Estudio computacional de los sitios de reconocimiento entre el

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANALISIS
EXPERIENCE RECEPCIONAL
Estudio computacional de los sitios de reconocimiento
entre el anhfdrido Isatoico y dos de sus analogos con la
enzima senna proteasa (factor D).
TESIS
Presenta:
Teresa Lopez Falfan
Director: Dr. Fernando Rafael Ramos Morales
Asesor: Dr. jose Correa Basurto
Xalapa, Ver.
Julio de 2008
El presente trabajo se realizo en la Unidad de Servicios de Apoyo en
Resolution Analitica (SARA) de la Universidad Veracruzana en Xalapa Ver., bajo la
direction del Dr. Fernando Rafael Ramos Morales y en el Laboratoiio de Modelado
Molecular de la Section de Estudios de Posgrado e Investigation (SEPI) de la Escuela
Superior de Medicina del Institute Politecnico Nacional en la ciudad de Mexico D. F.
Bajo la asesoria del Dr. Jose Correa Basurto (Proyectos CONACYT 62488 y SIP-IPN
20080026). La base teorica (mecanica cuantica) de entrada utilizada en el
. presente trabajo fue proporcionada por el Dr. Sergio Duran Niconoff del Institute
de Cientias Basicas de la Universidad Veracruzana en Xalapa Ver.
AGRADECIMIENTOS
Esta es quiza la parte mas dificil de escribir, ya que es tanta la gente a la cual
quiero expresar mi mas sincera gratitud.
Quiero agradecen
Toda su paciencia, ayuda, comprension y corapanfa:
En primer lugar a mi raadre Rufina por darme la vida, por ser un ejemplo, en mi
independencia como persona; por hacerme conocer lo que es valorar cada
esfuerzo y cada logro.
A mi hermana Ina, que aunque no siempre nos entendemos, se que me quieres en
el fondo, gracias por toda la ayuda en este proceso, porque aunque estas lejos,
siempre estas pendiente, te quiero.
A mi abuela Aurelia* que aunque no este aquf se que estas orgullosa, te extrano.
A ti amor, Luis por no dejarme solo, por apoyarme en mis decisiones, guardar la
paciencia, consentirme, escuchar mis quejas, por todo tu amor y paciencia mil
gratia.
A mi tia Cele, quien siempre estuvo hay animandome y ofreciendome todo aquel
recurso posible. No sabe como me ayudaste.
A toda mi familia, a cada una de mis primas (Irma, Nathaly, Betita y Ceci),
primos (Gustavo, Erick y Fer), a mis tfos y tias, mis sobrinos, por confiar en mi y
sentirse orgullosos de mis logros. Especialmente a la pequena Danae que me
brinda alegria.
A mis amigos Man, Areli, Conchis, Erika, Amado y Eloy, por confiar en mis
capacidades, por tolerarme, apoyarme, hacerme reir, por saber quien soy y
sobretodo por ser quienes son. Especialmente a ti Kika por ser una gran asesora.
Al Dr. Rafael Ramos; por compartir su conocimiento, por creer en mi, darme
apoyo tanto profesional como personal, eso es invaluable. Mil Gracias.
Al Dr. Oscar Gracias por sus valiosa orientation en este proceso, no tiene idea de
como aclaro dudas yle dio sentido a muchas cosas.
A cada lino de los profesores que hideron posible este dia, Q.C. Francisco Soils
Paez, M en C Maria del Carmen Castillo Guerrero, M. en C. Hector Escobar
Henrfquez por todas sus reganos oportunos y sus ensenanzas que seran de
utilldad, no unicamente en mi vida laboran, sino tambien personal.
A todos que de una u otra forma hicieron posible este dia, las palabras y gratitud
nunca sera suficiente.
Los quiero a todos y cada uno de ustedes, por todo este apoyo
y el que se que seguiran brindando, GRACIAS...
Tere.
INDICE:
RESUMEN
1
1. INTRODUCCION
2
2. ANTECEDENTES
4
2.1. ANHIDRIDOISATOICO
4
2.1.1. IMPORTANCIA QUlMICA
S
2.12.. TOXICIDAD
6
2.1.3. ACTIVIDADINHIBITORIA DE ANHIDRIDO ISATOICO
8
2.2. PROTEASAS
11
2.2.1. LAS SERINA PROTEASAS
12
2.3. SISTEMA DEL COMPLEMENTO
14
2.3.1. FUNCION DEL COMPLEMENTO
14
2.3.2. ACTIVACION DEL COMPLEMENTO
14
2.3.3. VIA ALTERNA
14
2.4. QUIMICA COMPUTACIONAL
16
2.4.1. MODELADO MOLECULAR
18
2.4.2. METODOS DE MECANICA MOLECULAR
18
2.4.3. METODOS SEMIEMPIRICOS
20
2.4.4. METODOS AB INITIO
21
2.4.4.1. METODOS HARTREE-FROCK
21
2.4.5. METODOS DE FUNCIONALES DE LA DENSIDAD
2.4.6. OPTIMIZACION DE LA GEOMETRIA
2.4.7. ACOPLAMIENTO MOLECULAR (DOCKING)
3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
4. HIPOTESIS
5.1. OBJE1WO GENERAL
5.2. OBJETIVOS ESPEClnCOS
6. MATERIAL
\
7. METODOLOGIA
7.1. MODELADO MOLECULAR
7.2. ACOPLAMIENTO MOLECULAR (DOCKING)
8. RESULTADOS
8.1. OPTIMIZAaON GEOMETRICA
8.2. ACOPLAMIENTO MOLECULAS
9. DISCUSION
i
10. CONCLUSIONES
11. REFERENCIAS
RESUMEN
El presente trabajo consistio en identificar los sitios de reamodmiento entre el
anhfdrido isatoico (ISA] y dos de sus analogos con en Factor D (senna probeasa)
perteneciente al sistema del complemento; estudios anteriores han demostrado que
este compuesto es inhibidor de multiples protemas en diversos sistemas biologicos.
La identification de manera teorica, de los sitios de interaccion entre las
moleculas de interes se efectuo mediante la implementation de dos metodos
computationales, el primero file el Modelado Molecular en el que se obtuvieron las
optimizaciones geometricas de la molecula de ISA y sus dos analogos que poseen los
grupos sustituyentes nitro e hidroxietilo en el carbono seis de la molecula. Utilizando
los programas Gaussian View 03 y Gaussian 03, empleando el metodo B3LYP y una
base AUG-cc-pVDZ, para obtener los niveles mmimos de energfa.
El segundo metodo utilizado es el Docking (acoplamiento molecular) el cual se
realizo con cada una de las moleculas optimizadas y la proteina del Factor D tomada
del PDB (Protein Data Bank), utilizando el programa AutoDock, y el Visual Molecular
Dynamics para la revision del acoplamiento final.
Las tres moleculas analizadas presentaron interacciones en comun de tipo
electrostaticas y por puentes de hidrogeno con los residues Arg 218, Cys 191, Gly 216,
He 227, Thr 214 y Val 213, con la caracteristica de que la molecula am sustituyente
nitro, ademas de los residuos antes mencionados, presents uniones por puente de
hidrogeno con los residuos Ser 190 y Lys 192. La molecula con el sustituyente
hidroxietilo presento una interaccion por puente de hidrogeno con Ser 190, Lys 192
adem&s de una interaccion electrostatica con Ser 217. Y por ultimo, ISA presento una
interaccion electrostatica con Ser 195, adicional a las interacciones en comun.
1. INTRODUCCION
Mudios compuestos pueden producir alguna respuesta de tipo farmacologica
por medio de una interaction fisicoqufmica, con macromoieculas esperificas del
organismo denominados normalmente receptores (R),
generalmente de origen
proteico.
Las moleculas que se unen a los receptores se denominan ligandos (L). Dentro
de la macromolecula del receptor, existen regiones esperificas a las que se unen los
ligandos, que reciben el nombre de sitios de reconocimiento. Cuando un L se une a un
R, la funrion celular se modifica, incluso inhibiendola.1
En este contexto la identification de posibles inhibidores de una protelna
puede ser realizada de manera experimental,2 sin embargo debido a los altos eostos y
prolongados tiempos que representan, se ha llegado a la necesidad de utilizas
herramientas mas rapidas como la quimica computational, basada en teorias quimicocuanticas implementadas en programas de computo, donde se pueden llevar acabo la
aplicacidn de metodos de modelado molecular y acoplamientos moleculares.
Por lo anterior para poder explicar los fen6menos que gobiernan la interaction
R-L, se utiliza el metodo teorico de acoplamiento molecular, tambien llamado docking
que nos permite predecir los sitios de union y su afinidad.
Algunas de las sustancias con efecto farmacologico son utilizadas en la
manufactura de productos agricolas, tintes, pigmentos, saborizantes, frag^nrias,
productos farraaceuticos, y productos qui'micos industriales3. Uno de estos
precursores es el anhidrido isatoico (ISA), el cual es un compuesto heteroticlico.
Reportes previos realizados por Hua Jing et al., en 1998; 4 han demostrado que
ISA actua como inhibidor del factor D, esta es una proteina que pertenece a la familia
de las serina proteasas, que se encuentra implicada en reactiones de tipo enziraatico
de la activation de la via alterna del complemento, el cual es uno de los prinripales
mecanismos efectores de la inmunidad humoral Por lo que el estudio de algunos
analogos de esta molecula mediante la tecnica de Docking podria dar a conocer si
pueden unirse a este complejo en los mismos sitios de reconocimiento y de esta
manera proporcionar information sobre el mecanismo de inhibition de tipo
enzimatica.
Sin embargo, la aplication de la quunica computational no sustituye a la
experimentation, sino que sirve como una herramienta versatil y complementaria
para obtener datos de la actividad de las moleculas tanto individual como en
interaccion con otras. Por ello constituye un gran apoyo informatico para las tecnicas
experimentales, que intentan recrear lo que sucede en el laboratorio.
2. ANTECEDENTES
2.1. ANHIDRIDO ISATOICO
En 1884, Kolbe uso el nombre de acido isatoico para identificar al producto de
la oxidation de la isatina con acido cromico (Figura 1). Erroneamente considerado
como un acido, en realidad es un anhidrido, por lo que posteriormente se nombro
anhidrido isatoico.3
H2Cr04
Isatina
Acido cromico
Anhidrido isatoico
Figura 1: Reaction de isatina y acido cromico.
La nomenclatura asotiada al anhidrido isatoico es frecuentemente confusa e
involucra varios metodos para numerar el anillo. Sin embargo la IUPAC (International
Union of Pure and applied Chemistry) presenta su nombre como un sistema
heteroticJico: 2H-3,l-benzoxazina-2,4(lH)-diona (Figura 2).
Figura 2: Numeration de la estructura de ISA
2.1.1. IMPORTANCE QUIMICA
EI anhi'drido isatoico es un compuesto muy versatil debido a la fetilidad de
reacrionar tanto con nucleofilos, especies donadoras de electrones, como con
electrofilos que son aceptores de los mismos.
La amplia gama de transformaciones quimicas del anhi'drido isatoico se deben
en gran medida a su capacidad para eliminar una molecula de CO2 con la formation de
imino-cetonas altamente reactivas (Figura 3).5
H
Figura 3: Formation de imino-cetonas a partir del anhldrido isatoico.
El acido antranflico es un derivado de la reaction de ISA, por reduction de
acido orto-nitrobenzoico y es intermediario en la fabrication de tintes (anil) (Figura
4), farmacos y perfumes en sintesis organica. El mdigo es un colorante que se aislaba
de un arbol, actualmente es un producto sintetico que se ha transformado en el
colorante ti'pico de los "jeans".6
O
Acido antranflico
Indigo
Figura 4: Ejemplos de compuestos derivados de ISA.
2.1.2. TOXICIDAD
En algunos estudios sobre la toxicidad aguda y sub-aguda del anhidrido
isatoico se encontraron datos impOrtantes por medio de experimentos en modelos
animales, sobre la dosis letal 50 (DLso) por distintas vfas de administration (Tabla I):7
Tabla I:
DLso por diversas vfas de administracidn
Modelo
Via de administration [mg/Kg)
Intraperitone
Cutanea
Oral
al
>1000-1250
>1000
Raton
>500
>810
>2500
Rata
>500
Cerdo
>500
Gate
Gallina
>2500
Un s into ma aparente de intoxication en ratones, ratas, conejillos de india y
gates es la disnea y en algunos casos, espasmos cronicos tras la administration oral e
intraperitoneal Tras la administration oral los sintomas se hacen evidentes en los
primeros 60 minutes, al tres dias se produce la muerte y aquellos animales que
sobreviven se mantienen estables. En la administration intraperitoneal los smtomas
de intoxication se observaron despues de tinco minutes. Tras la administration
intraperitoneal los primeros smtomas de intoxicatidn fueron observados despues de
cinco minutes. La mortalidad se produce entre en primer a tercer dia La
administration por via cutanea no presenta smtomas de intoxication en los siete dias
de experimentation.
En los casos
por inhalation probados en ratas, no hubo muerte por la
exposition a una atmosfera enriquecida con ISA durante ocho horas. Se determino un
limite de > 50 mg/l (> 5300 mg/m3) en ratas Wistar tras la exposition durante cuatro
horas, donde presentaron una respiration irregular o agitada y liquido rojszo en la
nariz. Se encontro que el 81% de las partlculas de ISA en llegaron a la region alveolar.7
En los casos por inhalation no se observo muerte por la exposition a una
atmosfera enriquetida con ISA (> 5300 mg/m3) durante ocho horas, pero en algunos
animates se observa respiration irregular o rapida y lfquido rojizo en la nariz. Se
encuentra que el 81% de las particulas de ISA llegaron a la region alveolar.
Una poblation de ratas Wistar hembras y machos fue expuesta a la inhalation
de ISA (11.6 y 71 mg/m3) por 4 horas, durante 5 dfas consecutivos, en un periodo de 4
semanas; tras la exposition se pesaron y anaiizaron macroscopicamente el corazon,
testiculos, hlgado, pulmones, bazo, glandulas suprarrenales, rinones, ovarios y
tiroides. Unicamente en ratas hembra expuestas a una concentration de 71 mg/Kg de
ISA/m3 muestra un aumento significativo en el peso del pulmdn, el resto de los
organos de ambos grupos no mostraron cambios.
La aplication de ISA sin diluir en los ojos de conejos, ocasiona un
enrojecimiento en el momento de la aplication, no obstante, despues de una hora se
presenta un edema grave y a las 24 horas se observa una hemorragia en la conjuntiva,
sin embargo los efectos disminuyen despues de 8 dias.7
En estudios de fertilidad, ratones hembras de unos 20 g de peso, tuvieron una
alimentation de 150 g/Kg (grupo de prueba y control), se les administro ISA via oral
en el alimento durante 7 dfas anteriores al periodo de apareamiento y 14 dfas despues
del mismo. El grupo de prueba presento una disminution del 20% en el numero de
ratas prenadas con respecto al grupo control Modificationes en la dosis muestran
variationes en el l'ndice de fertilidad (Tabla II):8
Tablall:
Modificationes de la dosis en estudios de fertilidad
Indice de fertilidad %
Dosis g/Kg
50.0
Control
33.3
0.75
15.4
1.5
17.4
3.0
2 . 1 3 . ACTIVIDADINHIBITORIA DE ANHIDRIDO ISATOICO
A continuation se mencionan algunos estudios acerca de actividad de ISA sobre
diversas protemas metabolicas del cuerpo, que pueden inhibir su funcionamiento.
Otsuka et aL En 1988, encontraron que ISA a 10 3 M (163 (ig/mL) inhibe a la
Concamavalina A (Con A) e inmonoglubulina E (IgE), estimulando la liberatidn de
histamina de las celulas peritoneales
de ratas en un 90.5% y
98.5%
respect!varaente.7-9
Shinogi et aL En 1985, senalan que concentrations de 10*4 a 10 3 M (16.314 a
163.14 pg/mL), de ISA puede lograr una inhibition de la elastasa pancreatica portina
a su vez la activation de la tripsina despues de 30 minutos de incubation en un 62 y
88%, respectivamente.7'10
Geld y Abeles, en 1986, probaron algunos subproductos de ISA como
inhibidores de serina proteasas. Estos subproductos tienen la particularidad de
contener sustituyentes cargados positivamente en su estructura (Tabla 111)
inactivando iireversiblemente varias enzimas similares a la tripsina y la trombina,
inactivandolas preferentemente sobre la quimotripsina. Por lo que es posible
preparar derivados o subproductos de ISA que son altamente selectivos de enzimas.11
Tablalll:
Sustituyentes de ISA probados en quimotripsina, tripsina o trombina.11
0
1
Numero de molecula
1
2
Ri
H
ch 2 nh 3 +
3
ch 2 nh 3 +
4
CH2NHb+
R2
R2
H
H
o
Estudios realizados por Moorman y Abeles, en 1982, proponen el desarrollo de
inactivadores autodestructivos de serina proteasas mediante dos metodos generales.
El primero, donde se emplea un sustrato que durante el proceso enzimatico normal da
lugar a un reactivo intermediario, el cual reacciona con los grupos funcionales en el
sitio activo para proporcionar un complejo enzima-inactivador unido covalentemente.
El segundo metodo utiliza un sustrato que conduce a una acil-enzima relativamente
estable. Esto sugiere que ISA reune las caracteristicas esenciales del segundo metodo.
La reaction hipotetica de ISA con la a-quimotripsina se muestra en la Figura 5.12
Figure 5:
Esquema hipotetico de la inactivacion de a-quimotripsina
mediante el anhidrido isatoico
o
La preincubation de ISA (1.25 x 1(H) con a-quimotripsina (8 x 1(H) dio como
resuitado en el perdida del 50% de actividad en aproximadamente 1.2 minutos y la
inactivacion completa en menos de seis minutos. La incubation de ISA con elastasa
pancreatica, a-litica proteasa y tripsina dieron como resuitado un tiempo medio de
inactivacion de > 25 minutos, regresando a su actividad aproximadamente en dos
horas.12
2.2. PROTEASAS
Las proteasas son enzimas que hidrolizan protei'nas generando, peptonas y
finalmente polipeptidos.13 Se encuentran naturalmente en organismos vivos, donde
actuan a nivel de ]a digestion molecular y la reduction de proteinas no deseadas. Estas
enzimas proteoliticas comprenden la tripsina y la quimotripsina, as! como las
proteasas, elastasas y catepsinas.14
Las proteasas se clasifican de acuerdo a las similitudes de su estructura
tridimensional Si la estructura tridimensional no esta disponible, la clasification se
hace basandose en el orden de los residuos catallticos de la cadena peptidica y las
secuentias que los flanquean.15
Una clasification de las proteasas es la descrita por Barret y Rawlings en 1993,
basandose en su mecanismo catalltico de las proteasas, donde encontramos:16
•
Serina proteasas
•
Cistefna proteasas
• Aspartico proteasas
•
Metaloproteasas
Algunas otras son:
•
Treonina proteasas
•
Glutamii proteasas
•
Mixtas (serina, treonina y tisteina) .
•
Endopeptidasas
•
Exopeptidasas
2.2.1. LAS SERINA PROTEASAS
Las serina proteasas constituyen una familia de enzimas que en su sitio de
fijarion al sustrato utilizan un residuo de serina activada de forma espedfica para
hidrolizar catah'ticamente enlaces pepti'dicos. Esta serina puede ser caracterizada
mediante una reaction irreversible entre el grupo hidroxilo de su cadena lateral y el
diisopropilfluorofosiato (DFP), el cual es un potente inhibidor de estas proteasas y
reacciona irreversiblemente.15
Las serina proteasas participan en procesos fisiologicos cuidadosamente
controlados, tales como la coagulation de la sangre, la fibrindlisis, la activaci6n del
complement©, la fertilization y la production de hormonas.15
La activation de protemas catalizada por serina proteasas son ejemplo de
proteolisis limitada, ya que unicamente se hidroliza de manera espedfica uno o dos de
los centenares de enlaces peptidicos, dependiendo de la secuentia de la proteina.15 No
obstante, en conditiones desnaturalizantes, estas mismas enzimas hidrolizan
multiples enlaces peptidicos, dando asi lugar a la digestion de peptidos, protemas, e
incluso de si mismas (autdlisis). Se cree que diversas enfermedades, tales como
enfisemas, artritis, trombosis, metastasis cancerosa y algunas formas de hemofilia
provienen de la ausentia de regulation de serina proteasas especificas (Tabla IV).16
Tabla IV
Papel bioqulmico y fisioldglco de algunas serina proteasas. 15
Posible enfermedad por
deficiencia o
Acridn
Proteasa
malfuncionamiento
Calicrema piasmatica
Factor Xlla
Factor XIa
Infarto cerebral (apoplejia),
Factor IXa
infarto coronario, trombosis,
Coagulation
Factor Vila
trastornos hemorragicos
Factor Xa
Factor Ila (trombina)
Protema C reactiva
Factor Clr
Factor Cls
Inflamatidn, artritis
Factor D
reumatoide, enfermedades
Complements
Factor B
autoinmunes
C3 convertasa
Tripsina
Quimotripsina
Pancreatitis
Digestion
Elastasa (pancreatica)
Enteropeptidasa
Uroquinasa activadora
Fibrinolisis, migration
del plasminogeno
Trastornos de coagulation,
celular, embriogenesis,
Activador tisular del
metastasis tumoral
menstruation
plasmin6geno
Plasmina
Calicreinas titulares
Acrosina
Activation hormonal
Subunidad a del factor
Fertilization
lnfertilidad
de creciniiento neuronal Activation del factor de
Subunidad y del factor de
crecimiento
creciniiento neuronal
Elastasa de granulocitos Degradation extracelular
de proteinas y peptidos,
Catepsina G
Inflamation, respuesta alergica
fimcion celular de los
Quimasas de mastotitos
mastotitos
Triptasas de mastotitos
2.3.SISTEMA DEL COMPLEMENTO
EI sistema del complement® es uno de los principales mecanismos efectores de
la respuesta inmune, que juega un papel fundamental en la defensa del huesped frente
a las infecciones y en los procesos inflamatorios. El sistema del complemento esta
constituido por un grupo de mas de 30 protemas plasmaticas y de membrana que
estan presentes en la circulacidn de manera inactiva, derivadas del hfgado, macrofego,
tejido epitelial intestinal, y genitourinario, asf como del adipocito.17-18'19
2.3.1. FUNCION DEL COMPLEMENTO
Dentro de las principales funtiones del sistema de complemento encontramos
la production de lisis celular; opsonization, donde celulas ajenas se presenta para la
fagoritosis; la generation de fragmentos peptfdicos que regulan la respuesta
inflamatoria e inmunitaria y ayudan a regular la actividad biologica de las celulas.18
2.32.. ACTIVACI6N DEL COMPLEMENTO
Existen tres vfas en la activation del complemento: la via clasica, activada por
anticuerpos unidos a antfgenos; la via alterna, que se activa sobre la superfirie de las
celulas microbianas en ausencia de anticuerpos; y la via de la lectina, activada por una
lectina plasmatica que se une a residuos de manosa sobre los microo rganismos.20 El
reconotimiento del microorganismo por cualquiera de estas vfas produce una serie de
reacciones enzimaticas consecutivas en cascada.21
2.3.3. VIA ALTERNA
Esta via es independiente de anticuerpos por lo que se activa directamente
sobre la superficie de muchos microorganismos, dentro de esta via alterna
encontramos al factor D.
La cascada de esta via nos proporrionara una idea del mecanismo de action del
factor D, para explicar la importanria de su inhibition ya que esta via actua varios dlas
antes de que entre en action la via clasica (Figura 6).22
Figura 6: Via alterna del complemento
La molecula C3 tircula en el plasma sufriendo hidrolisis espontanea de su
unidad tioester formando al C3(H20), por lo que en presencia de iones Mg2+ y el
C3(HzO) puede unirse al factor B, exponiendo un sitio que sirve como sustrato para
una protefna serica activa desde el punto de vista enzimatico denominado factor D,
para asf produtir las enzimas convertasa: C3a y C3b.23
La convertasa C3 (C3bBb) que es muy inestable, y por lo regular, se disocia con
rapidez. Sin embargo, en la sangre tircula una protefna Uamada properdina (P), este
factor se une a C3bBb proporcionandole estabilidad, para disminuir asf su
degradation y permitir que continue la cascada del complemento, dando lugar a
C3bBbP, llevando a la activation de C3 y C5 convertasa para provocar un ataque a la
membrana celular; mediante la opsonization de patogenos, proportionando una
primera linea de defensa contra las infectiones.
2.4. QUIMICA COMPUTACIONAL
A fines de los anos setenta aparerio un nuevo campo de conodmiento
orientado al diseno de moleculas asistido por computadoras: la qufmica
computational. Esta nueva disdplina file impulsada por las prindpales companfas
farmaceuticas del mundo interesadas en la busqueda de nuevos productos.
Aun cuando el termino qufmica computadonal es muy empleado, el interes por
definirlo ha sido escaso; es mas con mucha frecuencia todavfa suele utilizarse el
concepto qufmica tedrica como un sinonimo en forma erronea.24
Una de las definidones mas aceptadas es la propuesta por Paul von Rague
Schleyer en 1985: "La Qufmica Computational intenta modelar todos los aspectos de
la qufmica lo mas real posible mediante el uso de calculos en lugar de la
experimentation.25
Sin embargo, de forma mas breve, como su propio nombre lo indica, la qufmica
computadonal es el estudio de los procesos qufmicos mediante diversas herramientas
de compute.26 Utiliza los resultados de la Qufmica Teorica (metodos matematicos para
la prediction de propiedades ffsicas y qufmicas de compuestos), incorporados a un
programa, para calcular las estructuras y las propiedades de moleculas y cuerpos
solidos.25-27
Es conveniente diferendar los terminos qufmica teorica y qufmica
computadonal. El primero esta asodado a con la busqueda de mejores teorias para
describir parametros determinados experimentalmente24 e incluye los desarrollos de
la qufmica cuantica, la mecanica cuantica y la mecanica estadfstica en modelos
inclinados a explicar, entre otras cosas, la realidad fisica del fenomeno de la
reactividad. Estos desarrollos se pueden trasformar en algoritmos programables, asf
la qufmica teorica es proveedora de los metodos aplicables en la qufmica
computadonal.28
Diagrama tornado de "Algunos aspectos basicos de la qmrnica computational"26
La qmrnica computational esta constituida por dos grandes areas basadas en
diferentes printipios fisicos: los metodos de la Mecanica Cuantica (QM) y la Mecanica
Molecular (MM), que dan lugar a la existencia de cuatro grupos de metodos de
calculo.242529
r Metodos
f
MM2
MM3
Generales
Metodos de Mecanica
-< Metodos
CHARMM
Molecular (MM)
<
Especializados
AMBER
en biomoleculas
Metodos de
Quimica
Computational
Ab initio
<
Metodos
SCF-MO
Metodos
J
Semiempiricos j
Metodos de Mecanica
Cuantica (QM)
^
V
V
Metodos
DFT
{
HF
MPn
CASSCF
<
AMI
pj^
Metodos f BLYP
Puros \ BPW91
Metodos
Hibridos
{
B3LYP
2.4.1. MODELADO MOLECULAR
E) modelado molecular es una representation de estructuras quimicas, el cual
tuvo sus initios a partir de la mitad del siglo XIX.26 En la Enticlopedia Britanica se
entiende como un modelo a una description o similitud usada para ayudar a la
visualization de algo (como por ejemplo un atomo) que no puede observarse
directamente.30
El modelado molecular hoy en dia es una de las tecnicas computacionales que
permiten crear modelos quimicos de diversos materiales, mediante la resolution de
la ecuation de Schodinger que describe el com porta mi ento de los nucleos y electrones
de un sistema.31 Permite caracterizar y predetir la estructura y estabilidad de un
sistema qui'mico, estimar las diferencias energeticas entre distintos estados, y explicar
mecanismos y procesos quimicos generates a nivel atomico y molecular.
2.4.2. METODOSDE MECANICA MOLECULAR
Los metodos de mecanica molecular estan basados en las leyes de la mecanica
clasica y usan como modelo una molecula compuesta por atomos (considerados
particulas puntuales dotadas de masa y carga), unidos por enlaces que se pueden
comparer con resortes. A partir del uso de varias parametros como las constantes de
fuerza de alargamiento de enlace y la introduction de terminos que permiten
considerar interactiones entre los atomos no enlazados, el metodo constituye una
expresion para la energfa potential en funti6n de las positiones atomicas V(x,y,z). Por
medio de la minimization de estas funtion, para varios conformaros moleculares, los
metodos de mecanica molecular predicen propiedades como geometria en equilibrio y
energia relativa.27•30
En los metodos de mecanica molecular se analizan las contiibutiones a la
energia potential de las moleculas debido a:
Alargamiento de energfa (Valars)
Deformation de angulos de enlace (Vdef)
Deformation fuera del piano (V°°P)
Rotation interna alrededor de un enlace, tambien Uamado torsion (Vtor3
Interacciones entre esta clase de movimientos (que permiten el termino cruzado
fycn&Q
Atracciones y repulsiones de Van der Waals entre atomos no enlazados (Vvdw)
Interacciones electrostaticas entre los atomos (Velec)
La suma de estas contribuciones produce la energfa potential, V, para una
conectividad y conformation molecular determinada.
V= Va,ai^ + Vdef+V°°P + V*01" + VOTIZ + Vvdw + Ve,ec
Las expresiones explititas empleadas para cada termino el la ecuation anterior
definen el campo de fuerza en mecanica molecular y las derivadas de la energfa
potencial que determinan las fuerzas que actuan en cada atomo 24
Ademas de evitar la solution de la ecuation de Schrodinger, los aspectos
cuantitativos del movimiento nuclear no son tornados en cuenta. Esto significa que la
dinamica de los atomos es tratada por la mecanica clasica, es detir, la segunda ley de
Newton. Para los fenomenos independientes del tiempo, el problema se reduce a
calcular la energfa de una geometrfa da da. El interes cosiste a menudo en encontrar la
geometria de moleculas estables y/o diversas conformationes. El problema entonces
se reduce a encontrar el mfnimo de energfa en la superfitie de energia potential 3 2
Los metodos de mecanica molecular permiten:
> DesarroIIar calculos rapidamente
> Describir logicamente la mayorfa de los nucleos
> Estudiar sistemas con varios tientos de atomos
> Aplication de variables para modelos macromoleculares
Por su parte, a traves de los metodos mecanico cuanticos, tambien
denominados calculos de estructura electronica, podemos obtener los estados
cuanticos, energeticos y otras propiedades relacionadas de las moleculas, que se
basan en la aproximation SCF-MO (Self-Consistent Field-Molecular Orbitals), que
resuelve de forma aproximada la ecuacion de Schrddinger independiente del tiempo,
en donde la energia es asociada a la ecuacion de Hamilton, siendo una funtion de
onda, la funtion propia correspondiente.33 Los sub-metodos utilizados son los
denominados semiempiricos y ab initio.
2.4.3. METODOS SEMIEMPIRICOS
Los metodos semiempiricos, utilizan parametros experimentales para
simplificar el calculo computational. Estos metodos minimizan costos al redutir
numero de integrates a calcular, ya que se consideran algunas simplificationes como:
> Considerar solo los electrones de Valencia y no los de capas internas.
Esto se logra al tomar en cuenta una carga nuclear menor, o utilizar
funtiones que atienden a los nucleos y electrones como una entidad,
llamada potential interno.
> Utiliza solo conjuntos de base minima, asi como el numero minimo de
funtiones necesarias, para representar a los electrones. Los atomos de
hidrogeno tienen una funtion base, mientras los atomos en la segunda y
tercera fila de la tabla periodica poseen cuatro.
> Realiza aproximationes para simplificar el numero de integrales de
traslape y de repulsion interelectronica.
Los calculos semiempiricos han sido muy destacados en la description de la
qufmica organica, donde hay solamente algunos elementos usados extensivamente y
las moleculas son de tamano moderado. Sin embargo, los metodos semiempiricos se
han ideado espetificamente para la descriptidn de la qufmica inorganica.34
Tambien se utilizan como un primer paso en calculos ab-initio de sistemas muy
grandes; por ejemplo, para obtener una mejor estructura de partida de un sistema
molecular de muchos cuerpos para futuros calculos Hartree-Fock o de Teorfa del
Funcional de la Densidad, o para obtener una description cualitativa sobre la molecula
(orbitales moleculares, cargas atomicas o modos vibrationals). 33
La ventaja de los calculos semiempi'ricos es que son mucho mas rapidos que los
calculos ab initio. Por el contrario la desventaja de estos calculos es que los resultados
pueden ser erroneos.
2.4.4. METODOS AB INITIO
Los metodos ab-initio (al initio), este nombre se le da a los calculos que se
derivan directamente de printipios teoricos, sin la inclusion de datos experimentales.
La mayor parte del tiempo esto esta referido a un calculo de mecanica cuantica
aproximado.
Las
aproximaciones
hechas
son
generalmente
aproximationes
matematicas.34
El mas comun de los calculos ab initio es el metodo llamado Hartree-Fock (HF),
este metodo tomo en cuenta las interacciones entre los electrones solo de manera
promedio, en la cual la repulsion electron-electron no es tomada en cuenta.33
2.4.4.1.
METODOS HARTREE-FROCK
La aproximation de Hartree-Fock es equiyalente, en qufmica computational, a
la aproximation de orbitales moleculares. Este metodo es un procedimiento iteractivo
para calcular la mejor solution a la ecuation de Schrddinger independiente del
\
tiempo, para moleculas aisladas, tanto en su efecto fundamental como en estado
excitado.35
Para un calculo atomico HF, se parte de un conjunto de orbitales de un atomo
con un solo electron. Para calcular moleculas o cristales, las fimciones de onda
initiates son tfpicamente una combination lineal de orbitales atomicos. Esto da una
recopilation de orbitales monoelectricos, que por lo general deber ser antisimetrica,
lo que se consigue mediante el uso del determinants de Slater de acuerdo al principio
de exclusion de Pauli.36
Esencialmente, este metodo emplea los determinantes de Slater para combinar
las funciones de onda del electron, y a traves iterativo, los coeficientes de los orbitales
son modificados de ciclo en ciclo hasta conseguir la energia electronica constante
minima y cuando los orbitales no cambian, entonces se habra logrado un campo autoconsistente (SCF). Este metodo puede aplicarse a sistemas cerrados (RHF) como en de
campo abierto (UHF).
El calculo Hartree-Fock (RHF) es usado para un sistema de capa cerrada. Esto
lleva a la restriction que debe haber un a un par de electrones, y que deben estar
espin-apareados. La restriccion que cada orbital es doblemente ocupado o no
ocupado. El calculo RFH es apropiado para sistemas neutros, aniones o cationes.
El calculo Hartree-Fock no restringido (UHF) es un sistema de capa abierta,
donde al menos un orbital sera ocupado individualmente. Calcula dos series de
orbitales moleculares, uno para cada tipo de espin, llamado alfa y beta. Esto considera
que cada orbital molecular doblemente ocupado consta de dos orbitales moleculares
individuates espin-apareados ocupados. El calculo UHF calcula el efecto de
perturbation de un espin desapareado sobre los espines apareados formalmente y
generando densidades de espin realistas.37
2.4.5. METODOS DE FUNCIONALES DE LA DENSIDAD
Los m£todos derivados de la Teoria del Funtionales de la Densidad (DFT) se
conocen como una alternativa a los metodos ab initio para determinar la estructura
electronica molecular. Este metodo es mas sentillo, por lo que ha hecho posible
estudiar moleculas complejas posibilitando el estudio de protefnas o reacciones
enzimaticas.35
La teoria de fiincionales de la densidad, es una teoria de la estructura
electronica que esta escrita en terminos distribution de densidad electronica. Esto
contrasta con los metodos tradirionales en mecanica cuantica, basados de onda
polielectricas, mas complicadas.
Si conocemos el funcional que relaciona la energia con la densidad electronica,
podremos encontrar el estado fundamental del sistema, ya que sera aquella
distribucion electronica que corresponde a la menor energia.
La DFT moderna es una teoria exacta en prinripio, aunque en la practica hay
que hacer varias aproximaciones. En muchos casos, la DFT de resultados satisfactorios
(comparados con datos de metodos mecanico cuanticos mas presisos) a un costo
computacional relativamente bajo. 35
2.4.6. OPTIMIZACI6N DE LA GEOMETRIA
Dos de las propiedades que se obtienen directamente de un calculo son la
energia y la geometria. Por lo general un calculo se inicia con una geometrfa de
partida, construida con base en datos geometricos disponibles, ya sea tablas de
longitud de enlace o datos conseguidos a partir de determinaciones estructurales
como difracrion de rayos X o de neutrones.33
El concepto de superfirie de energfa potencial es fundamental en la difusion de
la estructura molecular y del proceso de optimization de geometria, proceso para
encontrar la minima energfa. Esta superfirie tambien llamada superfirie de potencial o
mas correctamente superfirie de energfas potentiates (ya que cada punto en la
superfitie le corresponde un valor de energfa potential, aunque este termino no es
popular), describe la energfa de la molecula en funtion de su geometria: de enlace,
angulos de Valencia, angulos torsionales o cualquier otro parametro para definir la
geometria.33
2.4.7. ACOPLAMIENTO MOLECULAR (DOCKING)
Muchos compuestos con propias farmacologicas pueden produtir una
respuesta biologica por medio de la interaction con biomoleculas esperificas
(protefnas, acidos nucleicos, carbohidratos y lfpidos).
Esta interaction puede ser simulada y manipulada por medio del acoplamiento
molecular (docking)2
el cual es un metodo computational donde se desarroUan
algoritmos que permiten predecir la mejor orientation de una molecula, buscando
formas de union entre ligandos potentiales y un bianco macromolecular cuya
estructura es conocida experimentalmente.38 A su vez, puede utilizarse para predecir
la fuerza de asotiacion, de afinidad y actividad entre dos moleculas, utilizando
funtiones de puntualizacion.39
La mayoria de las funtiones de puntuacion se basan en la mecanica molecular y
los campos de fuerza donde la energfa corresponde a la mas baja y posible para
indicar que la interaction entre dos moleculas tiene mayor probabilidad de ser
estable.
Podemos definir a un receptor como una molecula que retibe a una molecula
mas pequena o de otra protefna o incluso un acido nucleico, y a un ligando como una
molecula capaz de ser la pareja complementaria en un proceso de acoplamiento.
El receptor y el ligando son una pareja de moleculas que tienen la caparidad de
unirse una a la otra, y produtir como resultado algun efecto biologico. El sitio de
union, es una zona de la superfitie del receptor donde se efectua la union con el
ligando.3 Esta expresion es semejante a la analogfa de la Have y cerradura que sirve
para entender la complementariedad de los sitios activos de las enzimas y sus
sustratos.40
El objetivo del acoplamiento molecular consiste en encontrar la unidn mas
probable entre el ligando y el receptor con un menor requerimiento energetico (ya
que a menor energia, es mas fuerte la union), asf como el sitio idoneo de union
molecular, de tal manera que la energfa libre del sistema general se minimiza.31'32
La optimization de la geometrfa consiste en encontrar las coordenadas de una
estructura molecular que represente un mfnimo de energfa potential
La simulation de acoplamiento molecular es un proceso complicado, debido a
que el receptor y el ligando estan separados por una distancia fisica, el ligando
encuentra la position en el sitio activo de la protefna despues de una serie de
movimientos en uri espacio conformational. Cada uno de los movimientos en la
conformation espatial del ligando induce un costo energetico total del sistema, por lo
que despues de cada movimiento la energfa del sistema total es calculada.31
Tipos de enlaces entre el ligando y receptor
Las fuerzas que rigen la interaction entre los atomos y las moleculas son la
base de las interacciones entre los ligandos y sus receptores. Existen dos formas
fundamentals de union en este complejo.
I. Uniones no covalentes: son uniones mediadas por fuerzas de interaction
relativamente debiles, que sin embargo son sufitientemente estables para
permitir que se produzca un efecto. Este se produce por:
Uniones ionicas: este tipo de enlaces se forma entre iones con carga opuesta,
que se disotian reversiblemente a la temperatura del cuerpo. Son interacciones que
ocurren a nivel cation-anion, entre distintas moleculas cargadas, y que por lo mismo
tienden a formar una union electrostatica entre los extremos de cargas opuestas, lo
que depende de la electronegatividad de los elementos constitutivos.
Fuerzas de van der Walls o fuerzas de dispersion de London: son fuerzas de
enlace debiles, actuan entre todos los atomos que estan en cercanfa mutua. La fuerza
de atraccion entre estas uniones es inversamente proporcional a la septima potencia
de la distancia de separation entre atomos o moleculas.
Puentes de Hidrogeno: Los atomos de hidrogeno posen una carga parcialmente
positiva en su superficie y forman enlaces con atomos de oxfgeno y nitrogeno que se
encuentran con carga negativa.41
Efecto hidrofobico o interaccion hidrofobica: por definition, una sustancia es
hidrofobica si no es miscible en agua. Este efecto se presenta cuando una molecula no
es capaz de interaccionar con las moleculas de agua.
II. Uniones covalentes: son uniones mediadas por la compartition de electrones
entre atomos adyacentes. Donde participan dos tipos de fuerzas, las de
atraccion y repulsion entre las capas electronicas. Esta unidn es mucho mas
estable y poco reversible en condiciones biologicas 42
Con todo esto podemos darnos cuenta que la quimia computacional es una
gran herramienta alternativa para conocer a las moleculas de interes tanto individual
como en un interaccion.
Justification y Planteamiento del problema
3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las serina proteasas participan en multiples procesos fisiologicos entre los que
podemos destacar a la cascada de coagulation, el sistema inmune e inflamacion y su
contribution en las enzimas digestivas. Esta familia de protefnas, utilizan un residuo
de serina activado para unirse al sustrato catalizando la hidrolisis de enlaces
peptfdicos.
Dentro de estas protefnas podemos encontrar al Factor D, que se encuentra en
la via alterna del complemento. El mal ftmcionamiento o una defitientia de factor D,
puede tener consecuencias tales, como la production de inflamacion, artritis
reumatoide o una enfermedad auto-inmune, esta defirienria puede ser produtida por
la inhibition de compuestos organicos.
El anhfdrido isatoico, debido a estudios anteriores se ha identificado como un
inhibidor potencial de la slerina proteasas, sin embargo, los sitios de reconorimiento
esperificos de algunas moleculas analogas no esta definido, pero gracias a las
herramientas de la qufmica computational y el modelado molecular podemos
predecirlos.
Considerando todo lo anterior, el objetivo del presente trabajo consists en
conocer las interacriones moleculares de una serina proteasa, pertenetiente al
complemento (factor D), con el anhfdrido isatoico y dos de sus analogos, identi ficando
sus sitios esperificos de reconorimiento y fuerzas implicadas en la interaction
mediante el uso de herramientas de la qufmica computadonal.
Hipotesisy Objetivos
4 . HIPOTESIS
Dadas sus propiedades nucleofilicas y electrofilicas existe interaccione del
factor D (serina proteasas) con el anhidrido isatoico y dos de sus analogos.
5.1.0BJETIV0 GENERAL
Conocer los sitios de reconocimiento entre el anhidrido isatoico y dos de sus
analogos con el receptor (factor D).
5.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Optiraizar la geometrfa molecular de los analogos de ISA
•
Realizar el acoplamiento del anhidrido isatoico y dos analogos a un receptor de
tipo serina proteasas (Factor D).
• Visualizar los sitios de reconocimiento entre la macromolecula (enzima) y los
ligandos y los valores energeticos.
6. MATERIAL
Para realizar el modelado molecular del anhfdrido isatoico, sus analogos y el
acoplamiento molecular, se dispuso de computadoras de escritorio con las siguientes
caracteristicas:
•
Modelo Sony Vaio Desktop Pcv-R525 MV con procesador Pentium IV,
sistema operativo Windows XP, memoria RAM de 256 MB, disco duro de
80 GB.
•
Computadora DELL con procesador Intel Core 2 Duo, sistema operativo
Windows XP y memoria RAM de 512 Mb con un disco duro de 100 GB.
•
Computadora DELL con procesador Intel Core 2 Duo, sistema operativo
Linux, memoria RAM de 1 GB con un disco duro de 100 GB.
Asi como los siguientes programas:
•
Software Gauss View 03
•
Software Gaussian 03
•
Software Autodock Tools 1.4.5
•
Software Visual Molecular Dynamics 1.8.6
•
Software Molekel 4.3 win 32
7. METODOLOGIA
7.1. MODELADO MOLECULAR
Para generar la conformation tridimensional molecular energeticamente
favorable de cada una de las moleculas (ligandos) se utilizo el programas Gaussian
View 03; Gaussian 03 se empleo para la optimization geometrica de las molecula,
donde se obtuvieron los niveles mfnimos energeticos, por medio de la Teoria de
Funtionales de la Densidad (DFT) aplicando la base AUG-cc-pVDZ. Los archivos de
salida (.out), fiieron convertidos en archivos PDB empleando el programa molekel
Tabla V:
ISA y sustituyentes optimizados
Nombre IUPAC
Estructura qufmica
6-(l-hidroxietil)- 2H-3,l-benzoxazina-2,4-(lH)diona
8
H
i
Op
-0.07
u °
2H-3,l-benzoxazina-2,4-(lH)diona
0.00
0
6-nitro-2H-3,l-benzoxazina-2,4-(lH)diona
8
H
fTT
/ ^^lO^S^ 3
02N
5
€Tp: constante de Hammett
|•
0
0.78
En la Tabla V, se presentan las tres estructuras quimicas utilizadas para las
interacciones moleculares (Docking) estos analogos posen un sustituyente en el
Carbono seis de la molecula ISA, y son el grupo hidroxietil y el grupo nitro, los cuales
fueron seleccionadas de acuerdo a estudios realizados previamente sobre las
propiedades electrofilicas y nucleofilicas de la moleculas ISA realizados por Ramos y
Duran (sin publicar), de acuerdo a la constants de Hammett, que caracteriza las
propiedades electronicas de los diversos sustituyentes. Se encontro que el compuesto
menos reactivo es ISA, ya que los sustituyentes tiene como objetivo aumentar la
reactividad, la position C6 es la mas susceptible al ataque electrofilico, mientras que la
position C2 es la mas probable de sufrir un ataque nudeofilico.
7.2. ACOPLAMIENTO MOLECULAR (DOCKING)
i
Antes de iniciar el acoplamiento, el primer paso es obtener la estructura de la
proteina de interns (factor D), la cual generalmente, ha sido determinada previamente
mediante una tecnica como la cristalografYa de rayos X, o menos frecuente mediante
una espectroscopia de Resonancia Magnetica Nuclear (RMN). La estructura de la
proteina empleada en el presente trabajo fue obtenida en la base de datos Protein
Data Bank (PDB).
Esta estructura proteica posee la clave PDB lbio (Figura 4), y file obtenida por
difraction de rayos X, a una temperatura de 95 fiK y un pH de 6.4.
Figura 7: Protefna lbio del factor D, tomada de PDB
Posteriormente se utilizo el programa AutoDockTools donde los archivos PDB
fueron convertidos en PDBQS. Estos archivos fueron utilizados para un previo
acondidonamiento de los ligandos y el receptor, utilizando la funtion grid box: que
delimita el espado en el cual los ligandos y el receptor van a interactuar.
Para identificar los residuos de la protefna con los cuales interacdona cada una
de las moleculas analogas del anhfdrido isatoico, se utiliz6 el programa
AutoDockTools. La visualization de estas interacriones se realizo en el programa
VMD, siendo asf posible establecer el tipo de enlaces entre estas moleculas.
8. RESULTADOS
8.1. OPTIMIZACION GEOMETRICA
Para llevar acabo las optimizaciones de geometria de cada una de las moleculas
se utilizo el software Gaussian 03, utilizando la Teoria de Funcionales de la Densidad,
aplicando la base AUG-cc-pVDZ, debida a que estudios previos muestran que dentro
de las diferentes bases de funcion, mediante la base utilizada se pueden obtener datos
mas exactos en comparacion con datos de cristalografia.
Ya que dentro de los antecedentes presentados hemos encontrado que los
sustituyentes de preferencia son aquellos con carga positiva, por lo que en el presents
trabajo se selecciono como base a la molecula ISA, un sustituyente con un grupo
cargado negativamente (hidroxietil) y uno positivo (nitro).
8.2. ACOPLAMIENTO MOLECULAS
TablaVI:
Resultados del docking entre las proteina y las moleculas de ISA y sustituyentes
Energia libre Constante de Aminoacidos con los
Nombre de sustituyente
que interacaona
disociacion Kd
CKJ/mol)
3.85 X10 6
ISA
-7.39
ARG218
CYS191
GLY 216
1LE227
SER 195
THR 214
VAL213
hidroxietil
-8.77
3.75 X10 7
nitro
-8.46
1.06 X 1 0 6
ARG 218
CYS 191
GLY 216
ILE 227
LYS192
SER 190
SER 217
THR214
VAL213
ARG 218
CYS 191
GLY 216
ILE 227
LYS 192
SER 190
THR214
VAL213
La energia libre y la constante de disociacion, al igual que los residuos de la
proteina (factor D) con los cuales interacciona ISA y sus analogos se presentan en la
tablaVI.
ISA presents interacciones de tipo electrostaticas con los residuos Arg 218, Cys
191, Ser, 195, Thr 214 y Val 213 e interacciones por puentes de hidrogeno con los
residuos Gly 216, y lie 227, de la protefna (factor D).
6-(l-hidroxietil)- 2H-3,l-benzoxazina-2,4-(lH) diona presenta interacciones
de tipo electrostaticas con los residuos Arg 218, Cys 191, Lys 192, Ser 217,, Val 213 y
Gly 216, e interacciones por puente de hidrogeno con Arg 218, lie 227, Ser 190 y Thr
214.
6-mtro-2H-3,l-benzoxazina-2,4-(lH) diona presenta interacciones de tipo
electrostaticas con Arg 218, Sys 191, Gly 216, Thr 214 y Val 213, e interacciones por
puente de hidrogeno con lie 227, Ser 190 y Thr 214.
9. DISCUSION
Todas las moleculas presentan interacciones de tipo electrostaticas y por
puentes de hidrogeno, estos ultimos se pueden interpretar como la mejor interaction.
Por lo que proporciona mayor estabilidad a la molecula y como podemos observar en
la tabla VI, la energia libre mas baja y la constante de disociacion mas alta es
presentada por la molecula ISA, por lo contrario la de mayor energia libre y menor
constante de disociacion es la 6-(l-hidroxietil)- 2H-3,l-benzoxazina-2,4-(lH) diona,
esto nos indicando que la molecula mas estable energeticamente es aquella que
contiene el sustituyente hidroxietil, al igual que el mayor numero de interacciones
por puentes de hidrogeno y residuos de la proteina.
Sin embargo la interaccion de cada molecula se ileva a cabo sobre el mismo
sitio activo de la proteina, en su portion nucleofilica de las moleculas de ISA, esta
molecula de acuerdo a los resultados obtenidos es la de menor estabilidad, sin
embargo se encuentra en una configuration espatia diferente a sus analogos, se
encuentra en una rotati6n practicamente de 90 9 con respecto a sus derivados, y a
pesar la de menor densidad electronica es la que se encuentra mas internamente.
Por lo observado en los resultados de interacti6n se puede resaltar que entre
mayor sea el numero de elementos en el sustituyente sera mayor en numero de
residuos afmes a la molecula. Y los grupos funtionales que sean adicionados tambien
tienen una gran influentia de acuerdo a sus propiedades electro-donadoras o electro atractoras.
10.
CONCLUSIONES
Habiendo revisado las interacciones de la molecula ISA y cada uno de sus
analogos con el factor D, las conclusiones de este trabajo son:
•
Despues de la revisi6n bibliogr&fica se encontr6 que existen estudios
sobre la inhibici6n del factor D por el anhidrido isatoico y que los sitios
de reconocimiento de esta interaccion en comparaci6n con el presente
estudio se encontraron dos sitios similares de interaccion, estos son la
Arg 218 y la Ser 195 dando una referencia de que las interacciones
moleculares son correctas.
•
Debido a que si existen interacciones entre las dos moleculas an^logas
del anhidrido isatoico podemos identificar que esta es llevada acabo
mediante la zona nucleofilica de la molecula del anhidrido isatoico por
lo que los sustituyentes le proporcionan mayor estabilidad debido a que
presenta m£s residuos con los cuales interaccionar. Se destaca que la
inhibici6n del fartor D, podria ser producida por las dos moleculas
an&ogas del anhidrido isotonico, esto es de suma importancia ya que
este es un precursor muy importante en la industria farrrtac6utica y de
productos como pinturas, fragancias, tintes, etc., con los cuales nos
encontramos en constante contacto.
•
De acuerdo a los resultados obtenidos en la molecula con sustituyente
hidroxietil, que presenta la menor energfajibre y la mayor constante de
disociaci6n, indicandonos estos valores que esta interaction es las mas
estable energSticamente, esto se expresa en la mayor interaccion con los
residuos de factor D, se puede decir que la inhibicidn de este factor
puede ser potencializado por esta molecula.
•
Tambien en algunas revisiones podemos encontrar una propuesta
hipotetica sobre la interacci6n del anhfdrido isatoico y la aquimotripsina la cual propone que la interaccion se lleva acabo en la
parte nucleofilica de ISA, mediante este estudio podemos confirmar que
los sitios propuestos son los propensos a sufrir un rompimiento.
y
•
Entonces estas moleculas analogas pueden ser inhibidoras de otro tipo
de serina proteasas.
En base a lo anterior se propone:
1. Realizar interacciones moleculares con las dem£s serina proteasas
pertenecientes al sistema del complemento ya que como todo resuitado
teorico no podemos asegurar que a nivel in vivo el anhfdrido isatoico
ataque unicamente al factor D, debido a que existen multiples proteinas
de tipo serina proteasas, tanto en el sistema del complemento como
otros.
2. Realizar estudios tedricos de compuestos utilizados en la industria
derivados del ISA para determinar su afinidad cop proteinas
indispensables en los sistemas bilogicos como las serina proteasas, y asf
obtener information sobre posibles inhibiciones.
f
38 \
11.
REFERENCIAS
1. Manual Merck en Espanol. 2007. Farmacodindmica. Estudio de los efectos
bioqufmicosy fisioldgicos de losfdrmacosy de sus mecanismos de action. (Disponible
en: http://manualmerck.tripod.com/MMCap300.htm. Consultado el: 6 de abril del
2008).
2. World Intellectual Property Organization. 2006. Mitodospara realizar simulationes
de acoplamiento molecular con receptores flexibles utilizando una nueva funcidn de
puntuatidn.
(Disponible
en:
http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=CU2006000003&
DISPLAY=STATUS.
Consultado el: 12 de mayo del 2008).
3. Coppola, G. M. 1980. The chemistry ofisatoic anhydride. Synthesis. 505.
4. Jing, H.f Badu, Y. S., Moore, D., Kilpatrick, J. M., Liu, X. Y., Volanakis, J. E., Narayana, S.
V. 1998. Structures of native and complexed complement factor D: implications of the
atypical His57 conformation and self-inhibitory loop in the regulation of specific
serine protease activity. J. Mol. Biol. 282:1061-1081.
5. Shvekhgeimer, M. G. 2001. Synthesis of Heterocyclic compounds based on isatoic
anhydrides (2H-3,l-Benzoxazine-2,4-diones). Chemistry of Heterocyclic Compounds.
Vol. 37.4:385-443.
6. Request Tecnical Bulletin INT4120, ISATOIC ANHYDRIDE. (Disponible en:
http://www.pmcsg.com/markets/intermediates/chem/ia.htm. Consultado el: 25
de mayo del 2008).
7. Chemie, B. G. 1992. Toxicological Evaluations
6.224:101-113.
8. Cutting, W. C., Rogers, J., Tabar, P. 1988. Antifertility effects ofisatioc anhydride and
Derivates. Med. Pharmacol. Exp. 15:7-16.
9. Otsuka, H., Hirai, Y., Nagao, T., Yamasaki, K. 1988. Anti-inflammatory activity of
benzoxazinoids from roots ofCoix lachryma-jobi var. ma-yuen. J. Nat Prod. 51:74-79.
10. Shinogi, M., Agha, B. J., Tsuji, K., Digenis, G. A. 1985. Antiprotease activity of some
carbamate derivatives. J. Pharm. Sci. 74:482-485.
11. Gelb, M. H., Abeles, R. H. 1986. Substituted isatoic anhydrides: selective inactivators of
trypsin-like serine proteases. J. Med. Chem. 29:585-589.
12. Moorman, A. R., Abeles, R. H. 1982. A new class of serine protease inactivators Based
on Isatoic Anhydride. J. Am. Chem. Soc. 104:6785-6786.
13. Babor, J. A., Ibarz, A. J. 1995. Qufmica general moderna. Mexico, D.F. Epoca. 824.
14. L6pez, D. A. 1995. Enzimas: La Fuente de la Vida. Barcelona. Edika Med. 69.
15. Deulin T. M. 2004. Bioqufmica. 4a ed. Mexico D.F. Reverte. 377-387.
16. Tesis doctoral de Carxa. Introduccidn: Las proteasas y su clasification. (Disponible
en:
http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-1105102171358//vcg2de7pdf. Consultado el: 6 de abril del 2008).
17. Abbas, A. K., Lichtman, A. H., Pober, J. S. 2002. Inmunologia celulary molecular. 3a ed.
Madrid. McGraw-Hill Interamericana. 329-347.
18. Parslow T. G. et al. 2002. Inmunologia basica y clinica. 10a ed. Mexico, D.F. El Manual
Moderno. 199-205.
19. Lezama P. A. 2007. Importancia del Sistema de Complemento. Rev. Med. Vallejiana.
vol.4.168-78. ISSN 1817-2075.
20. Abbas, A. K., Linchtman, AH. 2004. Inmunologia celulary molecular. 5 a ed. Madrid.
Elsevier. 326-343.
21. Porcel, J. M. Vergarin, D. 1993. Medicina clinica. Universidad autonoma. Barcelona.
428-435.
22. Ianez; P. E. 1999. Curso de inmunologia general. Universidad de granada. Espana.
23. Garcia, 0. E., Alonso, A., Mir6, M., Pena, J. 2003. Sistema del complemento.
Inmunologfaonline. Universidad de Cordova y Sweden Diagnostics. Espana.
24. Cuevas, G., Cortes, F. 2003. Introduccidn a la qufmica computacional. Primera
edition. Fondo de Cultura Econ6mica. Mexico. 2:215-227.
25. Cossio, F. P., Arrieta, A., Lecea, B. 2003. Aplicacidn de la quimica computacional a la
resolution de problemas qufmicos. Espana; 215-218.
26. Nicolas, V. M. I., Marin, C. C., Castro, M. F. M., Miranda, R. R. Algunos Aspectos Bdsicos
de la Qufmica Computacional. Mexico, D.F. UNAM.
27.
Wikiversidad.
2008.
Qufmica
computacional.
(Disponible
http://es.wikiversity.org/
wiki/Qu%C3%ADmica_computacional. Consultado el: 2 de abril del 2008).
28. Jensen, F. 1999. Introduction to computational chemistry. Wiley, New York.
en:
29. Uscanga, H. R. A. 2005. Estudio de la relation cuantitativa estructura actividad
(ERCEA) de derivados con actividad antifungica por tecnicas computacionales. Tesis
profesional. Universidad Veracruzana. Q.F.B.
30. Montero C. L. A. 2003. Modelos moleculares e hipersuperficies. Universidad de La
Habana. Cuba.
31. Casanovas, J., Armelin, E., Iribarren, J. I., Alemcin, C., Liesa, F. 2005. La modelizacidn
molecular como herramienta para el disefio de nuevos polfmeros conductores.
Polfmeros: Ciencia y Tecnologfa. vol. 15.4:239-244.
32. Jensen, F. 1999. Introduction to computational chemistry. Wiley, New York.
33. Diez, M. E.f Vera, R. 1998. Metodos de Estructura Electronica. (Disponible en:
http://www.cecalc.ula.ve/documentacion/tutoriales/gaussian/g94/nodel6.html.
Consultado el: 15 de mayo del 2008).
34. Young, D. Chem. 1998. Introduction to computational chemistry. Young. Chem. Aust
11,5.
35. Cjunto, H. J. A. Arroyo, C. J. La qufmica teorica y la qufmica cuantica
CSI. Boletfn 45.16-19.
computational.
36. Fernandez, G. I. 2004. Calculo de las derivadas de la energfa Ibre en disoluciones
empleando un metodo Quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) y la
aproximacidn del campo medio. Tesis doctoral. Universidad de Extremadura.
Departamento de qufmica. Badajoz. 37.
37. Morge R. J. F. 2006. Estudio computational de 1, 3, 5-triazinas sustituidas como
potenciales nucleobases. Tesis profesional. Universidad Veracruzana. Q.F.B. Xalapa,
Veracruz. 32.
38. Scior, T., Morales, E. M., Stefanon, E. S. 2007. Los Modulos in silico, una herramienta
para el conocimiento farmacoldgico. Elementos: Ciencia y Cultura. UNAM. 45-48.
39. Wikipedia, Encyclopedia libre. 2008. Docking (molecular). (Disponible en:
http://en.wikipedia.org/wiki/Docking_(molecular). Consultado el: 12 de mayo del
2008).
40. Badenas, F. G. 1993. Metodos computacionales de modelado molecular y disefio de
fdrmacos. Dpto. de Ffsica y Farmacologfa. Universidad de Alcaic de Henares Madrid.
253-327.
41. Palomino, M. 1999. Receptores de Fdrmacos. Dermatologfa Peruana. Vol. 9.1
42. Carmine Pascuzzo Lima. Mecanismos Moleculares de Action de los Farmacos.
(Disponible en: www.geocities.com/carminepascuzzolima/Mecanismos_Molecula
res_Drogas. consultado el: 8 de mayo del 2008).