Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 25 DETERMINACIÓN
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Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 25 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA EN ARTEMIA SALINA DE DIEZ EXTRACTOS HIDROETANÓLICOS DE ESPECIES DE PLANTAS DE ZAMORA CHINCHIPE DETERMINATION OFMEDIAN LETHAL CONCENTRATIONIN ARTEMIASALINA OF TEN HYDROETHANOLIC EXTRACTS FROM PLANTS OF ZAMORA CHINCHIPE Claudia Teresa Cruz Erazo 1, Luis Alberto Morocho Yaguana1*. 1Técnica investigadora, Unidad de Fitoquímica del Laboratorio de Análisis Químico, Universidad Nacional de Loja, Ciudadela Universitaria Guillermo Falconí, La Argelia. Loja. Ecuador. claudiacruzerazo@hotmail. com,[email protected] * resinas, concluyéndose además que tres extractos presentaron una toxicidad moderada con valores entre 100 y 1000 ugml-1 y siete no son tóxicas con valores de CL50 superiores a 1000 ug ml-1. Palabras claves: toxicidad, plantas medicinales, metabolitos secundarios, Artemia salina, CL50, dimetilsulfóxido. Autor para correspondencia Abstract Resumen El presente estudio se realizó con el propósito de investigar la composición fitoquímica y toxicidad de las plantas de uso medicinal en la Región Sur del Ecuador, las cuales son usadas frecuentemente por sanadores de las etnias Shuar y Saraguro para tratar padecimientos de tipo infeccioso. Según la metodología propuesta por Schabra, a partir de los extractos hidroetanólicos enteros y liofilizados de 10 especies de plantas medicinales de Zamora Chinchipe se pudo identificar doce metabolitos secundarios. Con los extractos enteros se realizó el ensayo de letalidad sobre Artemia salina por medio de la técnica de micropocillos, para lo cual se tomaron de 8-20 náuplios y se pusieron en contacto con diluciones crecientes de los extractos por 24 horas a 25-30 ºC y con iluminación permanente. Se contaron los náuplios muertos en cada pocillo al cabo de las 24 horas, luego agregó metanol y se determinó el número total de náuplios. Las lecturas se procesaron según el método de Probit usando el programa estadístico SPSS v.18. De los 10 extractos evaluados 3 tuvieron reacciones positivas para alcaloides, 10 para triterpenos y esteroides, 8 para flavonoides, 10 para lactonas y cumarinas, 9 para saponinas, 10 para taninos y fenoles, 10 para azúcares reductores, 8 para aminoácidos y 2 para The present study was carried out to investigate the phytochemical composition and toxicity of medicinal plants in the Southern Region of Ecuador, which are often used by healers of Saraguro and Shuar ethnic groups to treat an infectious type. According to the methodology proposed by Schabra, from whole hydroetanolics extracts and lyophilized of 10 species of medicinal plants from Zamora Chinchipe,twelve secondary metabolites were identified.With whole extracts the lethality assay was conducted on Artemia salinathrough microwell technique, for which 8-20 nauplii were taken and placed in contact with increasing dilutions of the extracts for 24 hours at 25-30 ° C with continuous illumination. Dead nauplii were counted in each well after 24 hours, then methanol was added and total numbers of nauplii were determined. The readings were processed according to the method of Probit using SPSS v.18 statistical software. From 10 extracts evaluated 3 of them had positive reactions for alkaloids, 10 for triterpenes and steroids, 8 for flavonoids, 10 for lactones and coumarins, 9 for saponins, 10 for tannins and phenols, 10 for reducers sugar, 8 for amino acids and 2 for resins, concluding that three extracts also showed a moderate toxicity values between 100 and 1000ug ml-1 and seven non-toxic with LC50 values above 1000 ug ml-1. 26 Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 Key words: toxicity, medicinal plants, secondary metabolites, Artemia salina,CL50,dimethylsulfoxide. Introducción En América Latina las plantas son parte fundamental del entorno, especialmente de las comunidades indígenas y campesinas (Ansaloni et al. 2010). En Ecuador más del 80 % de la población, recurre a la medicina tradicional, en especial a las plantas medicinales y los productos provenientes de ellas para curar sus dolencias, esto es debido a la tradición heredada de sus ancestros, e incrementado por el difícil acceso de la población a la atención médica y a medicamentos (Buitrón 1999). Muchas veces la medicina tradicional y el uso de plantas medicinales son la única fuente asequible de atención sanitaria, en especial en las comunidades más pobres que carecen de atención por un sistema oficial poco efectivo (OMS 2005). El uso de las plantas medicinales como parte de la medicina tradicional, en los últimos años se ha incrementado rápidamente viéndose favorecido en países en vías de desarrollo, en donde el uso se ha extendido al sector urbano y en los países desarrollados se hace cada vez más popular (OMS 2005;Ramachandran et al. 2011), como consecuencia crece la demanda de datos sobre la eficacia de los tratamientos y prácticas tradicionales. Sin embargo, las investigaciones que se realizan sobre medicina tradicional en cuanto a eficacia y seguridad son insuficientes para respaldar científicamente su uso (OMS 2005). Compuestos químicos como glucósidos, esteroides, terpenos, flavonoides, alcaloides, saponinas, cardiotónicos, fenoles, cumarinas, antocianinas, taninos, quinonas, antracenósidos, constituyen un amplio grupo de metabolitos secundarios, que al tener actividad farmacológica se denominan principios activos (Kuklinski 2000). Las plantas contienen principios activos que pueden presentar una notable actividad fisiológica en el ser humano y por ello pueden constituirse en un importante aliado parala prevención y tratamiento de ciertas patologías. No obstante, se conoce que muchas plantas pueden ocasionar reacciones tóxicas a quienes las utilizan, estas reacciones tóxicas se deben a la presencia de algunos metabolitos (Kuklinski 2000). Por esta razón, se llevan a cabo investigaciones con el propósito de determinar la presencia de metabolitos secundarios, bioactividad y toxicidad de las plantas medicinales (Fidalgo & Ramos 2009). La evaluación de la toxicidad es importante cuando se quiere valorar la seguridad de una planta medicinal para su uso tradicional o con fines de elaboración de fitofármacos (Zhang 2000). El ensayo de letalidad de Artemia salinaes considerado como una de las herramientas más útiles para una evaluación preliminar de toxicidad de extractos de plantas, detección de toxinas de hongos, metales pesados, cianobacterias y algas y resulta poco oneroso y con favorables consideraciones bioéticas (Fernández-Calienes Valdés et al. 2009). Determina el valor de la concentración letal media (CL50) de un pequeño crustáceo conocido comúnmente como el camarón de salmuera (Molina S. & Said F. 2006). En las provincias de Loja y Zamora Chinchipe, al Sur del Ecuador, se presenta una considerable variabilidad de microclimas, encontrándose desde clima tropical seco, subtropicalhúmedo y templadoandino en la provincia de Loja; mientras que en la provincia deZamoraChinchipe se cuenta con un climatemplado, que cambia dehúmedoasemi-húmedo, por lo que la vegetación es abundante (SENPLADES 2010). En estas zonas se reporta la existencia de 275 especies de plantas, de las cuales 152 son nativas, 57 introducidas, 8 son endémicas. Estas plantas son utilizadas para tratar diversas patologías desde dolores de estómago hasta malaria (Tene et al. 2007). El presente estudio se llevó a cabo con Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 27 el objetivo de evaluar la toxicidad de 10 extractos de plantas medicinales que son utilizadas frecuentemente por los sanadores de la Etnia Shuar de la provincia de Zamora Chinchipe, para el tratamiento de enfermedades frecuentes. Utilizando para el screening fitoquímico el método de Schabra(Schabra 1984) y para la determinación de la CL50 el método modificado de citotoxicidad en microplaca con A. Salina. Materiales y métodos encuestas desarrolladas en la provincia de Zamora Chinchipe durante los años 2008 y 2009, las cuales indagaron sobre qué plantas utilizan para tratar los padecimientos comunes, especialmente enfermedades infecciosas de la zona de estudio, qué partes, cómo la preparaban y con qué, la forma de administración y las precauciones para usarla. Durante el mes de noviembre de 2010, se colectaron partes de 10 plantas, las mismas que fueron seleccionadas por la frecuencia de uso por sanadores de las Etnias Saraguro y Shuar de la provincia de Zamora Chinchipe, según se exponen en el Cuadro 1. Selección y colecta de plantas Para la selección de las plantas y sus partes que se incluyeron en el estudio, se realizaron Cuadro 1. Nombre común, científico y partes usadas de las especies analizadas Nº 1 2 3 4 5 Parte usada Raíces Raíces Hojas Hojas Hojas 7 8 Nombre común Nombre científico Muka chiank Renealmia sp.(Zingiberaceae) Piri piri Cyperus sp3.(Cyperaceae) Solanumoccultum Bohs (Solanaceae) Tacup Parabra Brunfelsia grandiflora D. Don (Solanaceae) Winchiq Bidens pilosa L. (Asteraceae) Valeriana chaerophylloides Sm. (ValerianaceCulantrillo ae) Begonia Begoniafischeri Schrank (Begoniaceae) Lancetilla Iresineherbstii Hook. (Amaranthaceae) 9 Malva Hojas y tallos 6 10 Malachraruderalis Gürke (Malvaceae) Principio del formulario Hojas y flores Hojas y flores Hojas y tallos Caña agria de Final del formulario Hojas, flores y tallos bejuco Arthrostemaciliatum Ruiz & Pav. (Melastomataceae) Las colectas se realizaron en varias comunidades nativas de los cantones El Pangui, Yacuambi y Centinela del Cóndor, de acuerdo al Instructivo para la colecta de drogas del Laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Nacional de Loja (UNL). De los ejemplares colectados se prepararon dos muestras, una para su siembra en la Estación El Padmi de la UNL y otra para su identificación en el Herbario Reinaldo Espinosa de la UNL. El lavado del material colectado se realizó con agua potable y se desinfectó por inmersión en solución acuosa de hipoclorito de sodio al 0,5 % (Acosta de la Luz 2002)”4”, “2” ] ] }, “author” : [ { “dropping-particle” : “”, “family” : “Acosta de la Luz”, “given” : “L\u00e9rida”, 28 Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 “non-dropping-particle” : “”, “parse-names” : false, “suffix” : “” } ], “id” : “ITEM-1”, “issued” : { “date-parts” : [ [ “2002” ] ] }, “note” : “Desinfecci\ u00f3n qu\u00edmica.\n \nMuchos han sido los tratamientos qu\u00edmicos que ha utilizado el hombre, pero entre los m\u00e1s difundidos est\u00e1 el empleo de sales clorinadas como el hipoclorito de sodio o de calcio; de f\u00e1cil adquisici\u00f3n, relativamente econ\u00f3micas y buenas desinfectantes debido a que su acci\u00f3n est\u00e1 determinada por el Cloro libre que act\u00faa cuado se encuentra en diluci\ u00f3n y que adem\u00e1s tiene la ventaja de una acci\u00f3n instant\u00e1nea a concentraciones bajas. Para la reducci\ u00f3n de la poblaci\u00f3n microbiana se emplean dosis m\u00ednimas, entre 0,5 2,0% y el tiempo de inmersi\u00f3n es tambi\ u00e9n breve, entre 5 y 10 minutos. Es de destacar que se prefiere la sal de sodio por ser m\u00e1s soluble que la de calcio, la que deja en la droga una capa blancuzca, que le proporciona un aspecto no adecuado. (Alfaro et al., 2000. El secado de hojas, flores y tallos se realizó a temperatura ambiente y protegido de la luz solar. Las raíces fueron troceadas y secadas en estufa a 45 ºC. La molienda se realizó en molino de cuchillas con tamiz de 2 mm. Preparación de extractos y diluciones de ensayo Los extractos se prepararon por maceración, para lo cual se pesó 30 g de hojas y 50 g de raíces de cada planta, se colocó en un Erlenmeyer con tapa de cierre hermético y seagregó etanol 70 % v/v en agua en pequeñas cantidades hasta 2 cm por sobre la superficie de la droga; se dejó reposar por 48 horas, agitando eventualmente. Transcurrido el tiempo indicado se realizó la filtración por gasa y papel filtro respectivamente. Los filtrados se concentraron en rotavapor a 45 ºC, el solvente recuperado se usó para sucesivas extracciones, haciéndose las correcciones de concentración y dejándolo en contacto con la planta por 4 horas con eventual agitación. Este proceso se repitió hasta que el filtrado cuando el filtrado quedó sin color y translúcido. El extracto concentrado fue secado en estufa a 45 ºC y luego liofilizado. A partir de los liofilizados se preparó una solución madre de cada extracto con una concentración final de 1 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO)al 25 % (Atta-ur-Rahman et al. 2005) en agua de mar artificial (Prefectura Naval Argentina 1998). A partir de esta solución se prepararon otras diluciones conteniendo 50, 150, 350, 550 y 750 µg/mL de liofilizado. Estas soluciones se conservaron a 4 °C hasta su utilización. Tamizaje fitoquímico El tamizaje fitoquímico se realizó siguiendo la metodología propuesta por Schabra (1984), habiéndose realizado las pruebas cualitativas para los metabolitos señalados en el Cuadro 2. Cultivo de A. salina En un Erlenmeyer de 250 mL se depositaron 0,25 g de quistes de A. salina, se agregaron 250 mL de agua de mar artificial y 6 mgl-1 de levadura (Prefectura Naval Argentina 1998), se incubó a 27,5 ± 2,5 ºC por 48 horas, con aireación e iluminación permanentes. Al mismo tiempo, en un Erlenmeyer de 50 mL se oxigenó agua de mar artificial por 24 horas. Al cabo de cuarenta y ocho horas se suspendió la aireación, iluminación y se revistió el Erlenmeyer con una envoltura negra, dejando descubierta solo la parte inferior del Erlenmeyer. Por sifonamiento se tomaron 50 mL de agua de mar con náuplios y se mantuvieron suspendidos por agitación manual. Ensayo de letalidad Se rotularon placas de 96 micropocillos (Solis et al., 1993) de fondo plano con el nombre de la planta y las diluciones, al control negativo (blanco) le correspondió el número cero. A partir de la solución madre Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 29 se procedió a depositar en los pocillos el equivalente a 50, 150, 350, 550 y 750 µg/ mL de extracto, 50 µL de agua de mar con náuplios de A. salina y agua de mar artificial aireada hasta completar 200 µL. La determinación se realizó por triplicado para cada dilución. Paralelamente se realizó la prueba utilizando el patrón de dicromato de potasio como referencia (González Pérez & Aportela Gilling 2001), para validar la técnica. Los micropocillos fueron incubados luego por veinte y cuatro horas a 27,5 ± 2,5 ºC, con intensa iluminación (Atta-ur-Rahman et al., 2005). Una vez transcurrido el período de incubación se examinaron las placas realizando el recuento de náuplios muertos. Se consideraron náuplios muertos a aquellos que no presentaron movimiento por más de 5 segundos, luego se adicionó 100 µL de metanol a todos los micropocillos, se dejó reposar por 15 minutos y se realizó un nuevo recuento. Para la valoración de la CL50 se consideró las siguientes categorías: extremadamente tóxico (CL50< 10 μg/mL), muy tóxico (entre 10 y 100 μg/mL), moderadamente tóxico (entre 100 y 1 000 μg/mL) y no tóxico (CL50 > 1 000 μg/mL). (Valdés-iglesias et al. 2003). el método Probit que es una regresión lineal desarrollada para establecer la relación existente entre la concentración de una sustancia tóxica y la respuesta de la especie ensayada expuesta al tóxico por un tiempo determinado (24 horas) (Vincent 1980). La respuestade los organismos se transforma a unidades Probit en el eje Y y el logaritmo decimal de la concentración de tóxico en el eje X. Los datos obtenidos de las lecturas fueron procesados en el programa SPSS versión 18, desarrollando un análisis de regresión y fijándose los valores de CL50. Resultados Los metabolitos identificados en las diferentes especies se exponen en el Cuadro 1, indicando la intensidad de las reacciones presentadas, así mismo en el Cuadro Nº 3 se muestran los valores de CL50 para las diez plantas estudiadas de las cuales Cyperus sp3, S. occultum y Begonia fischeri, resultaron moderadamente tóxicas, con concentraciones de 459, 676 y 650 ug/ mL respectivamente; es decir, valores entre los 100 y 1000 ug/mL. Los siete extractos restantes: Renealmia sp. B. grandiflora, Bidens pilosa, V. cherophylloides, I. herbstii, M. ruderalis, A. ciliatum, se encuentran en la categoría de no toxicas. Análisis estadístico Para la determinación de la CL50 se siguió En el Cuadro 3 se detallan los valores de la CL50 para las plantas estudiadas. Cuadro 3. Determinación de CL50 Nº Nombre CL50 μg/mL 1 Renealmia sp. >40000 2 Cyperus. sp3. 429 3 S.occultum 676 4 B. grandiflora 1244 5 Bidens pilosa >40000 6 V. chaerophylloides 1106 7 Begoniafischeri 650 8 I.herbstii 39512 9 M.ruderalis 38151 Escala No tóxica Moderadamente tóxica Moderadamente tóxica No tóxica No tóxica No tóxica Moderadamente tóxica No tóxica No tóxica �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� ��� �� ��� �� �� �� �� �� ���� ���� ��� �� ��� �� �� �� �� �� �� �� �� �� ���� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� ��� ��� ���� �� ��� �� ��� ���� 10 Final del formulario �� �� ��� ���������� ������������� ���������� ����������� ��� ������ �� ��������� �������� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� ��� �� �� ������� ������� Principio del formulario ������������������������������������������������������������� ���������������������������������������������� ��� ��� ��� �������� �������� ��������� � ������ ����� ��������� ������������ ������������������������������������ �� ������������������������� �� �� �� �� �� ������������������� �� �� �� �� �� ������������������������� �� ��� ��� ��� ���������������������� �� ����������������������� �� �� �� �� �� ����������������������� ��� �� �� �� �� ��������������������� �� ��� �� �� ������� �� ������������������� �� �� �� �� �� �������������������� ��� �� �� ��� ������������������ �� �������������������� �� ���� �� ��� ���������� ��� ��������������������� �� ��� �� �� ������������� ��� ��������������� �� �� �� �� ��� �������� �� �� �� �� ��������������������������������������������� 30 Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 No tóxica 2295 A. ciliatum Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 31 Discusión La determinación de la letalidad en A. salina ha sido utilizada con eficiencia para detectar componente tóxicos en plantas (FernándezCalienes Valdés et al. 2009; Solis et al. 1993;Meyer et al. 1982) y en base a ella, evaluar los posibles usos terapéuticos, considerándose, además que existe una buena correlación entre los realizados en Artemia salina con la toxicidad en ratones (Lagarto Parra et al. 2001), estableciéndose para tal fin una escala (Valdés-iglesias et al. 2003) en base a la cual se puede clasificar a los extractos estudiados por su toxicidad. patologías humanas origen infeccioso. principalmente de Los extractos evaluados mostraron mayoritariamente baja toxicidad mediante el ensayo de letalidad sobre Artemia salina, lo que permite respaldar el uso tradicional de estas plantas. Las especies de plantas cuyos resultados mostraron baja toxicidad de los extractos tienen la posibilidad de continuar otros estudios de bioactividad, los cuales sientan las bases para el desarrollo de fitofármacos. Agradecimientos Los resultados obtenidos indican que los extractos hidroetanólicos de tres especies pueden ser consideradas medianamente tóxicas, sin haberse establecido una relación causal con los resultados del tamizaje fitoquímico, el cual es necesario profundizar. Las tres especies mencionadas se utilizan comúnmente para tratar diversas patologías; de este modo Cyperus sp3 es usadacomo purgante, en reumatismo, mordedura de serpiente e infecciones respiratorias (Proyecto Plantas Medicinales 2009). S. occultum es utilizada para quemaduras, infecciones intestinales (Contento G. & Andrade 2008)y Begonia fischeri para diarreas e infecciones respiratorias (Proyecto Plantas Medicinales 2009), afecciones comunes en la zona de estudio y por ello también son usadas frecuentemente. Los resultados del presente trabajo confirman que las especies evaluadas son seguras para su uso, aunque se debe profundizar en la evaluación las bioactividades atribuidas, que no se abordan aquí, pero que sin duda permitirán justificar su uso con mayor criterio científico. Queremos expresar nuestros sinceros agradecimientos a los sanadores de las diversas comunidades Shuar y Saraguro de la zona de estudio por hacernos partícipes de su sabiduría; a la Dra. Ruth Sigüenza, Directora Provincial de Salud de Zamora Chinchipe; al Dr. Rumi Contento, Coordinador del Subproceso de Medicina Intercultural de la Dirección de Salud de Zamora Chinchipe, por su apoyo incondicional al proyecto y a la labor investigativa de la UNL. A los directivos de la UNL, al Dr. Max González Merizalde, Rector UNL periodo 2003-2008; al Dr. Gustavo Villacís Rivas Rector de la UNL periodo 2008-2013, 20132018 y al Dr. Rómulo Chávez, Director de Investigaciones UNL, motivadores y convencidos impulsadores del proyecto. Referencias bibliográficas Conclusiones Acosta de la Luz, L. 2002. herbotecnia, Desinfeccion de plantas medcicinales, principios basicos. Available at: http://www. herbotecnia.chttp//www.herbotecnia.com. ar/c-public-004.htmlom.ar/c-public-004.html [Accessed April 2, 2013]. Se determina la toxicidad moderada de tres plantas medicinales utilizadas frecuentemente por los sanadores de la provincia de Zamora Chinchipe para tratar Ansaloni, R. et al. 2010. 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Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”. LojaECUADOR. [email protected] *Autor para correspondencia. 1 Carrerade Ingeniería Agronómica. Universidad Nacional de Loja-ECUADOR. 2 Centro de Genética Microbiana y de Plantas. Universidad Católica de LovainaBÉLGICA. [email protected] 3 4 Resumen La Marchitez Vascular del Babaco (MVB), causado por Fusariumoxysporum es una enfermedad de gran importancia debido a las severas pérdidas que produce en el cultivo de Babaco. El objetivo de esta investigación fue estudiar la variabilidad morfológica de once aislados fúngicos asociados a la MVB en la provincia de Loja, Ecuador. Las
