respuesta al problema bioquímico

REB 22(3): 158-160
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RESPUESTAS
AL
PROBLEMA BIOQUÍMICO
Los estudios de inhibición por producto son uno de
los enfoques más comúnmente utilizados en la determinación del mecanismo cinético de una enzima, debido a que a partir de estos se puede deducir el orden
de unión de los substratos y de liberación de los productos en ambos sentidos de la reacción.
Para estos experimentos las velocidades iniciales
se determinan de manera usual pero se utilizan diferentes concentraciones fijas de inhibidor (incluyendo cero) en la mezcla de reacción y concentraciones
saturantes o no saturantes del substrato fijo variable.
Cabe enfatizar que la concentración del substrato fijo
debe cuidarse, pues puede modificar el patrón de inhibición por producto. En el caso de la enzima málica
presentamos los resultados de los experimentos a concentraciones no saturantes del substrato fijo (1).
El tipo de inhibición por producto se puede determinar fácilmente al analizar el efecto del inhibidor
sobre la pendiente y el intercepto sobre el eje vertical
(ordenada al origen) de gráficas de dobles recíprocos.
Un producto (P) actuará como un inhibidor competitivo con respecto a un substrato variable (S) solamente si P y S son mutuamente excluyentes, lo cual
implica que P y S compiten por la misma forma de la
enzima o si P se une antes que S en una secuencia
ordenada para dar lugar a una forma de la enzima
que no une S (2). En este caso solamente la pendiente del gráfico de dobles recíprocos se ve afectada,
pero no la ordenada al origen al variar la concentración del producto (Tabla IIA).
Si en el gráfico de dobles recíprocos los interceptos sobre el eje vertical son los que se modifican y no
la pendiente al aumentar la concentración de producto, se obtendrá una serie de líneas paralelas que corresponden al patrón gráfico de un inhibidor de tipo
incompetitivo (Tabla IIB). P será un inhibidor
incompetitivo con respecto a S solamente si S debe
unirse antes que P en la secuencia de reacción (2).
En este caso P y S no son mutuamente excluyentes
porque se unen a diferentes formas de la enzima y no
están interconectados por pasos reversibles porque
existen entre ellos pasos que experimentalmente no
se llevan a cabo (ver explicación más adelante).
P actuará como un inhibidor mixto o no competitivo con respecto a S si P y S son mutuamente
excluyentes y P puede unirse antes que S (2). En este
caso tanto las pendientes como los interceptos se
incrementan al aumentar la concentración de producto
y las líneas convergen en un punto a la izquierda del
eje vertical, ya sea por arriba, en o debajo del eje
horizontal, incluso pueden no cruzarse en el mismo
punto (Tabla IIC). Es conveniente aclarar que se puede clasificar a un compuesto indistintamente como
inhibidor no competitivo o como inhibidor mixto. Algunos autores consideran un inhibidor no competitivo a aquél en el que las líneas de dobles recíprocos
se cruzan sobre el eje de las equis y al resto de los
patrones de cruce (por encima o por debajo) los definen como mixtos (2). Sin embargo, Cleland (3) considera que no existe una justificación teórica sólida
que permita distinguir entre ambos tipos de
inhibidores, por lo cual define como inhibidor no
competitivo a cualquier compuesto que modifique
tanto interceptos (1/Vmáx) como pendientes (Km/
Vmáx) en el gráfico de dobles recíprocos al aumentar su concentración.
Una vez revisados estos antecedentes, podemos definir el mecanismo cinético de la enzima málica analizando los patrones de inhibición por producto que
se muestran en la Tabla I. En el caso de la enzima
málica el producto NADH es un inhibidor competitivo con respecto al sustrato variable NAD+, lo cual
indica que estas dos moléculas se unen a la misma
forma de la enzima. Con esta evidencia podemos proponer que ambas moléculas sólo se pueden unir a la
enzima libre (E), es decir, en la reacción forward de
la enzima málica el NAD+ es el primer sustrato que
se une y el NADH es el último de los tres productos
en liberarse.
Con esta información se puede concluir que el
malato se une en segundo lugar. Para apoyar esta propuesta en la secuencia de unión de los substratos se
analiza el tipo de inhibición del NADH con respecto
al malato. Si el malato es el segundo substrato en
unirse, eso implicaría que el NADH y el malato se
unen a diferentes formas de la enzima (E y ENAD+
respectivamente), y en consecuencia, el NADH
inhibiría la reacción de manera no-competitiva con
respecto al malato. Además el malato y el NADH
pueden estar conectados reversiblemente debido a que
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TABLA II
PATRONES GRÁFICOS DE DOBLES RECÍPROCOS Y DEFINICIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS
Vmáxap
(Vmáx/Km)ap
PATRÓN GRÁFICO
↑
TIPO DE INHIBICIÓN
A. Competitivo
Vmáx
[P]
(Vmáx/Km)
(1+ I/Kic)
↑
[P]
B. Incompetitivo
Vmáx
Vmáx/Km
Vmáx
Vmáx/Km
(1+ I/Kiu)
(1+ I/Kic)
[P]
↑
C. No competitivo
o mixto
↑
↑
(1+ I/Kiu)
[P]
Vmáxap (Velocidad máxima aparente) y (Vmáx/Km)ap (Constante de especificidad) para cada tipo de inhibición. P = concentración de inhibidor;
Kic = constante de inhibición competitiva; Kiu = constante de inhibición incompetitiva.
existe una secuencia ordenada estricta desde la liberación del NADH hasta la unión del malato al complejo enzima-NAD +. La interconexión entre un
substrato y un producto por pasos reversibles conduce a una competencia, indirecta, por la enzima. Por
lo tanto esperaríamos que el NADH fuera un inhibidor
no competitivo (o mixto) con respecto al malato como
se muestra en la Tabla I. Con los datos analizados
podemos proponer un esquema cinético parcial de la
reacción de la enzima málica (Esquema I).
Varela Gómez M
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NAD+
↓
malato
↓
ENAD-malato ↔ ENADH-piruvato-HCO–3
ENAD+
E
?
↑
?
↑
NADH
↑
ENADH
E
Esquema I. Diagrama de Cleland obtenido a partir de los patrones de inhibición por producto del NADH con
respecto a los dos sustratos.
Para determinar el orden de liberación de los otros
dos productos (HCO3– y piruvato) es necesario analizar sus patrones de inhibición con respecto a ambos
substratos. De acuerdo con los datos que se presentan
en la tabla I, el HCO3– es un inhibidor no competitivo
con respecto a ambos substratos. Este patrón de inhibición indica que este producto se une a una forma
diferente de la enzima a la que se unen los substratos,
pero las cuales están interconectados por pasos
reversibles. Por otro lado, el piruvato es un inhibidor
de tipo incompetitivo con respecto a ambos sustratos.
Esto sugiere que el piruvato se une a una forma de la
NAD+
↓
E
malato
↓
ENAD+
enzima diferente a la que se unen los sustratos, pero a
diferencia de lo que se determinó para el HCO3, no
existen pasos reversibles que interconecten directamente a las formas de la enzima que unen los sustratos y al
piruvato. La explicación de que no existan pasos
reversibles entre la liberación del piruvato y la unión
del NAD+ y el malato es que entre estos eventos se
produce la liberación de otro producto.
Finalmente, con este análisis podemos proponer
que el HCO3– es el primer producto que se libera y el piruvato el segundo. Por lo tanto el esquema de Cleland
final para la enzima málica es el siguiente:
HCO–3
↑
piruvato
↑
ENAD-malato ↔ ENADH-piruvato-HCO–3 ENADH-piruvato
NADH
↑
ENADH
E
REFERENCIAS
1. Hsu RY, Lardy HA, Cleland WW (1967) JBC 242, 5315.
2. Segel, H I. (1975). Enzyme Kinetics. John Wiley and Sons, New York, USA pp 342-344
3. Cleland, W W (1970) Steady State Kinetics. En: The Enzymes volumen 2. Editor: Boyer PD.
Academic Press., New York pp 1-65
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