
por el antígenocD3 presenteen las
célulasT, ha demostrado
ser eficaz en el tratamientodel rechazo
agudodel transplanterenal y también
del
transplantehepáticoy cardíaco,obteniéndose
en algunoscasosresultadossimilaresa
losconseguidos
conterapias
convencionales
(esteroides
a altasdosis);sinembargolos
efectoscolateralestambiénson importantes,
incluyendosíntomassimila¡esa los
de
un cuadrogripal' cambiosen la presión
arterialy disnea.por otro lado, el desarrollo
de anticuerpos
humanosfrentea ratón,acabalimitando
su usorepetido(zg0).
85
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
hr
, puedendividirse en res grupos:
productosde origen microbiano,
productosobtenidosde mamíferos
y compuestos
sintéticos'r'os inmunomoclulaclores
de origen mícrobianohandemostrado
tener un
beneficioterapéuticolimitado,
baja purezay muchavariabilidad
entre los distintos
lotes;el másestudiado
ha sidoel bacilode calmette-Guerin
(BcG), quese ha usado
en distintostiposde cáncercon
diferentes
result¿dos,
siendoel carcinomasuperficial
de vejiga (inyeccióninrravesical)
una de susprincipaiesindicaciones
(1,273). En
cuantoa losproductosde origen
mamíferocomo las timosinas(sustancias
ho¡monelike producidaspor el timo y que
tienendiversasactividadesbiológicas,
incluyendo
el aumentode la respuesta
inmuneen animalesnormalesy
timectomizados),
aunque
potencialmente
útilesenel traüamiento
dedeterminados
estados
de inmunodeficiencia,
su verdaderaeficacia no ha
sido demosffadaaún en ensayos
crínicoscontrolados
(273)' l-os cotnpuestos
sintéficoscomoel levamisol,una
drogaanúhelmínticacapaz
de inhibir la actividaddecélulas
T supresoras,
cuandoesadministradoa pacientes
con
cáncerseasociaa un incremento
en la respuesta
de hipersensibilidad
reta¡daday a un
aumentode la proliferaciónlinfocitaria
y de lasrespuestas
mitogénicas
in vitro (273\.
86
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1.6 ANAPSOS:EXTRACTO
DE POLYPODIUM LEUCOTOMOS
calaguaraesel nombrecomún
del helechopolypodiumleucotomos,
típicode
determinadaszonasde centroamérica,
y cuyo crecimientoóptimo
se da en,,e ros
2000-2500m' de altura;desde
hacetiempo,vienesiendoutilizado
en sudaméncay
Españaen el tratamiento
de enfermedades
cutáneas
comoel psoriasisy la dermadds
atópica' Los efectosclínicos
del extractopreparadoa partir
de los rizomas de ra
planta(Anapsos)'hansido
confirmados
y documenhdos
en ensayoscrínicosabiertos
y doble-ciegoplacebocontrolados.
El extractoes administrado
orarmentea ros
pacientes'y hastael momento
solosehanobservado
efectossecundarios
menores,del
tipo de molesrias
gástricaseg1_2g3).
Estudiosinicialesdemostraron
un efectoantitumoralde Anapsos
(ANp). La
actividadmetabólicade dicha
sustancia
sobrefragmentosde tumores
humanos,,in
vitro"' mosfó inhibiciónde
la síntesis
de ADN y proteínas,
asícomodisminuciónder
transportede glucosa ma¡cada
ai interior de la célula, affibuyéndose
el efecto
antineoplásicoa modificaciones
en la membranaplasmática.
La accióndei producto
sobretejidosnormales,al
contrarioque la acciónde
los citostáticos,fue más
bien
anabórica'tanto in vitro como
in vivo (2g4). otros autores,
atribuyeronel efecto
antineoplásico
a unainrcraccióncon receptores
citoplasmáticos
similar-ara ejercida
por los glucocorticoides
(295).
87
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En el año 1983,sedescribiópor vezprimeraun efectoinmunomodulador
de
Anapsos.En sujetosvoluntariossanos,la administración
del productopor vía oral,
disminuye-larespuesta
linfoblásticaa la estimulacióncon mitógenosy los niveles
séricosde inmunoglobulinas
despuésde tresdíasde tratamiento,y aumentael índice
de supresión,la respuestalinfoblásticaa mitógenos,los niveles séricos de
inmunoglobulinas
y la proporciónde célulasCD8+, sin altera¡la tasade células
CD3+ y CD4+, trascincodíasde administrac
ión(296).Diversosestudiosrefieren
el efectoinmunomodulador
de Anapsosen patologíasdiferentescomo la dermatitis
atópica,la psoriasiso el vitfligo (291-293,297).
Del mismomodo,en un estudio
realizado en EsclerosisMúltiple, el tratamiento con extracto de Polypodium
leucotomosresultóútil para corregirlas alteraciones
del fenotipoinmunológicomás
frecuentesen dicha enfermedad(aumentode linfocitos T inductoresde célulasB y
disminución de linfocitos T supresores)coincidiendoello a su vez con una
estabilización
clínicade los pacientes
(298).El efectoinmunomodulador
de Anapsos
ha sidoigualmentepuestode manifiestopor otrosautores(299).
En estudiosexperimentales
realizadoscon Anapsosse ha podido comprobar
queestecompuestoactúacomopotencialagenteneurotróficoy neuroinmunoregulador
modulandoIa producciónde IL-I, IL-2 y TIIF en SNC de ratas tratadascon
diferentesdosis del extracto (300). Posteriormente,los mismos autores han
demostradoque la administraciónaguda y crónica de Anapsos revierte la
hiperactividadmotora y el deterioro del aprendizaje,y tiende a normalizarlas
alteraciones
neuroinmunes
cerebrales
observadas
en un modeloanimalde enfermedad
de Alzheimer (301). En un estudioen el que se administróAnapsospor vía
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Volver al índice/Tornar a l'índex
subcutánea
a ratonesviejosduranteonce meses,se ha observadoque el producto
mejorala coordinación
psicomotora
con respectoa animalesno tratados,sin
afectar
significativamente
la tasade supervivencia,
la evolucióndel pesocorporal,la ingesta
sóliday líquida,ni la apariciónde signosneurológicos
(30r).
Anapsosse ha mostradotambiénútil en ei tratamientode patologías
tan
diversascomoel herpeszoster(302),la estomatitisaftosa(303)o afecciones
oculares
primariaso secundarias
a enfermedad
sistémica(304-305).
Diversosautoreshan referido una actividadcolagenopoyética producto,
del
relacionándola
con mecanismos
inmunológicos
(306,307).
89
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IT.- OBJETIVOS
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Volver al índice/Tornar a l'índex
tr. OBJETIVOS
En un intentode ahonda¡en la actuación
del productodesdeun puntode vista
inmunológicoque nospermitierahallar
un nexocomún
justificar la mayor
capazde
parte de sus efectos,decidimostestar
la capacidadinmunomoduiadora
de dicha
sustancia"in vitro". para elro nosplanteamos
los siguienteobjetivos:
1.- comprobarsi Anapsosejerceuna
acciónpleitropicasobreel sistema
inmune.
2'- valorar el efectode Anapsossobre
la producciónde citocinaspor
células del sistemamonocito/macrófago.
3'- Vaiorarer efectode Anapsossobre
la producciónde citocinaspor
los diferentesclonesde linfocitosT
helper:TH', THl y TH2.
4'- Valorar el efectode Anapsossobreproliferación
y activaciónde linfocitos
T, de linfocitosB y de célulasNK.
An¿íiisisfenotípicopor citometríade
flujo.
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
IIT.. MATERIAL Y METODOS
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
Anapsos(extractode Polypodiumleucotomos),
en forma de liofilizado, fue
amablementecedido por ASAC Pharmaceutical
InternationalA.I.E (Alicante,
España)'Todos los experimentosfueronrealizadoscon el
mismo lote del producto
(PaJ-22).
Los rizomas del Polypodium leucotomosfueron recolectados
en las
PlantacionesExperimentaies
y de Recuperación
Ecológicade Guatemala,propiedad
de ASAC Pharmaceutical
Internationalsituadaa2000meÍospor
encimadel nivel del
mar' Los rizomasfueronexaminados
parasu identificaciónpor JM. Aguilar Cumes
(Jefe del Jardín Bouínico de la universidad de
San carlos de Guatemala).La
deshidratación
de los rizomasse hizo a 50o c durante4g ho¡as.Los
rizomassecos
(500 gr) fueron sumergidosy maceradosen una
mezclade disolventespolares(5
litros) a una temperaturainicial de 70o c y llevados
a temperaturaambiente
(temperaturafinal) durante8 horas.El extractoasí
obtenido,fue filtrado
parasu usoen el experimento.
91
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
y liofilizado
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
3,2 MUESTRADEL ESTUDIO
Las célulasseobtuvieronde un grupode diezdonantes
sanosde ambossexos.
con edadescomprendidas
entrelos 21 y 35 años.
3.3 TEST DE LABORATORIO
células mononuclea¡es
de sangreperiféricafueronaisladasa partir de sangre
heparinizada,mediantecentrifugaciónen gradiente
de densidad(Fico[-Hypaque).
Lascélulasseparadas
fueronajustadas
entodosloscasosa lxl0ulml conmedio
de cultivo RPMI 1640 (WHITAKER), suplementado
con r0% de suerode ternera
fetal (FLow), 1vode antibiótico(GIBco) y rvo
deGluramina(GIBCO).
3.3.1
Las células fueron sembradaspor triplicado
en placas de 96 pocillos
(cosTAR) de fondoplano,a razónde 200.000
célulasipocillo
(200 pllpocillo). Las
célulasfueronestimuladas
con0'5 pglml del mitógenopHA o 4
¡.rg/mlde pokeweed
(PwM), con y sin Anapsos,así como
con Anapsossolo. Las
dosis de Anapsos
utilizadasen todoslos casosfueronde 75, 150,
500, 1000, 1500y 4500 pglml.
como controi de la proliferaciónse utilizaron
célulasconteniendosolo medio
92
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
de
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
cultivo' Las célulasseincubarona continuación
en estufade cultivo, durante3 días
a37oC y 5% de co2; 18-20horas
antesde finalizarel cultivo,seincorporó
al medio
1 ¡'tcu de 3[H]-Timidina(AMERSHAM).
Finalmente
las célulasfueronrecolectadas
en el Harvesbry la proliferación
medidaen un contadorbetay expresada
en c.p.m.
(cuentaspor minuto).
3.3.2 Determinación
de citocinas
Las células se sembrarona razón
d,e lx1'./pocilro (1 ml/pociro).
La
estimulaciónse realizó con Lps
solo (control), Lps+pHA, Lps*Anapsos
y
LPS+PHA *Anapsos' se decidió
utilizarlps comoestimulante
común,p¿*aasegurÍu
una buenaproducciónde citocinas
inflamatoriascomo IL_lp o TNF_'.
Las dosis
utilizadasen cadacasofueron20
*dmrde Lps, 4 ¡tglmrde pHA y 150
¡iglml de
Anapsos'Seutilizóestadosisde Anapsos
por serIa quepresentómayorefecto
sobre
la proliferaciónlinfocitaria.Las
célulasse incubaronen estufa(37oc,
5% de co2)
y se realizóunacinéticacompreta
de cadaunade las citocinas(a las
0, 12, 24, 4g,
72 y 96 horas)'paracadaunade las
condiciones
de estimulación.
Trascentrifugarlos
medios' se recolecüaron
los sobrenadantes
en vialesde congelación(1 ml/vial)
y se
guardaronen congeladora -70oc,
hastasu ulterior procesamiento.
Las citocinas
medidasfueronla IL-lp, TNF-'
, rL-2,INF-y, rL-4 eIL_10y su determinación
se
realizómedianteELISA (RD Diagnostics).
Los límitesde detecciónparalos distintos
Kits, fueronde (5 pg/ml.
93
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
3.3.3 Análisisfenotíoico
Las célulasse sembrarona lxiOu/ml en placas(cosrAR) a ruzón
de r
' ml/pociilo.Lascondiciones
de estimulación
fueronlasmismasquelas utilizadaspara
determinarproducciónde citocinas(20 pg/ml de LpS, ylo 4 pglml de pHA y/o
150
p'g/mIde Anapsos).Las célulasseincubarondurante48 horasen
estufa(37oC,5Vo
de CO') y a continuaciónfueronlavadascon medioRPMI 1640conteniendo
ZVode
suerode ternerafetai y l% de azidasódica(10 minutosa 1500rpm y
5 minutosa
1200rpm; Ta: 18oC),ajustadas
a un mínimode 200.000células/tubo,e incubadas
durante45 minutosa 4oC con5A%de sueroAB, 1% de azidasódica
y los diferentes
anticuerposmonoclonales.
Finalmenteselavaronde nuevolas células(2 lavadosde
5 minutosa 1200rpm, 4oC) y se resuspendieron
en 2 ml de pBS/glicerolal 50%.
Seguidamente
lasdistintaspoblaciones
fueroncuantificadas
por inmunofluorescencia
directamediantean¿ílisis
fenotípicopor citometríade flujo analíticacon dobleo triple
marcaje,usandola combinación
de anticuerpos
monoclonales
másadecuada
en cada
caso(GALTAG:cD3, cD4, cD5, cDg, cD16, cD19, cD25, cD3g,
GD45RA;
Becton Dickinson: CD45RO). Como fluorocromosse utilizaron
(FITC), ficoeritrina(pE) o rercercolor (TC).
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
la fluoresceína
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Volver al índice/Tornar a l'índex
3.4 ESTADÍSTICA
Los resultadosde la proliferaciónvienenexpresados
en mediageométrica*
error estandarde la media geométrica.La significaciónest¿dísticase determinó
medianteel testde la t-Studentparadatospareados.Se consideraron
significativos
aquellosvaloresparaunap< 0'05.
Tanto para el análisisde la producciónde citocinascomo para el análisis
fenotípico,la significaciónestadística
se determinómedianteel testde la t-student
paradatospareados.Los resultados
vienen.expresados
como los valoresmedios*
error estandarde la media; se consideraronsignificativosaquellosvalorespara una
p( 0'05.
La correlaciónentrelas distintascitocinasparalas diferentescondicionesde
estimulación,sedeterminómediantelos coeficientes
de correlaciónlineal.
95
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
IV.- RESULTADOS
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
TV.RESULTADOS
cuandolas célulasseesümula¡on
con Anapsossolo, seobservóun
aumento
estadísticamente
significativoenla proliferación,con
lasconcentraciones
de 75 ¡tg/ml
( c p m: 5 8 1 5 +1 7 1 6p; =Q'0 1 3)
y 150 ¡ r glm l( cpm: 6954+ 1751;
p:0,017) vs.
control (células sin esrimular)
(cpm=3g0
6+766); dichas dosis coinciden
respectivamente
con los nivelespiasmáticosaproximados
que se alcanzaríancon la
tomade 3-6 cápsulas/día
de 120mg (<500 pglml). A dosis
superiores
de Anapsos,
esteefectode estimulaciónfue disminuyendo
progresivamente,
llegandoincrusocon
la dosisde 4500pglml a obtener
valoresdeproliferacióninferiores
a los del control,
pero sin llegaren ningúncaso
a alcanzarniveles
de significación(Figura 1; resultados
expresados
en mediageométrica* e¡rorestándar
dera mediageométrica).Mencionar
a esterespectoque la viabilidad
ceiula¡ del cultivo medidapor la
técnicade Azul
Trypan, en aqueiloscasosen ros
que se utilizó la dosismás
alta de Anapsos(4500
pglml) fue inferior ar 50%,
siendoen el restode casossuperior
at 90vo.El aumenb
mencionado
enlascifrasdeproliferación
quedóconsistentemente
enmascarado
cuando
las célulasfueron simulkíneamente
estimuradas
con ros mitógenospHA (Fig.2)
o
PwM (Fig'3); dosissuperiores
a 1000pglml de anapsos,mosffaron
una tendencia
progresivaa disminuirra proriferación
inducidapor ambosmitógenos,
sin que ros
resultados
fueranestadísticamente
significativos
(Fig.2 y 3).
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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4.2 DETERMINACIONDE CITOCINAS
Las TablasI, II, ilI, IV, V y VI, muestranla cinéticade producciónde las
paralas diferentescondiciones
diferentescitocinasanalizadas,
de estimulación.Los
resultadosvienenexpresados
comola media(x) + error estándarde la media(e.s.m).
La Figura4 muestrala producciónde IL-lp "in vitro" (X+esm)en PBMNc
de sujetossanosestimuladascon Anapsos,comparadacon la estimulacióndebidaa
los mitógenossolos.Los nivelesde IL-lp de célulasestimuladas
con LPS+PHA,
fueron inferioresa lo largo de toda la curva a los producidospor célulascontrol
estimuladas
soloconLPS, aunquesoloa las 12horasdecultivolasdiferenciasfueron
(810+67 pg/ml vs. 1041198 pglml) (p<0'05).
estadísticamente
significativas
También se aprecia en estasprimeras 12 horas, una reducciónestadísticamente
significativaen los nivelesde IL-lp en el grupo de célulasestimuladascon
LPS*Anapsos(755X74 pglml), comparados
con los nivelesde dicha citocinaen
célulascontrolestimuladas
soloconLPS(104i+98 pg/ml)(p < 0'025).Globalmente,
lo que se observaes un retrasode L2 horasen la síntesisy/o liberaciónde IL-lp
cuando las células fueron estimuladascon Anapsos, de modo que las curvas
correspondientes
a las célulasestimuladas
con esteproductoalcanzaronun máximo
de produccióna las 24 horas,mientrasque las curyascorrespondientes
a células
estimuladas
solocon LPS o con LPS+PHA alcanzaron
dichom¿íximo
a las 12 horas
de cultivo. Las diferenciasobtenidasentrelos nivelesde IL-lp a las 24 hons en
97
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
célulasestimuladascon Anapsosy a las 12 horasen célulasestimuladascon LpS v
PHA+LPS, no fueronsignificativas.
La Figura5 muestrala cinéticade producciónde TNF-a "in vitro" (Xf esm)
en PBMNc de los sujetosdel estudio.Los nivelesalcanzados
de TNF-a en células
estimuladas
conLPS* Anapsosenlasprimeras12horasde cultivo (468+ 122pg/ ml)
,
fueron inferioresa los obtenidosen célulasestimuladas
solo con LpS (623+11g
pg/m1);alas24 horasde cultivo sin embargo,los nivelesde TNF-a en las células
estimuladas
con LPS*Anapsosfueronmayores(3581 121pg/ml) que los obtenidos
con lascélulasestimuladas
solocon LPS (I62+21pglml). No obstante,
ni a las 12
ni a las 24 horasdichasdiferenciasfueronsignificativas.
La cinéticade producciónde la IL-2, aparecerepresentada
en la Figura 6
(resultadosexpresadosen X*esm). Cuandolas célulasfueron estimuladas
con
PHA+LPS, la cinéticade la curvade producciónde IL-2 fue prácticamente
idéntica
a la obtenidacuandoseestimularonlas célulassolo con LPS, observándose
tan solo
una ligera elevación en los niveles de dicha citocina que en ningrin caso fue
significativa.Sin embargo,cuandoa la sumadeambosmitógenos
seañadióAnapsos,
se produjo un incrementoen los nivelesde IL-2 a lo largo de toda la curva. Estas
diferenciasfueron estadísticamente
significativascon respectoa las célulascontrol
estimuladas
solocon LpS, a las 12 horasde cultivo(31tO pg/mt vs. 20* 1 pglml)
(p<0'05), alas24horas(30+5 pgimlvs. 19*1 pg/mt)(p<0'05) y a las 72horas,
dondealcanzósu m¿íxima
significación(60+5 pglml vs. 4l+3 pglml) (p<0'01).
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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Conrespectoa la producción"in vitro" deINF-1, lasdistintascurvasaparecen
representadas
expresados
en i*esm). I"a adición de PHA
en la Figura7 (resultados
al LPS se tradujoen un incrementoen los niveiesde producciónde dicha citocina,
si se comparabancon los obtenidosal estimularlas célulascon LPS solo; estas
diferenciassehicieronsignificativasa partir de las 24 horasde cultivo (29+9 pg/ml
vs. 6tl pg/ml)(p<0'025),manteniéndose
a las48 (43111pg/mlvs. 15+1 pglml)
(p<0'025) y alcanzando
su máximasignificacióna las 72 horas(47+11 pglml vs.
16+ 1 pg/ml) (p < 0'01). Cuandoa PHA+LPS seañadióAnapsos,dichasdiferencias
a partir de las 24 horasde cultivo una mayor significación
aumentaron,aJcanzando
que al añadirsolola PHA al LPS (p < 0'005 a las 24 horas,p < 0'01 a las 48 horas
y p < 0'001 a las 72 horas).
En la Figura 8 aparecerepresentada
la cinéticade producciónde la IL-10
(x-+esm).Ocurrióalgosimilara lo observado
enel casodel INF-y. Cuandoseañade
PHA al LPS, tambiénseobservaun incrementoen los nivelesde producciónde dicha
citocina,comparándolos
conlosobtenidos
al estimularlascélulascon LPS soio;estas
diferenciasfueron significativasa las 12 horasde cultivo (3080+334 pglml vs.
530+96 pglmi) (p<0'001), a las 24 (4000+305pg/ml vs.2444*337 pg/ml)
(p<0'005) a las 48 (3426+578pglml vs. 191It52!6pglml) (p<0'05) y alas72
horas(3040+452pg/ml vs. 17681361pg/ml) (p<0'025). Al añadirAnapsosa
PHA+LPS, lasdiferenciasanterioresaumentaron,
alcanzando
a partir de las24 horas
de cultivo unamayorsignificación
queal añadirsolola PHA at LPS (p (0'001 a las
24 horas,p < 0'025a las48 horasy p < 0'001 alas72 horas).La adiciónde Anapsos
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
a LPS, se tradujo también en un incremento significativo de dicha citocina
(1418+421)(p<0'05) en las 12 primerashorasde cultivo.
La cinéticade producciónde laIL-4 aparecerepresentada
en la Figura 9; los
nivelesobtenidosde dichacitocinaen las4 curvasfueronprácticamente
idénticos,no
existiendoen ningúncasodiferenciassignificativasentreellas.
La Tabla VII muestralas correiaciones
linealesentrecitocinas,que revierten
cuandose añadeAnapsosal cultivo.
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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ESTIMULO
HORAS DE
CULTIVO
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INF-y/lL-10
INF-y/lL-10
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12
12
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0'20
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0'002
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0'001
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|L-lpt 1L-2
24
24
24
0'33
0'80
- 0'80
NS
0.004
0'005
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lL-1p/ INF-y
lL-1p/ INF-y
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48
48
0'94
o'22
- 0'69
0'004
NS
0'003
rL-1p/rL-10
rL-lp/ rL-10
tL-rp/ rL-10
48
48
4E
0'25
0'73
- 0'66
NS
0'02
0'003
CORREIáCION
(p)
LPS PHA ANP
TABI.AVII
Indicalas correlaciones
linealesentrecitocinas,
que reviertencuandose añadeAnapsosal cultivo.
r: Coeficientede correlac¡ón
p: n¡velde significación
NS.no significativo
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
4.3 ANÁLISISFENOTíPICO
Las TablasVIII, IX y X muestranlos porcentajesde expresiónde diferentes
antígenosde diferenciaciónleucocitarios,para las condicionesde estimulación
F0
(célulassin estimular),LpS*pHA, LpS*Anapsosy Lps+pHA*Anapsos;
los
resultados
vienenexpresados
comola i*esm.
Tras 48 horas de estimulacióncon LPS+PHA, se observaun descenso
significativoenel porcentajede expresiónde marcadores
de membranacaracterísticos
de la líneade linfocitosT (CD3,CD5, CD4)vs. célulassinestimular
a tiempoinicial
(F0); en el casodel CD3 ocune lo mismo,en la estimulación
con LpS*Anapsosy
LPS+PHA*Anapsos.Cuandolascélulasfueronestimuladas
con LpS*Anapsos,se
produjoun incremento
significativodelporcentaje
totaldecélulascDg+ (p:0,001)
vs. F0 y del porcentaje
toraldecélulasCDs+ (p:0'001) y célulasCD4+ (p:0,004)
vs. LPS+PHA. La adición de Anapsosa Lps+pHA produjo
un aumento
significativoen la expresióndel marcadorCD4 (p:0'017), asícomo
una tendencia
al aumentoen la expresiónde CD3 y CD5; igualmentese produjo
un incremento
significativo(vs. F0) en el porcenraje
de célulasexpresando
cDg (Fig.l0) (Tabla
VIID.
La estimulacióncon LpS+pHA tras 4g horas de cultivo, produjo
un
incremento significativo (vs. F0) en el porcentaje de células
CD4+CD25+
(p:0'005), que aumentócuando se incluyó Anapsosen
las condicionesde
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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estimulación(p<0'001). La ligera tendencia
al aumentodel porcentajede células
cD4+cD45Ro+ observadatras la estimulación
con LpS+pHA (vs. F0), se
transformaen un incrementosignificativode dicho porcentaje(p<0'005 vs. F0 y
LPS+PHA), cuandolas célulasson estimuladas
con LPS*Anapsos,apreci¿índose
tambiénen esteúltimo casoun incrementosignificativoen el porcentajede células
cD4+cD38+ (p=0'01) vs. LPS*PHA. I-a adiciónde Anapsosa LpS*pHA
produjo una tendenciaal aumentoen el porcentajede célulasCD4+CD25* vs.
LPS+PHA, así como un incrementosignificativode la proporciónde células
CD4+CD45RO+vs. F0 y LPS+PHA(p<0'005)(Fig.11)(TablaIX).
La estimulacióncon LPS+PHA produjo t¡as 48 horas de cultivo un
incremento significativo vs. F0 (p<0'005), de ros porcentajesde células
CDS+ CD25+ y CD 1ó * . Cuandolascélulasfueronestimuladas
conLpS* Anapsos,
los nivelesde significaciónpara dichascélulasaumentaron(p<0'001 vs. F0), y
también se observóun incrementosignificativovs. Lps+pHA (p:0'024 para
cD8+cD25+ y p:0'035 paralas cD16+). La adiciónde Anapsosa Lps+pHA
se tradujo también en un incremento significativo del porcentaje de células
cD8+cD25+ 1p:6'02; p<0'001 vs. F0) y en una tendencia
al aumentode las
célulasCD16+ (vs. F0). El porcentajede célulascon alta y baja densidadde
expresiónde CD8, tambiénsemodificóen funcióndel estímulorecibido.Así cuando
las célulasestiínsin estimular(F0) o estimuladas
con LPS+PHA, los patronesson
similares,mostrandoun mayorporcentajede célulascon alta expresióndel receptor
de membranacD8 (cD8on,hJ
(p<0'001 vs LpS*Anapsos). La estimulacióncon
LPS*Anapsos da lugar a un patrónopuestoal anterior,con un porcentajesuperior
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de célulascon baja expresiónde dicho receptor(cD&J
vs F0 y LpS+pHA
(p < 0'001)' La adiciónde Anapsosa LPS+PHA,
tiendea disminuirel porcentaje
de
célulasCD8b,irr,,
y a aumentarel de célulasCDgd'"(Fig.12)(Tabla
X).
No se produjeroncambiossignificativos
en los porcentajesde expresiónde
célulasCD19+ (Fig.i0) ni decélulasCD4+CD45Ra* (Fig.
i 1), paralas diferentes
condiciones
de estimulación.
103
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
V.- DISCUSIÓN
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
V.DISCUSIÓN
En 1986,fuepropuestaunasubdivisiónmayordelos linfocitosT cooperadores
CD4+ de ratón, basadaen diferenciasen suspatronesde producciónde citocinas.
Hoy se aceptaque los clonesde linfocitosT de la subpoblación
THl, sintetizany
secretan
entreotrascitocinasinterleucina-2
e interferón-gamma,
perono interleucina-4
ni interleucina-5,mientrasque los clonesde linfocitos T de la subpoblaciónTH2
producenentreotrasrL-4,rL-s,rL-6 e IL-10 pero no rL-2 ni INF-y; una tercera
subpoblaciónde linfocitosT, la TH0, sintetizaun patrón mixto de dichascitocinas
(18s).
Diversosautoreshanaisladoclonesde linfocitosT humanos,similaresa los
THO, THl y TH2 del ratón, hablandode patronesde citocinasTH0-like, THl-like
y TH2-like. Algunosde estosautoreshan comprobadoademásque dichospatrones
puedenacumularseen los tejidoso en la sangreperiféricade pacientescon distint¿s
enfermedades,
siendoel patróndistintodependiendo
de la enfermedaden cuestión.
y compruebanque la inmunizaciónde los pacientescon agentesdiferentesevoca
respuestasdistintas,TH1 o TH2 . Así, tras la primoactivación,los linfocitos T
"naive" solo producenIL-Z; a los pocosdíasde haberseactivadose transformanen
célulasTHO, lascualesdependiendo
del tipo deantígenoestimulantey trasvariosdías
de exposiciónal mismo,setransforman
encélulasTH1 o TH2. La subpoblación
THI
representaa las células efectorasmás importantesen reaccionesinflamatorias
asociadasa respuestasvigorosasde hipersensibilidadretardada,pero con baja
r04
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
producciónde anticuerpos,üalcomoocurrepor ejemploen la dermatitispor
contacto
o en infeccionesdebidasa algunasbacteriasintracelulares.El fenotipofuncional
de
la mayor parte de los clonesTH2, no se asociaa respuestas
de hipersensibilidad
retardada,pero sí a producciónpersistentede anticuerpos(incluyendo IgE) y
eosinofilia, tal como ocurreen infeccioneshelmínticasen humanos,y en la alergia
(203,2t0,227).
Numerosasenfermedades(Artritis Reumatoide,Enfermedad de Crohn,
enfermedadde Lyme) sehanasociadoconproducciónexcesiva"in vitro" de citocinas
inflamatoriascomola IL-l0 y el TNF-a, y otrasenfermedades
comoel SIDA o el
lupus eritematososistémico,se han asociadocon una produccióndisminuída
de
citocinas THl-like como La lL-2 y el INF-y
!40).
El efecto que dererminados
fármacoscomo el metrotexate,ejercencomo restauradores
de estedesequilibrio,se
ha relacionadoen determinados
casoscon unamejoríaclínicade los pacientes(30g).
También hay estudiosque demuestranque la disfunciónque se produce
en la
liberaciónde citocinasdurantela infecciónviral, puedeser la responsable
de la
supresiónde la respuesta
inmuneque acompaña
a determinadas
infeccionesvirales
(30e).
Dado pues que las citocinasjuegan un papel importanteen la homeostasis
inmunológica,la determinación
de variaciones
en susnivelespuedeser importante
para una mejor comprensiónde las alteracionesinmunológicasque acompañan
a
distintasenfermedades
(76). Es por ello, por lo que basándonosen los diversos
105
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
estudios que apoyan un papel de Anapsoscomo potencial inmunomodulador,
decidimosinicia¡ el presentetrabajo.
Estudiosprevios(299)"in vitro" con PBMNc de controlessanosestimuladas
con ConA demostraronuna supresióndosisdependiente
de la proliferaciónal añadir
Anapsosal cultivo,asícomounainhibicióndosisdependiente
enla secrecióndeIL-2.
En amboscasos,la supresiónfue m¿íximacon las dosisde 500 y 1000 pg/ml
de
Anapsos.La mediciónde citocinascomo Ia IL-la, IL-lp, rL-6 y TNF_* en los
sobrenadantes
de cultivo, demostróun incremento
dosisdependiente
en la secreción
de dichascitocinas,cuandolasPBMNcfueronestimuladas
conAnapsosy ConA; este
incrementoresultóm¿íximocon dosisde 500-1000pglmt. Cuandolas células
se
estimularoncon Anapsossolo (sin conA) a razónde 1000 pglml, se produjo
igualmenteun incrementocon respectoal controlsin estimulación,en la secreción
de
dichascitocinas,aunquelos nivelesobtenidosfueronmuchomásbajos.
En el presentetrabajo hemos mostradoque Anapsos "in vitro" a dosis
consideradas
efectivascuandoseusanin vivo (<500 ¡rglml), es cap.v de estimular
la proliferaciónde PBMNcde sujetossanosen cultivoy de aumenüar
la secreción
de
IL-Z a lo largode todala cinéticade la curva,con nivelesmáximosde citocina
a las
72 hotasde cultivo, que coincidencon el tiempode máximarespuesta
proliferativa.
Un efectode éstimulaciónde la proliferaciónya ha sido referidoen esiudiosprevios
(2e6).
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Por otro lado, Anapsoses capz de reducir, al menos
inicialmente,la
liberaciónde IL-1B al medio, y tiendea disminuirlos
nivelesde TNF-c en las
primeras12 horasde cultivo.
La disparidadmanifieslaentrelos resultados
de nuestroestudioy los obtenidos
en el estudio citado previamente(299), creemosque se
debe
básicamentea ias
diferenciasmetodológicas
entreambos.El mitógenoutilizadopara la estimulacióny
lasdosisde Anapsosempleadas,
sondistintas.De hecho,cuandonosotrosutilizamos
dosissuperioresdel producto,en el casode la proliferación
tambiénobservamosuna
tendenciaa la supresión,
peroqueen ningúncasollegaa ser significativa.por
oro
lado hay que teneren cuent.aque el efectode estimulación
sobrela proliferaciónse
haceevidentecuandolas célulassonestimuladas
solocon Anapsos,quedandodicho
efectoenmascarado
en la co-estimulación
con los otros mitógenosutilizados;los
autoresdel trabajoprevio no midieronel efectoqueAnapsos
por
sí solopodíaejercer
sobredicho parámetro(299).
En cuanto al efecto diferentedel producto sobre
los niveles obtenidosde
citocinasinflamatoriascomola IL-lF o el TNF-a
en ambosestudios,creemosque
ademáspuedehabersidodecisivoel hechode quelos
autoresdel mencionadoestudio
(299) han utilizado un solo punto en el tiempo, para
compararlos nivelesde una
mismacitocinaen condicionesdistintasde estimulación.
Así por ejemplo, si nos
fijamosen la cinéticacompletade la IL-lP obtenida
en el presenteestudio(Fig.4),
se compruebaque hay dosgruposde curvasdiferentes.
uno de elloscorresponde
a
lasdoscurvasen lasquela estimulación
seha hechoconLpS soioo conLpS*pHA:
t07
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
el otro corresponde
a estasmismascurvasperoañadiendo
Anapsosal cultivo. Lasdos
curvassin Anapsosobtienenun máximo
de produccióna las 12 horas,mientras
que
al añadi¡éste'se produceun enlentecimiento
o retrasoen la liberaciónde la
IL-l g
al medio de cultivo, de modoque
ambascurvas alcanzandicho
máximoa ras24
horas' si analizamosun soropunto
de cortepara las 4 curvas,por ejempr
o a las24
horas,comorosnivelesobtenidos
en lascurvascon Anapsossonmayores,
podríamos
interpretarerróneamente
que Anapsosestiíestimulando
de algún modo la síntesiso
la liberaciónde dichacitocinaal
medio,cuandoen realidadesüíocurriendo
justo lo
contrario.
Pa¡tede ros hatazgosobservados
con
Anapsossobrela IL-lp en el presente
estudio'concuerdan
con los obtenidosenestudiosexperimenhles
en animalestratados
con dichoproductopor vía oral (300,301).
El hechode que Anapsos"in vitro"
puedaser capazde bloquear
o retrasar,
al menosinicialmente,la producción
o la liberaciónde citocinasinflamatorias
como
Ia IL-IF o el TNF-c' puede
result¿rde interéspara explicar
como podría estar
actuandoel productodesdeun punto
de vistainmunológico,al menosparcialmente,
sobredeterminadas
patologíasenlasqueun aumento
en los nivelesde dichascitocinas
pudieraes'urjugandoun papel
en la pabgeniade lasmismas.AsÍ por
ejemplo,ra IL_
1 mediaun importantenúmero procesos
de
patológicosasociados
a enfermedad,como
puedeser er casoder psoriasis
u otras enfermedades
(310,311).En el caso der
psoriasis,el efectoantinflamatorio
de exffactosvegetalesdergéneroporypodium,
ya
ha sidopuestode manifiestopor
otrosautores(3i2).
108
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
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Por otro lado,es sabidoquecitocinascomola
juegan un papel importanteen la
IL-r-c, la IL_r F y el TNF_',
destruccióndel tejido conectivo,al estimular
la
PGE2y la colagenasa
(71). En estesentido,los efectosreferidos
de Anapsossob¡e
la IL-lF y el TNF-c, puedenjustificar, también
en partey desdeun puntode vista
inmunológico,la ya descritaacúvidadcolagenopoyética
del producto(306,307).
Igualmente,se ha demostradoel papelque niveles
aument¿dos
de IL_r F yro
TNF-a y subsecuentemente
de pGE2, juegan en la patogenia de dive¡sas
enfermedades
neurodegenerativas
como la enfermedadde Alzheimery la Esclerosis
Múltiple (313,314),así como el papelterapéutico
de agentesantinflamatorios
no
esteroideos
enestasenfermedades
(315).Desdeestepuntodevista,aquellos
fármacos
que como en el caso del Anapsossean
capacesde disminuir la produccióno la
liberaciónde dichascitocinas,puedenresultar
de utilidad en el tratamientoae eshs
enfermedades
(316).De hecho,diversosautoreshanpodido
comprobaren estudios
experimentares
realizadoscon Anapsos,que est" compuesto
actúacomo potencial
agenteneurotróficoy neuroinmunoregulador
(300), normalizandolas alteraciones
neuroinmunescerebralesobservadasen
un modero animal de enfermedadde
Alzheimer, y revirtiendo la hiperactividad
motora y el deterioro del aprendizaje
típicosde estaenfermedad
(301).
De cualquier forma, pensamosque para
confirmar definitivamente la
relevanciaclínicade los datosanteriores,
sonnecesarios
nuevosestudios,'in vivo,,
quepermitandemostrarun efectomantenido
de la drogasobredichascitocinas.a lo
largo del tiempo.
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
En cuantoal INF-y, los resultados
obtenidosparecenmásdebidos
a la acción
de la PHA, que al propio Anapsos.
De hecho, y tal como ocurre
en el presente
estudio, ya se ha demostrado
que la esdmulaciónconjunta
de pBMNc con
LPS+PHA, reducera producción
de IL-1 si secomparacon LpS
soroy aumenüa
la
producciónde INF-y si secompara pHA
con
sora(317).No obstante,seobserva
que
cuandoa Lps+pHA se añadeAnapsos,
se produceun aumentoen ra significación
estadística
paraer INF-y cuandoambas
curvassecomparancon LpS soro,
quepuede
interpretarsecomo un papelpotenciador
del productosobrela acciónejercida
por la
PHA en dichacitocina.Lo mismo
ocurrecon la IL_10.
Desdeel puntode vistadel INF-Y,
su
aumentopuederesultarinteresante
para
explicar en algún caso y desde
un punto de vista inmunológico,
las ya referidas
accionesantitumoraly/o antivírica
del producto(294,295,302-304)
dado el efectode
estimulaciónque dichacitocina
ejercesobrela inmunidadcerular.
Esteaspectodel
productose ve reforzadopor
su acciónincremenhdorasobre
IarL_2.
El aumentode IL-10 puederesultar
interesante,
por su efectocoestimulatorio
con oras citocinas(rL-2) en el
crecimientode timocitos,por su
conocidoefecto
inhibitoriosobrelascitocinasinflamatorias,
asÍcomopor su efectoestimulante
de la
inmunidadhumoral sobre los
linfocitos B (100). Er efecto
de Anapsosen la
producciónde anticuerpos
ya ha sidoreferidoen estudios
previos(296).
Anapsosno pareceejercer en principio
ningún efecto
producciónde IL_4.
i10
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
apreciablesobre la
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
De todo lo expuestoen el presenteestudioy fijándonos
en las correlaciones
obtenidasent¡e las citocinaspara las diferentescondiciones
de estimulación(Tablas
vII), seobservaqueAnapsosno actúadel mismomodo
sob¡elasdiferentescitocinas
medidas.
El efectoopuestoe independiente
queAnapsospareceejercersobrela IL-lp
y larL-2 es reforzadopor unade lascorrelaciones
del presenteestudioque
la atención.cuandonosotrosestimulamos
las célulasen
másllama
cultivo con LpS*pHA, se
observaunacorreiaciónpositiva(r=0,g0; p:0'004) queestá
indicandoquela acción
de LPS+PHA sobreambascitocinases idéntica.Sin
embargo,cuandoañadimos
Anapsosa LPS+PHA, dichacorrelaciónsehacenegativa(r=-0'go;
p:0,005). Lo
mismoocurreen er casode la IL-lg y er INF-y o Ia
IL-10 e IL-10. Del mismo
modo, correlaciones
que resultannegativascuandolas célulasse estimulan
sólo con
mitógenos,setransformanen positivasal añadi¡Anapsos
al mediode
cultivo: éstees
el casode la IL-10 y ei INF-y.
Podemospuesconcluir que el productopareceejercer
un efecto opuestoe
independienre
sobrela IL-1 p e rL-2, IL-r p e INF-y e IL-1p e IL-10.
Sin embargo,
ejerceun efectosimilarsobrela IL-10 e INF-y; algunasde
estascorrelaciones
apoyan
un posibleefectosinergístico
de Anapsosy pHA sobrela IL-10 y er INF-y. De este
modo, aunqueotros estímulospuedanes|ar envueltos
en la autoregúlaciónde la
producciónde citocinas,Anapsostambiénejerce
un papelimportanteen la misma.
111
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Estosresultados'sugierenun efectopleiotrópico
"in vitro" de Anapsosp¿*a
las diferentescitocinasanalizadas,quepuede
debersea un modode accióndiferente
sobredistint¿spoblaciones
del sistemainmune.por un lado Anapsos
estáejerciendo
un efectoinhibitorio posiblemente
sobrelos monocitos,principalescélulassecreroras
de IL-lp y TNF-d; por otro estiíestimulando
a diversoscionesde linfocitos T
(principalmente
THl), o tar vez THO(IL-2, INF-y, IL-10),
paraque produzcany/o
secretensus citocinasal mediode cultivo.
creemosque ser¿ínnecesarios
nuevos
estudiosen poblacionescelularesseparadas,
para poder confirmar definitivamenre
estosdatos.
La citometríade flujo constituye
unherramienta
muy sensible
deidentificación
y caracterización
de poblacionescelulares.una de susaplicaciones
máscomunesen
el campode Ia clínica, incluye el inmunofenotipado
de
antígenosde diferenciación
de superficiecelula¡es(31s) . Además
de determinarel número y Ia función
de
granulocitos,linfocitos y monocitos,
han llegadoa ser rutina en el diagnóstico
y en
la monitorizacióndel tratamientocon posibles
agentesinmunomoduladores.
La
inmunomodulación
de la expresiónde antígenosde superficie
celulares,puedeser
reconocidacomo un cambio,en el tiempo,
del porcentajede cérulaspositivaspara
dichosantígenosy/o un cambioen la
densidadrelativade los mismos(31g).
El
fenotipo' en ocasionespuedeindicar
una cierta función. Esta correlaciónpuede
resultar en parte del hechoque muchas
de las moléculasde superficiecelulares
reconocidaspor 10santicuerposmonoclonales,
juegan un paper específicoen
las
funcionesde los linfocitos,como es
el reconocimiento
del antígenoo la lisis de
n2
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
célulasinfectadas
por virus. otrasdeestasmoleculas
constituyen
marcadores
de línea
celular'otrasreflejanmadurez
o activación
celula¡o receptores
paracitocinas(32.3437).
Estudios"in vivo" realizadosen sujetos
sanos,demuestranque Anapsos
incremenhel porcentaje
de célulascD8+ sin alterarel porcentaje
de célulascD3+
ni el de célulascD4+ (296).En un estudio
preliminaren pacientes
con Esclerosis
Múltiple' otros autoresdemuestran
tambiénun aumentodel porcentaje
de células
cD8+, asícomounadisminución
derporcentaje
decéruras
cD4+cD45Ro+ (2gg).
otros autoresrefierenun efectodel producto
sobrecélulascDg+ en pacientescon
otraspatologías(297).
Nosotrosdemostramos
queAnapsos"in vitro" a dosisterapéuticas
incremenn
el porcentajede linfocitosT, tantode población
su
cooperadora
como especialmente
de la supresora/citotóxica.
El aumentoen la coexpresiónde células
cD4+ y células
cD8+ con antígenos
de membrana
comoel cD25, cD3g, y cDa5Ro, indica
que
Anapsoses capazde inducir igualmente
la expresiónde marcadores
de activaciónen
dichascélulas.
La disminución en la expresiónde
marcadorestípicos de linfocitos T
observada
en la estimulación
con LPS*PHA, p¿rreceserdebidaa
una.disminución
relativadel porcentaje
de los linfocitoscD4* (no activados),
a expensas
sobretodo
de un aumentoen el porcentaje
de célulascD16+ y en menorgradode
linfocitosB.
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La mayorpartede la citotoxicidaddependiente
deanticuerpoestámediadapor
célulasNK y por unapequeña
subpoblación
de linfocitosT, queexpresancDi6 (5).
Este marcadorse expresaen más del
95% de laspBMNc con actividadcitotóxica
para distintaslíneascelulares(319).
Aproximadamente,
entre un 30-50vode las
células NK también expresanel antígeno
cDg pero con una intensidad de
fluorescenciabaja Qzq' Los resultados
de esteestudiodemuestranque Anapsos
incrementael porcentajedecélulascon
expresióndedichosma¡cadores
de membrana.
caracterizadas
como citotóxicas.
En resumen,Anapsos"in vitro" puede
ejercerun efectoestimulanteen la
proliferación y activaciónde linfocitos
T y de célulasNK. Ello permite explicar,
desdeun punto de vistainmunológico,
los resultados
obtenidoscon el productoin
vitro e in vivo de su actividadantitumorar
y antivíricaeg4,2g5,302_304),y
apoya
en parte' los obtenidosen el estudiosobre
citocinas,dondese demuestraun efecto
predominantedel productosobrela
inmunidadcelular,potenciandola producción
de
rL-2 e INF-y (321)' otros autorestambién
encuentran
esteefectopredominantedel
productosobrela inmunidadcelular(322).
No obstante,seránnecesarios
nuevosestudiospara elucidardefinitivamente
la relaciónexistenteentreroscambios
fenotrpicos
observados
y su función.
Las hormonasesteroideasglucocorticoideas
son ampliamenteusadaspara
suprimir de modo eftcazlas manifestaciones
de numerosasreaccionesinflarnatorias
e inmunes'El númerototalde linfocitos
T circulantes
disminuyemarcadamente:
el
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
númerode célulascD4l
se reduceen un mayorgradoque el númerode células
cD8+' Inhibenla respuesta
linfoproliferativa
in vitro, en partedebidoa unalesión
en la síntesisy secreciónde interleucina-2,que
másprobablemente
es el resultado
indirectode unaproducciónsúprimidade la IL-IF
por los monocitos.El efectode
los corticosteroides
sobrelos linfocitosB es menor.La terapiacon
esteroidesno
altera ni la actividadde las célulasNK, ni la
ADCG. Anapsos,al igual que los
esteroideses capazde frenar, al menosinicialmente,
la produccióny/o liberaciónde
L-lP; peroa diferenciade los esteroides
y la ciclosporina,
es cap¿ude estimularla
producciónde rL-2 y la proliferaciónlinfocit¿ria,
o lo que es lo mismo, de ejercer
un efectoopuestoe independiente
sobredichacitocinay la IL- 1g. at contrarioque
los esteroidesy otrasdrogascon actividadsobre
el SistemaInmune(Ciclofosfamida,
Azatioprina,ciclosporina),Anapsosno actúa
disminuyendo,sino incremenfandoel
porcentajede linfocitos T (in vitro), tanto
de cD4+, como sobre todo de células
cD8+' Del mismomodopafeceactuarsobrecélulas
con potencialactividadADCC
(cD16+), incrementando
su porcentaje.[a ciclosporina,por el contrario,
parece
centrarsu acciónexclusivamente
sobrelos linfocitosT cD4*.
En resumen,el efectoestimulante
ejercidopor
Anapsos,,invivo,,e ,,invitro,,
sobre células dei SistemaInmune con expresión
de antrgenosde memb¡ana
característicos
de linfocitosT (especialmente
de la poblacióncDg+) y de células
Natural Kiiler, su efecto incrementadordel
índice supresor (296) y er efecto
pleiotrópicoejercidosobrediferentescitocinas,
confierenal productouna interesanb
capacidadinmunomoduladora.
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Volver al índice/Tornar a l'índex
Las diferenciasque a priori pa.recenexistir entre Anapsosy
otras drogas
inmunomoduladoras,
asícomola ausencia
de toxicidaddemostrada
del productoa las
dosis utilizadasen este estudio,abrenenormemente
el abanicode posibilidades
terapéuticas
del productoen ensayos
clínicos.
Concluímosque su buenatoleranciaclínica,la ausenciade efectos
adversos
demostradaen los diferentes ensayosclínicos y avalada por
la ausencia de
notificaciones
de los mismosal SistemaNacionalde Farmacovigilancia
durantelos
últimos 15años,y los hallazgos
descritosen estetrabajode investigación,
confieren
al producto un potencial interesantepara evaluar su
efecto en determinadas
enfermedades
autoinmunes
sistémicas,
o infecciosas,
especialmente
víricas,enlasque
existaun excesode producciónde citocinas.inflamatorias
o un disbalance
THI/TH2.
que puedaestarjugandoun papelimportanteen su patogenia,
y sobretodo teniendo
en cuentaqueel tratamiento
de dichaalteracióninmunecon determinados
ffumacos.
se traduceen muchoscasosen una mejoríaclínicade ra
enfermedad.
Por tanto,los resultados
del presenteestudio,constituyenunapuertaabierta
para futuras investigaciones
"in vitro" y a ser posible ,,in vivo,,, que permitan
establecerde un mododefinitivo el mecanismo
o mecanismos
de
sobreel sistemainmune.
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
accióndel producto
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
VI.. CONCLUSIONES
Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
VI. CONCLUSIONES
1.- Anapsosejerceun efectopleiotrópico"in vitro", ptra diferentes
citocinas.
2.- Anapsosejerceun efectoinhibitoriosobrelos monocitos,principalescélulas
secretoras
de IL-lp y TNF-c.
3-- El efecto inhibidor ejercidopor Anapsossobrecitocinasde la inflamación
como la IL-IF o el TNF-c, justifica su actividadcolagenopoyética
sobre
aquellostejidos afectadospor procesospatológicos,como el psoriasiso la
dermatitisatópica.
4.- Anapsosejerceun efectoestimuiante
sobrediversosclonesde linfocitosT.
principalmenteTHl o THO, incrementando
la producciónde las citocinasIL2, INF-y e IL-10.
5.- Anapsosejerceun efectoestimulante
sobrela proliferacióny activaciónde
linfocitosT CD4+.
6.- Anapsosejerceun efectoestimulantesobrela proliferacióny activaciónde las
poblaciones
celularescD8+ y cDl6+ (linfocitosT y célutasNK).
IT7
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
Volver al índice/Tornar a l'índex
7'- El efectodeestimulación
ejercidopor AnapsossobrecitocinasTH1-likecomo
el IL-2 o el INF-y, junto con su efecto estimulante
de la proliferación y
activaciónde linfocitos T y célulasNK, indica
una acciónpredominantedel
productosobrela inmunidadcelula¡.
8'- El incrementode IL-10 observadocon Anapsos,
resultainteresante
por su
efectocoestimulatorio
conotrascitocinas(IL-2), comopor suconocido
efecto
inhibitoriosobrelas citocinasinflamatorias.
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Tesis doctorales de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
INDICE DE FIGURAS
Figura L: Proliferaciónlinfocitariaencuenüas
por minuto,decélulasestimuladas
solo
con Anapsos.
Figura 2: Proliferaciónlinfocitariaencuentas
por minuto,decélulasestimuladas
con
PHA (0'5 pglml) masAnapsos.
Figura 3: Proliferaciónlinfocitariaen cuentaspor
minuto,de célulasestimuladas
con
PWM (4 ¡rg/ml) masAnapsos.
Figura 4: Secreción
de IL-l9 paralasdiferentes
condiciones
de estimulación(LpS,
LPS+PHA, LpS*Anapsos,I-bS+pHe *Anapsos).
Figura 5: secreción.de
TNF-c paralasdiferentes
condiciones
de estimulación
(Lps,
LPS+PHA, LpS*Anapsos,I-ÉS+pHe *Anapsos).
Figura 6: Secreciónde IL-2 paralas diferentes
condiciones
de estimulación(LpS,
LPS+PHA, LpS*Anapsos,LPS+PHA *Anapsos).
Figura 7: Secreciónde INF-y paralas diferentes
condicionesde estimulación(Lps,
LPS+PHA, LpS*Anapsos,t irS+pUn*Anapsos)
Figura 8: Secreciónde IL-10 paralasdiferentes
condiciones
de estimulación(Lps,
LPS+PHA, LpS*Anapsos,Lps+pHA*Anapsos).
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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Figura 9: Secreciónde IL-4 para las diferentescondicionesde estimulación(LpS,
LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos).
Figura L0: Porcentaje
de célulasexpresando
los antígenos
de membranaCD5, CD3,
CD4, CD8 o CD19,paralas diferentes
condiciones
de estimulación:
F0 (célulassin
estimulara tiempoinicial), LPS+PHA, LPS*Anapsos,LpS+pHA *Anapsos.
Figura 1l-: Porcentaje
de célulasCD4+ con expresiónsimult¿ínea
de CD25,CD38,
CD45RAo CD45RO,p?r&lasdiferentes
condiciones
deestimulación:
F0 (célulassin
estimulara tiempoinicial), LPs+PHA, Lps *Anapsos,LpS+pHA*Anapsos.
Figura 12: Porcentaje
de célulascD16+, cD8+cD25+, y expresión
de cDg con
alta (bright) o baja (dim) intensidadde fluorescencia,
paralas diferentescondiciones
de estimulación: F0 (células sin estimular a tiempo inicial), LpS+pHA,
LPS* Anapsos,LPS+PHA +Anapsos.
t46
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
INDICE DE TABLAS
Tabla I: Cinéticade producciónde IL-1P para las diferentescondicionesde
estimulación(LPS, LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos).
Tabla II: Cinética de producciónde TNF-c para las diferentescondicionesde
estimulación(LPS, LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos).
Tabla III: Cinética de producciónde IL-2 para las diferentescondicionesde
estimulación(LPS, LPS+ PHA, LPS* Anapsos,LPS+ PHA* Anapsos).
Tabla IV: Cinéticade producciónde IL-4 para las diferentescondicionesde
(LPS,LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos).
estimulación
Tabla V: Cinética de producciónde INF-y para las diferentescondicionesde
estimulación(LPS, LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos).
Tabla VI: Cinéticade producciónde IL-10 para las diferentescondicionesde
(LPS,LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos).
estimulación
Tabla VII: Correlacioneslinealesentre citocinas,que reviertencuando se añade
Anapsosal cultivo.
Tabla VIII: Porcentaje
decélulasexpresando
losantígenos
de membrana
CD5, CD3,
CD4, CD8 o CD19, paralasdiferentes
condiciones
de estimulación:F0 (célulassin
estimula¡a tiempoinicial), LPS+PHA, LPS*Anapsos,LPS+PHA*Anapsos.
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Efectos in vitro de anapsos(polypodium leucotomos) sobre fenotipo celular... Jose Miguel Sempere Ortells.
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Tabla IX: Porcentaje
de célulasCD4+ con expresiónsimultiínea
de CD25,CD38,
CD45RAo CD45RO,ptr? lasdiferentes
condiciones
deestimulación:
F0 (célulassin
estimulara tiempoinicial), LPS+PHA, LPS*Anapsos,Lps+pHA*Anapsos.
TablaX: Porcentaje
decélulasCD16+, CD8+CD25+, y expresión
deCD8 conalta
(bright) o baja (dim) intensidadde fluorescencia,para las diferentescondicionesde
estimulación:
F0 (célulassinestimulara tiempoinicial),LPS+pHA, LpS*Anapsos,
LPS+PHA *Anapsos.
t48
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