3TM GENOMA herramientas 00

TEMA MONOGRÁFICO
GENÉTICA BÁSICA (I)
Herramientas básicas de análisis genético
J. Clàriaa, M. Sánchezb y R. Queraltc
a
Unidad de ADN. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Institut d´Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS).
b
Laboratorio de Genoma Humano. Facultad de Medicina. Universidad de Barcelona.
c
Servicio de Genética. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Barcelona.
E
l rápido desarrollo de la biología molecular en las dos últimas
décadas ha representado una revolución en la metodología
empleada en los laboratorios de análisis clínicos y de diagnóstico
biomédico. La consecuencia inmediata de este progreso ha sido no
sólo la reducción del número y volumen de muestras a analizar y la
automatización de la mayoría de las técnicas, sino también el desarrollo de programas de prevención que han contribuido de forma
significativa a mejorar la salud pública. El objetivo de este capítulo
es describir de forma resumida las herramientas básicas más utilizadas en el diagnóstico molecular y definir el estado actual de su
aplicación al análisis genético.
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Para realizar cualquier análisis genético debemos previamente aislar el material genético del paciente, el cual está formado por cadenas de ácidos nucleicos. Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el
ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN).
El ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células,
mientras que el ARN se encuentra en el citoplasma de las células.
Así pues, debemos partir de un material celular, ya sea sangre total
o muestra de tejido para aislar tanto ADN como ARN. Si partimos
de tejidos sólidos, tanto para el aislamiento de ADN como de
ARN, se debe fraccionar antes de la extracción del ácido nucleico.
Aunque en este capítulo nos centraremos en metodologías basadas en el análisis de ADN, a continuación se describen las principales características del aislamiento de ADN y ARN.
La extracción de ADN de las células se realiza mediante una incubación con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) que solubiliza los lípidos de membrana y la proteinasa K que degrada enzimáticamente las proteínas. Posteriormente, se separa el ADN de
las proteínas mediante precipitación salina o mediante extracción
con fenol-cloroformo. Una vez aislada la fase nucleica se precipita
con etanol absoluto y se eliminan las impurezas de sales con lavados de etanol al 70%. Finalmente, el ADN se resuspende en una
solución acuosa1.
La extracción de ARN es más compleja que la del ADN debido
a la alta estabilidad y actividad de las ribonucleasas, enzimas que
degradan el ARN. Por tanto, es muy importante trabajar con materiales y productos libres de ribonucleasas. El primer paso para el
aislamiento del ARN consiste en la lisis de las células en un medio
químico que destruya las ribonucleasas, como el tiocianato de guanidinio. Posteriormente, el ARN es separado de las demás macromoléculas en un gradiente de cloruro de cesio, precipitado con isopropanol, lavado con etanol al 75% y resuspendido en una solución
acuosa2.
AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada a
mediados de los años ochenta por Mullis3,4. A este bioquímico el
invento le valió el premio Nobel de Química en 1993, mientras
que a la empresa que en esos momentos estaba trabajando (la
compañía Cetus) le valió unos 300 millones de dólares al vender la
patente a la compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche. En tan
sólo 20 años la PCR se ha convertido en una de las técnicas de laboratorio más utilizadas y una de las más citadas en la literatura
científica.
La PCR es una técnica relativamente sencilla por la cual una cadena de ADN es amplificada millones de veces de un modo rápido
y preciso. La PCR es también una técnica altamente sensible que
permite la amplificación de ADN a partir de cantidades mínimas
de material (es posible amplificar una sola molécula de ADN). Estas características junto con su fácil aplicación y versatilidad, hacen
que la PCR sea una técnica sumamente útil no sólo en investigación básica, sino también en aplicaciones de interés clínico, como
el diagnóstico genético y la medicina forense.
A grandes rasgos, la PCR es un método in vitro de síntesis de
ADN por el cual cualquier fragmento de ADN puede ser replicado selectivamente. En la figura 1 se recoge un esquema resumido
del proceso de la PCR. En general, la reacción de PCR consiste en
la amplificación de un fragmento de ADN delimitado por dos oligonucleótidos cebadores (primers, fragmentos de ADN monocatenario de 15 a 25 bases) en repetidos ciclos de desnaturalización, hibridación (annealing) de los cebadores a la secuencia de ADN
complementaria y extensión de la nueva cadena mediante la actividad de la enzima ADN polimerasa5. Dado que cada miembro de
la pareja de cebadores se hibrida específicamente a cada una de las
dos cadenas complementarias de ADN, la síntesis de nuevas cadenas de ADN se restringe al fragmento de ADN delimitado por los
dos cebadores. A continuación se describe con más detalle cada
una de las etapas clave de la PCR.
Desnaturalización
Cuando se suministra calor a una cadena de ADN bicatenario, los
puentes de hidrógeno que estabilizan la doble hélice se rompen y
se separan las dos cadenas de ADN. Por esta razón, en la primera
etapa de la PCR se aplica calor (94 °C, 1 min) a la muestra para separar las dos cadenas complementarias de ADN (fig. 1).
Hibridación
Si la solución que contiene el ADN se deja enfriar (a temperaturas que suelen ir desde 40 a 60 °C durante 30-60 s) se logra la
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5’
3’
3’
5’
5’
3’
Desnaturalizar
Hibridar
cebadores
Cebador
Cebador
Cadena original
1
3’
5’
Extender nueva cadena
2
Desnaturalizar
Hibridar cebadores
Extender nueva cadena
Desnaturalizar
Hibridar cebadores
3
Extender nueva cadena
Desnaturalizar
Hibridar cebadores
4
Extender nuevas cadenas
Desnaturalizar
Hibridar cebadores
5
Extender nuevas cadenas
Ciclo
Figura 1 Diagrama esquematizado del proceso de la PCR. El material de partida es un ADN de doble cadena.
En primer lugar (ciclo 1), las cadenas se desnaturalizan y se hibridan los cebadores específicos,
los cuales flanquean la región de ADN a amplificar (representada entre líneas discontinuas).
A continuación la Taq polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN a partir del cebador específico. En el segundo ciclo (ciclo 2) se desnaturalizan las cadenas, se hibridan los cebadores específicos y se sintetizan nuevas hebras de ADN. A partir del ciclo 3 y en continuos ciclos de desnaturalización-hibridación-extensión se amplifica exponencialmente el fragmento de ADN de interés. En
este esquema y a partir de los ciclos 1 y 2, no se representan las cadenas originales, las cuales se
amplifican de forma no exponencial y, por tanto, no contribuyen de forma significativa en el producto final.
hibridación de la pareja de cebadores específicos a las cadenas
de ADN gracias a la complementariedad de sus bases a las regiones flanqueantes del ADN a amplificar (fig. 1). Cada uno de
los cebadores se hibrida a una hebra distinta, de forma que ambos presentan su extremo 3’ hacia el interior de la región a amplificar.
Extensión
Es la elongación de las cadenas de ADN mediante la actividad de
la ADN polimerasa. En presencia de una ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa de Thermus aquaticus), de deoxinucleótidos trifosfato (dNTP) en concentraciones saturantes, magnesio y
otros cofactores en un tampón apropiado y a 72 °C (temperatura óptima
de polimerización de la Taq) durante
1 min aproximadamente, las dos hebras de ADN son copiadas a partir de
los cebadores específicos (fig. 1). Así,
se obtienen dos productos mixtos con
regiones de cadena doble y sencilla,
que poseen en común un segmento
de doble cadena, la región diana a
amplificar.
Si en un segundo ciclo se repite
todo el proceso de desnaturalización-hibridación-extensión, se obtendrán cuatro moléculas de ADN de la
región diana amplificada. A partir de
aquí en cada ciclo se duplica el número de copias de la región diana. El
resultado final es una acumulación
exponencial del fragmento de ADN
amplificado. Es decir, se obtienen
aproximadamente 2n copias, siendo n
el número de ciclos de amplificación
realizados. El termociclador es el
aparato que de forma automática realiza esta secuencia de acontecimientos durante el número de ciclos deseado.
Aunque la PCR, tal como apuntamos anteriormente, es una técnica rápida, sencilla y de fácil aplicación,
también posee algunos inconvenientes. Entre los más importantes cabe
citar la fidelidad de la Taq polimerasa
que no siempre es del todo precisa
(se ha estimado que incorpora de 1 a
2 errores por cada 10.000 bases) y la
fácil contaminación de los reactivos
(p. ej. mediante la formación de aerosoles en las puntas de las pipetas dispensadoras).
CLONACIÓN MOLECULAR
La clonación molecular consta básicamente de dos procesos: la creación de
una construcción o construct y la introducción de dicha construcción
dentro de una célula eucariota o procariota. Una construcción se compone de un vehículo, denominado vector, donde insertaremos un
fragmento de ADN obtenido normalmente mediante PCR. Seguidamente, se introduce esta construcción en una célula para generar múltiples copias idénticas.
Un vector es una construcción artificial de ADN que contiene los elementos necesarios para replicarse en el interior de la
célula, como un ente independiente del genoma celular, cuando ésta se divida. Un vector consta de un origen de replicación
que permite la multiplicación dentro de la célula, un sitio de
clonación, o multicloning site, que es la zona donde se inserta el
fragmento de interés y de un gen de resistencia a un antibiótico
(ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc.) que nos permitirá se-
Estándar
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Digerido
GENÉTICA BÁSICA (I)
No digerido
TEMA MONOGRÁFICO
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y
ELECTROFORESIS
ADN
ADN
En 1970 Smith et al descubrieron que algunas enzimas de ciertos microorganismos corOrigen
taban el ADN en determinados puntos de su
secuencia6. Estas enzimas son las endonucleTTGA
asas de restricción o enzimas de restricción y
AACT
se denominan según las iniciales del microor420 pb
ganismo del que proviene, seguido de la va506 pb
riedad de la especie y de un número romano
396 pb
si existe más de una enzima aislada de un
298 pb
280 pb
mismo tipo de bacteria (p. ej., Hind III proTCGA
viene de Haemophilus influenzae variedad
AGCT
Rd y es la tercera enzima que se aisló). El lu154 pb
gar que reconoce y corta una determinada
140 pb
134 pb
enzima de restricción se denomina diana de
restricción. Algunas de estas dianas presentan
Enzima de restricción
Gel de agarosa
la característica de ser palindrómicas, es decir, que leyendo la secuencia nucleotídica en
Electroforesis
sentido 5’-3’ obtenemos lo mismo que en
Figura 2 Enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa. La figura representa un frag- sentido 3’-5’ (fig. 2, TCGA).
mento de PCR de 420 pb que contiene la diana de restricción TCGA, que es cortado en 2
El proceso de cortar el ADN con una enzifragmentos de 140 y 280 pb por una enzima de restricción (simbolizado por unas tijeras). ma de restricción se denomina digestión. PaSi no existe la diana de restricción, la enzima no podrá actuar y obtendremos un único
ra realizar una digestión de un fragmento de
fragmento de 420 pb. Los fragmentos de ADN se visualizan en un gel de agarosa teñido con
ADN normalmente basta añadir la enzima de
bromuro de etidio. El tamaño de los fragmentos se estima mediante la extrapolación de la
restricción y un tampón adecuado e incubar
distancia recorrida en el gel por fragmentos de ADN de tamaño conocido (estándar).
la mezcla a la temperatura requerida por la
enzima. Finalmente, se analiza la muestra
leccionar positivamente aquellas células que han incorporado el
cargándola en una matriz o gel de agarosa o poliacrilamida y somevector.
tiéndola a un campo eléctrico (electroforesis) (fig. 2). De forma
Para realizar una construcción circular debemos tener el vector
breve, la electroforesis consiste en aplicar sobre el gel de agarosa o
linearizado, es decir, cortado o digerido con una enzima de restricpoliacrilamida un campo eléctrico donde el polo positivo se sitúa
ción que presente una diana única en el sitio de clonación del vecen el extremo contrario al sitio de carga de la muestra; de este motor. Posteriormente, se inserta el fragmento de interés entre los dos
do, la muestra, que es ADN y posee carga negativa, se desplaza
extremos del vector, proceso que se denomina ligamiento. De esta
por el interior del gel en dirección al polo positivo (fig. 2). Es neceforma, una vez incorporado el fragmento de interés al vector, volvesario añadir a las muestras un colorante que nos permita visualizar
mos a tener una construcción circular. De forma muy resumida, la
su localización aproximada. Las moléculas de ADN se visualizan
reacción de ligamiento incluye el vector linearizado, el fragmento a
por tinción con bromuro de etidio, compuesto que se intercala enclonar, la ligasa o enzima que los unirá y el tampón de la ligasa que
tre las bases del ADN y emite fluorescencia cuando es estimulado
aporta los iones necesarios para que la enzima funcione.
con radiación ultravioleta. Para tener una referencia del tamaño de
Una vez insertado el fragmento de interés en el vector, se introlos productos de digestión, en uno de los carriles del gel se carga
duce toda la construcción en el interior de una célula eucariota o
un estándar o marcador, que consiste en un conjunto de fragmenprocariota, proceso que se denomina transformación. Normalmentos de ADN de longitud (en pares de bases, [pb]) conocida (fig. 2).
te, se utilizan células procariotas, como la bacteria Escherichia coli,
debido a que crecen con más rapidez y con menos requerimientos
nutricionales que las células eucariotas. Existen diferentes métoSECUENCIACIÓN DE ADN
dos de transformación, siendo los más utilizados la electroporación, el choque térmico y la transfección mediada por virus o por
Las técnicas de secuenciación de ADN se desarrollaron a finales
de los años setenta y revolucionaron de forma significativa el munliposomas. En la electroporación sometemos a las células a una
do de la genética molecular. Originalmente, se describieron dos
descarga eléctrica, mientras que en el choque térmico las sometemétodos de secuenciación de ADN: el método de Maxam y Gilmos a un cambio de temperatura. Ambos procedimientos generan
poros en las membranas de las células permitiendo que la consbert7 y el método de Sanger et al8. Mientras que el método de Matrucción se introduzca en el interior de ellas. En la transfección
xam y Gilbert está basado en la degradación química de la cadena
utilizamos virus para infectar o liposomas para fusionar las células
original de ADN, el método de Sanger et al se basa en la síntesis
e introducir nuestra construcción.
de una nueva cadena de ADN mediante la actividad enzimática de
Una vez transformada, la propia maquinaria celular se encargauna ADN polimerasa. Aunque ambos métodos producen poblará de realizar múltiples copias de la construcción. Para recuperar
ciones de fragmentos marcados (originalmente con radioactividad)
estas copias será necesario lisar las células y purificar nuestra consde distinta longitud, los cuales son separados por electroforesis en
trucción. Las miles de copias de nuestro fragmento de interés se
un gel de poliacrilamida, en la práctica el método enzimático de
utilizarán para otras aplicaciones como, por ejemplo, sondas para
Sanger et al es el más popular y el más utilizado para secuenciar
Southern o Northern blot, para realizar estudios de transcripción
ADN de forma rutinaria. En los últimos años, el método original
y/o traducción in vitro, etc.
de Sanger et al se ha modificado y mejorado sustancialmente, sien-
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Cebador
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ADN a secuenciar
ADN polimerasa
dNTP
Terminadores (ddNTP)
PCR
Gel de poliacrilamida
Electroferograma
Figura 3 Secuenciación de ADN. La reacción de secuenciación consta de la
muestra de ADN a secuenciar, un cebador (sense o antisense),
una ADN polimerasa, deoxinucleótidos (dNTP) y terminadores dideoxinucleótidos (ddNTP), acoplado cada uno de ellos a un fluorocromo característico. Durante el proceso de la PCR, estos
terminadores se incorporan a la nueva cadena de ADN, generando fragmentos de tamaño variable. Estos fragmentos se separan en un gel de poliacrilamida y la señal emitida por cada uno
de ellos da lugar a un pico característico del electroferograma.
do los cambios más importantes la sustitución de la radioactividad
por marcadores fluorescentes y la aplicación de la PCR. A continuación se describen a grandes rasgos las principales características del método de Sanger et al.
Método de Sanger et al
El método enzimático de Sanger et al está basado en la incorporación de terminadores dideoxinucleótidos (ddNTP) a una nueva cadena de ADN mediante la actividad de una ADN polimerasa.
Aunque los ddNTP se incorporan a la nueva cadena de la misma
forma que se incorporan los deoxinucleótidos convencionales
(dNTP), difieren de éstos porque carecen del grupo 3’-OH necesario para la elongación de la cadena. Por esta razón, cuando se incorpora un ddNTP a la nueva cadena creciente de ADN, la ausencia del grupo hidroxilo evita la formación del puente fosfodiéster
con el siguiente dNTP y la elongación de la cadena se termina en
ese punto. En la práctica, cada uno de los cuatro ddNTP se combina con una mezcla de los cuatro dNTP convencionales en presencia de la ADN polimerasa y de un cebador (primer) específico. En
el método original, cada uno de los cuatro ddNTP se empleaban
en cuatro reacciones distintas en presencia de un dNTP marcado
radiactivamente, de forma que se obtenían poblaciones de ADN
de distinta longitud de nucleótidos. Los fragmentos radiactivos obtenidos se separaban en un gel de poliacrilamida y la secuencia de
ADN completa se determinaba mediante autorradiografía.
Como ya se ha comentado anteriormente, el método enzimático
de Sanger et al es el método de secuenciación más utilizado en la
actualidad, pero con importantes modificaciones. En este sentido,
la incorporación de la PCR ha dado lugar a lo que se denomina secuenciación cíclica. En la secuenciación cíclica y al igual que en el
método original de Sanger et al, se copia la cadena original de
ADN a partir del cebador hasta el lugar de incorporación del
ddNTP por la ADN polimerasa. La diferencia radica en que en la
secuenciación cíclica, esta reacción tiene lugar de 20-30 veces en
un termociclador, lo cual resulta en la generación de múltiples copias de los fragmentos, lo que amplifica enormemente la señal y
facilita su detección. Otras modificaciones importantes del método
original de secuenciación son la sustitución de la radiactividad por
fluorocromos y la automatización de su detección y análisis mediante secuenciadores automáticos de ADN. Así, en el método
actual la fluorescencia suele estar asociada a los terminadores
ddNTP (cada terminador esta asociado a un fluorocromo distinto), los cuales se incorporan a la nueva cadena de ADN mediante
la amplificación cíclica usando la actividad de la Taq polimerasa
(fig. 3). Los nuevos fragmentos de ADN se separan en un gel de
poliacrilamida y la señal emitida por cada uno de los fluorocromos
al ser excitados por un láser es captada por unos detectores y analizada mediante soporte informático (fig. 3). Las principales ventajas
de la secuenciación automática son la gran flexibilidad en la utilización de cualquier cebador (normalmente es uno de los dos usados
para amplificar el ADN por PCR) y que los errores de lectura causados por falsas paradas de la ADN polimerasa no se detectan, ya
que no incorporan fluorescencia. Además, y puesto que cada terminador lleva asociado un distinto fluorocromo, el número de tubos a manejar se divide por cuatro mientras que el número de
muestras a secuenciar en un mismo gel se multiplica por cuatro.
SSCP Y RFLP
El análisis de SSCP (single strand conformation polymorphism) es
una de las técnicas mas empleadas para la detección de mutaciones del ADN. Es la técnica de elección cuando se conoce el gen
responsable de una enfermedad pero se desconoce la situación de
la mutación y hay que analizar un gran número de muestras. La
técnica se basa que en condiciones no desnaturalizantes, el ADN
de cadena sencilla adopta una conformación dependiente de su secuencia. La región de ADN a analizar se amplifica por PCR, la doble cadena generada se desnaturaliza por calor y, seguidamente, se
analizan las cadenas sencillas por electroforesis en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Si el fragmento de ADN amplificado
es portador de una mutación, la movilidad de las cadenas sencillas
diferirá respecto a la de un control normal, generando un patrón
anómalo de migración. Las condiciones de electroforesis permiten
discriminar entre dos moléculas que difieran en un solo
nucleótido9. Los productos de PCR deben oscilar entre 200 y 400 pb.
La confirmación del cambio de nucleótido y su situación se determinará posteriormente mediante secuenciación.
El análisis de RFLP (restriction fragment length polymorphism) es
la metodología empleada para el análisis de polimorfismos de longitud
del ADN de los fragmentos de restricción. El ADN genómico a analizar se corta con las enzimas de restricción de interés y a continuación
el ADN cortado se separa mediante electroforesis en un gel de agarosa. El gel se incuba en una solución desnaturalizante para obtener las
dobles hebras desnaturalizadas y los fragmentos separados se transfieren a una membrana mediante la técnica conocida como Southern
Blot10. La membrana se hibrida con una sonda específica (fragmento
de ADN marcado) dando lugar a distintos fragmentos a analizar. Esta
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A
Cebador
CACACGTGCAC
PCR (cebadores fluorescentes
CTGCACTTTGACAGGGATA CACACACACACACACACA TACGTAGCCGTATACCGG
GACGTGAAACTGTCCCTAT GTGTGTGTGTGTGTGTGT ATGCATCGGCATATGGCC
Core
Cebador
B
H1
P
M
P
S
D
M: madre
H1
H2
P
E
H2
P: padre
H1, H2: hijos
T
S: sangre
T: tumor
GTGTGCACGTG
CACACGTGCAC
Figura 4 Microsatélites. A) Secuencia de un microsatélite. La repetición
(CA)n se halla dentro del rectángulo. B) Patrón electroforético
de una herencia normal biparental. H1: heterozigoto; H2: homozigoto. B) Patrón electroforético de un desequilibrio cromosómico.
H1: trisomía (dos alelos maternos y un alelo paterno); H2: monosomía (un alelo paterno y pérdida del alelo materno). D) H1: herencia uniparental materna; H2: herencia uniparental paterna;
E: pérdida de heterozigosidad (pérdida de un alelo).
C
técnica se ha utilizado para el análisis del ADN polimórfico (ADN repetido). Con la introducción de la PCR el análisis de RFLP por
Southern Blot se ha sustituido por el análisis de microsatélites.
ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES
El análisis de microsatélites, o STR (short tandem repeats), consiste en la amplificación por PCR de una región de ADN genómico
no codificante que contiene una secuencia polimórfica (core) repetida n veces11 (fig. 4A). En función del número de nucleótidos repetidos distinguimos los microsatélites del tipo dinucleótido (CA)n,
trinucleótido (TGA)n, tetranucleótido (TAGA)n y pentanucleótido
(TAGAG)n. Para un microsatélite determinado, el número de repeticiones (n) es variable entre individuos y, por tanto, el tamaño
del fragmento amplificado será distinto. Con la posterior separación electroforética en un gel de poliacrilamida desnaturalizante se
obtendrá un patrón de bandas alélico, polimórfico y propio de cada individuo. Para la elección de un microsatélite se debe tener en
cuenta una serie de condiciones: una alta heterozigosidad (porcentaje de individuos con dos alelos de distinto tamaño), un elevado
número de alelos, una secuencia polimórfica regular, unos alelos
fácilmente distinguibles y una buena amplificación por PCR.
Para un determinado microsatélite y un determinado locus se
produce la amplificación de dos alelos, uno de cada progenitor.
Estos alelos pueden ser de distinto tamaño (heterozigoto) (fig. 4B
[H1]), o bien del mismo tamaño (homozigoto), en este caso se visualiza una sola banda de doble intensidad (fig. 4B [H2]). Las utilidades del análisis de microsatélites son bien conocidas para la
identificación de individuos en genética forense. En genética clínica se utiliza para el diagnóstico de duplicaciones cromosómicas,
como el síndrome de Down, que estudia el origen parental y meiótico de la no disyunción del cromosoma 21 (fig. 4C [H1])12. También se utiliza en el análisis de microdeleciones cromosómicas, co-
T
G
GTGTGAACGTG
M
C
H2
GTGTGGACGTG
H1
CACACGTGCAC
GTGTGTACGTG
M
)
A
Figura 5 Chips de ADN. En este esquema se representa un chip de ADN
utilizado para estudiar la existencia de mutaciones puntuales
en un gen. Un chip de ADN es una matriz sólida donde se hallan
inmovilizados miles de fragmentos de ADN diferentes (normalmente oligonucleótidos). La región del gen a analizar se amplifica
por PCR en presencia de cebadores acoplados a un fluorocromo,
y el fragmento obtenido se hibrida a la matriz conteniendo la
secuencia de ADN complementaria inmovilizada. Según en qué
posición de la matriz se detecte la fluorescencia podremos discernir qué nucleótido ocupa esa posición en nuestra muestra de
ADN.
mo el síndrome de Williams (microdeleción de la región
7q11.23)13 y el síndrome velo-cardio-facial (microdeleción de la región 22q11.2)14, donde se estudian los locus delecionados y el origen parental de la deleción (fig. 4C [H2]). El análisis de disomía
uniparental estudia la herencia de un determinado par de cromosomas de un solo progenitor, sin contribución del otro progenitor,
dando lugar a distintos síndromes como el de Angelman y el de
Prader Willi debido a una duplicación paterna y materna, respectivamente, del cromosoma 15 (fig. 4D [H2, H1])15,16. El análisis de ligamiento de una familia estudia la cosegregación de determinados
alelos con el fenotipo de una enfermedad y, por último, el análisis
de pérdida de heterozigosidad (LOH: Loss of heterozygosity), estudia en un mismo individuo y para un locus determinado la pérdida de un alelo en un tejido tumoral respecto a la presencia bialélica en otro tejido no tumoral (fig. 4E).
CHIPS DE ADN Y OTRAS TECNOLOGÍAS
DE FUTURO
Una de las constantes de los métodos de biología molecular es
la tendencia a disminuir el volumen de reacción y de miniatu-
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rizar todos los procesos, de forma que sea posible analizar el
máximo número de muestras en el mínimo espacio y volumen.
Éste es el concepto básico de la tecnología de microarrays y
chips de ADN: analizar miles de genes y variantes genéticas de
forma rápida y en un volumen de reacción del orden de nanolitros.
Un array es una matriz donde se ordenan un gran número
de muestras. Un microarray es una matriz que contiene miles de
muestras ordenadas cada una de ellas en puntos de 200 µm de diámetro. A grandes rasgos, existen dos tipos de microarrays. En primer lugar, los microarrays propiamente dichos donde diversos
fragmentos de ADN (normalmente cADN) se hallan inmovilizados en una superficie sólida, como por ejemplo en un portaobjetos de vidrio o una membrana de nailon. Por otra parte, existen los
denominados DNA chip microarrays, donde el ADN en forma de
oligonucleótidos se halla inmovilizado en una placa de silicona
de forma similar a los chips de informática o microprocesadores.
En ambos casos el procedimiento analítico es el mismo: el ADN
aislado de la muestra a analizar se marca con fluorescencia y se hibrida (a temperatura y condiciones ya establecidas) a la matriz
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conteniendo el ADN complementario inmovilizado (fig. 5). Las
dos principales aplicaciones de los microarrays y chips de ADN
son la detección de las mutaciones/polimorfismos más habituales
de una enfermedad y el análisis de las diferencias en el grado de
expresión de un determinado gen. En el primer supuesto, el material de partida será ADN genómico, mientras que en el segundo caso el material a analizar es el cARN obtenido a partir del
cADN sintetizado por retrotranscripción del ARNm original de la
muestra.
La aplicación de la tecnología de microarrays y chips de ADN al
análisis del genoma humano se denomina de forma genérica como
genómica. De forma similar, la aplicación de esta tecnología al estudio de la expresión proteica recibe el nombre genérico de proteómica. Bibliografía
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