FONDECYT

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Concurso Nacional de Proyectos FONDECYT 2005 ***
COMPROBANTE DE RECEPCION DE INFORME FINAL
NUMERO
RESPONSABLE :JULIO CESAR TAPIA PINEDA
RUT
:10739461-3
TIPO
:POSTDOCTORADO
ETAPA :2006
3050037
DURACION : 2 A-no(s)
TITULO : EL SUPRESOR DE TUMORES CAVEOLINA-]. INTERACTUA CON LA CICLOOX
IGENASA-2 E INHIBE SU ACTIVIDAD CATALITICA, PROMOVIENDO LA A
DISCIPLINA :BIOLOGIA CELULAR (BIOLOGIA 2)
FECHA RECEPCION :02/04/2007
FONDECYT
TIMBRE RECEPCION
INFORME FINAL
GOBIERNO DE CHILE
PROYECTO FONDECYT POSTDOCTORADO
FONDECVT
3050037
2 AÑOS
SEGUNDO AÑO
NÚMERO PROYECTO
DURACIÓN
AÑO DE EJECUCIÓN
TAPIA PINEDA
10.739,461-3
ANDREW QUEST
14,672.243-1
INVESTIGADOR POSTDOCTORADO
RUT
INVESTIGADOR PATROCINANTE
RUT
[email protected]
9786706
[email protected]
7382015
JULIO
E-mail
E-mail
FONO
FONO
[ab. Comunicaciones Celulares, Facultad de Medicina, Av Independencia 1027, Santiago
DIRECCION INV. POSTDOCTORADO
PERIODO QUE INFORMA
31 / marzo / 2006
31 / marzo / 2007
DESDE
HASTA
CONTENIDO
(MARQUE ELCASILLERO QUE CORRESPONDA)
FUE ENVIADO
NO HAY AD)UNTO (FECHA)
SERA ENVIADO
(FECHA)
Informe Final (en formulario)
Publicaciones
Presentaciones a Congresos
Evaluación del Investigador Patrocinante
Otros (especificar)^S IN
Firma Investigador Patrocinante Firma Investigador Posdodorado
Fecha.
?7 /
CONTENIDO DEL INFORME FINAL
I. CUMPLIMIENTO DE LOS OBJETIVOS PLANTEADOS EN EL PROYECTO.
Objetivos
1. Determinar que la reexpresión
ectópica de Cav-1 en células de
adenocarcinoma de colon inhibe una de
las hemireacciones catalizadas por la
COX-2
2. Definir el dominio específico de Cav1
involucrado en la inhibición de COX-2 y
analizar su interacción con esta enzima,
así como la formación de otros
complejos macromoleculares
3. Generar clones estables en células de
adenocarcinoma de colon con las
mutantes de Cav-1 en su dominio de
interacción-inhibición de COX-2 y
analizar con estas mutantes, o un
péptido Sintético del dominio de
interacción, el rol in situ de COX-2 en la
promoción de la sobrevivencia de estas
células frente a situaciones de estrés
4.
Definir los mecanismos que
contribuyen a la estabilización de la
proteína -catenina en células tumorales
y su relación con la mayor expresión de
genes importantes en proliferación
celular y resistencia a la apoptosis, como
COX-2 y survivina
Si
¿Cumplido?
Parcial
No
E
E
E
E
E
E
E
E
Fundamentación para el cumplimiento
parcial o incumplimiento
En células de cáncer de colon l-1T29(US) la
expresión ectópica de Cav-1 WT inhibe a COX-2
medida por un ensayo de actividad peroxidasa.
En estas células ocurre sólo este tipo de
regulación post- transcripcional, puesto que en
otras la Cav-1 también regula la cantidad de
mRNA de COX-2 a nivel transcripcional.
Se encontró algunos residuos cercanos al
dominio putativo tipo-WW de Cav-1 que están
involucrados en la inhibición de la actividad
enzimática de COX-2. No obstante, no se pudo
determinar la interacción entre ambas proteínas
por métodos tan sensibles como MALDI-TOF/TOF
ni se pudo identificar otras proteínas que se
asocien o interactúen con Cav-1.
Se generaron clonesestabsdeCav-1 WT y
mutantes que permitieron definir que el dominio
tipo-WW está involucrado en la inhibición de
COX-2 a nivel post-transcripcional en células
HT29(US). Se analizó también el rol de COX-2
en la sobrevida de células de distintos tipos de
cáncer. Sin embargo, no se estudió el efecto de
Cav-1 WT (o mutantes en dominio tipo-WW) en
la modulación de la resistencia a la apoptosis.
Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los
objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los
Consejos.
En primer lugar, se agradece al Consejo la buena acogida a nuestra propuesta de incorporación de un
objetivo adicional debido a los problemas que se explicaron en el informe anterior. No obstante, durante el
segundo año del proyecto se intentó cumplir con los tres primeros objetivos planteados, obteniéndose
resultados interesantes que prontamente serán enviados a publicación.
Pero sin duda los resultados más importantes están relacionados con el objetivo adicional que, a nuestro
juicio, permiten darlo como cumplido por cuanto se estableció un mecanismo que aplica tanto para células
normales como tumorales, donde la actividad transcripcional de l-catenina es fundamental en la expresión
de genes blanco, como survivina y COX-2, y que normalmente están relacionados con la modulación de la
sobrevida y resistencia a la apoptosis (ver figura 8 de sección Resultados). Es así como, hemos definido en
nuestro laboratorio que las proteínas CK2 y Caveolina-1 funcionan de manera opuesta sobre la regulación de
la actividad transcripcional de -catenina promoviendo o reprimiendo sobrevida celular, respectivamente.
Estos resultados han sido aceptados favorablemente en la comunidad científica internacional y han podido ser
publicados en revistas de gran prestigio como Journal of Ce!! Science y Proceeding of the National Academy
of Sciences of the USA.
Por lo tanto, en el desarrollo de este proyecto se ha mostrado una capacidad de superación de los
problemas inherentes a toda investigación, lo cual ha sido respaldado por publicaciones en excelentes
revistas internacionales.
II. RESULTADOS
Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño
carta, espacio seguido. Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados.
Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en
anexos la información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación.
Objetivo 1. Determinar que la reexpresión ectópica de Cav-1 en células de adenocarcinoma de
colon inhibe una de las hemireacciones catalizadas por la COX-2.
Objetivo 2. Definir el dominio específico de Cav-1 involucrado en la inhibición de COX-2 y analizar
su interacción con esta enzima, así como la formación de otros complejos macromoleculares.
En el informe anterior se mostró que la expresión ectópica de Cav-1 silvestre (clones C14 y C16) en
células metastásicas de cáncer de colon HT29(US) tuvo un efecto inhibidor de la actividad enzimática de
COX-2 (ie, a nivel post-transcripcional) pero no sobre sus niveles de mRNA (ie, a nivel transcripcional), como
ocurrió en las células embrionarias HEK-293T. Además, en estas mismas células la expresión de la doble
mutante de Cav-1 en los residuos Trp-128 y Pro-132 del dominio tipo-WW no tuvo efecto sobre COX-2 a
nivel transcripcional, mientras que células HT29(US) expresando Cav-1 con las mismas mutaciones (ie, clon
C37) mostraron un bloqueo de la inhibición de la actividad de COX-2 por Cav-1.
En consecuencia, se intentó definir más detalladamente los residuos del dominio tipo-WW de Cav-1
que están involucrados en la regulación transcripcional y post-transcripcional de COX-2, para lo cual se
generó la mutación W98F correspondiente al otro triptofano que define al dominio. Similarmente a lo
observado con la mutante Cav1Wl2S'l32G en células HEK-293T y HT29(US), la mutación del residuo Trp-98
condujo a una reducción en los niveles de mRNA de COX-2 sólo en células embrionarias HEK-293T y parecida
a la observada con Cav-1 silvestre (figura lA). Por el contrario, la expresión ectópica de la misma Cav-1
mutante (clon C56) en células de cáncer de colon HT29(US) no tuvo un efecto significativo sobre la actividad
enzimática de COX-2 (figura iB). En consecuencia, estos resultados sugieren que el dominio-tipo WW de
Cav-1 conformado por los residuos Trp-98, Trp-128 y Pro-132 no estaría participando en la regulación
negativa de COX-2 a nivel transcripcional en células HEK-293T, mientras que en células de cáncer de colon
HT29(11S) este dominio sólo estaría regulando la actividad enzimática a un nivel post-transcripcional.
A
NT
Mock
WT
W98F W128F1P132G
B
COX-2
80
o
60
40
t
20
mock
c14
c37
c56
Figura 1. Cav-1 regula negativamente a actividad de COX-2 a nivel post-transcripcional. (A) RT-
PCR para la expresión de cox-2 en células HEK293T transfectadas transitoriamente con el vector
pLacIOP vacío (mock) o conteniendo los cDNAs de Cav-1 silvestre (WT) y mutantes W98F y
W128F/P132G. NT indica no transfectadas. (B) Ensayo de actividad porcentual de COX-2 (cayman
Corp) en clones de HT29(US) que expresan ectópicamente el vector vacío (mock) o las formas de
Cav-1 silvestre (C14), W128F/P132G (C37) y W98F (c56). En todos los casos se indujo la expresión
de Cav-1 silvestre y mutantes con 1 mM IPTG.
Objetivo 3. Generar clones estables en células de adenocarcinoma de colon con las mutantes de
Cav-1 en su dominio de interacción-inhibición de COX-2 y analizar con estas mutantes, o un
péptido sintético del dominio de interacción, el rol in situ de COX-2 en la promoción de la
sobrevivencia de estas células frente a situaciones de estrés.
En el informe anterior se mostró el diseño de las formas Cav-1 wT y Cavlwl2&'l32G, su expresión
transitoria en células embrionarias HEK-293T o estable en células de cáncer de colon HT29(US) y se analizó
su efecto en la regulación transcripcional y post-transcripcional de COX-2.
Por consiguiente, se estudió el rol in situ de COX-2 en la sobrevida y resistencia a la apoptosis de
distintos tipos celulares. En primer lugar se analizó el efecto del inhibidor específico "COX-2 Inhibitor II"
(Calbiochem) en la proliferación y resistencia a la apoptosis en células de cáncer de colon (HT29, DLD1),
mama (ZR75) y embrionarias (HEK-293T). Los resultados mostraron que el nivel de actividad enzimática de
COX-2 es determinante sobre los niveles de proliferación y apoptosis medidos en estas células, puesto que
en general una mayor actividad de COX-2 (figura 2A) se correlaciona con una mayor sensibilidad a la muerte
por apoptosis (figura 2B). Asimismo, se observó también una cierta tendencia de las células a tener una
menor capacidad proliferativa (figura 2C). Interesantemente, estos resultados mostraron que células que
poseen una mayor actividad enzimática de COX-2 (y probablemente también una mayor expresión) son más
susceptibles a la muerte producida por un inhibidor específico. Esto también indica que células que expresan
ectópicamente Cav-1 silvestre debiesen ser menos resistentes a la muerte por apoptosis, aunque durante
este proyecto ese aspecto no fue abordado.
B
4T2OiUS)
DLD1
ZR75
HEK
100
41T20(US)
DLD1
ZRHS
4444294)5)
HEE
01.04
D415
04,4,
Figura 2. La actividad de COX-2 es importante en la regulación de la sobrevida celular. (A) Ensayo de
actividad específica de COX-2 en células de cáncer de colon (HT29[US] y DLD1), mama (ZR75) y embrionarias
(HEK-293T) crecidas en presencia de un inhibidor específico de COX-2. (B) Apoptosis medida por citometría
de flujo de células tratadas como en A y teñidas con yoduro de propidio. Se muestra las veces de aumento de
la apoptosis con respecto al control sin inhibidor. (C) Proliferación medida por ensayo MTS (Promega) de las
células tratadas como en A. Se muestra el promedio de al menos tres ensayos con p : 5 0.01.
Objetivo 4. Definir los mecanismos que contribuyen a la estabilización de la proteína 3-catenina
en células tumorales y su relación con la mayor expresión de genes importantes en proliferación
celular y resistencia a la apoptosis, como COX-2 y survivina.
Este objetivo adicional fue propuesto en el informe anterior debido a que nuestros resultados
mostraron que la regulación post-transcripcional de COX-2 por Cav-1 (ie, inhibición de la actividad
enzimática) ocurría solamente en células metastásicas de cáncer de colon HT29(US), mientras que en las
demás células analizadas, como HEK-293T, DLD-1, ZR-75 e incluso HT29(ATCC), estaba ocurriendo una
regulación a nivel transcripcional (ie, disminución de niveles de mRNA y proteína) no sólo de COX-2 sino
también de la proteína inhibidora de la apoptosis Survivina. Además, encontramos que la proteína kinasa
CK2 participa positivamente en la regulación de la expresión de COX-2 y survivina en células HT29(US) a
través de un mecanismo mediado por la proteína íl-catenina, actuando en estas células como un factor
promotor de la proliferación y de resistencia a la apoptosis. Los datos mostraron que inhibiendo CK2 con un
inhibidor específico, TBB, en células HT29(US) o expresando transitoriamente la subunidad cx en HEK-293T se
observaba la disminución y aumento, respectivamente, de los niveles proteicos de COX-2 y survivina.
Por lo tanto, para entender mejor el mecanismo dependiente de í-catenina que da cuenta de la
regulación transcripcional de COX-2 y survivina, se estudió el efecto de la expresión ectópica de Cav-1
silvestre sobre la expresión de COX-2 en distintos tipos de células. Se produjo clones estables de Cav-1
silvestre en líneas celulares de cáncer de colon (HT29-US y DLD-1) y mama (ZR75), así como se expresó
transitoriamente la misma en células no cancerosas (HEK-293T) y se analizó los niveles de mRNA y proteína
de COX-2. Se observó que Cav-1 regula negativamente los niveles de mRNA de COX-2 y survivina en las
células DLD-1, ZR75 y HEK-293T (figura 3). Estos resultados están relacionados con los publicados
recientemente por nuestro grupo con respecto a la regulación de la expresión de la proteína inhibidora de la
apoptosis Survivina (ver anexo Torres V.A. et al. J. Ceil Sci. 2006 119:1812-23) y en su conjunto permiten
postular un mecanismo de regulación de la progresión celular y resistencia a la apoptosis por parte de Cav-1,
donde esta proteína impediría la transcripción de genes blanco de la ruta 1-catenina-Tcf/Lef, como COX-2 y
survivina (ver esquema de figura 8).
IPTG
DLDI
-
+
ZR75
-
+
HEK
-
+
Figura 3. Cav-1 regula la expresión de COX-2
cox-2
RT-PCR de
células transfectadas con el vector de
expresión pLacIOP-Cav-1 y crecidas en
ausencia (-) o oresencia (+) de !PTc.
y survivina a nivel transcripcional.
survivina
=
-
-
actina
Si bien este mecanismo ocurre en varios tipos celulares cancerosos (como DLD1 y ZR75) y no
cancerosos (como HEK-293T y NIH-3T3) e incluso en la línea celular de cáncer colorectal HT29(ATCC),
sorprendentemente no es funcional en la sublínea metastásica HT29(US) (figuras 4A y 4B). Para explicar
esta diferencia, se analizó en ambas líneas celulares de HT29 el nivel de expresión y localización subcelular
de E-cadherina, una proteína típicamente relacionada con í-catenina y con función supresora de tumores.
Se observó que, a diferencia de las células HT29(ATCC), en la variante metastásica HT29(US) el nivel de
expresión de E-cadherina fue muy bajo y la mínima cantidad se acumuló en parches discretos en el interior y
no en la superficie celular (figura 4C).
A
IPTG
mock
Cav-1
- +
- +
B
caveolin-1
survivin
mock
Figura 4. La regulación de la expresión de
genes blanco de /I-catenina-Tcf/Lef por Cav-1
es dependiente de E-cadherina. (A) Western
Cav.1
IPTG - +
- +
caveolin-1
blot donde se muestran los niveles proteicos
de caveolina-1, survivina y actina en células
HT29(ATCC) transfectadas con vector vacío
pLacIOP (mock) o conteniendo el cDNA de
caveolina-1 silvestre (cav-1), ambos crecidos
en ausencia (-) o presencia (+) de 1 mM
IPTG. (B) Western blot de células HT29(IJS)
tratadas en las mismas condiciones de A. (C)
en
células
Niveles
E-cadherina
de
HT29(ATCC)
HT29(US)
detectados
y
mediante
microscopía
confocal
de
fluorescencia. Se muestra la localización de
E-cadherina (verde) y los recuadros
muestran una ampliación de la zona marcada
con flechas donde el núcleo aparece teñido
con yoduro de propidio (rojo).
survivin
-
actin
acti n
ji.
HT29(ATCC)
HT29(uS)
Similarmente a lo que ocurre en la línea HT29(ATCC) que expresa normalmente E-cadherina en su
superficie, la reexpresión de E-cadherina en células HT29(US) devolvió a éstas la habilidad de Cav-1 para
regular negativamente a survivina y también de reducir la proliferación celular (figura 5A y 5B),
consecuentemente con un aumento en la coi nmunoprecipitación (figura 5C) y colocalización (no mostrado)
entre Cav-1 y l-catenina. Adicionalmente, Cav-1 y E-cadherina cooperaron en la represión de la
transcripción dependiente de ll-catenina-Tcf/Lef en células HEK-293T (figura 5D). Por lo tanto, la regulación
negativa de la expresión de survivina e inhibición de la proliferación mediada por caveolina-1 en células
rnetastásicas requiere de la presencia de E-cadherina, mientras que su ausencia compromete severamente la
habilidad de Cav-1 para actuar como un supresor de tumores (estos resultados han sido enviados a la revista
Molecular Ceil Biology para su publicación).
E-cadhenn
A
Mork
Figura S. La presencia de E-cadherina devuelve
a las células HT29(US) la capacidad de regular
negativamente la expresión de survivina. (A)
Western blot donde se muestran los niveles
proteicos de Cav-1, survivina y actina en células
HT29(US) transfectadas con vector vacío
pLacIOP (mock) o conteniendo el cDNA de
caveolina-1 silvestre (Cav-1), ambos crecidos
en ausencia (-) o presencia (+) de 1 mM IPTG
(comparar con figura 4B). (B) Proliferación
medida por ensayo MTS de células HT29(US)
expresando o no Cav-1 y en ausencia o
presencia de E-cadherina, según leyenda al pie
de figura. (C) Ensayo de inmunoprecipitación
(IP) utilizando anticuerpo anti-Cav-1 de las
mismas células marcadas con barras achuradas
en B y visualización de la asociación de Ecadherina o 3-catenina en un WB. (D) Ensayo
de actividad transcri pcional de (3-catenina
mediante reportero de luciferasa en las mismas
células en B. Donde se indica, el asterisco
indica un valor estadístico de p 0.001.
100 H
cav-1
75 IPTG
-
+
- +
Caveolin-1
50-4
-
25-1
survivin
Caveolin-1
actin
- +
- +
-
c
E-cadherin
*
D
it' caveoiin.i
!
b
loo-.
75.
.:
!; 1:::
Ecadhenn
13-catenin
caveoiin-1
-
6
caveolin-1
-
-
+
+
E-cadherin
-
+
-
+
Por el contrario, resultados anteriores sugieren que la proteína kinasa CK2 es importante en la
sobrevida de las células tumorales debido a que regula positivamente la expresión de genes involucrados en
progresión del ciclo celular y de resistencia a la apoptosis, como survivina y COX-2. El estudio de la
regulación de la expresión de survivina mediante distintas estrategias experimentales como: (i) utilizando
inhibidores específicos de la actividad de la proteína kinasa CK2, como TBB y DMAT, en células de distintas
líneas de cáncer; (II) eliminando la expresión de la subunidad CK2u mediante siRNA en células embrionarias
HEK-293T; y (iii) sobreexpresando transitoriamente la subunidad o en células HEK-293T; permitió definir que
esta enzima es otro componente importante en el mecanismo de regulación de la actividad transcripcional de
la proteína 13-catenina, actuando esencialmente de modo opuesto a caveolina-1 (ver esquema de figura 8), y
teniendo un rol primordial en la viabilidad de las células tumorales. Estos resultados fueron recientemente
publicados en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
(ver anexo Tapia J.C. et al. PNAS 2006 103:15079-84).
Puesto que la inhibición de CK2 con TBB tuvo un efecto negativo en la expresión de COX-2 en células
HT29(US) así como la expresión ectópica de la subunidad CK2u produjo un aumento en los niveles de mRNA
y proteína para COX-2 en células HEK-293T (informe anterior), se utilizó el inhibidor más específico para
CK2, DMAT, y se analizó su efecto en la expresión de COX-2 y resistencia a la apoptosis en células de
distintas líneas de cáncer. Como se esperaba, la inhibición de CK2 con DMAT tuvo un severo efecto en la
expresión de COX-2 a nivel de mRNA y proteína en células de cáncer de colon y mama (figura 6).
DMAT
011)1
HT29ATCC) HT29(U5)
+
ZR-75
COX-2
cm
HT29(ATCC) HT29(US DMAT -
-
+
-
-
DLD-1
+
-.--
ZR-75
-
Figura 6. La proteína kinasa CK2 regula
positivamente la expresión de survivina y COX-2
a nivel transcripcional. (A) RT-PCR de células
crecidas en ausencia
+
o presencia (+) de 40
(B) WB de las mismas células
mostradas en A.
pM DMAT.
actin
-
Asimismo, los niveles de apoptosis en las mismas líneas de cáncer fueron incrementados en
presencia del inhibidor DMAT aunque en grado distinto dependiendo del tipo celular (figura 7A).
Interesantemente, la diferencia de apoptosis observada entre células fue bastante similar a la que se midió
cuando se utilizó un inhibidor específico de COX-2 (figura 75). Considerando que el nivel de actividad
enzimática de COX-2 influye en la viabilidad y apoptosis de distintas células (ver figura 2), estos resultados
sugieren que la diferencia de apoptosis entre células se relaciona con la diferencia en los niveles de expresión
de COX-2 producto de la regulación diferencial de la actividad transcripcional de 3-catenina por la proteína
kinasa CK2. Por consiguiente, asumiendo que existe una conexión entre COX-2 y survivina, como se ha
sugerido recientemente (Krysan K. et al. 2004 Faseb J. 18:206-8), la presencia de CK2 en la célula tumoral
parece ser importante para mantener elevados niveles de COX-2 y survivina, los que a la postre le
proporcionan una ventaja por sobre otras debido a que la proteína kinasa CK2 promovería una mayor
proliferación y resistencia a la apoptosis.
A
B
5
2j
1T9iATCCi
HT29(USI
OLDI
ZP-75
+IT29iATCC1 -1T29(US1
0101
¿R75
Figura 7. La diferencia de apoptosis entre distintas células es un reflejo de la diferencia en
los niveles de expresión de COX-2 debido a la regulación diferencial de la actividad
transcripcional de /1-catenina por la proteína kinasa CK2. Apoptosis medida por citometria
de flujo en células crecidas en presencia de un inhibidor especifico de CK2, DMAT (A), o de
un inhibidor de COX-2 (B) y teñidas con yoduro de propidio. Se muestra las veces de
aumento de la apoptosis con respecto al control sin inhibidor.
Finalmente, los resultados obtenidos en este proyecto pueden ser resumidos en el modelo que
aparece en la figura 8, donde se muestra los distintos componentes que interactúan funcionalmente para
regular la expresión de proteínas, como survivina y COX-2, involucradas en la sobrevida y resistencia a la
apoptosis en células de cáncer de colon y Otros.
Figura 8. Caveolina-1 y CK2 modulan la sobrevida y resistencia a la apoptosis en
células tumorales. El esquema muestra que dentro de la célula la actividad
transcripcional de l-catenina es fundamental en la expresión de genes blanco,
como survivina y COX-2, los cuales modulan la sobrevida y resistencia a la
apoptosis. De esta forma, CK2 y Cav-1 funcionarían de manera opuesta en la
regulación de la actividad de -catenina promoviendo o reprimiendo sobrevida
celular, respectivamente.
III. PRODUCTOS GENERADOS POR EL PROYECTO
En esta sección debe incluir todo documento o material cuyo contenido corresponda
substancialmente a los objetivos del proyecto que se informa y en los que se explicite el N° del
proyecto FONDECYT. Aténgase a los formatos que se incluyen para cada tipo de producto
generado. Sólo adjunte copia de los documentos no enviados previamente a FONDECYT.
1. Artículos en revistas científicas nacionales o extranjeras con Comité Editorial.
Título del Artículo
Caveolin-1 controis celi proliferation and celi death by suppressing
expression of the inhibitor of apoptosis protein Survivin
Autor(es)
Torres VA., Tapia J.C., Rodríguez D.A., Párraga M., Lisboa P., Montoya M.,
Leyton L. y Quest A.E.G.
Nombre Completo de la
Revista.
Journal of Ce!! Science
Ref. bibliográfica
Estado de la publicación a
la fecha."
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay
N°
Pág. 1812-23
0 Publicada/En Li Aceptada
LI Enviada
LI En preparación
Prensa
FONDAP 15010006, WellcomeTrust WT064911/Z/01/Z, ICGEB CRP/CH102- 01, FIRCA 1-R03-TW06024-01, Fondecyt 1040390
Título del Artículo
Casein kinase 2 (CK2) increases survivin expression via enhanced í-cateninT ceil factor/lymphoid enhancer binding factor-dependent transcription
Autor(es)
Tapia J.C., Torres V.A., Rodriguez D.A., Leyton L., and Quest A.E.G.
Nombre Completo de la
Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA
Ref. bibliográfica
Estado de la publicación a
la fecha.*
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay
Año:
Revista.
Año: 2006
2006
Vol. 119
Vol.
103
N°
41
Pág. 15079-84
E2 Publicada/En E Aceptada -
Li Enviada
E En preparación
Prensa
FONDECYT 1040390, ICGEB CRP/CH102-01, Eogarty-NIH #R03TW00602403, FONDAP 15010006, Wellcome Trust WT064911/Z/01/Z
Título del Artículo
Caveolin-1-mediated down-regulation of survivin and inhibition of cell
proliferation in metastatic cancer cells requires E-cadherin expression
Autor(es)
Torres VA, Tapia JC, Lladser A, Rodríguez DA, Leyton L. and Quest AFG.
Nombre Completo de la
Revista.
Molecular CefI Bio!ogy
Ref. bibliográfica
Año:-- 2007 Vol. ______ N° _______ Pág.
Estado de la publicación a LI Publicada/En LI Aceptada
1121 Enviada
la fecha.*
Prensa
Otras fuentes de
FONDAP 15010006, FONDECYT 1040390
financiamiento, si las hay
9
-
E En preparación
Título del Artículo
Protein kinase CK2 promotes tumor ceil viability via transcriptional
upregulation of cyclooxygenase -2
Autor(es)
Tapia )C, Lladser A, Rodríguez DA, Hernández JG, Leyton L. and Quest AFG.
Nombre Completo de la
Journal of Biological Chemistry
Ref. bibliográfica
Año:
Revista.
2007
Vol.
N°
Pág.
Estado de la publicación a E
la fecha.*
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay
E Enviada
Publicada/En E Aceptada
En preparación
Prensa
FON DECYT 1040390, Fogarty-NIH R03TW006024-03, ICGEB CRP/CH102-01,
FONDAP 15010006
Título del Artículo
Caveolin-1 reduces cyc1ooxygenase-2 (COX-2) expression
transcriptiorial mechanism involving the I-catenin-Tcf/Lef pathway
Autor(es)
Rodríguez DA, TapiaJC, Torres VA, Leyton L and Quest AFG
Nombre Completo de la
Revista.
j7jnai of Celi Science
Ref. bibliográfica
Año: 2007 Vol.
N°
Estado de la publicación a E Publicada/En E Aceptada
la fecha.*
Prensa
Otras fuentes de
financiamiento, si las hay
via
a
Pág.
E Enviada
1151 En preparación
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Prensa/Aceptados/Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de envío.
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3. Presentaciones a Congresos Nacionales e Internacionales. Adjunte copia del resumen o texto de la
ponencia y de la tapa de/libro de Resúmenes, si no la ha enviado previamente.
Título de la Ponencia
Autor(es)
Protein kinase CK2 promotes ceil survival in cancer celis by a mechanism involving
enhanced ;-catenin-Tcf/Lef dependent transcription of the inhibitor of apoptosis
protein Survivin
Tapia .J., Torres y ., Leyton L., and Quest A.E.G.
Nombre del Congreso International Symposium Mechanisms of Ceil Death: Molecular Insights and
Therapeutic Perspectives
País: Chile
Ciudad: Reñaca
Fecha: 13-16 Abr, 2005
Lugar y Fecha
Título de la Ponencia
Autor(es)
Caveolin-1 down-regulates the expression of the IAP protein survivin via a
transcriptional mechanism involving the l-catenin-Tcf/Lef pathway
Torres y ., Tapia J., Leyton L. and Quest A.F.G.
Nombre del Congreso International Symposium Mechanisms of Ceil Death: Molecular Insights and
Therapeutic Perspectives
País: Chile
Ciudad: Reñaca
Fecha: 13-16 Abr, 2005
Lugar y Fecha
Título de la Ponencia Caveolin-1 down-regulates expression of survivin via inhibition of fl-catenin____________________ Tcf/Lef-dependent transcription
Autor(es)
Torres V., Tapia )., Leyton L. and Quest A.F.G.
Nombre del Congreso International Meeting Biosciences 2005: From Genes to Systems
Lugar y Fecha
País: United Kingdom
Título de la Ponencia
Protein kinase CK2 mediated ceIl survival is linked to enhanced expression of the
inhibitor of apoptosis protein Survivin
Tapia J.C., Torres V.A., Rodriguez DA., Leyton L. and Quest A.E.G.
Autor(es)
Ciudad: Glasgow
Fecha: 17-21 Jul, 2005
Nombre del Congreso 45f" Annual Meeting of The American Society for CelI Biology
Lugar y Fecha
País: United States of Ciudad: San Francisco
America
Título de la Ponencia
Caveolin-1 down-regulates the expression of the inhibitor of apoptosis protein
survivin via a transcriptional mechanism involving the p-catenin-Tcf/Lef pathway
Torres V., Tapia J., Rodriguez D., Leyton L., Quest A.F.G.
Autor(es)
F echa: 10-14 Dic, 2005
Nombre del Congreso Keystone Symposia. Connecting the Scientific Community (Lipid Rafts and CelI
Funtion)
País: United State of Ciudad: Colorado
Fecha: 23-28 Mar, 2006
Lugar y Fecha
America
Título de la Ponencia
Autor(es)
Protein kinase CK2 increases cyclooxygenase-2 (COX-2) expression vía a
transcriptional mechanism involving the í-catenin-Tcf/Lef pathway
Tapia JC, Rodríguez DA, Torres VA, Leyton L., Quest A.F.G.
Nombre del Congreso
XX Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile Lugar y Fecha
País: Chile
Título de la Ponencia
E-cadherin facilitates caveolin-1-rnediated down-regulation of survivin and
inhibition of cell proliferation
Torres y ., Tapia 3., Lladser A., Rodríguez D., Leyton L., Quest A.F.G.
Autor(es)
Ciudad: Pucon
-
Fecha: 8-12 Oct, 2006
Nombre del Congreso XX Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile
País: Chile
Lugar y Fecha
Ciudad: Pucon
[Fecha: 8-12 Oct, 2006
Título de la Ponencia Caveolin-1 reduces cyclooxygenase-2 (COX-2) expression via a transcri ptional
mechanism involving the í3-catenin-Tcf/Lef pathway
Autor(es)
Rodriguez DA, Tapia )C, Torres VA, Leyton L., Quest A.F.G.
Nombre del Congreso 1 XX Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile
Lugar y Fecha
1
País: Chile
Ciudad: Pucon
1
Fecha: 8-12 Oct, 2006
Título de la Ponencia E-cadherin promotes the anti-proliferative role of caveolin-1 as well as down____________________ regulation of survivin
Autor(es)
Torres V.A., Tapia 3., Lladser A., Rodriguez D., Leyton L. and Quest A.F.G.
Nombre del Congreso 46 th Annual Meeting of The American Society for CelI Biology
Lugar y Fecha
País: United
America
States
of Ciudad: San Diego
12
Fecha: 9-13 Dic, 2006
IV. OTROS LOGROS DEL PROYECTO. Describa, si las hay, actividades tales como:
• Estadías de investigación
• Cualquier otro logro no contemplado en los ítems anteriores y que Ud. quiera destacar.
Se realizó una estadía en el laboratorio del Dr. Jay W. Heinecke, Proteomics Core, Mass
Spectrometry Resource, Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine,
University of Washington, Seattle, USA. Este laboratorio posee los más modernos equipos que existen
actualmente para hacer investigación en el área de la Proteómica, como MALDI-TOF/TOF, ESI, etc.
Posteriormente, se ha mantenido una comunicación contínua con el Dr. Heinecke, lo cual implica una
colaboración así como la realización de futuras estadías del investigador responsable o alumnos de
doctorado. La experiencia ganada en el área de la Proteámica se ha aplicado en diversas líneas de
investigación en nuestro laboratorio y en otros que conforman el Centro Fondap de Estudios
Moleculares de la Célula (CEMC).
La asistencia a la 45 1' Reunión Anual de la Sociedad Americana de Biología Celular (ASCB) en San
Francisco, USA, fue de gran utilidad para los propósitos de este proyecto, puesto que además de
conocer las líneas de investigación de vanguardia en biología celular sirvió para contactar a algunos
investigadores con quienes se pudo y podrá colaborar. El primer ejemplo es el Dr. Timothy Hla
(Director, Center for Vascular Biology, Health Center, University of Connecticut) quien es un reconocido
investigador en el área de la ciclooxigenasa-2 y nos envió el plásmido pOSM1--cox-2 que fue utilizado en
experimentos para determinar que: (i) la regulación transcripcional y post-transcripcional de COX-2 es
dependiente de Cav-1 '' 13-catenina; (u) la expresión ectópica de COX-2 aumenta la resistencia a la
apoptosis en células de cáncer de colon; y (iii) la reversión de la muerte debido a la expresión ectópica
de COX-2 en células tratadas con inhibidores específicos de CK2 es consecuencia del incremento de la
estabilidad de survivina. Asimismo, se estableció el contacto con la Dra. Odile Filhol-Cochet (INSERM,
Grenoble, Francia) quien está dispuesta a recibir al investigador responsable o algún tesista de
doctorado en el ámbito de colaboración relacionada con la nueva línea de investigación que se pretende
continuar (párrafo siguiente).
El último logro a mencionar está relacionado con el novedoso mecanismo descrito para explicar la
función anti-apoptótica de la proteína kinasa CK2 y su rol en la resistencia a la muerte inducida por
drogas en células de cáncer de colon. Considerando que esta kinasa está frecuentemente
sobreexpresada e hiperactiva en distintos tipos de cáncer, nos propusimos ampliar nuestros
descubrimientos a otras líneas tumorales, con resultados positivos. Así, este mecanismo de resistencia
a la apoptosis mediado por CK2 y dependiente de la actividad transcripcional de f-catenina-Tcf/Lef es
funcional en distintos tipos celulares normales y tumorales. Estos resultados llevaron a que el
investigador responsable ideara una nueva línea de investigación relativa al estudio del mecanismo
molecular que da cuenta de la regulación de la estabilidad de l-catenina por parte de CK2, lo cual se
planteará en un proyecto Fondecyt de Iniciación.
Finalmente, debido a los logros científicos del investigador responsable es que el Centro FONDAP de
Estudios Moleculares de la Célula le ha otorgado la posición de Investigador Asociado y el respaldo
institucional en términos de infraestructura y honorarios para continuar con la investigación propuesta.
En el mismo contexto, el investigador está trabajando como Coordinador del curso de Biología Celular
para las carreras de Obstetricia y Puericultura en la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, a
la espera de que prontamente sea incluido a la planta de académicos.
13
V. INFORME DE EVALUACION DE INVESTIGADOR PATROCINANTE
NOMBRE:
i.tV
El proyecto de post-doctorado desarrollado por el Dr. Julio Tapia en mi laboratorio fue formulado
originalmente en el estudio de la regulación post-transcripcional de COX-2 por la proteína supresora de
tumores Caveolina-1 en células de cáncer de colon. Si bien no pudimos cumplir con todos los objetivos
específicos planteados, durante el segundo año de ejecución se avanzó en todos ellos de manera
considerable, con resultados que sin duda serán prontamente publicados en buenas revistas
internacionales (dos manuscritos en preparación)
El problema surgido al comienzo de este proyecto debido a que la inhibición de la actividad peroxidasa
de COX-2 por Cav-1 se debía también a la regulación negativa de su expresión a través de un mecanismo
dependiente de -catenina, nos condujo a estudiar más profundamente y en distintos tipos celulares,
normales y tumorales, el mecanismo de regulación positiva de la expresión de survivina, una proteína
inhibidora de la apoptosis y sobreexpresada en la mayoría de los cánceres. Este cambio de rumbo en la
línea de investigación del proyecto fue una muy buena decisión por cuanto pudimos delinear un mecanismo
para explicar la regulación de COX-2 y survivina en células tumorales (especialmente en HT29) donde
Caveolina-1 y la proteína kinasa CK2 actuarían de manera opuesta promoviendo o impidiendo apoptosis,
respectivamente. Parte fundamental en este mecanismo lo constituye la proteína kinasa CK2, la cual
promueve un aumento de la actividad transcripcional de 3-catenina y un incremento de la expresión de
ambas proteínas, COX-2 y survivina, ambas relacionadas con una mayor resistencia de las células
cancerosas a la muerte inducida por drogas quimioterapeuticas. Así, se describió por primera vez el
carácter anti-apoptótico de la proteína kinasa CK2 a través de la regulación de la estabilidad de -catenina
y la consecuente mayor expresión de proteínas involucradas en proliferación y sobrevida, como COX-2 y
survivina, lo cual le valió a estos resultados ser publicados en la revista Proceeding of the Nationa/
A ca clem y of Scien ces of the USA.
Por otro lado, un avance importante también relacionado con este proyecto fue haber definido que el
mecanismo de regulación de la expresión de COX-2 y survivina por caveolina-1 ocurre en la mayoría pero
no en todas las células, ya que en células metastásicas derivadas de cáncer de colon, HT29(US), o de
melanoma murino, BL16-F1O, este mecanismo no funciona. Esto nos condujo a obtener resultados muy
interesantes que muestran que la regulación negativa de la expresión de survivina e inhibición de la
proliferación mediada por caveolina-1 en células metastásicas requiere de la presencia de E-cadherina,
mientras que su ausencia compromete severamente la habilidad de Cav-1 para actuar como un supresor
de tumores (manuscrito enviado a la revista Molecular Ce!! Biology).
En conclusión, evalúo muy positivamente la investigación realizada por el Dr. Tapia, por cuanto ha
avanzado en todos los objetivos específicos propuestos pese a las dificultades encontradas. Justamente el
desarrollo de la capacidad de superar las dificultades que se encuentre en el camino y desarrollar nuevas
ideas exitosas lo veo como una parte esencial en la formación de un post-doctorado. Su trabajo ha llevado
ya a dos publicaciones en revistas de muy buen nivel y seguramente serán por lo menos tres más (1 en
revisión y 2 en preparación), por lo que al término del año 2007 el Dr. Tapia debiese contar con 5
publicaciones en muy buenas revistas internacionales como resultado de su periodo de post-doctorado en
mi laboratorio. Esto representa un muy buen rendimiento. Además, el Dr. Tapia supo aprovechar las
posibilidades que le ofreció contar con un proyecto para aprender nuevas técnicas (incluyendo
espectrometría de masas) que le sirven para el desarrollo de proyectos como investigador independiente
en el futuro cercano. El excelente desempeño del Dr. Tapia en mi laboratorio ha conducido a su afiliación
al Centro FONDAP-CEMC como un investigador joven asociado y se espera luego contar con su
incorporación al ICBM como académico, donde ya ha asumido responsabilidades en docencia coincidente
con dicha proyección.
Firma Investigador Patrocinante
Fecha:
OJS
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VI. RESUMEN (NO DEBE EXCEDER ESTE ESPACIO EN LETRA ARIAL 10)
Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los
resultados alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no
especialista en el tema. Esta información podrá ser difundida.
El cáncer es una de las principales causas de muerte en Chile y a nivel mundial. Dentro de las
neoplasias, el cáncer de colon es una de las más frecuentes y su etiología se ha asociado con cambios
genéticos y con diversos factores ambientales o epigenéticos. Caveolina-1 (Cav-1) es una proteína integral
de membrana de 21-24 kDa y componente principal de las caveolas e interactúa, a través de ciertos
dominios específicos (de andamiaje y tipo-WW), con un gran número de proteínas que participan en
distintas rutas de señalización, muchas de ellas involucradas en proliferación celular. Debido a que la
interacción de estas proteínas con Cav-1 generalmente conduce a su inactivación, se ha sugerido que
caveolina-1 funcionaría como un supresor de tumores.
Por otro lado, los niveles de proteína y actividad de COX-2 (una enzima que regula la síntesis de
prostaglandirias y que está asociada con resistencia a la apoptosis) están aumentados en células de cáncer
colorectal. Esto se ha descrito como un evento epigenético que promueve la formación de tumores. En
nuestro laboratorio, el análisis estructural de COX-2 determinó que esta proteína tendría algunos dominios
involucrados en la interacción con Cav-1 (CBD), así como resultados preliminares mostraron que su
actividad pero no su expresión es inhibida por la reexpresión de Cav-1 en células HT29. Por consiguiente,
la hipótesis de este proyecto fue que "La proteína supresora de tumores Cav-1 inhibe a COX-2 a través de
interacciones que involucran su dominio de andamiaje y/o su dominio tipo-WIV, favoreciendo así la
apoptosis en células de adenocarcinoma de colon".
Mediante el diseño de clones estables que expresan Cav-1 silvestre o mutantes en células de cáncer de
colon HT29, se demostró que el dominio tipo-WW está relacionado con la capacidad de Cav-1 de regular
negativamente a COX-2 a nivel post-transcripcional (ie, inhibición de su actividad enzimática). No obstante,
este efecto se observó sólo en la variante metastásica de cáncer colorectal, HT29(US), puesto que en
células embrionarias de riñón (HEK-293T), cáncer de mama (ZR75), cáncer colorectal (DLD1) e incluso en
la línea parental HT29(ATCC), se observó además una regulación negativa de la expresión de COX-2 a
nivel transcripcional (le, mRNA). La regulación negativa de la expresión de COX-2 por Cav-1 fue similar a lo
que ocurrió con la proteína anti-apoptótica Survivina, la cual junto con COX-2 constituye un blanco conocido
de la ruta canónica de señalización de Wnt, cuyo componente principal es la proteína coactivadora de la
transcripción -catenina. Se analizó entonces la posibilidad de que Cav-1 pudiera regular negativamente la
expresión de COX-2 y survivina por medio de la inhibición de la actividad transcripcionai de 3-catenina. En
efecto, nuestros resultados mostraron que Cav-1 regula negativamente la actividad transcripcional de 13catenina, lo cual conlleva a una disminución de los niveles de mRNA y proteína para COX-2 y survivina y,
consecuentemente, a una mayor predisposición de las células normales y cancerosas a la apoptosis
inducida por drogas quimioterapeúticas.
Los resultados anteriores nos llevaron a estudiar el rol anti-apoptótico de la proteína kínasa CK2, puesto
que había sido descrito que estabiliza a (3-catenina de la degradación proteasomal, es decir, actuaría
esencialmente de manera opuesta a Cav-1 Mediante el uso de inhibidores específicos, transfección con
vectores que expresan la subunidad catalítica CK2o (o mutante inactiva) y la inhibición de su expresión con
siRNAs específicos, se estableció que la proteína kinasa CK2 regula positivamente la actividad
transcripcional de 13-catenina y, consecuentemente, la expresión de sus genes blanco, como COX-2 y
survivina, los cuales están involucrados en promover sobrevida y resistencia a la apoptosis.
Por lo tanto, hemos definido un mecanismo de regulación de la sobrevida en células normales y
tumorales donde CK2 y caveolina-1 funcionan de manera opuesta. La proteína kinasa CK2 actúa como un
factor anti-apoptótico promoviendo la expresión de COX-2 y survivina por medio del aumento de la actividad
transcripcional de 13-catenina. En cambio, Cav-1 tiene un rol pro-apoptótico (consecuente con su labor
como supresor de tumores) disminuyendo la actividad transcripcional de 13-catenina y así la expresión de
sus genes blanco, y con la consiguiente disminución de la viabilidad celular.
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