Cribado ampliado por Espectrometría de masas en tándem

Cribado ampliado por
espectrometría de masas en
tandem
Curso: Cribado Neonatal de enfermedades
endocrino-metabólicas
José Mª Egea Mellado
H.U. Virgen de la Arrixaca
Avances en cribado
neonatal
a) Mayor conocimiento de las causas y
tratamiento de las enfermedades genéticas
b) Desarrollo de tecnologías que se pueden
aplicar al cribado neonatal è plataformas
multiplex
c) Desarrollo de estrategias de segundo nivel
è mejoran el valor predictivo positivo del
cribado
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1
Plataformas multiplex
Conjunto
de
tecnologías
que
permiten
identificar múltiples analitos a partir de un
único proceso analítico è cribado de múltiples
enfermedades de forma simultánea
Un test à una enfermedad è un test à múltiples enfermedades
Ejemplos
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Chips Microarray DNA
Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)
Espectrometría de masas
en tandem (MS/MS)
Aplicaciones para el análisis de moléculas en un
amplio rango de pesos moleculares:
• Bajo Pm (<1 kDa) è drogas, vitaminas,
pesticidas, metabolitos intermediarios, etc…
• Pm 1-10 kDa è polipéptidos sintéticos y
polisacáridos
• Elevado Pm (>10 kDa) è polipéptidos,
proteínas, oligonucleótidos y polisacáridos
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2
¿Qué es la espectrometría
de masas?
Es una técnica en la que se mide la relación
masa/carga (m/z) de los componentes de una
muestra, los cuales se encuentran en fase gaseosa
y han adquirido una carga (+ o -).
El espectro de masas de un compuesto se obtiene
mediante la separación de los distintos iones en
que se fragmenta en función de su m/z è fines
identificativos.
Eligiendo los iones adecuados de un compuesto
determinado, se puede llegar a su cuantificación.
Esquema de un
espectrómetro de masas
Vacío
10-5 – 10-8 mbar
Introducción
de muestra
Fuente
de iones
Analizador
de masas
Detector
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Fuente de iones
Ionización dura
Ionización por impacto electrónico (EI)
Ionización blanda
Ionización química (CI)
Ionización química por desorción (DCI)
Ionización por bombardeo de átomos rápidos (FAB)
Ionización/desorción de la matriz asistida por láser
(MALDI)
Ionización química
Ionización a presión atmosférica (API)
Es una ionización muy blanda en la que no se
produce fragmentación de la molécula.
Dos tipos de API:
Ionización por ElectroSpray (ESI)
Ionización química a presión atmosférica
(APCI)
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Ionización por
ElectroSpray (ESI)
Ionización por
ElectroSpray (ESI)
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5
Ionización por
ElectroSpray (ESI)
Ionización por
ElectroSpray (ESI)
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6
Ionización química a
presión atmosférica (APCI)
Video ionizacion ESI
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7
Video ionización
blanda
Utilidad de los distintos
tipos de ionización
ESI è se usa preferentemente para compuestos que son:
ü Iónicos o
ü muy polares o
ü termolábiles o
ü con pesos moleculares > 1000 uma
APCI è se usa preferentemente para compuestos que no
son muy polares.
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Analizadores de
masas
•Analizadores de sector magnético
•Filtro de masas cuadrupolo
•Analizadores de trampa de iones
•Analizadores de tiempo de vuelo (TOF)
•Analizadores de resonancia de ion
ciclotrón (ICR)
Filtro de masas
quadrupolo
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9
Funcionamiento del
cuadrupolo
Quadrupolo
Modos de trabajo:
• Full Scan
• Selected Ion Monitoring (SIM)
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Espectrometría de masas
en tándem (MS/MS)
Técnica muy rápida
Posee una gran sensibilidad ( RIA)
Se basa en una ionización blanda (ESI, APCI)
Analizador de masas è triple cuadrupolo
Gran versatilidad:
Genómica
Proteómica
Desórdenes metabólicos
Espectrómetro de
MS/MS
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11
Triple quadrupolo
Modos de trabajo:
•Product Ion Scan à (SIM – Scan)
•Precursor Ion Scan à (Scan – SIM)
Proporciona información
estructural
•Neutral Loss Scan (NLS) à (Scan – Scan)
•Multiple Reaction Monitoring (MRM) è
análisis cuantitativo
Video triple
cuadrupolo
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CRIBADO NEONATAL
AMPLIADO
Metabolitos detectados
por MS/MS en cribado
neonatal
Sangre impregnada en papel (ionización modo +):
Aminoácidos.
Acilcarnitinas.
Orina impregnada en papel (ionización modo -):
Ácidos orgánicos.
Acilglicinas.
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13
Aminoácidos
(Modo NLS; m/z = 102)
*(MRM)
Fenilalanina (Phe)
Leucina+Isoleucina (Leu/Ile)
Valina (Val)
Tirosina (Tyr)
Citrulina (Cit)
Metionina (Met)
Arginina (Arg)
Glicina (Gly)
Ornintina (Orn)
Alanina (Ala)
Butilación de los
aminoácidos
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14
Modo de “Perdida de neutros”
(Neutral Loss Scan – NLS)
Q1
Q2
Celda de colisión
Q3
m/z - 102
Scan
Scan
Pérdida de neutros de los
aminoácidos butilados
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15
Fragmentación en celda
de colisión (NLS)
Modo de “Multiple Reaction
Monitoring” (MRM)
Q1
SIM ion
Precursor
mass fixed
Q2
Celda de colisión
Fragmentation
in the gas cell
(CAD)
Q3
SIM
Product
ion fixed
producing a trace of
intensity for this ion.
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16
Leu
Ala
Phe
Tyr
Aminoacidopatías
detectadas por MS/MS
Phe è
Leu/Ile è
Tyr è
Cit è
Met è
Gly è
Arg è
Fenilcetonuria (PKU)
Hiperfenilalaninemias (H-PHE)
Enfermedad del jarabe de arce (MSUD)
Tirosinemia (TYR-I, TYR-II, TYR-III)
Citrulinemia (CIT-I, CIT-II)
Aciduria argininosuccínica (ASA)
Homocistinuria (HCY)
Hipermetioninemia (H-MET)
Hiperglicinemia no cetósica (NKHG)
Argininemia (ARG)
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17
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18
Acilcarnitinas
Acilcarnitinas
(Modo Precursor Ion Scan; m/z = 85)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Carnitina libre (Co)
Acetilcarnitina (C2)
Propionilcarnitina (C3)
Malonilcarnitina (C3DC)
Butirilcarnitina (C4)
Isovalerilcarnitina (C5)
Tiglilcarnitina (C5:1)
Glutarilcarnitina (C5DC)
3-OH-isovalerilcarnitina (C5OH)
Hexanoilcarnitina (C6)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Octanoilcarnitina (C8)
Decanoilcarnitina (C10)
Decenoilcarnitina (C10:1)
Dodecanoilcarnitina (C12)
Dodecenoilcarnitina (C12:1)
Miristoilcarnitina (C14)
Tetradecenoilcarnitina (C14:1)
Palmitoilcarnitina (C16)
3-OH-palmitoilcarnitina
(C16OH)
• Oleilcarnitina (C18:1)
• 3-OH-oleilcarnitina (C18:1OH)
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Butilación de las
acilcarnitinas
Modo de “Precursor Ion
Scan” (PS)
Q1
Q2
Q3
Celda de colision
m/z=85
m 2+
m 1+
SIM
Scan
m 1+
m1
+
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20
Fragmentacion de las
acilcarnitinas
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Organicoacidurias
Acidemia isovalérica (IVA)
Deficiencia de la 3-metilcrotonil-CoA carboxilasa (3-MCC)
Deficiencia de la 3-metilglutaconil hidratasa (MGA)
Deficiencia de la 3-OH-3-metilglutaril-CoA liasa (HMG)
Leucina
Deficiencia de la 2-metilbutiril-CoA DH (2-MBG)
Deficiencia de la 2-metil-3-OH-butiril-CoA DH (MHBD)
Deficiencia de la â-cetotiolasa (BKT)
Deficiencia de la isobutiril-CoA DH (IBDH)
Isoleucina
Valina
Acidemia propiónica (PA)
Acidemia metilmalónica (MMA)
Ile + Val
Acidemia glutárica tipo I (GA I)
Lisina + triptófano
Deficiencia de la holocarboxilasa sintasa
Leucina
Isoleucina
á-cetoisocaproato
Valina
2-ceto-3-metilvalerato
Isovaleril-CoA
2-cetoisovalerato
2-metilbutiril-CoA
Isobutiril-CoA
2-MBG
IVA
3-metilcrotonil-CoA
IBDH
tiglil-CoA
Metacrilil-CoA
3MCC
3-metilglutaconil-CoA
2-metil-3-OH-butiril-CoA
MGA
3-OH-3-metilglutaril-CoA
2-metilacetoacetil-CoA
HMG
Acetoacetato
3-OH-isobutiril-CoA
MHBD
BKT
Acetil-CoA
3-OH-isobutirato
semialdehido metilmalónico
Propionil-CoA
PA
Metilmalonil-CoA
MMA
Succinil-CoA
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Acilcarnitinas
asociadas
C3 è
acidemia propiónica (PA)
acidemia metilmalónica (MMA)
C4 è
def. isobutiril-CoA DH (IBDH)
C5 è
acidemia isovalérica (IVA)
def. 2-metilbutiril-CoA DH (2-MBG)
C5-OH è
def. 3-metilcrotonil-CoA carboxilasa (3-MCC)
def 3-metilglutaconil hidratasa (MGA)
def. 3-OH-3metilglutaril-CoA liasa (HMG) à (C6DC)
def. 2-metil-3-OH-butiril-CoA DH (MHBD)
def. â-cetotiolasa (BKT) à (C5:1)
acidemia glutárica tipo 1 (GA1)
C5-DC è
Leucina
á-cetoisocaproato
Isoleucina
Valina
2-ceto-3-metilvalerato
C5
Isovaleril-CoA
2-cetoisovalerato
C4
2-metilbutiril-CoA
Isobutiril-CoA
2-MBG
IVA
3-metilcrotonil-CoA
IBDH
tiglil-CoA
Metacrilil-CoA
3MCC
3-metilglutaconil-CoA
2-metil-3-OH-butiril-CoA
MGA
3-OH-3-metilglutaril-CoA
HMG
Acetoacetato
3-OH-isobutiril-CoA
MHBD
2-metilacetoacetil-CoA
C5C5-OH
Acetil-CoA
BKT
3-OH-isobutirato
semialdehido metilmalónico
Propionil-CoA
PA
Metilmalonil-CoA
C3
MMA
Succinil-CoA
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23
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24
Defectos en el transporte
de los ác. grasos dentro
de la mitocondria
• Deficiencia en la captación celular de carnitina
(CUD)
• Defecto de la carnitina-palmitoiltransferasa I
(CPT-I)
• Defecto de la translocasa (CACT)
• Defecto de la carnitina-palmitoiltrasnferasa II
(CPT-II)
Acilcarnitinas asociadas a
defectos en el transporte de los
ác. grasos dentro de la
mitocondria
CUD è Carnitina libre baja à
C0
CPT I è
C0
C16, C18, C18:1, C18:2
CPT II è C0
C14, C16, C18, C18:1, C18:2
CACT è
C16, C18, C18:1, C18:2
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â-oxidación de los ácidos
grasos de cadena larga
Especificidad de la acilCoA deshidrogenasa
longitud de la cadena
VLCAD
14 – 20
LCAD
12 – 18
MCAD
6 – 12
SCAD
<6
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Defectos de la âoxidación
• Def. de la Acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta è
SCAD
• Def. de la Acil-CoA deshidrogenasa de cadena media è
MCAD
• Def. de la Acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga
è VLCAD
• Def. de la 3-OH-acil-CoA deshidrogenasa de cadena
corta è SCHAD
• Def. de la 3-OH-acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga
è LCHAD
• Def. de la proteína trifuncional è TFP
• Def múltiple de acil-CoA deshidrogenasa o acidemia
glutárica tipo 2 è MAD o GA2
Acilcarnitinas asociadas a
defectos de la â-oxidación
SCAD è C4
SCHAD è C4-OH
MCAD è C6, C8, C10, C10:1
VLCAD è C12, C12:1, C14, C14:1
LCHAD/TFP è C16-OH, C16:1-OH, C18-OH,
C18:1-OH
GA2 è C4, C5, C6, C8, C10, C10:1, C5-DC,
C12, C12:1, C14:1, C16
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27
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Aspectos a tener en
cuenta
En un solo ensayo se tienen en cuenta muchos analitos:
10 Aminoácidos
21 Acilcarnitinas
La probabilidad de que alguno de ellos esté fuera del
rango referencia es grande è
habría un gran número de resultados positivos è
sobrecarga de trabajo del laboratorio en confirmación
de resultados è
generación de stres en las familias de los niños con
resultado positivo y sometido a seguimiento analítico è
gasto elevado en pruebas adicionales de confirmación de
la enfermedad
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29
Acciones a realizar
1.
Establecimiento de los analitos con mayor
importancia en el diagnóstico de las
enfermedades objeto del cribado.
2. Establecimiento de puntos de corte y
algoritmos de diagnóstico adecuados para
disminuir el número de resultados positivos
Se mejora el valor predictivo positivo de la
prueba de cribado
¿Qué analitos son
importantes en el perfil de
acilcarnitinas?
• Analitos primarios è establecen los perfiles
presuntamente positivos
• Analitos secundarios è en combinación con los
primarios se asigna al perfil un riesgo de ser un
verdadero positivo
• Relaciones de analitos è asignan al pefil un
riesgo añadido de ser un verdadero positivo
Elevaciones aisladas de analitos secundarios o
de las relaciones no son tenidas en cuenta en la
valoración de perfil positivo
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30
Analitos primarios en el
perfil de acilcarnitinas
C0 è CUD
C0 è CPT I
C3 è PA, MMA
C4 è IBDH, SCAD
C4-OH è SCHAD
C5 è IVA, 2-MBG
C5-OH è 3-MCC,
MGA, HMG, MHBD,
BKT
C3-DC è MAL
C5-DC è GA1
C8 è MCAD
C14:1 è VLCAD
C16 è CPT II, CACT
C16-OH è LCHAD/TFP
Analitos primarios,
secundarios y relaciones
PKU è
Phe + Phe/Tyr
HCY è
Met + Met/Phe
PA è
C3 + C3/C2
MCAD è
C8 + (C10, C10:1) + C8/C10
CPT 1 è
C0 + (C16, C18, C18:1, C18:2) +
C0/(C16+C18)
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Establecimiento de los
puntos de cut-off
Nr of individuals
‘Sana’
enferma
+2SD
Falsos
Negativos
Falsos
positivos
El punto de cut-off debería encontrarse por encima del p99 de
población sana y por debajo del p5 de la población enferma
Puntos de cut-off
(aspectos a tener en cuenta)
Cada laboratorio debe establecer sus propios puntos de
cut-off referidos a la población normal objeto de
cribado.
Muchas de las enfermedades cribadas tiene una baja
prevalencia en la población cribada è se necesita mucho
tiempo para tener en número de casos necesarios para
establecer puntos de cut-off adecuados.
Proyecto internacional de colaboración Región4
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32
Alteraciones metabólicas
detectadas en la Región de Murcia
Recién nacidos analizados mediante MS-MS: 24.937
•
•
•
•
•
Hiperfenilalaninemias è 2
PKU è 1
MCAD è 1
Aciduria metilmalónica è 2 + (1+1)
Déficit múltiple de las deshidrogenasas è
1?
Incidencia de alteración metabólica: 1:3500 r.n.
Conclusiones (1)
La aplicación de la MS/MS a los Programas de
Cribado Neonatal supone un cambio filosofía:
• un test à múltiples enfermedades.
• Valoración de perfiles de analitos y no valores
aislados.
• Aplicación de pruebas de segundo nivel que mejoran
notablemente el VPP del cribado.
• El Cribabo Neonatal Ampliado permite conocimiento
real de la prevalencia de muchas enfermedades que
hasta ahora se detectaban a partir de las
manifestaciones clínicas
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Conclusiones (2)
• Establecimiento de nuevos fenotipos asintomáticos de
algunas enfermedades.
• Detección de enfermedades que, aunque no cumplen los
criterios clásicos de inclusión en programas de cribado,
su detección precoz pueden evitar a las familias una
“odisea” diagnóstica posterior de la enfermedad de su
hijo.
• Mejor conocimiento de la historia natural de algunas
enfermedades raras que permitirá en el futuro poder
establecer tratamiento más efectivos.
Laboratorio de
Metabolopatías
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34
Muchas gracias
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