resistencia multiple a drogas. estudio in vitro del efecto modulador

Departament de Medicina
Universitat de Lleida
Universitat
Rejjistr
1 0 NOV. 1997
RESISTENCIA MULTIPLE A DROGAS. ESTUDIO IN
VITRO DEL EFECTO MODULADOR DE PSC 833 Y
TAMOXIFEN EN UN MODELO EXPERIMENTAL
PROPUESTA DE TRIBUNAL LECTURA DE TESIS
RESISTENCIA MULTIPLE A DROGAS. ESTUDIO IN VITRO DEL EFECTO
MODULADOR DE PSC 833 Y TAMOXIFENO EN UN MODELO EXPERIMENTAL.
Virginia Callao Molina
Directores de Tesis: Dr. Xavier Gómez i Arbonés i Josep Macià i Virgili.
Departament de Medicina. Universitat de Lleida.
Fecha y hora de lectura: 12 de diciembre de 1997,12:00 horas.
Aula de Grados. Unidad Docente del Hospital Universitario Arnau de Vilanova
Tribunal:
Presidente:
Dr. Francisco O'Valle Ravassa
Profesor Titular de Anatomía Patológica.
Departamento de Anatomía Patológica e Historia de la Ciencia.
Universidad de Granada.
El Dr O'Valle pertenece a uno de los muy escasos grupos en España que actualmente se dedica
activamente al estudio del fenómeno MDR desde un vista clínico-experimental Es un reconocido experto
sobre MDR y actualmente pertenece al Departamento de Anatomía Patológica de la Universidad de
Granada y al Hospital Universitario adscrito a dicha Universidad Forma parte del grupo de trabajo sobre
Resistencia Múltiple a Drogas de la Sociedad Ibérica de Citometría Ha sido moderador de sesiones sobre
MDR, como en el Congreso de la SIC de 1997 (Lisboa) El último artículo publicado por su grupo sobre
MDR aparece en Am J Pathol 1995 Feb,146(2) 398-408 (Relationship between P-glycoprotein expression
and cyclosporin A m kidney An immunohistological and cell culture study Garcia del Moral R, O'Valle F,
Andújar M, Aguilar M, Lucena MA, Lopez-Hidalgo J, Ramírez C, Medina-Cano MT, Aguilar D, GomezMorales M)
Secretaria:
Dra. Asunción Pinacho Oyarzabal
Médico Adjunto de Hematología y Hemoterapia.
Hospital de Santa Maria. Lleida.
La Dra Pinacho actualmente está adscrita al Banco de Sangre del Hospital Universitario Arnau de
Vilanova de Lleida Es una experta en el tratamiento de soporte de los pacientes oncohematológicos La
imporancia clínica del estudio del fenómeno MDR en enfermos hematológicos recomienda la inclusión de un
experto clínico en el manejo de estos pacientes Además, la Dra Pinacho ha colaborado en estudios sobre
MDR y posee amplia experiencia en las técnicas de citometría de flujo Su última publicación sobre
citometría de flujo está en prensa (Inmunología) Que una parte importante de los resultados de los
experimentos se han obtenido utilizando la citometria de flujo realizando estudios funcionales sobre P-gp
170 justifica que en Tribunal se incluya un experto en esta técnica
Vocal:
Dr. Miguel Ángel Izquierdo Delso.
Médico Adjunto del Servicio de Oncología
Instituto Catalán de Oncología. L'Hospitalet del Llobregat. Barcelona
El Dr Izquierdo permaneció durante algunos años en Free University Hospital (Amsterdam), con el
grupo de Scheper Es autor de numerosas publicaciones sobre MDR como primer firmante (Overexpression
of the ABC transporter TAP in multidrug-resistant human cancer cell lines Br J Cancer 74(12), 1961-1967
(1996) Major vault protein LRP-related multidrug resistance Eur J Cancer 32A(6), 979-984 (1996)
Antiproliferative effects of interleukm-12 treatment on human tumor colony-forming units taken directly from
patients Anticancer Drugs 7(3), 275-280 (1996) Broad distribution of the multidrug resistance-related vault
lung resistance protein m normal human tissues and tumors Am J Pathol 148(3), 877-887 (1996)
Overlapping phenotypes of multidrug resistance among panels of human cancer-cell lines. Int J Cancer
65(2), 230-237 (1996). Relationship of LRP-human major vault protein to in vitro and clinical resistance to
anticancer drugs. Cytotechnology 19(3), 191-197 (1996). Drug resistance-associated marker Lrp for
prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma. J Nati Cancer Inst
87(16), 1230-1237 (1995)) y en otras 6 más formando parte del grupo de trabajo. Actualmente el Dr.
Izquierdo trabajo en el Servicio de Oncología del Instituto Catalán de Oncología. Aunque ahora se dedica
preferentemente a tareas asistenciales es un reconocido experto sobre resistencia múltiple a drogas.
Vocal:
Dr. Gerard Mintenig Florensa
Profesor Titular de Fisiología
Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques.
Universitat de Lleida
El Dr. Mintenig ha publicado varios trabajos sobre P-gp 170. Además algunos de ellos con
referencia a tamoxifeno, uno de los fármacos que nuestro grupo ha investigado como modulador de la
bomba. Es un reconocido experto sobre P-gp 170, como demuestran las publicaciones: Sardini A, Mintenig
GM, Valverde MA, Sepúlveda FV, Gill DR, Hyde SC, Higgins CF, McNaughton PA. Drug efflux mediated by
the human multidrug resistance P-glycoprotein is inhibited by cell swelling. J Cell Sei 1994 Dec;107( Pt
12):3281-3290. Zhang JJ, Jacob TJ, Valverde MA, Hardy SP, Mintenig GM, Sepúlveda FV, Gill DR, Hyde
SC, Trezise AE, Higgins CF. Tamoxifen blocks chloride channels. A possible mechanism for cataract
formation. J Clin Invest 1994 Oct;94(4):1690-1697. Valverde MA, Mintenig GM, Sepúlveda FV, Mintenig GM.
Differential effects of tamoxifen and I- on three distinguishable chloride currents activated in T84 intestinal
cells. Pflugers Arch 1993 Dec;425(5-6):552-554. Mintenig et al. Specific inhibitors distinguish the chloride
channel and drug transporter functions associated with the human multidrug resistance P-glycoprotein.
Receptors Channels 1(4), 305-313 (1993). Gill DR, Hyde SC, Higgins CF, Valverde MA, Mintenig GM,
Sepúlveda FV. Separation of drug transport and chloride channel functions of the human multidrug
resistance P-glycoprotein. Cell 1992 Oct 2;71(1):23-32.
Vocal:
Dr. Jacint Boix Torres
Profesor Titular de Farmacología
Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques.
Universitat de Lleida
Uno de los objetivos finales de los modelos de laboratorio para el estudio de P-gp 170 es estudiar a
capacidad moduladora de fármacos que puedan ser aplicados en la práctica clínica. El Dr. Boix es profesor
de farmacología humana. Su línea de investigación actual trata acerca de los procesos y mecanismos
involucrados en la muerte celular. La muerte celular es uno de los objetivos del uso de la quimioterapia en
los pacientes con cáncer y del empleo de moduladores de MDR en los enfermos con neoplasias
quimiorresistentes. Los aspectos farmacológicos de la modulación de MDR y las consideraciones
farmacológicas que explican el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre P-gp 170 y su aplicación sobre
pacientes limitada por los efectos tóxicos y secundarios indeseables nos han llevado a considerar muy
interesante que un experto en farmacología forma parte del Tribunal de lectura de la presente Tesis.
Suplentes:
Dr. José Manuel Porcel i Pérez. Departament de Medicina. Universitat de Lleida.
Dra. Carmen Pinol i Felis. Departament de Medicina. Universitat de Lleida.
Dr. Joan Viñas i Salas. Departament de Cirurgia. Universitat de Lleida.
yVrbonés
Je Medicina.
UniVofsííat de Lleida
Xavier Gómez i Arbonés, profesor associado del Departament de Medicina de la
Universitat de Lleida y codirector de la tesis doctoral "RESISTENCIA MULTIPLE A
DROGAS. ESTUDIO IN VITRO DEL EFECTO MODULADOR
DE PSC 833 Y
TAMOXIFENO EN UN MODELO EXPERIMENTAL",
Hago constar,
Que la Dra. Asunción Pinacho Oyarzabal, Médico Adjunto de Hematología y Hemoterapia
del Hospital de Santa Maria, Lleida, actualmente está adscrita al Banco de Sangre del
Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida. Es una experta en el tratamiento de
soporte de los pacientes oncohematológicos. La imporancia clínica del estudio del
fenómeno MDR en enfermos hematológicos recomienda la inclusión de un experto clínico
en el manejo de estos pacientes. Además, la Dra Pinacho ha colaborado en estudios
sobre MDR y posee amplia experiencia en las técnicas de citometría de flujo. Su última
publicación sobre citometría de flujo está en prensa (Inmunología). Que una parte
importante de los resultados de los experimentos se han obtenido utilizando la citometría
de flujo realizando estudios funcionales sobre P-gp 170 justifica que en Tribunal se incluya
un experto en esta técnica.
Por estos motivos considero conveniente que la Dra. Pinacho forme parte del Tribunal que
debe juzgar la presente tesis.
Para que así conste firmo el presente documento.
Lleida, 3 de cotubre de 1977.
Xavier Gómez i Arbonés, profesor associado del Departament de Medicina de la
Universitat de Lleida y codirector de la tesis doctoral "RESISTENCIA MULTIPLE A
DROGAS. ESTUDIO IN VITRO DEL EFECTO MODULADOR DE PSC 833 Y
TAMOXIFENO EN UN MODELO EXPERIMENTAL",
Hago constar,
Que el Dr. Miguel Ángel Izquierdo Delso, Médico Adjunto del Servicio de Oncología del
Instituto Catalán de Oncología (L'Hospitalet del Llobregat. Barcelona) permaneció durante
algunos años en Free University Hospital (Amsterdam), con el grupo de Scheper. Es autor
de numerosas publicaciones sobre MDR como primer firmante (Overexpression of the
ABC transporter TAP in multidrug-resistant human cancer cell lines. Br J Cancer 74(12),
1961-1967 (1996). Major vault protein LRP-related multidrug resistance. Eur J Cancer
32A(6), 979-984 (1996). Antiproliferative effects of interleukin-12 treatment on human
tumor colony-forming units taken directly from patients. Anticancer Drugs 7(3), 275-280
(1996). Broad distribution of the multidrug resistance-related vault lung resistance protein
in normal human tissues and tumors. Am J Pathol 148(3), 877-887 (1996). Overlapping
phenotypes of multidrug resistance among panels of human cancer-cell lines. Int J Cancer
65(2), 230-237 (1996). Relationship of LRP-human major vault protein to in vitro and
clinical resistance to anticancer drugs. Cytotechnology 19(3), 191-197 (1996). Drug
resistance-associated marker Lrp for prediction of response to chemotherapy and
prognoses in advanced ovarian carcinoma. J Nati Cancer Inst 87(16), 1230-1237 (1995)) y
en otras 6 más formando parte del grupo de trabajo. Actualmente el Dr. Izquierdo trabajo
en el Servicio de Oncología del Instituto Catlán de Oncología.
Por estos motivos considero conveniente que la dr. Izquierdo forme parte del Tribunal que
debe juzgar la presente tesis.
Para que así conste firmo el presente documento.
Lleida, 3 de^otubre de \ 977.
X
Universitat de Lleida
Departament de Medicina
1297
700 aniversari
Universitat de Lleida
Av. Alcalde Rovira Roure, 80
(Hospital Universitari Arnau de Vilanova)
25198 LLEIDA
Catalunya (Espanya)
Tel. + 34 73 702433
FAX + 34 73 702435
Xavier Gómez i Arbonés i Josep Macià i Virgili, doctors en Medicina i Cirurgia i
professors associats de Medicina del Departament de Medicina de la Universitat
de Lleida,
Fem constar:
Que la llicenciada Virginia Callao Molina ha realitzat sota la nostra direcció la
Tesi Doctoral titulada "RESISTÈNCIA MÚLTIPLE A DROGAS. ESTUDIO IN
VITRO DEL EFECTO MODULADOR DE PSC 833 Y TAMOXIFEN EN UN
MODELO EXPERIMENTAL".
Que el treball reuneix la casuística, metodologia, resultats, revisió
bibliogràfica i demés condicions generals necessàries per permetre arribar a
conclusions vàlides que l'habilitin per optar al títol de Doctor en Medicina.
Que la Tesi està en condicions de ser llegida davant del Tribunal
corresponent.
I, perquè així consti i tingui els efectes corresponents, signem la aquest document.
Lleida, 9 d'octubre de 1997.
1300
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no hubiera sido posible sin la colaboración de un buen número de
personas, a las cuales deseo expresar mi agradecimiento:
En primer lugar y muy especialmente al Dr. Xavier Gómez i Arbonés, profesor
del Departamento de Medicina de la Universidad de Lleida a quien debo mi interés
por la investigación biomédica, y quien me ha enseñado las bases para la
realización de mi tesis doctoral. He tenido una enorme satisfacción de tenerlo como
director de tesis y quiero agradecerle no solamente sus consejos y constante apoyo
en la realización de este trabajo sino también su paciencia y su amistad.
AI Dr. Josep Macià i Virgili, Jefe de Servicio de Hematología y Hemoterapia
del Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida y profesor del Departamento
de Medicina de la Universidad de Lleida, codirector de esta tesis, por haberme
introducido en el interesante mundo de la hematología y por confiar en mí para llevar
a cabo este trabajo.
AI Dr. Gerard Mintenig, profesor de Fisiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Lleida, por habernos proporcionado de forma desinteresada la línea
celular de fibroblastos sobre la que se ha desarrollado nuestro modelo experimental.
A la firma comercial Sandoz, por habernos proporcionado la droga PSC 833,
lo que nos ha permitido incluirla en nuestro estudio.
AI Dr. Joan Cornelia del Departamento de Ciencias Medicas Básicas de la
Facultad de Medicina de Lleida por habernos permitido trabajar en la unidad de
cultivos celulares, lo que ha supuesto una ayuda fundamental para realizar nuestro
trabajo. En especial a Nuria y a Isabel por sus adecuados consejos y por su
inestimable ayuda en la preparación del material necesario para el mantenimiento de
las células.
A la Dra. Monste Teixidó que vivió con nosotros las dificultades del comienzo
del trabajo, por su constante interés, ayuda y amistad.
A Tomás, Víctor, Gonzalo, África, Cristina M., Armando, Cristina B., Asun,
Pilar, JuanMa, Miguel, Carmen y Rafa, porque han conseguido hacer más fácil mi
trabajo diario siendo no sólo compañeros sino también muy buenos amigos.
A todo el personal del Servicio de Hematología y Hemoterapia por su apoyo y
su interés.
Al Servicio de Farmacia del Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida
y en especial al Dr. Schoenenberger y al Dr. Cano, por su colaboración
desinteresada.
Al Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina y a la Universidad
de Lleida, por favorecer las condiciones necesarias para que se llevara a cabo este
trabajo de investigación. En especial a Teresa, Montse, María y Jordina, por su
amabilidad y ayuda.
^
fo"W
Parte de este trabajo ha sido financiado con una beca del Fondo de
Investigaciones Sanitarias y una beca de La Paería.
A toda mi familia y en especial a mi mejor amiga, mi madre, que ha estado
siempre a mi lado en los buenos y malos momentos.
A Luís y a María, gracias por todo...
A Luís y María
A mi madre
Resistencia Múltiple a Drogas
RESUMEN (FICHA MECANIZADA DEL MINISTERIO DE EDUCACIÓN)
RESISTENCIA MULTIPLE A DROGAS. ESTUDIO IN VITRO DEL EFECTO
MODULADOR DE PSC 833 Y TAMOXIFENO EN UN MODELO EXPERIMENTAL.
La resistencia múltiple a drogas (MDR) es un importante mecanismo involucrado
en el fracaso de la quimioterapia en neoplasias humanas. MDR está asociada a la
expresión del gen mdr1 y la glicoproteína P-gp 170 que codifica. Esta glicoproteína actúa
como una bomba expulsora de fármacos que reduce su acción citotóxica intracelular. La
posible aplicación clínica de fármacos con acción moduladora de la bomba pero con
aceptables efectos secundarios, abriría una vía terapéutica muy importante en pacientes
con neoplasias resistentes que expresen el fenotipo MDR ya que se podría conseguir la
resensibilización de las células tumorales a la quimioterapia. La existencia de formas
alternativas de MDR, no P-gp 170 dependientes, dificulta el estudio específico de P-gp 170
y de su modulación en ensayos clínicos o muestras procedentes de enfermos con
neoplasias quimiorresistentes.
El objetivo de este trabajo es desarrollar un método que permita el estudio del
fenómeno MDR atribuïble específicamente a la acción de P-gp 170 y su modulación en
condiciones experimentales de laboratorio y comprobar la supuesta acción moduladora de
PSC 833, tamoxifeno y combinaciones de ambos.
Hemos puesto a punto un modelo experimental basado en líneas celulares
sensibles y resistentes (células NIH-3T3 salvajes y transfectadas con el gen mdr1),
sustancias fluorescentes substratos de la bomba (daunorrubicina) y lectura por citometría
de flujo, que permite valorar específicamente el fenómeno MDR-P-gp 170 de una forma
funcional. En experimentos de incorporación y expulsión, se ha validado el modelo y se ha
estudiado la acción moduladora de PSC 833, tamoxifeno y combinaciones de ambos en
comparación con un"reconocido modulador de P-gp 170 como es verapamilo.
Los resultados del estudio demuestran que PSC 833 a dosis de 0.5 pM es capaz
de modular de forma completa la acción de P-gp 170 en experimentos de incorporación.
Sin embargo, con tamoxifeno o combinaciones de tamoxifeno y PSC 833 a dosis de 0.1 uM
solo se consigue una modulación parcial de la bomba.
Resistencia Múltiple a Drogas
ÍNDICE GENERAL
Resumen ficha mecanizada
1
índice general
2
índice de tablas, figuras y fotografías
10
índice de abreviaturas
12
I.- Introducción
15
1. -Cáncer y quimioterapia antineoplásica
15
1.1.- Conceptos básicos
15
1.2.- Mecanismo de acción de los quimioterápicos
15
1.3.- Mecanismos de resistencia de las células tumorales
16
1.3.1.- Resistencia primaria
17
1.3.2.- Resistencia adquirida
17
1.3.2.1.- Resistencia a una determinada droga o grupo de
drogas relacionadas estructural o funcionalmente
17
a.- Resistencia al metotrexato: descenso en la activación
del fármaco, alteración de la dihidro-folato reductasa
18
b.- Resistencia al 5-fluoracilo: aumento en la expresión de
timidilato sintetasa, alteración en el sistema del glutation
18
c.- Agentes alquilantes: alteración en los mecanismos de
reparación del DNA
18
d.- Antraciclinas: alteración en la topoisomerasa II
18
e.- Alcaloides de la vinca: alteraciones en la tubulina
18
1.3.2.2.- Resistencia a un grupo de drogas no relacionadas
funcional ni estructuralmente: Resistencia múltiple
a drogas
18
a.- P-glícoproteína 170
18
b.- MDR no relacionada con P-gp 170: Proteína asociada
a MDR y Proteïna asociada a la resistencia pulmonar
18
2.- Resistencia múltiple a drogas
19
2.1.-Concepto e historia
19
2.2.- Base genética: gen mdr1
20
2.3.- Expresión proteica: P-glicoproteína
21
2.3.1.- Estructura y función
21
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
2.3.2.- Expresión de P-gp 170 en tejidos normales
2.4. - Expresión de P-gp 170 en diferentes neoplasias
2.4.1.-Tumores sólidos
22
25
25
2.4.1.1.- Resistencia intrínseca
25
2.4.1.2.- Resistencia adquirida
25
2.4.2.- Neoplasias hematológícas
26
2.4.2.1.- P-gp 170 en leucemia aguda
26
a.- Leucemia mieloblástica aguda
26
b.- Leucemia linfoblástica aguda
27
2.4.2.2.- P-gp 170 en mieloma múltiple
27
2.2.2.3.- P-gp 170 en leucemia linfocítica crónica
28
2.2.2.4.- P-gp 170 en linfomas no hodgkinianos
29
2.2.2.5.- P-gp 170 en leucosis mieloide crónica
29
2.5.- Métodos de estudio del fenómeno MDR
29
2.5.1.- Detección del fenómeno MDR a nivel genético (DNA)
30
2.5.2.- Detección del fenómeno MDR a nivel transcripcional (RNAm)
30
2.5.3.- Estudio a nivel de expresión proteica
30
2.5.3.1.-Valoración cuantitativa de P-gp 170
30
2.5.3.2. - Valoración funcional de P-gp 170
32
a.-Citometría de flujo
32
b.- Sistemas de análisis de imagen
34
2.6.- Modulación del fenómeno MDR
34
2.6.1.-Concepto e historia
34
2.6.2.-Agentes clásicos
36
2.6.2.1.-Verapamilo
37
2.6.2.2.-Tamoxifeno
39
2.6.3.- Nuevos agentes
39
2.6.3.1.-SDZPSC 833
40
2.6.3.2.- Otros moduladores
41
2.6.4.- Uso combinado de sustancias moduladoras
3.- MDR no relacionada con P-gp 170
41
43
3.1.- Proteína asociada a la resistencia múltiple a drogas
43
3.2.- Proteína relacionada con la resistencia pulmonar
44
4.- Citometría de flujo. Principios básicos y aplicaciones
46
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
4.1.- Concepto y principios básicos
46
4.2.- Historia de la citomeíría de flujo
47
4.3.- Características generales de los citómetros de flujo
48
4.3.1.-Sistema óptico
48
4.3.2.-Sistema hidráulico
49
4.3.3.- Componente electrónico
49
4.3.4.- Prestaciones de los citómetros de flujo
50
4.4.- Fluorocromos utilizados en citometría de flujo
50
4.4.1.- Marcadores fluorescentes de unión covalente
50
4.4.2.- Marcadores fluorescentes de unión no covalente
50
4.4.3.- Marcadores fluorescentes sensibles al microambiente
51
4.5.- Reproducibilidad y comparación de resultados
51
4.6.- Aplicaciones de la citometría de flujo
52
5.- Cultivos celulares
5.1.- Medios de cultivo
53
53
5.1.1.-Constituyentes básicos de los medios de cultivo
53
5.1.2.- Suplementos para medios de cultivo
54
5.2.- Manejo de los cultivos celulares
55
5.2.1.- Evaluación diaria
55
5.2.2.-Subcultivos
55
5.2.3.-Criopreservación
55
5.3.- Modificación celular
56
5.3.1.- Mutagénesis
56
5.3.2.-Fusión
56
5.3.3.-Transfección
56
5.3.4.- Infección
56
II.-Justificación del trabajo
59
III.-Hipótesis
62
1- Hipótesis primera
62
2- Hipótesis segunda
62
3- Hipótesis tercera
62
IV.- Objetivos del trabajo
63
1.- Primer objetivo: Desarrollo del modelo de laboratorio,
estudio funcional de P-gp 170
63
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
2.- Segundo objetivo: Validación del modelo. Estudio de
inhibición de P-gp 170
63
3.-Tercerobjetivo: Acción moduladora de PSC 833 sobre P-gp 170
64
4.- Cuarto objetivo: Acción moduladora de tamoxifeno sobre P-gp 170
64
5.- Quinto objetivo: Estudio de la acción combinada de PSC 833
y tamoxifeno sobre P-gp 170
65
V.- Material y métodos
67
1.- Planteamiento metodológico
67
2.- Líneas celulares
69
2.1.- Fibroblastos NIH-3T3
69
2.2.- Cultivos y mantenimento
69
2.2.1.- Protocolo de descongelación de líneas celulares
70
2.2.2.- Cambio de medio de cultivo
70
2.2.3.- Protocolo de realización de subcultivos
".
70
2.3.- Obtención de suspensiones celulares
71
2.4.- Estudio de viabilidad celular
72
2.5.- Estudio de expresión de P-gp 170
72
3.- Substratos fluorescentes de P-gp 170
74
3.1.- Rodamina 123
74
3.2.- Daunorrubicina
74
4.- Fármacos moduladores
75
4.1.- Verapamilo
75
4.2.-PSC 833
75
4.3.-Tamoxifeno
76
5.- Análisis por citometría de flujo
77
5.1.-Características del citómetro de flujo
77
5.2.- Alineación del citómetro
77
5.3.- Creación de tests específicos
77
5.3.1.- Test para el estudio de acumulo de fármacos en el
interior celular
77
5.3.2.- Estudio de la viabilidad celular
78
5.3.3.-Contaje celular
78
5.3.4.- Detección cuantitativa de P-gp 170
79
6.- Diseño del estudio
6.1.- Consideraciones preliminares
80
80
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
6.1.1- Estudios de viabilidad celular
80
6.1.2.- Estudios a diferentes temperaturas
80
6.2.- Estudio básico de incorporación de fármacos
81
6.3.- Comparación entre células con y sin fenotipo MDR
81
6.4.- Modulación de MDR con verapamilo
81
6.5.- Estudios de expulsión de fármacos
84
6.6.- Modulación de MDR con diferentes drogas. PSC 833 y tamoxifeno
85
6.6.1- Experimento de valoración de la concentración
óptima de PSC 833
85
6.6.2.- Experimento de valoración de la concentración
óptima de tamoxifeno
86
6.6.3.- Experimentos de incorporación y expulsión
87
7.- Recogida de datos y análisis de los resultados
7.1- Variables del estudio
90
:
90
7.1.1- Variables de identificación del experimento
90
7.1.2.-Tipo celular
90
7.1.3.- Modulador
90
7.14.- Canal fluorescencia
91
7.1.5.- Porcentaje de expulsión
91
7.1.6.- Porcentaje de mortalidad celular
91
7.2.- Comparaciones estadísticas
VI.- Resultados
91
94
1- Estudio de la expresión de P-gp 170 en las líneas celulares
94
2.- Estudio de la función de P-gp 170
95
2.1- Estudio de la cinética de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3
95
2.2.- Estudio de la cinética de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3J3-mdr1
95
2.3.- Comparación entre las cinéticas de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 y 3T3-mcfr/
96
3.- Estudio de modulación con verapamilo
99
3.1- Experimentos para la valoración de la concentración y el
tiempo de incubación
99
3.2.- Estudio de la cinética de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 en presencia de verapamilo
100
3.3.- Estudio de la cinética de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3J3-mdr1 en presencia de verapamilo
101
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
3.4.- Resultados de los estudios de incorporación
102
3.4.1- Comparación entre las cinéticas de incorporación de las
células 3T3 en presencia o no de verapamilo
102
3.4.2.- Comparación entre las cinéticas de incorporación de
daunorrubicina en las células 3T3-mdr1 en presencia o
no de verapamilo
102
3.4.3.- Comparación entre las cinéticas de incorporación de
daunorrubicina en las células 3T3 en ausencia de modulador
y las células 3T3-mdr1 en presencia de verapamilo
103
3.5.- Resultados de los estudios de expulsión
104
3.5.1- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 en presencia o no
de verapamilo
104
3.5.2.- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3-mdr1 en presencia o no
de verapamilo
-.
104
3.5.3.- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 en ausencia de modulador
y las células 3T3-mdr1 en presencia de verapamilo
104
4.- Estudio de modulación con SDZ PSC 833
106
4.1.- Estudio de diferentes concentraciones
106
4.2.- Estudio de cinética de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 en presencia de PSC 833
107
4.3.- Estudio de cinética de incorporación y expulsión de
daunorrubicina en las células 3J3-mdr1 en presencia de PSC 833
108
4.4.- Resultados de los experimentos de incorporación
109
4.4.1.- Comparación entre las cinéticas de incorporación de
daunorrubicina en las células 3T3 en presencia o
no de PSC 833
109
4.4.2.- Comparación entre las cinéticas de incorporación de
daunorrubicina en las células 3J3-mdr1 en presencia
o no de PSC 833
110
4.4.3.- Comparación entre las cinéticas de incorporación de
daunorrubicina en las células 3T3 en ausencia de modulador
y las células 3T3-mdr1 en presencia de PSC 833
110
4.4.4.- Comparación entre las cinéticas de incorporación de
daunorrubicina en las células 3J3-mdr1 en presencia de
PSC 833 y en presencia de verapamilo
111
4.5.- Resultados de los estudios de expulsión
4.5.1.- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 en presencia o no de PSC 833
112
112
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
4.5.2.- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3-mcfrí en presencia
onodePSC833
112
4.5.3.- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3T3 en ausencia de
modulador y las células 3T3-mdr7 en presencia de PSC 833
112
4.5.4.- Comparación entre las cinéticas de expulsión de
daunorrubicina en las células 3~T3-mdr1 en presencia de
PSC 833 y en presencia de verapamilo
113
5.-Estudiode modulación con tamoxifeno
115
5.1.- Estudio de diferentes concentraciones y tiempos de incubación
6.- Estudio del efecto de la combinación de PSC 833 y tamoxifeno
Vil.-Discusión
115
117
120
1.- Métodos de estudio. Método funcional
120
2.- Citometría de flujo y sustancias fluorescentes
r
121
3.- Líneas celulares quimiorresistentes transfectadas. Estudio de la
expresión de P-gp 170. Autofluorescencia. Viabilidad celular
124
4.- Estudios de incorporación/expulsión
129
5.- Estudio funcional de P-gp 170
131
6.- Importancia del contaje celular
132
7.- Importancia clínica del estudio de P-gp 170 y de su modulación
132
8.- Experimentos de modulación
137
8.1.-Verapamilo
137
8.2.- Otros moduladores
142
8.3.-PCS 833
143
8.4.-Tamoxifeno
151
8.5.- Combinación de tamoxifeno y PSC 833
155
9.- Limitaciones y perspectivas futuras
156
9.1.- Limitaciones
156
9.2.- Perspectivas futuras
157
VIII.-Resumen
160
1.- Introducción y objetivos
160
2.- Material y métodos
163
2.1.- Líneas celulares
,
163
2.2.- Fármacos
164
2.3.- Citómetro de flujo. Tests específicos
164
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
2.4.- Diseño del estudio
165
2.5.- Recogida de datos y análisis de los de resultados
167
3.-Resultados
168
3.1.- Estudio de la expresión de P-gp 170 en las células del modelo
168
3.2.- Comparación entre las cinéticas de incorporación y expulsión
de las células 3T3 y 3T3-mcH
168
3.3.- Estudio de modulación con verapamilo
168
3.3.1.- Experimentos de incorporación
168
3.3.2.- Experimentos de expulsión
168
3.4.- Estudio de modulación con SDZ PSC 833
169
3.4.1.- Experimentos de incorporación
169
3.4.2.- Experimentos de expulsión
170
3.5.- Estudio de modulación con tamoxifeno
171
3.6.- Estudio del efecto de la combinación de PSC 833 yíamoxifeno
171
4.- Discusión
171
IX.- Conclusiones
175
X.-Bibliografía
179
XI.-Anexos
194
1.- Anexo 1: Calibración del citómetro
194
2. - Anexo 2 : Cinética de incorporación y expulsión de daunorrubicina
194
3.-Anexo 3: Primera parte test viabilidad celular
194
4.-Anexo 4: Segunda parte test viabilidad celular
194
5.- AnexoS: Contajefibroblastos
195
6.- Anexo 6: Detección de P-gp 170
195
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
1£
ÍNDICE DE TABLAS, FIGURAS Y FOTOGRAFÍAS
Tabla 1: Expresión, función y consecuencias de la modulación de P-gp 170 en diferentes
tejidos normales
Tabla 2: Expresión de P-gp 170 en células 3T3 y 3J3-mdr1
Tabla 3: Resultados de incorporación y expulsión de DNR en las células 3T3
Tabla 4: Resultados de incorporación y expulsión de DNR en las células 3J3-mdr1
Tabla 5: Resultados de incorporación de DNR en ambos tipos celulares
Tabla 6: Resultados de expulsión de DNR en ambos tipos celulares
Tabla 7: Resultados de la incorporación de DNR en células transfectadas en presencia de
diferentes concentraciones de VRP
Tabla 8: Resultados de incorporación de DNR en células transfectadas incubadas con
VRP en distintos periodos de tiempo.
Tabla 9: Resultados de incorporación y expulsión de DNR en células 3T3 con VRP 10 jaM
Tabla 10: Resultados de incorporación y expulsión de DNR en células 3J3-mdr1 con VRP
Tabla 11: Resultados de incorporación de DNR en células 3T3 en presencia o no de VRP
Tabla 12: Resultados de incorporación de DNR en células 3T3-mdr1 con y sin VRP
Tabla 13: Resultados de incorporación de DNR en células 3T3 y 3T3-mdr1 con VRP
Tabla 14: Resultados de la expulsión de DNR en las células 3T3 y 3T3 con y sin VRP
Tabla 15: Resultados de expulsión de DNR en las células 3T3-mdr1 con y sin VRP
Tabla 16: Resultados de la expulsión de DNR en las células 3T3 y 3T3-mdr1 con VRP
Tabla 17: Resultados del experimento de valoración de concentración óptima de PSC 833
Tabla 18: Resultados del experimento de valoración de concentración óptima de PSC 833
Tabla 19: Resultados de incorporación y expulsión de las células 3T3 con PSC 833
Tabla 20: Resultados de incorporación y expulsión en las células 3T3-mdrf con PSC 833
Tabla 21 : Resultados de incorporación en células 3T3 con y sin PSC 833
Tabla 22: Resultados de incorporación en células 3J3-mdr1 con y sin PSC 833
Tabla 23: Resultados de incorporación en células 3T3 y 3T3-mdr con PSC 833
Tabla 24: Resultados de incorporación en células 3J3-mdr1 con VRP y con PSC 833
Tabla 25: Resultados de expulsión en las células 3T3 con y sin PSC 833
Tabla 26: Resultados de expulsión en las células 3T3-mdr1 con y sin PSC 833
Tabla 27: Resultados de expulsión en las células 3T3 y 3T3-mdr con PSC 833
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
Tabla 28: Resultados de expulsión en las células 3J3-mdr1 con VRP y con PSC 833
Tabla 29: Resultados de incorporación en las células transfectadas incubadas con
diferentes concentraciones de PSC 833
Tabla 30: Resultados de incorporación en células transfectadas y sensibles incubadas con
PSC 833 y TMX aislados y en combinación
Figura 1 : Modelo de la P-gp 170 humana insertada en la membrana
Figura 2: Esquema de la función de P-gp 170
Figura 3: Esquema de un citómetro de flujo
Figura 4: Modelo teórico en que se basa nuestro proyecto
Figura 5: Esquema de los experimentos
Figura 6: Cinética de incorporación y expulsión de DNR en las células 3T3 y 3J3-mdr1 en
ausencia de modulador
Figura 7: Imágenes citométricas de experimentos sobre mezclas celulares
Figura 8: Curvas de cinética de incorporación de DNR en las células 3T3-mdr1 en
presencia de diferentes concentraciones de VRP
Figura 9: Curvas de cinética de incorporación de RH 123 en las células 3T3-mdr1 en
presencia de VRP 10ju,M
Figura 10: Curvas de cinética de incorporación y expulsión de DNR en las células 3T3 y en
las células 3T3-mdr1 incubadas con VRP 10 jaM
Figura 11: Curvas de cinética de incorporación y expulsión de DNR en las células 3T3 y
3T3-mdr1 tras la incubación con PSC 833 a diferentes concentraciones
Figura 12: Curvas de las cinéticas de incorporación y expulsión de DNR en las células
sensibles y resistentes tras la incubación con PSC 833
Figura 13: Diagrama de cajas de los resultados de incorporación de DNR
Figura 14: Diagrama de cajas de los resultados de expulsión de DNR
Figura 15: Curvas de cinética de incorporación de DNR en las células sensibles y
resistentes tras la incubación con diferentes concentraciones de tamoxifeno
Figura 16: Curvas de cinética de incorporación de DNR en las células 3T3 y 3T3-mdr1 tras
la incubación con la combinación de PSC 833 0.1 ju,M y TMX 50 ju,M
Foto 1 : Fibroblastos creciendo en monocapa en la placa de cultivo
Foto 2: Fotografías de fibroblastos de la línea celular 3J3-mdr1
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
12
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ABC: ATP binding cassette (familia de proteínas dependientes de ATP)
CMF: Citometría de flujo
CMRL: Connaught Medical Research Laboratories 1066
DMEM: Doulbecco's modification of Eagle's medium
DMSO: Dirnetilsulfóxido
DNR: Daunorrubicina
EDTA: Acido etiliendiaminotetracético
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
FL2: Fluorescencia 2
FL3: Fluorescencia 3
FSC: Forward scatter
IC: Intervalo de confianza
Kb: Kilobases
LB: Linfocitos B
LFL1 : Logaritmo de fluorescencia 1
LFL3: Logaritmo de fluorescencia 3
LLA: Leucosis linfoblástica aguda
LLC: Leucosis linfática crónica
LMA: Leucosis mieloblástica aguda
LMC: Leucosis mieloide crónica
LNH: Linfoma no hodgkiniano
LRP: Proteína asociada a la resistencia pulmonar
LT: Linfocitos T
MDR: Resistencia múltiple a drogas
MEM: Minimal essential medium
MM: Mieloma múltiple
MRP: Proteína asociada a MDR
NIH 3T3: Fibroblastos sensibles o salvajes
NIH 3T3-mdrf : Fibroblastos transfectados con el gen mdr1
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
13
NK: Células natural killer
PBS: tampon fosfato salino
P-gp 170: P-glicoproteína 170
RH 123: Rodamina 123
RNAm: RNA mensajero
RPE: R-ficoeritrina
RPMI: Rosewell Park Memorial Institute 1640
RT-PCR: Reacción en cadena de la polirnerasa- transcriptasa reversa
SD: Desviación estándar o típica
SLPC: Síndrome linfoproliferativo crónico
SSC: Side scatter
TM: Segmentos transmembrana .
TMX: tamoxifeno
UA: Unidades arbitrarias
UV: Ultravioleta
VAD: Vincristina, doxorrubicina, dexametasona
VRP: Verapamilo
índice
Resistencia Múltiple a Drogas
M.
INTRODUCCIÓN
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
15_
I.- INTRODUCCIÓN
1.- CÁNCER Y QUIMIOTERAPIA ANTINEOPLASICA
1.1.- CONCEPTOS BÁSICOS
El cáncer es una enfermedad que se desarrolla cuando una célula adquiere, de
forma espontánea o inducida por un agente carcinogénico, una alteración en sus
mecanismos de proliferación y diferenciación. Ello da lugar a un crecimiento
celular
inadecuado que escapa a los mecanismos de control fisiológicos. Además, estas células
anormales desarrollan una alta capacidad para diseminarse por^todo el organismo, tanto
por vía linfática como hematógena, apareciendo nuevos tumores a distancia o metástasis.
La comprensión de los fenómenos complejos que dan lugar al desarrollo de la neoplàsia,
así como su capacidad de invasión y diseminación es fundamental para desarrollar
estrategias diagnósticas y terapéuticas eficaces (Casciato and Lowitz, 1983).
La quimioterapia es una de las armas fundamentales en el tratamiento del cáncer,
sobre todo en neoplasias diseminadas o irresecables. Se consigue en muchos casos
remisiones duraderas, supervivencias prolongadas y cada vez más una elevada
probabilidad de curación de la enfermedad.
El término quimioterapia engloba a un gran número de sustancias de distinta
composición química y con diferente mecanismo de acción, pero utilizadas con una misma
finalidad: frenar el crecimiento de la población celular neopiásica. La acción citotóxica no
siempre es selectiva dañándose también las células normales lo que da lugar a la aparición
de importantes efectos secundarios en muchos casos de difícil control. La toxicidad de
estos fármacos es muy variada e incluye desde reacciones alérgicas leves hasta toxicidad
directa de los diferentes órganos sistémicos, incluyendo la mielosupresión.
1.2.- MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS QUIMIOTERAPICOS
Los fármacos citotóxicos pueden ser clasificados en relación con su actividad sobre
el ciclo celular. Los fármacos denominados ciclo-inespecíficos actúan tanto sobre células
en división como sobre células en reposo (esteroides y antibióticos antitumorales excepto
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
^
16
bleomicina). Los fármacos ciclo-específicos destruyen únicamente las células que se
encuentran dentro del ciclo celular. Algunos de ellos sólo son activos durante una fase
concreta del ciclo, denominándose fase-específicos (L-asparraginasa en fase G1,
alcaloides de la vinca en fase M). Otros no son específicos de fase, pudiendo actuar en
cualquier punto del ciclo celular (agentes alquilantes, dacarbacina). Tanto los fármacos
ciclo-inespecíficos como los ciclo-específicos fase-independientes presentan una curva
dosis-respuesta lineal. A mayor cantidad de droga administrada, mayor es la fracción de
células eliminadas. Las drogas ciclo-específicas dependientes de fase tienen un límite en
su capacidad antitumoral pero su efecto está en función tanto del tiempo de acción como
de su concentración.
Por otra parte, estas sustancias quimioterápicas pueden producir citotoxicidad
interfiriendo con diferentes procesos celulares. Los antimetabolitos, como metotrexato y 6mercaptopurina interfieren con la producción de purinas y pirimidinas y de este modo
inhiben la biosíntesis de ácidos nucleicos. Los agentes alquilantes como la ciclofosfamida,
alteran el DNA uniéndose a una sola hélice o produciendo uniones cruzadas entre las dos
hélices. Algunos antibióticos como doxorrubicina y daunorrubicina (DNR) se intercalan
entre las bases del DNA evitando la síntesis de DNA y RNA; otros como la bleomicina
rompen físicamente el DNA. Los alcaloides de la vinca se fijan a la proteína tubulina
rompiendo el huso mitótico. Las hormonas alteran la transcripción del RNA. Los metales
pesados forman enlaces covalentes con las bases de DNA. El busulfán y las nitrosureas
degradan el DNA por un mecanismo de alquilación.
1.3.- MECANISMOS DE RESISTENCIA DE LAS CÉLULAS TUMORALES
Para que la quimioterapia sea eficaz, el paciente debe estar en buenas condiciones
físicas, el tumor debe tener características de crecimiento favorables y los fármacos deben
ser eficaces contra esa neoplàsia en particular. Entre las características relacionadas con el
desarrollo tumoral que limitan la eficacia de la quimioterapia se encuentran: la existencia de
una gran masa tumo'ral al diagnóstico, una fracción de crecimiento tumoral baja, resistencia
de las células tumorales a los fármacos quimioterápicos y la existencia de reservónos
dentro del organismo que limitan el acceso de las drogas al tejido tumoral. A pesar de que
el desarrollo de nuevos fármacos quimioterápicos y combinaciones de fármacos clásicos ha
supuesto una mayor efectividad en el tratamiento del cáncer, el clínico se enfrenta
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
^
17
constantemente a la falta de respuesta de algunas neoplasias al tratamiento inicial o a la
aparición de resistencia a lo largo del mismo (De Vita et al, 1989).
1.3.1.- Resistencia primaria: Cada vez es más evidente el hecho de que en el
momento del diagnóstico muchos tumores humanos ya contienen células cancerosas que
son resistentes a la quimioterapia estándar. Se produce una selección constante de células
resistentes dentro del tumor mientras el paciente recibe el tratamiento, lo que lleva a un
crecimiento excesivo de células tumorales insensibles al quimioterapia) administrado. La
aparición de este tipo de resistencia se ha relacionado con diferentes factores como: la
capacidad proliferativa del tumor, la accesibilidad vascular de las drogas al mismo y, sobre
todo, una resistencia intrínseca de las células tumorales al tratamiento citotóxico.
1.3.2.- Resistencia
adquirida:
Oíros
tumores,
que
inicialmente
responden
adecuadamente a un determinado régimen terapéutico, presentan una progresiva falta de
respuesta a los fármacos utilizados (incluso a otras drogas diferentes) lo que limita
finalmente la eficacia del tratamiento quimioterápico. En otros casos, tras una muy buena
respuesta inicial, se produce una recidiva del tumor, evidenciándose una falta de
sensibilidad a las posteriores pautas terapéuticas. Este tipo de resistencia se denomina
resistencia adquirida.
Una gran variedad de mecanismos pueden contribuir a la aparición de resistencia,
pero al final son la expresión de la heterogeneidad que la población tumoral' va adquiriendo
con el tiempo. A medida que el tumor crece, se producen mutaciones espontáneas y
fenómenos de amplificación génica que son fundamentales en la aparición de la falta de
respuesta al tratamiento.
Según Goldie y Goldman, la probabilidad de que aparezca una célula resistente en
un tumor depende directamente del tamaño del mismo y de la frecuencia de mutaciones
espontáneas. Estos autores defienden que la probabilidade de curación de la enfermedad
neoplásica es mayor si el tratamiento se instaura precozmente y si la masa tumoral es
pequeña.
En las dos últimas décadas se ha profundizado en el estudio de las bases genéticas
y bioquímicas de la resistencia a drogas (Roninson, 1987; Biedler, 1992). Utilizándose
diferentes modelos experimentales se han descrito diferentes mecanismos de resistencia
tumoral:
1.3.2.1.- Resistencia a una determinada droga o grupo de drogas
relacionadas estructural o funcionalmente:
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
11.
a.- Resistencia al metotrexato: descenso en la activación del fármaco, alteración de
la dihidro-folato reductasa
b.- Resistencia al 5-fIuoracilo: aumento en la expresión de timidilato sintetasa,
alteración en el sistema del glutation
c.- Agentes alquilantes: alteración en los mecanismos de reparación del DNA
d.- Antraciclinas: alteración en la topoisomerasa II
e.- Alcaloides de la vinca: alteraciones en la tubulina
1.3.2.2.- Resistencia a un grupo de drogas no relacionadas funcional ni
estructuralmente: Resistencia múltiple a drogas
a.- P-glicoproteína 170
b.- MDR no relacionada con P- glicoproteína 170: Proteína asociada a MDR (MRP)
y Proteïna asociada a la resistencia pulmonar (LRP).
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
2.- RESISTENCIA MULTIPLE A DROGAS
2.1.- CONCEPTO E HISTORIA
A finales de los años 60 se publicaron diferentes estudios que describían un
fenómeno de resistencia cruzada a múltiples drogas.
Burchenal y sus colaboradores, en 1963, observaron en líneas celulares de
leucemia murina que la inducción de resistencia a un grupo determinado de agentes
citotóxicos podía inducir resistencia cruzada a otros fármacos diferentes.
En 1968, Kessel demostró una reducción en el acumulo de dactinomicina D en
células leucémicas murinas resistentes a los alcaloides de la vinca.
Biedlery Rihem, en 1970, evidenciaron un resistencia cruzada a un gran grupo de
productos naturales con características estructurales y bioquímicas distintas en células de
pulmón de hámster chino resistentes a la dactinomicina y a la DNR.
En 1973, Daño y sus colaboradores demostraron que este tipo de resistencia se
debía a un descenso en el acumulo intracelular del fármaco citotóxico por la existencia de
un transporte activo hacia el exterior de la célula. Estos autores proponían como
responsable del fenómeno la existencia de una bomba de expulsión a nivel de la
membrana celular.
En 1976, Juliano y Ling, estudiando células de ovario de hámster chino resistentes
a la colchicina descubrieron una glicoproteína de membrana de elevado peso molecular
(170
Kilodaltons)
que
se
correlacionaba
cuantitativamente
con
el
grado
de
quimiorresistencia de la célula. Esta molécula se denominó "P-glicoproteína 170" (P-gp
170), siendo la responsable de los trastornos de permeabilidad de la membrana en estas
células. Poco después se describió como una fosfoglicoproteína, siendo la fosforilación una
modificación post-translacional (Carlsen et al, 1977).
Poco después estas observaciones se extendieron a las células humanas,
inicialmente en líneas celulares de leucemia linfoblástica resistentes a la vinblastina (Beck
étal, 1979).
A partir de aquí han sido múltiples los estudios sobre P-gp 170 tanto en líneas
celulares humanas como murinas, obteniéndose nuevos datos sobre aspectos genéticos,
bioquímicos y de biología molecular de este fenómeno.
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
20
Los estudios genéticos iniciales sugerían que el descenso en el acumulo de
fármacos en las células con fenómeno de resistencia múltiple se debía a una única
alteración genética. Poco después, a través de técnicas de amplificación y de transfección
génicas se aisló el gen responsable de este fenómeno. El gen mdr1 codifica la
glicoproteína de membrana P-gp 170 y es el responsable directo de esta forma de
resistencia (Ueda et a!, 1986).
En 1992, Goldstein y sus colaboradores describieron y acuñaron el concepto de
fenotipo de resistencia múltiple a drogas o MDR. En modelos de laboratorio, las células
tumorales adquirían resistencia a una determinada droga citotóxica exponiéndose de forma
repetida a concentraciones ascendentes de dicha droga. Estas células seleccionadas
mostraban resistencia cruzada a otras drogas diferentes no relacionadas ni funcional ni
estructuralmente con las utilizadas al inicio.
Las células con fenotipo MDR eran capaces de mantener concentraciones
intracelulares del fármaco inferiores a las que carecían del fenotipo MDR debido a un
mecanismo de expulsión de sustancias dependiente de energía. Los estudios de
transporte de drogas indicaban que este fenómeno se debía a una alteración en la
membrana celular y no a cambios enzirnáticos celulares específicos.
El fenotipo MDR incluye resistencia cruzada a antraciclinas (doxorrubicina, DNR),
epipodofilotoxinas (etopósido), alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina),
taxanos
(paclitaxel, docetaxel), actinomicina D, mitoxantrone y VP-16. Fármacos como bleomicina,
metotrexato, cisplatino y drogas alquilantes no están afectados por éste fenómeno.
2.2.- BASE GENÉTICA: GEN mdr1
El gen mdr1 pertenece a una pequeña familia de genes que incluye dos miembros
en humanos (mdr1 y moY2/3) y tres miembros en roedores. El gen mdr1 humano está
localizado en el cromosoma 7 (q21.1), tiene una longitud de 100 kb y está formado por 29
exones.
La transfección de cDNA del gen mdr1, en líneas celulares sensibles, es capaz de
conferir el fenotipo MDR con elevada expresión de P-gp 170 (Ueda et al, 1987).
A pesar de un 60 % de homología con el gen mdr1, mdr2/3 es incapaz de traducir
fenotipo MDR, aunque puede tener importancia clínica. Recientes estudios muestran su
sobreexpresión en las leucemias B prolinfocíticas previamente al tratamiento (Nooter et ai,
1990; Herweijer ef a/, 1990).
Introducción
21
Resistencia Múltiple a Drogas
2.3.- EXPRESIÓN PROTEICA: P-GLICOPROTEINA 170
2.3.1.- Estructura y función: P-gp 170 es una fosfoglicoproteína transmembranaria
de 170 kilodattons, compuesta por 1280 aminoácidos. Pertenece a una superfamilia de
ABC (ATP binding cassette) proteínas especializadas en el transporte celular dependiente
de energía (Higgins, 1992). En su estructura existen dos mitades idénticas con un puente
de unión. En cada una de ellas existe un segmento hidrofóbico amino-terminal que
contiene seis lazos transmembrana y una región hidrofílica carboxi-terminal intracelular que
contiene zonas de unión a nucleótidos para la unión e hidrólisis del ATP. Contiene,
además, varias zonas de glicosilación en el primer lazo externo cerca del extremo aminoterminal de la molécula (van der Heyden et al, 1995).
Interior membrana
Figura 1: Modelo bidímensional y tridimensional de la P-gp 170 humana insertada en la membrana
plasmática. Se muestran los lugares de fosforilación y de unión al ATP. También se muestra la
estructura canalicular que adopta la bomba insertada en la membrana.
Se sabe que las dos mitades de la molécula no son independientes en su función
de transporte de sustancias ya que la inactivación de una de ellas conduce a una pérdida
defunción global (June et al, 1991) (Figura 1).
La molécula de P-gp 170 forma una estructura canalicular a través de la cual los
substratos de la misma,
incluyendo
drogas
citotóxicas y otras sustancias,
son
transportados activamente desde el citoplasma o la membrana plasmática al exterior de la
célula (June eí al, 1991).
Introducción
22
Resistencia Múltiple a Drogas
El funcionalismo de esta glicoproteína reside en tres dominios en los que se
produce la unión al ATP, el transporte específico de sustancias y el mareaje por fotoafinidad
(Endicottand Ling, 1989).
P-gp 170 actúa, pues, como una bomba de transporte de membrana ATPdependiente que, por un mecanismo de expulsión activa, es capaz de reducir la retención
intracelular de diferentes sustancias entre las que se incluyen fármacos citotóxicos
reduciendo su acción sobre los puntos diana y con ello su acción terapéutica. (Figura 2)
I
.>•
antracidinas
Epipodofilotoxmas
alcaloides
Figura 2: Esquema de la función de P-gp 170 como bomba expulsera de fármacos reduciendo su
acción tóxica a nivel de los puntos diana.
Aunque inicialmente se pensaba que la función transportadora de la bomba podía
estar regulada por mecanismos de fosforilación/defosforilación de la molécula (Robert,
1994), recientemente se ha demostrado que la fosforilación de P-gp 170 no es
imprescindible para conferir el fenotipo MDR (Germán ef al, 1995). De todas formas, es
posible que sí afecte a la especificidad del fármaco por la bomba o a la respuesta a
inhibidores.
2.3.2.- Expresión y papel fisiológico de P-gp 170 en tejidos normales: P-gp 170 se
describió inicialmente como una molécula únicamente presente en células tumorales
resistentes a drogas. Con la aparición de anticuerpos monoclonales dirigidos contra P-gp
170 (Kartner ef al, 1985) se evidenció su amplia expresión en tejidos normales (Fojo et al,
1987, Thiebaut et al, 1987, Cordon-Cardo et al, 1990). El estudio en muestras de tejidos
(procesados por anatomía patológica, tanto en muestras de biòpsia como de autopsias) ha
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
23
permitido obtener una aproximación detallada de la distribución de P-gp 170 en tejidos
humanos (Lum and Gosland, 1995).
La preponderancia de P-gp 170 en tejidos formados por células epiteliales con
función secretora sugiere su implicación en mecanismos de transporte de sustancias. Esta
proteína transportadora puede ser utilizada con diferentes finalidades por distintos tejidos.
Se ha relacionado con procesos de detoxificación celular, a través de la expulsión de
sustancias tóxicas o potencialmente tóxicas, incluyendo drogas antineoplásicas. Tiene un
papel importante en el transporte hormonal intracelular, en concreto en el mantenimiento
de niveles homeostáticos de esteroides en las células de la glándula adrenal. Además se
ha demostrado su importancia en la preservación de las barreras hemato-encefálica
placentaria y testicular (protección del cerebro, testículos y feto frente a sustancias tóxicas),
lo que puede explicar la dificultad de algunas drogas para ejercer su función en estos
tejidos convirtiéndolos en santuarios farmacológicos para las células malignas.
Entre los tejidos que presentan una alta expresión de glicoproíeína (Fojo eí al,
1987) se encuentra el cortex adrenal, túbulos renales proximales, canalículos biliares,
trofoblastos placentarios, mucosa del colon e intestino delgado, células endoteliales de los
capilares cerebrales y del testículo, células epiteliales del páncreas, epitelios del bronquio y
próstata y glándulas sudoríparas.
Existen otros tejidos en los que la expresión es moderada, como son, la médula
adrenal, epitelio traqueal, útero y mama.
La expresión de P-gp 170 es baja en músculo esquelético, corazón, bazo, esófago,
estómago, ovario y médula espinal.
En cuanto al tejido hematopoyético, P-gp 170 se expresa en determinadas células
de médula ósea (células CD34+) y en leucocitos normales de sangre periférica (Drach et
al, 1992; Chaudhary ef al, 1992; Walter ef al, 1994). Este último autor realizó un estudio
de la expresión de P-gp 170 tanto a nivel genético (mdr1 mRNA) como proteico (MRK 16) y
funcional con rodamina 123 (RH 123) en los leucocitos normales de voluntarios sanos,
llegando a la conclusión de que esta glicoproteína se expresa con diferente intensidad en
los diferentes poblaciones leucocitarias. Walter encuentra una alta expresión de P-gp 170
en células Natural Killer (CD56) y linfocitos T supresores (CD8) y una expresión moderada
en linfocitos T helper (CD4) y linfocitos B (CD19). En los monocitos (CD14) la expresión es
baja y en los granulocitos encuentra niveles de mdr1 mRNA moderados pero ausencia de
positividad para la valoración proteica. En el estudio funcional únicamente evidencia
Introducción
24
Resistencia Múltiple a Drogas
negatividad en los monocitos y granulocitos. Con todo ello llega a la conclusión de que en
los granulocitos P-gp 170 se expresa de forma moderada, pero esta expresión no se
produce en la membrana celular y no se relaciona con la función de transporte de
sustancias. En los monocitos la expresión de P-gp 170 es baja y no es funcional. Se cree
que el papel fisiológico de P-gp 170 en los leucocitos podría estar relacionado con el
transporte de citoquinas, de moléculas con acción citotóxica y de mediadores de la
inflamación (interleukina Ib) (Young and Kransey, 1992; Gupta étal, 1993).
Otros autores encuentran positividad para P-gp 170 en los progenitores mieloides
(CD33+) y células pluripotenciales o stem cell (CD34+) (Chaudhary and Roninson, 1991;
Drach et al, 1992). En las stem cell se ha sugerido que P-gp 170 puede tener un papel
protector frente a tóxicos. La reciente observación de que la transducción del gen mdr1 en
células hematopoyéticas murinas las protege frente a la acción tóxica de la quimioterapia
sugiere que la inducción de este gen en células hematopoyéticas sanas humanas podría
reducir los efectos mielosupresores de la quimioterapia (Licht et al, 1994). Es decir, la
introducción de copias adicionales del gen mdr1 en el genoma de las células progenituras
hematopoyéticas permitiría una quimioprotección, consiguiéndose reducir la toxicidad de la
quimioterapia a altas dosis sobre la médula ósea, que es el efecto dosis-limitante en el
tratamiento de muchos tumores sólidos (Hegewisch-Becker et al, 1995).
ÓRGANOS
Glándula adrenal
EXPRESIÓN
Cortical
FUNCIÓN
Transporte esteroides
Tracto gastro-intestinal
Mucosa colon e
intestino delgado
NK, LT, LB, Monocitos,
Mieloide, Stem cells
Desconocida
Riñon
Túbulos proximales
Hígado
Hepatocitos, y
conductos biliares
Mama, placenta, útero,
próstata, testículo
Barrera
Hematoencefálica
Glándulas sudoríparas
Excreción de
sustancias tóxicas
Excreción de
sustancias tóxicas
Barrera a sustancias
tóxicas
Barrera a tóxicos
Tejido hematopoyético
Sistema Reproductor
Cerebro
Piel
Desconocida
Desconocida
MODULACIÓN
Reducción en el
transporte hormonal
Aumento en la
absorción de tóxicos
Retardo en la
recuperación de la
mielosupresión
Reducción el la
eliminación de tóxicos
Reducción de la
eliminación de tóxicos
Náuseas y vómitos.
Neurotoxicidad
Mucositis y úlceras
Tabla 1: Expresión, función y consecuencias de la modulación de P-gp 170 en diferentes tejidos
normales.
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
25
2.4 - EXPRESIÓN DE P-GP 170 EN DIFERENTES NEOPLASIAS
2.4.1.- Tumores sólidos: Existen numerosos trabajos que documentan la expresión
de P-gp 170 en tumores sólidos relacionándola tanto con resistencia intrínseca como con
resistencia adquirida (Bellamy, 1990a; Pinedo and Giaccone, 1995; Chan et al, 1990;
Nooterand Herweijer, 1991a; Broxterman et al, 1994; Leighton and Goldstein, 1995; Garcí
del Moral et al, 1995)
2.4.1.1.- Resistencia intrínseca: Se describen tumores que habitualmente
muestran una elevada expresión de glicoproteína en el momento del diagnóstico
previamente al inicio del tratamiento antineoplásico. La mayoría de ellos derivan de
tejidos que utilizan de forma fisiológica dicha molécula, es decir, aquellos con alta o
intermedia expresión de P-gp 170 (Leighton and Goldstein, 1995). En estos casos
la expresión de P-gp 170 suele ser mayor en tumores bien diferenciados que en los
pobremente diferenciados (Kanamaru et al, 1989). Los tumores con fenómeno MDR
que derivan de tejidos con baja expresión de glicoproteína, probablemente se
originan de una subpoblación seleccionada de células P-gp 170 positivas.
Clínicamente estos tumores muestran una pobre respuesta al tratamiento
quimioterápico inicial y por tanto un peor pronóstico. En este grupo se encuentran
neoplasias como el carcinoma renal, cáncer de colon, carcinoma hepatocelular,
cáncer adrenocortical, feocromocitoma y cáncer de páncreas.
2.4.1.2- Resistencia adquirida: Existen oíros tumores que únicamente
expresan
niveles
elevados de
P-gp
170
tras
la
exposición
a
agentes
quimioterápicos. Suelen ser tumores derivados de tejidos con baja o nula expresión
de P-gp 170 de forma fisiológica. Estas neoplasias responden adecuadamente al
tratamiento
inicial pero progresivamente
adquieren resistencia
y pierden su
sensibilidad a la quimioterapia utilizada y en muchos casos a otros fármacos
alternativos. En otros casos, y tras una buena respuesta mantenida al tratamiento,
se desarrollan recidivas tumorales que no responden al mismo (Nooter, and
Herweijer, 1991a).
Como ejemplos de este tipo de tumores podemos nombrar el cáncer de
mama, cáncer de ovario, tumor de Wilms, cáncer de esófago, cáncer de pulmón y
melanoma.
En general, la detección del fenotipo MDR en estos tumores permitiría
identificar a pacientes con peor pronóstico, individualizar la estrategia terapéutica y
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Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
predecir la respuesta al tratamiento indicado. De hecho, estudios retrospectivos han
demostrado que la expresión de P-gp 170 en algunos tumores en el momento del
diagnóstico tiene un claro valor pronóstico independiente. En este grupo de tumores
destacan el sarcoma de la infancia (Chan et al, 1990), el neuroblastoma (Chan eí al,
1991) y el osteosarcoma (Baldini et al, 1995).
2.4.2.- Neoplàsies hematológicas: A pesar de que el uso de drogas citotóxicas ha
supuesto
un importante avance en el tratamiento
de las enfermedades onco-
hematológicas, muchos pacientes con este tipo de neoplasias desarrollan resistencia a las
drogas que se utilizan en el tratamiento de su enfermedad. Esta resistencia puede aparecer
en el momento del diagnóstico (resistencia intrínseca) o bien durante el curso y tratamiento
de la enfermedad (resistencia adquirida) (van der Heyden eí al, 1995). Se sabe que la
mayoría de fármacos empleados en el control de estas enfermedades están implicados en
el fenómeno M DR.
Numerosos grupos han investigado la expresión del gen mdr1 en las neoplasias
hematológicas, aunque con resultados poco comparables debido a la falta de un método
de estudio estandarizado (Marie, 1995). Se ha demostrado la existencia de una correlación
positiva entre la expresión de P-gp 170 y la quimiosensibilidad de estas neoplasias lo que
permitiría predecir la respuesta a diferentes regímenes terapéuticos de los diferentes tipos
de enfermedades (Pasman and Schouten, 1993). La ventaja del estudio de las leucemias
en relación a los tumores sólidos es la facilidad para obtener muestras tumorales, es decir
células malignas, antes, durante y después del tratamiento.
2.4.2.1.- P-gp 170 en leucemia aguda:
a.- Leucemia mieloblástica aguda (LMA): Existen diferentes estudios que reportan
una alta frecuencia de expresión del gen mdr1 en LMA, aunque con resultados poco
comparables dadas las diferencias entre los métodos utilizados en el estudio
(Goldstein eí al, 1989; Noonan eí al, 1990; Nooter et al, 1991b; Campos eí al,
1992a). La mayoría de autores hablan de 33-50 % de casos positivos en el
momento del diagnóstico. El porcentaje aumenta en los casos post- tratamiento y
sobre todo en enfermedades refractarias (Zhou eí al, 1992). El fenotipo MDR se ha
relacionado con otros marcadores de mal pronóstico como la presencia de CD7 y
CD34 (Holmes eí al, 1989; te Boekhorst eí al, 1993; Paietta eí al, 1995), un
cariotipo desfavorable, la edad avanzada y LMA secundarias (List, 1996). Además,
otros mecanismos de resistencia a drogas podrían estar asociados al fenotipo MDR
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
como la presencia MRP y LRP (List, 1996; Paietta et al, 1995) o el aumento de
mRNA glutation-S-transferasa, que se ha relacionado con la sobreexpresión del gen
mdr1 (Russo et al, 1994). La correlación entre la expresión de P-gp 170 y el éxito
del tratamiento en la LMA está bien documentada, existiendo al menos cuatro
trabajos que reportan una estrecha relación entre la expresión de mdr1 y la ausencia
de remisión y refractariedad de la enfermedad (Marie et al, 1991 ; Pirker et al, 1991 ;
Campos et al, 1992b; Zhou étal, 1992).
b.- Leucemia linfoblástica aguda (LAL): Tanto en los casos del adulto como en los
de la infancia la incidencia de casos con fenotipo MDR al diagnóstico es baja
(Brophy efa/, 1994; Fenneteau et al, 1993). Goasguen ha encontrado en su estudio
una alta correlación entre la presencia de P-gp 170 y el fracaso de la quimioterapia
(Goasguen et al, 1993). .En este estudio se demuestra que el periodo libre de
enfermedad se acorta marcadamente en niños con LLA que expresen fenotipo
MDR. En adultos con LAL que exprese P-gp 170 se demuestra una mayor dificultad
para lograr remisiones completas que en los casos negativos.
2.4.2.2.- P-gp 170 en mieloma múltiple (MM): Dalton y sus colaboradores, en
un trabajo realizado en 1989 para valorar la expresión de P-gp 170 en neoplasias de
célula B y su posible modulación, concluyen que el fenómeno MDR aparece en los
casos de MM refractarios y que puede contribuir al desarrollo de resistencia a
drogas en esta enfermedad (Dalton et al, 1989b). Epstein, en 1989, utilizando
técnicas de citornetría de flujo (CMF) encuentra niveles altos de P-gp 170 asociados
con resistencia a VAD (vincristina, doxorrubicina y dexametasona) tanto adquirida
como de novo en pacientes con MM aneuploide (Epstein étal, 1989).
Los estudios publicados en relación a la expresión de P-gp 170 en el MM
son también heterogéneos en sus conclusiones (de O a 60 % de casos positivos al
diagnóstico), debido a los diferentes métodos utilizados para la valoración de MDR.
Entre los trabajos más importantes destacan el de Sonnenveld (Sonnenveld et
a/,1993), que reporta un 31 % de casos positivos antes del tratamiento y el trabajo
de Grogan (Grogan et al, 1993). Este autor decribe una positividad del 6 % en el
momento del diagnóstico, y defiende un aumento progresivo en la incidencia de
MDR durante el curso de la enfermedad en relación a la dosis de antraciclínicos y
de alcaloides de la vinca recibida (drogas implicadas en el fenómeno MDR). Se cree
que el número de casos resistentes podría llegar a ser del 100 % en pacientes que
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
28
hubieran recibido el equivalente a diez ciclos de VAD. Linsenmeyer realiza un
estudio en 35 pacientes con MM evaluando su respuesta al tratamiento observando
una correlación positiva entre la expresión de P-gp 170 y la respuesta al tratamiento
(melfalán y diferentes agentes relacionados con MDR). La presencia de células
plasmáticas con fenotipo MDR durante el periodo de remisión post-tratamiento
identifica a un grupo de pacientes con alto riesgo de recidiva precoz y resistencia al
tratamiento (Linsenmeyer et al, 1992).
Pérez-Simón y colaboradores realizan una evaluación funcional de P-gp 170
en 30 pacientes de MM, con el fin de correlacionar los resultados con distintas
características de la enfermedad. Sus resultados sugieren una mayor expresión de
P-gp 170 en aquellos casos de MM con estadio más avanzado, con datos clínicos
de enfermedad activa, con .mayor número de células plasmáticas y menor expresión
de los marcadores de superficie CD56 y CD10. Además existiría relación entre las
anomalías presentes en el cromosoma 7 y la expresión de P-gp 170 (Pérez-Simón
et al, 1995).
El MM es una neoplàsia en la que, pese a una respuesta inicial adecuada a
las pautas quimioterápicas convencionales, se producen con frecuencia recaídas
que llevan a una evolución tórpida de la enfermedad y al fallecimiento del paciente a
causa de una resistencia adquirida a las diferentes pautas terapéuticas disponibles.
2.2.2.3.- P-gp 170 en leucemia linfocítica crónica (LLC): Diferentes autores
han descrito casos de MDR en esta enfermedad, tanto en el momento del
diagnóstico como después del tratamiento (Shustik et al, 1991; Michieli eí al, 1991).
Marie y colaboradores reportan, en 1994, niveles mayores de mdr1 mRNA en los
linfocitos B neoplásicos en los pacientes que habían recibido tratamiento (tanto
clorambucil corno poliquimioterapia),
a diferencia de los pacientes recién
diagnosticados. Además, en algunos pacientes se observó una alta expresión de
mdr1 mRNA en los linfocitos T normales (en comparación con los niveles de P-gp
170 encontrados en la población T de individuos sanos) (Marie et al, 1994). Grulois
no encuentra correlación entre el número de íinfocitos B leucémicos con fenotipo
MDR y parámetros clínicos o tratamiento previo en un estudio realizado en 1995 en
40 pacientes de LLC. Este autor preconiza que la actividad MDR es habitualmente
baja en esta enfermedad (Grulois et al, 1995).
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
?§-
2.2.2.4.- P-gp 170 en linfomas no hodgkinianos (LNH): Aunque existen
numerosos trabajos sobre la expresión de P-gp 170 en los LNH (Goldstein et a!,
1989; Miller et al, 1991; Niehans et al, 1992), las diferentes métodos utilizados, el
hecho de que en las muestras ganglionares exista una mezcla de células malignas
y células estromales y la heterogeneidad de la propia enfermedad, han dificultado la
obtención de conclusiones homogéneas. En la mayoría de trabajos se concluye que
la frecuencia de casos positivos para MDR en el momento del diagnóstico es baja
(del 2 al 18 %) aumentando significativamente en las recidivas (50 %). Varios
autores han estratificado los casos en relación al tipo de linfoma (bajo y alto grado,
subtipo B/T, estadio I-IV), no encontrando diferencias entre estos subgrupos
(Niehans ef al, 1992). En general, los niveles elevados de P-gp 170 en estos
tumores se han relacionado con peor respuesta al tratamiento y cortos periodos de
remisión.
2.2.2.5.- P-gp 170 en leucosis mieloide crónica (LMC): La expresión del
fenómeno MDR se ha asociado, en las LMC no tratadas, con la crisis blástica más
que con la fase crónica, reflejando una asociación de la expresión de P-gp 170 con
el aumento en la malignidad de la enfermedad y con un menor grado de
diferenciación en las células blásticas (Pirker ef al, 1989; Goldstein ef al, 1989).
Kuwazuru en un estudio realizado en pacientes con LMC en crisis blástica describe
la aparición del fenómeno MDR en leucemias inicialrnente P-gp 170 negativas tras
el tratamiento quimioterápico y en las recidivas (Kuwazuru ef al, 1990). Marks y
colaboradores, en 1996, en un estudio de laboratorio realizado en líneas de
leucemia humana no encuentran una relación entre la resistencia de los pacientes
con LMC al tratamiento quimioterápico, especialmente en crisis blástica, y la
presencia de P-gp 170.
2.5.- MÉTODOS DE ESTUDIO DEL FENÓMENO MDR
Existen varios métodos para determinar el fenómeno MDR. Se sabe que los
cambios genéticos responsables de la resistencia a drogas pueden producirse a nivel de
DNA, de RNA o a nivel proteico, por lo que las técnicas de detección de MDR pueden ir
dirigidas a estos diferentes niveles (van der Heyden et al, 1995). Pero no sólo es
importante detectar la intensidad en la expresión de MDR en una población celular, sino
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
30
también valorar su funcionalidad, es decir, su papel en la resistencia a drogas. Por eso los
métodos funcionales son los más utilizados y los que aportan mayor información.
Es fundamental desarrollar métodos de estudio que sean específicos para MDR y
con una alta sensibilidad, con el fin de aplicarlos en la práctica clínica. La estratificación de .
pacientes en diferentes categorías según el patrón de sensibilidad a quimioterápicos de
sus enfermedades neoplásicas, permitiría al clínico adaptar el tratamiento adecuado a la
biología de cada tipo de tumor en los diferentes pacientes.
2.5.1.- Detección del fenómeno MDR a nivel genético (DNA): Uno de los
mecanismos por el que
las células
pueden
adquirir
resistencia al tratamiento
quimioterápico es la amplificación génica. Este mecanismo, estudiado a través de técnicas
de genética molecular (Southern blot, dot blot, etc.) fue crucial en el descubrimiento del
gen mdr1, sin embargo no parece ser necesario para la sobreexpresión de dicho gen (Shen
era/, 1986; Pastan and Gottesman, 1987). El inicio de la transcripción de mdr1 (activación
génica) puede ocurrir previamente o incluso en ausencia de amplificación del mismo.
Diferentes investigadores han detectado la presencia de este mecanismo tanto en estudios
"in vitro" (Scotto ef al, 1986; Shen et al, 1986) como en estudios clínicos (Ito et al, 1989;
Shin et al, 1992), pero su contribución al desarrollo del fenómeno MDR en tumores
humanos durante el tratamiento quimioterápico parece ser mínima, teniendo mayor
importancia la fase transcripcional.
Por todo ello el estudio a nivel de DNA tiene escaso valor para su aplicación en la
práctica clínica.
2.5.2.- Detección del fenómeno MDR a nivel transcripcional (RNAm): Existen
diferentes métodos para la cuantificación del RNA mensajero: Northern blot, ensayo de
protección de RNasa, slot
blot
hibridación,
hibridación
in situ y transcriptasa
reversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), siendo este último método el mas
sensible ya que ofrece los mejores resultados en casos con muy bajos niveles de expresión
de MDR (Noonan et al, 1990; Van der Heyden era/, 1995).
2.5.3.- Estudio a nivel de expresión proteica:
2.5.3.1.- Valoración cuantitativa de P-gp 170: La detección y cuantificación
de P-gp 170 se basa en la utilización de anticuerpos monoclonales que reconocen
diferentes zonas antigénicas de la molécula, algunas intracitoplasmáticas y otras de
membrana (Kartner et al, 1985). Se conocen una gran variedad de ellos: C219,
JSB-1, MRK16, MRK17, 4E3, C494, Hyb-612, UIC2, 265/F4, etc. Los anticuerpos
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
monoclonalesC219, JSB-1 yC494 reaccionan con epítopos intracitoplasmáticos de
P-gp 170, por lo que para su utilización es imprescindible permeabilizar la
membrana celular. Se sabe que cada uno de ellos reconoce un epítopo diferente,
por lo que no se producen reacciones cruzadas. Los anticuerpos monoclonales
MRK16, UIC2 y 4E3, reconocen diferentes epítopos externos de la molécula de Pgp170.
El anticuerpo MRK16 reconoce un epftopo externo de P-gp 170 de origen
exclusivamente humano que no tiene reacción cruzada con la proteína del gen mdfö
humano y cuya acción interfiere con el funcionalismo de la glicoproteína (Mamada
and Tsuruo,1986; Thiebaut et al, 1989). Ferrand y colaboradores, en un estudio
realizado en 1996, comprueban la alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad
de un método para cuantificación de moléculas de P-gp 170 basado en la CMF y
utilizando como anticuerpo monoclonal específico a MRK16 (Ferrand et al, 1996).
4E3 es un anticuerpo monoclonal de clase lgG2a que reacciona
específicamente con un epítopo localizado en una región externa de la molécula de
P-gp 170 y es capaz de reconocer tanto las formas glicosiladas como las no
glicosiladas de la glicoproteína (Arceci et al, 1993). Se sabe que no reacciona con el
producto del gen mdr3. Su unión a las células que expresan P-gp 170 en su
membrana no afecta al acumulo intracelular ni potencia la citotoxicidad de DNR en
estas células (a diferencia de otros anticuerpos como MRK16 ó UIC2), es decir no
altera la función de la bomba. Esta característica es importante pues permite el uso
de 4E3 para el estudio funcional de P-gp 170 sin interferir con la dinámica de
incorporación y expulsión de las sustancias fluorescentes utilizadas.
Los métodos más utilizados para la valoración cuantitativa de P-gp 170 son
el método de Western blot, la inmunohistoquímica y la CMF.
Dalton y sus colaboradores (Dalton et al, 1989b) utilizan técnicas de
inmunohistoquímica en líneas de MM seleccionadas para MDR y en células
mielomatosas obtenidas de pacientes con enfermedad refractaria, poniendo a punto
un método para la detección y cuantificación de P-gp 170 utilizando el anticuerpo
monoclonal JSB1. Poco después, el mismo grupo (Grogan et a!, 1990) experimenta
con diferentes anticuerpos monoclonales (JSB1, C219 y MRK16) utilizando líneas
celulares resistentes de MM y muestras clínicas de mieloma con la finalidad de
optimizar el estudio inmunocitoquímico de P-gp 170. Estos autores concluyen que:
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
32
dado que cada uno de estos anticuerpos reconoce diferentes epítopos de P-gp 170,
el uso de un pequeño panel de anticuerpos sería útil para la valoración de la
expresión de la glicoproteína. Esta conclusión es también apoyada por Chin-Yee y
su grupo (1996) en un estudio de comparación de la detección de P-gp 170 con el
anticuerpo monoclonal 4E3 frente al estudio funcional con DNR y ciclosporina A en
pacientes de LLC, realizado con técnicas de CMF.
La CMF es una técnica especialmente útil ya que permite realizar mediciones
en células individualizadas y estudios en poblaciones seleccionadas de células
heterogéneas.
2.5.3.2.- Valoración funcional de P-gp 170: Además del uso de anticuerpos
para detectar y cuantificar moléculas de P-gp 170 en las células, es fundamental
medir la funcionalidad de dicha proteína. Es decir, es necesario valorar su función
como bomba de expulsión de drogas y por tanto su implicación en el fenómeno de
resistencia celular a fármacos. La detección del gen mdr1, del RNAm o de P-gp 170
no tiene sentido si no se demuestra que existe un proceso funcional activo en la
célula que conduce a cambios en la dinámica de retención de drogas.
Para demostrar este mecanismo se puede medir el proceso de incorporación
y expulsión de diferentes sustancias que sean substratos de P-gp 170.
Los
primeros
ensayos
realizados
con
este
fin,
utilizaban
drogas
antineoplásicas marcadas con isótopos radiactivos (adriamicina, vincristina) sobre
líneas celulares (Tsuruo ef al, 1982). Estos estudios fueron importantes en la
investigación de este fenómeno, pero su aplicación clínica es limitada ya que son
muy laboriosos y requieren el manejo de materiales radiactivos.
Posteriormente
se
han
desarrollado
otras
técnicas
diseñadas
específicamente para detectar el fenómeno MDR en muestras clínicas. Estas
técnicas están basadas en el uso de sustancias fluorescentes y los procedimientos
utilizados para su valoración son la CMF y los sistemas de análisis e imagen celular,
a.- Citometría de flujo: La CMF se basa en el análisis celular individualizado,
utilizando una suspensión celular en flujo laminar sobre la que incide un haz de luz
láser. Dicha luz es dispersada por cada célula en todas las direcciones del espacio
siendo recogida por una serie de detectores. Así se obtienen parámetros que
permiten la discriminación de diferentes tipos celulares en función de su tamaño
(luz dispersada hacia delante o forward scatter) y complejidad citoplasmática (luz
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
33
dispersada a 90 grados o side scatter). Además, si las células se tratan previamente
con colorantes fluorescentes o bien con anticuerpos monoclonales específicos
unidos a fluorocromos, se pueden medir a la vez parámetros de fluorescencia
(Efferthefa/, 1989).
Los primeros ensayos funcionales basados en el uso de fluorocromos se
realizaron
aprovechando
las propiedades
fluorescentes de los antibióticos
antitumorales DNR y doxorrubicina (Schuurhuis ef al, 1991 ; Van Acker ef al, 1993).
Estas sustancias son conocidos substratos de P-gp 170 y son transportados
activamente desde el interior al exterior de las células que expresan MDR.
Otras sustancias que se han utilizado son colorantes vitales como RH 123
(Lampidis ef a/, 1985; Efferth eí al, 1989; Gheuens ef al, 1991; Ludescher ef al,
1991; Ludescher ef al, 1992; Pétriz ef al, 1996), fluo-3, hidroethidina, Hoechst,
Calceina AM (Feller étal, 1995) y otros, también probados substratos de la bomba
(Freyefa/, 1995).
Además, la CMF podría ser aplicada como técnica de screening rutinaria ya
que es relativamente barata, rápida, reproducible y fácil de realizar (Herweijer ef al,
1989; Gheuens efa/, 1991; Chin-Yee efa/, 1994; Pétriz and García-Lopez, 1997).
Uno de los inconvenientes de su aplicación en el estudio de tumores sólidos
es la necesidad de trabajar con suspensiones celulares. El uso de técnicas de
dispersión mecánicas o enzimáticas puede dar lugar a lesiones celulares que
alteren los resultados. Este problema no existe en el estudio de enfermedades
hematológicas.
Otro problema del estudio aislado de incorporación/expulsión es su baja
especificidad. La técnica puede ser únicamente utilizada para detectar diferentes
intensidades de fluorescencia por célula y no para identificar el mecanismo
responsable. Existen otros factores, además de la capacidad de expulsión de la
droga, que pueden contribuir a la detección de diferencias de fluorescencia:
diferencias en el tamaño y la permeabilidad celular, unión del fluorocromo a
estructuras intracelulares u otros mecanismos de expulsión no relacionados con Pgp 170. Con el fin de aumentar la especificidad de la técnica, se han desarrollado
diferentes procedimientos. La técnica más simple es la realización del estudio en
presencia o no de fármacos moduladores de P-gp 170. Herweijer y Ludescher han
desarrollado técnicas que permiten valorar la cinética de incorporación y expulsión
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
34
de DNR y RH 123 y su modificación en presencia o no de verapamilo, realizando
medidas secuenciales en el tiempo (Herweijer et al, 1989; Ludescher et al, 1993).
Gheuens y sus colaboradores (1991) desarrollan una técnica para la valoración de
P-gp 170, combinando el uso de un anticuerpo monoclonal específico, MRK16 y el
estudio de retención de DNR. Ludescher y su grupo (1992) realiza un estudio
similar, utilizando RH 123. Chin Yee y colaboradores (1994) comparan el estudio
funcional de P-gp 170 (utilizando DNR, ciclosporina A y verapamilo) con la
expresión celular de P-gp 170 determinada por Western Blot, encontrando entre
ambas técnicas una alta correlación. Broxterman describe una alta sensibilidad en
la valoración de P-gp 170 a través del estudio funcional con RH 123 y el modulador
PSC 833 (Broxterman et al, 1996). Todas estas técnicas han contribuido a
aumentar la especificidad del estudio funcional del fenómeno M DR aunque también,
en cierta medida, la complejidad de la técnica
b.- Sistemas de análisis de imagen: Se basan en valorar y medir la diferente
distribución intracelular de las sustancias fluorescentes en células que expresan el
fenotipo MDR. Se conoce que las antraciclinas se acumulan fundamentalmente en
el núcleo de las células vivas, existiendo una mínima cantidad en la membrana
celular, citoplasma u organelas. Esta distribución varía en las células que expresan
MDR. La mayor intensidad de fluorescencia se detecta en el aparato de Golgi,
lisosomas y mitocondrias, lo que se traduce en una mayor facilidad para expulsar las
drogas así como una reducción de la accesibilidad de las drogas a sus puntos diana
(Willingharn et al, 1986; Hindenburg et al, 1989). La adición de agentes inhibidores
de la función de P-gp 170 produce una redistribución de la fluorescencia hacia el
patrón nuclear inicial.
Estas técnicas todavía están en estudio pero parece que serán de gran
interés en la práctica clínica dada su alta reproducibilidad, facilidad de aplicación y
sensibilidad.
2.6.- MODULACIÓN DEL FENÓMENO MDR
2.6.1.- Concepto e historia: La potencial importancia clínica de la expresión de mdr1
en las células tumorales, ha llevado al desarrollo de numerosas estrategias dirigidas a
revertir el fenotipo MDR, entre ellas que se incluyen las siguientes:
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
• Uso de agentes quimioterápicos que no sean substratos de P-gp 170
(compuestos de platino, antimetabolitos, alquilantes, bleomicina) en aquellos pacientes en
los que se evidencia la expresión de mdr1 en sus células tumorales. El éxito de éstos
tratamientos está limitado por la aparición de mecanismos alternativos de resistencia.
• Desarrollo de análogos de los agentes quimioterápicos relacionados con MDR,
que mantengan su capacidad citotóxica sin ser substratos de P-gp 170. Como ejemplo un
derivado antraciclínico, morfolinoantraciclina, que todavía se encuentra en estudio (Vasey
et al, 1994)
• Uso de agentes citotóxicos todavía en estudio en forma liposomal de forma que no
son expulsados por P-gp 170. (Thierry étal, 1993).
• Inhibición de la expresión del gen mdr1, a través de la inhibición de la
transcripción del DNA.
• Administración simultánea de inhibidores de P-gp 170 y agentes quimioterápicos.
Esta estrategia ha sido la forma más utilizada para modular el fenómeno MDR, aunque con
una serie de limitaciones importantes que se exponen a continuación:
En 1981, Tsuruo y sus colaboradores demostraron que ciertas sustancias, como los
bloqueantes de los canales de calcio (en concreto verapamilo), eran capaces de
reestablecer la sensibilidad a los quimioterápicos en las células con fenotipo MDR a través
de una inhibición de la función de P-gp 170 (Tsuruo et al, 1981). Desde entonces se han
publicado numerosos trabajos que muestran la capacidad moduladora de diferentes
sustancias sobre P-gp 170, inicialmente en experimentos de laboratorio y posteriormente
aplicándose en la práctica clínica. Estas sustancias actúan fundamentalmente por un
mecanismo de bloqueo de los sitios de unión de las drogas a la glicoproteína
transportadora P-gp 170, produciendo una mayor retención intracelular del fármaco, un
aumento en su concentración a nivel de los puntos diana y por tanto una mayor acción
citotóxica.
Recientes estudios han demostrado que las drogas moduladoras interaccionan con
la glicoproteína en sitios de unión concretos denominados segmentos transmembrana (TM)
los cuales son claves para la unión y reconocimiento de estas sustancias, en particular los
dominios TM 5-6 y TM 11-12 (Kajiji ef al, 1994). De hecho, se sabe que la presencia de
mutaciones en estas regiones afectan tanto a la capacidad de P-gp 170 para reconocer y
transportar drogas como su interacción con conocidos
moduladores. Cardarelli y
colaboradores (1995), estudiando líneas celulares NIH-3T3 transfectadas, demuestran que
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
la sensibilidad de P-gp 170 a una sustancia moduladora depende no solo de dicha
sustancia y de la droga citotóxica utilizada, sino también de la presencia o ausencia de
mutaciones en la molécula de glicoproteína que puedan alterar la especificidad de
substrato.
A pesar de los resultados obtenidos en los experimentos de laboratorio utilizando
este tipo de drogas denominadas moduladores, su aplicación en clínica está limitada por
una serie de problemas. Las dosis necesarias para revertir el fenómeno MDR en el
laboratorio no pueden alcanzarse en clínica debido a los importantes efectos secundarios
que comportaría su uso. Por otro lado es importante tener en cuenta que dado que P-gp
170 también se expresa en los tejidos sanos, fundamentalmente en tejidos con función
excretora (hígado, riñon) y en las barreras hemáticas naturales (barrera hemato-encefálica,
feto-placentaria y testicular), su inhibición
puede
producir
una alteración en la
farmacocinética y biodisponibilidad de la droga citotóxica utilizada. Así se dificultaría su
eliminación, aumentarían sus niveles plasmáticos y se llegarían a conseguir niveles altos
de droga en tejidos sanos y en especial en aquellos habitualmente protegidos (SNC,
placenta y feto, testículo). Por todo ello se podrían producir efectos secundarios más
importantes y no habituales en este tipo de fármacos. Del mismo modo el acumulo de
fármaco citotóxico en en el tejido hematopoyético produciría un aumento en la toxicidad
hematopoyética (Lum and Gosland, 1995). Por otra parte, se ha demostrado que la
actividad de las sustancias moduladoras se reduce claramente en presencia de proteínas
séricas (en concentraciones fisiológicas), por lo que sus efectos en los pacientes pueden
variar de forma importante (Lehnert, 1996b).
2.6.2.- Agentes clásicos: Entre las sustancias moduladoras descritas clásicamente
se encuentran:
• Bloqueantes de los canales de calcio: verapamilo, nifedipina, quinina, quinidina.
• Inhibidores de la calmodulina: fenotiazinas.
• Análogos del tripanarol: tamoxifeno, toremifeno
• Esferoides.
• Progesterona.
• Ciclosporina A
• Cefalosporinas: ceftriaxona, cefoperazona.
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
37
A pesar de ser químicamente diferentes, estas sustancias comparten algunas
características fundamentales para su acción moduladora sobre P-gp 170, como son una
elevada ¡ipofilia y la existencia en su molécula de dos anillos aromáticos planos
Algunas de ellas se han ensayado "m vivo" con resultados variables, pero no se ha
generalizado su uso debido a los importantes efectos secundarios que comporta Las dosis
que se requieren para obtener resultados, equivalentes a las concentraciones utilizadas "in
vitro", son muy altas y en muchos casos no tolerables en la práctica clínica
2 6 2 1 - Verapamilo Uno de los fármacos moduladores más conocido y
estudiado es verapamilo (VRP), un antagonista de los canales de calcio Desde que
Tsuruo y sus colaboradores describieron, en 1981, su capacidad moduladora sobre
P-gp 170 en líneas celulares de leucemia hnfocltica munna resistentes a la
adnamicina, han sido muchos los trabajos que han confirmado este hecho utilizando
diferentes líneas celulares "m vitro" Rogan y cois, en 1984, describen la reversión
de la resistencia a adnamicina por verapamilo en células de cáncer de ovario
humano Kessel y Wilberdmg en 1985, prueban el efecto modulador de VRP (a
dosis entre 2 pM y 20 ^M) en una línea de leucemia murma con fenotipo MDR
(P388) a través de un experimento funcional con DNR Bellamy y cois, en 1988,
obtuvieron similares resultados tras el estudio en una línea celular de MM humana
con fenotipo MDR
Su mecanismo de acción se debe a una un bloqueo de los sitios de unión de
P-gp 170 a las drogas substratos de P-gp 170, impidiendo la expulsión activa de
estos fármacos al exterior de la célula (Akiyama et al, 1988, Ramu et al, 1992,
Bellamy étal, 1990b , Spoelstra et al, 1994)
Basados en los esperanzadores resultados obtenidos en los trabajos "m vitro"
de laboratorio, se pusieron en marcha diferentes estudios clínicos para evaluar la
acción quimiosensibilizante de verapamilo "in vivo" y su posible aplicación en la
práctica clínica
Desafortunadamente, en la mayoría de estos estudios se evidenció que la
dosis máxima tolerada de VRP producía niveles séricos significativamente inferiores
a los requeridos para la modulación de P-gp 170 La toxicidad cardiovascular fue
dosis-limitante a concentraciones séricas de 1-2 yM, mientras en la mayoría de
modelos "m vitro" se requieren concentraciones de 6-10 juM para la inhibición
completa de P-gp 170
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
38
Dalton y sus colaboradores (1989a) realizaron un estudio clínico piloto en
siete pacientes con MM refractario al tratamiento convencional con las drogas
vincristina, doxorrubicina y dexametasona (régimen VAD). La administración del
verapamilo fue por vía endovenosa de forma continua mientras se administraba el
tratamiento quimioterápico, produciéndose niveles séricos variables entre 200 y
1000 ng/ml. Dos de los cinco pacientes cuyas células mielomatosas expresaban Pgp 170 obtuvieron una buena respuesta, aunque la toxicidad sobre todo a nivel
cardiovascular (hipotensión y arritmias cardiacas) fue dosis-limitante. Ninguno de los
pacientes sin fenotipo MDR respondió al tratamiento con VRP. Pese a que la
duración de las respuestas al tratamiento fue corta, este estudio mostró que la
detección del fenotipo MDR podía identificar a pacientes con posibilidad de
beneficiarse del uso de drogas moduladoras. El estudio se continuó en 1991 con 22
pacientes de MM (Salmon et a, 1991). Del grupo de 10 pacientes con fenotipo
MDR, 4 obtuvieron respuesta tras la administración de altas dosis de verapamilo en
infusión continua junto al tratamiento con VAD. No se objetivó respuesta en los
pacientes sin fenotipo MDR.
Miller y colaboradores, en 1991, estudiaron el efecto de altas dosis de
verapamilo en infusión continua (niveles séricos entre 307 y 1810 ng/dl), asociado al
tratamiento quimioterápico convencional en 18 pacientes con linfoma refractario al
tratamiento, obteniendo un 42 % de respuestas favorables. Los efectos secundarios
de predominio cardiovascular fueron importantes. Estos estudios piloto sirvieron de
base para un ensayo aleatorizado fase III, llevado a cabo en 1994 por el
Southwestern Oncology Group (Dalton et al, 1994), que comparaba los resultados
del tratamiento VAD frente a VAD junto con verapamilo en MM refractario. El estudio
se llevó a cabo en 120 pacientes de MM resistente o en recidiva. El tratamiento con
verapamilo fue administrado por vía oral, alcanzándose niveles séricos de entre 150
y 400 ng/dl. Este estudio fue incapaz de demostrar un efecto beneficioso de la
adición de verapamilo al tratamiento VAD barajándose diferentes motivos: la
existencia de otros mecanismos de resistencia distintos de P-gp 170, la utilización
de dosis insuficientes del modulador (lo que explicaría la falta de efectos
secundarios encontrados en el trabajo) y su administración vía oral de forma
discontinua (los estudios "in vitro" demuestran que un modulador debe permanecer
de forma continua junto a las drogas quimioterápicas para poder ejercer su acción).
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
39
2.6.2.2.- Tamoxifeno: Tamoxifeno es un antiestrógeno sintético al que se le
ha atribuido capacidad para modular el fenómeno M DR (Ramu et al, 1984,
Leonessa et al, 1994). Tiene una vida media bifásica y sus principales efectos
secundarios son: náuseas, sofocos, leucopenia y trombopenia transitorias. Se han
descrito, aunque de forma ocasional, trombosis venosas y arteriales. A dosis altas y
de forma prolongada, puede producir trastornos corneales y retiñíanos. En 1984 se
describió por primera vez su capacidad para revertir la resistencia a drogas, en una
línea celular de leucemia murina P388 atribuyéndose ésta, a la interacción de la
hormona con los fosfolípidos de la membrana celular, produciéndose una alteración
de la capacidad de difusión de la misma (Ramu et al, 1984). Poco después se
demostró su acción sobre los sistemas de transporte de calcio, dato que sostenía
su posible acción generalizada sobre la función de la membrana. Berman y sus
colaboradores, en 1991, demuestran la acción selectiva de tamoxifeno sobre P-gp
170, tras realizar estudios de incorporación y expulsión de DNR en líneas celulares
de linfoma linfoblástico y de leucemia mieloide humanas, resistentes a la vincristina.
Estos autores demuestran que tamoxifeno aumenta la incorporación y retención de
DNR, de forma concentración-dependiente, sin relacionarse con la actividad
antiestrogénica y a dosis que podrían ser utilizadas "in vivo", en células con fenotipo
MDR. En 1994, los mismos autores (Berrnan et al, 1994), realizan un ensayo clínico
fase I, para valorar la acción moduladora de tamoxifeno en combinación con DNR
en pacientes con leucosis aguda refractaria o en recidiva. Este estudio sugiere que
se pueden alcanzar, "in vivo", concentraciones de tamoxifeno lo suficientemente
altas para revertir el fenotipo MDR (10 juM), con mínimos efectos secundarios y sin
interacciones farmacocinéticas evidentes. Sin embargo, Claudio y Emerman, en un
estudio realizado en 1996, sobre células epiteliales resistentes de glándula mamaria
humana tras pases con adriamicina,
no observan un efecto modulador
de
tamoxifeno a_ diferencia de la intensa actividad moduladora de ciclosporina A.
2.6.3.- Nuevos agentes: Evidentemente, si se pudiera disponer de fármacos
capaces de bloquear la bomba de expulsión de agentes antineoplásicos, con buena
tolerancia clínica y escasos efectos secundarios, se abriría una vía de tratamiento válida y
eficaz para pacientes con tumores que expresan MDR.
Este es un tema que preocupa a diversos grupos de investigación y por ello se está
trabajando para encontrar nuevas sustancias, o combinaciones de fármacos ya conocidos,
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
que sean capaces de revertir el fenómeno MDR y que puedan ser empleadas en la práctica
clínica. Los denominados moduladores de "segunda" y "tercera" generación se caracterizan
porque se han desarrollado específicamente con el fin de antagonizar la expulsión de
drogas mediada por P-gp 170.
En este grupo destaca el análogo no inmunosupresor de la ciclosporina D, PSC
833,
([3'-keto-Bmt1]-Val2]-Cyclosporine)
desarrollado
por
Sandoz
y
todavía
no
comercializado.
2.6.3.1.- PSC 833: PSC 833 ha demostrado ejercer una intensa actividad
inhibidora de P-gp 170 (5 a 10 veces mayor que ciclosporina A) sin presentar
efectos nefrotóxicos ni inmunosupresores y a bajas concentraciones (Twentyman et
al, 1991, Gaveriaux eí al, 1991; Boesch et al, 1991b¡ Jachez ef al, 1993). Este
efecto se ha demostrado .tanto en neoplasias hematológicas como en tumores
sólidos (Kellerei a/, 1992; Jonsson et al, 1992)
Jiang y colaboradores, en un estudio realizado en 1995 en una línea celular
de eritroleucemia humana resistente a DNR, demuestran que PSC 833 es capaz de
bloquear de forma específica la acción de P-gp 170, a concentraciones aplicables
en clínica y de un rnodo mucho más eficaz que ciclosporina A.
Archinal-Mattheis realiza un estudio en el mismo año en el que mediante un
experimento funcional, muestra que PSC 833 tiene un efecto modulador más
prolongado que ciclosporina A, puesto que, a diferencia de esta última, no es
activamente transportado por P-gp 170.
Actualmente se están llevando a cabo ensayos clínicos que comprueben
dicha capacidad quimiosensibilizante y aplicabilidad clínica. Los primeros estudios
clínicos (fase I) han demostrado que se pueden alcanzar en los pacientes
concentraciones séricas de 0.5 a 1 juM tanto de forma oral como endovenosa (Boote
ef al, 1994; Fisher et al, 1994). La toxicidad dosis-limitante es de predominio
neurológico, siendo la ataxia reversible el efecto secundario más frecuente.
Al igual que con la ciclosporina A y otros análogos, se han observado
también efectos sobre la farmacocinética de las drogas citotóxicas utilizadas
relacionadas con MDR, sobre todo en forma de mielosupresión (neutropenia
fundamentalmente) (Hama ef a/, 1997). El grupo de Sonnenveld en un ensayo
clínico fase I en pacientes con mieloma refractario concluye que es necesaria una
reducción de las dosis de doxorrubicina y vincristina cuando se asocia al tratamiento
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
41
PSC 833 (Sonnenveld et al, 1996). Estos resultados son similares a los obtenidos
por el grupo de Kornblau, en un ensayo clínico fase I en pacientes con LMA
refractaria. Estos autores observan que se requiere una reducción de las dosis de
mitoxantrone y etopósido cuando se administran conjuntamente con PSC 833
(Kornblau étal, 1997).
2.6.3.2.- Otros moduladores: Otros fármacos moduladores de reciente
aparición y que están siendo estudiados actualmente son, entre otros:
- Análogos del verapamilo (R-verapamilo, nor-verapamilo, tiapamilo, Rol 1-2933,
dexniguldipina, y otros) (Toffoli et al, 1995)
- SDZ 280-446, un ciclopétido semisintético análogo no inmunosupresor de la
ciclosporina D (Pourtier- Manzanedo et al, 1992).
- RU 486, un compuesto antiprogestágeno (Gruol et al, 1994).
- LY335979, un derivado ciclopropildibenzosuberano (Dantzig et al, 1996)
- S9788, un derivado triazineaminopiridino
- BIBW 22, un análogo del dipiridamol
- Tolitoxina, un producto natural derivado de un alga azul-verde
2.6.4.- Uso combinado de sustancias moduladoras: Otra forma de modulación de
M DR consiste en la utilización conjunta de agentes conocidos como inhibidores de P-gp
170, que actúen de forma sinérgica, a menores dosis, con la posibilidad de obtener
mejores resultados con menores efectos secundarios. Para ello, los fármacos utilizados
deben cumplir dos condiciones básicas: no deben presentar un incremento en su toxicidad
y deben producir una acción quimiosensibilizante aditiva o sinérgica en las células
tumorales resistentes.
Lehnert y sus colaboradores, en un estudio realizado en 1991 sobre un modelo
basado en una línea celular de mieloma humano resistente a la doxorrubucina
(8226/DOX6), demostraron que la utilización combinada de verapamilo y quinina, a dosis
menores que las usadas de forma aislada, puede modular el fenómeno MDR en neoplasias
humanas de célula B refractarias al tratamiento. El grupo de Berman ha demostrado así
mismo, un efecto sinérgico tras la utilización de dosis bajas de tamoxifeno y verapamilo, en
una línea celular de leucemia mieloide humana resistente a la vincristina (HL-60/RV). Hu y
sus colaboradores utilizaron verapamilo y ciclosporina con buenos resultados en líneas
celulares de leucemia humana (Hu et al, 1990).
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
42_
El problema fundamental de estos estudios se basa en que la administración
conjunta de sustancias moduladoras podría aumentar la toxicidad de las drogas citotóxicas
en tejidos normales que expresen P-gp 170. Por otra parte, los moduladores
podrían
interferir con la eliminación renal o hepática de los quimioterápicos produciendo unos
niveles séricos elevados inesperados de estos fármacos.
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
3.- MDR NO RELACIONADA CON P-GP 170
Aunque P-gp 170 es uno de los mecanismos principales y mejor estudiados de la
resistencia múltiple a drogas, se sabe que no es el único que da lugar al fenotipo MDR.
Existe evidencia, tanto en estudios "in vitro" como clínicos, de que la resistencia a fármacos
quimioterápicos es un fenómeno multifactorial (Mattern and Volm, 1993, Lehnert, 1996a).
Diferentes autores han presentado trabajos sobre líneas celulares que muestran un
fenotipo MDR pero en las que no se detecta expresión de P-gp 170 (Nielsen and
Skovsgaard, 1992; Center, 1993). Por otra parte, se conocen algunos tipos de tumores
resistentes al tratamiento quimioterápico, de forma primaria ó adquirida, que no expresan
P-gp 170, como pueden ser el melanoma y el cáncer de pulmón, mama y ovario (Lai et al,
1989; Belllamy, 1990).
Estos hallazgos indican que mecanismos adicionales de resistencia contribuyen al
fallo del tratamiento citotóxico en una gran cantidad de neoplasias avanzadas.
3.1.- PROTEÏNA ASOCIADA A LA RESISTENCIA MULTIPLE A DROGAS (MRP)
En 1992, Colé y sus colaboradores, describieron la proteína asociada a la
resistencia múltiple a drogas (MRP), en una línea celular de cáncer de pulmón de células
pequeñas (H69/AR). MRP es una glicoproteína de membrana, de 190 kilodaltons, formada
por 1531 aminoácidos. Se expresa en diferentes líneas celulares con fenotipo MDR no Pgp 170 y su mecanismo de acción se basa en la expulsión de drogas al exterior de la célula
por un mecanismo ATP dependiente (Zaman et al, 1994), es decir pertenece, de igual
forma que P-gp 170, a la superfamilia de proteínas transportadoras ABC (ATP-binding
cassette proteins). A través de estudios de transfección se sabe que la expresión del gen
mrp (localizado en el cromosoma 16: 16p13.1) confiere un fenotipo MDR similar, pero no
idéntico, al de P-gp 170 (Colé et al, 1994; Grant ef a/, 1994). Breuninger y su grupo
reportan, tras un estudio realizado en líneas de fibroblastos transfectadas con el gen mrp,
que la especificidad de fármacos de MRP es similar a la de P-gp 170 con la excepción del
taxo! y que la sensibilidad al verapamilo es menor (Breuninger ef al, 1995). Así mismo
demuestran que la función de MRP se relaciona con un aumento en la expulsión de
fármacos al exterior de la célula y una alteración en la distribución intracelular del fármaco,
de modo similar al fenotipo MDR.
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
44
Por ahora, la expresión y posible papel fisiológico de MRP en tejidos humanos
normales, así como su importancia en la resistencia tumoral a drogas no es completamente
conocida.
3.2.- PROTEÏNA RELACIONADA CON LA RESISTENCIA PULMONAR (LRP)
La búsqueda de nuevos mecanismos de resistencia a drogas llevó en 1993 al
descubrimiento de una proteína que se sobreexpresa en células neoplásicas con fenotipo
MDR no P-gp 170 (Scheper et al, 1993). Se denomina LRP (lung resistance protein)
porque se identificó inicialmente en una línea de cáncer de pulmón. En 1995, tras el
estudio del gen de esta nueva molécula localizado en el cromosoma 16 (16p11.2), se
demostró que LRP se identificaba como el componente mayor de los "vaults" (Scheffer et
al, 1995).
Los "vaults" son partículas complejas formadas por ribonucleoproteínas, que se
identificaron en 1986 en el hígado de rata mediante microscopía electrónica (Kedersha and
Rome, 1986). Posteriormente se detectaron en varias especies, incluyendo la especie
humana, encontrándose sobre todo en células epiteliales y macrófagos. Están formadas
por diferentes componentes: la proteína mayor, de 104 kD, tres proteínas menores y una
pequeña molécula de RNA, que forman una estructura compleja y dinámica. La mayoría se
localizan en el citoplasma, pero una fracción se encuentra en la membrana nuclear,
formando parte de los complejos de transporte intranuclear. Todo ello sugiere que su
función fisiológica esté relacionada con el transporte bidireccional de sustancias entre el
núcleo y el citoplasma.
LRP está ampliamente distribuida en los tejidos normales humanos de forma
variable. Existe una alta expresión en el epitelio bronquial, tubo digestivo, queratinocitos,
cortex adrenal y macrófagos. En los túbulos proximales renales, urotelio transicional,
células ductales pancreáticas y células germinales, la expresión es moderadamente alta.
LRP está también presente en una gran cantidad de tumores humanos, sobre todo
relacionada con la resistencia intrínseca a drogas. Se han detectado altos niveles de LRP
en tumores de colon, riñon y páncreas, niveles intermedios en tumores de ovario y niveles
bajos en cáncer testicular, neuroblastoma y LMA. El fenotipo de resistencia a drogas de
LRP es amplio e incluye drogas que no son substratos de P-gp 170 ni de MRP.
Desde su identificación, LRP se ha encontrado en un gran número de líneas
celulares con fenotipo MDR no P-gp 170 (seleccionadas tras pases con diferentes
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
quimioterápicos), como en líneas de cáncer de pulmón, fibrosarcoma, cáncer de mama y
MM (Scheper et al, 1993).
La sobrexpresión concomitante de LRP con la proteína MRP en líneas celulares con
MDR no P-gp 170 no es frecuente pese a estar localizados sus genes en el mismo
cromosoma. LRP y P-gp 170 no suelen aparecer de forma simultánea en líneas celulares
seleccionadas para MDR.
Se han puesto en marcha diferentes estudios para investigar la importancia real de
la expresión de LRP en tumores, en relación con la respuesta al tratamiento y en el
pronóstico. Recientemente se ha demostrado su valor pronóstico en la LLA de la infancia
(Klumper et al, 1995), LM A (Hart et al, 1995) y cáncer de ovario (Izquierdo et al, 1995).
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
46
4.- CITOMETRIA DE FLUJO. PRINCIPIOS BÁSICOS Y APLICACIONES
4.1.- CONCEPTO Y PRINCIPIOS BÁSICOS
La técnica de la CMF fue desarrollada en la década de los años sesenta, en los
Estados Unidos y Alemania, como un avance importante en la investigación de la biología
celular (Shapiro, 1988). Pero es desde hace aproximadamente quince años; en que los
avances en inmunología, oncología y hemopatología, así como el desarrollo de la
tecnología de los anticuerpos monoclonales (Köhler et al, 1975) y fluorocromos, han
permitido la aplicación de la CMF en la investigación biomédica y en la práctica clínica.
Se define como citómetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y
propiedades celulares (partículas biológicas) que fluyen en suspensión. Existen citómetros
que poseen, además, la capacidad de separar partículas de forma selectiva, a partir de una
suspensión líquida, denominándose "sorters".
Los principios básicos de la CMF son sencillos (Gomez-Arbonés, 1990). Es esencial
disponer de una suspensión de células o partículas individuales, de modo que la dificultad
para obtenerla es un factor limitante para el empleo de la técnica. Las células o partículas
(núcleos, organelas, cromosomas,etc.) son marcadas por colorantes fluorescentes que son
capaces de excitarse con una fuente luminosa de alta energía.
La suspensión celular convenientemente procesada y teñida, se inyecta en la
cámara de flujo del citómetro, que está hidrodinámicamente enfocada para que las células
pasen individualmente,
una detrás de otra, a través de un punto en que éstas
interaccionan físicamente con un haz de luz monocromática, dispersando la luz en todas
las direcciones. La luz dispersada hacia adelante (llamada forward scatter a 0 grados) está
relacionada con el tamaño de la célula. La luz dispersada a 90 grados del eje del haz
lumínico (light scatter a 90 grados) está relacionada con la estructua interna y la
complejidad citoplasmática.
La excitación de los fluorocromos ocurre en el punto de interacción de la célula y el
haz lumínico, dando como resultado la emisión de una luz de longitud de onda superior a
la incidente. Esta luz es recogida a 90 grados, siendo dirigidas las longitudes de onda
seleccionadas mediante espejos (dicroicos) adecuados a detectores fotomultiplicadores.
Las longitudes de onda no deseadas son bloqueadas por filtros ópticos. Si se dispone de
múltiples fluorocromos, excitables con la fuente de luz única, pueden unirse a las células
Introducción
47
Resistencia Múltiple a Drogas
permitiendo, de este modo, medidas fluorescentes simultáneas de varios parámetros de
una sola célula.
Las señales eléctricas analógicas son convertidas en señales digitales y son
procesadas por un ordenador, con el fin de generar histogramas correlacionados con los
parámetros deseados y efectuar el análisis de los mismos.
Filtros
de banda
Láser
placas deflectoras <
Right Angle
üght scattering
detector
Figura 3: Esquema de un citómetro de flujo
Las ventajas que proporciona la CM F frente a otros métodos que emplean
fluorocromos incluyen la objetividad, elevada sensibilidad
y velocidad de análisis,
posibilidad de realizar mediciones simultáneas sobre una sola célula y separación celular
en los sorters. Las desventajas y limitaciones son los altos costes de instrumentación y la
incapacidad de visualizar las células que estamos analizando.
4.2.- HISTORIA DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
La CM F se inició con lav)intención de representar un avance en el proceso de contar
y medir el tamaño de partículas o células en poblaciones no homogéneas
En los años 30 se describen los primeros contadores celulares automatizados. En
1953, Crosland y Taylor diseñan una cámara de flujo basada en la inyección de la muestra
en el seno de un fluido de arrastre a través de un capilar que se estrecha y centra el flujo de
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
48
la misma Con este sistema evitaban la obstrucción del capilar y mejoraban el enfoque de
la muestra con el haz de luz Estos autores sentaron las bases de las cámaras actuales
En 1965, Kamentsky usó la espectrofotometría (luz absorbida) dentro del sistema
de CMF, para cuantificar ADN
Además utilizó la medida multiparamétrica de luz
dispersada para evaluar características de los núcleos
Fue el primero en emplear
histogramas biparamétricos y desarrolló un sistema capaz de separar selectivamente
partículas en función de sus características citométncas el sorter neumático
Poco después, Fulwyler desarrolla el sorter electrostático, basado en la tecnología
de las impresoras de chorro de tinta Es el sistema empleado en la actualidad por la
mayoría de sorters
En 1967-69, Van Dilla describe el primer citómetro de flujo con configuración
ortogonal (perpendicularidad de los ejes de iluminación, paso de muestra y detección de
fluorescencia) Este autor aplicó la CMF para el estudio de la cuantifícación del DNA y de
las fases del ciclo celular
Durante los años 60 y 70 se desarrolla la tecnología de la CMF y la mejora en las
prestaciones de los instrumentos utilizados Pero es a partir de los años 80 cuando se
producen importantes avances en las aplicaciones de esta técnica en la investigación en
diferentes áreas, biología, genética, zoología, botánica, etc (Melamed et al, 1991)
4.3.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS CITOMETROS DE FLUJO
A diferencia de otras técnicas, el citómetro de flujo mide características celulares
individuales de un gran número de células y además, permite medir características de
poblaciones concretas en muestras heterogéneas
En todo citómetro de flujo existen unos componentes básicos
4 3 1 - Sistema óptico
El sistema óptico está constituido por la fuente de
iluminación, los filtros necesarios para discriminar la señal lumínica y llevarla al detector
adecuado y, por último, los fotodetectores que se encargan de recoger la luz
Como fuente de iluminación se pueden usar lámparas de arco voltaico o láseres,
siendo éstos últimos más utilizados por sus ventajas mejor rendimiento para FITC,
posibilidad de iluminación con vanos láseres y posibilidad de separación celular Los
láseres más utilizados son los de argón de baja intensidad (488 nrn, 15mW), refrigerados
por aire Los citómetros que utilizan luz de láser deben tener una configuración ortogonal
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
49
La luz producida por la fuente de iluminación, después de mteraccionar con las
partículas en la cámara de flujo, excita la fluorescencia de los fluorocromos y es dispersada
Existe también dispersión de luz según las características morfológicas de las partículas
La luz dispersada es recogida por la lente colectora y mediante los filtros ópticos de la
bancada óptica es llevada a los fotodetectores
Los filtros ópticos son los que seleccionan la longitud de onda que llega a cada
fotodetector y le confieren la especificidad de lectura de una u otra fluorescencia Existen
filtros coloreados o de absorción, que absorben la luz de una determinada longitud de
onda Los filtros de interferencia o dicroicos reflejan la luz que tiene una longitud de onda
superior o inferior a la que dejan pasar
Los fotodetectores pueden ser de dos tipos los fotomultiplicadores detectan la señal
de fluorescencia y luz dispersada a 90 grados
Los fotodetectores diodos detectan
generalmente la dispersión frontal de la luz
4 3 2 - Sistema hidráulico Está compuesto por la cámara de flujo y el sistema de
presión y de inyección de la muestra Las cámaras de flujo son diferentes según sea la
fuente de iluminación del citómetro Los aparatos equipados con láser utilizan cámaras
similares a la descrita por Crosland y Taylor Las cámaras pueden ser cerradas o abiertas,
teniendo, éstas últimas, velocidades de flujo superiores y fácil limpieza, aunque la cámara
cerrada ofrece una mejor discriminación señal/ruido
El sistema de presión y de inyección de la muestra se encarga de adquirir la
muestra e inyectarla junto con el fluido de arrastre en la cámara de flujo Es fundamental
que la velocidad de inyección de la suspensión celular sea constante y que las presiones
se mantengan estables durante toda la lectura Existen dos sistemas principales
por
presión, en la que se crea una presión en el tubo de la muestra que obliga a que ésta fluya
hacia la cámara de flujo, y por inyección isovolumétnca por jeringa, en la que la muestra es
aspirada por una jeringa que después la inyecta en la cámara de flujo
4 3 3 - Componente electrónico Cuando la luz incide en los fotodetectores se
produce una respuesta de los mismos en forma de señal eléctrica Los pulsos detectados
por los fotodetectores pasan a un amplificador y, después, son convertidos de señal
analógica a digital Se pueden efectuar amplificaciones lineales a 256 canales (8 bits),
1024 canales (10 bits) o logarítmicas (3 ó 4 décadas)
Existe la posibilidad de seleccionar un umbral de señal, así como crear regiones
selectivas de adquisición Después del procesamiento informático de la señal se obtienen
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
histogramas mono, biparamétricos o multiparamétricos. Los datos obtenidos con la lectura
por CMF pueden ser almacenados en forma de histograma o como base de datos en la
que se registra en forma de lista para cada evento, la señal producida por cada parámetro
evaluado (list mode).
4.3.4.- Prestaciones de los citómetros de flujo: Las prestaciones de los citómetros
de flujo se evalúan en función de varios parámetros (Steen, 1991):
a.- Sensibilidad: cantidad mínima de moléculas de un fluorocromo determinado que
pueden ser medidas con cierta precisión. Para la luz dispersada es el tamaño o índice de
refracción menor que puede ser medido con cierta precisión. La sensibilidad aumenta si se
disminuye la velocidad del flujo.
b.- Resolución (expresado como coeficiente de variación o CV): reproducibilidad de
la señal producida por idénticas células o partículas.
c.- Velocidad de medida: es la velocidad media máxima a la que las células pueden
ser medidas sin exceder de una frecuencia determinada de coincidencias. En los
citómetros láser oscila alrededor de la cifra teórica de 5.000 células/segundo.
4.4.- FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO
Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la
estructura, función y vitalidad de las células.
En citometría, el fluorocromo ideal debería tener un alto coeficiente de extinción a la
longitud de onda de excitación (probabilidad de absorber la luz), un alto rendimiento
cuántico (emisión de luz), una elevada fotoestabilidad y un corto estado de excitación. Si el
fluorocromo va unido a otra molécula, por ejemplo un anticuerpo monoclonal que le confiera
especificidad de mareaje, debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente
(Waggoner et al, 1991).
4.4.1.- Marcadores fluorescentes de unión covalente: Se utilizan para mareaje de
proteínas, lípidos o bien otras moléculas biológicas. El más empleado es el isotiocianato de
fluoresceína (FITC). Otros que se han descrito son rodamina, rojo texas, cianinas y
ficoeritrina. Este último se utiliza mucho porque, tras ser excitado a 488 nm, emite más allá
del espectro de la fluoresceína, permitiendo el doble análisis con un sólo láser.
4.4.2.- Marcadores fluorescentes de unión no covalente:
4.4.2.1.- Marcadores del contenido en ADN y ARN: Hoechst, DAPI, DIPI,
cromomicina A3, mitramicina, naranja de acridina, y otros. De uso común es-eL
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Resistencia Multiple a Drogas
51_
yoduro de propidio, que se excita con un láser de 488 nm y se une al ADN por
intercalación entre la doble cadena de bases
4 4 2 2 - Marcadores de potencial de membrana
cianmas y RH 123
También se utilizan para mareaje de mitocondnas, dado la alta diferencia de
potencial de su membrana
4 4 2 3 - Otros fluorocromos fluorocromos que se utilizan para estudiar la
actividad de bombas de membrana, receptores celulares o actividad enzimática Se
emplean sustancias fluorescentes que se acumulan en el interior celular o que
cambian su capacidad fluorescente o espectro de emisión/excitación por acción
sobre ellas de un proteínas que las expulsan o introducen en las células o que
ejercen sobre ellas una acción enzimática
443-
Marcadores fluorescentes
sensibles
al microambiente
Pueden ser
empleados para estimar las propiedades del ambiente en que se encuentran, puesto que
varían su espectro de absorción o emisión en función de las características del
microambiente que les rodea o de la concentración que se alcanza Se emplean para
determinar diferentes estados funcionales
pH, calcio,
potencial
red-ox, actividad
enzimática, cinética de fármacos y función de P-gp 170
4.5.- REPRODUCIBILIDAD Y COMPARACIÓN DE RESULTADOS
Los citómetros de flujo ofrecen una información relativa, no absoluta
Para
cuantificar hay que correlacionar los canales con resultados de muestras conocidas, es
decir, calibrar y ajustar las escalas Para ello se utilizan estándares de alineación, que son
materiales estables que tienen unos valores determinados de fluorescencia o dispersión de
la luz, válidos para detectar cambios y problemas en la configuración óptica y señal con el
tiempo
Para poder comparar los resultados entre distintos centros o con el paso del tiempo,
hay que asegurarse de que el citómetro funciona correctamente de modo continuado, por
lo que es fundamental ajustar diariamente el voltaje del fotodetector y/o las ganancias para
conseguir picos de intensidad determinada de un estándar y hacer curvas de seguimiento
Para monitonzar las prestaciones o reproducibilidad de los reactivos y la calidad de
los métodos de preparación celular se utilizan controles, que son un material que produce
unos resultados esperados o conocidos Los controles son importantes en los análisis de
ADN (se utilizan controles de ploidía) y en las técnicas de mmunofluorescencia (se utilizan
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
controles negativos para descartar unión específica del fluorocromo y seleccionar el umbral
de autofluorescencia, y controles positivos, para comprobar el buen funcionamiento de la
técnica)
4.6.- APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
La CM F se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales
de células o partículas en suspensión Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se
dan en biología y medicina y son la identificación de antígenos celulares mediante técnicas
de mmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular
La CMF se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos
• En hematología contaje celular, fórmula leucocitana, contaje reticulocitano, análisis de
médula ósea
• En farmacología estudios de cinética celular
• En inmunología subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulación Imfocitana
• En oncología diagnóstico/pronóstico, monitonzar tratamiento
• En microbiología diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos
• En genética canotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
5.- CULTIVOS CELULARES
Los cultivos celulares son procedimientos que nos permiten reproducir experimentos
"ex vivo" y estudiar características celulares en el laboratorio, como paso previo a su
aplicación en la práctica clínica
Si tenemos éxito en mantener las células viables durante largos periodos de tiempo,
podremos manipularlas con el fin de responder a diferentes preguntas Para asegurar que
las respuestas obtenidas tienen validez, las condiciones en las que las células se
encuentran cultivándose deben ser las óptimas para cada tipo celular (Darling and Morgan,
1994)
5.1.- MEDIOS DE CULTIVO
En general, todos los medios de cultivo están formados por soluciones básales
nutritivas, isotónicas y tamponadas, que proporcionan una fuente de energía a las células
Están, además, enriquecidas con sales, aminoácidos, vitaminas y otros suplementos
Estos suplementos, junto con las diferencias en la mezcla y concentración de los
constituyentes básicos, caracterizan cada tipo de medio
La elección del medio a utilizar depende del tipo de célula en cultivo Existen dos
tipos principales medios simples, de uso común como MEM (minimal essential medium),
RPMI (Rosewell Park Memorial Institute 1640) o DMEM (Doulbecco's modification of
Eagle's medium), y medios complejos y muy enriquecidos que se utilizan para el cultivo de
tipos celulares especializadas
En este ultimo grupo destacan Ham's F12, Iscove's
modification of DMEM y CMRL (Connaught Medical Research Laboratories 1066)
5 1 1 - Constituyentes básicos de los medios de cultivo
5 1 1 1 - Aminoácidos Esenciales argmina, cisteína, glutamina, etc
esenciales
alanma,
prolma, etc
La glutamina
No
se considera uno de los
componentes esenciales de todo medio de cultivo, como fuente principal de energía
junto a la glucosa y el piruvato Su carencia está implicada en una reducción de la
viabilidad celular
5 1 1 2 - Vitaminas Las más comunes son las vitaminas del grupo B (ácido
fólico, biotma y pantotenato), así como el ácido ascórbico y la vitamina E Son
importantes para el crecimiento y la supervivencia celular
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
5 1 1 3 - Iones Representan la base de la osmolandad del medio y son
principalmente Na+, K+, Mg2+, Ca2+, CI", SO42", PCV5", HCO3'
Para cultivos en suspensión (por ejemplo con medio RPM I), deben reducirse
las concentraciones de Ca2+y Mg2+, ya que son cofactores de la agregación celular
El NaHCO3/CO2 es el sistema tampón más utilizado y requiere un nivel de
CO2 de 5-10 % y una humedad del 100 % en la atmosfera en la que se incuban las
células para conseguir el mantenimiento del equilibrio ácido-base del medio y por
tanto, un adecuado crecimiento celular
5 1 1 4 - Carbohidratos La glucosa es una de las fuentes de energía
principales para la mayoría de medios aunque se pueden utilizar también galactosa,
fructosa o mañosa
5 1 1 5 - Otros constituyentes Nucleósidos, piruvato, lípidos Se utilizan en
medios de formulación compleja, sobre todo en aquellos no suplementados con
suero, como soporte para determinados tipos celulares especializadas
5 1 2 - Suplementos para medios de cultivo
5 1 2 1 - Sueros El enriquecimiento del medio de cultivo con suero es
necesario para el crecimiento de la mayoría de células ya que contiene una sene de
sustancias básicas para su proliferación Esta mezcla de sustancias
incluye
proteínas (globulinas, albúmina, transfernna etc ), factores de crecimiento (factor de
crecimiento derivado de las plaquetas), hormonas (insulina, corticoïdes), minerales,
y otros Existen varios tipos de sueros, de diferentes procedencias, siendo los más
utilizados suero fetal bovino, suero equino y suero fetal de ternera Todos ellos
están, previamente a su uso, ultrafiltrados y testados para diferentes contaminantes,
principalmente el micoplasma, así como premcubados a 56°C para mactivar el
complemento que podría reaccionar con las globulinas
Habitualmente se añade de un 5 a un 10 % de suero al medio estándar,
para asegurar un crecimiento adecuado de las células
5 1 2 2 - Antibióticos El uso de antibióticos, aunque generalizado, es
controvertido Se recomienda no utilizarlos a largo plazo ya que pueden enmascarar
infecciones presentes en el cultivo o producir toxicidad a la células Los antibióticos
más utilizados son penicilina, estreptomicina y gentamicma No se recomienda el
uso rutinario de fungicidas
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
5 1 2 3 - Factores de crecimiento Se utilizan para mejorar la calidad de los
cultivos, sobre todo en líneas celulares especiales, por su actividad mitógena Son
atocinas, hormonas y factores de crecimiento celular (interleucmas, factor de
necrosis tumoral, Interferon,etc )
5.2.- MANEJO DE LOS CULTIVOS CELULARES
5 2 1 - Evaluación diana El mantenimiento de los cultivos celulares conlleva un
trabajo intenso ya que requieren cuidados especiales Si se dejan las células durante
mucho tiempo sin reposición de medio de cultivo fresco o sin divisiones, éstas sobrecrecen
y mueren Sin embargo, si se manejan con excesiva frecuencia, aumenta mucho el nesgo
de contaminación y se producen cambios bruscos de temperatura que interfieren con e!
crecimiento celular Por todo ello se aconseja una evaluación periódica, de forma rápida y
adecuada
La observación macroscópica del color y características del medio, nos orienta en la
valoración de problemas en el crecimiento celular un medio claro y de color amarillento nos
avisa de que existe un sobrecrecimiento celular y un excesiva acidez Si el medio es denso
y amarillo podemos sospechar una contaminación Si aparecen formas algodonosas en la
superficie es muy probable que estemos ante una infección fúngica Un color rojo púrpura
indica excesiva alcalinidad del medio, probablemente por falta de CC>2
Podemos observar las células con el microscopio invertido, para obtener información
sobre las características morfológicas, velocidad de crecimiento, existencia de agentes
infecciosos y de alteraciones en el medio de cultivo
Tanto la observación microscópica como la macroscópica son fáciles de llevar a
cabo y nos proporcionan bastante información con la mínima alteración de los cultivos
5 2 2 - Subcultivos Es fundamental realizar subcultivos de las células para evitar el
sobrecrecimiento y asegurar una adecuada proliferación Para ello es necesario obtener
suspensiones celulares, lo cual se puede conseguir a partir de los cultivos en placa por
diferentes métodos como por ejemplo la tnpsinización
5 2 3 - Cnopreservación Permite mantener las células a bajas temperaturas durante
un tiempo prolongado, pudiéndose recuperar posteriormente con una adecuada viabilidad
El dimetilsulfóxido (DMSO) es una de las sustancias más utilizadas con éste fin dada su
habilidad para penetrar en las células, permitiendo la congelación del agua mtracelular sin
la formación de cristales También se puede utilizar glicerol Las células se mantienen en
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
nitrógeno líquido, a -70°C. La descongelación debe ser rápida, utilizándose medio precalentado a 37 °C, y posteriormente requieren lavados para eliminar el DMSO.
Cada tipo celular requiere unas condiciones de criopreservación concretas que
deben seguirse en todo momento para el éxito del procedimiento.
5.3.- MODIFICACIÓN CELULAR
5.3.1.- Mutagénesis: Se ha utilizado tradicionalmente para producir alteraciones
concretas en determinadas vías metabólicas de las células, que puedan ser estudiadas
posteriormente.
La mutagénesis química se basa en el uso de drogas lesivas del DNA, que
producen mutaciones, delecciones y alteraciones en su reparación.
La mutagénesis insercional se basa en el uso de un vector retroviral que infecta las
células interfiriendo en la actividad génica de dichas células.
5.3.2.- Fusión: Se basa en la producción de híbridos celulares a través de la unión
de diferentes células, combinándose las características propias de cada célula. La forma de
fusión más conocida es la de linfocitos B murinos productores de inmunoglobulinas y una
línea celular de mieloma murino. En este caso se combina la capacidad secretora de los
linfocitos con la inmortalidad de las células de mieloma con la finalidad de obtener
anticuerpos rnonoclonales,
5.3.3.- Transfección: La introducción de un gen determinado en una célula se
puede realizar de diferentes formas:
• Co-precipitación calcio/fosfato: Muy útil para células adhérentes, pero no tanto para
células en suspensión.
• Electroporación: La exposición de las células a un impulso eléctrico de alto voltaje
permeabiliza su membrana, permitiendo el paso del DNA. Se puede utilizar para células
en suspensión y para células adhérentes.
• Lipofección: El DNA puede ser introducido en la célula a través de liposomas catiónícos
que lo transportan
• DEAE-Dextrano: Se utiliza para transfecciones transitorias.
5.3.4.- Infección: La introducción de material genético en las células se puede
realizar a través de agentes infecciosos, siendo los más comunes, el virus de Epstein-Barr,
los vectores retrovirales y el adenovirus.
Introducción
Resistencia Multiple a Drogas
• Virus de Epstein-Barr Es una técnica limitada puesto que sólo puede introducir genes
propios y únicamente puede infectar a Imfocitos B
• Infección retroviral El virus infecta la célula uniéndose a receptores de superficie,
produciéndose una copia de su genoma (doble cadena de DNA) que se integra en los
cromosomas de la célula infectada
Los retrovirus recombinantes se producen
sustituyendo genes virales por los genes de interés
Introducción
Resistencia Múltiple a Drogas
5§
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
Justificación del trabajo
Resistencia Multiple a Drogas
59
II.- JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
La resistencia de las células neoplásicas a los fármacos quimioterápicos, y en
concreto la aparición del fenómeno MDR es una causa importante de fallo en el tratamiento
del cáncer Esto condiciona en los pacientes con neoplasias resistentes un pronóstico muy
desfavorable por agotamiento de algunas de las diferentes opciones terapéuticas basadas
en la quimioterapia
Algunos de los fármacos más utilizados en los protocolos de
tratamiento de neoplasias sólidas y hematológicas están involucrados en el fenómeno
MDR,
sobre
todo
los
quimioterápicos
de
origen
natural
como
antraciclmas,
epipodofilotoxmas, alcaloides de la vinca, taxanos y otros
MDR está asociado a la expresión del gen mdr1 y a la proteína que codifica, P-gp
170 La glicoproteína P-gp170 es una bomba de membrana ATP-dependiente capaz de
expulsar activamente del interior celular determinados quimioterápicos reduciendo su
acumulo intracelular y por lo tanto su citotoxicidad Desde los experimentos de Tsuruo
(Tsuruo et al, 1982) se conoce que la acción de P-gp 170 puede ser inhibida por una
variedad de sustancias denominadas moduladores La aplicación clínica de estas drogas
moduladoras está limitada por su elevada toxicidad a las dosis necesarias para inhibir el
fenómeno MDR
Muchos son los grupos que dirigen sus investigaciones al estudio del fenómeno
MDR y que intentan encontrar fármacos con capacidad para revertir MDR que sean
efectivos y con escasos efectos secundarios La posibilidad de disponer de fármacos
capaces de bloquear la bomba de expulsión de quimioterápicos, que presenten una razón
toxicidad-beneficio favorable, abrirá una vía de tratamiento válida y eficaz para los pacientes
con tumores que expresan MDR
Los proyectos de investigación que abordan el problema de la quimiorresistencia
tumoral están generalmente basados en experimentos sobre líneas celulares a las que se
les ha inducido fenotipo MDR por pases sucesivos con bajas concentraciones de
quimioterápicos Otros autores, con una aproximación más pragmática al problema, han
iniciado estudios sobre los resultados de la administración "in vivo" de posibles fármacos
moduladores en pacientes con tumores resistentes Los resultados de estos trabajos son
Justificación del trabajo
Resistencia Multiple a Drogas
60
heterogéneos y discordantes debido a las diferentes condiciones de estudio, los diferentes
métodos utilizados y al descubrimiento reciente de otras formas de MDR no relacionadas
con P-gp 170 Por ello, es necesario desarrollar métodos estandarizados para el estudio de
fenómeno MDR que sean reproducibles, rápidos, fáciles de realizar y capaces de
evidenciar la acción moduladora de diferentes sustancias específicamente sobre P-gp 170
Estos estudios de laboratorio deben ser realizados con el objetivo de comprobar la
capacidad del efecto de nuevos fármacos (propuestos como moduladores de la bomba u
otros que se han diseñado específicamente con este fin) como paso previo a los ensayos
"m vivo" sobre pacientes
En este estudio se presentan los resultados de un proyecto de investigación en el
que se desarrolla un modelo experimental, basado en líneas celulares transfectadas con el
gen mdr1 y en técnicas de CMF, a través del cual se puede estudiar el fenómeno MDR
desde un punto de vista funcional así como su modulación en diferentes condiciones
experimentales y por diferentes sustancias
Justificación del trabajo
Resistencia Múltiple a Drogas
81
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis y objetivos
Resistencia Multiple a Drogas
62_
I.- HIPÓTESIS
Las hipótesis que se plantean en el estudio son las que se describen a
continuación
1- Hipótesis primera:
Un modelo experimental basado en el estudio por CM F del acumulo/expulsión de
substratos fluorescentes de P-gp 170 en líneas celulares con y sin expresión del gen mdr1
(NIH-3T3 y NIH-3T3-mcfr/) permite el estudio del fenómeno MDR
£sfe modelo debe permitir realizar la valoración funcional del fenómeno MDR a
través del estudio de las cinéticas de incorporación y expulsión de fármacos substratos
de P-gp 170 y poner de manifiesto diferencias entre las células con y sin expresión de Pgp 170 Así mismo debe ser posible llevar a cabo la identificación de sustancias con
capacidad para modular P-gp 170 de forma específica (inhibición de la función de P-gp
170 en las células MDR)
2- Hipótesis segunda:
Tamoxifeno y PSC 833 son capaces de revertir el fenómeno MDR en condiciones de
laboratorio y su acción moduladora está basada en una inhibición específica de P-gp 170
Estos fármacos son capaces de inhibir la acción de P-gp 170 con la misma eficacia que un
fármaco de reconocida acción moduladora como es verapamilo
3- Hipótesis tercera:
El uso combinado de tamoxifeno y PSC 833 tiene una acción smérgica, es decir
que una combinación de ambos fármacos consigue el mismo efecto modulador sobre P-gp
170 a menores concentraciones de cada fármaco
Hipótesis y objetivos
Resistencia Multiple a Drogas
63
IV.- OBJETIVOS DEL TRABAJO
Los objetivos que se han considerado para el siguiente trabajo son
1.- Primer objetivo: Desarrollo del modelo de laboratorio y estudio funcional de P-gp
170.
Poner a punto un modelo experimental basado en líneas celulares y en técnicas de
CMF que permita evidenciar en condiciones de laboratorio que P-gp 170 está presente en
las células transfectadas y que es funcionante
Para ello se utilizará una línea de fibroblastos munnos transfectada de forma
permanente con el gen mdr1 humano (NIH-3T3-mc/r/) y que por tanto debería expresar en
su membrana la proteína P-gp 170 Como control negativo se dispone de la misma línea
celular pero sin la expresión de P-gp 170 (fibroblastos salvajes NIH-3T3)
La expresión del gen mdr1 en forma de P-gp 170 en la membrana de las células
transfectadas se demostrará utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo
externo de la misma (4E3) a través de una técnica de mmunofluorescencia indirecta por
CMF La funcionalidad de P-gp 170 se pondrá de manifiesto a través del estudio de la
dinámica de incorporación y expulsión de sustancias fluorescentes que son substratos de
la bomba Para ello se medirán las variaciones en la fluorescencia intracelular a lo largo del
tiempo tras la incubación con estas sustancias, tanto en las células problema como en las
control El método de medida de fluorescencia utilizado será la CMF A partir de los
histogrames obtenidos en cada medida se realizarán curvas de cinética de incorporación y
expulsión de fármacos, siendo la comparación entre estas curvas y entre los niveles
máximos de fluorescencia alcanzados por cada línea celular, lo que nos permitirá valorar la
existencia y funcionalismo de P-gp 170
2.- Segundo objetivo: Validación del modelo. Estudio de inhibición de P-gp 170.
Una vez desarrollado el modelo experimental, comprobar que a través del mismo, se
puede evidenciar la capacidad que tienen determinadas sustancias, como verapamilo, para
inhibir o modular la acción de P-gp 170 de forma específica
Hipótesis y objetivos
Resistencia Múltiple a Drogas
6£
Para ello, y aplicando el modelo experimental antes descrito, se realizarán curvas de
cinética de incorporación y expulsión de substratos fluorescentes de P-gp 170, en
presencia o no de verapamilo
La validación del modelo consiste en demostrar que el acumulo de DNR en las
células transfectadas incubadas con verapamilo deberá ser similar al observado en las
células salvajes y, superior al que se produce en las células transfectadas sin incubar con
verapamilo Se realizarán estudios con diferentes concentraciones del modulador y a
diferentes tiempos de incubación con el fin de determinar la condiciones óptimas
experimentales para conseguir una modulación adecuada
3.- Tercer objetivo: Acción moduladora de PSC 833 sobre P-gp 170.
Estudiar el efecto inhibidor sobre P-gp 170 de PSC 833 a través del modelo
experimental ya descrito y comparar su efecto modulador con el de verapamilo
Para ello, micialmente se realizarán estudios con diferentes concentraciones de
PSC 833 para valorar la dosis mínima que consiga una modulación adecuada
Posteriormente se realizarán experimentos de incorporación y expulsión de substratos
fluorescentes de P-gp 170, en presencia o no de PSC 833, tanto en células transfectadas
como en células salvajes y siempre en paralelo con el control positivo de modulación
(verapamilo)
4.- Cuarto objetivo: Acción moduladora de tamoxifeno sobre P-gp 170.
Estudiar el efecto inhibidor sobre P-gp 170 de tamoxifeno a través del modelo
experimental ya descrito y comparar su efecto modulador con el de verapamilo
Para ello, micialmente se realizarán estudios con diferentes concentraciones del
fármaco para valorar la dosis mínima que consiga
una
modulación
adecuada
Posteriormente se realizarán experimentos de incorporación y expulsión de substratos
fluorescentes de P-gp 170, en presencia o no de tamoxifeno, tanto en células transfectadas
como en células salvajes y siempre en paralelo con el control positivo de modulación
(verapamilo)
Hipótesis y objetivos
Resistencia Múltiple a Drogas
65
5.- Quinto objetivo: Estudio de la acción combinada de PSC 833 y tamoxifeno sobre
P-gp 170.
Comprobar si combinaciones de estos fármacos, a concentraciones inferiores a las
necesarias para conseguir la modulación de P-gp 170 de forma aislada, consiguen revertir
el fenómeno MDR de forma adecuada.
Para ello se realizarán experimentos
de
incorporación y expulsión utilizando diferentes concentraciones de PSC 833 y tamoxifeno
en combinación y se valorará el efecto inhibidor de las diferentes mezclas, comparándolo
con el de verapamilo.
Hipótesis y objetivos