SC94-100 Enfermedades producidas por

Proyecto Nº SC94-100
ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PATÓGENOS INTRACELULARES EN
LEGUMINOSAS DE IMPORTANCIA ECONOMICA EN ESPAÑA
Equipo Investigador:
Javier Romero Cano (Dr. I.A.)
María del Mar Babin Vich (Dra. C.B.)
Serafina Castro Robleda (Dra. Far.)
Carmen de Blas Beorlegui (Dra. C.B.)
Jesús Fresno Pérez (Dr. C.B.)
Gerardo Carazo Monge (I.T.A.)
Susana Llamas Espinosa (L.B.)
Equivalente de jornada completa: 2,90
Centro de Investigación:
Centro de Investigación y Tecnología. (SGIT). INIA.
Duración:
Enero 1994 - Diciembre 1997
Coste:
Miles de pesetas: 14.527
Fianciación INIA 100%
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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS
Las leguminosas de grano (judías, lentejas guisantes, garbanzos, habas) son un cultivo
tradicional de los agrosistemas mediterráneos. Constituyen una fuente importante de proteínas
para la dieta humana y ganadera, y son un factor de fertilidad fundamental debido a la fijación
del nitrógeno en el suelo, por lo que forman parte en la rotación de cultivos. España es uno de
los mayores productores de la Unión Europea, ya que nuestro en nuestro país se siembran
anualmente más de cien mil hectáreas de judías y garbanzos y alrededor de cincuenta mil
hectáreas de lentejas, guisantes y habas, constituyendo cultivos importantes en zonas de
secano: Castilla y León, Castilla-La Mancha, Andalucía y Extremadura y con el desarrollo de
la industria de envasaso y congelación su cultivo tiende a incrementarse en zonas de
irrigación: Albacete, Antequera y Badajoz. En Galicia, Asturias, Cantabria y País Vasco el
cultivo de estas leguminosas tiende a aumentar como una alternativa a la disminución de la
cabaña lechera.
Una de las limitaciones más serias a la producción de las leguminosas de grano son las
enfermedades, especialmente las producidas por parásitos intracelulares: virus, viroides y
fitoplasmas. Entre ellos los potyvirus del mosaico común de la judía (BCMV) y del mosaico
común necrótico de la judía (BCMNV) que son los más extendidos en los cultivares
españoles, y estudios previos han demostrado la presencia de estos virus en la práctica
totalidad de las variedades de judía ensayadas, por lo que el rendimiento es menor poniendo
en peligro la continuidad del cultivo y el riesgo de la pérdida de variedades de alubia de
reconocida calidad culinaria como es en el País Vasco la “gernikesa”, las judías con
denominación de origen del Barco de Avila o la judía verde “garrafal de oro” en Almería.
Se han descrito más de una docena de virus afectando a las leguminosas de grano. Los
problemas más importantes surgen de los virus que se trasmiten por semilla que constituyen
focos primarios de infección que son posteriormente dispersados por otros vectores, en
muchos casos insectos (pulgones, trips y mosca blanca). Por otro lado las semillas infectadas
son vehículos de dispersión del virus a largas distancias.
Frente a esta perspectiva la lucha contra estas enfermedades hay que enfocarla hacia la
eliminación del inóculo primario (uso de semillas libres de virus, eficaz control de insectos
etc.) y la utilización de genes de resistencia o tolerancia a estos patógenos. Para estos dos
medios de lucha es necesario en primer lugar conocer los principales patógenos, sus
propiedades y las cepas presentes en la geografía española, así como una evaluación de los
daños económicos que ocasionan y en segundo lugar contar con métodos de diagnóstico
rápidos, sensibles, específicos, fáciles de interpretar y que no presenten problemas para la
salud del personal, así como poner a punto métodos eficaces de seguimiento y análisis de los
genes de resistencia, naturales o artificiales, que se pretende incorporar en variedades
españolas de interés agronómico. Una parte importante del desarrollo de nuevos métodos
para la detección de parásitos intracelulares será dedicada a su detección en las semillas, para
lo cual la técnica altamente sensible de la amplificación enzimática de los ácidos nucleicos
por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) parece ser la más adecuada. Otra estrategia
a seguir es aplicar los resultados de la caracterización de las cepas de los potyvirus de la judía
para diseñar un vector que lleve el gen de la proteína de la capsida de este virus con el cual se
transformarían plantas de Phaseolus vulgaris a fin de obtener resistencia a esta enfermedad.
Los objetivos propuestos en el proyecto fueron:
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a) Detectar e identificar los virus, viroides y fitoplasmas que infectan variedades
españolas de judías, garbanzos, lentejas, guisantes y habas.
b) Incorporación de resistencia a BCMV mediante transformación de plantas.
c) Evaluación de las pérdidas económicas que ocasionan las virosis en judía.
d) Detección de patógenos intracelulares en semillas.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos en este proyecto según los objetivos propuestos fueron:
1. Detectar e identificar los virus, viroides y fitoplasmas que infectan variedades españolas
de judías, garbanzos, lentejas, guisantes y habas.
− Hemos completado el mapa fitopatológico de las principales virosis que afectan a
los cultivos de las leguminosas de grano en España.
− Hemos continuado con la caracterización biológica y molecular de los principales
patógenos: Potyvirus de la judía (BCMV, BCMNV, BYMV), marchitez del haba
(BBWV).
− Se ha identificado por primera vez en España el virus del amarilleamiento
necrótico del haba (FBNYV) y un fitoplasma en el mismo cultivo.
− Se ha continuado con el estudio y caracterización de los RNAs defectivos
interferentes del virus del moteado del haba (BBMV), habiendo descrito los
efectos de las secuencias terminales, su tamaño y su capacidad codificadora en la
acumulación de los RNAs defectivos interferentes en planta.
2. Incorporación de resistencia a BCMV mediante transformación de plantas.
− Se han clonado los genes de la proteína de la capsida del BCMV y BCMNV en
plasmidos de expresión pEt-11.
− Se han preparado plantas transgénicas de Nicotiana tabacum con diversas
construcciones de RNAs defectivos interferentes del BBMV, para evaluar la
resistencia frente a ataques virales.
3. Evaluación de las pérdidas económicas que ocasionan las virosis en judía.
− Se ha realizado la propagación en ambientes controlados de semillas de judía
libres de virus de la variedad Bontiful.
− Se ha analizado él % de virus presentes en semillas de agricultores de León y
Valladolid, para estimar él % de infección inicial en un campo de judía.
− Se ha evaluado la dispersión de la enfermedad en parcelas de agricultores en León
y Valladolid.
4. Detección de patógenos intracelulares en semillas.− Se han desarrollado métodos de detección de virus y fitoplasmas basados en PCR
y su posterior análisis mediante enzimas de restricción para estudiar variabilidad y
clasificación.
− Se han ensayado diversas sondas DNA y RNA marcadas con dioxigenina y
reveladas con luminiscencia en hibridaciones moleculares no radioactivas para la
detección de virus.
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INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA
PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES
PROPORCIONADA
POR
EL
En el primer objetivo de este proyecto con la identificación de los virus que están produciendo
síntomas de enfermedad, hemos completado el mapa fitopatológico de las principales virosis
y fitoplasmosis que afectan los cultivos de las leguminosas de grano en España. De esta
manera hemos podido identificar la presencia de los potyvirus: mosaico común de la judía (
bean common mosaic, BCMV), mosaico común necrótico de la judía ( Bean common mosaic
necrotic BCMNV) y amarilleamiento de la judía ( bean yellow mosaic, BYMV); el
cucumovirus mosaico del pepino (cucumber mosaic, CMV); el fabavirus marchitez del haba
(Broad bean wilt, BBWV); el alfamovirus mosaico de la alfalfa (alfalfa mosaic, AMV); El
tospovirus bronceado del tomate (tomato spotted wilt, TSWV) y fitoplasmas en judías. Los
luteovirus enrollado de la judía ( Bean leaf roll, BLRV)y amarillez de la remolacha del oeste
(Beet western yellows, BWYV), el cucumovirus mosaico del pepino (CMV), el tospovirus
bronceado del tomate ( Tomato spotted wilt, TSWV) y el potyvirus amarilleamiento de la
judía ( bean yellow mosaic, BYMV); en haba, garbanzos y lenteja. A este grupo de virus
habría que añadir la presencia en España del virus del amarilleamiento necrótico del haba
(faba bean yellow necrotic virus, FBYNV), virus DNA monocatenario transmitido por
pulgones que no ha sido todavía clasificado en ningún grupo por el comité Internacional de
taxonomía de virus. Este patógeno constituye el principal problema fitopatológico de los
cultivos de haba en los países del Norte de África y por lo tanto se convierte en un peligro
potencial para los cultivos españoles, sobre todo para los de la zona de Murcia donde han sido
detectados por la primera vez en nuestro País. Igualmente hemos detectado la presencia de un
fitoplasma afectando el haba en una de las nuevas zonas de cultivo de esta leguminosa como
es el valle de Antequera en Málaga. El conocimiento de la distribución de las principales
enfermedades intracelulares de las leguminosas de grano, nos permitirá establecer medidas
culturales de control sobre los factores de dispersión como pueden ser las semillas o sus
insectos vectores.
Para poder obtener un mejor conocimiento del ciclo de vida de estos patógenos intracelulares
durante este proyecto hemos iniciado la caracterización biológica y molecular de los potyvirus
de judía (BCMV, BCMNV y BYMV) y del virus de la marchitez del haba (BBWV), para
obtener información sobre su modo de transmisión por semilla, su dispersión en la población
y su identidad, y para producir anticuerpos específicos capaces de detectar estos virus y
diferenciarlos de otras razas presentes en España.
En el estudio de caracterización de los RNAs defectivos interferentes (DI-RNAs) del
bromovirus del moteado del haba (broad bean mottle virus, BBMV), hemos encontrado que
no todos los huéspedes son capaces de replicar los DI-RNAs, así las especies del genero
Chenopodium : quinoa, amaranticolor y murale, Nicotiana occidentale, judía y guisantes
no replican los DI-RNAs, ni transmiten estas moléculas a otras plantas, actuando como
plantas “filtros”, fenómeno cuyo mecanismo estamos estudiando. En experimentos con
protoplastos hemos observado que estas moléculas se acumulan en las plantas “filtros” pero
su cantidad es 100 veces menor si las comparamos con su huésped natural el haba. De estos
resultados podemos concluir que existe una especificidad de huésped en la acumulación de las
DI-RNAs y que está en relación con la sintomatología inducida por el virus. Diversas
inoculaciones realizadas con RNAs y DI-RNAs homólogos y heterólogos de raza han
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demostrado que no existe especificidad de raza y que los DI-RNAs se multiplican y
encapsidan con el virus de su misma raza o razas diferentes, sin embargo si existe una
especificidad de DI-RNAs ya que cada raza sólo es capaz de inducir una sola molécula
delecionada que es la que prevalece y sé encapsida aunque varíen el tamaño y las secuencias
donde se producen las deleciones. A la vista de estos resultados y para estudiar el efecto
interferente o no de estas moléculas hemos preparado construcciones bajo el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor en el plásmido Ti de Agrobacterium de los DI-RNAs
naturales y artificiales con el codon de iniciación normal o mutagenizado. Estas
construcciones se están usando para preparar plantas transgénicas que expresen estos DIRNAs de forma constitutiva y poder examinar su posible papel interferente cuando se
inoculen con el virus auxiliar. Los resultados de estos experimentos nos indicarán el camino a
seguir en el posible uso de los DI-RNAs en el control de las virosis en las plantas cultivadas
En el segundo objetivo hemos clonado los genes de la proteína de la capsida del BCMV y
BCMNV, secuenciados en un proyecto anterior, en plasmidos de expresión pET-11 y
expresado las proteínas mediante su inducción por IPTG, análisis de “western blots” nos
demostró que la proteína obtenida correspondía con el peso molecular de la proteína de la
capsida de estos virus. Estas proteínas inducidas in vitro serán utilizadas para la producción de
anticuerpos poli y monoclonales que nos permitan la diferenciación de los dos virus de forma
sencilla y rutinaria por ELISA. Igualmente al no disponer de un sistema de regeneración in
vitro de plantas de judía, hemos iniciado los estudios de resistencia a virosis usando como
modelo el BBMV y como planta a transformar Nicotiana tabacum. Para este trabajo hemos
preparado plantas transgénicas de tabaco con diversas construcciones de DI-RNAs, las cuales
serán analizadas para evaluar su posible resistencia a la infección viral. Esta expresión de
RNAs defectivos interferentes constituye una nueva vía de control de las enfermedades
virales y es conveniente estudiar y elucidar su mecanismo antes de poder usarlo en plantas de
gran cultivo.
En el tercer objetivo de este proyecto hemos realizado dos clases de actividades, de un lado
nos hemos ocupado de la propagación de semillas de judía de la variedad bountiful en
habientes controlados con mallas antipulgones para obtener semilla con la garantía de libres
de virus. Este material nos servirá para la propagación de las diversas razas de los potyvirus
BCMV y BCMNV y para usarlo en ensayos de evaluación de las pérdidas económicas
ocasionadas por los ataques virales. Por otro lado hemos analizado en el laboratorio mediante
ELISA y RT-PCR él % de semillas infectadas en lotes de agricultores de León y Valladolid,
esta evaluación nos sirve para conocer de una manera real él % de infección inicial en un
campo de judía en el cual realizamos observaciones epidemiológicas tendientes a saber la
dispersión de la enfermedad en una determinada región y variedad. Todos estos datos están
siendo analizados mediante programas informáticos de epidemiología de enfermedades
virales.
Finalmente en el cuarto objetivo había que destacar los esfuerzos realizados para poner apunto
métodos de detección de patógenos intracelulares en las semillas de las leguminosas de grano,
en este aspecto hemos desarrollado técnicas de ELISA e IC-RT-PCR para detectar los
potyvirus de la judía, que se transmiten en porcentajes elevados por las semillas, en este
mismo trabajo hemos analizado distintas formas de homogeneizar el material vegetal,
encontrando que tratamientos simples como poner en remojo las semillas horas antes de
homogeneizarlas, aumenta la sensibilidad de los métodos usados en la detección de las virosis
y hace mas fácil el tratamiento de las semillas. En otro orden de cosas también hemos estado
experimentando en el uso de las Hibridaciones moleculares para la detección de estos virus en
semillas. En estos experimentos se ha utilizado sondas RNA y DNA marcadas con
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Dioxigenina y reveladas con quimiluminioscencia, como una alternativa para ser usado en
análisis de rutina. Estas Hibridaciones a pesar de ser fáciles de realizar necesitan de personal
con cierta preparación en el manejo de los ácidos nucleicos y las técnicas de la Biología
Molecular. Estos métodos puestos a punto en este objetivo podrán ser empleados en ensayos
de rutina en el análisis de las semillas de las leguminosas de grano que se vayan a sembrar en
las diversas áreas de la geografía española y evitar así la posible introducción de nuevas razas
del virus en regiones donde no existe; esta medida es muy importante porque la transmisión
de las virosis alcanza altos porcentajes por semilla y existe una amplia circulación de este
material no sólo entre regiones de nuestro país, sino muchas veces entre diferentes países y
hasta continentes.
Otro punto importante en este desarrollo de nuevos métodos de detección de enfermedades ha
sido el esfuerzo realizado a mejorar los métodos usados en la detección de fitoplasmas,
Empleando la homología que presentan todos los miembros de este grupo de patógenos en el
gen de 16SRNA se han designado una serie de cebadores específicos que permiten amplificar
parte de este gen por PCR y su posterior análisis mediante enzimas de restricción dando de
esta manera poliformismos que han sido usados para clasificar a los fitoplasmas en grupos.
En las leguminosas de grano los fitoplasmas encontrados pertenecen al grupo del stolbur y se
están haciendo experimentos tendientes a analizar mediante secuencia si hay diferencias en
los fitoplasmas encontrados en los diversos cultivos y regiones. Estos métodos una vez mas
pueden ser utilizados por los organismos de la Protección de los Vegetales para determinar la
presencia o ausencia de estos patógenos en las plantas que muestren síntomas sospechosos de
tener estas enfermedades.
FORMACION DE PERSONAL
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Margarita Sáiz Zalabardo, titulada “El virus
del mosaico común de la judía. Caracterización biológica, serológica y molecular de aislados
españoles”, en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid.
1994. Apto “cum laude”.
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de David Martínez Herrera, titulada “Variabilidad
en la interacción de patógenos intracelulares (virus y viroides) con Arabidopsis thailiana (L)
Heynh”, en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid. 1994.
Apto “cum laude”.
PUBLICACIONES
Artículos científicos
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del virus del mosaico del pepino (CMV) mediante ELISA utilizando anticuerpos comerciales.
Investigación Agraria Producción y Protección Vegetales, 9. 145-151.
De Blas C., Borja, M.J., Saiz, M., Romero, J. 1994. Broad Spectrum Detection of Cucumber
Mosaic Virus (CMV) Using The Polymerase Chain Reaction. Journal of Phytopathology,
141. 323-329.
Castro S., Sáiz, M., Romero, J. 1994. Mycoplasma-like organisms associated with Vicia
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Sáiz M., Dopazo, J., Castro, S., Romero, J. 1994. Evolutionary relationships among bean
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Libros
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(CIAT).Serie o colección: Phaseolus Beans Advanced Biotechnology Research Network.
Ed.: W. Roca, J. Mayer, M. Pastor-Corrales, J. Tohme. 283-291.
De Blas C., Sáiz M., Nolasco G. 1994. Detection of viruses affecting common bean by a
method combining inmunocapture and PCR amplification. Editorial: Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT). Serie o colección: Phaseolus Beans Advanced Biotechnology
Research Network. Ed.: W. Roca, J. Mayer, M. Pastor-Corrales, J. Tohme. 292-295.
De Blas C., Zabalgogeazcoa I., Castro S,, Romero J. 1996. Técnicas de detección de ácidos
nucleicos virales. Editorial: M.V. Phytoma-España S.L. Serie o colección: Patología Vegetal.
Ed.: G. Llacer, M.M. López, A. Trapero, A. Bello. Número de Volúmenes: 2. 255-274.
7
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de la judía en España Editorial: Universidad de Santiago de Compostela. Serie o colección:
Situación actual y perspectivas del cultivo de la judía. Ed.: Antonio de Ron. 82-83.
Patentes
Autores: Gustavo Nolasco, Carmen de Blas, David Martínez, Florentina Sánchez, Javier
Romero, Fernando Ponz y Vicente Torres. Denominación : Procedimiento para la tipificación
molecular de patógenos virales con genoma RNA y de patógenos subvirales mediante síntesis
aleatoria de cDNA. Registrado en: España. Fecha: 16 Agosto 1996. Situación actual: En
explotación.
Autores: Gustavo Nolasco, David Martínez, Florentina Sánchez, Javier Romero, Fernando
Ponz y Vicente Torres. Denominación: Procedimiento para analizar estructuralmente el
genoma de patógenos virales y subvirales.Registrado en: Europa. Fecha: 20 Diciembre 1994.
Situación actual: En explotación.
Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios
Sáiz M., Castro, S., De Blas, C., Carazo, G., Fresno, J., Romero, J. Epidemiología del virus
del mosaico común de la judía (BCMV) en España y uso de la amplificación enzimática
(PCR) en la detección y caracterización de serotipos. VII Congreso Latinoamericano de
Fitopatología. Santiago de Chile (Chile). Enero, 1994.
Castro S., Carazo G., Romero J. Mycoplasm-like organisms associated with Phaseolus
vulgaris". 10th International Congress of International Organization for Mycoplasmology.
Bordeaux (Francia). Julio, 1994.
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mosaico común de la judía (BCMV) en semilla mediante amplificación enzimática. VII
Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología. Sitges, Barcelona (España). Octubre,
1994.
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Fitopatología. Sitges, Barcelona (España). Octubre, 1994.
Fresno J., Carazo G., Castro S., De Blas C., Babin M., Romero J. Detección e identificación
de virosis que infectan lenteja en la machuela. VII Congreso de la Sociedad Española de
Fitopatología. Sitges, Barcelona (España). Octubre, 1994.
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Congreso Latinoamericano de Fitopatología. Mérida (Venezuela). Octubre, 1995.
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Congreso Latinoamericano de Fitopatología. Mérida (Venezuela). Octubre, 1995.
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Septiembre, 1995.
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