Métodos de diagnóstico inmunológico in vivo e in vitro en

Métodos de diagnóstico inmunológico
in vivo e in vitro en Enfermedades por
Hipersensibilidad de Tipo I y IV
Dr.
Dr. Juan
Juan Rodríguez-Tafur
Rodríguez-Tafur Dávila
Dávila
Prof.
Prof. Asociado
Asociado de
de Inmunología
Inmunología Clínica
Clínica yy Farmacología
Farmacología
Facultad
Facultad de
de Medicina
Medicina
Universidad
Universidad Nacional
Nacional Mayor
Mayor de
de San
San Marcos
Marcos
Lima
Lima (Perú)
(Perú)
LA HISTORIA CLINICA
• La Historia Clínica es fundamental en el
diagnóstico de la Alergia.
• Antecedentes familiares y personales
• Clínica
• Repercusión de la enfermedad
• Factores desencadenantes y agravantes
Metodolog
ía Diagn
óstica
Metodología
Diagnóstica
Valoraci
ón de la Exposici
ón Ambiental
Valoración
Exposición
• Detecció
ón de alergenos principales en muestras
Detecci
Detección
domiciliarias
• Diagnó
óstico de Sensibilizació
ón sisté
émica
Diagn
Sensibilizaci
sist
Diagnóstico
Sensibilización
sistémica
• Demostració
ón de anticuerpos IgE circulantes y de
Demostraci
Demostración
respuestas celulares especí
íficas a los alergenos
espec
específicas
Monitoreo de la Inflamaci
ón ó
rgano-específica
Inflamación
órgano-específica
• Recuento de cé
élulas inflamatorias y cuantificació
ón de
c
cuantificaci
células
cuantificación
mediadores solubles en diversos lí
íquidos y muestras
llíquidos
bioló
ógicas
biol
biológicas
Exposición Ambiental
Metodolog
ía
Metodología
•
•
•
ELISA cuantitativo
RIDA (western
(western blot para antigenos)
antigenos)
Pruebas de detecció
ón rá
ápida
detecci
rrápida
detección
Algunos
Algunos alergenos
alergenos identificables
identificables
••
••
••
••
••
••
••
••
Dermatophagoides
Dermatophagoides
Dermatophagoides
Dermatophagoides far
far
Blomia
Blomia tropicalis
tropicalis
Lepidoglyphus
Lepidoglyphus destructor
destructor
Gato:
Gato:
Perro:
Perro:
Cucaracha:
Cucaracha:
Aspergillus:
Aspergillus:
pte
Der
pte
Der pp 1,
1, Der
Der pp 22
Der
Der ff 1,
1, Der
Der ff 22
Blo
Blo tt 55
Lep
Lep dd 22
Fel
Fel dd 11
Can
Can ff 11
Bla
Bla gg 1,
1, Bla
Bla gg 22
Asp
Asp ff 11
Exposición Ambiental
Criterios de causalidad alergenos - enfermedad
•• La
ón es
asociaci
La fuerza
fuerza de
de asociació
asociación
es grande
grande tanto
tanto en
en estudios
estudios poblacionales,
como
como controlados
controlados yy prospectivos
prospectivos
•• Observaciones
Observaciones consistentes
consistentes en
en distintas
distintas regiones
regiones
•• Claro
gradiente
de
relació
ó
n
dosisrespuesta
relaci
dosis
Claro gradiente de relación dosis-respuesta
•• Existe
íos especí
íficos
yy
desaf
espec
Existe evidencia
evidencia experimental
experimental en
en desafí
desafíos
específicos
respuesta
respuesta aa medidas
medidas de
de control
control ambiental
ambiental
Indicaciones para valorar del nivel de exposició
ón
exposici
exposición
•• Establecer
Establecer factores
factores de
de riesgo
riesgo
•• Monitorear
Monitorear si
si las
las mediadas
mediadas de
de control
control ambiental
ambiental se
se estan
estan tomando
tomando
correctamente.
correctamente.
Exposición Ambiental
Niveles de riesgo para algunos alergenos
intradomiciliarios
• Fel d 1
• Bla g 2
1 a 8 ug/ gr. polvo
> 10 unidades/ gr. polvo
Niveles de exposici
ón a Dermatophagoides en sujetos
exposición
at
ó
picos
al
é
rgicos
atópicos alérgicos y su correlacion con el riesgo:
Riesgo ug Der p1/gr. polvo
# áácaros
caros
•
•
•
•
D
ébil
Débil
Moderado
Alto
Muy alto
< 0,2
de 0,2 a 2
de 2 a 10
> 10
< 10
de 10 a 100
de 100 a 500
> 500
Monitoreo de la Inflamaci
ón
Inflamación
Métodos no invasivos
•
•
•
Determinaciones en la vía aérea
Determinaciones en sangre circulante
Determinaciones en orina
Métodos invasivos
• Lavado bronquioalveolar
• Biopsias
Marcadores en V
ía A
érea
Vía
Aérea
(+ usados en investigacion clinica)
clinica)
AIRE EXHALADO
• Oxido ní
ítrico
n
nítrico
••
••
••
Analizador
Analizador de
de quimioluminiscencia
quimioluminiscencia
A
ños
aaños
A partir
partir de
de los
los 55 añ
↑
en
asma
sma
ató
ó
pico
ático, severidad
a
at
sintom
↑ en asma atópico sintomá
sintomático,
severidad del asma
ESPUTO INDUCIDO
• C
élulas y mediadores de la inflamació
ón
inflamaci
Células
inflamación
• mRNA para citocinas por RT-PCR
RT
RT-PCR
•• Nebulizació
ón ultrasó
ónica con
Nebulizaci
ultras
20
Nebulización
ultrasónica
con 3,5%
3,5% ClNa
ClNa por
por 20’
20’’
•• Correlació
ón con actividad inflamatoria
Correlaci
Correlación
Marcadores en Sangre Circulante
(+ usados en investigacion clinica)
clinica)
C
ÉLULAS INFLAMATORIAS
CÉLULAS
INFLAMATORIAS
•• Eosinó
ófilos (LFA-1, EG2)
Eosin
(LFA
Eosinófilos
(LFA-1,
EG2)
•• Linfocitos
Linfocitos T
T (CD3,
(CD3, CD4,
CD4, CD8,
CD8, CD25,
CD25, CD23)
CD23)
•• mRNA
ático para citocinas
intracitoplasm
mRNA intracitoplasmá
intracitoplasmático
MEDIADORES
MEDIADORES INFLAMATORIOS
INFLAMATORIOS
•• ↑
de
ECP,
ón con
ón
(correlaci
funci
↑ de ECP, EPO,
EPO, EPX
EPX yy MPO
MPO (correlació
(correlación
con HRB,
HRB, funció
función
pulmonar,
íntomas yy tratamiento)
ssíntomas
pulmonar, sí
tratamiento)
CITOCINAS
ÉCULAS DE
ÓN
MOL
ADHESI
CITOCINAS yy MOLÉ
MOLÉCULAS
DE ADHESIÓ
ADHESIÓN
•• ↑
sICAMón con severidad AB, RA, DA)
sICAM-1 (correlació
(correlaci
↑sICAM-1
(correlación
•• ↑
sILsIL-2R (marcador
corticoresistencia
↑sIL-2R
(marcador de
de fatalidad
fatalidad y corticoresistencia)
corticoresistencia))
•• ↑
sVCAMsVCAM-1 (( asma
↑sVCAM-1
asma yy quertatoconjuntivitis
quertatoconjuntivitis vernal)
vernal)
Marcadores en Orina
(+ usados en investigacion clinica)
clinica)
EDX (Neurotoxina Derivada de Eosin
ófilos)
Eosinófilos)
•• ↑
índromes eosinofí
ílicos, asma
ópico
ssíndromes
eosinof
at
↑ en
en sí
eosinofílicos,
asma ató
atópico
•• Correlaciona
éutica en niñ
ños,
terap
ni
Correlaciona con severidad del asma y respuesta terapé
terapéutica
niños,
pero
ío con alergeno
desaf
pero cae
cae tras
tras desafí
desafío
• LTE4 (Leucotrieno E4)
••
••
Refleja
ón total, excreció
ón biliar y funció
ón renal
producci
excreci
funci
Refleja producció
producción
excreción
función
renal
↑
en
asma
por
AAS,
asma
nocturno,
EIA,
provocació
ón con
provocaci
↑ en asma por AAS, asma nocturno,
provocación
con alergenos,
pero
ón
obstrucci
pero no
no correlaciona
correlaciona con obstrucció
obstrucción
9αα11ββ--PGF
PGF22 y PGD
-M (Metabolitos de PGD2)
PGD-M
•• Origen
Origen en
en MC
MC
•• ↑
ón con
provocaci
↑ en
en mastocitosis,
mastocitosis, EIA,
EIA, provocació
provocación
con alergenos
alergenos o
o AAS
Marcadores en Orina
Ventajas
••
••
••
Muestra
ácil obtenció
ón
ffácil
obtenci
Muestra de fá
obtención
Niveles
urinarios
representan
ón sisté
émica total
producci
sist
Niveles urinarios representan producció
producción
sistémica
total
Pueden
ón glomerular
filtraci
Pueden ser
ser referidos a la tasa de filtració
filtración
• Desventajas
••
••
••
Elevaciones
Elevaciones transitorias
transitorias pueden
pueden no
no ser
ser detectadas
detectadas
Afectado
Afectado por
por metabolismo
metabolismo renal
renal
Desconocimiento
Desconocimiento de
de la
la fuente
fuente de
de origen
origen
• El marcador ideal deber
ía correlacionar con
debería
evidencias de inflamaci
ón en la biopsia.
inflamación
M
étodos Invasivos
Métodos
LAVADO BRONQUIOALVEOLAR
• C
élulas inflamatorias
Células
•• ↑
ópico
at
↑ de
de Eo
Eo yy MC
MC en
en asma ató
atópico
•• ↑
ística yy cultivos
qu
↑ de
de PMN
PMN en
en asma,
asma, fibrosis
fibrosis quí
quística
cultivos bacterianos
positivos
positivos
•• ↑
élulas Epiteliales
ños con
C
ni
↑ de
de Cé
Células
Epiteliales en
en niñ
niños
con asma
asma ee infantes
infantes con
con
sibilancias
sibilancias
• Componentes solubles
••
••
••
↑
-1 (correlació
ón con
sICAM
(correlaci
↑ sICAMsICAM-1
(correlación
con frecuencia
frecuencia yy severidad)
severidad)
↑
-gamma
IFN
↑ IFNIFN-gamma
↑
↑ ECP
ECP
M
étodos Invasivos
Métodos
BIOPSIA BRONQUIAL
• C
élulas inflamatorias
Células
•• ↑
ámina propia,
ún en
llámina
aaún
↑ de
de Eo
Eo (EG2)
(EG2) en
en lá
propia, aú
en asma
asma leve
•• ↑
ópicos
at
↑ de
de MC
MC en
en ató
atópicos
• Evidencias de remodelació
ón
remodelaci
remodelación
•• Engrosamiento
ágeno subepitelial
col
Engrosamiento de
de la
la membrana
membrana de
de colá
colágeno
• Los cambios histoló
ógicos ocurren en forma precoz y
histol
histológicos
pueden anteceder al desarrollo de los sí
íntomas
s
síntomas
M
étodos Invasivos
Métodos
BIOPSIA NASAL Y O LAVADO NASAL
• C
élulas inflamatorias
Células
•• ↑
ópicos
at
↑ de
de Eo
Eo (EG2)
(EG2) Ba
Ba yy MC
MC en
en ató
atópicos
• mRNA para citocinas en cé
élulas T y macró
ófagos
c
macr
células
macrófagos
•• ↑
-gamma e IL-12 tras IT
INF
IL
↑ de
de mRNA
mRNA para
para INFINF-gamma
IL-12
BIOPSIA CUTANEA
• C
élulas inflamatorias y citocinas
Células
•• Marcació
ón con
-alfa en urticaria por frí
ío
Marcaci
TNF
fr
Marcación
con TNFTNF-alfa
frío
•• Marcació
ó
n
con
EG2,
CD4,
CD30,
IL4,
ICAM-1, VCAM-1, en parches
Marcaci
IL
ICAM
VCAM
Marcación
CD30, IL-4, ICAM-1,
VCAM-1,
parches
con
caros en
con áácaros
en DA
DA
Diagnóstico inmunológico in vivo.
• Pruebas de hipersensibilidad inmediata:
– prick-test, prick to prick.
– cutirrección
– intradermorreacción
• Hipersensibilidad tardía:
– patch-test
• Pruebas de provocación
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas.
Hipersensibilidad inmediata
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
• Limpiar la piel con un antiséptico incoloro,
marcar los puntos de la prueba con marcador
o cinta adhesiva
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
• Colocar una gota de cada extracto alergénico, y de
los controles positivo (histamina 1/100) y negativo
(salino 0,9%) sobre la piel.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
• Pasar una lanceta verticalmente en relación a la
superficie cutánea a través de la gota del extracto y
erosionar la piel superficial, sin producir sangrado,
retirandola al cabo de un segundo (normas de la EAACI).
• Para evitar el sangrado, usar lancetas de 1 mm.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
• En la punción modificada la lanzeta se inserta dentro de la
piel en ángulo de 45º y se pasa a través de la gota del
extracto. Ségun se retira, se levanta ligeramente la piel, con
lo que se produce una ligera lesión cutánea, que deberá ser
superficial y no producir sangrado.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
• Tras esperar 15 minutos, marcar el contorno de la
pápula con un rotulador de punta fina.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick
•• Aplicar
Aplicar cinta
cinta adhesiva
adhesiva
con
con el
el fin
fin de
de que
que el
el
dibujo
dibujo se
se adhiera
adhiera aa
ésta
ésta yy retirarla.
retirarla.
•• Pegarla
Pegarla en
en la
la hoja
hoja de
de
pruebas
pruebas cutáneas,
cutáneas,
como
como documento
documento para
para
archivar
archivar en
en la
la historia
historia
clínica
clínica del
del paciente
paciente
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Cutirreacción
• Limpiar la piel con un antiséptico incoloro dejar
secar.
• Marcar la zona con un rotulador de punta fina.
• Realizar una escarificación de 2-4 mm de
longitud en las capas superficiales de la piel
con una lanceta o aguja fina, sin producir
sangrado.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Cutirreacción
• Colocar una gota de cada extracto a testificar (sin
contaminar el dosificador), o el alimento fresco, y una
gota de los controles positivo (histamina base 1/100 y
negativo (salino 0,9%).
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Cutirreacción
••
••
••
••
Leer
Leer aa los
los 15
15 minutos.
minutos.
Dibujar
Dibujar la
la pápula
pápula yy el
el eritema.
eritema.
Transferir
Transferir aa cinta
cinta adhesiva.
adhesiva.
Pegar
Pegar la
la cinta
cinta adhesiva
adhesiva en
en hoja
hoja apropiada
apropiada de
de HC.
HC.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Intradermorx
••
••
••
••
••
Estirar
Estirar la
la piel
piel del
del antebrazo
antebrazo con
con una
una mano
mano yy con
con
la
la otra
otra se
se colocar
colocar la
la aguja
aguja en
en angulo
angulo de
de 45
45
grados
grados con
con la
la piel,
piel, el
el bisel
bisel de
de la
la aguja
aguja debera
debera
estar
estar dirigido
dirigido hacia
hacia la
la piel.
piel.
Insertar
Insertar cuidadosamente
cuidadosamente la
la aguja,
aguja, moviendola
moviendola
hacia
hacia delante
delante yy hacia
hacia arriba
arriba como
como si
si se
se quisiera
quisiera
levantar
levantar la
la piel
piel con
con la
la punta
punta de
de la
la aguja.
aguja.
Descender
Descender el
el cuerpo
cuerpo de
de la
la jeringa,
jeringa, para
para eliminar
eliminar
el
el ángulo
ángulo formado
formado previamente
previamente con
con la
la superficie
superficie
cutánea.
cutánea.
Introducir
Introducir el
el antígeno
antígeno observando
observando la
la formación
formación
de
de una
una pápula
pápula que
que deberá
deberá alcanzar
alcanzar unos
unos 33 mm
mm
de
de diámetro,
diámetro, al
al inyectar
inyectar 0.02
0.02 ml
ml del
del alergeno.
alergeno.
Como
Como control
control positivo
positivo se
se utiliza
utiliza histamina
histamina base
base
al
al 1/10.000)
1/10.000) yy salino
salino como
como control
control negativo.
negativo.
2
1
3
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Intradermorx
VENTAJAS CON RESPECTO AL PRICK-TEST
– Mayor sensibilidad.
– Posibilidad de cuantificar la reactividad umbral.
– Concentraciones de Ag 100 veces menores.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Prick-IDrx
VENTAJAS DEL PRICK CON RESPECTO A LA
INTRADERMORREACCIÓN
–
–
–
–
–
–
–
–
Mejor definición positivo-negativo.
Seguridad.
Rapidez.
Simplicidad.
Menores molestias para el paciente.
Mayor nº de testificaciones simultáneas.
Mejor correlación resultados – H. Clínica.
Extractos más estables.
Hipersensibilidad Tipo IV (Patch Test)
Th1
Epidermis
IFNγ
IL-2,3
MIF
Área paracortical de
Ganglios linfáticos
Activación y reclutamiento de
Macrófagos: fagocitosis, lib.enzimas
MFG
Expresión de MHC-II y de moléculas
De adhesión ICAM-I en superficie de
Queratinocitos y céls endoteliales
Liberación IL-1,6, GM-CSF
Edema, microvesículas
Epidérmicas
Eccema de contacto
Activación y proliferación Linf T.
Infiltrado LT, MFG, cels epitelioides,..
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Patch test.
•
•
•
Abrir el sobre y sacar el parche.
Retirar la lámina protectora del parche.
Evitar todo contacto con los antígenos.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Patch test.
• Colocar el parche en la parte superior de la espalda
del paciente aprox. a 5 cm del centro, de forma que
el alergeno nº 1 esté situado en la parte superior
izquierda del panel.
• Alisar el parche desde el centro hacia fuera
asegurando que cada uno de los alergenos esté en
contacto con la piel.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Patch test.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Patch test.
• Los parches deben ser retirados al cabo de 48
horas y la rx se lee entre 72 a 96 horas.
• Se hacen dos lecturas un las 48 horas, ésta debe
ser completada con una lectura a las 72-96 horas.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Pruebas cutáneas. Patch test
INTERPRETACION
?
+
++
+++
Reacción dudosa, ligero eritema.
Negativa.
Positivo débil (eritema, infiltración, posibles pápulas).
Positiva (eritema, infiltración, posibles pápulas,
vesículas).
Muy positiva (reacción bulosa).
Reaccion positiva por Hipersensibilidad a
Corticoides
Paneles
Paneles internacionales
internacionales incluyen
incluyen al
al Pivalato
Pivalato de
de Tixocortol
Tixocortol yy aa la
la Budesonida
Budesonida
Reaccion positiva de Hipersensibilidad a
Corticoides por Patch Test
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Diagnóstico inmunológico in vitro.
• Cuantificación de IgE:
– Elisa
– Quimioluminiscencia
• Test de liberación de histamina
• Degranulación óptica de basófilos
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Cuantificación de IgE
• EIA (Enzimoinmunoanálisis)
– Marcador es enzima unida covalentemente al Ag o al Ac.
Se mide la Actividad enzimática
••
••
••
Colorimétricos:
Colorimétricos: se
se mide
mide intensidad
intensidad color
color
Fluorométricos
Fluorométricos (FEIA):
(FEIA): fluorescencia
fluorescencia al
al ser
ser expuesta
expuesta aa lux
lux UV
UV
Luminiscentes:
de
reacción
química
o
BQ
Luminiscentes: de reacción química o BQ
• Fase líquida o sólida (ELISA)
• RIDA (western blot)
Tecnica de CAP-RAST
Evaluación como clases de IgE
Específica
Clase IgE
0
kU/l
< 0,35
1
2
3
4
5
0,35 ≤ x < 0,7
0,7 ≤ x < 3,5
3,5 ≤ x < 17,5
17,5 ≤ x < 50
50 ≤ x < 100
Nivel de Ac
Ausente o no
detectable
Bajo
Moderado
Alto
Muy alto
Muy alto
6
≥ 100
Muy alto
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Cuantificación de IgE
• En piel normal existen de 5.000 a 12.000 mastocitos/mm3
distribuidos sobre todo alrededor de los vasos
• Existen de 5.000 a 500.000 moléculas de IgE pegadas a
cada mastocito, y pueden persistir entre 6 y 12 semanas
• La vida media de la IgE específica en sangre es de 2,5 días.
• Prick Cutáneo >>> Sensibilidad que IgE específica.
Inconvenientes CAP-ELISA
• Al ser la IgE extraordinariamente citofílica, sus
resultados serán inferiores a los de las Prick Cutaneo
• Entonces es un error conceptual pedir CAP-ELISA
porque la Prick Cutáneo haya sido negativa.
• PC negativa o dudosa, difícilmente de encontrará IgE
específica en suero
• Bastante caras (sólo se deben realizar para un número
limitado de alergenos)
Indicaciones de CAP-ELISA (I)
• Dermatitis severa (ej D.atópica) y generalizada, sin zonas
cutáneas accesibles a PC
• Control negativo: positivo por dermografismo (>5mm)
Excepcional con la generalización del prick
• Imposibilidad de suspender anti-H1 u otros fármacos que
inhiban las PC: útil el control + (existen otras alternativas:
esteroides, CGDS..)
• Confirmación de significación clínica de unas PC positivas
Indicaciones de CAP-ELISA (II)
• Niveles de sensibilización extremadamente altos, en que
puedan ser peligrosas los Prick Test (gran anafilaxia por
betalactámicos, alimentos, venenos)
• Prick Test – o dudosos para hongos, con H Clínica sospechosa
de alérgia, y Prick Test repetidamente negativas para otros
alergenos.
• Alergenos tóxicos, insolubles en agua o sustancias altamente
sensibilizantes.
• Seguimiento de Inmunoterapia.
• Investigación.
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test de liberación de histamina
•• Mediadores
Mediadores como
como la
la histamina
histamina son
son sustancias
sustancias biológicamente
biológicamente activas
activas
que
que se
se liberan
liberan del
del mastocito
mastocito de
de los
los tejidos
tejidos o
o de
de los
los basófilos
basófilos
sanguíneos
sanguíneos cuando
cuando se
se produce
produce la
la reacción
reacción antígeno-anticuerpo.
antígeno-anticuerpo.
•• Este
Este test
test nos
nos permite
permite estudiar
estudiar de
de una
una forma
forma directa
directa in
in vitro
vitro la
la respuesta
respuesta
alérgica
alérgica yy conocer
conocer la
la reactividad
reactividad frente
frente aa diferentes
diferentes alergenos.
alergenos.
•• Mide
Mide por
por métodos
métodos fluorométricos
fluorométricos o
o por
por radioinmunoensayo
radioinmunoensayo (RIA)
(RIA) la
la
cantidad
cantidad de
de histamina
histamina que
que se
se libera
libera después
después de
de incubar
incubar leucocitos
leucocitos del
del
paciente
paciente con
con un
un alergeno.
alergeno.
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test de liberación de histamina
• Se incuban 750 microl de sangre periférica de cada paciente (extraída
en tubos con heparina) durante 30 minutos, a 37º C, en agitación, con
20 microl de los alergenos (excepto en los tubos control: total, basal y
los incubados con anti-IgE)
• Tras añadir 1,6 ml de EDTA 1,5 mM a cada tubo se centrifuga a 1.600
rpm durante 30 minutos
• Se cuantifica la histamina presente en el sobrenadante, mediante una
técnica fluorimétrica basada en la reacción de la histamina con el
ortoftal-dialdehído (OPT) en un medio fuertemente alcalino.
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test de liberación de histamina
• Ambas sustancias forman un complejo fluorescente que se
cuantifica empleando un sistema automático Technicon
Autoanalyzer AAII® monocanal de flujo continuo.
• Con este método se cuantifica la histamina a una velocidad
de 40 muestras por minuto.
• Se consideraron positivas aquellas liberaciones superiores
al 20%.
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test de liberación de histamina
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test degranulación de basófilos
• Existen determinados alergenos (alimentos y
medicamentos), cuyos resultados en las pruebas
in vitro no son en general tan concluyentes, en
especial con los medicamentos.
• Consiste en un ensayo de estimulación de
basófilos in vitro con los alergenos problema, para
su estudio posterior mediante citometría de flujo
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test degranulación de basófilos
• La citometría de flujo es una
técnica analítica adecuada para
detectar basófilos activados
(marcados con anticuerpos
monoclonales) cuantificando la
fluorescencia emitida por estos.
Diagnóstico inmunológico in vitro.
Test degranulación de basófilos
• Valora el porcentaje de basófilos que degranulan después
de ponerlos en contacto con un alergeno, comparando con
valores basales.
• Ha demostrado ser útil para el DX de alergia a
neumoalergenos, alimentos y sobre todo de medicamentos
(Beta-lactámicos) no es una prueba muy usada.
Diagnóstico de Sensibilización
•
•
•
•
•
•
IgE alergeno --específica
específica
Anticuerpos contra ant
ígenos mayores
antígenos
Respuesta linfoproliferativa con alergenos
Producci
ón de citocinas in vitro
Producción
Degranulaci
ón de bas
ófilos
Degranulación
basófilos
Liberaci
ón de mediadores
Liberación
Activaci
ón de Linfocitos
Activación
Respuesta linfoproliferativa con alergenos
• Medició
ón de la sí
íntesis de DNA mediante la
Medici
s
Medición
síntesis
incorporació
ón de 3H-timidina a los 7 dí
ías de
incorporaci
3H
d
incorporación
3H-timidina
días
cultivo con el alergeno
Cultivos celulares y liberaci
ón de citocinas
liberación
ón de la producció
ón de citocinas en el
•• Medició
Medici
producci
Medición
producción
sobrenadante de los cultivos mediante ELISA
••Detección
Detecció
Detección semicuantitativa de mRNA intracelular
para citocinas mediante RT-PCR
RT
RT-PCR
Mediadores Qu
ímicos
Químicos
Degranulaci
ón de bas
ófilos
Degranulación
basófilos
• Test de degranulaci
ón de bas
ófilos
degranulación
basófilos
• BASOTEST
Liberaci
ón de mediadores
Liberación
• Liberaci
ón de Histamina
Liberación
• Liberaci
ón de Leucotrienos
Liberación
• CAST
LABORATORIO INMUNOLOGICO ESPECÍFICO EN ALERGIA
Utilidad en función del mecanismo
Mecanismo
Metodología
Técnica
Aplicación
cutánea
Mediado Prueba
IgE-específica
por IgE Liberación mediadores
SPT
RAST, FAST, ELISA
BASOTEST, CAST
Anafilaxia, Urticaria, Asma
Eccema atópico, Rinitis,
Alergia Gastrointestinal
Mediado IgG-específica
por CIC IgA-específica
Ag-Ac Inmunocomplejos
IDR, RAST
Inmunofluorescencia
PEG-CC, C1qBA
Enteropatía por gluten
Dermatitis herpetiforme
Gastroenteritis
eosinofílica alérgia
T.T.B
Alergia a medicamentos
Enterocolitis y colitis
inducidas por alimentos
Hipersen
Linfoproliferación
sibilidad Liberación citocinas
celular
LABORATORIO INMUNOLOGICO ESPECÍFICO EN ALERGIA
Eficiencia Comparativa
Prick Test
RAST
Liberación
Mediadores
Proliferación
Linfocitos
Sensibilidad
ALTA
ALTA
VARIABLE
BAJA
Especificidad
ALTA
VARIABLE
ALTA
BAJA
$
$$$
$$$$$
$$$
SI
NO
SI
NO
SI
NO
NO
NO
BUENA
BUENA
BUENA
POBRE
Característica
Costo
Influido por
medicación
Influido por
síntomas
Correlación prueba
de provocación
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocaciones
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocaciones
• Nasales
• Bronquiales (no incluiremos por
costos de equipos).
• Conjuntivales
• Orales (no inlcuida fue tratada en
Round tables)
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocación nasal
• Consiste en pulverización de 0,1-0,2 ml de un extracto
alergénico en la mucosa nasal del paciente. Esto puede
hacerse mediante una jeringa o atomizador.
• Cuando la respuesta es positiva, el paciente experimenta
estornudos (en los primeros 2 minutos), hidrorrea
(generalmente siguiendo a los estornudos) y bloqueo nasal.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocación nasal
•• Estos
Estos síntomas
síntomas pueden
pueden cuantificarse,
cuantificarse, contando
contando el
el número
número de
de
estornudos
estornudos producidos,
producidos, pesando
pesando las
las secreciones
secreciones producidas
producidas yy
midiendo
midiendo el
el grado
grado de
de bloqueo
bloqueo nasal
nasal inducido.
inducido.
•• Esta
Esta respuesta
respuesta debe
debe ser
ser comparada
comparada aa la
la producida
producida por
por una
una
solución
solución control
control (suero
(suero fisiológico),
fisiológico), para
para comprobar
comprobar su
su
especificidad.
especificidad.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocación nasal
INDICACIONES
– Para confirmar que una reacción cutánea positiva es clínicamente
relevante y que no se trata de una sensibilización subclínica.
– Para descubrir alergia localizada en órgano de shock (en caso de
que existan).
– Cuando es imposible llevar a cabo una provocación bronquial, en
pacientes asmáticos.
– Como control en la inmunoterapia, investigación.
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocación conjuntival
•• Test
Test sencillo,
sencillo, rápido,
rápido, preciso
preciso yy con
con un
un bajo
bajo riesgo
riesgo de
de reacciones
reacciones
sistémicas.
sistémicas.
•• Se
Se usa
usa la
la colocación
colocación de
de una
una gota
gota de
de suero
suero fisiológico
fisiológico (como
(como control)
control) en
en
el
el saco
saco conjuntival.
conjuntival.
•• Si
Si no
no hay
hay reacción
reacción se
se continúa
continúa con
con la
la administración
administración de
de igual
igual forma,
forma, de
de
concentraciones
concentraciones crecientes
crecientes de
de un
un extracto
extracto acuoso
acuoso del
del antígeno
antígeno problema
problema
una
una vez
vez en
en cada
cada ojo.
ojo.
•• Las
Las provocaciones
provocaciones se
se realizan
realizan aa intervalos
intervalos de
de 20
20 minutos,
minutos, finalizándose
finalizándose
en
en caso
caso de
de positividad
positividad (hiperemia
(hiperemia yy prurito
prurito ocular).
ocular).
Diagnóstico inmunológico in vivo.
Provocación conjuntival
Indicaciones
– Diagnóstico de rinoconjuntivitis alérgicas. Cuando
existen dudas, a pesar de la historia y pruebas
cutáneas, sobre la relevancia clínica de un
determinado alergeno.
– Valorar respuesta a la inmunoterapia en investigación.
Conclusiones
•• Principales
Principales mecanismos
mecanismos implicados
implicados tipos
tipos II yy IV
IV de
de Gell
Gell yy Coombs
Coombs
•• Principales
Principales entidades
entidades clínicas:
clínicas: rinitis,
rinitis, asma,
asma, urticaria-angioedema,
urticaria-angioedema,
dermatitis
dermatitis
•• Gran
Gran importancia
importancia de
de la
la Historia
Historia Clínica
Clínica
•• Tests
Tests in
in vivo:
vivo: PC,
PC, Patch-test
Patch-test yy provocaciones
provocaciones
–– La
más
utilizada
Prick-test:
La más utilizada Prick-test: rápido,
rápido, sencillo.
sencillo. Barato
Barato yy mayor
mayor
sensibilidad
que
CAP
sensibilidad que CAP
•• CAP-ELISA
CAP-ELISA sólo
sólo indicaciones
indicaciones precisas.
precisas. Más
Más cara
cara que
que prick.
prick. No
No
disponible
disponible en
en nuestro
nuestro medio.
medio. Mayor
Mayor sensibilidad
sensibilidad del
del RIDA.
RIDA.
•• Test
Test de
de liberación
liberación de
de histamina:
histamina: poco
poco uso
uso
•• Test
Test de
de degranulación
degranulación de
de basófilos:
basófilos:
–– Todavía
Todavía no
no extendido.
extendido.
–– Mayor
importancia
Mayor importancia en
en medicamentos
medicamentos