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Universidad de Los Andes Facultad de Ciencias Postgrado Interdisciplinario en Química Aplicada Mención Estudio de Materiales Elucidación Estructural de Biomoléculas utilizando Resonancia Magnética Nuclear Isolda Romero Canelón Determinación de estructura de proteínas por difracción de rayos X REQUISITOS: 9 Cristales difractantes de la proteína VENTAJAS: 9 Sin tamaño límite de la proteína, en cuanto se pueda cristalizar 9 La determinación de la estructura es rápida, una vez que se obtengan los datos 9Cálculo directo de los datos DESVENTAJAS: 9 La cristalización es un ARTE. 9 Las estructuras cristalográficas son un promedio estático. 9 Los átomos de Hidrógeno no se pueden detectar de manera directa Elucidación de estructura de proteínas por Resonancia Magnética Nuclear REQUISITO: 9 La proteína debe ser soluble y estar libremente suspendida en disolución VENTAJAS: 9 No se necesitan cristales 9 Proporciona detalles de la dinámica molecular 9 La RMN “ve” los hidrógenos 9 Los experimentos de RMN puede confeccionarse para responder preguntas concretas 9 Estudios interacción con ligandos, sustratos y otras proteínas 9 Se puede estudiar el plegamiento de proteínas (“protein folding”) 9 La muestra no se daña y se recupera totalmente DESVENTAJAS: 9 El límite en el peso molecular para la predicción estructural ab initio ~40 kD 9 Se requiere una alta solubilidad Resonancia Magnética Nuclear RMN Resonancia Magnética Nuclear En ausencia de campo magnético, los espines nucleares se orientan al azar. Cuando la muestra se coloca en un campo magnético los núcleos con espín positivo se orientan en la misma dirección del campo, en un estado de mínima energía denominado estado de espín α. Los núcleos con espín negativo se orientan en dirección opuesta a la del campo magnético, en un estado de mayor energía denominado estado de espín β. La diferencia de energía entre los dos estados de espín α y β, depende de la fuerza del campo magnético aplicado H0. Cuanto mayor sea el campo magnético, mayor diferencia energética habrá entre los dos estados de espín. 600 MHz 300 MHz ΔE E Ho El valor del radio giromagnético depende del tipo de núcleo que se está irradiando; en el caso del 1H es de 2.675 x 108 T-1s-1. ΔE = hν = h (γ /2π) Ho Campo uniforme Ho Población de Núcleos con spín paralelo al campo Secuencia de pulsos Cambio de spín en núcleos Presesión de Núcleos Pérdida de magnetización Medición de tiempos de relajación En Química Orgánica OH OH O HO OH OH O O N OH HO Jean Jeener Atomos de spín I y de spín S conectados por un enlace Pulso selectivo permitiría la transferencia de magnetización controlada del núcleo de spín I al núcleo de spín S RMN-2D para casos más complicados COSY — COrrelation SpectroscopY: Conectividad básica a través de enlaces (mismo núcleo) TOCSY — TOtal Correlation SpectroscopY: Igual que el COSY pero utiliza difentes núcleos. NOESY — Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY: permite observación efecto NOE. (mismo núcleo) ROESY — Rotational Overhauser Effect SpectroscopY HMQC — Heteronuclear Multiple Quantum Correlation: Correlación de diferentes núcleos unidos por un enlace. HMBC — Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Correlación de diferentes núcleos unidos por 2 o más enlaces. O O N OH HO Aplicación de RMN en Biomoléculas Estructura Dinámica Conformacional Plegado Resonancia Magnética Nuclear Interacciones Macromoleculares Estabilidad Conformacional Kurt Wüthrich Premio Nobel en Química 2002 For his development of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution Protein Structure Determination in Solution by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Kurt Wüthrich Science 1989, Vol 243, pp.45-50 Relación entre estructura 3D y función. 9 Uso RMN: provee datos complementarios a la Difracción de Rayos-X 9 Recolección de datos únicamente utilizando RMN-2D 3-6 experimentos: estructura completa Básicamente COSY, NOESY 9 COSY: utilizado para determinar la secuencia de aminoácidos provee información de los H vecinos en el mismo residuo de aminoácido provee conectividad directa entre residuos 9 NOESY: Información de la estructura secundaria Distancia de 5Å entre cadenas que interactúan Información sobre movimientos y variaciones rotacionales Estructura Terciaria: Información métodos bidimensionales Métodos computacionales. CH3 HO O OH NH2 Threonine Thr-Ile-Phe-Arg PHE ARG THR ILE Thr-Ile-Phe-Arg PHE ARG THR ILE NOESY lisosima Núcleos Activos: En una cadena polipeptídica 1H: 100%, 13C: 1%, 15N: 0.3% The NMR Facility at the Genomic Science Center, The RIKEN Yokohama Institute Structural genomics will turn protein structure discovery into a factory production-line process (Nature, vol 408, 130-131, 2000) Gracias !!!
