Prácticas integradas de Ecología molecular microbiana

Prácticas integradas de Ecología molecular
microbiana
Indice.
Página
1. Introducción
1
2. Cronograma
1
3. Esquema de trabajo
2
4. Reactivos utilizados
3
5. Preparación de las Muestras
3
6. Hibridación “in situ” con sondas fluorescentes (FISH)
5
7. Extracción del ADN
7
8. Amplificación por PCR
8
9. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
10
10. Amplificación del gen del ARNr 16S para la construcción de genotecas
16
1. Introducción
Las técnicas de microbiología tradicionales requieren la obtención de cultivos puros (lo que no
siempre es posible) y múltiples ensayos de laboratorio, por lo que son poco adecuadas para
estudiar la biodiversidad de un ecosistema. Durante la década de los 90’ se desarrollaron una
serie de técnicas de biología molecular que han supuesto una revolución en el campo de la
Ecología microbiana. Dichas técnicas, basadas en el 16S rRNA, permiten estudiar la
biodiversidad microbiana de un ecosistema sin necesidad de proceder al aislamiento de las
especies que lo integran.
En estas prácticas vamos a emplear tres de las principales técnicas aplicables a estudios de
ecología molecular microbiana: la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante
(DGGE/TGGE), la hibridación in situ con sondas de DNA marcadas con un cromóforo
fluorescente (FISH), y la construcción y rastreo de genotecas. Se trabajará con muestras
naturales (suelo) y artificiales: flóculos de la depuradora de fangos activos de la UAM (aerobia)
y biomasa (lodo granular) un reactor UASB (anaerobio).
2. Cronograma
Este grupo de prácticas se estructura en cinco sesiones intensivas de laboratorio (4-6 horas de
duración), más una sesión teórica previa y una sesión de análisis de resultados posterior.
1ª Sesión.

Fijación de las muestras para FISH (lo harán los monitores por la mañana)

Preparación de las muestras

Extracción y limpieza del DNA

Análisis del DNA en gel de agarosa.

PCR gen 16S rRNA utilizando cebadores universales para los dominios Bacteria (para
genoteca) y Archaea (para PCR anidada). Dejar overnight.

Lavado de las muestras para FISH.
2ª Sesión

PCR utilizando cebadores universales para los dominios Bacteria y Archaea (para DGGE,
fragmento del gen 16S rRNA). Si es posible, hacer PCR directa y anillada.

Preparar y correr gel de agarosa para analizar productos PCR de la primera sesión.

Preparar geles de agarosa para analizar la PCR para DGGE.

FISH: observar mediante contraste de fases o tras tinción con DAPI para ver dilución
adecuada para conteo.
1

Clonación: ligación para hacer una genoteca. Dejar overnignt.
3ª Sesión

Preparar las placas LB

Clonación: transformación y plaqueo en placas LB-Amp

Preparar gel DGGE

Correr gel de agarosa para analizar la PCR para DGGE

FISH: fijar las muestras en portas.

Recoger y guardar placas genoteca
4ª Sesión

FISH: hibridación y lavado

Picar colonias genoteca en placa maestra. Cálculo eficiencia clonación.

Correr DGGE (o.n.)
5º Sesión

Revelar y ver DGGE

Observación revertientes

Análisis microscópico (cuantificación) de las hibridaciones del FISH
.
3. Esquema de trabajo.
MUESTRA
Extracción de ADN
Hibridación in situ
PCR
DGGE
Genoteca
2
4. Reactivos utilizados.
CBM
29-HindIII ADN
4,6-diamino-2-fenol-dihidrocloruro (DAPI)
MERCK
Acrilamida / bisacrilamida (40%) (37,5:1)
BIORAD
Acido clorhídrico
MERCK
Acido bórico
GIBCO-BRL
Agarosa
SIGMA
Bromuro de etidio
SIGMA
Citifluor AF-1
CITIFLUOR Ltd.
Cloruro sódico
MERCK
dNTPs
PHARMACIA
Dodecilsulfato sódico (SDS)
MERCK
EcoRI
BIOLABS
Etanol
MERCK
Formaldehído
MERCK
Formamida
PHARMACIA
Sau3AI
BIOLABS
Taq-polimerasa
PROMEGA /BIOTOOLS
Tritiplex III (EDTA)
MERCK
Tris-Trizma Base
SIGMA
Sondas FISH: ver tabla.
Cebadores 341f-GC, 622fGC, 907r, 1492r, 27f, 948f, BIOTOOLS/ TAPER
1492r
Kit Fast DNA kit for soil BIO101
QUIAGEN
Kit Microcon-Centrifugal filter devices
MILLIPORE
Kit pGEMT-Easy vector
PROMEGA
Ampicilina
BRITEPEN
Células competentes
CBM
Agar
PRONADISA
X-gal
DUCHEFOR
5. Preparación de las muestras.
Las muestras serán preparadas según sus características físicas y su procedencia. Puesto que
las muestras para hacer FISH deben fijarse en el momento de su recogida, los procedimientos
descritos a continuación se realizarán con dos alícuotas independientes: una fijada en
formaldehído (para hacer FISH, protocolo 6) y otra sin fijar (para extraer DNA, protocolo 7).

Muestra de suelo o lodo de depuradora.
Para extracción de DNA:
1. Pesar aproximadamente 0,5 – 2 g, resuspender en 5 mL de NaCl 0,9%
2. Disgregar por sonicación (potencia media 0.50 w,
frecuencia constante, durante 3
minutos). Agitar la muestra en el vortex durante 10 minutos.
3. Dar un pulso de centrífuga para eliminar el material inerte grueso y quedarse con el
sobrenadante.
3
4. Centrifugar éste a 5000 rpm durante 10 minutos y tomar el pellet (desechar el
sobrenadante).
5. Resuspender el pellet en 1000 l de PBS 1X1. Guardar a 4°C.
Para FISH:
Las muestras se entregarán fijadas. Lo más habitual es hacerlo con formaldehído (el
concentrado está al 37%) a una concentración final del 4% (v/v) en PBS. El tiempo de
fijación suele variar entre 2 y 16 horas a 4°C.
1. Centrifugar la suspensión en formaldehído durante 5 minutos a 14000 r.p.m.
Resuspender el pellet en 1000 l de PBS.
2. Repetir el lavado con PBS. Centrifugar 7 minutos a 14 000 r.p.m.
3. Resuspender el pellet en PBS o NaCl y continuar con los pasos 2-4 del protocolo
anterior.
4. Resuspender el pellet resultante en 1000 l en Etanol: PBS (1:1). Conservar a -20°C.

Lodo granular.
Para la extracción de DNA.
Tomar 2-5 gránulos, resuspenderlos en 1 ml
de PBS 1X y
disgregar por sonicación
(potencia media 0.50 w, frecuencia constante, durante 30 segundos) o con un potter.
Guardar a 4°C.
Para FISH
1. Decantar el formaldehído y lavar abundantemente con PBS.
2. Repetir el lavado con PBS para eliminar el formaldehído externo a los gránulos.
3. Pesar aproximadamente 0.05 g (5-10 gránulos), resuspender en 1 ml de PBS y
disgregar por sonicación (potencia media 0.50 w, frecuencia constante, durante 30
segundos). Puede requerirse repetir el proceso para romper y disgregar bien los
gránulos. Alternativamente, los gránulos pueden disgregarse con un potter y un vortex.
4. Centrifugar a baja velocidad (3.000 rpm, 1 minuto) para eliminar los restos de gránulos.
5. Descartar el pellet y centrifugar el sobrenadante durante 5-7 minutos a 10.000 rpm.
6. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS.
7. Centrifugar 5-7 min a 10.000 rpm.
8. Resuspender el pellet resultante en 1 ml de la mezcla PBS:etanol (1:1). Conservar a -20
ºC hasta su utilización.
________________________________________________
PBS (buffer fosfato sódico):
 130 mM NaCl
 10 mM Na2HPO4 / NaH2PO4
Ajustar el pH a 7.2
Esterilizar en autoclave.
4
6. Hibridación “in situ” con sondas fluorescentes (FISH).
El FISH permite identificar in situ la presencia de microorganismos al nivel taxonómico que se
requiera. Las sondas son oligonucleótidos de DNA (16-20 nucleótidos) marcadas en su
extremo 5’ con un cromóforo fluorescente cuya secuencia es complementaria de una región del
16S rRNA. Debido a su pequeño tamaño, son capaces de penetrar en las células fijadas,
hibridando (apareamiento DNA-RNA) “in situ” con los ribosomas de las células completas,
generando una señal fluorescente que permite su identificación, localización y
posterior
cuantificación. La especificidad de la sonda utilizada, que es función de la conservación de la
secuencia de rRNA seleccionada, nos permite detectar/identificar al nivel taxonómico que
deseemos: desde dominio hasta especie.
El proceso de hibridación in situ se divide en cuatro etapas: i) toma de muestra y fijación en el
momento de la recogida para preservar la integridad celular y, especialmente, de sus
ribosomas; ii) hibridación con una sonda específica marcada con un fluorocromo; iii) tinción de
contraste con un marcador universal (DAPI, que se une al DNA de cualquier célula) u otra
sonda más general marcada con otro fluorocromo de distinto color; iv) visualización mediante
un microscopio de fluorescencia. La cuantificación puede hacerse mediante contaje directo en
el microscopio (epifluorescencia o láser confocal), análisis de imágenes (tratamiento de las
imágenes tomadas con cámara CCD o microscopio láser confocal) o citometría de flujo. La
relación entre las células hibridadas con la sonda específica de grupo y las teñidas con DAPI o
hibridadas con la sonda general nos dará el porcentaje de nuestras bacterias en la muestra con
respecto al número total de bacterias presentes o con respecto al grupo general cuya sonda
hayamos utilizado (v.g. bacterias o arqueas).
Es la única técnica cuantitativa, aunque el proceso puede ser tedioso y subjetivo (microscopio
de epifluoroscencia) o muy complejo (microscopio láser confocal). Permite estudiar la
estructura de agregados microbianos (biopelículas, flóculos, gránulos), si bien lo ideal para ello
sería disponer de un microscopio confocal. Su principal limitación es la disponibilidad de
sondas para el taxón o grupo bacteriano que queremos localizar. Si no es así, es preciso
diseñar la sonda y poner a punto sus condiciones de hibridación, lo que requiere tiempo y
experiencia.
5
Tabla 1. Sondas para FISH y sus características
Sonda
Secuencia (5’-3’)
EUB338
ARC915
ALF968
BET42a
HGC69A
GCTGCCTCCCGTAGGAGT
GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
GGTAAGGTTCTGCGCGTT
GCCTTCCCACTTCGTTT
TATAGTTACCACCGCGT
MX825 (**)
TCGCACCGTGGCCGACACCT
AGC
Formamida (%) /
NaCl (mM)
35 / 80
20 / 225
20 / 225
35 / 80
25 / 159
20 / 225
Especificidad
Bacteria
Archaea
Alpha-proteobacteria
Beta-proteobacteria
Gram-positivos con alto
G+C (Actinobacteria)
Methanosaeta
(*): solo en el lodo granular.
6.1 Fijación.
Las muestras se fijan con formaldehído o para-formaldehído a una concentración final del 4%.
El tiempo más habitual es de 4 horas a 4oC, si bien puede variar entre 2-20 dependiendo de la
muestra. El procedimiento de fijación y lavado del formaldehído es el descrito en al apartado 5.
Las muestras en PBS:etanol pueden conservarse a -20oC durante meses.
6.2 Hibridación y lavado
Paso 1: estimación de la dilución adecuada. Preparar cuatro diluciones (1/5, 1/10, 1/100,
1/1000 en etanol:PBS 1:1) -de la muestra preparada en 5- y añadir 5 l de cada suspensión a
un pocillo del portaobjetos multipocillos ( 0,5 cm. FEDELCO. ER-308). Secar durante aprox.
15 minutos en estufa (30- 46 oC) y teñir con DAPI (1 mg/ml), durante 3 minutos. El exceso de
DAPI se lava primero con H2O Milli-Q y luego con Etanol 70%. Dejar secar y añadir una gota de
CITIFLUOR en cada pocillo, poner el cubre y contar las bacterias teñidas de azul al
microscopio de fluorescencia con el filtro para DAPI. Para realizar la hibridación debemos
seleccionar la dilución en la cual contemos aproximadamente 50-100 bacterias por campo.
Paso 2: hibridación. Añadir 5 l de la dilución seleccionada en un pocillo del portaobjetos
excavado multipocillos. Secar. Deshidratar la muestra introduciéndola en disoluciones de etanol
de concentración creciente (50%, 80%, 100%), 3 minutos en cada concentración. Dejar secar a
temperatura ambiente. Añadir 8 l del tampón de hibridación (tablas 2, 3) y 1 l de cada sonda
de FISH a utilizar (tabla 1). Poner el porta en una cámara de hibridación y dejar hibridando
durante 2 horas (entre 1.5 y varias horas) a 46oC.
Paso 3: lavado. Tras la hibridación debe eliminar el tampón de hibridación (cuidado con los
restos. La formamida es tóxica!) mediante un lavado con alta fuerza iónica. Para esto, llenar la
cámara de hibridación con 50 ml de tampón de lavado (tablas 2 y 3) y mantenerlo durante 15
minutos (¡exactos!) a 48 oC (tener el baño pre-calentado). Pasado este tiempo eliminar el
tampón de lavado, quitar los restos con agua y secar (aire, estufa). Teñir con DAPI (1 mg/ml),
6
durante 3 minutos y eliminar el exceso de DAPI lavando primero con H2O Milli-Q y luego con
Etanol 70%.
Tabla 2: Composición química del tampón de hibridación y del tampón de
lavado. (Los valores de X,Y,Z se indican en la tabla 3).
Tampón de Hibridación
NaCl
Tris – HCl
Formamida
SDS
Agua Milli-Q
Tampón de lavado
NaCl
Tris – HCl
EDTA
SDS
Agua Milli-Q
Concentración
5M
1 M ( pH = 8)
100
10 %
PURA
Concentración
5M
1 M ( pH = 8)
0.5 M ( pH = 9)
10 %
PURA
Cantidad
180 l
20 l
X
1 l
Hasta 1000 l
Cantidad
Y
1000 l
Z
50 l
Hasta 50 ml
Tabla 3: Valores de X, Y, Z . Estos dependen del porcentaje de formamida utilizada
para cada sonda (V hibridación = 1 ml; V lavado = 50 ml).
Formamida (%)
X(l)= Formamida Y (l) = NaCl (5M) Z (l) = EDTA (0.5M)
0
9000
0
0
50
6300
0
5
100
4500
0
10
150
3180
0
15
200
2150
500
20
250
1490
500
25
300
1020
500
30
350
700
500
35
400
460
500
40
450
300
500
45
500
180
500
50
550
100
500
55
600
40
500
60
650
0
500
65
700
0
350
70
750
0
250
75
800
0
175
80
850
0
125
85
900
0
88
90
950
0
62
95
Paso 4: observación y conteo. Las muestras se observan al microscopio con los filtros
específicos para cara fluorocromo. Para proteger la fluorescencia añadir una gota de citifluor.
7- Extracción del ADN de los microorganismos presentes en la
muestras utilizando el FastDNA Kit for soil BIO 101.
1- Tomar la muestra preparada en el paso 5 y mezclar con 120 μl de MT Buffer. Añadir la
mezcla en los tubos (Lysing Matriz E tube).
7
2- Romper las bacterias en el equipo Fastprep FP120, con los siguientes parámetros: Cuatro
ciclos de ruptura a 5,5 potencia y 40 segundos. Enfriar 5 minutos en hielo entre el segundo
y tercer ciclo.
3- Centrifugar el tubo a 14000 rpm, durante 1 minuto y transferir el sobrenadante a un
eppendorf de 1,5 mL.
4- Añadir al sobrenadante 250 μl de PPS y mezclar invirtiendo 12 veces.
5- Centrifugar a 14000 rpm durante 5 minutos.
6-
Transferir el sobrenadante a un eppendorf de 5 mL y añadirle 1 mL de Binding Matriz
Suspensión.
7- Agitar la mezcla lentamente en un rotor vertical durante 20 minutos a 4 oC.
8- Filtrar en un SPIN filter, añadiendo al filtro volúmenes no superiores a 600 μl de la mezcla,
centrifugar a 14000 rpm durante 1 minuto y desechar el sobrenadante. Repetir las veces
que sean necesarias hasta filtrar toda la mezcla.
9- A la resina retenida en el filtro añadirle 500 μl de SEWS-M y centrifugar a 14000 rpm
durante 1 minuto.
10- Centrifugar el SPIN filter a 14000 rpm durante 3 minutos, para secar la muestra.
11- Descartar el tubo eppendorf, meter el filtro en un nuevo tubo y dejarlo abierto 5 minutos
para que se seque.
12- Añadirle 100 μl de DES y resuspender la resina (homogenizar 2 minutos).
13- Centrifugar a 14000 rpm durante 3 minutos. El líquido filtrado contiene el ADN. Conservarlo
a 4oC.
8- Amplificación por PCR de un fragmento del gen del ARNr 16S para
DGGE.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método rápido y versátil de amplificación
in vitro de secuencias específicas de ADN presentes en una mezcla compleja de secuencias
(ADN total). Para poder llevar a cabo una amplificación selectiva es necesario conocer las
secuencias flanqueantes a la diana. Con ellas se construyen dos oligonucleótidos, de entre 15
y 30 bases, que actúan como cebadores (primer) en la reacción.
Estos cebadores están
diseñados para que se pueda iniciar la reacción de síntesis de ADN en presencia de una ADN
polimerasa termoestable adecuada (Vg. Taq, TthI,..) y de los precursores del ADN (los cuatros
desoxinucleótidos trifosfato: dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Cada cebador inicia la síntesis de
una hebra de ADN complementaria a una de las hebras del segmento de la diana con lo que
las dos hebras de nueva síntesis serán complementarias entre sí. Las hebras de ADN de
nueva síntesis servirán de moldes para las reacciones de síntesis en los ciclos posteriores. En
estas prácticas la PCR se utilizará para amplificar fragmentos de DNA que serán separados
8
mediante DGGE (apartado 9) y para la formación y rastreo de librerías genéticas (apartados
10 y 11).
Condiciones de la PCR para posterior DGGE (volumen de 100 μl)
Tampón 10X (sin MgCl2) ………………10 μl.
Solución de MgCL2 (25 mM)
………..
12 μl1
dNTPs (50 mM)…………………………. 1 μl
Cebadores (50 μM) 2 ………………..….. 1 μl (de cada uno: Forward y Reverse).
ADN………………………………………. Depende de las características de la muestra y su
Concentración (1-10 μl. Puede ser necesaria su
dilución previa)
Taq ADN Polimerasa ………………….
0,5
H2O MilliQ………………………………..Hasta 100 μl
1
: la concentración final de Mg2+ es de 3 mM. Si el tampón 10X incluye Mg2+ debe tenerse en
cuenta.
2
: 50 pmoles/ μl
Para amplificar por PCR fragmentos del gen del ARNr 16S a partir de una muestra compleja, y
que posteriormente serán resueltos mediante DGGE se utilizarán los siguientes pares de
cebadores (tabla 4): 341F-GC - 907R (T = 52oC) para bacterias y 622F-GC - 1492R (T = 42oC)
para arqueas. Programa:
94 oC
94 oC
10 min.
1 min.
T
72 oC
72 oC
2 min.
10 min.
1 min.
4 oC
35 Ciclos
Tabla 4. Cebadores utilizados para la amplificación por PCR del gen ARNr 16S de Bacterias y
Arqueas.
Cebador
Diana
Secuencia (de 5´a 3´)
Especificidad
Referencia
907R
907-926
CCGTCAATTCMTTTGAGTTT
Dominio Bacteria
Brosius, 1981
341F-GC*
344-357
CCTACGGGAGGCAGCAG
Dominio Bacteria
Brosius, 1981
622F-GC*
622-639
TGAAATCYYRTAATCCC
Dominio Arquea
Chan, 2001
1492R
1492-1514
TACGGYTACCTTGTTACGACTT
Universal
Lane, 1991
Nota: GC*: secuencia de 40 nucleótidos rica en GC, unida al extremo 5´del cebador. La secuencia GC es: 5´CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCC CCG CCC-3´. (M = C:A, Y = C:T, R = A:G)
9
9. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE).
La DGGE/TGGE se basa en la diferente movilidad electroforética de fragmentos de DNA
parcialmente desnaturalizados con igual longitud pero diferente secuencia, lo que da lugar a un
patrón de bandas reflejo de la diversidad genética presente en la comunidad microbiana. El
número de bandas corresponde con el número de miembros predominantes, y su
secuenciación y posterior análisis filogenético dan una buena perspectiva sobre la composición
de dicha comunidad.
A partir de la muestra que se quiera estudiar se lleva a cabo la extracción de DNA y RNA.
Mediante PCR se procede a una amplificación parcial (entre 300 – 1000 pb) del gen del 16S
rRNA utilizando cebadores específicos. Las distintas moléculas de DNA correspondientes a
diferentes microorganismos o unidades taxonómicas operacionales (OTUs) se separan
mediante electroforesis desnaturalizante. Para ello se utilizan geles de poliacrilamida con un
gradiente creciente de urea-formamida (DGGE) o de temperatura (TGGE). Cada molécula de
DNA se desplaza hacia el polo positivo y deja de moverse cuando la concentración de ureaformamida/temperatura provoca su desnaturalización (separación de las dos moléculas del
DNA de doble hebra según su temperatura de fusión -Tm). Cada banda obtenida en el gel
corresponde a un microorganismo presente en la muestra original, por lo que el simple patrón
de bandas puede ser suficiente para determinados estudios. Las bandas pueden ser
recortadas y el DNA secuenciado. Comparando las secuencias resultantes con una base de
datos de 16S DNA de bacterias y arqueas, podremos saber con que organismos tienen mayor
similitud los microorganismos presentes en nuestra muestra.
La DGGE/TGGE y otras técnicas de “huella genética” son técnicas rápidas y sencillas si se
limitan a la obtención de un patrón de bandas, aunque puede aumentarse su complejidad y la
información obtenida si se incluye la secuenciación y análisis filogenético de las mismas.
Generan una información taxonómica y filogenética relativamente precisa (menos que la
clonación, pero más que el FISH) sobre los microorganismos predominantes en el sistema, y
es útil para seguir la evolución espacial y temporal de las poblaciones de microorganismos y su
respuesta a cambios físico-químicos y nutricionales.
9.1- Preparación del gel de DGGE.
1-
Para hacer el gel se utilizan 2 cristales: (G)- cristal
grande (20cm x 20cm) y (P)- cristal pequeño
G
(20cm
P
x
18cm).
Además
se
utilizan
dos
separadores (1 mm de espesor).
1
10
2P
Se colocan los separadores encima del cristal
grande (G). Se puede poner un poco de vaselina en
la superficie de los separadores para que el cierre
lateral sea más hermético.
G
2
3- Posteriormente se coloca el cristal pequeño encima.
3
4- Se utilizan dos pinzas (A, B) para
ajustar los cristales.
B
A
4
5- Primero se pone una pinza y luego se coloca la
otra.
5
11
6-
Ajustar bien las pinzas (¡cuidado!: no apretar
excesivamente. Tanto las pinzas como los
vidrios pueden romperse) y verificar que los
cristales
están
colocados
correctamente.
Poner el sistema formador de gel sobre una
base, que tiene en la parte inferior una lámina
de plástico que sella herméticamente todo el
6
sistema.
7- El sistema formador de gel se ajusta a la base
mediante dos llaves laterales.
7
7-
Formación del gel: Montar un sistema como se indica en la figura 8. Se prepararán
dos soluciones de urea-formamida (20% y 70%) a partir de los stock (0% y 80%).
H
L
8
Composición del Stock 0%:
37,5 mL de Acrilamida/Bisacrilamida 40%.
5 mL de TAE 50X
llevar hasta 250 mL con agua MilliQ.
12
Composición del Stock 80%:
37,5 mL de Acrilamida/Bisacrilamida 40%.
5 mL de TAE 50X
84 g de Urea
80 mL formamida desionizada.
llevar hasta 250 mL con agua MilliQ.
Preparación de las soluciones de urea-formamida

Solución al 20%: Se mezclan 2,5 mL del stock al 80% y 7,5 mL del stock al 0%.
Homogenizar levemente y añadir 6,9 μl de TEMED y 53 μl de APS (1%).

Solución al 70%: Se mezclan 8,75 mL del stock al 80% y 1,25 mL del stock al 0%.
Homogenizar levemente y añadir 6,9 μl de TEMED y 53 μl de APS (1%).
TEMED : N,N,N´,N´-tetrametilentilendiamina.
APS: Peroxidisulfato de amonio.
Las soluciones 20% y 70% se añaden en los depósitos del formador de gradientes. La solución
del 20% en el compartimiento (L) y la solución del 80 en el compartimiento (H). Cerciorarse que
la comunicación entre ambos compartimientos este cerrada.
Al compartimiento (H) se le introduce una “mosca” magnética y todo el sistema se coloca
encima de un agitador magnético para garantizar que la mezcla se homogenicé de forma
continua. El agitador magnético se pone en marcha en cuanto se añaden las dos soluciones.
Posteriormente, de forma simultánea se pone en marcha la bomba peristáltica y se abre la
comunicación entre los compartimientos (H) y (L). Observaremos como en el compartimiento
(H) se van mezclando poco a poco ambas soluciones y la bomba peristáltica bombea esta
mezcla al sistema formador del gel.
Cuando prácticamente no queda solución en los compartimientos, se inclina el formador del
gradiente para bombear todo.
Posteriormente se mezclan 10 mL de la solución stock del 0% con 6,9 μl de Temed y 53 μl de
APS (1%) y se homogeniza. De esta mezcla se adiciona 9 mL al sistema formador del gel, por
la parte superior con la ayuda de una pipeta pasteur. Luego se introduce suavemente el peine
formador de los pocillos y añade más mezcla hasta completar el gel. Dejar polimerizar, a 4oC,
durante un mínimo de 4 horas y un máximo de 24 h.
13
Se preparan 7,5 L de TAE 1X a partir del stock de TAE 50X ( mezclar 242 g de Tris base, 57,1
mL de ácido acético glacial, 100 mL de 0,5 M EDTA, disolver hasta 1 L con agua destilada y
esterilizar 20 minutos a 1 atm)
9- Después de gelificado se saca el peine y se lavan
los pocillos con el buffer TAE 1X. Se coloca el
sistema formador de gel sobre la pieza de sujeción.
9
10-
Introducir el conjunto en la carcasa que
contiene 7,5 L del buffer TAE 1X.
10
11- Las muestras (producto de PCR) que se
van a cargar en el gel se concentran al vacío
hasta reducir su volumen a unos 15 μl. Añadir
a cada muestra 10 μl tampón de carga y
cargarlas en los pocillos con mucho cuidado y
evitando que pase muestra de un pocillo a
otro.
El gel se corre con las siguientes condiciones
11
electroforéticas: Potencial eléctrico: 200 v
Tiempo: 4 horas.Temperatura: 60 oC
12- Después de correr el gel de DGGE, se apaga
la fuente, el sistema de agitación y calentamiento
y se saca el conjunto de la carcasa.
14
12
13- El sistema formado de gel se separa de la pieza
de sujeción.
13
14- Se quitan las 2 pinzas con mucho
cuidado y
con la ayuda de los separadores se
quita solo
el cristal pequeño. Quedando el gel
pegado al
cristal grande. Luego el gel (junto con
el
cristal
grande) se tiñe durante 20 minutos en
solución
de
Bromuro
de
una
Etidio
(alternativa: GelRed) y, posteriormente,
se
lava
14
con agua durante 10 minutos.
15- Foto de un gel de DGGE
(gradiente 20 - 70), después
de
teñido.
Cada
carril
corresponde a una muestra y,
en teoría, cada banda a un
microorganismo con diferente
secuencia. Estas bandas se
cortan, se reamplifican con
los
15
mismos
primer,
se
purifican y se secuencian.
15
10. Amplificación del gen del ARNr 16S para la construcción de
genotecas.
A partir de los ADNs extraídos en el punto 7, vamos a volver a amplificar el ADN
correspondiente al gen que codifica el ARN 16S. El producto de la PCR se utilizará para la
construcción de genotecas en plásmidos. La amplificación se realizará utilizando los siguientes
cebadores:
Cebador
27f
25f
1492r
Secuencia
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
CYGGTTGATCCTGCCRG
TACGGYTACCTTGTTACGACTT
Y: C/T; R: A/G
Especificidad
Bacteria
Archaea
Universal
Las condiciones de la reacción de PCR son las siguientes:
2,5L de tampón de reacción (10x), 5pmol de cada cebador, 3,75mM MgCl2, 0,2mM dNTPs,
5g de Albúmina de suero bovino (BSA) y 0.5-1u de ADN polimerasa, en un volumen final de
25L.
El programa de PCR consiste en 5min de desnaturalización a 94°C seguido por 25 ciclos de
1min a 94°C (desnaturalización), 1 min a 55ºC (anillamiento), 2 min a 72°C (elongación) y un
ciclo final de 10 min a 72°C.
Los productos de PCR se clonarán en el plásmido pGEMT easy vector de Promega (Madison,
E.E.U.U.). Para ello, se realizará la siguiente reacción de ligación:
2X Rapid ligation buffer 5l
P-Gem vector
1l
Producto de PCR
3l
T4 DNA Ligasa
1l
Los tubos se incubarán como mínimo 1 hora a temperatura ambiente (alternativa: 4°C toda la
noche, lo que aumenta la eficiencia).
Los productos de las ligaciones se transformarán en células competentes de E. coli DH5,
según el siguiente protocolo:
1. Dejar un tubo de células competentes (si fuera necesario hacer alícuotas de 50 l) en
hielo hasta que se descongele (unos 5 min). Mezclar suavemente.
2. Centrifugar las ligaciones con un breve pulso. Añadir 2 l de cada reacción de ligación a
un tubo esteril de 1,5 ml. Colocar en hielo
3. Incubar 30 min en hielo
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4. Incubar la mezcla durante 1’30” a 42oC (shock térmico). No agitar. Inmediatamente
poner los tubos en hielo otros 2 min.
5. Añadir 500 l de medio SOC o LB a temperatura ambiente a las reacciones de
transformación.
6. Incubar 1 / 1.5 h a 37oC, con agitación.
7. Plaquear 100 l de la transformación en una placa de LB/ampicilina/X-Gal
8. Centrifugar el resto de la transformación, eliminar la mayoría del líquido y plaquear otra
placa de LB/Ampicilina/X-Gal (Amp: 100 ng/l ; X-Gal: 100 ng/l)
9. Incubar las placas a 37oC durante la noche.
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