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© Segunda Edición
Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María
Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443
Lima, Perú, 1997
Diseño e impresión : Art. Lautrec S.R.Ltda.
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TECNICOS
PARA EL DIAGNOSTICO
SEROLOGICO DE SIFILIS
COMITÉ RESPONSABLE:
Blgo. Martha Glenny Araujo
Dr. Carlos Carrillo Parodi
COMITÉ EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas
Dr. César Cabezas Sánchez
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Dr. Jaime Chang Neyra
MINISTERIO DE SALUD
ALTA DIRECCIÓN
Dr. Marino Costa Bauer
Ministro
Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco
Viceministro
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Jefe
CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
Dr. César Cabezas Sánchez
Director General
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PERFIL DE AUTORES
Blgo. Martha Glenny Araujo
Bióloga
Jefe del Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de
Salud Pública, INS, MINSA.
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Médico Cirujano, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peuana Cayetano Heredia.
PERFIL DE LOS EDITORES
Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas
Médico Cirujano, Doctor en Farmacología
Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA
Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía,
Universidad Peruana Cayetano Heredia
Miembro, Instituto de Medicina Tropical “Alexander Von Humbolt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Dr. César Cabezas Sánchez
Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales
Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, MINSA.
Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Médico Cirujano, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Jefe, Instituto Nacional de Salud
Dr. Jaime Chang Neyra
Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries
Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA
Investigador, Instituto de Medicina Tropical “Alexander Von Humbolt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Agradecimientos:
El Comité Editor agradece a los señores Doctores, Humberto Guerra Allison, Agusto Yi Chu, por su colaboración en la revisión y las
correcciones efectuadas al manuscrito de la primera edición de esta obra.
La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la
Universidad Peruana Cayetano Heredia.
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INDICE
Presentación........................................................................................................................ ........................ 8
Resolución Jefatural................................................................................................................................... 9
CAPITULO I
Introducción................................................................................................................................................ 11
CAPITULO II
Obtención de la muestra de sangre .......................................................................................................... 13
CAPITULO III
Transporte de muestras a otro laboratorio ............................................................................................. 19
CAPITULO IV
Prueba del Laboratorio de Investigaciones en Enfermedades
Venéreas (Veneral Disease Research Laboratory, VDRL) .................................................................... 16
4.1 Antígeno ................................................................................................................................................ 16
4.2 Muestra a usar para la Prueba de VDRL ............................................................................................... 16
4.3 Prueba de VDRL en Suero .................................................................................................................... 16
4.3.1 Prueba de VDRL Cualitativa......................................................................................................... 16
4.3.2 Prueba de VDRL Cuantitativa ...................................................................................................... 18
4.4 Prueba de VDRL en Líquido Céfalo Raquídeo (LCR) .......................................................................... 19
4.4.1 Preparación de Suspensión Antigénica Sensibilizada................................................................... 19
4.4.2 Procedimiento................................................................................................................................ 19
4.5 Interpretación de resultados de la prueba de VDRL .............................................................................. 19
4.6 Limitaciones de la prueba VDRL .......................................................................................................... 19
CAPITULO V
Prueba de Reagina Plasmática Rápida (RPR)
18 mm. en Tarjeta ..................................................................................................................................... 20
5.1 Muestra a usar para la Prueba de RPR................................................................................................... 20
5.2 Muestra RPR Cualitativa ....................................................................................................................... 20
5.3 Muestra RPR Cuantitativa ..................................................................................................................... 20
5.4 Interpretación de resultados de la prueba RPR ...................................................................................... 27
5.5 Limitaciones de la Prueba RPR ............................................................................................................. 27
CAPITULO VI
Microhemaglutinación para Treponema pallidum (MHA-TP) ............................................................. 28
6.1 Prueba cualitativa: Metodología ............................................................................................................ 28
6.2 Interpretación de resultados ................................................................................................................... 30
6.3 Limitaciones de la prueba...................................................................................................................... 30
CAPITULO VII
Anticuerpos de Treponema Fluorescentes Absorbidos
(FTA-Abs) .................................................................................................................................................. 31
7.1 Reactivos principales ............................................................................................................................. 31
7.1.1 Antígeno ....................................................................................................................................... 31
7.1.2 Absorbente.................................................................................................................................... 31
7.1.3 Suero Control Reactivo................................................................................................................. 31
7.1.4 Suero Control no Reactivo............................................................................................................ 31
7.1.5 Suero Control no Específico ......................................................................................................... 31
7.1.6 Conjugado..................................................................................................................................... 31
7.2 Procedimiento........................................................................................................................................ 31
7.3 Interpretación de Resultados.................................................................................................................. 32
7.4 Factores de Error ................................................................................................................................... 32
7.5 Limitaciones de la Prueba...................................................................................................................... 32
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CAPITULO VIII
Flujograma de muestras para investigar sífilis ....................................................................................... 33
CAPITULO IX
Bioseguridad .............................................................................................................................................. 34
CAPITULO X
Referencias Bibliográficas......................................................................................................................... 35
CAPITULO XI (Anexos)
Anexo 1:
Material necesario para la obtención de muestras de sangre ....................................................................... 37
Anexo 2:
Requerimientos de material y equipo para la Prueba de VDRL .................................................................. 38
Anexo 3:
Requerimientos de material y equipo para la Prueba RPR .......................................................................... 41
Anexo 4:
Requerimientos de material y equipo para la Prueba MHA-TP .................................................................. 42
Anexo 5:
Requerimientos de material y equipo para la Prueba FTA-Abs .................................................................. 43
Anexo 6:
Registro de muestras para investigación serológica de sífilis (Separata)
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PRESENTACIÓN
La sífilis, es una de las enfermedades clásicas transmitidas sexualmente, de distribución amplia en el mundo,
muy severa, totalmente prevenible y que es resultante de la infección de persona a persona por el Treponema
pallidum, bacteria gram negativa, fina y móvil, del género Treponema (orden Spirochaetales, familia
Spirochaetaceae).
En base a datos epidemiológicos como localización geográfica, manifestaciones clínicas y modo de transmisión,
se diferenciaban cuatro especies patógenas para el hombre, cuyas enfermedades en su conjunto se denominan
Treponematosis. De acuerdo a estudios de homología de DNA, ellas, han sido unificadas en una especie y tres
sub especies: Treponema pallidum, sub especie pallidum (sífilis), Treponema pallidum sub especie pertenue
(yaws), Treponema pallidum sub especie endémicus (sífilis endémica). La especie Treponema carateum (pinta)
retiene su denominación.
Igualmente, puede diseminarse de madre a feto (vertical) originando la sífilis congénita. La sífilis se caracteriza
por 3 estadíos con diferentes y dramáticas presentaciones clínicas, las dos primeras (primaria y secundaria), se
manifiestan como aguda y sub aguda, mientras que la sífilis terciaria es crónica. En la fase primaria, existe una
lesión (Chancro) en el lugar de la inoculación, que puede ser notada cuando aparece en órganos genitales, boca o
ano.
Por ello, una vez producida la enfermedad, su diagnóstico requiere de la destreza y tecnología adecuadas que
garanticen eliminar los riesgos que significan las complicaciones en sus formas tardía o crónica (secundaria,
terciaria) así como de la sífilis congénita, (retardo de desarrollo intrauterino, anormalidades óseas, e incapacidad
de supervivencia). Organizaciones como la NCDC (Atlanta, Georgia), recomiendan realizar el tamizaje de
mujeres en alto riesgo de sífilis en forma periódica, antes o durante el embarazo (primer y tercer trimestre). El
mejoramiento de la metodología de diagnóstico y procedimientos de confirmación, haciendo posible su acceso a
los laboratorios de la Red Nacional de Laboratorios, permitirá el reporte y el seguimiento adecuado en beneficio
de la población y a la vez permitirá corregir la subestimación en el número de casos. El trabajo de supervisión
que el INS a través de los laboratorios del Centro Nacional de Laboratorios de Salud realiza, permite contar con
la información procesal y control de calidad de metodología que en el futuro permitirá la validación de los
laboratorios afiliados.
Por ello el Manual ha sido diseñado en tres partes principales:
- La Toma y envío de muestras (Capítulos II y III).
- La Metodología (fundamentos, procedimientos operativos y bibliografía) de los métodos de diagnóstico
(Capítulos IV al X).
- Los Materiales y reactivos (Capítulo XI: Anexos 1 al 5), y las fichas de solicitud de investigación serológica
y su correspondiente registro en el laboratorio (Anexos 6 y 7).
Este documento técnico normativo contribuirá a la estandarización, afianzamiento, y excelencia de los
procedimientos de laboratorio importantes en el control de las enfermedades transmisibles en el país.
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Jefe
Instituto Nacional de Salud
8
9
CAPITULO I
INTRODUCCION
La sífilis, es una infección de transmisión sexual causada por una bacteria esperilar, el Treponema pallidum sub
especie pallidum (Foto 1), cuya diseminación es entre una lesión infectante de una persona enferma y la mucosa
o solución de continuidad de la piel de una persona no infectada.
Las manifestaciones clínicas son variadas, por lo que de acuerdo a los estadíos de la enfermendad es importante
elegir la prueba de laboratorio adecuada para su confirmación diagnóstica y seguimiento de su evolución. Así,
en la sífilis primaria se puede observar el Chancro duro (genital, oral, rectal, Foto 2), cuya secreción serosa
contiene gran cantidad de treponemas, los cuales, pueden visualizarse en un microscopio de campo oscuro. En
la sífilis secundaria se observan lesiones en la piel (roseola) y las pruebas treponémicas y no treponémicas son
reactivas. Luego de un período de latencia variado se presenta la sífilis terciaria, en la que hay compromiso
cardiovascular y/o del sistema nervioso; en este caso, las pruebas treponémicas son reactivas y en algunos casos
el único sustento diagnóstico. Otra forma clínica es la sífilis congénita.
Este manual tiene por objetivo uniformizar los criterios para los procedimientos, informe e interpretación de las
pruebas de laboratorio orientadas al diagnóstico de sífilis. Se incluyen los procedimientos para las pruebas No
treponémicas (VDRL, RPR) y pruebas Treponémicas (MHA-TP, FTA-Abs), estandarizados en el Laboratorio
de Sífilis del Instituto Nacional de Salud, el cual, es integrante del Programa de Control de Calidad para pruebas
de diagnóstico de Sífilis, organizado y supervisado a nivel mundial por el CDC/NCID (Centro de Control de
Enfermedades del Centro Nacional de Enfermedades Infecciosas de los EE.UU.).
Estas pruebas constituyen un invalorable apoyo para complementar el diagnóstico clínico y son la base para el
descarte de infección en muestras séricas y en pruebas de tamizaje. Siendo importante la confiabilidad de las
pruebas, este manual permitirá al personal de laboratorio contar con una guía que garantice la reproductibilidad
de las pruebas que se realizan en los diferentes laboratorios del país.
10
11
CAPITULO II
OBTENCION DE LA MUESTRA DE SANGRE
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitará para ejecutar la obtención de la
muestra, indicado en el Anexo 1.
Llenar la ficha del paciente con los datos que se solicitan.
Lavarse las manos antes de obtener la muestra y colocarse los guantes.
Si el paciente se encuentra en el laboratorio, haga que se siente de manera que el brazo quede colocado,
paralelamente, a la mesa de trabajo donde se hará la extracción de sangre. Ponga el brazo del paciente
sobre la mesa de trabajo apoyándolo en un pequeño cojín bajo el codo, con la palma de la mano vuelta
hacia arriba.
2.5.
2.6.
Si el paciente se encuentra en cama extienda el brazo del paciente en una posición descansada.
El sitio más adecuado para la extracción de sangre es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del
codo, en el punto donde es más gruesa y visible.
2.7.
Colocar la aguja en la jeringa, ajustándola herméticamente tocando sólo la base de la aguja. Asegúrese
que la aguja y la jeringa no estén obstruídos.
Para aplicar la ligadura, con la mano derecha, coloque la ligadura alrededor del brazo y sujete
firmemente los extremos.
2.8.
12
2.9.
Con la mano izquierda, tire de un extremo de la ligadura cruzándolo y a continuación introduzca este
extremo por debajo de la parte principal de la ligadura. Esta se deberá ajustar sólo lo suficiente para
aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por
las arterias.
2.10.
2.11.
2.12.
Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas.
Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en que introducirá la aguja.
Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en
alcohol yodado.
Tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo índice sobre la base de la aguja.
Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba; introduzca la aguja en el centro de la vena, sin
titubeos, de 1-1.5 cm aproximadamente.
2.13.
2.14.
13
Nota: “Nunca intente punzar una vena por un lado”. “Nunca introduzca la aguja con el bisel hacia
abajo”.
2.15.
2.16.
2.17.
2.18.
2.19.
2.20.
2.21.
2.22.
Con la mano izquierda tire hacia atrás el émbolo de la jeringa. muy lentamente. Deberá entrar la sangre
en la jeringa. hasta completar 5 cc.; si no entrara la sangre, inténtelo nuevamente.
Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.
Aplicar un pedazo de algodón seco sobre la zona por donde se punzó la piel. Saque la aguja con un
movimiento rápido.
Pedir al paciente que presione, firmemente, el algodón durante 3 minutos, con el brazo extendido.
Luego de extraída la sangre por punción venosa, retire la aguja de la jeringa y colóquela en un depósito
de metal (para autoclavar); vierta, lentamente, la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y
tápelo. Deje reposar el tubo con la sangre en posición vertical, en una gradilla, por un lapso de 30
minutos a 2 horas, centrifugue la sangre de 2,000 - 2500 r.p.m. durante 5 minutos. Si no dispone de
centrífuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el suero se separará del coágulo.
Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta de Pasteur.
Depositar el suero en un tubo limpio y seco, así estará listo para ser inactivado.
Si se remitiese la muestra a otro laboratorio, coloque el suero en viales de plástico con taparrosca o en
frascos de Weathon o tipo penicilina estéril de 5 ml de capacidad, colocando inmediatamente la tapa y
sellando con parafilm o cera.
Codificar el frasco de inmediato.
14
CAPITULO III
TRANSPORTE DE MUESTRAS A
OTRO LABORATORIO
El envío de muestras a otro laboratorio se realiza cuando las muestras de suero no pueden ser procesadas
en el mismo laboratorio o cuando se desea una confirmación del diagnóstico mediante prueba treponémica.
3.1. Rotular el vial o frasco con el nombre o código que identifique al paciente y fecha de obtención.
3.2. Envolver el frasco con papel absorbente o gasa.
3.3. Colocar el vial (es) o el (los) frasco (s) dentro de una caja de plástico y asegúrelos con cojincillos de
algodón, y hielo (de ser posible hielo seco).
3.4. Poner el envase y la ficha en una caja de espuma plástica (tecnopor).
3.5. Rotular la caja con la dirección y nombre a donde la dirige y señale que es Producto Biológico.
3.6. Enviar la muestra lo más pronto posible.
15
CAPITULO IV
PRUEBA DEL LABORATORIO DE
INVESTIGACIONES EN ENFERMEDADES VENEREAS
(Venereal Disease Research Laboratory, VDRL)
La prueba de VDRL, es una prueba de microfloculación en lámina, utiliza un antígeno que contiene
cardiolipina, lecitina, y colesterol. (Foto 3).
La suspensión de antígeno forma grumos cuando se enfrenta con anticuerpos antilipídicos presentes en el
Suero o Líquido Cefaloraquídeo (LCR) de pacientes con Sífilis o algunas otras enfermedades de tipo crónico.
4.1 ANTIGENO
El antígeno para esta prueba es una solución alcohólica que contiene cardiolipina al 0.03%, colesterol al
0.9% y suficiente lecitina purificada para producir una reactividad estandar, generalmente es 0.21%, este
antígeno debe permanecer a una temperatura entre 23 a 29°C antes de su preparación.
Nota:
- Cada lote de antígeno debe ser estandarizado serológicamente por comparación adecuada con un
antígeno de reactividad conocida.
- Los componentes de este antígeno permanecen en solución a temperaturas normales, de modo, que
cualquier precipitado que se observe indicará que hay alteraciones debidas a factores tales como
evaporación o introducción de materiales aditivos con las pipetas. Debe desecharse los antígenos que
contengan precipitados.
4.2 MUESTRA A USAR PARA LA PRUEBA DE VDRL
La prueba de VDRL se puede realizar empleando:
a. Suero
b. Líquido Céfalo Raquídeo (LCR)
El operador debe tener las siguientes precauciones:
- Examine que las muestras a procesar no estén turbias o hemolizadas.
- El suero debe ser inactivado por calentamiento en baño María a 56°C por 30 minutos.
- El LCR debe centrifugarse antes de procesar, pero no debe ser calentado.
- Las muestras deben estar a temperatura ambiente antes de ser evaluadas (23 a 29°C).
4.3 PRUEBA DE VDRL EN SUERO
4.3.1. Prueba de VDRL Cualitativa
a.
Con una micropipeta colocar 50 ul del suero control reactivo al primer anillo de la lámina serológica y
50 ul del suero control no reactivo al segundo anillo; a partir del tercer anillo, colocar 50 ul de los
sueros problemas en cada uno de los anillos de la lámina serológica.
16
b.
Añadir con una micropipeta 17 ul de solución antigénica (ver preparación en Anexo 2) sobre cada
muestra. De no contar con micropipeta, utilice una jeringa de 2 cc. con aguja calibre 18 (sin bisel) y
sosteniéndola en posición vertical deje caer una gota de solución antigénica sobre cada muestra.
c.
Colocar la lámina con las muestras en un rotador a 180 r.p.m. por 4 min. Se recomienda que el área de
trabajo mantenga una temperatura ambiental entre 23 a 29°C; y si se trabaja en una zona calurosa es
conveniente cubrir las muestras con una cámara húmeda.
d.
Terminada la rotación, examinar las láminas inmediatamente usando un microscopio con ocular de
10X y objetivo de 10X.
e.
Los resultados se informarán de la siguiente manera:
17
4.3.2 Prueba VDRL Cuantitativa
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
Colocar 50 ul de solución salina al 0.9% del 20 al 40 círculo de la lámina serológica.
Añadir 50 ul. de suero en el 1º y 2º círculo.
Mezclar la solución salina y el suero en el 2º círculo y transfiera 50 ul al 3º círculo. Haga lo mismo
hasta e14° círculo y descarte los últimos 50 ul.
Repetir los pasos b, c y d de la prueba cualitativa.
La lectura sigue los mismos parámetros que para la prueba cualitativa.
Reportar el título en términos de la más alta dilución en que se produzca un resultado reactivo.
Si se obtiene resultado reactivo por sobre el título 1/8 proseguir con:
g.1. Prepare una dilución 1/8, colocando en un tubo 0.7 ml de solución salina al 0.9% y
agregue 0.1 ml del suero problema.
g.2. Colocar 50 ul de solución salina 0.9% en los círculos 2,3, y 4 de la lámina serológica.
g.3. Añadir 50 ul de la dilución 1/8 en los círculos 1 y 2.
g.4. Seguir el procedimiento repitiendo los pasos c al f.
Informar los resultados según el siguiente esquema:
18
4.4 PRUEBA CUALITATIVA VDRL EN LIQUIDO CEFALO RAQUIDEO (LCR)
4.4.1 Preparación de Suspensión Antigénica Sensibilizada
a.
b.
En un tubo de vidrio mezclar una parte de solución salina al 10% con una parte de suspensión
antigénica preparada para la prueba con suero.
Mezclar fuertemente y dejar reposar por 5 minutos. Así estará lista para ser utilizada.
4.4.2 Procedimiento
a.
b.
c.
d.
e.
Colocar 50 ul de LCR problema en una lámina serológica.
Añadir 10 ul con micropipeta, o de lo contrario una gota de suspensión de antígeno sensibilizado
utilizando jeringa de vidrio con aguja sin bisel calibre 21.
Colocar la lámina en el rotador por 8 minutos a 180 r.p.m.
Terminada la rotación observar al microscopio (ocular 10X y objetivo 10X).
Informar los resultados de la siguiente manera:
4.5 INTERPRETACION DE RESULTADOS DE LA PRUEBA VDRL
a.
b.
c.
d.
Un VDRL Reactivo puede indicar infección presente o pasada con Treponemas Patógenos, sin
embargo, esto también puede ser una reacción falso positiva. Un falso positivo se detecta con una
prueba treponémica, la cual, es No Reactivo.
Un VDRL No Reactivo sin evidencia clínica de sífilis, puede indicar que no hay infección por
Treponemas o que el tratamiento fue efectivo. Un VDRL No Reactivo, con evidencia clínica, puede
observarse en sífilis primaria o en sífilis secundaria, presentándose en este último, como fenómeno de
prozona.
La caída de 4 veces el título en VDRL indica una evidencia de tratamiento efectivo.
El valor predictivo del diagnóstico serológico de sífilis se incrementa cuando se combina el resultado
de una prueba de VDRL con una prueba treponémica.
4.6 LIMITACIONES DE LA PRUEBA VDRL
a.
b.
Puede producirse un fenómeno de prozona, en el cual la reactividad de un suero no diluido se ve
inhibida. Este fenómeno puede sospecharse cuando se produce una reacción débilmente reactiva, o se
aprecian grumos bastante grandes mezclados con partículas sueltas de antígeno en la prueba
cualitativa, por lo que todo suero que presente algún tipo de reacción debe ser sometido a una prueba
cuantitativa.
Puede producirse falsos positivos en muestras de personas o pacientes que usan narcóticos, padecen
de Lupus eritematoso, Mononucleosis, Malaria, Lepra, Neumonía viral, o que recientemente hayan
sido inmunizados.
19
CAPITULO V
PRUEBA DE REAGINA PLASMATICA RAPIDA (RPR)
18 mm EN TARJETA
La prueba de RPR, es una prueba serológica no treponémica de floculación macroscópica. Utiliza un
antígeno que es una modificación del antígeno de VDRL, que contiene partículas de carbón para ayudar a
visualizar de modo macroscópico la reacción, cloruro de colina para no inactivar los sueros y ácidos
etildiaminotetraacético (EDTA) para hacer más estable la suspensión. (Foto 4).
5.1 MUESTRA A USAR PARA LA PRUEBA DE RPR
Para realizar la prueba de RPR pueden usarse dos tipos de muestras:
a. Suero
b. Plasma, que debe ser procesado dentro de las 24 horas de su colección.
El operador debe tener precauciones con las muestras:
-
No deben presentar turbidez (contaminado).
No deben estar hemolizadas.
Deben estar a temperatura entre 23-29°C.
5.2 PRUEBA RPR CUALITATIVA
a.
b.
c.
d.
Colocar la aguja sin bisel en el frasco de plástico.
Colocar parte del antígeno (dependiendo del número de muestras a procesar), en el frasco de plástico y
verificar que la gota de antígeno salga de forma uniforme a través de la aguja.
Colocar sobre cada uno de los círculos de la tarjeta 50 ul de los sueros a evaluar, o una gota utilizando
el aplicador del Kit. No olvide los sueros control (reactivo y no reactivo).
Con ayuda del aplicador extienda la muestra dentro del círculo sin salir del margen.
20
e.
Agregue 17 ul de antígeno, con micropipeta o una gota con el gotero del Kit, sobre las muestras a
evaluar.
f.
Coloque la tarjeta con las muestras sobre el rotador por 8 minutos a 100 r.p.m.
g.
Inmediatamente después tome la tarjeta con ambas manos y balancéala para observar los grumos, sobre
todo, en casos de mínima reactividad.
h.
i.
Es preferible hacer la lectura bajo una lámpara de luz, sin ayuda de luna de aumento.
Los resultados se informarán según el siguiente esquema:
21
Nota: Si se observan grumos definidos o pequeños debe procederse a realizar la prueba cuantitativa.
5.3 PRUEBA RPR CUANTITATIVA
a.
b.
c.
Colocar 50 ul de suero fisiológico al 0.9% del 2° al 5° círculo de la tarjeta.
Colocar 50 uL del suero problema en el primer círculo y 50 uL en el segundo círculo, mezcle bien en el
segundo círculo y luego transfiera 50 uL al tercer círculo mezcle bien y transfiera 50 uL al cuarto
círculo. Mezcle bien y transfiera 50 uL al 5to círculo, mezcle y descarte 50 uL.
Usando un aplicador, extienda la mezcla en cada círculo comenzando en el 5° y terminando en el 1°
círculo.
22
23
24
25
26
d.
e.
f.
Repetir los pasos del e al g de la prueba cualitativa.
La lectura y reporte de los resultados sigue los mismos parámetros que para la prueba cualitativa.
Reportar el título hasta la dilución en que observe una reacción inclusive una reacción muy fina, que se
considerará como Reactivo mínimo (Rm). (Foto 5).
CUADRO 2:
CUADRO DE TITULACION PARA LA PRUEBA
DE RPR CUANTITATIVA
5.4 INTERPRETACION DE RESULTADOS DE LA PRUEBA RPR
a.
b.
c.
d.
Un RPR Reactivo puede indicar infección presente o pasada con Treponemas Patógenos, sin embargo,
esto también puede ser una reacción falso positivo. Un falso positivo se detecta con una prueba
treponémica, la cual, es No Reactiva.
Un RPR No Reactivo sin evidencia clínica de sífilis, puede indicar que no hay infección por treponemas
o que el tratamiento fue efectivo. Un RPR No Reactivo con evidencia clínica puede observarse en sífilis
primaria, o en sífilis secundaria, presentándose en este último como fenómeno de prozona.
La baja de 4 veces el título en RPR indica una evidencia de tratamiento efectivo.
El valor predictivo del diagnóstico serológico de sífilis se incrementa cuando se combina el resultado de
una prueba de RPR con una prueba treponémica.
5.5 LIMITACIONES DE LA PRUEBA RPR
a.
b.
Puede producirse un fenómeno de prozona, en el cual, la reactividad de un suero no diluido se ve
inhibida. Este fenómeno puede sospecharse cuando se produce una Reacción mínima, o se aprecian
grumos bastante grandes mezclados con partículas sueltas de antígeno en la prueba cualitativa, por lo
que todo suero que presente algún tipo de reacción debe ser sometido a una prueba cuantitativa.
Puede producirse falsos positivos en muestras de personas que usan narcóticos, padecen de Lupus
eritematoso, Mononucleosis, Malaria, Lepra, Neumonía viral, o hayan sido recientemente inmunizados.
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CAPITULO VI
MICROHEMAGLUTINACION PARA
TREPONEMA PALLIDUM (MHA-TP)
Es una prueba de hemaglutinación pasiva que se basa en la aglutinación de eritrocitos sensibilizados
con Treponema pallidum. Si en el suero del paciente se encuentran anticuerpos contra Treponemas patógenos;
éstos reaccionarán con los eritrocitos sensibilizados formando una malla de células aglutinadas que cubren
completamente el fondo del pocillo; pero si en el suero no se encuentran anticuerpos, los eritrocitos se
precipitarán formando un botón compacto en el fondo del pocillo (Fotos 6 y 7).
6.1 PRUEBA CUALITATIVA: METODOLOGIA
a.
b.
c.
Colocar 25 ul del suero diluente en la primera fila de la microplaca.
Colocar 100 ul de suero diluente en la segunda fila.
Colocar 25 ul de suero diluente de la 3° a la 5° fila.
d.
Añadir 25 ul del suero control reactivo en el 1° pocillo de la 1ra columna, mezcle bien; transfiera 25 ul
al 2do. pocillo de la misma columna, mezcle bien; y, transfiera 25 ul al 3er. pocillo y mezcle bien y
descarte 25 ul transfiera 25 ul del 2do. pocillo al 4to. pocillo, de la misma columna, mezcle bien y
transfiera 25 ul al 5to. pocillo, mezcle bien y descarte 25 ul
e.
Utilizar la 2° columna para el suero control no reactivo y a partir de la 3° columna coloque los sueros a
evaluar, siguiendo la secuencia señalada en (d).
Dejar reposar 30 min a temperatura ambiente (23-29°C).
Usando uno de los goteros que proporciona el Kit, coloque 3 gotas (75 ul) de células no sensibilizadas
al 3° pocillo de cada columna.
Usando el otro gotero coloque 3 gotas (75 ul) de células sensibilizadas del 4° al 5° pocillo de cada
columna.
f.
g.
h.
28
i.
j.
k.
Agitar la placa suavemente por unos segundos.
Dejar reposar por 2 horas a temperatura ambiente (23-29°C).
Reportar los resultados de acuerdo al siguiente esquema:
29
6.2 INTERPRETACION DE RESULTADOS
a.
b.
c.
Un resultado Reactivo acompañado de una prueba No Treponémica Reactiva sugiere una infección
pasada o presente con Treponemas Patógenos; sin embargo, algunos falsos positivos se pueden
presentar.
Un resultado No Reactivo acompañado de una prueba No Treponémica No Reactiva, usualmente,
indica ausencia de infección Treponémica, excepto en caso de infección primaria muy reciente (menos
de una semana).
Un resultado No Reactivo acompañado de una prueba No Treponémica Reactiva indica un falso
positivo.
6.3 LIMITACIONES DE LA PRUEBA
a.
b.
c.
d.
e.
La prueba de MHA-TP, tiene una sensibilidad de 98-99% frente a la de FTA-Abs.
No debe ser utilizada para evaluación de tratamiento.
Puede ser reactiva en pequeño porcentaje (1%) en personas sanas.
Puede dar reacción en personas con PIAN, PINTA.
En suero de personas con Mononucleosis, Lepra y enfermedades autoinmunes, puede dar falsos
positivos.
30
CAPITULO VII
ANTICUERPOS DE TREPONEMA
FLUORESCENTES ABSORBIDOS (FTA-Abs)
La prueba de FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody-Absorption Test), es una prueba de
inmunofluorescencia indirecta, en la que el suero problema, es diluido en una solución absorbente (extracto de
cultivo de Treponema phagedenis), y colocado en una lámina que contiene el antígeno (Treponema pallidum
cepa Nichols). Si en el suero se encuentran anticuerpos contra Treponemas patógenos, éstos se unirán al
antígeno y cuando se adiciona el conjugado (inmunoglobulina antihumana con isotiocianato de fluoresceína) éste
se unirá al anticuerpo dando como resultado una reacción que se visualiza en el microscopio de fluorescencia.
(Fotos 8 y 9).
7.1 REACTIVOS PRINCIPALES
7.1.1 ANTIGENO
Es una suspensión de cultivo de Treponema pallidum en testículos de conejo.
7.1.2 ABSORBENTE
Preparado a partir de cultivos de Treponemas no patógenos. Los kits lo proporcionan en viales de 5ml, sin
embargo, también se puede presentar en liófilos los cuales deben ser rehidratados con 5ml de agua
destilada estéril y distribuido en tubos de 12x75 mm colocando 200 ul en cada uno; deben taparse bien
para evitar evaporación.
7.1.3 SUERO CONTROL REACTIVO
Es un pool de muestras de suero humano reactivo, con una intensidad de coloración de 4+.
7.1.4 SUERO CONTROL NO REACTIVO
Es un pool de muestras de suero humano no reactivo.
7.1.5 SUERO CONTROL NO ESPECÍFICO
Es un pool de muestras de suero obtenidas de personas no sifilíticas, en la cual, se observa una coloración
de 2+ a una dilución 1:5 en buffer fosfato, pero que no colorea a una dilución 1:5 en solución absorbente.
7.1.6 CONJUGADO
Anticuerpo antihumano producido en conejo y conjugado a una molécula de isotiocianato de fluoresceína.
7.2 PROCEDIMIENTO
Sacar las láminas fijadas con antígeno (ver fijación de antígeno) para que tomen temperatura ambiente y los
sueros para ser inactivados a 56°C por calentamiento en baño maría.
a. Enumerar las láminas en orden correlativo, de modo, que correspondan a los tubos con las muestras.
b. Colocar 200 ul de PBS en un tubo 12x75 mm para cada suero a evaluar, inclusive los controles.
c. Colocar 200 ul de absorbente en un tubo de 12x75 mm para cada suero a evaluar, inclusive los
controles.
d. Adicionar 50 ul del suero a evaluar al tubo que contiene el PBS y mezclar bien.
e. Adicionar 50 ul del suero a evaluar al tubo que contiene el absorbente y mezclar bien.
f. Colocar 20 ul de la mezcla (PBS+Suero) en uno de los círculos de la lámina que contiene antígeno
fijado de modo que cubra todo el círculo.
g. Colocar 20 ul de la mezcla (Absorbente+Suero) en el otro círculo de la lámina que contiene antígeno
31
fijado de modo que cubra todo el círculo.
Preparar láminas para:
- Suero Control Reactivo
- Suero Control No reactivo
- Coloración Inespecífica. Esta lámina se preparará de la siguiente manera, en uno de los círculos
coloque 20 ul de PBS y en otro 20 ul de absorbente.
i. Colocar todas las láminas dentro de una cámara húmeda (colocar un papel de filtro embebido con agua
en una cubeta de plástico con tapa). Inmediatamente, colocar esta cubeta en la estufa a 35-37°C por 30
minutos.
j. Terminada la incubación realice los lavados:
- Con una pizeta haga un lavado rápido con PBS a cada lámina, cuidando de que el chorro no caiga
directamente sobre los círculos de la lámina.
- Coloque las láminas en una jarra de coloración que contenga PBS, en cantidad suficiente para
cubrir las láminas y agítelas suavemente sacando y sumergiendo las láminas durante 10 minutos.
- Cambie el PBS por agua destilada y agite suavemente igual que en el paso anterior.
k. Secar cuidadosamente las láminas con papel filtro.
l. Añadir 20 ul de conjugado a cada círculo.
m. Colocar las láminas en la cámara húmeda e incube nuevamente a 37°C durante 30 minutos.
n. Repetir el paso j.
o. Colocar una gota de líquido de montaje (buffer-glicerina) sobre cada círculo y cúbralo con una
laminilla. Evite formar burbujas. Observar al microscopio de fluorescencia.
p. Reportar los resultados de acuerdo al siguiente esquema:
h.
7.3 INTERPRETACION DE RESULTADOS
a.
b.
c.
d.
Un resultado reactivo acompañado de antecedentes clínicos de sífilis y/o una prueba no treponemica
reactiva indican infección por Treponema pallidum sub-especie pallidum.
Un resultado reactivo sin antecedentes clínicos de Sífilis puede deberse a infección por Treponema
pallidum sub-especie pertenue (Pian) o Treponema carateum (Pinta).
Un resultado reactivo mínimo (1+), sin antecedentes clínicos, puede ser falla durante el procesamiento
de las muestras, en ese caso, solicitar una nueva muestra después de dos semanas.
Un resultado no reactivo acompañado de una prueba no treponémica reactiva indicará un falso positivo.
7.4 FACTORES DE ERROR
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Si el microscopio no está bien centrado o si la lámpara ya tiene mucho tiempo de uso la fluorescencia
no será nitida.
Si no se ha fijado bien el antígeno a la lámina puede ser eliminado con los lavados, dando un falso
negativo.
Si se aprecia precipitado en el conjugado, esto puede dar una coloración no específica.
Si el pH de los reactivos no es el adecuado los resultados pueden ser variables.
Si los sueros están hemolizados y/o contaminados, los resultados pueden ser variables.
Si la rehidratación y mezcla del antígeno no fué la adecuada, se observarán acúmulo de treponemas y
no morfología definida pudiendo confundirse con precipitados.
7.5 LIMITACIONES DE LA PRUEBA
a.
b.
La prueba de FTA-Abs no debe ser usada como prueba de tamizaje, pues se ha detectado un 1% de
falsos positivos en población general.
Algunos resultados falsos positivos han sido asociados al diagnóstico de Lupus eritematoso y al uso de
drogas narcóticas.
32
CAPITULO VIII
FLUJOGRAMA DE MUESTRAS PARA
INVESTIGAR SIFILIS
33
CAPITULO IX
BIOSEGURIDAD
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
Considere toda muestra como sospechosa de VIH-Sida, u otra enfermedad que pueda ser transmitida
por la sangre.
Use guantes durante la obtención y procesamiento de la muestra.
No pipetear con la boca, use micropipeta o pipetas de Pasteur.
Use mascarilla.
Coloque todo el material utilizado en frascos que contengan lejía, u otro desinfectante.
Descarte las agujas utilizadas en depósitos de metal.
En caso de derramar sangre y/o suero sobre la mesa de trabajo desinféctela usando un pedazo de
algodón empapado en lejía, sosténgalo con una pinza y frote con él, la mesa.
Tenga cuidado de no pincharse con la aguja después de haber obtenido la muestra de sangre.
(Ver Foto 10)
34
CAPITULO X
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.
Borobio M.V., Martin E. and Perea E.J. (1984). Specificity of Three Serological Tests for Syphilis:
VDRL, FTA-Abs and TPHA in Healthy People, Pregnant Women and Diabetics. Europ.J. of Sex. Trans.
Diseases; Vol 1:155-158.
2.
Creigbton Ernest T. (1990). A Manual of Test for Syphilis. American Public Health Association;
Washington DC; págs. 77-89, 99-108.
3.
Hambie E.A., Larsen S.A., Perryman M.M., Pettit D.E., Mullally R.L. and Whittington W. (1983).
Comparatison of a New Rapid Plasma Reagen Card Test With the standard Rapid Plasma Reagen 18 mm
Circle Card Test and The veneral Disease Research Laboratory Slide Test for Serodiagnosis of syphilis.
Clin. Microbiology. 17(2): 249-254.
4.
Ito F., Hunter E.F., George R.W., Swisher B.L., and Larsen S.A. (1991). Specific lnmunoflourescense
Staining of Treponema pallidum in Smears and Tissues. J. Clin. Microbiology. 29(3): 444-448.
5.
Larsen S.A.; Cruce D.D.; Farshy C.E.; and Feeley John. (1978). Heated versus unheated sera in a
Microhemagglutination Assay for Antibodies to Treponema pallidum. J. Clin. Microbiology; 8 (4): 468.
6.
Organización Panamericana de la Salud. (1983). Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de
Salud ONS, Ginebra. Publicación Científica N° 439.
7.
Organización Panamericana de la Salud. (1993). Guía para el Control de calidad de la serología para la
detección de infecciones transmitidas por transfusión de sangre. OPS/OMS-Ministerio de Salud de
Uruguay; Montevideo. 12 págs.
8.
Organización Panamericana de la Salud. (1994). Manual de Procedimientos de Control de Calidad para
los Laboratorios de Serología de los Bancos de Sangre; Washington. 60 págs.
9.
Perryman M.W, Larsen S.A., Hambie E. A, Pettit D.E., Mullally R.L and Whittington W. (1982).
Evaluation of a New Rapid Plasma Reagin Card Test as a Screening Test for Syphilis. J. Clin.
Microbiology. 16 (2): 286-290.
35
CAPITULO XI
ANEXOS
36
ANEXO 1
MATERIAL NECESARIO PARA LA OBTENCION
DE MUESTRAS DE SANGRE
-
Tubos de prueba 13 x 100 mm.
Frascos de Westhon o tipo penicilina de 5 cc. de capacidad etiquetados.
Pipetas de Pasteur.
Agujas descartables 20x1”.
Jeringas descartables de 5 ml.
Ligadura de 2.5 de mm. de diámetro.
Lejía al 3 - 5%
Algodón.
Alcohol Yodado.
Depósito de metal (tarros) para descarte de agujas.
Chupones (Para pipeta de Pasteur).
Frasco de vidrio de boca ancha (para colocar solución de lejía, para jeringas).
Centrífuga (opcional).
Refrigeradora.
Mascarilla.
Guantes.
Cajas de plástico etiquetadas (para enviar sueros).
37
ANEXO 2
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL Y EQUIPO
PARA LA PRUEBA DE VDRL (Ver Foto 3)
A.2.1. MATERIALES Y EQUIPOS
a. Máquina rotatoria adaptable a 180 r.p.m. que describa un círculo de 19 mm de diámetro en un plano
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
l.
m.
n.
o.
horizontal.
Microscopio de campo claro con ocular 10X y objetivo de 10X.
Aguja roma (sin bisel) calibre 18 para reacciones con suero y calibre 21 para LCR (opcional).
Láminas serológicas, de 2x3 pulgadas con anillos de 14 mm de diámetro.
Frasco redondo de fondo plano con boca angosta y tapón de vidrio con capacidad para 30 ml.
Jeringa de vidrio de 2 cc (opcional).
Micropipeta de un canal graduable rango 5-50 ul.
Tips (1-100ul).
Pipetas de: 1,0 ml terminal.
5,0 ml
10,0 ml
Frasco de vidrio con lejía AL 3-5%.
Mandil.
Mascarilla.
Guantes quirúrgicos.
Kit de VDRL: (conservar según especificaciones del fabricante).
- Antígeno Stock.
- Solución salina amortiguada (buffer salino).
Sueros control (reactivo y no reactivo).
A.2.2 PREPARACION DE LA SOLUCION ANTIGENICA PARA TRABAJO
a. Depositar con pipeta de 1 ml, 0.4 ml de buffer salino en un frasco de fondo plano.
b. Añadir con pipeta de 1 ml 0.5 ml de antígeno de VDRL proporcionado por el Kit, se debe adicionar
gota a gota acompañado de movimientos circulares de modo que se mezcle el antígeno (ag) con la
solución de buffer. Una buena rotación se consigue cuando el frasco describe un círculo de 2 pulgadas
de diámetro tres veces por segundo.
38
c. Verificar que no quede antígeno en la pipeta.
d. Añadir con pipeta de 5 ml, 4.1 ml de buffer al frasco con la mezcla anterior.
e. Tapar el frasco y agítelo, vigorosamente, 30 veces durante 10 segundos aproximadamente, así la
solución quedará lista para ser usada por un día, pero debe mantenerse entre 23-29°C.
f.
Mezclar suavemente la suspensión cada vez que se va a usar.
g. Luego de usar el antígeno lavar la botella y jeringa con agua, alcohol y acetona. En ese orden, separe la
aguja luego de lavarla.
A.2.3 SOLUCION SALINA AL 0.9%
Añada 900 mg de cloruro de sodio a 100 ml de agua destilada.
A.2.4 SOLUCION SALINA AL 10%
Añada 10 g de cloruro de sodio a 100 ml de agua destilada.
A.2.5 SOLUCION SALINA AMORTIGUADA
39
-
Formaldehído neutro de calidad analítica .....................................
Fosfato disódico (Na2HPO4) anhidro ...........................................
Fosfato monopotásico (KH2PO4) ..................................................
Cloruro de sodio (A.C.S.) .............................................................
Agua destilada ...............................................................................
PH : 6,0 +/- 0,1
40
0,5 ml.
0,093 gr.
0,170 gr.
10,0 gr.
1,000 ml.
ANEXO 3
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL Y EQUIPO
PARA LA PRUEBA RPR (Foto 4)
-
-
Kit de RPR 18 mm. prueba en tarjeta. Este Kit provee lo siguiente:
• Tarjetas con círculos marcados
• Capilares
• Antígeno
• Aguja roma (sin bisel) N°20
• Aplicadores de madera o plástico
• Frasco gotero de plástico
(Conservar en refrigeración)
Tips (1-100 ul)
Rotador mecánico adaptable a 100 rpm.
Mascarilla
Mandil
Guantes
Frasco de vidrio de boca ancha para desinfectante (lejía)
Refrigeradora
Sueros control (reactivo y no reactivo)
Micropipeta de un canal graduable rango 5 - 50 ul.
41
ANEXO 4
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL Y EQUIPO
PARA LA PRUEBA DE MHA-TP (Foto 6)
a. Micropipeta graduable 10-200 ul (de un canal y multicanal).
b. Microplaca de 96 pocillos de fondo en U.
c. Kit de MHA-TP que provee: (Conservar en refrigeración)
¾ Solución reconstituyente
¾ Suero diluyente
¾ Células sensibilizadas
¾ Células no sensibilizadas
¾ Suero control
¾ Goteros
d. Frasco de vidrio con lejía al 3-5%.
e. Tips (1-100 ul).
f. Mandil
g. Mascarilla
h. Guantes quirúrgicos
Nota: Para reconstituir el suero control y las células siga las recomendaciones del fabricante.
42
ANEXO 5
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL Y EQUIPO
PARA LA PRUEBA FTA-Abs (Foto 8)
A.5.1 MATERIALES Y EQUIPOS
- Baño María graduado a 56°C
- Estufa a 35-37°C
- Microscopio de fluorescencia con Lámpara de halógeno HBO200 Ocular 10X, Objetivo 40X 100X,
Filtros K515 o K530
- Micropipeta de un canal de 10-200ul
- KIT FTA-Abs. El kit provee los siguientes reactivos: (Conservar en refrigeración)
• Antígeno fijado en lámina
• Absorbente
• Conjugado de título conocido
• Buffer fosfato (pH: 7.2 +/- 0.2)
• Líquido de montaje
• Sueros control
- Mandil
- Mascarilla
- Guantes
- Tips (1-100 ul)
- Frasco de vidrio con lejía al 3-5%.
A.5.2 PREPARACION DE REACTIVOS
Para la rehidratación de reactivos seguir las instrucciones del fabricante que vienen descritas con el kit,
teniendo cuidado de usar agua destilada estéril.
A.5.2.1 Láminas con Antígeno
a. Utilice láminas porta objetos 25x75” nuevas y limpias, marque dos círculos de 1 mm de diámetro
aproximadamente utilizando un lapicero con punta de diamante, luego sumergirlas en alcohol de 95° y
secar con papel absorbente.
b. Hidratar el liófilo en 1 ml de agua destilada estéril, mezcle completamente, es preferible usar un vortex
por 10 segundos; luego coloque una alícuota (5 ul) de esta suspensión a cada círculo de la lámina.
c. Dejar secar a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos.
d. Colocar las láminas con el antígeno en una jarra de coloración conteniendo acetona químicamente
pura, durante 15 minutos.
e. Las láminas, así fijadas con antígeno, deben conservarse en la refrigeradora.
A.5.2.2 Buffer fosfato (PBS)
NaCl ....................................... 7.65 g
Na2HPO4 ................................ 0.724 g
KH2PO4 .................................. 0.21 g
H2O destilada .......................... 1000 ml
43
Disolver completamente las sales y ajustar el pH a 7.2 +/- 0.2 con Na (OH) 1 N.
A.5.2.3 Montaje
A una parte de PBS, añadir 9 partes de glicerina químicamente pura y estéril.
A.5.2.4 Tween 80 al 2%
Calentar en baño María 50 ml de buffer fosfato y Tween 80. Medir en esterilidad 49 ml de buffer y
agregar 1 ml de Tween 80; mezclar bien y ajustar el pH a 7.2 +/- 0.2.
A.5.2.5 Titulación del Conjugado
a. Hidratar el liófilo siguiendo las instrucciones del fabricante.
b. Usar sueros contol reactivo 4+, reactivo 1+, no específico (4+ ó 2+ en buffer y no colorea en
absorbente).
c. Utilizar un conjugado de título conocido para comparar los patrones de reactividad.
d. Preparar diluciones seriadas de conjugado en PBS más tween 80 al 2% (Ver Cuadro 5).
44
45
46
Esta publicación se terminó de imprimir
en Diciembre de 1997 en los
Talleres Gráficos de Art. Lautrec S.R.Ltda.
Av. Paseo de la República 731 - Lima 13
Tel/Fax: 423-7616
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