Documento 823475

RESUMEN:
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) es un medio artificial para replicar una
secuencia corta y específica de ADN.
Sus componentes son:
+2 cebadores: También llamados oligonucleótidos. Tienen de 15 a 20 bases de DNA de
longitud y se sintetizan en un laboratorio.
+Una DNA Polimerasa: En forma termoestable. Deriva de la bacteria Thermus acuaticus(*)
+Nucleótidos libres: Se agregan en gran cantidad para la replicación de la secuencia
deseada
+DNA genómico: La prubea es muy sensible, por lo que puede usarse una cantidad muy
pequeña de DNA
El procedimiento de la PCR es el siguiente:
1.- Desnaturalización del DNA por calor a 95°
2.- Se agregan los cebadores, que se anillan a las bases complementarias a medida que
se enfría de 35° a 65°, uno en
3´de la primer hebra, y otro en 5´de la segunda cadena
3.- Se recalienta entre 70° y 75°, y se agregan los nucleótidos libres
4.- La polimerasa inicia la elongación
*A temperatura óptima, sintetizará hasta 1000 bases por minuto
*El número de copias que se obtiene es exponencial
*La fidelidad de la copia se puede comprobar por electroforesis
*La muestra es muy contaminable, por lo que el procedimiento debe realizarse en un lugar
limpio, separado y especializado
Los tipos de PCR son:
+Básica: Se divide en:
*Específica del alelo: Para identificar polimorfismos de una sola base
*Ensamblaje: Las cadenas largas de DNA se sintetizan artificialmente
*Asimétrica: Tiene preferencia por una cadena
*De colonia: Se utilizan microorganismos como bacterias para la replicación de la
secuencia
*Dependiente de helicasa: La temperatura permanece constante, la helicasa separa
el DNA
*Hot Start: Reduce la ampliación inespecífica del primer ciclo
*Cuantitativa: Permite medir las amplificaciones
+Anidada: El producto de una amplificación se usa para la siguiente copia
+In situ: A partir de secciones histológicas o células
+Multiplex: Utiliza más de un par de cebadores
+Transcriptasa inversa: (TI) El molde inicial no es un DNA, si no un RNA
+En tiempo real: Cuando el proceso se monitorea en vivo mediante inmunofluorescencia
¿Por qué la PCR es útil en el campo médico?:
-Sirve para genotipar especies patógenas
-Útil en la medición de carga viral en pacientes enfermos
-Test de rutina para la verificación de calidad de la sangre en transfusiones
-Detecta la presencia de mutaciones y enfermedades hereditarias
(*)La Thermus acuaticus es una bacteria termófila que puede continuar viviendo en
temperaturas que superan los 45°
RFLP
En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length
Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN
que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también
llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos.
Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia,
longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una
población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos
fragmentos de restricción.
La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares
de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en
ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede
mostrar la relación genética entre individuos.
Este es un método usado aún por varios laboratorios para la determinación
de paternidad por ADN. Sin embargo, es un método antiguo y - en la práctica
- es tecnológicamente obsoleto. Hoy en día el método más preciso y exacto
es el Método STR el cual es el usado por BioGenomica.
Descripción del método RFLP:
1) El ADN es extraído de los glóbulos blancos (leucocitos) de la sangre.
2) El ADN de la muestra es cortado en fragmentos, los que resultan ser de
tamaños diversos, precisamente porque estos tamaños dependen de la
diversidad y variabilidad genética de la muestra. El nombre RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms) significa que se usa la
propiedad de ciertas enzimas llamadas de restricción para cortar regiones
específicas del ADN que sucede que son muy variables (hipervariables) de
individuo a individuo (polimorfismo).
3) Los fragmentos de ADN son colocados en una superficie gelatinosa (gel
de agarosa) con el propósito de someterlos a una separación en base a su
diferente tamaño.
4) Se sumerge el gel en una solución conductora y luego se aplica una
corriente eléctrica a lo largo del gel. A este proceso se le llama
electroforesis.
5) Puesto que el gel (hecho de agarosa) tiene poros, los fragmentos más
pequeños de ADN migrarán hacia el ánodo (polo positivo) más rápidamente
que los fragmentos de ADN que sean más largos.
6) Los fragmentos de ADN así separados se transfieren luego por
adhesividad a una membrana de nylon. A este proceso se le conoce como
Southern blotting.
7) La membrana de nylon contiene ahora covalente y firmemente adheridos
los fragmentos de ADN en la misma posición en que migraron sobre el gel
durante el proceso de electroforesis.
8) Esta membrana de nylon es expuesta a sondas marcadas de ADN. Estas
sondas son pequeños fragmentos sintéticos de ADN de secuencia conocida
y que corresponden a zonas selectas de hipervariabilidad del ADN humano.
Las sondas suelen estar marcadas con isótopos radiactivos o con
sustancias fluorescentes (por tanto, emisoras de luz).
9) La membrana de nylon luego se coloca contra una película de rayos X (si
se usó sondas radiactivas) o fotográfica (si se usó sondas fluorescentes), la
cual luego es revelada.
10) El proceso se repite varias veces usando la misma membrana de nylon,
pero exponiéndola a diversas sondas. Cada sonda identifica áreas diferentes
del ADN (que mapean en regiones diferentes de diferentes cromosomas)
RESUMEN:
POLIMORFISMO
Polimorfismo genético es la presencia de múltiples alelos (variantes) de un locus (al
menos dos de ellos con frecuencias superiores al 1%)
Los cambios en un nucleótido o polimorfismo de nucleótido único son los más
frecuentes: SNP.
Constituyen la base de la variabilidad humana. Esta variación puede “estar
determinada por diferencias genéticas o por diferencias en las circunstancias en las que
cada individuo vive”. En efecto, algunas diferencias biológicas son de origen puramente
genético, sin que el ambiente pueda ejercer influencia sobre éstas: es el caso de los
grupos sanguíneos. Sin embargo, la mayoría de las diferencias perceptibles a simple vista
tienen a la vez un origen genético y ambiental: es el caso del tamaño o del peso de cada
individuo de una especie dada.
Aplicaciones de los polimorfismos:
Marcadores en el mapeo de genes
Diagnóstico presintomático y prenatal de enfermedades hereditarias
Detección de heterocigotos de riesgo
Pruebas de paternidad
Medicina forense
PREGUNTAS:
1.- ¿Cuál es la función de la PCR?
A) Obtener ratones transgénicos
B) Obtener copias de ARN ribosomal
C) Replicar una secuencia corta y específica de ADN de forma artificial
D) Recolectar genes para una genoteca
2.- Los siguientes son tipos de PCR básica:
A) In situ, multiplex, de ensamblaje
B) Transcriptasa inversa, anidada, en tiempo real
C) Específica del alelo, dependiente de helicasa, cuantitativa
D) Asimétrica, de colonia, hot start
E) C y D son correctas
3.- Diferencia entre la PCR normal y la dependiente de la helicasa
A) La normal se mantiene a temperatura constante y la dependiente de la helicasa
utiliza elevación de temperatura
B) En la normal, la temperatura se eleva para desnaturalizar el ADN, y en la
dependiente de helicasa, la temperatura se mantiene constante, mientras una
helicasa separa las hebras de ADN
C) Ninguna, son iguales, sólo que la normal es más lenta
D) La dependiente de la helicasa no utiliza nucleótidos libres
4.- Componentes de la PCR
A) DNA genómico (puede ser una cantidad pequeña)
B) Una gran cantidad de DNA, nucleótidos libres y 8 pares de cebadores
C) Dos cebadores, una DNA polimerasa, nucleótidos libres
D) A y C son correctas
E) Una helicasa y una bacteria (Thermus acuaticus o E. coli)
5.- ¿Dónde se colocan los cebadores?
A) Uno en la 3´ de la primer cadena, y otro en la 5´ de la segunda cadena
B) No importa, pueden colocarse en cualquier parte de la hebra
C) En las 3´ de cada cadena
D) En las 5´ de cada cadena
E) Ninguna de las anteriores
1)
a)
b)
c)
d)
Las enzimas de restricción son también conocidas como:
Endonucleasas de restricción
Protesas de restricción
Secuencias de restricción
Ninguna de las anteriores
2) La técnica RFLP se usa como:
a) marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a
contraer ciertas enfermedades genéticas
b) en ciencia forense
c) en pruebas de paternidad
d) todas las anteriores
3) una vez que los frragmentos de ADN se colocan en el gel de agarosa y se les
aplica corriente:
a) los fragmentos mas largos migran hacia el polo positivo más
rápidamente que los fragmentos de ADN que sean más largos.
b) los fragmentos más pequeños de ADN migrarán hacia el polo positivo más
rápidamente que los fragmentos de ADN que sean más largos.
c) los fragmentos cortos y largos migran por igual hacia el polo positivo y
posteriormente al negativo.
d) ninguna de las anteriores
1.
A)
B)
C)
D)
Es la variabilidad dentro de un fragmento de ADN:
Alelo
Fragmento
Gen
Polimorfismo
2. Es el conjunto de molecuas de DNA (muestras de tejidos o células) inmobilizadas
sobre una superficie sólida que nos permite la deteción de esas secuencias en las
muestras a investigar:
A) Alelo
B) Microarray
C) Variabilidad
D) Bases
3. Las siguientes son aplicaciones de polimorfismos genéticos ecepto:
A) Marcadores en el mapeo de genes
B) Diagnóstico presintomático y prenatal de enfermedades hereditarias
C)
D)
E)
F)
Detección de heterocigotos de riesgo
Pruebas de paternidad
Medicina forense
Detección de cambios en un nucleótido o polimorfismo de nucleótido único