momentos de ciencias 2012 I ultimo

MOMENTOS DE
Universidad de la
AMAZONIA
Momentos de Ciencia 9:(1), 2012
CIENCIA
Protocolo de evaluación de fagocitosis de Candida albicans por el
neutrófilo
Tarin A. Lucero-Garzón*ª, Dayana K. Caro-Gil**, Diver L. ladino-Velasquez**,
Shirley Cruz***
*Bacterióloga, M. Sc. Docente Universidad de Boyacá. Tunja, Boyacá.
**Bacteriólogos Universidad de Boyacá
***Bacterióloga, Esp. Docente Universidad de Boyacá
Recibido 28 de Noviembre de 2011; aceptado 02 de Abril de 2012
Resumen
Dentro del sistema inmunológico innato la fagocitosis juega un papel fundamental en la protección inespecífica para contrarrestar
la acción destructiva de algunos microorganismos. En este proceso de endocitosis, interfieren células especializadas del sistema
inmune como lo son neutrófilos y macrófagos, conocidas como fagocitos los cuales poseen receptores de membrana que reconocen
al antígeno previamente opsonizado rodeándolo con su membrana citoplasmática e introduciéndolo al interior de la célula. Las
diferentes técnicas actualmente estandarizadas para la evaluación de la capacidad fagocítica, no refieren recuentos conocidos de
polimorfonucleares (PMNs), no establecen diferencias significativas entre la capacidad fagocítica con o sin opsonización y no
tienen en cuenta el gradiente de concentración para separar la población celular objeto de estudio. Por tanto, el presente artículo
establece un protocolo para determinar la capacidad fagocítica de los neutrófilos frente a Candida albicans, estimando las
diferencias de dicha capacidad con y sin la adición de opsoninas. Se propone que el porcentaje de fagocitosis es de 82,3% ± 3,4%
(media +/- DE) con opsoninas y de 4,13% ±0,78% sin opsoninas (media +/- DE), en individuos con recuentos de leucocitos entre
5.000 y 10.000 con neutrófilos entre 60 y 70%. Lo anterior permitirá la evaluación clínica de pacientes con infecciones relacionadas
con fallas en la fagocitosis comparando los resultados obtenidos con los valores de referencia.
Palabras clave: Candida albicans, Fagocitosis, Neutrófilo, Opsonización.
ABSTRACT
In the innate immune system phagocytosis plays a fundamental role in the non-specific protection to counteract the destructive
action of some microorganisms. In this process of Endocytosis, interfere specialized cells of the immune system such as neutrophils
and macrophages, known as phagocytes which have membrane receptors that recognize the Antigen previously opsonized
surrounding it with their cytoplasmic membrane and introducing it to the inside of the cell. Different techniques currently
standardized for the evaluation of the Phagocytic capacity, not concern known counts of polymorphonuclears (PMNs), do not
establish differences between with or without opsonization phagocytic capacity and does not take into account the concentration
gradient to separate cell population object of study. Therefore, this article establishes a protocol for determining capacity
Phagocytic neutrophils against Candida albicans estimating differences in that capacity with and without the addition of opsonins.
Proposed that the percentage of phagocytosis is 82,3% ± 3,4% (average +/-of) with opsonins and 4,13% ±0, 78% without opsonins
(average +/-of), in individuals with counts of white blood cells between 5.000 and 10.000 with neutrophils between 60 and 70%.
This will allow the clinical evaluation of patients with infections related to failures in the phagocytosis by comparing the results
obtained with the reference values.
Key words: Candida albicans, neutrophil, opsonization, phagocytosis
Introducción
el organismo a través de receptores de membrana
para destruirlo o inactivarlo. Este proceso es
llevado a cabo mediante una serie de etapas que
incluyen quimiotáxis, opsonización, adhesión,
endocitosis y excreción (Molina et al, 2002, Tosi M,
2005]
La opsonización es el fenómeno mediante el cual
se marca al antígeno para que este sea reconocido
por las células fagocíticas y dé inicio al proceso de
endocitosis. Para ello es necesario la presencia de
opsoninas, que son partículas presentes en el suero
tales como anticuerpos principalmente tipo IgG,
La respuesta inmunológica en el organismo se
divide en dos tipos: la respuesta inmune
a dq uir i da car a cte r iza da por se r ta r dí a ,
pr o l o ng ada y g en er ado ra de m e m o r i a
inmunológica, y la respuesta inmune innata, que
utiliza la fagocitosis como el proceso mediante el
cual células especializadas como los macrófagos
y los neutrófilos, conocidos como fagocitos y
considerados la primera línea de defensa, se unen
al microorganismo reconocido como extraño para
Autor para correspondencia: ª [email protected]
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Separación de PMNs neutrófilos
Los neutrófilos fueron aislados según Histopaque 1077 SIGMA ALDRICH® por gradiente de
concentración con Ficoll; el total obtenido de la
separación se lavó y se resuspendió en PBS
(phosphate Buffer Solution), se realizó recuento
en cámara de Neubauer y se ajustó diluyendo a 5 x
104 células/mm3 Luego mediante coloración de
Wright y re c u e n t o difer e ncial m anua l; se
confirmó la obtención de un porcentaje >95% de
neutrófilos
Obtención de levaduras (Candida albicans)
La cepa de C. albicans se aisló de una muestra
clínica y fue identificada por el laboratorio de
Microbiología del hospital San Rafael de Tunja.
Se sembró en agar Saboraud y PDA, realizando
cultivos stock de tres y catorce días. Se obtuvo la
colonia de levadura con pique de punta nueva y
estéril (puntas de policarbonato), se suspendió en
PBS precalentado a 37°C y se realizó recuento en
cámara de Neubauer al microscopio con objetivo
de 40x. Finalmente, se determinó el total de
l evaduras con ta das, me di a n te l a f ór m u l a :
Conidias / ml = # de conidias contadas x 25.000 x
factor de dilución Conidias total (Cañedo & Ames
2004)
Opsoninas: Con el fin de evitar que se genere
reacción cruzada con anticuerpos del sistema
ABO durante la opsonización, se obtuvo suero de
donante AB centrifugado a 2500 rpm durante
diez minutos alicuotado y congelado a - 20ºC,
siendo utilizado para cada uno de los ensayos.
Ensayo determinación de fagocitosis
a. Con opsonización: En un tubo eppendorf se
sirvieron 200 µl de la suspensión de levaduras, se
adicionaron 200 µl de suero AB lo que permitió el
proceso de opsonizacion mediada por IgG2, FNT
e IL8 entre otras, se mezcló e incubó por 30
minutos a 37ºC, luego se tomaron 10 µl de esta
suspensión y se colocó en un tubo epperdorf con
50 µl de la suspensión de neutrófilos, se mezcló y
se realizó montaje en cámara de Neubauer
durante 30 minutos a 37ºC en condiciones de
cámara húmeda. A continuación se observó al
microscopio en 10x y 40x para realizar un conteo
porcentual diferencial de células en fagocitosis y
no fagocitando en 100 ?neutrófilos). Se consideró
fagocitosis positiva la presencia de una o más
levaduras dentro de una célula. Finalmente, se
registraron los datos en matriz de resultados.
b. Ensayo sin opsonizacion: este ensayo difiere del
componentes del complemento, la porción Fab, el
y la
fa c t o r de n ecrosis t u mo ra l (FN T)
interleuquina 8 (IL8). La porción Fab de la
opsonina se une a un receptor de membrana
celular que posee el patógeno, marcándolo para
facilitar su reconocimiento y permitiendo la unión
a la porción que quedó libre, es decir Fc (Fracción
cristalizable), dando inicio a la endocitosis (Peter ,
et al, 2000, Urban , et al).
Los polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) son
cél ulas que ci r cul a n en sang r e perifér i ca
aproximadamente de uno a dos días; y son
consideradas los fagocitos profesionales junto con
los macrófago. Estas células son las encargadas de
llevar a cabo el proceso de fagocitosis en el
organismo, tienen la capacidad de migrar por
medio de agentes quimiotácticos al lugar que ha
sido invadido por los microorganismos (Collado,
et al, 2008)
La evaluación de la capacidad fagocítica es
i m por t a nt e d e b i do a que p r opor c ion a
información acerca de la función del sistema
inmunológico y de las alteraciones que se
presentan en la fagocitosis. Las diferentes técnicas
que evalúan dicho proceso no refieren las
diferencias entre la capacidad fagocítica con o sin
opsonización y no tienen en cuenta los recuentos
iniciales de polimorfonucleares, por lo tanto en el
presente artículo, se describe una técnica fácil de
realizar, que utiliza mínimas cantidades de sangre
y que garantiza la separación y obtención de
PMNs (Muniz , et al,2003).
Este protocolo permite determinar el porcentaje
de fagocitosis partiendo de recuentos conocidos
de PMNs frente al patógeno C. albicans. Este
procedimiento estandarizado se utilizó para
establecer el porcentaje de fagocitosis que tiene un
individuo con recuento total de blancos y
recuento diferencial normal.
Materiales y Métodos
Toma de la muestra y recuento de blancos
Se obtuvieron muestras de sangre venosa en
tubo con heparina de diez sujetos adultos
voluntarios con recuento de leucocitos entre 5.000
y 10.000 por mm3, y porcentaje de neutrófilos entre
60 a 70%, criterios que se evaluaron a través de
recuento manual de leucocitos en cámara de
Neubauer y empleando la coloración de Wright
para realizar recuento diferencial. Estos recuentos
se confi r ma r on m e d i a n te el equ i p o de
hematología automatizada Human count 60®.
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una desviación estándar de 0,8 % Podemos
sugerir que el porcentaje de fagocitosis por
neutrófilo de C. albicans en sujetos que cumplen
con los criterios de inclusión (recuento de blancos
entre 5.000 y 10.000 y porcentaje de neutrófilos
entre 60% y 65 %), es de 82,3 ± 3,4 % con
opsonización y el porcentaje de fagocitosis sin
opsoninas es bajo de solo 4,13± 0,7 % con un valor
P = 0.007 lo que determina una alta significancia
*
AS* entre los porcentaje. Existe reproducibilidad
de resultados entre los operadores pues en los 30
recuentos no se encontró diferencia significativa
con un valor P= > 0,.08 NS.
anterior por la no adición de suero lo que presume
ausencia de opsoninas.
Análisis estadístico
De los datos reportados se determina la media
de los porcentajes de fagocitosis realizada por
triplicado y se obtiene el valor de ± una
desviación estándar, para hallar la significancia
estadística se utilizó la prueba de Mann Whitney
wilcoxon MWW o prueba de U.
Resultados
Los materiales y métodos descritos en el
presente trabajo en si mismo son factibles de
equiparar en posteriores estudios, comparando
in div i du os c on dife r ent e s recue n to s de
neutrófilos en sangre periférica o no ajustados
para el ensayo.
Determinación del porcentaje de fagocitosis
Se realizaron 60 ensayos de fagocitosis que
corresponden a diez sujetos de estudio con
opsonización y sin Opsonización (tabla 1), en
triplicado por 3 operadores diferentes.
Discusión
Ellie Metchnikoff en el año 1980 descubrió la
función que cumplían las células fagocíticas y
afirmo que esta era esencial para la supervivencia
(Rojas &Arce, 2004), considerándola como la
principal estrategia que posee el hospedero para
co m bati r micro o rga n ism o s c a usan t es de
enfermedades infecciosas (Warowska, et al, 2006).
Un defecto de la fagocitosis produce supresión
del sistema inmunológico, incrementando de esta
manera el riesgo de adquirir procesos infecciosos.
Es t o s defe c tos p u eden se r c a usado s por
alteraciones en la adherencia, la locomoción, la
opsonización, la
deformabilidad, el
reconocimiento, la adhesión, la ingestión, la
formación del fagosoma, la desgranulación, y
definitivamente en la capacidad para matar a los
m i croorgan i sm os, o eli m i n ar d e l ma te r i al
ingerido (Babieri, et al , 2005). Por esta razón,
evaluar la función fagocítica se ha convertido en
objeto de estudio y es por eso que actualmente
existen diferentes técnicas que valoran dicho
proceso, las cuales no han contemplado las
diferencias entre la capacidad fagocítica con o sin
opsonización, los recuentos iniciales de PMNs y
no describen el gradiente de concentración para
separar la población celular, por lo tanto se
establece una técnica fácil de realizar, que utiliza
mínimas cantidades de sangre y que garantiza la
separación y obtención de PMNs. Para garantizar
que la técnica sea eficiente es indispensable
además de controlar condiciones como la
humedad, temperatura ?37ºC? y los tiempos de
incubación ?30 minutos?, considerar aspectos tales
como: utilizar la heparina como anticoagulante
para conservar la celularidad y emplear un
gradiente de concentración que asegure la
separación de los PMN. Por tal razón se utilizó
Tabla 1. Porcentaje de fagocitosis de los sujetos de
estudio
Sujeto
Recuento (%)
O1CO O1SO O2CO O2SO O3CO O3SO
1
86,0
5,0
83,0
3,0
85,0
4,0
2
80,0
3,0
77,0
4,0
84,0
4,0
3
82,0
3,0
84,0
5,0
83,0
5,0
4
78,0
3,0
75,0
5,0
83,0
3,0
5
84,0
4,0
87,0
5,0
85,0
4,0
6
88,0
5,0
84,0
5,0
82,0
5,0
7
79,0
4,0
87,0
4,0
75,0
4,0
8
83,0
4,0
82,0
3,0
87,0
5,0
9
10
Media
82,0
5,0
4,0
5,0
4,3
4,0
3,0
3,9
80,0
80,0
81,9
83,0
79,0
82,1
82,0
82,9
4,0
4,2
O: Op er ador ; CO: C on ops on izac i ó n ; S O : s i n
opsonización
Se determinó la media de cada uno de los ensayos
por operador obteniendo el promedio del
porcentaje de fagocitosis con adición de suero
(opsoninas) de 82,3% y la desviación estándar de
los mismos SD = 3,4%
El porcentaje de fagocitosis sin opsonización es
decir sin adición de suero, es considerablemente
más bajo que el obtenido con opsonización se
obtuvo un porcentaje de fagocitosis de 4,13% con
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recuentos celulares que presenten infecciones
producto de defecto en la fagocitosis.
Ficoll (Histo-paque 1077 SIGMA ALDRICH®)
que actúa mediante una solución de polisucrosa
y diatrizoato sódico ajustada a una densidad de
1,077 lo que facilita la recuperación de células
mononuclear es y po l imor f o n ucl e ares en
pequeños volúmenes de sangre. Se recomienda
usar un suero tipo AB para la obtención de las
opsoninas evitando que se genere reacción
cruzada con anticuerpos del sistema ABO y
conservarlo a una temperatura de - 20ºC, los
lavados con PBS durante el proceso permite
desechar plaquetas, microorganismos y Ficoll
que pueden quedar luego de la separación. Como
patógeno se empleó el hongo levaduriforme C.
albicans que resulta fácil de reproducir y de
mantener in vitro. El recuento de la misma debe
ajustarse con PBS precalentado para evitar que
ocurra muerte intracelular.
Se sugiere que el porcentaje de fagocitosis por
neutrófilo de C. albicans en sujetos que cumplen
con los criterios de inclusión es de 82,3 ± 3,4 % con
opsonización y el porcentaje de fagocitosis sin
o ps o nina s es 4, 1 3± 0,78% , en co ntr ándos e
diferencia altamente significativa (AS) entre los
dos porcentajes ratificando y la importancia de la
opsonización dentro de la fagocitosis.
No se encontró diferencia significativa (NS)
entre los recuentos realizados por los tres
operadores lo que manifiesta una
reproducibilidad de resultados. La significancia
estadística de este trabajo tiene un valor P=95%.
En conclusión, consideramos que este protocolo
permite determinar el porcentaje de fagocitosis
que debe tener una persona con recuento total de
blancos y recuento diferencial normal, partiendo
de recuentos conocidos de PMNs frente al
patógeno C. albicans. De esta forma, se convierte
en u n método dia g nósti c o signific a tiv o y
altamente reproducible para evaluar el proceso de
fagocitosis, aplicable en individuos con diferentes
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