+ L E
Anuncio
SUSTANCIAS BIOACTIVAS CON PROPIEDADES ANTIBACTERIANAS Bacteriocinas producidas por Bacterias Gram negativas Dr. Gino Corsini Laboratorio de Bacteriología Molecular Centro de Investigaciones Biomédicas (CIB) Facultad de Medicina Universidad Diego Portales. BACTERIOCINAS Polipéptidos o proteínas de síntesis ribosomal que posee actividad antibacteriana. Las bacteriocinas son producidas por bacterias y ejerce su actividad sobre otras bacterias de la misma especie o especies relacionadas Gram positivas Masa molecular Termoestabilidad Sensibilidad enzimática Presencia de aminoácidos modificados postraduccionalmente Modo de acción Gram negativas Colicinas - colicinas formadoras de poro - nucleasas - colicina M Masa molecular mayor a 10.000 Da Microcinas - microcina C7 - microcina B17 - ColV - microcina J25 - microcina E492 - microcina H47 - microcina L - microcina M - microcina 24 Masa molecular memor a 10.000 Da BACTERIOCINAS DE GRAM POSITIVOS Clase I.- Lantibióticos. Son péptidos pequeños activos a nivel de membrana y que contienen algunos aminoácidos poco comunes como lantionina, b-metil-lantionina y dihidroalanina que se forman debido a modificaciones posteriores al proceso de la traducción. Un ejemplo bien conocido de estas bacteriocinas es la Nisina BACTERIOCINAS DE GRAM POSITIVOS Clase II.- No lantibióticos. Son bacteriocinas de peso molecular variable, que contienen aminoácidos regulares. En este grupo se pueden identificar tres subclases: - IIa - IIb - IIc BACTERIOCINAS DE GRAM POSITIVOS Clase III.Son péptidos grandes mayores de 30 kDa. En esta clase se encuentran las: - helveticinas J y V - acidofilicina A - lactacinas A y B. Bacteriocina Clase Microorganismo productor Nisina I Lactococcus lactis subsp lactis Pediocina PA-1 IIa Pediococcus acidilactici y Lactobacillus plantarum WHE92 Pediocina JD IIa Pediococcus acidilactici JD1-23 Sakacina A IIa Lactobacillus sake 706 Sakacina P IIa Lactobacillus sake LTH673 Curvacina A IIa Lactobacillus curvatus LTH1174 Mesentericina Y105 IIa Leuconostoc mesenteroides Plantaricina E/F IIb Lactobacillus plantarum C11 Lactococcina A IIb Lactococcus lactis subsp cremoris Lactococcina B IIb Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4 Lactacina F IIb Lactobacillus johnsonii Divergicina IIc Carnobacterium divergens LV13 Helveticina III Lactobacillus helveticus BACTERIOCINAS DE GRAM NEGATIVOS Colicinas - colicinas formadoras de poro - nucleasas - colicina M Microcinas - microcina C7 - microcina B17 - ColV - microcina J25 - microcina E492 - microcina H47 - microcina L - microcina M - microcina 24 Masa molecular mayor a 10.000 Da Masa molecular menor a 10.000 Da Colicinas Proteínas de tamaño molecular mayor a 10 kDa, producidas por algunas cepas de E. coli que presentan actividad sólo sobre especies relacionadas con la cepa productora. La producción de la bacteriocina resulta en un suicido para la bacteria. Colicina E1 Mecanismo de acción colicinas grupo E T Mecanismo de acción colicina A Piocinas Proteínas de tamaño molecular mayor a 10 kDa, producidas por cepas de Pseudomonas aeruginosa que presentan actividad sólo sobre otras especies de P. aeruginosa. La producción de la bacteriocina resulta en un suicido para la bacteria. Tipos de Piocinas: -Tipo R - Tipo F - Tipo S Presentan actividad bacteriostática o bactericida Son de bajo masa molecular (inferior a 10 kDa.) MICROCINAS Resistentes a condiciones extremas: pH y temperatura Resistentes a algunas proteasas Solubles en solventes Orgánicos como metanol. 69 284 272 386 241 247 187 mcbA mcbB mcbC mcbD mcbE mcbF mcbG MccB17 7 350 404 267 mccA mccB mccC mccD 521 334 MccC7 58 208 442 mcjA mcjB mcjC MccJ25 424 Col V Mcc24 1 kb mcjD 103 78 cvaB 171 93 90 mdbA mtfI mtfS mccF 580 698 cvaA mccE 414 mtfA cvaC cvi 707 mtfB Mecanismo Bacteriostático Nat Prod Rep. (2007) 24: 708-734 Mecanismo Bactericida Nat Prod Rep. (2007) 24: 708-734 Klebsiella pneumoniae E. coli Salmonella Citrobacter Enterobacter Erwinia Klebsiella Microcina E492 M 1 2 M kDa. 17 14,4 8,2 6,2 3,5 2,5 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de microcina E492 purificada, marcada covalentemente con fluorescamina (carriles 1 y 2). Aumento en el paso de corriente por incorporación de canales de microcina E492 en una bicapa fosfolipídica. La flecha a la izquierda indica corriente cero. K. pneumoniae Clonamiento Expresión E. coli Microcina E492 Los determinantes genéticos para la producción de microcina E492 están contenidos en en cromosoma bacteriano 13 kb mceF mceC mceB mceD mceA mceA: microcina E492 (103 aa) mceB: inmunidad (95 aa) mceC: homóloga a glicosil transferasa mceD: homóloga enteroquelina esterasa mceE: proteína 114 aa., sin homólogo mceE mceH mceG mceI mceJ mceF: proteína de membrana mceG: exportador tipo ABC mceH: proteína accesoria de secreción mceI : proteína 163 aa. (Aciltransferasa) mceJ: proteína 524 aa., sin homólogo Producción de microcina E492 activa durante las etapas de crecimiento bacteriano K. pneumoniae E. coli La microcina E492 activa se produce mayoritariamente en fase exponencial. MceA MceA MceA* X X OM Tol C Ton B ExbB Mce Mce A A Ton B Mce ExbB Ton B ExbB B Mce D Mce Pre-MceA ? E Fe2+ ? IM Mce C F Mce Mce H Mce G Pre-MceA mceA Mce I ? Mce J DETERMINACIÓN DE LAS UNIDADES TRANSCRIPCIONALES DETERMINACIÓN DE LOS SITIOS DE INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN mceA: microcina E492 mceB: inmunidad mceB mceA RL2 RL1 mceB A M 1 2 3 4 RL3 mceA B 1 2 3 4 M 5 6 7 8M Transcripción de los genes mceA y mceB. (A) RT-PCR empleando RNA total de E. coli VCS257pJEM15 (carriles 1 y 3) y E. coli VCS257pJAM434 (carriles 2 y 4). (B) RT-PCR empleando RNA total de K. pneumoniae. En todos los casos se empleó el partidor RL3 para realizar RT. Para la etapa de PCR se emplearon las parejas de partidores RL1-RL3 (carriles 1A, 2A, 5B, 6B, 7B y 8B) o RL1-RL2 (carriles 3A, 4A, 1B, 2B,3B y 4B). +1 -10 AATTAGAATTCCTTAATAATAAAATGAATCAATGCGCTT 5’3’ TA AT AT AT AT TA GC AT AT TA CG 3’5’ G A T C PEx Primer extension analysis of the mceBA transcription start site. RNA from E. coli VCS257pJAM434 and a primer which anneals only to the mceB gene (~100 bp downstream from the start site) were used for the RT reaction. Lanes G, A, T, and C correspond to the DNA sequencing reaction of pJAM434. Lane PEx corresponds to the primer extension reaction. Lagos, R. y cols. (2001) Mol. Microbiol. 42: 229-243. mceC mceF mceD mceE M 1 2 3 1 2 3 4 4 M 1500 1500 1000 1200 1000 500 mceD mceC M 1 2 3 4 M 1 1500 1500 1000 1000 500 500 mceE 2 3 mceF Transcripción de los genes mceC, mceD, mceE y mceF. En cada experimento se empleó cantidades crecientes de RNA total de E. coli VCS257pJAM434 extraído de fase exponencial (2 g carril 2, 4 g carril 3 y 8 g carril 4). El carril 1 corresponde a un control de contaminación con DNA, la muestra de RNA se trató con Dnasa I y se utilizó para realizar directamente un PCR. El carril M corresponde al estándar de tamaño molecular 100 bp DNA ladder. mceE +1 -35 -10 TAAGAATTGGTTACGTACTGATTATGTTAACTACTATTAATGGTAGTTAACTGAT 5´3´ T A A T A T T A G C G C T A A T G C T A T A 3´5´ G A T C PEx. Caracterización del sitio de inicio de la transcripción del gen mceE mediante extensión del partidor (“primer extension”). mceF +1 -35 -10 CCTGGTGGCGGCAGATGACGGGTAAGAACAACGTTGCTGGCTTTGATCTGACCGC 5´3´ G C C G T A T A T A G C A T T A C G T A G C A T C G C G 3´5´ G A T C PEx. Caracterización del sitio de inicio de la transcripción del gen mceF mediante extensión del partidor (“primer extension”). mceC +1 -10 -35 CGTTGTTTCCAGAGTGATGTGTTTTTCTGATGAGTGGATTAAGTTCCTAAAACG mceD +1 -10 GGTACGCCAACCAGCGGTATGTAAACGGGAAGTGAATCCTCTTTCATAGCTAA -35 Caracterización del sitio de inicio de la transcripción de los genes mceC y mceD. mceH mceG mceI mceJ J I H mceI mceJ G mceG mceH IJ GH HI Estac. A Log. M G H G H B RT-PCR PCR M GH IJ HI GH IJ HI M I J M I J Estudio de la expresión (A) y acoplamiento (B) transcripcional de los genes mceGHJJ mediante RT-PCR. mceJ mceG mceH mceI HI (-) M9 + G M9+G+C E E L L (+) M Estudio del acoplamiento transcripcional de los genes mceHI en fase exponencial y estacionaria de crecimiento, mediante RT-PCR. Se empleó como templado RNA total de E. coli VCS257pJAM434 aislado a partir de un cultivo en fase estacionaria (E) y fase exponencial (L) de medio mínimo suplementado con glucosa (M9 + G) y medio mínimo suplementado con glucosa y citrato (M9 +G +C). M corresponde a 100 bp DNA ladder. (+) y (-) corresponden a controles. mceJ +1 -10 -35 CCGTATAGGATCCCTTGTTTTTATTGGTGTTGGGTTACACAACTGATTTGGG mceH -35 +1 -10 GCGAAATGTACCCCGGTATCATTTTGATGGAACGCTGCATTTTCGGAGTTT Caracterización del sitio de inicio de la transcripción de los genes mceJ y mceH. Organización transcripcional de los genes implicados en la síntesis e inmunidad de la microcina E492. P P mceC mceB mceF mceD mceE mceA P P mceBA mceH mceG P P mceGHIJ P mceGH Lagos, R. y cols. (2001) Mol. Microbiol. 42: 229-243. mceI mceJ EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES DEL SISTEMA MICROCINA E492 A B M bp 1000 L E - + L E bp 780 500 530 Transcripción de los genes mceAB en fase exponencial (L) y estacionaria (E) de crecimiento. Los experimentos de RT-PCR se realizaron empleando RNA total de E. coli VCS257pJAM434. El producto de amplificación de 850 bp que aparece en todos los carriles, corresponde al mensajero de -lactamasa empleado como control interno. Los carriles (-) corresponden a control de tratamiento con DNasa I. Los carriles (+) corresponden a control positivo usando DNA de pJAM434. Corsini y cols. (2002) Biochimie 84: 539-544 Electrophoresis of inactive microcin E492 purified from cells grown to stationary phase 1 2 3 Samples of microcin E492 purified from E. coli VCS257pJAM434 in stationary phase of growth (lanes 1, 2) were covalently labeled with fluorescamine and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of these samples was performed. The media of cells in stationary phase were replaced by fresh medium and before purification the cell were incubated during 6 (lane 1) or 14 (lane 2) hours. Lane 3, active microcin purified from cells in exponential phase of growth. The arrow indicates the protein band corresponding to microcin. Corsini y cols. (2002) Biochimie 84: 539-544 Producción de microcina E492 activa durante las etapas de crecimiento bacteriano ? 13 kb mceF mceC mceB mceD mceA mceA: microcina E492 mceB: inmunidad mceC: homóloga a glicosil transferasa mceD: homóloga enteroquelina esterasa mceE: proteína 114 aa., sin homólogo mceE mceH mceG mceI mceJ mceF: proteína de membrana mceG: exportador tipo ABC mceH: proteína accesoria de secreción mceI : proteína 163 aa. (Aciltransferasa) mceJ: proteína 524 aa., sin homólogo M L E - + L E - + M 1000 500 mceC mceIJ Transcripción de los genes mceC, mceI y mceJ en fase exponencial (L) y estacionaria (E) de crecimiento. Los experimentos de RT-PCR se realizaron empleando RNA total de E. coli VCS257pJAM434. El producto de amplificación de 850 bp que aparece en todos los carriles, corresponde al mensajero de -lactamasa empleado como control interno. Los carriles (-) corresponden a control de tratamiento con DNasa I. Los carriles (+) corresponden a control positivo usando DNA de pJAM434. Corsini y cols. (2002) Biochimie 84: 539-544 • La organización genética del sistema productor de microcina E492 en el plasmidio pJAM434 esta formada por 10 genes agrupados en 7 unidades transcripcionales: mceBA, mceC, mceD, mceE, mceF, mceHG y mceJIHG • La microcina E492 organizada en un operón bicistrónico junto con la proteína de inmunidad, se sintetiza tanto en fase exponencial como estacionaria de crecimiento. • Durante fase estacionaria se sintetiza microcina E492 inactiva debido a la ausencia de la transcripción de los genes mceI y mceJ. EXPRESIÓN TRADUCCIONAL DE LOS GENES DEL SISTEMA MICROCINA E492 MudII1681 lac C A H 1 Mu Tn5 lac KmR B G H 5,9 5,6 A Y G B 7,5 7,4 Z’ B 14,2 H: HindIII B: BamHI G: BglI Localización de Fusiones Traduccionales en pJAM434 Genes Fusiones mceA mceB pMuME132 mceC pMUG21 mceG pMUG13 pMuME12 pMUG14 • Análisis con Enzimas de Restricción • PCR pMUG24 pMUG41 mceH pMUG12 pMUG131 mceI pMUG43 mceJ pMUG33 300 1 200 150 0,1 100 Actividad -galactosidasa (Unidades Miller) OD600 nm 250 50 0,01 0 0 100 200 300 400 500 600 tiempo (min) Expresión traduccional de la proteína MceA-LacZ y de la proteína MceB-LacZ. Las curvas de color azul corresponden a la cinética de crecimiento bacteriana (DO 600 nm) de E. coli pop3001.6pMuME132 ( ) y de E. coli pop3001.6pMuME12 (). Las curvas de color rojo corresponden a la actividad -galactosidasa que presentan las fusiones MceA-LacZ ( ) y MceB-LacZ () expresada en unidades Miller. 500 DO 600 nm 400 300 0,1 200 100 0,01 (Unidades Miller) 1 Actividad -galactosidasa 600 MceC-LacZ 0 0 100 200 300 400 500 600 tiempo (min) 40 30 0,1 20 10 0,01 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 (Unidades Miller) DO 600 nm 50 Actividad -galactosidasa 60 1 MceI-LacZ 0 1800 tiempo (min) Expresión traduccional de la proteínas MceC-LacZ y MceI-LacZ. • Existe una diferencia en los niveles de expresión traduccional de los productos génicos de mceA y mceB, pese a que provienen de un mismo mRNA • La fusión MceC-LacZ presentó una expresión baja al comienzo de la fase exponencial, luego aumentó y al llegar a fase estacionaria disminuyó levemente. • MceI-LacZ se expresó muy pobremente al comienzo de la fase exponencial, pero su expresión aumentó durante la fase exponencial y al llegar a fase estacionaria cayó drásticamente. Mcc24 Microcina 24, antecedentes Producida por un aislado uropatogénico de E. coli (cepa 2424). Los determinantes génicos estaban codificados en un plasmidio de 43.54 Kb, p24-2. La región mínima para la producción de microcina 24 está contenida en un fragmento de DNA de 5,25 kb el cual se clonó en el vector pBR322, generando el plasmidio pGOB18 Plasmid. (1994) 31: 288-296 Microcina 24, antecedentes El sistema de la microcina 24 posee 5 ORFs mdbA, mtfI, mtfS, mtfA y mtfB. (GenBank U47048) Acceso GenBank: U47048 Microcina 24, antecedentes La microcina 24 es sintetizada como un pre péptido… MYMRELDREELNCVGGAGDPLADPNSQIVRQIMSNAAWGPPLVPERFR GMAVGAAGGVTQTVLQGAAAHMPVNVPIPKVPMGPSWNGSKG AGDPLADPNSQIVRQIMSNAAWGPPLVPERFRGMAVGAAGGVTQTVLQGAA AHMPVNVPIPKVPMGPSWNGSKG Microcina 24, antecedentes Mutantes en el tonB son resistentes a la microcina 24 Microbiol. (2003) 149: 2557-2570. Requiere de un receptor de membrana externa J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3253-3259. Se desconoce el receptor para la microcina 24 Microbiol. (2003) 149: 2557-2570. Mutantes en los receptores Fep, Fiu, Cir son sensibles a la acción de la microcina 24 Microbiol. (2003) 149: 2557-2570. Microcina 24, antecedentes Se postula como una microcina formadora de poros (BACTERICIDA) Nat Prod Rep. (2007) 24: 708-734 Similitud 51,0 %, identidad 43,3 % No hay evidencia experimental que avale dicho mecanismo. En función a los antecedentes expuestos Hipótesis La microcina 24 se expresa en fase exponencial de crecimiento bacteriano y su mecanismo de acción es dependiente del sistema de adquisición del ferricromo hidroxamato (FhuA), que depende a su vez de la proteína TonB y actuaría en la célula blanco mediante la permeabilización de la membrana citoplasmática, generando la muerte celular. Caracterizar la expresión del péptido antimicrobiano microcina 24 www.designfreebies.org 1. PURIFICAR LA GICINA A Cada 1 hora 1/2 E. coli MC1061pGOB18 Mcc 24 1/4 1/8 1/16 1/32 10 μL Cada 1 hora Densidad óptica Unidad Arbitraria (UA) Company Logo Densidad óptica Actividad Producción de Microcina 24 durante el crecimiento de E. coli MC1061pGOB18 Expresión a nivel transcripcional de la microcina 24 Expresión transcripcional de los genes mtfI y mtfS mediante RT-PCR Purificar y caracterizar el péptido antimicrobiano microcina 24 14000 x g 10 min E. coli MC1061pGOB18 Mcc 24 OD600 = 0,7 1 mL 37 C 12 horas Carril 1: Estandar de tamaño Carril 2: Fracción 70 % Carril 3: Fracción 80 % Carril 4: Fracción 95 % Purificación de la microcina 24 mediante cromatografía en columna hidrofóbica Sep-Pak C18 Purificación mediante HPLC Espectrometría de masa de la microcina 24 Masa teórica: 7527,36 Da (GenBank U47048) Espectrometría de masa MALDI-TOF de la microcina 24 253 Da inferior Secuenciación del sistema microcina 24 141 93 414 707 89 GenBank FJ895580 Se desconoce mecanismo de acción de la microcina N (Ex Mcc 24) ¿La microcina N es capaz de permeabilizar la membrana interna? Fenotipo lacZ + ONPG Orto-Nitrofenil-β-galactósido Periplasma Permeasa LacY Citoplasma LacZ MI E. coli HB101 Fenotipo lacZ - Fenotipo lacZ + Periplasma Mcc 24 Citoplasma LacZ Ensayos de permeabilidad de células de E. coli HB101 con microcina N Ensayo de viabilidad celular in vivo Control Mcc N Microscopía de fluorescencia de E. coli tratada con microcina N LIVE/DEAD BactLight …si la microcina N es capaz de generar un daño en la membrana interna, permeabilizándola… ¿Este daño puede generar muerte en la bacteria? ¿La bacteria es capaz de regenerar la integridad de su membrana? Ensayo de viabilidad celular ** Bacterias tratadas con MccN * Bacterias sin tratamiento * p < 0,05 ** p < 0,01 Recuento del número de células viables Determinar el o los componentes involucrados en el mecanismo de acción de la microcina N en la célula blanco Los receptores que utilizan las microcinas pertenecen al sistema de transporte del hierro (FepA, Fiu, Cir, FhuA) La microcina N no utiliza los receptores FepA, Fiu y Cir. ¿Utiliza FhuA? Ensayos de actividad antimicrobiana con cepa productora de microcina N 37 C DO600 = 0,6 E. coli E. coli MC1061pGOB18 37 C por 12 Hr E. coli DH5α E. coli JM110 E. coli P8 (AB2847) E. coli C600 Sensibilidad de cepas de E. coli mutantes en fhuA FhuA pertenece a un operón de genes… Estructura del operón fhu E. coli BW25113 E. coli S100 Sensibilidad de E. coli S100 (mutante en los genes fhuCDB) Sensibilidad de las mutantes del sistema fhu a la microcina N Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2: 2006.0008. Sensibilidad de las mutantes del sistema fhu a la microcina N complementadas con sus respectivos genes Mecanismo de acción de la microcina N sobre su célula bacteriana blanco
