modificación del contenido de glutatión y su efecto en la expresión y

Profesor Patrocinante
Dra. Ilona I. Concha
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
Profesor Co-Patrocinante
Dra. Maite A. Castro
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
MODIFICACIÓN DEL CONTENIDO DE GLUTATIÓN Y SU EFECTO EN LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE VITAMINA C EN CÉLULAS DE SERTOLI
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
HÉCTOR ENRIQUE MANCILLA CHÁVEZ
VALDIVIA – CHILE
2010
Dedicado a mis padres y
Hermanas Patty y Andrea
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a la Dra. Ilona Concha por darme la oportunidad de entrar a su
laboratorio, por la confianza que depositó en mí y por guiarme durante todo este
proceso educativo. Muchas gracias por el apoyo, la increíble paciencia y su buena
voluntad. También quisiera agradecer a la Dra. Maite Castro y a la Dra. Constanza
Angulo por su ayuda y consejos los cuales fueron de gran utilidad en mi formación
profesional.
A mis compañeros de laboratorio, por compartir sus conocimientos; la buena
disposición y compañerismo han sido fundamentales en este aprendizaje. Rodrigo,
Eduardo, Alex, Franz, Silvana, Felipe, Aníbal, Cristian, María Paz, Magda.
Quisiera agradecer al Dr. Juan Carlos Vera y a la Dra. Coralia Rivas por
permitirme ir a aprender metodologías relacionadas con mi tesis en su laboratorio del
Departamento de Fisiopatología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
de Concepción, después del incendio del 3 de Diciembre del 2007. Así mismo quisiera
agradecer al Dr. Juan Carlos Slebe por la disposición de su laboratorio para realizar
ciertos experimentos y al Dr. Joel Asenjo por su disposición y buena voluntad. Y por
último a todos los integrantes del Instituto de Bioquímica que de algún modo
participaron en mi formación académica.
Quiero agradecer especialmente a mi familia, a mis padres quienes siempre me
han brindado su confianza. Muchas gracias por apoyarme en todas la decisiones que
he tomado en mi vida y su inmensa paciencia. También agradecer a mis hermanas
Patty y Andrea, quienes han estado presentes en cada momento, gracias por estar
siempre presentes. A mi querida Tamara, gracias por tu amor, increíble paciencia y
compañía, te quiero mucho.
Esta tesis fue desarrollada en el laboratorio de Metabolismo Molecular,
perteneciente al Instituto de Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Universidad
Austral de Chile y fue financiada por FONDECYT 1060135, proyecto de responsabilidad
del Dra. Ilona Concha.
I ÍNDICE DE CONTENIDOS
Páginas
1.
RESUMEN
1
1.1.
SUMMARY
2
2.
INTRODUCCIÓN
3
2.1.
Glutatión
3
2.1.1.
Generalidades del glutatión
3
2.1.2.
Metabolismo del glutatión
8
2.1.3.
Modificación del glutatión intracelular
11
2.2.
Vitamina C
12
2.2.1.
Generalidades vitamina C
12
2.2.2.
Sistemas involucrados en el trasporte de la vitamina C
16
2.3.
Relación funcional entre el glutatión y la vitamina C
19
II 2.4.
Células de Sertoli y su papel en la espermatogénesis
25
2.5.
Glutatión, vitamina C y espermatogénesis
31
3.
MATERIALES Y MÉTODOS
37
3.1.
Materiales
37
3.1.1.
Reactivos químicos
37
3.1.2.
Materiales biológicos
39
3.1.3.
Instrumentos
39
3.2.
Métodos
40
3.2.1.
Cultivo de células de Sertoli 42GPA9
40
3.2.2.
Ensayo de viabilidad mediante azul de tripán
40
3.2.3.
Extracción de RNA
40
3.2.4.
Reacción en cadena de la polimerasa acoplada a transcripción
41
reversa (RT-PCR)
III 3.2.5.
Inmunohistoquímica
44
3.2.5.1. Cromógena
44
3.2.5.2. Inmunofluorescencia
45
3.2.6.
Inmunocitoquímica
47
3.2.7.
Extracción y cuantificación de proteínas totales
3.2.8.
Separación electroforética de proteínas
49
3.2.9.
Transferencia de proteínas a membranas de PVDF
49
3.2.10.
Análisis de Western blot
50
3.2.11.
Ensayos de transporte
51
3.2.12.
Modificación del contenido de glutatión
52
3.2.13.
Determinación de glutatión total
52
3.2.14.
Ensayo de TUNEL
53
3.2.15.
Análisis estadístico
54
48
IV 4.
RESULTADOS
55
4.1.
Trasportadores de ácido ascórbico en el epitelio seminífero
55
4.2.
Expresión y función de SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli
65
4.3.
Efecto del BSO sobre el epitelio seminífero
70
4.4.
Determinación del contenido de glutatión intracelular en células
88
de Sertoli 42GPA9
4.5.
Efecto de la ausencia de glutatión sobre la expresión y función
95
de los transportadores de AA en células de Sertoli
4.6.
Efecto del peróxido de hidrógeno sobre la viabilidad de las
100
células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión
5.
DISCUSIÓN
5.1.
Transportadores
103
de
ácido
ascórbico
se
expresan
diferencialmente en el túbulo seminífero durante el desarrollo de
la línea germinal masculina
104
V 5.2.
Las células de Sertoli como modelo para estudiar la relación
107
entre los transportadores de AA y el glutatión
5.3.
El efecto del BSO asociado a una disminución del contenido de
109
glutatión afecta la expresión y función de SVCT1
5.3.1.
Estudios in vivo
109
5.3.2.
Estudios in vitro
112
5.4.
Sensibilidad de las células de Sertoli 42GPA9 depletadas de
116
glutatión al peróxido de hidrógeno
6.
BIBLIOGRAFÍA
120
VI INDICE DE FIGURAS
Páginas
Figura 1.
Estructura del glutatión
5
Figura 2.
Ciclo redox del glutatión
6
Figura 3.
Ciclo γ-glutamil
9
Figura 4.
Oxidación de ácido ascórbico
13
Figura 5.
Biosíntesis de ácido ascórbico en mamíferos
15
Figura 6.
Reciclaje de la vitamina C
23
Figura 7.
Epitelio seminífero
29
Figura 8.
Localización de SVCT1 y del marcador de células de Sertoli,
57
WT1, durante el desarrollo del epitelio seminífero de rata
Figura 9.
Localización de SVCT2 y del marcador de células de Sertoli,
59
WT1, durante el desarrollo del epitelio seminífero de rata
Figura 10.
Inmunolocalización de SVCT1 y SVCT2 lo largo de todo el
túbulo seminífero de rata
63
VII Figura 11.
Funcionalidad de los transportadores de ácido ascórbico en
68
células de Sertoli
Figura 12.
Alteración del contenido de glutatión y su efecto en la
72
viabilidad celular en el epitelio seminífero de rata
Figura 13.
Expresión de SVCT1 en el epitelio seminífero de rata
75
depletado de glutatión
Figura 14.
Expresión de SVCT2 en el epitelio seminífero de rata
77
depletado de glutatión
Figura 15.
Expresión de GLUT3 en el epitelio seminífero de rata
80
depletado de glutatión
Figura 16.
Expresión de glicógeno sintasa en el epitelio seminífero de
83
rata depletado de glutatión
Figura 17.
Expresión de PTG en el epitelio seminífero de rata depletado
86
de glutatión
Figura 18.
Determinación del contenido de glutatión en células Sertoli
42GPA9
90
VIII Figura 19.
Modificación del contenido de glutatión en células de Sertoli
94
42GPA9
Figura 20.
Expresión de los transportadores de ácido ascórbico en
98
células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión
Figura 21.
Efecto del peróxido de hidrógeno en células
de Sertoli
101
Transportadores de vitamina C y el contenido de glutatión en
118
42GPA9 tratadas con BSO
Figura 22.
el epitelio seminífero de rata
IX INDICE DE TABLAS
Páginas
Tabla I.
Expresión de los transportadores de ácido deshidroascórbico
32
(GLUTs) en testículo
Tabla II.
Expresión de los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs) en
33
testículo
Tabla III
Contenido de glutatión y actividad de enzimas antioxidantes
dependientes de glutatión en testículo
33
X LISTA DE ABREVIATURAS
3α-HSD
: 3α-hidroxiesteroide deshidrogenasa
AA
: Ácido ascórbico
ASC
: Transportador de alanina-serina-cisteína
BHT
: Barrera hemato-testicular
BSA
: Albúmina de suero de bovino
BSO
: L-butionina-S,R-sulfoxamida
Cit B
: Citocalasina B
Cit E
: Citocalasina E
DEM
: Dietil maleato
DHA
: Ácido deshidroascórbico
DHT
: Dihidrotestosterona
DMEN
: Medio Dulbelcco`s Eagle modificado enriquecido con F-12
XI dNTP
: Desoxinucleótido fosfato
DOG
: 2-desoxi-D-glucosa
DTNB
: 5,5’-ditio-bis-(ácido 2 nitrobenzoico)
DTT
: 1,4-ditiotreitol
EDTA
: Ácido etilendiaminotetracético
EROs
: Especies reactivas del oxígeno
G6PD
: Glucosa 6-P deshidrogenasa
GLO
: L-gulono-γ-lactona oxidasa
GLUT
: Transportador facilitativo de hexosas
GPx
: Glutatión peroxidasa
GR
: Glutatión reductasa
GRx
: Glutarredoxina
GSH
: Glutatión reducido
XII GSSG
: Glutatión oxidado
GST
: Glutatión S-transferasa
GSTO
: Glutatión S-transferasa omega
HRP
: Peroxidasa de rábano picante
Km
: Constante de Michaelis-Menten
MGS
: Glicógeno sintasa muscular
NADPH
: Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato reducido
NADP+
: Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato
OMG
: 3- o-metilglucosa
PBS
:Tampón fosfato salino
PDI
: Proteína disulfuro isomerasa
PHL
: Floridzina
PKC
: Proteína quinasa C
XIII PKA
: Proteína quinasa dependiente de AMPc
PP1
: Proteína fosfatasa 1
PVDF
: Polivinilideno fluoruro
RT-PCR : Transcriptasa reversa acoplada a la reacción de polimerasa en cadena
SDS
: Dodecil sulfato de sodio
SVCT
: Co-transportador de sodio/ascorbato
TEMED
: N,N,N´N´-tetrametilendiamina
TNB
: Ácido tio-nitrobenzoico
TUNEL
: TdT- mediated dUTP nick end labelling
Vmax
: Velocidad máxima
WT1
: Factor de transcripción del tumor de Wilms
γ-GT
: γ-glutamil transpeptidasa
1 1. RESUMEN
Las células somáticas de Sertoli tienen un rol clave en la maduración y
supervivencia de las células germinales en el túbulo seminífero. Vitamina C y glutatión
son los antioxidantes solubles más importantes en la fisiología celular y son
fundamentales en el desarrollo de la línea germinal masculina y en la defensa contra
agentes químicos y radiaciones. En este trabajo se estudió el comportamiento
molecular y funcional de los trasportadores de vitamina C frente a niveles disminuidos
de glutatión intracelular.
Se utilizaron cortes de testículo de rata y la línea celular de Sertoli 42GPA9.
Análisis de RT-PCR, inmucitoquímica y Western blot revelaron que las células de Sertoli
expresan ambas isoformas de transportadores de vitamina C (SVCT 1 y 2). La función
de estos transportadores se determinó mediante ensayos de transporte de ácido
ascórbico. En experimentos in vivo con ratas tratadas con L-butionina-sulfoximina
(BSO), inhibidor de la γ-glutamilcisteína sintetasa, observamos diferencias en los
niveles y localización de SVCT1 en cortes de testículos. Se obtuvieron resultados
similares cuando se trataron cultivos de células de Sertoli con este inhibidor. Sin
embargo, cuando se realizaron ensayos funcionales en células de Sertoli depletadas de
glutatión, observamos un aumento en la captación de ácido ascórbico.
Estos datos sugieren que existe una estrecha relación entre los niveles
intracelulares de glutatión y la expresión de SVCTs.
2 1.1. SUMMARY
The somatic Sertoli cells within the seminiferous tubules perform a key role in
supporting maturation and survival of germ cells. Vitamin C and glutathione are watersoluble antioxidants fundamental for cell physiology and are crucial in the development
of male germ cell line as well as against chemical agents and radiation. In this work, we
studied the molecular and functional behavior of vitamin C transporters under conditions
of decreased levels of intracellular glutathione.
We
used
rat
testis
slices
and
42GPA9
Sertoli
cell
line.
RT-PCR,
immunocytochemical and Western blot analysis revealed that Sertoli cells express both
isoforms of vitamin C transporters (SVCT 1 and 2). The function of these transporters
was assessed by ascorbic acid uptake assays. In in vivo experiments with rats treated
with L-buthionine-sulfoximine (BSO), an inhibitor of the γ-glutamylcystein synthetase, we
observed differences in the levels and localization of SVCT1 in testicular slices. Similar
results were obtained when Sertoli cell cultures were treated with this inhibitor. However,
when functional assays were performed on glutathione depleted Sertoli cells, we
observed an increase in ascorbic acid uptake.
These data suggest a close relationship between intracellular glutathione levels
and SVCT expression and localization.
3 2. INTRODUCCIÓN
Existen dos tipos de antioxidantes: los antioxidantes enzimáticos y los
antioxidantes no enzimáticos. Los primeros se encuentran dentro del organismo e
impiden la formación de radicales libres a partir de otras moléculas. Si los radicales
libres ya existen, estos antioxidantes se encargan de convertirlos en moléculas menos
dañinas para el organismo. Ejemplos de estos antioxidantes son: la catalasa de los
peroxisomas, la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa. Los antioxidantes no
enzimáticos son aquellos compuestos que donan sus electrones a los radicales libres,
neutralizándolos y evitando reacciones en cadena. Sin embargo, los antioxidantes no
enzimáticos como el glutatión, la vitamina C, la vitamina E y el β-caroteno no se
convierten en radicales libres debido a la gran movilidad de sus otros electrones o
simplemente son radicales libres no reactivos.
2.1. Glutatión
2.1.1. Generalidades del glutatión
Dentro de la defensas no enzimáticas, tienen un papel importante los tioles no
proteicos, de los cuales el glutatión (L-γ-glutamil-L-cisteinilglicina) es el más abundante
presentando concentraciones entre 0,5-10 mM dentro de todas las células mamíferas,
debido a que todas ellas poseen la maquinaria necesaria para su síntesis (Cotgreave y
Gerdes 1998; Meister, 1983; Sies, 1996).
El glutatión es un tripéptido derivado de la glicina, el glutamato y la cisteína, el
cual es un antioxidante crítico debido a su relativa abundancia y capacidad para ciclar
4 rápidamente entre su forma reducida (GSH) y oxidada (GSSG) (Figura 1). Más del 90%
del glutatión total (GSH+GSSG) se encuentra como GSH. En situaciones de estrés
oxidativo, el GSH puede reaccionar directamente con los radicales libres o bien puede
reducir los peróxidos por medio de la glutatión peroxidasa (GPx) formando GSSG por
unión de dos moléculas de GSH mediante un puente disulfuro entre las cisteínas, el
cual es inmediatamente reducido a GSH por medio de la enzima glutatión reductasa
(GR), utilizando NADPH como cofactor (Figura 2).
5 Figura 1. Estructura del glutatión. El glutatión es un tripéptido derivado del
glutamato, cisteína y glicina. Existe en dos formas: la forma reducida (GSH), y la forma
oxidada, un compuesto formado por 2 moléculas de GSH unidas por un enlaces
disulfuro, conocido como glutatión oxidado (GSSG).
6 Figura 2. Ciclo redox del glutatión. La eliminación de peróxidos en las células
es realizado por la enzima glutatión peroxidasa (GPx). En esta reacción el glutatión
reducido (GSH) es convertido en su forma oxidada (GSSG), pero luego es revertido
nuevamente a GSH por acción de la glutatión reductasa (GR). Esta enzima utiliza el
NADPH como cofactor. La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) cataliza la primera
reacción en la vía de la pentosa fosfato, la ruta metabólica que suple a las células de
NADPH y de pentosas para la síntesis de ácidos nucleicos. La reacción catalizada por
la G6PD es la reducción del NADP+ a expensas de la deshidrogenación de la glucosa6-fosfato en 6-fosfogluconato.
7 El GSH desempeña numerosas e importantes funciones metabólicas, una de
ellas es la protección de las células contra la oxidación, debido a que posee un grupo
sulfidrilo, el cual es un fuerte nucleofilo y confiere protección contra en daño causado
por oxidantes, neutrófilos, radicales libres y compuestos tóxicos, así como proteger
frente al efecto nocivo de las radiaciones (Sies,1991). Estos mecanismos de defensa
incluyen la detoxificación de xenobióticos con la participación de enzimas conjugantes
del tipo de la glutatión S-transferasa. Entre sus múltiples funciones destaca su
participación en el correcto plegamiento de las proteínas recién sintetizadas,
manteniendo los grupos sulfidrilo de las proteínas en su forma reducida y posee un
papel importante en la reparación del DNA (Meister y Andereson, 1983; Meister, 1994).
El glutatión también interviene en la síntesis de DNA (Estrela et al., 2006), en este
proceso se requiere la reducción de ribonucleótidos para la formación de
desoxirribonucleótidos, una reacción catalizada por la ribonucleótido reductasa. En esta
reacción debe intervenir un donante de hidrógeno que puede ser la tiorredoxina o la
glutarredoxina (Fernandes y Holmgren, 2004). Muchas de estas funciones se deben a
su estructura química, el GSH posee dos características estructurales: un grupo
sulfidrilo (-SH) de la cisteína, el cual interviene en las reacciones redox y un enlace γ-
glutamilo entre la glutamina y la cisteína, el cual le da resistencia a la degradación por
peptidasas celulares. Este enlace sólo es hidrolizable por la enzima γ-glutamil
transpeptidasa (γ-GT) localizada en la membrana celular.
8 2.1.2. Metabolismo del glutatión
El ciclo del γ-glutamil, es un conjunto de reacciones enzimáticas que participan
tanto en la síntesis como en la degradación del glutatión, (Meister y Tate, 1976;
Meister, 1983) (Figura 3).
Estudios de Bloch y sus colaboradores demostraron que la síntesis de glutatión
es catalizada en 2 pasos (Snoke y Bloch, 1945), siendo ambos dependiente de ATP. El
primero paso consiste en una condensación del grupo γ-carboxilo del glutamato con el
α-amino de la cisteína. El grupo carboxilo es activado inicialmente por el ATP para dar
lugar a un intermediario de reacción del tipo fosfato de acilo, el cual es atacado por el
grupo amino de la cisteína, dando lugar a la γ-glutamilcisteína. Este primer paso es
realizado por la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa. En condiciones fisiológicas, el paso
limitante para la síntesis de glutatión es la disponibilidad de cisteína. La síntesis de
glutatión está regulada por una retroalimentación negativa, ya que el glutatión inhibe la
γ-glutamil-cisteín sintetasa (Richman y Mesiter, 1975). El segundo paso de la reacción
es parecido, siendo activado el grupo α-carboxilo de la γ-glutamilcisteina a una forma
fosfato acilo que permite la condensación con la glicina. Este último paso de la síntesis
del glutatión es realizado por la enzima glutatión sintetasa.
9 Figura 3. Ciclo γ-glutamil. Es un conjunto de las reacciones enzimáticas que
participan en la síntesis y degradación del GSH. Las enzimas y etapas involucradas
están numeradas de la siguiente manera. 1, γ-glutamilcisteína sintetasa. 2, glutatión
sintetasa. 3, salida de GSH. 4, γ-glutamil transpeptidasa. 5, γ-glutamil ciclotransferasa.
6, oxoprolinasa. 7, dipeptidasa. 8, sistema de transporte alanina-serina-cisteína (ASC).
9, acetilación. 10, glutatión S-transferasa.
10 El glutatión es degradado extracelularmente en un proceso de 2 etapas, la
primera etapa es catalizada por la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GT), catalizando 2 tipos
de reacciones:
• Reacción de transpeptidación: el grupo γ- glutamilo se transfiere a un aceptor
adecuado.
• Hidrólisis del enlace γ-glutamilo.
La γ-GT se localiza en la membrana plasmática de las células (Meister y
Anderson, 1983) y su sitio activo se orienta hacia la cara externa de la membrana.
Cuando el GSH interacciona con la membrana, la γ-GT forma un γ-glutamil aminoácido,
que entra al interior de la célula. La enzima γ-glutamil ciclotransferasa cataliza la
liberación del aminoácido y formación de 5-oxoprolina. La oxoprolinasa cataliza la
hidrólisis dependiente de ATP de la 5-oxoprolina, lo cual libera glutamato para la
síntesis de GSH. También son sustrato de la γ-GT los GSH-conjugados producidos por
la reacción catalizada por la glutatión S-transferasa. Dicha enzima cataliza las
reacciones entre GSH y una amplia variedad de compuestos electrofílicos de origen
exógeno. La segunda etapa es catalizada por la cistenil-glicina dipeptidasa, la cual
hidroliza la cisteinilglicina formada por la γ-GT, liberando glicina y cisteína (Meister y
Anderson, 1983). El sistema de transporte de alanina-serina-cisteína (ASC), mediante
un transporte dependiente sodio, introduce cisteína al interior de la celular y es
reutilizada en la síntesis de GSH (Chirstensen et al., 1967). Aunque no se conocen
todas las funciones del ciclo γ-glutamil, se ha sugerido que también estaría participando
11 el metabolismo y transporte de aminoácidos, especialmente la cisteína (Meister y
Larsson, 1995).
2.1.3. Modificación del glutatión intracelular
El L-butionina-S,R-sulfoxamida (BSO) es un inhibidor específico de la γglutamilcisteína sintetasa (Griffith y Meister, 1979), enzima que cataliza la formación del
enlace amido entre el ácido glutámico y la cisteína. La reacción corresponde a la etapa
limitante de la síntesis de glutatión. El BSO se ha usado ampliamente para disminuir las
concentraciones de glutatión en macrófagos, eritrocitos, células de Sertoli y células
espermatogénicas de hámster (Rouzer et al, 1981; Griffith, 1981; den Boer et al, 1989).
Por otro lado el dietil maleato (DEM) produce una rápida caída del GSH
intracelular por conjugación, en una reacción mediada por la enzima glutatión Stransferasa. El producto de esta reacción es degradado y no entra al ciclo de reducción
de glutatión por acción de la enzima glutatión reductasa, por lo que se produce una
rápida depleción del GSH celular (Guaquil et al., 1997).
12 2.2. Vitamina C
2.2.1. Generalidades vitamina C
La vitamina C (L-ácido ascórbico) es un micronutriente esencial para el
organismo debido a que posee múltiples funciones fisiológicas. Esta vitamina es
necesaria en la síntesis de colágeno y carnitina como co-factor enzimático, para
mantener los iones metálicos en su forma reducida y en la neutralización de radicales
libres generados a partir de numerosos procesos fisiológicos y patológicos (Carr y Frei,
1999; padayaty et al., 2003). Esta vitamina es una cetolactona de seis carbonos y dos
grupos ácidos ionizables (pKa 4,04 y 11,34) que se encuentra parcialmente ionizada a
pH fisiológico. La vitamina C puede existir en 2 formas biológicamente activas, la forma
oxidada, el ácido deshidroascórbico (DHA) y la forma reducida, el ácido ascórbico (AA)
(Carr y Frei, 1999). En los organismos la vitamina C se encuentra principalmente en su
forma reducida como AA (Schorah et al., 1996), sin embargo se oxida en forma
reversible a DHA. La oxidación es dependiente del pH, de la temperatura y de la
concentración de algunos metales en transición, tales como hierro y cobre (Grünewald
et al., 1993). Debido al carácter reversible de esta oxidación es que la biodisponibilidad
de la vitamina C es igual a la suma de su forma oxidada y reducida (Figura 4).
13 Figura 4. Oxidación de ácido ascórbico. El ácido ascórbico (AA) es un agente
reductor que perdiendo un electrón se transforma en el radical libre semideshidroascorbato (SDA). La pérdida de un segundo electrón da origen al ácido
deshidroascórbico (DHA), que es la forma oxidada de la vitamina C. Tanto el ácido
ascórbico como el ácido deshidroascórbico son biológicamente activos en procesos de
óxido-reducción (Linster y Van Schaftingen, 2007).
14 La vitamina C es una vitamina hidrosoluble que es sintetizada en forma de AA
por una variedad de organismos del reino animal y vegetal. En la mayoría de los
mamíferos dicha síntesis ocurre en el hígado. Sin embargo, durante el transcurso de la
evolución organismos como humanos, primates, conejillos de india, salmón coho y
algunas aves han perdido la capacidad de sintetizarla y deben obtenerla de la dieta.
Esto se debe a que carecen de L-gulono-γ-lactona oxidasa (GLO), la última enzima en
la vía de síntesis de vitamina C partir de D-glucosa y D-galactosa. La GLO cataliza la
oxidación de L-gulono-γ-lactona a ácido L-ascórbico con la formación de peróxido de
hidrógeno (Figura 5) (Kiuchi et al, 1982; Padh, 1990; Naidu, 2003). Estas especies son
capaces de sobrevivir gracias a que poseen un sistema de transporte que permite que
AA proveniente de la dieta sea absorbida a nivel del intestino delgado. (Siliprandi et al,
1979). La vitamina C una vez ingerida de la dieta, es incorporada al plasma sanguíneo
a través de su absorción intestinal. En el plasma la vitamina C está presente en su
forma reducida a concentraciones que varían entre 20 y 50 µM (Capellmann et al.,
1994). Diversas células y tejidos acumulan elevadas concentraciones de vitamina C, las
cuales pueden llegar a valores 100 veces más altos que los encontrados en el plasma
(Rose, 1988). La acumulación de vitamina C en determinados tejidos depende de un
sistema de trasporte especializado que permita la incorporación de AA en determinados
tipos celulares.
15 Figura 5. Biosíntesis de ácido ascórbico en mamíferos. El ácido ascórbico es
sintetizado a partir de D-glucosa o D-galactosa. La enzima L-gulono-γ-lactona oxidasa
no se expresa en humanos y primates, entre otras especies.
16 2.2.2. Sistemas involucrados en el trasporte de la vitamina C
La vitamina C, debido a su tamaño y carga a pH fisiológico, no es capaz de
difundir libremente a través de las membranas celulares, la entrada y la salida de esta
vitamina en las células depende de dos mecanismos de trasporte: un primer sistema
que transporta DHA y un segundo sistema que transporta AA (Bigley y Stankova,1974;
Okamura, 1979; Schorah, 1992; Welch et al., 1995; Ngkeekwong y Ng, 1997).
El ácido deshidroascórbico es transportado por un mecanismo facilitado de baja
afinidad y de alta capacidad de transporte, a través de los transportadores facilitativos
de hexosas (GLUTs), con 14 isoformas descritas (GLUT1-GLUT14), de las cuales
GLUT1, GLUT2, GLUT3 y GLUT4 transportan DHA in vitro (Vera et al., 1993; Rumsey
et al., 1997; Vera et al., 1995; Angulo et al., 1998). Estos transportadores presentan 12
dominios transmembrana, con sus extremos amino y carboxilo terminal intracelulares
(Mueckler et al., 1994). El DHA presenta un mecanismo de transporte bi-direccional de
baja afinidad (Km 1-4 mM) que es inhibido por glucosa y citocalasina B (Vera et al.,
1993; Vera et al., 1995; Rumsey et al., 1997; Angulo et al., 1998; Nualart et al., 2003)
Los distintos GLUTs difieren en sus propiedades funcionales, ya sea en las respectivas
afinidades por sus sustratos. Además de lo anterior, muestran una distribución tisular y
celular diferencial, observándose también que distintas células expresan normalmente
más de una isoforma simultáneamente. GLUT1 es el transportador más ampliamente
distribuido y se expresa en elevados niveles en células de las barreras sangre-tejido
que se establecen por la formación de uniones ocluyentes entre células endoteliales
(barrera hemato-encefálica) o entre células epiteliales (barrera intestinal). GLUT2 se
expresa en hepatocitos, células β del páncreas, riñón y placenta. GLUT3 está presente
17 en forma abundante en el cerebro, riñón y placenta. GLUT4 está restringido al tejido
adiposo y muscular los cuales comparten la propiedad de ser sensibles a la acción de la
insulina (Mueckler et al., 1985; Flier et al., 1987; Thorens et al., 1988; Bashan et al.,
1992; Lisinski et al., 2001; Reagan et al., 2001; Fueger et al., 2004; Korgun et al., 2005;
Park et al., 2005).
El ácido ascórbico es transportado por un mecanismo activo de alta afinidad y de
baja capacidad de transporte, a través de los co-transportadores de Na+/ascorbato
(SVCTs), con dos isoformas descritas hasta el momento, SVCT1 y SVCT2 (Tsukaguchi
et al., 1999; Daruwala et al., 1999; Rajan et al., 1999; Wang et al., 1999; Wang et al.,
2000). Tsukaguchi et al., (1998) clonaron dos transportadores de AA dependientes de
sodio a partir de tejidos de rata, y los denominaron SVCT1 y SVCT2 (Sodium
dependent Vitamin C Transporter). SVCT1 se clonó a partir de bibliotecas de cDNA de
riñón de rata y humano (Daruwala et al., 1999; Faaland et al., 1998; Tsukaguchi et al.,
1999), y se determinó que posee 604 aminoácidos; SVCT2 se clonó a partir de cerebro
de rata y determinó que posee 592 aminoácidos. Ambas proteínas presentan 12
dominios de transmembrana y sus extremos amino y carboxilo terminal se encuentran
orientados intracelularmente. Ambas proteínas poseen un 65 % de identidad
aminoacídica, y los mayores porcentajes de identidad se encuentran en las regiones de
transmembrana, en tanto que la mayor divergencia aminoacídica se encuentra en los
extremos amino y carboxilo terminal (Tsukaguchi et al., 1998). En estudios cinéticos y
funcionales realizados en ovocitos de Xenopus laevis y células transfectadas, se
demostró que los trasportadores SVCTs son activados por sodio, saturables,
electrogénicos y altamente específicos para L-ascorbato.(Faaland et al., 1998;
18 Daruwala et al., 1999; Rajan et al., 1999; Wang et al., 1999; Wang et al., 2000). Para SVCT1 se han descrito una Km aparente entre el rango de 65-237 µM y para SVCT2
una Km de 8-62 µM (Wang et al., 2000; Savini et al., 2007). SVCT2 requiere calcio y
magnesio para su funcionamiento (Godoy et al., 2007). Estudios tendientes a demostrar
la distribución del producto de expresión de los genes que codifican para SVCT1 y
SVCT2 (hibridación in situ y Northern blot) sugieren que ambas isoformas poseen un
patrón de expresión tejido específico. SVCT1 se expresa en tejidos epiteliales de
absorción como intestino delgado, colón, riñón, ovario, páncreas, próstata, timo e
hígado. Por su parte, SVCT2 se expresa en células metabólicamente activas y tejidos
especializados, como tejido cerebral (principalmente en neuronas y algunos tipos de
células gliales), tejido ocular, bazo, próstata, testículo, ovario, placenta, leucocitos y
sistema endocrino, mostrando una expresión más general que SVCT1 (Faaland et al.,
1998; Tsukaguchi et al., 1999; Wang et al., 1999; Wang et al., 2000; Castro et al.,
2001, Mun et al., 2006). Sin embargo, estudios más detallados sugieren que la mayoría
de los tejidos expresan ambas isoformas pero con diferentes niveles de expresión
(Wilson, 2005).
El eflujo de AA ha sido pobremente estudiado. Los transportadores de glucosa
son capaces de transportar vitamina C hacia el exterior de las células sólo en su forma
oxidada, y los transportadores activos de AA sólo funcionan facilitando el ingreso de
esta vitamina al espacio intracelular. Dentro de las posibles formas de salida de ácido
ascórbico desde las células, se ha descrito la participación de canales de aniones
orgánicos sensibles a estiramiento (Filiberto et al., 1987; Siushansian et al., 1996;
Wilson et al., 2000), la exocitosis a través de vesículas secretoras (von Zastrow et al.,
19 1986), la participación de intercambiadores glutamato/ascorbato (Cammack et al., 1991)
y de hemicanales formados por conexinas (Ahmad y Evans, 2002). Estos últimos
podrían estar involucrados tanto en la entrada como en la salida de AA desde las
células (Wilson, 2005).
2.3. Relación funcional entre el glutatión y la vitamina C
La vitamina C y el glutatión son los antioxidantes solubles más importantes de la
fisiología celular (Meister., 1994). El glutatión se ha visto involucrado en la acumulación
celular de vitamina C y en mantenimiento de ésta en su forma reducida (Meister, 1994;
Linster y Van Schaftingen, 2007), debido a que el DHA es incorporado rápidamente por
las células y reducido a AA con la subsecuente acumulación de éste (Rumsey et al,
1997). Este proceso de regeneración de AA a partir de DHA, no es un proceso
espontáneo, pues ocurre mediante mecanismos enzimáticos dependientes de glutatión
(Himmerlreich et al, 1998; Ishikawa et al, 1998) e independiente de éste (Guaiquil et al,
1997). Sin embargo, el glutatión por sí solo es capaz de reducir el DHA a AA, pero es
un proceso muy lento en condiciones fisiológicas (Linster y Van Schaftingen, 2007). La
mantención de niveles constantes de vitamina C en una célula es un proceso dinámico
en el que la vitamina C está bajo un constante reciclaje entre sus formas oxidada y
reducida (Figura 6). En este contexto, los niveles de ácido ascórbico intracelulares no
dependen solamente de la vitamina C recién transportada, sino que existen al menos
dos procesos adicionales que pueden influenciar los niveles intracelulares de ácido
ascórbico: la oxidación del ácido ascórbico intracelular por especies oxidantes
generadas como producto del metabolismo oxidativo normal de una célula, y la
20 oxidación del ácido ascórbico intracelular durante la respuesta de la célula a eventos de
estrés oxidativo.
Los mecanismos enzimáticos involucrados en la reducción de DHA dependientes
de glutatión corresponden a glutarredoxina (GRx), proteína disulfuro isomerasa (PDI) y
glutatión S-transferasa omega (GTSO). Las dos primeras son oxidorreductasas y la
última corresponde a una tioltransferasa, las cuales poseen en su sitio activo uno o más
residuos de cisteína.
Las glutarredoxinas son enzimas citosólicas pequeñas de 12 kDa, las cuales
catalizan la reducción de los puentes disulfuro formados entre los grupos tiol de una
proteína o los formados entre las proteínas y el GSH (Wells et al., 1990; Yang y Wells,
1991; Bushweller et al., 1992). Dependiendo de la presencia de una o dos cisteínas en
su centro activo, se clasifican en monotiólicas y ditiólicas (Luikenhuis et al., 1998;
Fernandes y Holmgren, 2004). Adicionalmente, las Grx en mamíferos tienen una lista
creciente de funciones dentro de las cuales están la reducción del ácido
deshidroascórbico, proliferación celular y la regulación de la actividad de factores de
trascripción (Bandyopadhyay et al., 1998; Nakamura et al., 1999; Fernandes y
Holmgren, 2004). Con respecto a la actividad DHA reductasa de esta proteína, análisis
cinéticos han demostrado que presenta una Km aparente entre el rango de 0,2-2,2 mM
y 1,6-8,7 mM para DHA y GSH, respectivamente. Basándose en la ubicación subcelular
de la glutarredoxina, se sugiere que estaría contribuyendo en el reciclaje de la vitamina
C en el citosol (Wells y Xu, 1994; Bánhegyi et al., 2003).
PDI es una proteína de 57 kDa unida a la membrana del retículo endoplásmico,
que sirve para crear y reorganizar los puentes disulfuro durante la síntesis proteica,
21 presentando una eficiencia catalítica para la actividad DHA reductasa de 250 veces
menor que la glutarredoxina (Xu et al., 1996). Considerando la actividad reductasa en el
retículo endoplásmico, se propuso que el DHA podría estar implicado como oxidante en
la formación de puentes disulfuros en las proteínas catalizados por la PDI (Wells y Xu,
1994; Bánhegyi et al., 2003).
Maellaro et al., (1994) purificó de hígado de rata una proteína con actividad DHA
reductasa, con un peso molecular de 31 kDa y una Km aparente de 0,25 y 2,8 mM para
DHA y GSH, respectivamente. Esta DHA reductasa no tiene homología con
glutarredoxina y PDI, sino que pertenece a la nueva clase Omega de la super familia de
glutatión S-transferasa (GSTs). Se han descrito y caracterizado dos genes que se
transcriben activamente en humanos y se les ha denominado hGSTO1 (Board et al.,
2000) y hGSTO2 (Wang et al., 2005). Se han descrito ortólogos en cerdo (Rouimi et al.,
2001),
ratón
(Ishikawa
et
al.,
1998),
y
rata
(Ishikawa
et
al.,
1998).
Un aspecto importante en la secuencia de las subunidades de esta clase es la
presencia en su sitio activo de una cisteína (Cys32) en vez de una tirosina o una serina
(Board et al., 2000). Esta cisteína interactúa con el GSH formando un disulfuro mixto en
su sitio activo. Esta característica puede relacionarse con la actividad tiol transferasa de
la molécula, en la que se eliminan aductos S-tiolados formados entre las cisteínas de
las proteínas y el GSH en respuesta a estrés oxidativo (Listowsky, 2005). Todo esto
pone en evidencia la importancia que tiene este residuo cisteína y la formación del
enlace disulfuro en la actividad catalítica de las GST de clase Omega (Board et al.,
2000). En cuanto a la reducción de DHA, hGSTO2 resultó ser 70-100 veces más activa
que hGSTO1 (Schmuck et al., 2005). Por último, el papel de la actividad DHA reductasa
22 dependiente de GSH en el reciclaje de la vitamina C fue demostrado cuando en células
CHO que sobreexpresaban DHA reductasa de hígado de rata acumularon más AA que
las células no transfectadas cuando se incubaron en presencia de DHA (Ishikawa et al.,
1998).
La reducción dependiente de glutatión es muy importante pero, aparentemente
ésta no sería la única vía para la mantención del ácido ascórbico y es muy posible que
existan múltiples mecanismos enzimáticos. Se ha observado que en células mieloides
humanas la ausencia total de glutatión intracelular no afecta la capacidad de éstas para
acumular intracelularmente grandes cantidades de ácido ascórbico (Guaiquil et al.,
1997). En colon de rata se describió una actividad de reductasa de ácido
deshidroascórbico que requiere de la participación de NADPH como dador de
electrones y que posteriormente fue purificada de hígado de rata (Del Bello et al., 1994)
e identificada como la enzima 3α-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3α-HSD) (Del Bello
et al., 1994; Pawlowski et al., 1991; Penning et al., 1984; Penning y Sharp, 1987).
Estudios posteriores realizados en hepatocitos de rata y eritrocitos humanos, muestran
que la enzima tiorredoxina reductasa, una selenoproteína que en conjunto con
tiorredoxina forma un sistema de reducción de disulfuros proteicos (Gladyshev et al.,
1996; Holmgren y Bjornstedt, 1995) y que en la ausencia de tiorredoxina puede reducir
otros sustratos como ácido lipoico, vitamina K3 y aloxano, tiene la capacidad de reducir
al ácido deshidroascórbico en presencia de NADPH, contribuyendo así a la mantención
del contenido de ascorbato en hígado y eritrocitos (May et al., 1997; Mendiratta et al.,
1998).
23 Figura 6. Reciclaje de la vitamina C. La vitamina C es incorporada al interior de
la célula por dos mecanismos distintos, un trasporte activo que incorpora ácido
ascórbico (AA) y un trasporte facilitativo que incorpora ácido deshidroascórbico (DHA).
(azul). La utilización del AA como antioxidante conduce a la formación del radical libre
semi-deshidroascorbato (SDA) en el citosol. Varios sistemas enzimáticos representados
en verde convierten el SDA a AA. Por otro lado el DHA proveniente de fuentes
externas, puede ser reducido a AA mediante mecanismos enzimáticos dependientes e
independientes de glutatión (naranjo). GSTO, glutatión S-transferasa omega; 3αhidroxiesteroide DH, 3α-hidroxiesteroide deshidrogenasa; PDI, proteína disulfuro
isomerasa. RH, molécula reducida. R+, molécula oxidada.
24 El primer indicio acerca de que existía una interacción funcional entre el glutatión
y vitamina C, surgió de experimentos in vivo utilizando ratas recién nacidas, a las cuales
se les indujo una deficiencia de glutatión al administrarles BSO. La disminución en el
contenido de glutatión en los órganos de estas ratas produjo una disminución del
contenido de ácido ascórbico intracelular de al menos un 50% en la mayoría de los
órganos (Martensson y Meister, 1991). Por otro lado, la administración de vitamina C en
la dieta incrementó notablemente los niveles de glutatión intracelular, no sólo en las
ratas controles sino que también en las tratadas con BSO, previniendo los efectos
letales producidos por la deficiencia de glutatión de una manera dependiente de la dosis
(Martensson y Meister, 1991). Los mismos efectos fueron visualizados cuando a
conejillos de india adultos se les indujo una deficiencia de glutatión (Griffith, et al.,
1991).
Investigaciones posteriores demostraron que la deficiencia de glutatión inducía
muerte sólo en ratas recién nacidas, que al parecer no pueden sintetizar ácido
ascórbico, y en animales incapaces de sintetizar ascorbato de manera endógena, como
son los conejillos de india (Martensson et al., 1993). En ratones adultos que sí pueden
sintetizar vitamina C, pero en los que la síntesis de glutatión fue inhibida con BSO, no
se observó letalidad producida por la deficiencia de glutatión, pero si un aumento en la
síntesis de ácido ascórbico por el hígado y en menor grado por el riñón (Martensson y
Meister, 1992). En conejillos de india a los cuales se les administró una dieta libre de
vitamina C, la administración de ésteres de glutatión disminuyó la pérdida de ácido
ascórbico intracelular y retrasó la aparición de los síntomas de escorbuto (Martensson
et al., 1993). Aunque no se conoce el mecanismo por el cual la vitamina C incrementa
25 los niveles de glutatión, este efecto parece ser específico ya que otros antioxidantes
celulares son incapaces de generar un incremento en los niveles de glutatión
intracelular (Skaper et al., 1997). Se ha sugerido que la vitamina C produciría una
estimulación de las enzimas de la vía de las pentosas como la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa y transaldolasa (Puskas et al., 2000).
Lo que es interesante, es que esta interacción funcional vitamina C-glutatión
también se observa en humanos, ya que en individuos con una deficiencia en los
niveles de glutatión, éstos se ven aumentados luego de suplementación con vitamina C.
Más aún, un estudio realizado con células endoteliales de vena umbilical humana
demostró la presencia de radicales oxidantes en células conteniendo elevadas
concentraciones de glutatión, los que fueron neutralizados rápidamente cuando las
células fueron suplementadas con bajas concentraciones de vitamina C.
2.4. Células de Sertoli y su papel en la espermatogénesis
El epitelio del túbulo seminífero está constituido principalmente por dos clases de
células. Por una parte, la célula nutriente o nodriza, las células de Sertoli y, por otra, las
células que constituyen la línea espermatogénica o seminal. Estas últimas se disponen
en 4 a 8 capas que ocupan el espacio entre la membrana basal y la luz del túbulo
(Stevens y Lowe, 1988). Estas células se dividen varias veces, se diferencian y
terminan por producir espermatozoide, proceso conocido como espermatogénesis. Esta
proliferación y diferenciación celular tiene lugar en varios microambientes que son el
resultado de interacciones celulares que ocurren en el túbulo seminífero dentro del
testículo (De Kretser et al., 1988). Por último, en el espacio intersticial entre los túbulos
26 se encuentran las células de Leydig que tienen función endocrina (Weinbauer y
Wessels, 1999).
La organización anatómica del túbulo seminífero proporciona las bases para el
establecimiento de interacciones auto y paracrinas, y de contacto celular que forman
una red de señalización celular que determinará el control del proceso espermatogénico
(Grootegoed et al., 1989; Skinner et al., 1989; Jegou, 1993 Weinbauer y Wessels,
1999). Cuando colorantes vitales y otras sustancias son introducidas en el torrente
circulatorio, abandonan rápidamente los vasos y pasan a los espacios extracelulares de
la mayoría de los tejidos y órganos. En el testículo se ha descrito una estructura que
controla el paso de sustancias a la región luminal del túbulo seminífero, la barrera
hemato-testicular (BHT). Esta barrera no reside en las paredes de los vasos
sanguíneos, como es el caso de la barrera hemato-encefálica, se debe, en cambio, a la
presencia de complejos de unión especiales entre las células de Sertoli vecinas. De
este modo, dividen al epitelio en un compartimento basal que contiene las
espermatogonias y los espermatocitos preleptoténicos y un compartimento adluminal,
que contiene las fases más avanzadas de diferenciación de las células germinales y
que está limitado por las membranas de células de Sertoli adyacentes (Figura 5, A). Las
moléculas de los espacios extracelulares del intersticio tienen acceso al compartimento
basal, pero se les impide penetrar más profundamente en el epitelio, gracias a la
barrera formada por las uniones entre las células de Sertoli. Está barrera cercana a la
base del epitelio permite que las células de Sertoli mantengan en el compartimento
adluminal un microambiente particularmente favorable para la diferenciación de las
células germinales. El proceso de desarrollo espermatogénico consiste en la
27 proliferación de células madre y espermatogonias en contacto con la membrana basal
(compartimento basal), seguido por la entrada de las células espermatogénicas en
meiosis (espermatocitos preleptotenos) simultáneamente con la migración de éstos a
través de las uniones estrechas entre las células de Sertoli sin perturbar la
funcionalidad de la BHT (Ghabriel
et al., 2002). El resto del proceso meiótico y
postmeiótico hasta la etapa de espermátidas elongadas ocurre en el compartimento
adluminal (Russell, 1980). La proliferación y diferenciación de los espermatocitos
primarios (diploides), secundarios (haploide) y espermátidas (haploides) en el
compartimento adluminal ocurre entonces bajo la influencia y control directo de las
células de Sertoli (Figura 5, B) (Jegou, 1993; Skinner et al., 1991; Griswold, 1998).
La principal función de las células de Sertoli es separar el túbulo seminífero en
dos compartimentos fisiológicamente diferentes, formando la barrera hemato-testicular
(BHT) (Holash
et al., 1993), además de proporcionar nutrientes y factores de
crecimiento necesarios para la espermatogénesis son proporcionados por estas células.
Se sabe que en determinadas condiciones las células de Sertoli tienen actividad
fagocitaria, digiriendo los fragmentos citoplasmáticos (cuerpos residuales) que se
desprenden de las espermátidas durante su diferenciación, proceso conocido como
espermatogénesis (Clermont et al., 1987), Las células de Sertoli presentan
características morfológicas claras, estas células son alargadas y columnares, de forma
piramidal, y se apoyan sobre la lámina basal del túbulo (Sertoli, 1865). Su membrana
celular es irregular y presentan un citoplasma claro, eosinofílico y con formaciones
granulares, contiene numerosas mitocondrias, poco visible que constantemente cambia
para permitir el movimiento progresivo de las células germinales hacia el lumen de
28 túbulo (Pineau et al., 1999). El núcleo es de morfología irregular ovalada, se localiza
cerca de la lámina basal en la base del túbulo seminífero y se caracteriza por su forma
alargada con cromatina poco visible, el nucleoplasma es vesicular, con un nucléolo
grande, prominente y denso. Presentan un citoesqueleto bien desarrollado y son
capaces de anclarse a la lámina basal a través de uniones del tipo hemidesmosomas
(Brehm y Steger, 2005).
29 A
B
30 Figura 7. Epitelio seminífero. A. Esquema representativo de la arquitectura del
epitelio seminífero en mamífero. Barrera hemato-testicular formada por las células de
Sertoli. Las células de Sertoli vecinas se unen lateralmente por uniones ocluyentes que
dividen el túbulo seminífero en dos compartimentos e impiden el libre paso de
sustancias entre ambos. El compartimento basal comprende el espacio intersticial y los
espacios ocupados por las espermatogonias (A). El segundo compartimento,
denominado adluminal, incluye la luz del túbulo y el espacio que se extiende entre
células vecinas desde la luz hasta las uniones estrechas (B). Este compartimento
contiene espermatocitos, espermátidas y espermatozoides. B. Esquema representativo
de la espermatogénesis en el epitelio seminífero. Comienza con la proliferación de las
espermatogonias que están en contacto la membrana basal, la ultima división da lugar
a los espermatocitos I, posteriormente estas células entran en meiosis para dar lugar a
las espermátidas, la cuales se diferencian para alcanzar la maduración completa de los
espermatozoides.
31 2.5. Glutatión, vitamina C y espermatogénesis
En testículo de mamíferos, las células de Sertoli controlan la proliferación y
diferenciación de las células germinales a través de comunicación célula-célula y
conforman la barrera hemato-testicular. Estas células juegan un papel fundamental en
la regulación de la diferenciación y el metabolismo de las células germinales,
incluyendo la capacidad para regular los sistemas antioxidantes y responder a estrés
oxidativo.
Antioxidantes como la vitamina C y el glutatión son fundamentales para la
fisiología del sistema reproductor masculino. La vitamina C es esencial en el desarrollo
normal de la línea germinal masculina, encontrándose altamente concentrado en el
lumen del túbulo seminífero gracias a la expresión de los transportadores de vitamina C
(Tabla I y II). La carencia de vitamina C produce en conejillos de indias degeneración
masiva del epitelio germinal con descamación hacia el lumen de los túbulos seminíferos
y un efecto similar al de la privación androgénica en tejidos blanco tales como testículo,
epidídimo, conducto deferente y glándulas accesorias, sumado a un efecto secundario
de esterilidad, que se manifiesta como pérdida de la capacidad fecundante (Chinoy et
al., 1986). Concentraciones bajas de vitamina C en el líquido seminal están
estrechamente vinculadas con una calidad espermática disminuida e infertilidad
32 Tabla I. Expresión de los transportadores de ácido deshidroascórbico (GLUTs) en
testículo.
Transportador
Expresión en
tejido/tipo celular
Función
Referencia
GLUT1
Testículo, células de
Sertoli,
espermatocitos,
espermátidas,
espermatozoides.
Transporte de glucosa
y ácido
deshidroascórbico en
células de Sertoli y
espermatozoides,
transporte de glucosa
en espermatocitos
paquiténicos y
espermátidas
redondas.
Angulo et al., 1998;
Kokk et al., 2004,;
Carosa et al., 2005;
Rauch et al., 2006;
Angulo et al., 2008;
Galardo et al., 2008
GLUT2
Testículos, células de
Sertoli,
espermatocitos,
espermátidas,
espermatozoides.
Transporte de glucosa
y ácido
deshidroascórbico en
espermatozoides
Angulo et al., 1998;
Kokk et al., 2004,;
Angulo et al., 2008
GLUT3
Testículos, células de
Sertoli,
espermatocitos,
espermátidas,
espermatozoides.
Transporte de glucosa
y ácido
dehidroascórbico en
células de Sertoli y
espermatozoides,
transporte de glucosa
en espermatocitos
paquiténicos y
espermátidas redondas
Burant y Davidson
1994; Angulo et al.,
1998; Kokk et al.,
2004; Rauch et al.,
2006; Angulo et al.,
2008; Galardo et al.,
2008
GLUT4
Testículos, células de
Sertoli
No descrito
Angulo et al., 1998;
Angulo et al., 2008
Adaptado de Angulo et al. (2010)
33 Tabla II. Expresión de los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs) en testículo.
Transportador
Expresión en
tejido/tipo celular
Función
Referencia
SVCT1
Testículo, células de Transporte de
Sertoli, espermatocitos, ácido ascórbico en
células de Sertoli
espermátidas,
espermatozoide
Angulo et al., 2008
SVCT2
Testículo, células de Transporte de
Sertoli, espermatocitos, ácido ascórbico en
células de Sertoli
espermátidas,
espermatozoide
Tsukaguchi et al.,
1999; Wang et al.,
2000; Angulo et al.,
2008
Adaptado de Angulo et al. (2010)
Tabla III. Contenido de glutatión y actividad de enzimas antioxidantes dependientes de
glutatión en testículo
Glutatión
Célula de
Sertoli
27
Espermatocito
paquitenico
54
Espermátida
redonda
55
Espermatozoide
50
10
19
17
21
10
12
10
1400
200
200
50
No detectado
(nmol/mg de proteína)
Actividad GPx
(nmol producto/min/mg proteína)
Actividad GR
(nmol producto/min/mg proteína)
Actividad GST
(nmol producto/min/mg proteína)
(Bauche at al., 1994)
34 El líquido seminal de individuos normales contiene un nivel de vitamina C (727±
90 µM) que es varias veces mayor al normalmente encontrado en el suero (Berg et al.,
1941; Paz et al., 1977). La vitamina C es concentrada y secretada por las vesículas
seminales durante la eyaculación y es considerada como uno de los principales agentes
antioxidantes del semen. En el hombre, la disminución de la vitamina C del semen está
estrechamente relacionada con una calidad espermática reducida, expresada en
términos de disminución de la motilidad, menor número de espermatozoides, alteración
en la morfología y abundante aglutinación entre las células (Dawson et al., 1987; Lewis
et al., 1997; Sönmez et al., 2005) El papel de la vitamina C en la espermatogénesis se
podría relacionar con la elevada capacidad de los espermatozoides de mamíferos para
generar especies de oxígeno reactivas. La vitamina C, junto con otros compuestos en el
líquido seminal, juega un papel central en la protección del espermatozoide contra
especies de oxígeno reactivas como H2O2 y O2, que se generan a nivel de las
membranas de los propios espermatozoides (Aitken y Fischer, 1994; Aitken y Krausz,
2001).
Por otro lado, se ha sugerido que el glutatión jugaría un importante papel durante
la espermatogénesis debido a que mediciones en testículos de rata y ratón han
revelado un elevado contenido de glutatión y actividad de enzimas antioxidantes
dependientes de glutatión (Tabla III) (Li, 1975; Bauche at al., 1994; Castellón, 1994;
Tramer et al., 1998; Rao y Shaha, 2000; Castellon et al., 2005). De hecho, también se
ha propuesto una relación entre infertilidad y un contenido disminuido de glutatión (Teaf
et al., 1987; Irvine, 1996; Kumar et al., 2000). Grosshans y Calvin (1985) observaron un
incremento del contenido de glutatión en testículo de rata entre días los 8 y 28 post-
35 natal, manteniéndose los niveles de glutatión elevados durante todo el desarrollo
testicular. Este evento coincide con el inicio de la espermatogénesis, sugiriendo que el
GSH sería un factor importante en dicho proceso. Numerosos estudios han demostrado
que la concentración de glutatión en células espermatogénicas es mucho mayor que las
reportadas en las células de Sertoli, sin embargo, estudios con células aisladas y en
cultivos mixtos de células germinales y células de Sertoli, han revelado que
aparentemente las células germinales no poseerían la maquinaria o los precursores
necesarios para sintetizar glutatión, sugiriendo una nueva función para la célula de
Sertoli en la síntesis de glutatión por parte de las células germinales o las células del
epidídimo, relacionada con la biodisponibilidad de aminoácidos precursores (Bauche et
al., 1994; Li et al., 1989; den Boer et al., 1989; Castellon, 1999; Kaneko et al., 2002;
Castellon et al., 2003; Castellon et al., 2005).
Es ampliamente sabido que el ácido ascórbico funciona como un antioxidante
esencial en casos de severa deficiencia de glutatión, y que fisiológicamente glutatión y
ácido ascórbico actúan en conjunto como un sistema antioxidante celular que muestran
propiedades antioxidantes posiblemente complementarias. A pesar de que el papel del
glutatión y del ácido ascórbico en la defensa contra el estrés oxidativo ha sido
ampliamente documentada en distintos tipos celulares (Macho et al., 1997; Sato et al.,
1995; Schulz et al., 2000; Guaiquil et al., 2001), no existe evidencia si los
transportadores de ácido ascórbico están involucrados en este sistema. Además, se
sabe que el desarrollo y la supervivencia de las células germinales dependen del
contacto con las células de Sertoli en el epitelio seminífero de rata. Glutatión y vitamina
36 C son fundamentales en el desarrollo de la línea germinal masculina y en la defensa
contra agentes químicos y radiaciones.
En todo este contexto las células de Sertoli son un modelo válido para estudiar
en comportamiento molecular y funcional de los trasportadores de AA frente a los
niveles intracelulares de glutatión, debido a que estas células son las encargadas de
formar la barrera hemato-testicular a través de la cual se lleva a cabo el desarrollo de la
línea germinal masculina, además de proveer de nutrientes y factores de crecimiento, a
si como de vitamina C a las células germinales.
Tomando en consideración lo anterior se planteó siguiente hipótesis: La
ausencia de glutatión afecta la expresión y función de los transportadores de
acido ascórbico en células de Sertoli.
Por lo tanto, los objetivos específicos de esta tesis son:
1. Evaluar la localización de los trasportadores de vitamina C en cortes de
testículo de rata de distintas edades y en testículos adultos depletados de
glutatión.
2. Determinar la viabilidad celular de las células de Sertoli 42GPA9
depletadas de glutatión.
3. Evaluar la expresión y función de los transportadores de vitamina C en
células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión.
37 3. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. Materiales.
3.1.1. Reactivos químicos.
De Sigma Chemical Co. (USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: azul de
Coomassie G-250, Histochoice (fijador de tejido), ioduro de propidio (IP), citocalasina B
(cito B), citocalasina E (cito E), ouabaína, 2-desoxiglucosa (DOG), o-metilglucosa
(OMG), L-ácido ascórbico (AA), Tritón X-100, rojo fenol, starter-RT (oligo-dT), azul de
tripán, solución de colágeno tipo I de cola de rata, ácido sulfosalicílico, glutatión
reductasa, 5,5'-ditiobis (2-ácido nitrobenzoico), glutatión reducido, nicotinamida adenín
dinucleótido fosfato (NADPH), L-butionina-S,R-sulfoxamida (BSO) y dietil maleato
(DEM).
De Merck & Co, Inc. (Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: cloruro de
mercurio II, ácido clorhídrico, cloruro de potasio, alcohol metílico, alcohol etílico, fosfato
diácido de sodio, fosfato dihidrógeno de potasio, arcrilamida, bisacrilamida, alcohol
isopropílico, cloroformo, hidróxido de sodio.
De Winkler Ltda. (Chile) se adquirió albúmina de suero de bovino (BSA), glicina,
Tris, carbonato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), persulfato de amonio, cloruro de
sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, reactivo de Bradford, agua ultra pura libre de
nucleasas, tampón de carga de proteínas 2X.
De Gibco-BRL Laboratorios Life Technologies, Inc. (USA) se adquirió: tripsinaEDTA, penicilina/estreptomicina/fungizona.
38 De Hyclone (USA), se obtuvo medio de cultivo Dulbelco´s Eagle modificado
enriquecido con F-12 (DMEM-F12) y suero fetal bovino (FBS).
De Santa Cruz Biotechnology (USA), se obtuvo anti GLUT3 (sc-7582), anti βactina (sc-81178), anti SVCT1 (sc-9921), anti SVCT2 (sc-9927), anti WT1 (sc-192). De
INVITROGEN Corporation (USA), se obtuvo TOPRO-3, anticuerpo anti-IgG de cabra y
conejo conjugado a Alexa Fluor 488, anticuerpo anti-igG de cabra conjugado a Alexa
Fluor 568 y medio de montaje para fluorescencia.
De Pierce Biotechnology, Inc. (USA) se adquirieron los anticuerpos secundarios
conjugados a peroxidasa, anti-IgG de ratón, anti-IgG de cabra y anti-IgG de conejo,
reactivo ECL para quimioluminescencia y cocktail de inhibidores de proteasas 100X.
De Promega Co. (USA), se adquirió la enzima transcriptasa reversa M-MLV, los
dNTP`s, la enzima GoTaq polimerasa, estándar de DNA 100bp. De Lonza Group Ltda,
(Suiza), se obtuvo Agarosa Seakem. De OMEGA Bio-Tek Inc, (USA), se obtuvo RNASolv.
De MBI Fermentas (USA), fue obtenido el estándar de peso molecular preteñido
para geles de poliacrilamida-SDS.De bioWORLD (USA), se adquirió TEMED. De
Calbiochem, EMD Chemicals Inc (USA), se adquirió Tween 20 y β-mercaptoetanol.
Los análogos radioactivos [1,2-3H]-desoxi-D-glucosa (3H-DOG) y D-3-O-[metil-3H]glucosa (3H-OMG) fueron adquiridos en American Radiolabeled Chemicals, Inc. (USA)
y el 1-14C-L-ácido ascórbico (14C-AA) en Perkin Elmer Inc, (USA).
39 3.1.2 Material biológico.
Para los cortes histológicos se utilizaron ratas adultas Sprague-Dawley,
obtenidas del bioterio de la Universidad Austral de Chile, donde son mantenidos según
las normas vigentes. Estos animales de experimentación son anestesiados con
cloroformo y sacrificados por decapitación, según las medidas de bioseguridad del
“Manual de Normas de Bioseguridad” de CONICYT de 2008. Los restos animales son
cremados en el incinerador del Fundo Teja Norte de la Universidad Austral de Chile,
donde se descartan los desechos biológicos de acuerdo al Manual de Procedimiento
para el Manejo de Residuos de la UACh.
3.1.3 Instrumentos.
Los equipos utilizados fueron los siguientes: pHmetro Radiometer Copenhagen
PHM 83 Autocal, balanza Precisa 180ª, cámara de Neubauer VWR, centrífuga Eppendorf
5417-R, centrífuga Beckman Coulter Allegra 6, centrífuga Microv Fisher Scientific,
incubador para cultivo NuaireTMDH Autoflow, gabinete de seguridad biológica NuaireTM
Class II UN-425-600-E, microscopio confocal OLYMPUS Fluoview FV 1000, microscopio
de epifluorescencia OLYMPUS BX 50 con cámara OLYMPUS U-TV0 5XC-3, microscopio
invertido OLYMPUS CKX41, fuente de poder EPS 250 de Scientific Company, agitador
magnético IKAMAGR RCT, sonicador Ultrasonic Homogenizer 4710 Cole Parmer
Instruments Co. espectrofotómetro Aligent 8453, sistema de electroforesis y transferencia
Mini ProteanR Tri-Carb 1600 TR, agitador orbital Lab-Line, baño termorregulado Haake
40 D8, freezer a -70ºC Foma Scientific Bio-freezer 8425, freezer a -20ºC Consul, refrigerador
Fensa y Whirlpool.
3.2. Métodos.
3.2.1 Cultivo de células de Sertoli 42GPA9.
Las células de Sertoli 42GPA9 se cultivaron en medio DMEM-F12 suplementado
con FBS (suero bovino fetal) al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/mL,
estreptomicina 50 mg/mL y fungizona 50 ng/mL a 37ºC y CO2 al 5 % (Bourdon et al.,
1998; Lablack et al., 1998; Bourdon et al., 1999; Xing y Sairam, 2001).
3.2.2 Ensayo de viabilidad mediante azul de tripán
El colorante azul de tripán no puede penetrar células vivas, por consiguiente, si
este coloide logra entrar a las células éstas se consideran como células muertas (color
azul). Para el conteo se utilizó tripsina 0.25% por 10 minutos para obtener una
suspensión celular la cual fue tratada con azul de tripán (1:1) procediéndose
posteriormente a contar en cámara de Neubauer.
3.2.3 Extracción de RNA
Se obtuvo RNA total de células en cultivo mediante un método equivalente al de
Trizol, utilizando RNA-Solv. Se homogeneizaron 5-10 x 106 células en 1mL de reactivo
y se transfirieron a un tubo nuevo, se agregó 0,2 mL de cloroformo y se agitó
41 vigorosamente por 15 segundos en vórtex, inmediatamente se incubó en hielo por 10
minutos. Se centrifugó la muestra a 12000 x g por 15 minutos a 4ºC obteniéndose tres
fases. Posteriormente el 80% de fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se
precipitó el RNA con 0,5 mL de isopropanol dejando reposar 20 minutos, luego el RNA
fue centrifugado a 12000 x g por 10 minutos a 4ºC y se lavó con 1 mL de etanol 80% en
vortex, posteriormente se centrifugó a 7500 x g por 5 minutos y se retiró el etanol, se
dejó secar por 5 minutos y se resuspendió en 30µL de agua ultra pura libre de
nucleasas. Se determinó la concentración del RNA midiendo absorbancia a 260 nm
usando la relación de una unidad de absorbancia corresponde a 40µg/mL de RNA. A
las muestras obtenidas se les determinó la relación de absorbancia 260 nm/280 nm,
encontrándose todas dentro del rango de 1,9-2,0.
3.2.4 Reacción en cadena de la polimerasa acoplada a trancripción reversa (RTPCR)
Para la trascripción reversa se preparó una mezcla consistente en 4 µg de RNA,
1 µl de starter-RT 5 µM (oligo-dT) y agua libre de nucleasas para completar 35,5 µL, la
que se incubó a 70ºC por 5 minutos para finalmente dejarla en hielo. Paralelamente se
preparó una segunda mezcla que contenía 10 µL de tampón RT 5X (Tris-HCl 250 mM,
KCl 375 mM, MgCl2 15 mM, DTT 50 mM, pH 8,3), 4 µL de dNTP´s 10 mM, 0,7 µL de
enzima transcriptasa reversa M-MLV (200 U/µL), se juntaron ambas mezclas y se
incubaron a 42ºC por 1 hora. Adicionalmente, se realizó el mismo procedimiento en
ausencia de la enzima transcriptasa reversa para descartar la presencia de
contaminación con DNA genómico.
42 Para la reacción de amplificación, se utilizaron partidores diseñados para
amplificar segmentos internos de mSVCT1, mSVCT2.
Para controlar la integridad de
los cDNAs, se llevaron a cabo reacciones de amplificación utilizando partidores
diseñados para amplificar el gen que codifica para β-actina. En todos los casos, se
preparó la mezcla de reacción conteniendo en todos los casos: 2,5 µL de tampón green
5X, 1,25 µL de MgCl2 25 mM (tampón y MgCl2, suministrado con la enzima), 0,25 µL de
dNTP´s 10 mM, 5,3 µL de agua libre de nucleasas, 1,3 µL de cada partidor 10 µM, 1 µL
de templado y finalmente 0,1 µL de enzima GoTaq (5 U/µL), generando un volumen
final de 13 µL. Se utilizaron 2 pares juegos de partidores para cada isoforma de los
SVCTs. SVCT1 y SVCT2, diseñados para rata/ratón y SVCT1.1 y SVCT2.1 diseñados
exclusivamente para ratón. Los partidores usados fueron:
SVCT1
Sentido:
5’ act ctc ctc cgc atc cag at3’
Antisentido:
5’ cca ggc ggg cag agg cgt ag 3’
Tamaño del amplicón: 304 pb
SVCT1.1
Sentido:
5’ ctt gag agg tgg aag tgt c 3’
Antisentido:
5’ cag tag ccc agc gat aat gc 3’
Tamaño del amplicón: 651 pb
SVCT2
Sentido:
5’ ttg acc att aca ccc acg gt 3’
Antisentido:
5’ cat aga agc cat act ttg tg 3’
Tamaño del amplicón: 307 pb
43 SVCT2.1
Sentido:
5’ tgg acc ctt gac cat cac ac 3’
Antisentido:
5’ agg cgt agt agt cac cga tg 3’
Tamaño del amplicón; 475 pb
β-actina:
Sentido:
5` gca ccc tgt gct cac cga gg 3`
Antisentido:
5` caa tgc cac tgg tac gac cag ag 3`
Tamaño del amplicón: 350 pb
Para cada reacción de amplificación se siguieron los siguientes protocolos:
SVCT1: Se realizaron 35 ciclos incubando a 94°C durante 45 segundos, a 52°C
durante 45 segundos y 72 °C durante 30 segundos.
SVCT1.1: Se realizaron 35 ciclos incubando a 94°C durante 45 segundos, a 54°C
durante 45 segundos y 72 °C durante 30 segundos.
SVCT2: Se realizaron 35 ciclos incubando a 94°C durante 50 segundos, a 55°C
durante 50 segundos y 72ºC durante 30 segundos.
SVCT2.2: Se realizaron 35 ciclos incubando a 94°C durante 50 segundos, a
59°C durante 50 segundos y 72ºC durante 30 segundos.
β-actina: Se realizaron 30 ciclos incubando a 94ºC durante 30 segundos, a 64ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos.
Por último, los productos de amplificación obtenidos se resolvieron en geles de
agarosa al 1,5% que contenían bromuro de etidio 0,2 mg/mL. La electroforesis se
realizó a 60 V y se visualizaron las bandas obtenidas en un transiluminador UV.
44 3.2.5 Inmunohistoquímica
3.2.5.1 Cromógena
Los testículos de rata se fijaron con Bouin acuoso (75 mL ácido pícrico saturado
en agua, 25 mL formamida 40%, 5 mL ácido acético glacial) por 48 horas.
Posteriormente, las muestras fueron incluidas en parafina. Los testículos fijados e
incluidos se seccionaron con un micrótomo, obteniéndose cortes seriados de 5 µm de
grosor y fueron montados en portaobjetos de vidrio gelatinizados.
Los cortes incluidos en parafina fueron pasadas por xilol y una batería
descendente de etanol (100% I, 100% II, 95% I, 95% II, 70%, (v/v)) por 5 minutos cada
uno para desparafinar e hidratar, luego se lavaron tres veces con agua destilada por 3
minutos. Posteriormente, los cortes fueron sometidos a un tratamiento para mejorar la
exposición de los antígenos que consistió en incubar la muestra con citrato de sodio 10
mM (pH 6,0) en un horno microondas, 1 minuto a 100% de potencia, 10 minutos a 10%
de potencia y 15 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar el exceso de citrato se
lavó con agua destilada dos veces por 5 minutos. Para eliminar la actividad de la
peroxidasa endógena, los cortes se trataron con 3% peróxido de hidrógeno en metanol
durante 15 minutos. Seguido de tres lavados con tampón fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4;
320 mOsm), por 5 minutos. Se bloqueó y permeabilizó con solución de bloqueo (5%
BSA, 0.3% Tritón X-100, en PBS 0,1 M) por 2 horas en cámara húmeda a temperatura
ambiente. Para la incubación con los anticuerpos primarios (anti-SVCT 1, anti-SVCT2,
anti-GLUT3, anti-MGS y anti-PTG) se utilizaron diluciones de 1:100 en solución de
bloqueo modificada (1% BSA, 0,3% tritón X-100 en PBS 0,1 M). Se incubaron con el
45 anticuerpo primario por toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Posteriormente se
lavaron los cortes tres veces con PBS 0,1 M Tritón 0,3% por 10 minutos. Como
anticuerpo secundario se utilizó anti-igG de cabra, anti-igG de rata y anti-igG de conejo
conjugados con peroxidasa de rábano (HRP), según fuera el caso, en una dilución
1:200 en solución de bloqueo modificada, se incubó por 2 horas en cámara húmeda a
temperatura ambiente. Se lavó tres veces con PBS 1x-Tritón X-100 0,3 % una vez con
PBS 0,1 M por 10 minutos cada uno. Para el revelado se incubó con una solución de
3,3´-diaminobenzidina (DAB) 0,7 mg/mL y 0,03% de peróxido de hidrógeno por 10
minutos en oscuridad seguido de tres lavados con agua destilada por 3 minutos. Los
núcleos fueron teñidos con hematoxilina durante 10 segundos y el viraje de color se
realizó inmediatamente en borato de sodio por 2 segundos. Finalmente, los cortes
fueron deshidratados en una batería ascendente de etanol (70%, 95% II, 95% I, 100% II
y 100% I (v/v)) y xilol por 5 minutos cada uno, para luego ser montados utilizando
bálsamo de Canadá. Los cortes fueron observados en un microscopio de
epifluorescencia OLYMPUS BX 50 agrupado con una cámara OLYMPUS U-TV0 5XC-3.
3.2.5.2 Inmunofluorescencia
Los testículos de rata se fijaron con p-formaldehido al 4% en tampón fosfato 0.1M,
pH 7,4 por 48 horas. Posteriormente, las muestras fueron incluidas en parafina. Los
testículos fijados e incluidos se seccionaron con un micrótomo, obteniéndose cortes
seriados de 5 µm de grosor y fueron montados en portaobjetos de vidrio gelatinizados.
46 Los cortes incluidos en parafina fueron pasados por xilol y una batería descendente de
etanol (100% I, 100% II, 95% I, 95% II, 70%, (v/v)) por 5 minutos cada uno para
desparafinar e hidratar, luego se lavaron tres veces con agua destilada por 3 minutos.
Posteriormente, los cortes fueron sometidos a un tratamiento para mejorar la exposición
de los antígenos que consistió en incubar la muestra con citrato de sodio 10 mM (pH
6,0) en un horno microondas, 1 minuto a 100% de potencia, 10 minutos a 10% de
potencia y 15 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar el exceso de citrato se
lavó con agua destilada dos veces por 5 minutos Después de dos lavados con PBS 0,1
M por 10 minutos, se bloqueó y permeabilizó con solución de bloqueo (5% BSA, 0,3%
Tritón X-100, en PBS 0,1 M) por 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente.
Para la incubación con los anticuerpos primarios (anti-SVCT 1, anti-SVCT2, anti-WT1)
se utilizó una dilución de 1:100 en solución de bloqueo modificada (1% BSA, 0,3%
Tritón X-100 en PBS 0,1 M). Se incubaron con el anticuerpo primario por toda la noche
a 4°C en cámara húmeda. Posteriormente, se lavaron los cortes tres veces con PBS 0.1
M Tritón 0,3% por 10 minutos. Como anticuerpo secundario se utilizó anti-igG de cabra
conjugado a Alexa fluor 596 y anti-igG de conejo conjugado a Alexa fluor 488 en una
dilución 1:200 en solución de bloqueo modificada y se incubó durante 2 horas en
cámara húmeda a temperatura ambiente. Se lavó tres veces con PBS 0,1 M-Tritón X100 0,3 % y una vez con PBS 0,1 M por 10 minutos cada uno. Los núcleos fueron
teñidos utilizando TOPRO-3 1:5000 junto a la incubación del anticuerpo secundario. Las
muestras fueron montadas con medio de montaje para fluorescencia DAKO y
visualizadas utilizando un microscopio confocal invertido.
47 3.2.6 Inmunocitoquimica
Las células de Sertoli 42GPA9 fueron cultivadas sobre cubreobjetos redondos de
vidrio (12mm), previamente tratados con colágeno, las preparaciones fueron fijadas con
Histochoice : etanol (4:1),). Después de dos lavados con PBS 0,1 M ( pH7,4) por 10
minutos, se bloqueó y permeabilizó con solución de bloqueo (5% BSA, 0,3% Tritón X100, en PBS 0,1 M) por 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente. Para la
incubación con los anticuerpos primarios (anti-SVCT 1, anti-SVCT2 y anti-βactina) se
utilizo
diluciones de 1:50 y 1:200 en solución de bloqueo modificada (1% BSA, 0,3%
Tritón X-100 en PBS 0,1 M). Se incubaron con el anticuerpo primario por toda la noche
a 4°C en cámara húmeda. Posteriormente se lavaron los cortes tres veces con PBS 0,1
M-Tritón X-100 0,3% por 10 minutos. Como anticuerpo secundario se utilizó anti-igG de
cabra conjugado a Alexa fluor 488 y anti-igG de ratón conjugado a Alexa fluor 568, en
una dilución 1:200 en solución de bloqueo modificada, se incubó durante 2 horas en
cámara húmeda a temperatura ambiente. Se lavó tres veces con PBS 0,1 M-Tritón X100 0,3 % y una vez con PBS 0,1 M por 10 minutos cada uno. Los núcleos fueron
teñidos con ioduro de propidio 1,7ug/mL o TOPRO 3, según el caso, ambos incubados
junto al anticuerpo secundario. Las muestras fueron montadas con medio de montaje
para fluorescencia DAKO y visualizadas utilizando un microscopio confocal invertido.
48 3.2.7 Extracción y cuantificación de proteínas totales
Las células en cultivo previamente lavadas con PBS 0,1M (pH 7,4) fueron
despegadas de las placas de cultivo utilizando tripsina-EDTA 0,25% (p/v). El sedimento
celular fue resuspendido en tampón A (sacarosa 300 mM, DTT 3 mM, PMSF 100
µg/mL, aprotinina 2 µg/mL, pestatina A 1 µg/mL, leucopeptina 2 µg/mL y EDTA 1 mM,
pH 7,4) y sonicado 3-5 veces durante 15 segundos a 4ºC hasta disgregar
completamente. Los homogeneizados fueron centrifugados a 14,000 x g durante 15
minutos a 4ºC. El sobrenadante fue rescatado y cuantificado mediante el método de
Bradford. Estos extractos proteicos fueron utilizados para realizar ensayos de Western
blot. Las proteínas se cuantificaron utilizando el método de Bradford (Bradford et al.
1976). Se construyó una curva de calibración entre 0 y 40 µg de proteína en un
volumen final de 100 µL. Se utilizó como estándar BSA (2 ug/µL) diluido en agua
deionizada. Para todas las lecturas se utilizó un blanco de agua desionizada, la misma
usada para las diluciones. Se adicionó a cada tubo de la curva 1 mL del reactivo de
Bradford 1x (0.01% azul de Coomasie G, 4.75% etanol, 8.5% ácido fosfórico) y se
incubó por 3 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se realizó la lectura de
absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Para la
cuantificación de las muestras se tomó una alícuota de 5 µL de cada una y se diluyó
hasta completar un volumen final de 100 µL. En seguida se adicionó 1 mL de reactivo
de Bradford 1x.
49 3.2.8 Separación electroforética de proteínas
Las muestras de proteínas fueron separadas electroforéticamente en geles de
poliacrilamida al 10%. El gel separador y el espaciador se prepararon a partir de una
solución de acrilamida:bisacrilamida 30:0,8%. El gel separador se preparó con una
concentración final de poliacrilamida de 10% conteniendo Tris (pH 8,8) 375 mM; SDS
0,1%, persulfato de amonio 0,04% y TEMED 0,03%. Mientras que el gel espaciador se
preparó con una concentración final de poliacrilamida de 3,8% incluyendo Tris 125 mM
(pH 6,8), 0,1% SDS, 0,01% persulfato de amonio y 0,04% TEMED. Se tomaron
muestras de proteínas de 40 µg a 80 µg y se les agregó tampón carga 2X Winkler (Tris
100 mM, 2-mercaptoetanol 2%, SDS 4%, glicerol 20%, azul bromofenol 0,2%, pH 6,8) a
cada una y se calentaron a 95ºC por 5 minutos. Las muestras fueron cargadas en el gel
realizándose la electroforesis a 30mA por 1 hora en tampón de corrida (Tris 25 mM,
glicina 190 mM, SDS 0,1%, pH 8,3). Las proteínas separadas fueron transferidas a
membranas de PVDF.
3.2.9 Transferencia de proteínas a membranas de PVDF
Finalizada la electroforesis, las muestras se electrotransfirieron a membranas de
PVDF (difluoruro de polivinildeno; 0,45 micrones de poro, 100-145 µm de espesor).
Sobre una esponja embebida en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM,
SDS 0,1%, metanol 20%, pH 8,3) se depositó secuencialmente: un trozo de papel de
filtro (Whatman n° 1), la membrana de PVDF (previa activación de la membrana en
metanol por 15 segundos), el gel a transferir, otro papel de filtro y luego otra esponja
50 embebida en el misma tampón. Esto se colocó en una cámara de electrotransferencia
conteniendo el tampón mencionado y se aplicó una intensidad de corriente de 400 mA
por 1 horas. Una vez cumplido el tiempo la membrana se dejó secar a temperatura
ambiente. Para verificar el buen resultado de la transferencia, el gel fue teñido con
solución de azul de Coomassie (30% metanol y 10% ácido acético) durante tres horas,
y luego desteñido en una solución que contenía 30% de metanol y 10% de ácido
acético.
3.2.10 Análisis de Western blot
Para los experimentos de Western blot las membranas se incubaron con 10 ml
de solución de bloqueo (BSA 5%, Tween-20 0,1%) durante 2 horas con agitación
constante a temperatura ambiente. Luego, se expuso las membranas a los anticuerpos
primarios de interés, diluidos 1:5000 – 1:1000 en solución de bloqueo modificada (BSA
1%, Tween-20 0,1%) durante toda la noche con agitación constante a temperatura
ambiente. Finalizado este periodo, las membranas se lavaron tres veces por 20 minutos
en PBS 0,1 M-Tween-20 0,1% y se incubaron con anti-IgG de cabra o ratón conjugado
a peroxidasa de rábano (HRP) 1:5000 en solución de bloqueo modificada durante 2
horas a temperatura ambiente. Finalmente, las membranas se lavaron 2 veces con en
PBS 0,1 M-Tween-20 0,1% y una vez con PBS 0,1 M. El revelado del conjugado se
realizó utilizando un método de quimioluminiscencia, el cual se basa en la emisión de
luz no radiactiva detectando antígenos inmovilizados unidos directa o indirectamente
con anticuerpos conjugados con HRP. Se vertió sobre las membranas una solución que
contenía peróxido de hidrógeno y luminol. Luego de 1 minuto, se expuso durante 10-30
51 minutos un film fotográfico con la membrana tratada con luminol. La reacción fue
revelada con reactivo D72 y fijada con reactivo U3.
3.2.11 Ensayos de transporte
Para los ensayos de transporte los cultivos de células de Sertoli 42GPA9 fueron
crecidas en placas de 12 pocillos. Previo a cada experimento, se analizaron
cuidadosamente los cultivos celulares bajo el microscopio, de modo de asegurar que
sólo aquellos pocillos con densidad celular uniforme fueran usados. Además, se
despegaron las células de tres pocillos de estas placas, las cuales fueron cuantificadas
utilizando una cámara de Neubauer con el fin de estimar el número promedio de células
totales por pocillo. Los ensayos de incorporación con radioisótopos se realizaron según
lo descrito por Angulo y colaboradores (2008). Las células fueron lavadas con tampón
de incubación (Hepes 15 mM, NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8 mM,
pH 7,4, 320 mOsm) e incubadas en esta misma solución durante 30 minutos, a 32ºC en
el caso de Sertoli 42GPA9, para permitir el equilibrio entre los espacios extra e
intracelular. Luego de este periodo, se realizaron los ensayos de captación en 400 µl de
tampón de incubación que contenía 0,1-0,4 µCi de
14
C-L-ácido ascórbico (14C-AA) o 1-
1,2 µCi de D-3-O-[metil-3H] glucosa (3H-OMG). La reacción fue detenida con tampón de
incubación frío que contenía HgCl2 0,2 mM, seguido de 3 lavados con la misma
solución. Luego, las células fueron tratadas con 200 µl de tampón de lisis (Tris-HCl 10
mM pH 8,0, SDS 0,2%) y la radiactividad incorporada fue medida por centelleo líquido.
Los ensayos de transporte de ácido ascórbico se realizaron en presencia de DTT 1-5
52 mM. Con respecto a los ensayos de inhibición, las células fueron pre-incubadas a 32ºC
durante 30 minutos (citocalasina B, citocalasina E) o 1 hora (ouabaína, floridzina).
Todos los ensayos utilizando radioisótopos fueron realizados de acuerdo a las medidas
de bioseguridad del “Manual de Normas de Bioseguridad” de CONICYT de 2008. Los
residuos contaminados fueron almacenados en bodegas especiales destinadas para
ello en las instalaciones del PAAC (Proyecto de Administración Ambiental Corporativo),
de acuerdo al Manual de Procedimiento para el Manejo de Residuos de la UACh.
3.2.12 Modificación del contenido de glutatión
En cultivo de células de Sertoli 42GPA9, el glutatión intracelular fue depletado
por tratamiento con L-butionina-(S,R) sulfoximida (BSO) (0,25 a 2 mM) por 24 horas,
seguido por una incubación de 60 minutos con dietilmaleato (1 mM) (Guaiquil et al.,
1997). En animales, el glutatión celular fue depletado in vivo inyectando BSO
intraperitonealmente a una concentración de 4 mmol/Kg de peso dos veces al día (9 AM
y 9 PM) (Martensson et al., 1991; Martensson y Meister, 1992).
3.2.13 Determinación de glutatión total
Para medir glutatión total (Guaiquil et al., 1997), las células se lisaron con Tritón
X-100 al 0,4% en PBS 0,1 M (pH 7,4) y el homogeneizado se ajustó a 2,5% ácido
sulfosalicílico y se centrifugó a 10.000 x g por 10 min. Un volumen del sobrenadante se
agregó a pocillos de placas de micro titulación conteniendo Na2HPO4 70 mM pH 7,5
EDTA 3,5 mM, 5,5’-ditio-bis-(ácido 2 nitrobenzoico) (DTNB) 0,6 mM, Tritón X-100 0,2%,
53 ácido sulfosalicílico 2,5% y 1000 unidades de glutatión reductasa (tipo III). La reacción
comienzó luego de agregar NADPH y se midió el cambio de absorbancia a 412 nm. La
lectura se realizó durante 1 minuto.
3.2.14 Ensayo de TUNEL
El ensayo fue realizado con TACS TDT Kit, Las células fueron crecidas en
cubreobjetos redondos de 12 mm, luego se fijaron con p-formaldehido al 4% en tampón
fosfato 0.1 M (pH 7,4) por 15 minutos y se permeabilizaron con una solución 1:100 de
proteinasa K 1 mg/ml. Luego se procedió a lavar con una solución de PBS 0,1 M libre
de nucleasas 3 veces por 5 minutos. El control positivo de la técnica de TUNEL se
incubó
con una solución de nucleasas a 37ºC por 30 minutos, mientras las otras
muestras permanecían en PBS 0,1 M. Las nucleasas fueron inactivadas con 2 lavados
de PBS 0,1 M por 5 minutos. Las muestras fueron pre incubadas durante 5 minuto
con tampón TDT 1X (0,1 M tampón TACS SAFE-TDT; 0,05 mg/ml BSA y 0,06 mM 2mercaptoetanol ácido sulfónico), se secaron del exceso del tampón y se incubaron por
una hora a 37ºC con la mezcla reactiva (0,005 mM dNTP biotinilados, cobalto, y enzima
Desoxinucleotidil Transferasa Terminal). La reacción se detuvo incubando con tampón
STOP 1X (0,01 M EDTA, pH 8,0) durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego de
lavar 2 veces con PBS 0,1 M durante 2 minutos. Posteriormente, se incubó con una
solución de estreptovidina conjugadas con peroxidasa de rábano (HRP) 1:200 durante
25 minutos. Finalmente, las muestras se lavaron 3 veces con PBS 0,1 M y se procedió
a revelar. Para el revelado se incubó con una solución de 3,3´-diaminobenzidina (DAB)
0,7 mg/mL y 0,03% de peróxido de hidrógeno por 10 minutos en oscuridad seguido de
54 tres lavados con agua destilada por 3 minutos. Se realizó una tinción nuclear con
hematoxilina durante 10 segundos y puestos inmediatamente en borato de sodio por 2
segundos. Finalmente los cortes fueron deshidratados en una batería ascendente de
etanol (70%, 95% II, 95% I, 100% II y 100% I (v/v)) y xilol por 5 minutos cada uno, para
luego ser montados utilizando bálsamo de Canadá. Los cortes fueron observados en un
microscopio de epifluorescencia OLYMPUS BX 50 con cámara OLYMPUS U-TV0 5XC-3.
Cuando se utilizaron cortes histológicos de testículo de rata, los cortes incluidos
en parafina fueron pasadas por xilol y una batería descendente de etanol (100% I,
100% II, 95% I, 95% II, 70%, (v/v)) por 5 minutos cada uno para desparafinar e hidratar,
luego se lavaron tres veces con agua destilada por 3 minutos. Se lavaron 2 veces con
PBS 0,1 M y se continuaron permeabilizando igual que el ensayo descrito anteriormente
en células de Sertoli.
3.2.15 Análisis estadístico
La significancia de las diferencias entre tratamientos, para datos que
cumplieron con los supuestos de pruebas paramétricas, fue obtenida con análisis de
varianza (ANOVA), de una y dos vías, seguidas por la prueba a posteriori de
Bonferroni`s, la que permite evaluar las diferencias entre todos los grupos. Para estas
pruebas, diferencias con valores p<0.05 fueron interpretadas como significativas.
Todos los análisis fueron realizados utilizando el software estadístico GraphPad Prism
5.0.
55 4. RESULTADOS
4.1 Trasportadores de ácido ascórbico en el epitelio seminífero
El desarrollo del epitelio seminífero y la espermatogénesis de mamíferos, son
procesos muy complejos que involucran eventos de migración celular, proliferación,
diferenciación, e interacción célula a célula. Múltiples estudios han demostrado que
agentes tóxicos como los pesticidas, producen un aumento significativo del estrés
oxidativo en el testículo, conduciendo a un daño en las células germinales, causado
alteraciones durante la espermatogénesis. (Samanta y Chainy, 1997). Dentro de las
barreras de defensa frente a los daños producidos por estrés oxidativo, la vitamina C
juega un rol fundamental en distintos tipos celulares. Tomando en consideración lo
anterior, la presencia de transportadores de AA se vuelve primordial para la adquisición
de esta protección durante el desarrollo del sistema reproductor masculino.
Se analizó la expresión y localización de los co-transportadores de Na+/ascorbato
(SVCTs) en cortes de testículo de rata de distintas edades. Para poder ver la presencia
de los transportadores de AA en células de Sertoli en los cortes se utilizó un marcador
específico de estas células, la proteína WT1, factor de transcripción de la familia de
factores activadores dedos de zinc, siendo abundante en el tumor de Wilms (WT)
(Matsunaga, 1981), el cual es un tumor embrionario que se expresa específicamente en
las células de Sertoli y no en las células germinales (Merhi et al., 2001). La presencia de
la proteína SVCT1 y SVCT2 en el epitelio seminífero fue demostrada mediante
inmunofluorescencia y Western blot, utilizando anticuerpos purificados por afinidad,
dirigidos contra un péptido ubicado en la porción N-terminal de estos transportadores.
56 Se realizaron co-inmunofluorescencia indirecta para WT1 y SVCT1 (figura 8) y WT1 y
SVCT2 (figura 9) en cortes de testículo de rata de 1, 5, 15 ,35 y 60 días de edad. En la
figura 1 se observó la inmunorreacción positiva para WT1 en todas las edades, con
mayor intensidad en la base del túbulo a partir de los 15 días de desarrollo, el resto de
la marca podría corresponder a las prolongaciones de las células de Sertoli que van
desde la región basal a la región adluminal del túbulo seminífero. Esto también se
observó en la figura 9, presentando el mismo patrón durante las distintas edades.
Con respecto a los transportadores de AA, se observó una inmunorreacción
positiva para SVCT1 en las distintas edades, sin embargo, hay diferencias en el patrón
de expresión y localización durante el desarrollo del epitelio seminífero (Figura 8). En el
primer día se observó un intensa inmunorreacción en la base del túbulo seminífero de
carácter puntiforme. A los 5 días se observó una marca punteada de menor intensidad
localizada a lo largo de todo el túbulo seminífero, esta se mantiene a los 15 y 35 días de
desarrollo. Por último, a los 60 días la marca para SVCT1 se vuelve más difusa, pero
siempre con una leve tendencia puntiforme. La co-localización de SVCT1 y WT1 se
observó muy débil en todas las edades. La presencia de SVCT1 en el epitelio
seminífero fue confirmada mediante ensayo de Western blot, utilizando extracto de
proteínas totales de testículo de 60 días. Se detectó una banda correspondiente al
tamaño de 49 kDa para SVCT1 (Figura 8, B, carril 1). Se utilizó anticuerpo contra βactina como control de carga, detectándose una banda de 43kDa (Figura 8, B, carril
2). En ensayos descritos en la literatura SVCT1 presentó una banda de 55-65 kDa
aproximadamente en tejido de rata y ratón (Jin et al., 2005; Mun et al., 2006; Lee et al.,
2006).
57 A
B
58 Figura 8. Localización de SVCT1 y del marcador de células de Sertoli, WT1,
durante el desarrollo del epitelio seminífero de rata. A. Análisis inmunohistoquímico
para WT1 (verde) y SVCT1 (rojo) en cortes de testículo de rata de 1, 5, 15, 35 y 60 días.
Se muestra la superposición de imágenes de SVCT1 y WT1 (Merge) y una ampliación
de ésta (Zoom) en cada caso. La co-localización de ambas proteínas se observa en
amarillo. La barra de magnificación corresponde a 20 µm. B. Western blot para SVCT1
utilizando proteínas totales de testículo (1), como control de carga se utilizó β-actina (2).
59 Para SVCT2 se observó la aparición de inmunorreacción en la base del túbulo
seminífero a partir de los 15 días, sin embargo, en los primeros días de desarrollo la
marca es muy débil a lo largo del todo el túbulo seminífero. La co-localización de
SVCT2 y WT1 es muy marcada a los 15, 35 y 60 días (Figura 9, A), observándose sólo
a partir de los 15 días. La presencia de SVCT2 en el epitelio seminífero fue confirmada
mediante ensayo de Western blot, utilizando extracto de proteínas totales de testículo
de rata de 60 días. Se detectaron dos bandas correspondientes a los tamaños de 53 y
75 kDa (Figura 9, A, carril 1). Se usó anticuerpo contra β-actina como control de carga,
detectándose una banda de 43kDa. (Figura 9, B, carril 2). Se ha descrito que SVCT2
presenta una banda intensa de 66 kDa aproximadamente en tejidos de rata y ratón (Wu
et al., 2003; García et al., 2005; Jin et al., 2005; Mun et al., 2006; Lee et al., 2006).
60 A B
61 Figura 9. Localización de SVCT2 y del marcador de células de Sertoli, WT1,
durante el desarrollo del epitelio seminífero de rata. A. Análisis inmunohistoquímico
para WT1 (verde) y SVCT2 (rojo) en cortes de testículo de rata de 1, 5, 15, 35 y 60 días.
Se muestra la superposición de imágenes de SVCT2 y WT1 (Merge) y una ampliación
de ésta (Zoom) en cada caso. La co-localización de ambas proteínas se observa en
amarillo. La barra de magnificación corresponde a 20 µm. B. Western blot para SVCT2
utilizando proteínas totales de testículo (1), como control de carga se utilizó β-actina (2).
62 Con el fin de comparar la distribución de los SVCTs a lo largo del epitelio
seminífero se estudió la localización de SVCT1 y SVCT2 en cortes de testículo de rata
adulta. Para determinar si estas proteínas se encuentran en las células de Sertoli en el
epitelio seminífero, se utilizó el marcador específico WT1 en ensayos de doble
inmunofluorescencia indirecta. Los núcleos fueron teñidos con TOPRO-3, una sonda
nuclear que facilita el reconocimiento de las células presentes en el túbulo seminífero,
mediante morfología nuclear. Al analizar la localización de SVCT1 en el tejido se
observó una inmunorreacción difusa y puntiforme a lo largo del epitelio, además se
observó una marca intensa para SVCT1 en la cola de los espermatozoides (Figura 10,
A). Al realizar la superposición de ambas imágenes (WT1 y SVCT1) se observó que
existen zonas de co-localización discretas las cuales sugieren que SVCT1 se localiza
en células que son positivas para el marcador de células de Sertoli WT1 (Figura 10, A).
Al utilizar el mismo tipo de análisis usando anticuerpos específicos contra SVCT2, se
observó una reacción intensa en la región basal del túbulo, además, al igual que
SVCT1, SVCT2 se encuentra en las colas de los espermatozoides (Figura 10, B). Al
observar la superposición de ambas imágenes se vió una co-localización muy
abundante en la zona basal del túbulo seminífero indicando que SVCT2 estaría
presente en células de Sertoli (Figura 10, B).
En conclusión, estos resultados sugieren que los transportadores de AA se
expresan diferencialmente durante el desarrollo del epitelio seminífero de rata y que
ambas isoformas están presentes con distinto patrón de localización en el túbulo
seminífero en ratas reproductivamente maduras.
63 A
B
64 Figura 10. Inmunolocalización de SVCT1 y SVCT2 lo largo de todo el túbulo
seminífero de rata. Análisis inmunohistoquímico para WT1 (A, B), SVCT1 (A) y SVCT2
(B), en cortes de testículo de rata adulta. Los núcleos fueron marcados con TOPRO 3.
Se muestra la superposición de imágenes de SVCT1/2 y WT1 (Merge) y una ampliación
de cada imagen (Zoom). La co-localización de ambas proteínas se observa en amarillo.
La barra de magnificación corresponde a 20 µm.
65 4.2 Expresión y función de SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli
La vitamina C puede ser adquirida por las células en su forma oxidada, ácido
deshidroascórbico, o en su forma reducida, ácido ascórbico. Es importante destacar
que prácticamente toda la vitamina C en el organismo se encuentra como AA (Schorah
et al., 1996). Por otro lado, las células de Sertoli son las encargadas de formar la BHT,
impidiendo eficazmente la entrada de sustancias al compartimento adluminal, Por lo
tanto, se procedió a identificar la expresión de los transportadores SVCTs mediante RTPCR, inmunofluorescencia y Western blot en células de Sertoli 42GPA9 con el objeto
de averiguar si AA puede ser transportado al compartimento adluminal. Según análisis
de RT-PCR realizados a partir de preparaciones de RNA total obtenidas de los cultivos,
utilizando partidores específicos para el mRNA de SVCT1 y SVCT2 fue posible
amplificar un fragmento de 304 pb para SVCT1 (Figura 11, A, carril 1) y 307 pb para
SVCT2 (Figura 11 A, carril 3), los cuales corresponden al tamaño esperado. El mismo
fragmento fue amplificado en muestras provenientes de cDNA de células Caco-2, las
cuales expresan ambas isoformas de SVCTs (Figura 11, A, carril 2 y 4). No se observó
banda en el control negativo.
La presencia de las proteínas SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli fue
demostrada por análisis de Western blot e inmunofluorescencia. Utilizando extracto de
proteínas totales de células de Sertoli 42GPA9, se detectó una banda correspondiente
al tamaño de 50 kDa para SVCT1 tanto en las células de Sertoli (Figura 11, B, carril 1),
como en proteínas totales de células Caco-2 usadas como control positivo (Figura 11,
B, carril 2), y una banda de 62 kDa aproximadamente para SVCT2, tanto en los
extractos de células de Sertoli (Figura 11, B, carril 3), como en extractos de neuronas
66 corticales en cultivo usados como control positivo (Figura 11, B, carril 4). Usando los
mismos anticuerpos se realizó la técnica de inmunofluorescencia para SVCT1 y SVCT2
en células de Sertoli 42GPA9 y en células de cultivo primario. Se observó una marcada
fluorescencia usando anti-SVCT1 a nivel del citoplasma principalmente y en menor
grado en la membrana celular de las células de Sertoli 42GPA9, en cambio en los
cultivos primarios la fluorescencia detectada es más débil a nivel de citoplasma y
membrana celular (Figura 11, C). Por otro lado, utilizando anticuerpos contra SVCT2,
se observó marca en el citoplasma y la membrana de las células de Sertoli 42GPA9, en
cambio en los cultivos primarios se observó una intensa fluorescencia en el citoplasma
y la membrana celular (Figura 11, C).
Todos estos resultados demuestran que las proteínas son expresadas y
sintetizadas por las células de Sertoli, pero no nos dan evidencia si estos trasportadores
son funcionales en este sistema celular. Para averiguar si los transportadores SVCT1 y
SVCT2 son funcionales, se realizaron ensayos de transporte de AA en células de
Sertoli 42GPA9. Los ensayos de incorporación se realizaron durante 5 minutos a 32º C
frente a concentraciones crecientes de AA. La incorporación resultó ser saturable, lo
cual es una característica clásica de este transportador. (Figura 11, D). Análisis de
Eadie-Hofstee demostró que la incorporación de AA es mediada por 2 componentes.
Un componente de gran afinidad con una Km aparente de 10-12 µM y una Vmax de
100-121 pmoles/106celxmin, y un componente de menor afinidad con una Km aparente
entre 38 mM y una Vmax de 70-90 pmoles/106celxmin (Figura 4, E).
Los estudios de inhibición en los ensayos de transporte son importantes para
determinar la función de los mismos. Se utilizan sustancias conocidas en cuanto a su
67 poder bloqueador de ciertas actividades y/o etapas. Citocalasina B y E son muy
utilizadas, pues la primera es un inhibidor específico de los transportadores facilitativos
de hexosas, mientras que la segunda no causa efecto en la función de estos
transportadores (Basketter y Widas, 1978; Deves y Krupka, 1978). Floridzina (PHL) es
un inhibidor de los transportadores de glucosa dependientes de sodio (SGLTs)
(Toggenburger et al., 1982), mientras que ouabaína inhibe la bomba sodio-potasio
ATPasa. Se llevaron a cabo estudios de inhibición y competencia los cuales revelaron
que tanto floridzina como ouabaína disminuyen significativamente el transporte de AA
100 µM en aproximadamente 70% (Figura 11, F). Lo que indica que el transporte de AA
es mediado por los co-transportadores de sodio/ascorbato, pues los datos se
correlacionan con los ya descritos para este transporte (Padh y Aleo, 1987). Además,
se analizó el efecto del inhibidor específico, citocalasina B, de los transportadores
facilitativos de hexosas que son capaces de transportar DHA pero no AA. Se observó,
que citocalasina B y citocalasina E no inhiben el transporte de AA en células de Sertoli y
que usando los análogos de glucosa DOG y OMG, que son transportados por los
transportadores facilitativos de hexosas, no se observa una diferencia estadísticamente
significativa.
En conclusión, estos resultados confirman que las células de Sertoli 42GPA9 son
capaces de expresar el mensajero de ambas isoformas de los co-transportadores de
sodio/ascorbato, sintetizar las proteínas (SVCT1 y SVCT2), e incorpora AA a través de
transportadores funcionales.
68 A
C
B
69 Figura 11. Funcionalidad de los transportadores de ácido ascórbico en
células de Sertoli. A. Análisis de RT-PCR para SVCT1 y SVCT2. Carril 1: RNA total
aislado de línea celular de Sertoli 42GPA9, carril 2: RNA de células Caco-2. B. Análisis
de Western blot para SVCT1 y SVCT2, carril 1: proteínas aisladas de la línea celular de
Sertoli 42GPA9; carril 2: proteínas de células Caco-2 (SVCT1) y proteínas de neuronas
corticales (SVCT2) ambas usadas como controles positivos, respectivamente. C.
Inmunofluorescencia para SVCT1 (verde) y SVCT2 (verde) en las células de Sertoli
42GPA9 y cultivo primario de células de Sertoli. Los núcleos fueron teñidos con ioduro
de propidio, PI, (rojo). La barra de magnificación corresponde a 20 µm. D. Curva de
saturación para la incorporación de
14
C-ácido ascórbico (AA) (5 min, 32ºC). E. Gráfico
de Eadie-Hofstee para los datos obtenidos en D. F. En la gráfica se observa el efecto
de distintos inhibidores (floridzina, ouabaína, citocalasina E y B) y sustratos (2-desoxi-Dglucosa, DOG, y 3-O-metilglucosa, OMG) en el transporte de AA 100 µM a 32ºC por 5
min. Los datos corresponden a la media de 3 experimentos independientes ± DS. ***
p<0,001. Extraído de Angulo et al., (2008).
70 4.3 Efecto del BSO sobre el epitelio seminífero
El glutatión es un antioxidante que desempeña un papel clave en el control de la
infertilidad masculina (Luberda, 2005). El L-butionina-S,R-sulfoxamida (BSO) bloquea la
síntesis de GSH mediante la inhibición específica de la primera enzima de su síntesis,
la y-glutamilcisteína sintetasa (Griffith y Meister, 1979), por lo que se ha usado
ampliamente para disminuir el glutatión celular en gran variedad de tejidos, tanto in vivo
como in vitro. En estudios de depleción de glutatión realizados en testículo de rata
utilizando BSO demostraron que los niveles de glutatión disminuyen en un 20% a las 24
horas, sin embargo se recupera lentamente a las 72 horas, llegan a valores muy
similares a los normales (Teaf et al., 1987; Hirano et al., 1997). Hasta la fecha no se ha
demostrado el efecto del BSO en la viabilidad de las células espermatogénicas, ni se ha
relacionado
con
la
expresión
y
localización
de
los
co-transportadores
de
sodio/ascorbato.
Para visualizar el efecto del BSO sobre la viabilidad de las células
espermatogénicas, se trataron ratas con 4 mmol/kg de BSO durante 24 y 48 horas. Se
obtuvieron cortes histológicos de los testículos y se realizaron ensayos semicuantitativos mediante la técnica de TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick end labeling), la
que se fundamenta en la detección de quiebres de DNA internucleosomal, que tienen
lugar durante la apoptosis. En la figura 12, A se observan las imágenes representativas
del ensayo en todos los tratamientos. Con flechas blancas se indican las células TUNEL
positivas. Además, se muestra un gráfico representativo de las células TUNEL positivas
en cada 10 túbulos seminíferos versus los distintos tratamientos con BSO (figura 12,
B), indicando que no hay diferencias significativas en la viabilidad celular de los
71 testículos de rata tratados con BSO y los controles. En todos los casos se obtuvieron
aproximadamente 2 células TUNEL positiva/10 túbulos seminíferos, siendo muy
similares a los encontrados en condiciones fisiológicas en testículos de rata de 60 días.
Los resultados expuestos anteriormente, demuestran que los tratamientos con
BSO no afectan en la viabilidad de las células espermatogénicas en testículos de rata
adulta.
72 A B 73 Figura 12. Alteración del contenido de glutatión y su efecto en la viabilidad
celular en el epitelio seminífero de rata. Se inyectó BSO intraperitonealmente a una
concentración de 4 mmol/Kg de peso. Los cortes fueron obtenidos luego de un
tratamiento de 24 y 48 horas con BSO. Análisis semi-cuantitativo mediante la técnica de
TUNEL en cortes de testículo de rata adulta depletadas de glutatión. En flecha blanca
se observa una célula TUNEL positiva. A. se muestran imágenes representativas y el
control positivos de la técnica de TUNEL. Los núcleos fueron teñidos con hematoxilina
(azul). B se muestra el gráfico representativo.
74 Teniendo en cuenta la relación funcional que existe entre el glutatión y la
vitamina C y el efecto producido por deficiencia de glutatión sobre esta vitamina,
sumado a que en los sistemas biológicos la vitamina C se encuentra en su forma
reducida, se podría pensar que glutatión podría ejercer algún efecto sobre la expresión
de los transportadores de AA (SVCTs). Para esto se realizaron ensayos de
inmunohistoquímica con el fin de ver la presencia y localización de SVCT1 Y SVCT2 en
cortes de testículo de rata tratados con BSO durante 24 y 48 horas. En la
inmunodetección de SVCT1, se observó la típica marca puntiforme que va desde la
región basal a la región adluminal del túbulo seminífero en las ratas controles, sin
embargo en los cortes tratados por 24 horas con BSO hay una notable disminución en
la marca para SVCT1. Este efecto se vió revertido a las 48 horas con una intensa y
marcada inmunorreacción en células que se encuentran en la base del túbulo
seminífero, sugiriendo una redistribución de SVCT1 comparado con el control (Figura
13). Del mismo modo, se inmunodetectó SVCT2 en los cortes de testículo depletados
de glutatión sin encontrar ningún cambio en las distintas condiciones, observándose un
intensa inmunorreacción en la base del túbulo seminífero, característica de esta
isoforma (Figura 14).
75 76 Figura 13. Expresión de SVCT1 en el epitelio seminífero de rata depletado
de glutatión. Se realizó inmunohistoquímica en cortes de testículo de ratas depletadas
de glutatión, inyectando intraperitonealmente BSO a una concentración de 4 mmol/Kg
de peso. Los cortes fueron obtenidos luego de un tratamiento de 24 y 48 horas con
BSO. Se muestra la inmunorreacción de SVCT1 (café). En cada caso se muestra una
ampliación de la imagen (Zoom). Los núcleos fueron teñidos con hematoxilina (azul). La
barra de magnificación corresponde a 20 µm.
77 78 Figura 14. Expresión de SVCT2 en el epitelio seminífero de rata depletado
de glutatión. Se realizó inmunohistoquímica en cortes de testículos de ratas
depletadas de glutatión, inyectando BSO intraperitonealmente a una concentración de 4
mmol/Kg de peso. Los cortes fueron obtenidos luego de un tratamiento de 24 y 48
horas con BSO. Se muestra la inmunorreacción de SVCT2 (café). Los núcleos fueron
teñidos con hematoxilina (azul). En cada caso se muestra una ampliación de la imagen
(Zoom). La barra de magnificación corresponde a 20 µm.
79 Estudios previos demostraron que el BSO es capaz de disminuir en un 20% el
contenido de glutatión en testículo de rata, Nosotros demostramos que este efecto no
produce alteración en la viabilidad de las células espermatogénicas. Con respecto a la
relación de glutatión con la vitamina C, encontramos que una de las isoformas de los
transportadores de sodio/ascorbato, SVCT1 se ve alterada a nivel de expresión y
localización celular en el epitelio seminífero de rata.
Se analizaron otras proteínas mediante inmunohistoquímica en los mismos
cortes de testículo de rata tratados con BSO, con el fin de demostrar que el efecto del
BSO era específico para SVCT1 y no un efecto sistémico. Para esto se inmunodetectó
GLUT3, un transportador facilitativo de hexosas que está involucrado en el metabolismo
de la vitamina C. GLUT3 tiene una alta afinidad por 2 desoxi-D-glucosa (2-DOG), sin
embargo, es capaz de trasportar galactosa, manosa, xilosa y ácido deshidroascórbico.
Se ha demostrado su expresión en testículo, células de Sertoli y en células germinales
masculinas (Rauch et al., 2004; Angulo et al., 2008; Kokk et al., 2007). Los análisis de
inmunohistoquímica fueron positivos para GLUT3, tanto en testículo tratados con BSO
como el control (Figura 15), se observó un intensa marca en la membrana plasmática
en células ubicadas en la zona adluminal del epitelio seminífero y en la cola de los
espermatozoides.
80 81 Figura 15. Expresión de GLUT3 en el epitelio seminífero de rata depletado
de glutatión. Se realizó inmunohistoquímica en cortes de testículo de ratas depletadas
de glutatión celular, inyectando BSO intraperitonealmente a una concentración de 4
mmol/Kg de peso. Los cortes fueron obtenidos luego de un tratamiento de 24 y 48
horas con BSO. Se muestra la inmunorreacción con GLUT 3 (café). Los núcleos fueron
teñidos con hematoxilina (azul). En cada caso se muestra una ampliación de la imagen
(Zoom). La barra de magnificación corresponde a 20 µm.
82 Asimismo, se analizaron proteínas que no tienen relación con el metabolismo de
la vitamina C, sino con el metabolismo del glicógeno. El glicógeno es una forma
importante de almacenamiento energético en mamíferos. La glucógeno sintasa (GS) y
glucógeno fosforilasa (GP) son las encargadas de la síntesis y degradación del
glicógeno respectivamente, las cuales están sujetas a múltiples niveles de regulación
tanto hormonal como alostérico. La glicógeno sintasa es activada por desfosforilación,
mientras que ocurre lo contrario con la glucógeno fosforilasa (Lawrence y Roach, 1997).
En mamífero se han descrito 2 isoformas de glucógeno sintasa, una isoforma hepática
(LGS), la cual es tejido específica, y una forma muscular (MGS), la cual no sólo se
expresa en tejido muscular, sino que también en tejido adiposo, riñón, bazo y sistema
nervioso (Nuttall y Gannon, 1993; Shulman, et al., 1995). En trabajos anteriores se ha
demostrado actividad de la glucógeno sintasa en testículo como fluctuaciones cíclicas
del contenido de glucógeno en las células del epitelio seminífero (Fouquet y Guha,
1969), sin embargo, no se ha descrito a qué isoforma se atribuye esta actividad. En
nuestro laboratorio se ha demostrado que en testículo de rata se encuentra presente la
isoforma muscular de la glicógeno sintasa (Villarroel et al., datos no publicados).
Utilizando anticuerpos específicos contra MGS se realizó inmunohistoquímica en cortes
de testículo de rata tratados con BSO (Figura 16). Los resultados muestran que sólo se
logró inmunodetectar la proteína en los cortes controles, observando una marca
contínua a lo largo de todo el epitelio seminífero siendo más intensa en la base.
También hubo inmunorreacción positiva en la cola de los espermatozoides y en las
células de Leydig.
83 84 Figura 16. Expresión de glicógeno sintasa en el epitelio seminífero de rata
depletado de glutatión. Se realizó inmunohistoquímica en cortes de testículos de ratas
depletadas de glutatión celular, inyectando BSO intraperitonealmente a una
concentración de 4 mmol/Kg de peso. Los cortes fueron obtenidos luego de un
tratamiento de 24 y 48 horas con BSO. Se muestra la inmunorreacción de glicógeno
sintasa muscular, MGS, (café). En cada caso se muestra una ampliación de la imagen
(Zoom). Los núcleos fueron teñidos con hematoxilina (azul). La barra de magnificación
corresponde a 20 µm.
85 Por otro lado, la proteína fosfatasa 1 (PP1) es la responsable de la
desfosforilacion de GS y GP, para ser activada requiere estar unida a moléculas de
glucógeno. Esto se logra por la presencia de subunidades-G de unión especifica a
moléculas de glucógeno, las cuales son responsable de dirigir la PP1 a las moléculas
de glucógeno (Hubbard y Cohen, 1991). Hasta la fecha se han descrito 4 diferentes
subunidades-G, entre la que destaca PTG,
expresada principalmente en músculo,
hígado y tejido adiposo (Aggen et al., 2000; Brady, et al., 1997), sin embargo, en
nuestro laboratorio se ha demostrado la expresión del mRNA de esta proteína de
andamio en testículo de rata (Villarroel et al, datos no publicados). Asimismo, se ha
demostrado que PTG, además de su capacidad por dirigir a la PP1 hacia el glucógeno,
es capaz de unir diferentes enzimas involucradas en el metabolismo del glucógeno,
como GS y GP (Brady et al., 1997; Printen et al., 1997). Utilizando anticuerpos
específicos contra PTG, se realizaron ensayos de inmunohistoquímica en los cortes de
testículo de rata tratados con BSO (Figura 17). La inmunodetección fue positiva en
todos los casos, observándose una marca intensa en las células de Leydig del epitelio
seminífero. Los tratamientos con BSO produjeron un aumento en la inmunorreacción
para PTG a las 24 y 48 horas.
Los resultados anteriormente expuesto, nos sugieren que niveles bajos de
glutatión en testículo de rata podrían modular la expresión y localización de SVCT!, y no
de SVCT2 y GLUT3. Sin embargo, deficiencia de glutatión produce alteraciones en
proteínas que no tienen relación con el metabolismo de la vitamina C.
86 87 Figura 17. Expresión de PTG en el epitelio seminífero de rata depletado de
glutatión. Se realizó inmunohistoquímica en cortes de testículos de ratas depletadas
de glutatión celular, inyectando BSO intraperitonealmente a una concentración de 4
mmol/Kg de peso. Los cortes fueron obtenidos luego de un tratamiento de 24 y 48
horas con BSO. Se muestra la inmunorreacción con PTG (café). Los núcleos fueron
teñidos con hematoxilina (azul). En cada caso se muestra una ampliación de la imagen
(Zoom). La barra de magnificación corresponde a 20 µm.
88 4.4 Determinación del contenido de glutatión intracelular en células de Sertoli
42GPA9
Se han determinado concentraciones elevadas de glutatión en testículo de rata y
ratón (Calvin y Turner; 1982). En espermatocitos y espermátidas aislados de hámster
se ha observado una disminución gradual del contenido de glutatión durante
incubaciones prolongadas, pero sin una pérdida en la viabilidad celular, ya que el
contenido de ATP en las células se mantiene (den Boer et al, 1989). Esto sugiere que
las células germinales no poseen la maquinaria o los precursores necesarios para la
síntesis de glutatión, proponiendo una nueva función para la célula de Sertoli en la
síntesis de glutatión por parte de las células germinales. Además, las células de Sertoli
serían las encargadas de acumular el ácido ascórbico en el lumen del túbulo
seminífero. Por estas razones se procedió a estudiar el efecto de la depleción de
glutatión sobre la expresión y localización de los co-trasportadores de sodio/ascorbato
en estas células.
Primeramente, utilizando células de Sertoli 42GPA9 se determinó el contenido
normal de glutatión intracelular. Para ello se midió el volumen de intercambio celular,
con el fin de poder determinar con exactitud la concentración de glutatión de cada
célula. Para esto se realizaron ensayos de trasporte con 3-O-metilglucosa (OMG), un
análogo de glucosa no metabolizable. Este sustrato es específico para los
transportadores facilitativos de hexosas, y es transportado a favor de un gradiente de
concentración hasta alcanzar un equilibrio en el cual la cantidad de análogo que entra
se iguala a la que sale, de esta forma se podrá determinar el volumen de intercambio
celular.
89 En experimentos de incorporación de este sustrato usando 0,5 mM de OMG se
observó un aumento lineal de la incorporación en estas células durante el primer minuto
de incubación, con una velocidad inicial de 1076 ± 150 pmoles/106célulaxminuto
(Figura 18, A). Se determinó un volumen de intercambio celular de 3,2µL/106 células.
Los análisis de dosis respuesta del transporte de OMG indican que el transporte
aumenta a medida que aumentó la concentración de sustrato (Figura 18, B).
A continuación, se determinó la concentración de glutatión intracelular total
(GSH +GSSG) en cultivos de células de Sertoli 42GPA9. El principio de la cuantificación
se basa en la velocidad de formación del cromóforo TNB tras la reducción de DTNB, ya
que esto es proporcional a la suma de GSH y GSSG. Las células fueron crecidas en
placas de 12 pocillos y luego se midió el contenido glutatión cada 24 horas de cultivo.
Se observó una variabilidad en el contenido de glutatión en las células de Sertoli
durante 72 horas de cultivo, obteniendo concentraciones promedios entre 1,5-4,7mM
(Figura 17, C). Este fenómeno ya ha sido reportado anteriormente (Guaiquil et al.,
1997).
90 A
B
C
91 Figura 18. Determinación del contenido de glutatión
en células
Sertoli
42GPA9. A y B. Ensayos funcionales utilizando 3H-OMG en células de la línea 42GPA9
mantenidas durante 7 días en cultivo. A. Cinética de incorporación de OMG 0,5 mM a
20 ºC durante 600 segundos. La línea en los gráficos corresponde al ajuste a una
exponencial (R = 0,9860). Determinando un volumen de intercambio de 3,2µL/106
células. B. Curva de saturación para la incorporación de OMG (30 segundos, 20 ºC). La
línea corresponde al ajuste a una hipérbola rectangular (R = 0,9914) de la cual se
obtuvieron los parámetros: Km= 4 ± 0,2 mM y Vmax= 1042 ± 211 pmoles/106celxmin. C.
Gráfico representativo de la concentración de glutatión intracelular en cultivo de células
de Sertoli. La concentración de glutatión total fue determinada mediante una
cuantificación espectrofotométrica.
92 Por último, se modificó el contenido de glutatión usando tratamientos con BSO,
DEM y BSO/DEM. El dietil maleato (DEM) es un sustrato para la GST, siendo utilizado
para disminuir los niveles de glutatión mediante una reacción de conjugación catalizada
por esta enzima (Allameh et al, 1987). Este compuesto ha sido ampliamente utilizado
para depletar de glutatión cultivos celulares, incluyendo células de ovario de hámster
chino (Mitchell et al., 1983; Rice et al., 1986), células de carcinoma de pulmón humano
(Brodie y Reed, 1985), espermátidas redondas de ratas (den Boer et al., 1989). Los
tratamientos con 0,25; 0,5; 1 y 2 mM de BSO durante 24 horas produjeron una fuerte
caída de glutatión de 5,8 mM en las células no tratadas a 560 µM con 0,25 mM de BSO,
con 0,5; 1 y 2 mM BSO se obtuvieron concentraciones muy similares entre 70 y 50 µM.
(Figura 19, A). El DEM tiene un efecto agudo sobre la concentración de glutatión
intracelular, 1 mM de DEM produce una disminución del 55% del glutatión intracelular
en sólo 60 minutos. (Figura 19, B). Al tratar las células con ambas moléculas,
BSO/DEM, la condición con 0,25 mM BSO por 24 horas seguido de 1 mM DEM durante
1 hora se obtuvo una concentración de 650 µM, siendo muy similar al valor obtenido
cuando las células fueron tratadas sólo con 0,25 mM BSO. Por el contrario, en las
células tratadas con 0,5; 1 y 2 mM BSO seguido del tratamiento con DEM no se detectó
glutatión (Figura 19, B), debido a la sensibilidad del método.
Los cultivos de Sertoli 42GPA9 tratados con BSO, DEM y BSO/DEM no
mostraron toxicidad celular bajo las condiciones experimentales en estudio, se
realizaron ensayos de viabilidad celular por exclusión con azul de tripán, la cual fue
siempre mayor al 95% (Figura 18, C y D).
93 De estos resultados, se concluye que la modificación del contenido de glutatión
en las células de Sertoli 42GPA9 utilizando BSO y DEM, no afecta la viabilidad,
logrando así obtener cultivos celulares libres de este tiol.
94 A
B
***
C
***
***
**
***
***
***
***
D
FIGURA 19: Modificación del contenido de glutatión en células de Sertoli
42GPA9. A y B. Se realizaron ensayos de depleción del contenido intracelular de
glutatión en células de Sertoli 42GPA9. Se utilizaron células no tratadas (control),
incubadas por 24 horas con 0,25; 0,5; 1 y 2 mM BSO (A), o incubadas con 0,25; 0,5; 1 y
2 mM BSO seguida de un tratamiento de una hora con 1 mM dietil maleato, DEM, (B).
C y D. Análisis de viabilidad en células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión,
mediante exclusión con azul de tripán. Los datos corresponden a la media de 3
experimentos independientes ± DS. *** p<0,001; ** p<0,01.
95 4.5 Efecto de la ausencia de glutatión sobre la expresión y función de los
transportadores de AA en células de Sertoli
Para tener una mejor aproximación del efecto producido por la alteración del
metabolismo del glutatión sobre los transportadores de AA, se analizó la expresión y
función de los co-trasportadores de sodio/ascorbato en células de Sertoli 42GPA9
depletadas de glutatión.
Los siguientes experimentos las células de Sertoli 42GPA9 fueron incubadas con
1 mM BSO durante 24 horas o 48 horas, seguido
de 1mM DEM por 1 hora,
respectivamente. El tratamiento BSO/DEM produjo una fuerte caída del glutatión total
de aproximadamente 6 mM en las células controles a concentraciones no detectables
por el método en las células tratadas. Cuando estas células depletadas de glutatión se
cultivaron en un medio libre de BSO, los niveles de glutatión comenzaron a incrementar
a las 48horas alcanzando concentraciones alrededor de los 150 µM (datos no
mostrados).
A continuación, se procedió a identificar la expresión de los SVCTs mediante RTPCR, inmunofluorescencia y Western blot en células de Sertoli 42GPA9. Según análisis
de RT-PCR realizados a partir de preparaciones de RNA total obtenidas de los cultivos
sin tratamiento (control) y depletadas de glutatión, utilizando partidores específicos para
el mRNA de SVCT1 y SVCT2, fue posible amplificar un fragmento de 651 pb para
SVCT1 (Figura 20, A, carril 4) y 475 pb para SVCT2 (Figura 20, A, carril 7), los cuales
corresponden al tamaño esperado. En las células tratadas con 1 mM BSO por 24 horas
seguido de 1 mM DEM por 1 hora no fue posible encontrar el mRNA de SVCT1 (Figura
20, A, carril 5), no obstante, fue posible amplificar el mRNA de SVCT2 (Figura 20,A,
96 carril 8), obteniendo el tamaño esperado. Por último, en células tratadas con 1 mM
BSO por 48 horas seguido de 1 mM DEM por 1 hora, se amplificaron ambos transcritos
con los tamaños esperados (Figura 20, A, carril 6 y 9). Como control de carga se
usaron partidores específicos para el mRNA de β-actina (Figura 20, A, carril 1, 2 y 3).
La presencia de las proteínas SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli depletadas
de glutatión fue demostrada por análisis de Western blot e inmunofluorescencia.
Utilizando extracto de proteínas totales de células de Sertoli sin tratar (control) y
depletadas de glutatión, se detectó una banda correspondiente al tamaño de 62 kDa
para SVCT1 tanto en las células controles como en las tratadas por 24 horas, sin
embargo las células tratadas por 48 horas se detectó una disminución de alrededor del
50% en la banda correspondiente a SVCT1 (Figura 20, B). Para SVCT2 se detectó una
banda de 69 kDa y no se observó diferencia entre los tratamientos (Figura 20, B).
Usando los mismos anticuerpos se realizó la técnica de inmunofluorescencia para
SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli 42GPA9 (Figura 20, C). Se observó una
marcada fluorescencia usando anti-SVCT1 a nivel del citoplasma principalmente y en
menor grado en la membrana celular de las células 42GPA9, tanto en el control como
en las células depletadas de glutatión, sin embargo hay una leve disminución de la
inmunofluorescencia en las células tratas por 48 horas con BSO/DEM. En cambio
utilizando anti-SVCT2, se observó fluorescencia a nivel del citoplasma y en menor
grado en la membrana plasmática, sin diferencias entre las células controles y las
tratadas con BSO/DEM.
Estos resultados sugieren que la ausencia de glutatión en las células de Sertoli
42GPA9 produce una efecto sobre la expresión del mRNA y de una disminución a nivel
97 proteico de SVCT1, pero no de SVCT2. A continuación se realizaron ensayos de
incorporación de 100 µM de AA a 37ºC por 2 minutos con el objeto de evaluar si el
transporte de AA estaba alterado (Figura 20. D). Las células de Sertoli depletadas de
glutatión a las 24 y 48 horas aumentaron la incorporación de AA en aproximadamente
un 50% en comparación a las células controles.
En resumen, estos resultados indican que la modificación del contenido de
glutatión en las células de Sertoli 42GPA9 utilizando BSO y DEM, produce sólo una
disminución tanto a nivel del mensajero como de la proteína de SVCT1. Sin embargo,
análisis funcionales de estos transportadores revelan un aumento en la captación de AA
en estas células.
98 A
B
C
D
**
**
99 Figura 20. Expresión de los transportadores de ácido ascórbico en células
de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión. Las células de Sertoli fueron tratadas
con 1mM BSO por 24 horas, seguidas de 1mM DEM por 1 hora. A. Análisis de RT-PCR
para SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión. B Análisis
de Western blot para SVCT1 y SVCT2 en células de Sertoli 42GPA9 depletadas de
glutatión. C. Análisis de inmunocitoquímica para SVCT1 (verde) y SVCT2 (verde) en
células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión. Los núcleos fueron teñidos con
ioduro de propidio (PI). La barra de magnificación corresponde a 20µm. D. Se realizaron
ensayos de funcionales utilizando
14
C-AA en células depletadas de glutatión, la gráfica
muestra la incorporación 100 µM de ácido ascórbico (AA) a 37ºC por 2 minutos. Los
datos corresponden a la media de 3 experimentos independientes ± DS. ** p<0,01.
100 4.6 Efecto del peróxido de hidrógeno sobre la viabilidad de las células de Sertoli
42GPA9 depletadas de glutatión
Sabiendo de antemano, por trabajos en nuestro laboratorio, que las células de
Sertoli son altamente resistentes al estrés oxidativo (Pulgar, 2009), evaluamos la
resistencia de estas células depletadas de glutatión frente al peróxido de hidrógeno
(H2O2).
Las células de Sertoli 42GPA9 tratadas con 0,25; 0,5; 1 y 2 mM de BSO durante
24 horas se expusieron por 3 horas con 1 mM H2O2. Se evaluó la viabilidad celular por
exclusión con azul de tripán (Figura 21, A), sin encontrar diferencias significativas entre
las células no tratadas, las células expuestas sólo con H2O2 y las células depletadas
con las distintas concentraciones de BSO y luego expuestas a H2O2. Sin embargo,
cuando se realizó el mismo experimento, evaluando la viabilidad mediante la técnica de
TUNEL (Figura 21, B), observamos un incremento de las células TUNEL positivas de
manera dosis dependiente a las concentraciones de BSO cuando las células fueron
tratadas con 1 mM H2O2 por 3 horas. En la figura 21 B, se muestra en el inserto una
imagen representativa del ensayo utilizando 0,25 mM de BSO, seguido de 1 mM H2O2
por 3 horas, en el cual se observan las células TUNEL positivas con los núcleos
marcados de color café.
Estos resultados sugieren que el glutatión sería un antioxidante fundamental para
suplir las demandas frente a condiciones de estrés oxidativo en las células de Sertoli.
101 A B
***
***
***
102 Figura 21. Efecto del peróxido de hidrógeno en células de Sertoli 42GPA9
tratadas con BSO. A. Análisis de viabilidad celular mediante exclusión con azul de
tripán en células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión. Las células fueron tratadas
con 0,25; 0,5; 1 y 2 mM BSO por 24 horas, luego fueron expuestas por 3 horas con 1
mM H2O2. B. Análisis semi-cuantitativo de la técnica de TUNEL en células de Sertoli
depletadas de glutatión. En inserto se muestran imágenes
representativas de las
células de Sertoli 42GPA9 control y TUNEL positiva. Los datos corresponden a la media
de 3 experimentos independientes ± DS. *** p<0,001.
103 5. DISCUSIÓN
Estudios han demostrado que la infertilidad masculina representa el 40% del
problema de infertilidad total, afectando a un hombre de cada 20 en la toda la población
(Arabi, 2004). Las principales causas de ésta son la exposición a sustancias o fármacos
tóxicos, radiación, nicotina y especies de oxígeno reactivas (EROs). Se ha demostrado
que EROs puede desencadenar una infertilidad masculina por dos tipos de
mecanismos, el primer mecanismo consiste en un daño a nivel de la membrana
plasmática del espermatozoide afectando la movilidad y la capacidad para fusionarse
con el ovocito y el segundo corresponde a una daño en el DNA de las células
espermatogénicas afectando la contribución genómica paterna en el embrión. Los
antioxidantes como vitamina C y glutatión, por sus altas concentraciones reportadas en
el túbulo seminífero, estarían previniendo el daño oxidativo de las células
espermatogénicas.
El hallazgo principal de esta tesis es la modulación del co-trasportador de
sodio/ascorbato, SVCT1, frente a bajos niveles de glutatión en células de Sertoli
42GPA9. Para un mejor entendimiento del aporte de este estudio al conocimiento
científico de los transportadores de AA en el túbulo seminífero, la discusión se
presentará en cuatro capítulos.
104 5.1 Transportadores de ácido ascórbico se expresan diferencialmente en el túbulo
seminífero durante el desarrollo de la línea germinal masculina
En Ratus norvegicus la espermatogénesis comienza a partir del cuarto día postnacimiento con la migración de los gonocitos desde el centro del túbulo seminífero
hacia la membrana basal. Esta migración está probablemente facilitada por moléculas
de adhesión como la cadherina P presentes en las células de Sertoli de los testículos
inmaduros (Lin y Dephilip, 1996), seguido de su transformación a espermatogonias tipo
A o células madre. Los gonocitos son células de gran tamaño, núcleo es esférico y
voluminoso y poseen un gran nucléolo (Müller y Skakkebaek ,1984). Las células de
Sertoli son inmaduras y muy numerosas (26 por sección tubular transversal) y adoptan
un patrón pseudoestratificado. Luego comienza una onda de proliferación en el epitelio
seminífero, que se manifiesta por un aumento de las espermatogonias tipo A, la
aparición de las espermatogonias tipo B y los primeros espermatocitos I (Nistal y
Paniagua, 1984). A los 15 días post-nacimiento, la primera generación de
espermatocitos I entra en meiosis, al mismo tiempo una segunda generación de células
madre comienza una nueva ronda de proliferación y diferenciación. Por último, a los 4550 días post-nacimiento son producidos los primeros espermatozoides.
Vitamina C se ha visto ampliamente involucrada en infertilidad masculina. la
disminución de esta vitamina en el plasma seminal está estrechamente relacionada
con una calidad espermática reducida, expresada en términos de disminución de la
motilidad, menor número de espermatozoides, alteración en la morfología y abundante
aglutinación entre las células (Dawson et al., 1987; Jacob et al., 1992; Lewis et al.,
1997; Sönmez et al., 2005). Angulo et al, (2008) demostró la presencia de los co-
105 trasportadores de sodio/ascorbato (SVCT1 y SVCT2) en testículos de rata. En dicho
estudio se demostró que estos trasportadores son funcionales y que están involucrados
en el transporte de AA hacia el lumen del túbulo seminífero, siendo parcialmente
responsables de las altas concentraciones de AA reportadas en el plasma seminal (Berg et al., 1941; Paz
et al., 1977; Sönmez et al., 2005). Sin embargo, no hay
evidencia hasta la fecha del patrón de expresión y localización de estos transportadores
durante el desarrollo testicular.
Se decidió usar el marcador de células de Sertoli WT1, debido a que es un factor
de transcripción expresado en células de Sertoli temprano en la vida fetal y continúa
siendo expresado en estas células durante la madurez. Se localiza principalmente en el
núcleo y menos intensamente en el citoplasma, en todas las fases del desarrollo de
estas células. Por lo tanto, es un marcador estable de células de Sertoli (Sharpe et al.,
2003).
Al analizar la presencia de SVCT1 y SVCT2 mediante inmunohistoquímica en los
cortes de testículo de rata de distintas edades, se observó un patrón de distribución
diferencial de estos transportadores durante el desarrollo del epitelio seminífero. SVCT1
muestra una mayor expresión en los primeros días de desarrollo atribuible a la
inmunodetección tanto de las células de Sertoli inmadura como en los gonocitos. En el
primer día post-nacimiento se observa la presencia del trasportador en la base del
túbulo seminífero, sin haber co-localización con WT1, sugiriendo que un mayor
porcentaje de esta proteína está presente en los gonocitos. Sin embargo, a los 5 días
post-nacimiento hay un cambio en la distribución de SVCT1 ubicándose en todo el
epitelio seminífero y co-localizando fuertemente en el centro con WT1. Este cambio tan
106 radical en la ubicación de SVCT1 podría ser resultado de la migración y transformación
de los gonocitos a espermatogonias tipo A, además las células de soporte dejan de
dividirse y se diferencian a células de Sertoli. La localización de SVCT1 en los estados
más desarrollados del testículo muestra una distribución de carácter punteado a lo largo
de todo el epitelio seminífero, con variaciones entre las edades. Esta diferencia en las
edades de 15, 35 y 60 días pareciera que no tener relación con el proceso
espermatogénico, esto sugiere que SVCT1 estaría localizado en los distintos tipos de
células espermatogénicas que están presentes en las distintas etapas del desarrollo,
cumpliendo la función de incorporar AA en estas células.
Por otro lado, SVCT2 no fue detectado en los primeros días de desarrollo, en
cambio a los 15 días post-nacimiento, cuando comienza la primera meiosis de los
espermatocitos I, se detectó una marcada fluorescencia a lo largo de todo el epitelio
seminífero, siendo más intensa en la base del túbulo y manteniéndose hasta la
madurez del órgano. Esto sugiere que SVCT2 no sólo podría estar cumpliendo el rol de
incorporar ácido ascórbico en las células de la línea germinal masculina durante el
proceso diferenciación y proliferación de estas células con la subsecuente formación de
los espermatozoides, sino que podría estar asi mismo involucrado en la regulación de
algún proceso involucrado en la diferenciación o proliferación de estas células, ya que
SVCT2 se ha visto involucrado en diferenciación de osteoclastos y macrófagos (Wu et
al., 2004; Qiao y May, 2009).
Wu et al., (2008) demostró que SVCT2 estaría cumpliendo un papel dual en la
placenta: estimula la esteroidogénesis, de este modo ayudando a mantener el
embarazo, y acumulado AA en el feto. Estos hallazgos podrían sugerir que SVCT2 en el
107 túbulo seminífero
controlando
la
podría estar cumpliendo también una función dual, ya sea
expresión
o
síntesis
de
de
algún
factor
regulatorio
de
la
espermatogénesis, o bien produciendo un cambio en las células de Sertoli que aumente
su sensibilidad a testosterona.
Esto último se podría correlacionar ya que en los tejidos donde actúa la
testosterona, ésta se reduce de inmediato gracias a la enzima 5 α−hidroxilasa, a
dihidrotestosterona (DHT) que es un andrógeno mucho más potente, además en
estudios realizados en conejillos de india se ha visto que la hidroxilación de la prolina en
el cartílago articular era especialmente resistente a deficiencias de ascorbato,
produciendo una disminución en la síntesis de colágeno (Spanheimer, et al., 1986). Es interesante destacar que en las células de Leydig, encargadas de sintetizar y
secretar testosterona, sólo se logró inmunolocalizar SVCT2 (datos no mostrados),
pudiendo estar relacionado con la síntesis de testosterona.
En conclusión, sólo se puede afirmar que existe una expresión y localización
diferenciada de los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs) a lo largo del desarrollo
del epitelio seminífero, y que este patrón podría estar relacionado de algún modo con la
espermatogénesis.
5.2 Las células de Sertoli como modelo para estudiar la relación entre los
transportadores de AA y el glutatión
Se determinó la expresión de transportadores de AA, SVCT1 y SVCT2 en células
de Sertoli 42GPA9 en cultivo, mediante análisis de RT-PCR, inmunofluorescencia y
108 Western blot y también se analizó la función de estos transportadores mediante
ensayos funcionales utilizando radioisótopos.
Los resultados obtenidos por RT-PCR, inmunofluorescencia y Western blot
confirman la expresión de los transportadores SVCT1 y SVCT2 en estas células, sin
embargo, hubo pequeñas diferencias observadas en los resultados de Western blot
para las proteínas de células de Sertoli y las descritos previamente para SVCT1 y
SVCT2; esto podrían deberse a los distintos estados de glicosilación que pueden sufrir
estas proteínas (Tsukaguchi et al., 1999). Los ensayos funcionales revelaron que el
trasporte de AA en estas células está mediado por 2 componentes, el primero con una
Km aparente cercana a 38 µM que probablemente corresponda a la actividad de
SVCT1 y el otro con una Km aparente de 12 µM, que podría corresponder a la isoforma
SVCT2. Esta última Km es muy cercana a lo descrito para SVCT2 en célula CaCo-2 y
para el transportador SVCT2 humano clonado y expresado en ovocitos de Xenopus
laevis (Maulén et al., 2003). La Km para SVCT1 ha sido descrita en un rango de valores
muy amplio desde 75 a 200 µM aproximadamente (Wang et al., 1999).
En resumen, las células de Sertoli 42GPA9 expresan SVCT1 y SVCT2, siendo
ambas isoformas funcionales. Se ha demostrado que las células de Sertoli tienen toda
la maquinaria necesaria para la síntesis de glutatión, así como las enzimas
relacionadas con el metabolismo y la función de este antioxidante (Lu y Steinberger,
1977; den Boer et al., 1989; Bauche at al., 1994). Las células de Sertoli 42GPA9
constituyen así un modelo válido para estudiar la relación entre la expresión y
localización de los co-transportadores de sodio/ascorbato y los niveles intracelulares de
glutatión.
109 5.3 El efecto del BSO, asociado a una disminución del contenido de glutatión
afecta la expresión y función de SVCT1
El glutatión y la vitamina C muestran una fuerte interdependencia funcional. La
interrupción del metabolismo del glutatión en ratas y conejillos de indias, utilizando
tratamiento con butionina-(SR)-sulfoximina (BSO), un potente y específico inhibidor de
la síntesis del glutatión, reveló una disfunción y mortalidad asociada con la deficiencia
de glutatión, la cual fue revertida cuando se administró vitamina C en la dieta (Martensson, et al., 1991). Estudios previos sobre la expresión y función de los
transportadores de ácido ascórbico en respuesta de diferentes estímulos, han
demostrado que en células COS-1 que sobre expresan SVCT1 y SVCT2, tratadas con
activadores de proteína quinasa C, muestran una disminución en la incorporación de
AA, debido a una redistribución de SVCT1 en las membranas intracelulares sin afectar
a SVCT2. Estos resultados indicarían que SVCT1 y SVCT2 son regulados
independientemente (Liang et al., 2002).
5.3.1 Estudios in vivo
Se realizaron ensayos de inmunohistoquímica en cortes de testículo tratados con
BSO durante 24 y 48 horas. Estudios previos demostraron que utilizando una sola
inyección con BSO se logró disminuir el contenido de glutatión sólo entre 10-20%,
después de 32 horas, en cambio utilizando 2 inyecciones era más eficaz, resultando en
una reducción en un 20-25% en 32-48 horas después de la inyección final (Slott, et
al.,1989). Se utilizaron dos inyecciones para depletar de glutatión los testículos de rata
110 adulta, para lograr una mayor disminución de este tiol. Los resultados obtenidos por
Stoll, et al. (1989) demostraron que el recambio de glutatión en el testículo es
relativamente lento, debido a la modesta y retardada disminución de glutatión por los
tratamientos con BSO.
Es interesante destacar que los tratamientos con BSO no resultaron tener efecto
nocivo en las células germinales del epitelio seminífero, ya que no fue posible encontrar
células apoptóticas mediante la técnica de TUNEL. Glutatión cumple un rol importante
en la proliferación y diferenciación de las células germinales, principalmente en la
protección de las células germinales frente a la acción de radicales libres, evitando
mutaciones hereditarias (Teaf et al., 1985). Daños producidos en el DNA pueden ser
detectados mediante la técnica de TUNEL, debido a la fragmentación del DNA. Sin
embargo, con una disminución del 30 % del glutatión testicular, no hubo efecto sobre
las células espermatogénicas, dándole importancia a otros antioxidantes como la
vitamina C, la cual se encuentra a altas concentraciones en testículos de mamíferos y
protege frente al estrés oxidativo producido por el desbalance de las especies
prooxidante y antioxidante en los testículos tratados con BSO.
En los ensayos de TUNEL se muestra que en todas las condiciones hay
aproximadamente 2 células apoptóticas en cada 10 túbulos analizados, esto se debe a
un evento de apoptosis fisiológica que ocurre durante el desarrollo del sistema
reproductor en mamíferos. Esta apoptosis controla la superproducción de gametos
masculinos y restringe los niveles normales de proliferación, para que no sobrepasen la
capacidad de apoyo de las células de Sertoli (Kocak et al., 2002). La apoptosis de
111 células germinales ocurre en los testículos durante la espermatogénesis, esto ocurre
predominantemente en las espermatogonias.
Con respecto a los transportadores de vitamina C, hemos demostrado que los
tratamientos con BSO asociados con una disminución del glutatión testicular, producen
una alteración sólo en la expresión y localización de SVCT1. SVCT2 y GLUT3 no son
afectados por estos tratamientos. Mardones et al. (2008), utilizando cultivos de células
de hepatoma de rata tratados con BSO observaron una disminución en la incorporación
de AA, así como en la expresión de SVCT 1 y 2. En cambio cuando utilizaron cultivos
de hepatocitos de rata observaron una disminución en la incorporación de AA, la cual
fue atribuible a un internalización de SVCT1. En ambos casos no observaron
variaciones en los transportadores facilitativos de hexosas (Mardones et al., 2008).
Estos hallazgos concuerdan en cierto modo con los resultados obtenidos en el epitelio
seminífero, y la respuesta observada por la deficiencia de glutatión es al parecer tejido
especifica. Además, esta alteración sería observable solamente en relación a los
transportadores de AA y no a los transportadores de DHA.
Cuando analizamos las proteínas relacionadas con el metabolismo del glicógeno
observamos que glicógeno sintasa muscular (MGS) y PTG se ven alteradas de distinta
manera en los cortes de testículo de rata tratadas con BSO. Por un lado observamos
que los tratamientos con BSO producen una disminución significativamente de MGS a
lo largo de todo el epitelio, y por el otro lado hay un aumento de PTG en las células de
Leydig. Esto sugiere que la disminución de glutatión en las células de Sertoli produce
alteración en la expresión de estas proteínas.
112 En conclusión podemos afirmar que en ratas tratadas in vivo con BSO, se
observaron diferencias en la expresión y localización del transportador SVCT1 a nivel
del epitelio seminífero.
5.3.2 Estudios in vitro
Los estudios realizados en células de Sertoli 42GPA9, demostraron que estas
células, al ser tratadas con BSO/DEM, se logra una drástica caída del glutatión
intracelular, sin producir toxicidad en estas células. Las concentraciones utilizadas de
BSO/DEM fueron escogidas debido a las variaciones observadas en el contenido de
glutatión en las células en cultivo, de este modo asegurando una depleción completa en
cualquier placa de células tratadas con estas moléculas.
La capacidad de las células de Sertoli para regular la expresión de los
transportadores de AA en respuesta a la una alteración del metabolismo de glutatión,
resultó en la disminución de la expresión de SVCT1, sin embargo hay un aumento
significativo en la incorporación de AA en estas células. Esta disminución en la
expresión de SVCT1 concuerda con los resultados obtenidos por Mardones et al.
(2008), además con los resultados obtenidos in vivo, ya que en ratas adultas tratadas
con BSO por 24 horas se observó una disminución en la inmunorreacción de SVCT1 en
el epitelio seminífero.
El aumento en la incorporación de AA es un evento contradictorio, pues los
tratamientos con BSO/DEM producen una disminución en la expresión de una de las
isoformas de estos transportadores. Una de las explicaciones más probables de este
113 aumento puede relacionarse a variaciones de las propiedades cinéticas de uno o
ambos transportadores, o algún cambio en la localización subcelular de estos
transportadores.
La homeostasis celular es controlada por un balance entre señales de
supervivencia y de muerte celular, las cuales son mediadas por modificaciones posttraduccionales de proteínas. La fosforilaciones de los grupos hidroxilo de las serina,
treonina y tirosina en las proteínas son probablemente una de las modificaciones más
conocidas, sin embargo nuevas observaciones han dejado en evidencia que las
modificaciones post-traduccionales en los grupos sulfidrilo de las cadenas laterales de
las proteínas, pueden participar también en eventos de señalización celular. En
particular las S-glutationilaciones, en la cual se forma un enlace disulfuro entre la
cisteína de la cadena lateral de la proteína y el glutatión, al igual que las fosforilaciones
es un mecanismo reversible en la regulación de proteínas. La S-glutationilación altera
sustancialmente la funcionalidad y localización de enzimas, receptores, proteínas
estructurales, factores de transcripción y proteínas de transporte. Estos cambios,
naturalmente, tienen profundas implicaciones para la fisiología celular.
Esta oxidación del grupo sulfidrilo de la cisteína por S-glutationilación se ha visto
involucrada en distintas proteínas que tienen que ver con el citoesqueleto (actina y
tubulina), el metabolismo energético (Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y
piruvato quinasa), señalización celular (proteína tirosina fosfatasa 1B y PKC),
homeostasis de calcio (receptor de rianodina I y II), muerte celular (caspasa 3)
plegamiento de proteínas (PDI y proteosoma 20S) y por último en el estado redox de
las células (glutatión S-transferasa y tiorredoxina 1) (Mohr et al., 1999; Sykes MC et al.,
114 2007; Wang et al., 2001; Landino et al., 2004; Cotgreave et al., 2002; Fratelli et al.,
2002; Klatt et al., 2000; Ward et al., 2000; Haendeler J, 2006).
Las modificaciones de proteínas por S-Glutationilación ocurren tanto en células
sometidas a estrés oxidativo como en condiciones fisiológicas. Estudios han
demostrado que el factor regulador del interferon 3 se encuentra S-glutationilado en
condiciones normales o inactivo, y durante una infección viral su estado de Sglutationilación se ve disminuido, gracias a la actividad de la glutarredoxina-1 (GRX-1),
la cual es una enzima citoplasmática que cataliza la reducción reversible del grupo
sulfidrilo de la proteína S-glutationiladas (Gravina y Mieyal, 1993; Prinarakis et al.,
2008).
Gilge et al (2008) analizaron la relación entre la cantidad de proteínas
S-
glutationiladas y la concentración de glutatión intracelular en células HEK 293. Cuando
estas células fueron sometidas a tratamientos con BSO observaron una disminución de
las proteínas S-glutationiladas con respecto a las células no tratadas. Esto permite
especular que cuando se produce una caída drástica en el contenido de glutatión en las
células de Sertoli, muchas de estas modificaciones post-traduccionales que se
encuentran en condiciones fisiológicas se ven alteradas, sugiriendo que este aumento
en la incorporación de AA se pueda deber a alteraciones de sitios de S-glutationilación
de alguno de estos transportadores produciendo cambios en sus propiedades cinéticas
o bien cambios en su localización que explique de algún modo el aumento en la
incorporación.
Por otro lado los trasportadores de AA tienen múltiples sitios de fosforilación
dependientes de PKC. La fosforilación de SVCT1 inhibe la traslocación del citoplasma a
115 la membrana plasmática, en cambio la fosforilación de SVCT2 altera la actividad de
transportador por cambios conformacionales. Es bien sabido que la proteína quinasa C
es inactivada por S-glutationilación en condiciones de estrés, de este modo aumentaría
la traslocación de SVCT1 desde el citoplasma a la membrana plasmática, aumentando
la incorporación de AA bajo condiciones de estrés oxidativo. Sin embargo, en este
estudio las células tratadas con BSO experimentarían una disminución de las proteínas
S-glutationilisadas totales, produciendo una activación de PKC, lo que desencadenaría
una inhibición de la traslocación de SVCT1 a la membrana plasmática. Esto no explica
el aumento de la incorporación de AA en las células tratadas con BSO, pero se
correlaciona muy bien con los resultados obtenidos con SVCT1 tanto in vivo a las 48
horas de tratamiento, que sugieren una redistribución de SVCT1 a lo largo del epitelio
seminífero y una posible internalización de éstos.
La proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) también resulta ser regulada
por S-glutationilación, debido a un realce en la desfosforilación de la subunidad
catalítica de PKA (Kenneth et al., 2004). Wu et al., (2007) demostraron que SVCT2
interacciona físicamente con PKA y que esta quinasa es capaz de fosforilar SVCT2 in
vitro y en células intactas en los sitios Ser402 y Ser639. Esta fosforilación produce la
traslocación de SVCT2 a la membrana plasmática, aumentando el trasporte de AA al
interior de las células. Estos antecedentes sugieren que SVCT2 podría ser el
responsable en el aumento de la captación de AA por las células de Sertoli 42GPA9
tratadas con BSO, debido a la disminución total de las proteínas S-glutationiladas
provocando a su vez una activación de PKA, seguido de la fosforilación de SVCT2 por
116 PKA y de la traslocación de éste a la membrana plasmática con la subsecuente
incorporación de AA.
En conclusión, sólo se puede afirmar que al modificar el contenido de glutatión
en células de Sertoli 42GPA9, se observa una disminución en la expresión de SVCT1,
sin embargo los ensayos funcionales demuestran un aumento en la incorporación de
AA.
5.4 Sensibilidad de las células de Sertoli 42GPA9 depletadas de glutatión al
peróxido de hidrógeno
A realizar ensayos de viabilidad celular en células tratadas con distintas
concentraciones de BSO y posteriormente expuestas a peróxido de hidrógeno, se
observó mediante la técnica de TUNEL un incremento de las células TUNEL positivas
de manera dosis dependiente a las concentraciones de BSO.
Cuando las células fueron sólo expuestas a peróxido de hidrógeno no se observó
un cambio significativo en el número de células TUNEL positivas, sin embargo, cuando
fueron tratadas con BSO previamente, se observaron cambios significativos en todas
las condiciones, sugiriendo que el glutatión sería importante en el reciclaje de la
vitamina C y que la actividad de las enzimas con actividad DHA reductasa no
dependientes de glutatión no lograrían suplir las demandas de reciclaje de esta
vitamina, aumentado las especies prooxidantes y produciendo la muerte celular,
posiblemente mediante apoptosis.
117 Como conclusión se puede afirmar que la disminución del contenido de glutatión
en células de Sertoli 42GPA9 produce un aumento en la sensibilidad frente al peróxido
de hidrógeno.
Por último, es interesante destacar que teóricamente las células con niveles
bajos de glutatión en su microambiente, debieran presentar concentraciones inferiores
de AA, en comparación a las células en condiciones fisiológicas, En estas condiciones
SVCT2 tendría un rol primordial, por sus propiedades cinéticas (mayor afinidad por AA
que SVCT1), en la captación de ácido ascórbico por las células. Los resultados
obtenidos en esta tesis demuestran una disminución de SVCT1 en el epitelio
seminífero, corroborándose con la disminución en la expresión de SVCT1 en células de
Sertoli 42GPA9. Sin embargo, el aumento de la incorporación de AA no fue explicado
experimentalmente, proponiendo un aumento en la capacidad de trasporte (Vmax) de
SVCT2, ya sea por la traslocación de éste hacia la membrana plasmática, o por alguna
modificación que cambie su propiedades cinéticas favoreciendo el transporte de AA. En
la Figura 22, se muestra un esquema que muestra el efecto de la deficiencia de
glutatión sobre los transportadores de vitamina C en el epitelio seminífero de rata.
118 Figura 22. Transportadores de vitamina C y el contenido de glutatión en el
epitelio seminífero de rata. Transportadores de AA (SVCT) y transportadores de ácido
dehidroascórbico (DHA) (GLUT). El AA entra en las células de Sertoli a través de los
transportadores SVCT. La vitamina C puede entrar también a las células de Sertoli
como DHA por los transportadores GLUT, y ser reducida rápidamente a AA mediante
las enzimas DHA reductasas dependiente de glutatión. Contenido de glutatión
intracelular en la célula de Sertoli, (GSH) [3,1 mM], espermatocitos (GSH) y
espermátidas (GSH) [5,6 y 6,1 mM, Bauchè et al. (1994)]. La disminución del contenido
de GSH en las células de Sertoli afecta la expresión del Transportador SVCT1 y no
SVCT2, ni GLUT3, sin embargo hay un aumento en la incorporación AA, mediante un
mecanismo desconocido.
119 En este estudio nos preguntamos si los cambios en la expresión del
transportador de ácido ascórbico se relacionan con la capacidad antioxidante de las
células, o la disponibilidad celular de otros antioxidantes que no sean la vitamina C. El
tratamiento
con
un
inhibidor.
L-butionina-S,R-sulfoxamida
(BSO),
de
la
γ-
glutamilcisteína sintetasa conduce a la disminución de los niveles celulares de GSH, y
su aplicación puede proporcionar un modelo experimental útil de la deficiencia de GSH.
Los niveles celulares de GSH pueden aumentarse mediante el suministro de
sustratos para la síntesis de éste, como análogos de oxiprolina usados para aumentar
los niveles de glutatión en linfocitos (Williamson et al., 1982; Fidelus et al., 1987) y la Nacetilcisteína, la cual es capaz de entrar en una amplia variedad de células, siendo más
soluble y menos oxidable que la cisteína, y capaz de aumentar también los niveles de
glutatión (Cotgreave et al., 1991; Bonanomi y Gazzaniga,1980). Por otro lado hay
compuestos de entrega de GSH, como ésteres de glutatión.
Finalmente, el aumento de GSH celular puede ser de utilidad terapéutica,
además de ser una herramienta futura para estudiar el comportamiento de los
transportadores de vitamina C frente a concentraciones elevadas de glutatión y poder
dilucidar con mayor detalle el efecto de este tiol no proteico sobre estos
transportadores.
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