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Investigación en genes
Conocer el genóma
de los organismos
Modificar la dotación
génica natural
Tecnología del ADN recombinante
Conocimientos básicos que posibilitaron el desarrollo de la
Tecnología del ADN recombinante
I Enzimología de Acidos nucleicos
Endonucleasas de restricción (cortan)
Ligasas (unen)
ADN polimerasas (replican)
Transcriptasa inversa (transcriben)
II Complementariedad de bases
(construcción de nuevas secuencias, amplificar o detectar)
III Vectores de ADN
Entidades de ADN que pueden transportar ADN foráneo.
Plásmidos
Virus
I Enzimas de restricción
Descubiertas por Arber y H Smith
Presentes en bacterias
Cortan el ADN extraño
EcoRV (verde)
Sustrato:
• Reconocen una secuencia de entre 4-8 bp en una
molécula de ADN de doble hebra.
• Rompe un enlace fosfodiéster en ambas hebras
• Porción de la doble hebra de ADN cuya
secuencia es palindrómica o de simetría
rotacional binaria
I Enzimas de restricción
tipos de cortes:
Cortes escalonados, dejando productos con extremos cohesivos
Cortes simétricos, dejando productos con extremos romos
I Ligasas
Forma enlaces covalentes entre el
extremo 5’ de una cadena
polinucleotídica y el extremo 3’
de otra cadena polinucleotídica.
Enzimología de Acidos nucleicos
Producción de moléculas de ADN recombinante
I Enzimas de restricción y ligasas
Unión entre fragmentos de DNA con extremos
cohesivos
ligasas
Adición de secuencias de restricción a
fragmentos de ADN
II Complementariedad de bases
Debido a los puentes hidrógenos que se establecen entre las
bases, la adenina sólo puede unirse con la timina, y la citosina
con la guanina.
Por esto solo es necesario conocer la secuencia de una de las
cadenas para deducir la secuencia de la cadena
complementaria
III Vectores: moléculas de ADN
Plásmidos y virus
™Poseen replicación autónoma
™Llevan un sitio de origen de la replicación
™Presenta un sitio de multiclonado
™Poseen genes marcadores que permitan seleccionar las células huéspedes con la
recombinante
secuencia
Sal I
Sal I
Sal I
ADN de interés
plásmido
ligasa
ADN recombinante
ƒBacterias muertas (s/plásmido)
ƒBacterias resistentes a los dos antibióticos
ƒBacterias resistentes sólo a la ampicilina
III Vectores:
Ej: Bacteriófago λ
48 kb del fago no son esenciales para la infección lítica y pueden ser
reemplazadas por ADN foráneo
III Vectores:
Ej: Fago λgt- λβ (mutante del fago λ)
Posee dos sitios de restricción para EcoRI
≅10 kb
III Vectores:
Ej: Fago M13
Se empaqueta en formas víricas
III Vectores:
Vectores artificiales
Cósmidos
45 kb
BACs
300 kb
Cromosomas artificiales de bacterias
YACs
más de 600 kb
Cromosomas artificiales de levadura
YACs
Instrumentos básicos de la investigación en genes
1- Análisis de enzimas de restricción
2- Técnicas de Transferencia de ADN y ARN
3- Secuenciación de ADN
4- Síntesis en fase sólida de ácidos nucléicos
5- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
I Enzimas de restricción
1
Patrón de fragmentos de restricción
3
Patrón de fragmentos
de restricción
2
Virus SV40
Fragmentos de
ADN
2- Técnicas de Transferencia de ADN y ARN
Southern Blot o Transferencia de ADN.
Permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de
este ácido nucleico. Se utiliza para separar y caracterizar moléculas de ADN
3- Secuenciación de ADN
Método de interrupción controlada de la replicación (de Sanger)
1 hebra de interés de ADN
ADN polimerasa
Cebador
4 NTPs
2’,3’- didesoxi de ATP
2’,3’- didesoxi de TTP
2’,3’- didesoxi de GTP
2’,3’- didesoxi de CTP
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
3- Secuenciación de ADN
Electroforesis de ADN
2’,3’- dd de ATP
2’,3’- dd de CTP
2’,3’- dd de TTP
2’,3’- dd de GTP
3’ GTCGATGATACGACT 5’
5’ CAGCTACTATGCTGA 3’
4- Síntesis en fase sólida de ácidos nucléicos
Adición secuencial de monómeros activados a una cadena en crecimiento
unida a un soporte sólido.
5- Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Mezcla de reacción
-hebra de ADN que se quiere amplificar
-ADN polimerasa (de organismo termófilo)
-Cebador (complementario de secuencias colindantes)
-4 NTPs
Etapas
1-Separación de las hebras (94ºC)
2- Hibridación de los cebadores (54ºC)
3- Síntesis de ADN (72ºC)
Ventajas de la PCR
-Después de “n” ciclos la secuencia se amplifica 2n veces
-No es necesario conocer la secuencia a amplificar
-Se necesita conocer secuencias colindantes
-La secuencia a amplificar puede ser mucho mayor que
los cebadores
PCR
Utilidades
Diagnóstico clínico
Medicina Forense
Evolución molecular
Ejemplos de Uso de la Tecnología del ADN recombinante
A. Producción de moléculas de ADN recombinante
B. Biblioteca Genómica
C. Recorrido cromosómico
D. Manipulación de genes en eucariotas
E. Búsqueda de genes de cADN
F. Microarreglos de ADN
G. Organismos genéticamente modificados
A- ADN recombinante
Mutagénesis dirigida o mutaciones específicas in vitro
1-Deleciones:
Cortes en una secuencia con endo/exonucleasas
2- Sustituciones
Se pretende sustituir el
aminoácido serina por cisteína
3- Inserciones
B- Construcción de una
Biblioteca genómica
un gen
en una biblioteca genómica
C- Recorrido cromosómico
D- Manipulación de los genes eucariotas
E- Búsqueda de clones de cDNA
F- Microarreglos de ADN o Chips de genes
Soportes de vidrio o siliconas conteniendo miles de moléculas
distintas de ADN de hebra simple.
Pueden contener :
•todos los genes de un organismo
•genes expresados por un tipo celular particular
•genes seleccionados que uno quiere investigar
Sirven para monitorear la expresión de
muchos genes simultáneamente
F- Microarreglos de ADN
chip de ADN (microarray)
Células hepáticas normales
Células hepáticas cirróticas
RNA marcado
rojo
RNA marcado
verde
Verde: gen expresado sólo
en el hígado cirrótico
Rojo:
gen expresado
sólo en hígado
normal.
Blanco: gen no expresado en hígado
Naranja: gen expresado en hígado normal y
cirrótico
G- Organismos genéticamente modificados (GMOs)
Animales transgénicos
-Ratones gigantes
-Introducción del gen de la hormona de
crecimiento en óvulos fertilizados de ratón
-Los ratones que contenían el gen crecían más
rápidamente.
-Más aún si se les daba de beber agua con
cadmio
Inserción de genes en células eucariotas
¾Precipitación de ADN ajeno con Fosfato de Calcio
¾Microinyección
¾Infección con retrovirus
G- Organismos genéticamente modificados (GMOs)
ADN recombinante en vegetales
Agrobacterium tumefaciens infecta a la planta
e introduce en las células su ADN
Las técnicas de la química de ácidos nucléicos y dela
química de proteínas
se refuerzan mutuamente