Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 25 DETERMINACIÓN

Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 25
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA EN ARTEMIA SALINA DE
DIEZ EXTRACTOS HIDROETANÓLICOS DE ESPECIES DE PLANTAS DE ZAMORA
CHINCHIPE
DETERMINATION OFMEDIAN LETHAL CONCENTRATIONIN ARTEMIASALINA OF
TEN HYDROETHANOLIC EXTRACTS FROM PLANTS OF ZAMORA CHINCHIPE
Claudia Teresa Cruz Erazo 1, Luis
Alberto Morocho Yaguana1*. 1Técnica
investigadora, Unidad de Fitoquímica
del Laboratorio de Análisis Químico,
Universidad Nacional de Loja, Ciudadela
Universitaria Guillermo Falconí, La Argelia.
Loja. Ecuador. claudiacruzerazo@hotmail.
com,[email protected]
*
resinas, concluyéndose además que
tres extractos presentaron una toxicidad
moderada con valores entre 100 y 1000
ugml-1 y siete no son tóxicas con valores de
CL50 superiores a 1000 ug ml-1.
Palabras claves: toxicidad, plantas
medicinales,
metabolitos
secundarios,
Artemia salina, CL50, dimetilsulfóxido.
Autor para correspondencia
Abstract
Resumen
El presente estudio se realizó con el propósito
de investigar la composición fitoquímica y
toxicidad de las plantas de uso medicinal
en la Región Sur del Ecuador, las cuales
son usadas frecuentemente por sanadores
de las etnias Shuar y Saraguro para tratar
padecimientos de tipo infeccioso. Según la
metodología propuesta por Schabra, a partir
de los extractos hidroetanólicos enteros
y liofilizados de 10 especies de plantas
medicinales de Zamora Chinchipe se pudo
identificar doce metabolitos secundarios.
Con los extractos enteros se realizó el
ensayo de letalidad sobre Artemia salina
por medio de la técnica de micropocillos,
para lo cual se tomaron de 8-20 náuplios
y se pusieron en contacto con diluciones
crecientes de los extractos por 24 horas a
25-30 ºC y con iluminación permanente.
Se contaron los náuplios muertos en cada
pocillo al cabo de las 24 horas, luego agregó
metanol y se determinó el número total de
náuplios. Las lecturas se procesaron según
el método de Probit usando el programa
estadístico SPSS v.18. De los 10 extractos
evaluados 3 tuvieron reacciones positivas
para alcaloides, 10 para triterpenos y
esteroides, 8 para flavonoides, 10 para
lactonas y cumarinas, 9 para saponinas, 10
para taninos y fenoles, 10 para azúcares
reductores, 8 para aminoácidos y 2 para
The present study was carried out to
investigate the phytochemical composition
and toxicity of medicinal plants in the Southern
Region of Ecuador, which are often used
by healers of Saraguro and Shuar ethnic
groups to treat an infectious type. According
to the methodology proposed by Schabra,
from whole hydroetanolics extracts and
lyophilized of 10 species of medicinal plants
from Zamora Chinchipe,twelve secondary
metabolites were identified.With whole
extracts the lethality assay was conducted on
Artemia salinathrough microwell technique,
for which 8-20 nauplii were taken and
placed in contact with increasing dilutions of
the extracts for 24 hours at 25-30 ° C with
continuous illumination. Dead nauplii were
counted in each well after 24 hours, then
methanol was added and total numbers of
nauplii were determined. The readings were
processed according to the method of Probit
using SPSS v.18 statistical software. From
10 extracts evaluated 3 of them had positive
reactions for alkaloids, 10 for triterpenes and
steroids, 8 for flavonoids, 10 for lactones and
coumarins, 9 for saponins, 10 for tannins and
phenols, 10 for reducers sugar, 8 for amino
acids and 2 for resins, concluding that three
extracts also showed a moderate toxicity
values between 100 and 1000ug ml-1 and
seven non-toxic with LC50 values above
1000 ug ml-1.
26 Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013
Key words: toxicity, medicinal plants,
secondary
metabolites,
Artemia
salina,CL50,dimethylsulfoxide.
Introducción
En América Latina las plantas son parte
fundamental del entorno, especialmente de
las comunidades indígenas y campesinas
(Ansaloni et al. 2010). En Ecuador más del
80 % de la población, recurre a la medicina
tradicional, en especial a las plantas
medicinales y los productos provenientes
de ellas para curar sus dolencias, esto
es debido a la tradición heredada de sus
ancestros, e incrementado por el difícil
acceso de la población a la atención médica
y a medicamentos (Buitrón 1999). Muchas
veces la medicina tradicional y el uso de
plantas medicinales son la única fuente
asequible de atención sanitaria, en especial
en las comunidades más pobres que
carecen de atención por un sistema oficial
poco efectivo (OMS 2005).
El uso de las plantas medicinales como
parte de la medicina tradicional, en
los últimos años se ha incrementado
rápidamente viéndose favorecido en países
en vías de desarrollo, en donde el uso se ha
extendido al sector urbano y en los países
desarrollados se hace cada vez más popular
(OMS 2005;Ramachandran et al. 2011),
como consecuencia crece la demanda de
datos sobre la eficacia de los tratamientos
y prácticas tradicionales. Sin embargo,
las investigaciones que se realizan sobre
medicina tradicional en cuanto a eficacia y
seguridad son insuficientes para respaldar
científicamente su uso (OMS 2005).
Compuestos químicos como glucósidos,
esteroides,
terpenos,
flavonoides,
alcaloides,
saponinas,
cardiotónicos,
fenoles, cumarinas, antocianinas, taninos,
quinonas, antracenósidos, constituyen un
amplio grupo de metabolitos secundarios,
que al tener actividad farmacológica se
denominan principios activos (Kuklinski
2000). Las plantas contienen principios
activos que pueden presentar una notable
actividad fisiológica en el ser humano y por
ello pueden constituirse en un importante
aliado parala prevención y tratamiento de
ciertas patologías. No obstante, se conoce
que muchas plantas pueden ocasionar
reacciones tóxicas a quienes las utilizan,
estas reacciones tóxicas se deben a
la presencia de algunos metabolitos
(Kuklinski 2000). Por esta razón, se llevan
a cabo investigaciones con el propósito
de determinar la presencia de metabolitos
secundarios, bioactividad y toxicidad de
las plantas medicinales (Fidalgo & Ramos
2009). La evaluación de la toxicidad es
importante cuando se quiere valorar la
seguridad de una planta medicinal para su
uso tradicional o con fines de elaboración de
fitofármacos (Zhang 2000).
El ensayo de letalidad de Artemia salinaes
considerado como una de las herramientas
más útiles para una evaluación preliminar de
toxicidad de extractos de plantas, detección
de toxinas de hongos, metales pesados,
cianobacterias y algas y resulta poco oneroso
y con favorables consideraciones bioéticas
(Fernández-Calienes Valdés et al. 2009).
Determina el valor de la concentración letal
media (CL50) de un pequeño crustáceo
conocido comúnmente como el camarón de
salmuera (Molina S. & Said F. 2006).
En las provincias de Loja y Zamora
Chinchipe, al Sur del Ecuador, se
presenta una considerable variabilidad
de microclimas, encontrándose desde
clima tropical seco, subtropicalhúmedo y
templadoandino en la provincia de Loja;
mientras que en la provincia deZamoraChinchipe se cuenta con un climatemplado,
que cambia dehúmedoasemi-húmedo,
por lo que la vegetación es abundante
(SENPLADES 2010). En estas zonas se
reporta la existencia de 275 especies de
plantas, de las cuales 152 son nativas,
57 introducidas, 8 son endémicas. Estas
plantas son utilizadas para tratar diversas
patologías desde dolores de estómago
hasta malaria (Tene et al. 2007).
El presente estudio se llevó a cabo con
Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 27
el objetivo de evaluar la toxicidad de 10
extractos de plantas medicinales que son
utilizadas frecuentemente por los sanadores
de la Etnia Shuar de la provincia de
Zamora Chinchipe, para el tratamiento de
enfermedades frecuentes.
Utilizando para el screening fitoquímico el
método de Schabra(Schabra 1984) y para
la determinación de la CL50 el método
modificado de citotoxicidad en microplaca
con A. Salina.
Materiales y métodos
encuestas desarrolladas en la provincia de
Zamora Chinchipe durante los años 2008
y 2009, las cuales indagaron sobre qué
plantas utilizan para tratar los padecimientos
comunes, especialmente enfermedades
infecciosas de la zona de estudio, qué
partes, cómo la preparaban y con qué, la
forma de administración y las precauciones
para usarla. Durante el mes de noviembre
de 2010, se colectaron partes de 10 plantas,
las mismas que fueron seleccionadas por
la frecuencia de uso por sanadores de las
Etnias Saraguro y Shuar de la provincia de
Zamora Chinchipe, según se exponen en el
Cuadro 1.
Selección y colecta de plantas
Para la selección de las plantas y sus partes
que se incluyeron en el estudio, se realizaron
Cuadro 1. Nombre común, científico y partes usadas de las especies analizadas
Nº
1
2
3
4
5
Parte usada
Raíces
Raíces
Hojas
Hojas
Hojas
7
8
Nombre común
Nombre científico
Muka chiank
Renealmia sp.(Zingiberaceae)
Piri piri
Cyperus sp3.(Cyperaceae)
Solanumoccultum Bohs (Solanaceae)
Tacup
Parabra
Brunfelsia grandiflora D. Don (Solanaceae)
Winchiq
Bidens pilosa L. (Asteraceae)
Valeriana chaerophylloides Sm. (ValerianaceCulantrillo
ae)
Begonia
Begoniafischeri Schrank (Begoniaceae)
Lancetilla
Iresineherbstii Hook. (Amaranthaceae)
9
Malva
Hojas y tallos
6
10
Malachraruderalis Gürke (Malvaceae)
Principio del formulario
Hojas y flores
Hojas y flores
Hojas y tallos
Caña agria de Final del formulario
Hojas, flores y tallos
bejuco
Arthrostemaciliatum Ruiz & Pav. (Melastomataceae)
Las colectas se realizaron en varias
comunidades nativas de los cantones El
Pangui, Yacuambi y Centinela del Cóndor,
de acuerdo al Instructivo para la colecta de
drogas del Laboratorio de Fitoquímica de
la Universidad Nacional de Loja (UNL). De
los ejemplares colectados se prepararon
dos muestras, una para su siembra en la
Estación El Padmi de la UNL y otra para
su identificación en el Herbario Reinaldo
Espinosa de la UNL.
El lavado del material colectado se realizó con
agua potable y se desinfectó por inmersión
en solución acuosa de hipoclorito de sodio
al 0,5 % (Acosta de la Luz 2002)”4”, “2” ] ] },
“author” : [ { “dropping-particle” : “”, “family”
: “Acosta de la Luz”, “given” : “L\u00e9rida”,
28 Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013
“non-dropping-particle” : “”, “parse-names” :
false, “suffix” : “” } ], “id” : “ITEM-1”, “issued” : {
“date-parts” : [ [ “2002” ] ] }, “note” : “Desinfecci\
u00f3n qu\u00edmica.\n
\nMuchos han
sido los tratamientos qu\u00edmicos que ha
utilizado el hombre, pero entre los m\u00e1s
difundidos est\u00e1 el empleo de sales
clorinadas como el hipoclorito de sodio o
de calcio; de f\u00e1cil adquisici\u00f3n,
relativamente econ\u00f3micas y buenas
desinfectantes debido a que su acci\u00f3n
est\u00e1 determinada por el Cloro libre que
act\u00faa cuado se encuentra en diluci\
u00f3n y que adem\u00e1s tiene la ventaja
de una acci\u00f3n instant\u00e1nea a
concentraciones bajas. Para la reducci\
u00f3n de la poblaci\u00f3n microbiana se
emplean dosis m\u00ednimas, entre 0,5 2,0% y el tiempo de inmersi\u00f3n es tambi\
u00e9n breve, entre 5 y 10 minutos. Es de
destacar que se prefiere la sal de sodio por
ser m\u00e1s soluble que la de calcio, la
que deja en la droga una capa blancuzca,
que le proporciona un aspecto no adecuado.
(Alfaro et al., 2000. El secado de hojas, flores
y tallos se realizó a temperatura ambiente y
protegido de la luz solar. Las raíces fueron
troceadas y secadas en estufa a 45 ºC. La
molienda se realizó en molino de cuchillas
con tamiz de 2 mm.
Preparación de extractos y diluciones de
ensayo
Los extractos se prepararon por maceración,
para lo cual se pesó 30 g de hojas y 50 g
de raíces de cada planta, se colocó en un
Erlenmeyer con tapa de cierre hermético
y seagregó etanol 70 % v/v en agua en
pequeñas cantidades hasta 2 cm por sobre la
superficie de la droga; se dejó reposar por 48
horas, agitando eventualmente. Transcurrido
el tiempo indicado se realizó la filtración por
gasa y papel filtro respectivamente.
Los filtrados se concentraron en rotavapor
a 45 ºC, el solvente recuperado se usó para
sucesivas extracciones, haciéndose las
correcciones de concentración y dejándolo
en contacto con la planta por 4 horas con
eventual agitación. Este proceso se repitió
hasta que el filtrado cuando el filtrado
quedó sin color y translúcido. El extracto
concentrado fue secado en estufa a 45 ºC
y luego liofilizado. A partir de los liofilizados
se preparó una solución madre de cada
extracto con una concentración final de 1
mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO)al 25 %
(Atta-ur-Rahman et al. 2005) en agua de mar
artificial (Prefectura Naval Argentina 1998).
A partir de esta solución se prepararon otras
diluciones conteniendo 50, 150, 350, 550 y
750 µg/mL de liofilizado. Estas soluciones
se conservaron a 4 °C hasta su utilización.
Tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico se realizó siguiendo
la metodología propuesta por Schabra
(1984), habiéndose realizado las pruebas
cualitativas para los metabolitos señalados
en el Cuadro 2.
Cultivo de A. salina
En un Erlenmeyer de 250 mL se depositaron
0,25 g de quistes de A. salina, se agregaron
250 mL de agua de mar artificial y 6 mgl-1 de
levadura (Prefectura Naval Argentina 1998),
se incubó a 27,5 ± 2,5 ºC por 48 horas,
con aireación e iluminación permanentes.
Al mismo tiempo, en un Erlenmeyer de 50
mL se oxigenó agua de mar artificial por 24
horas.
Al cabo de cuarenta y ocho horas se
suspendió la aireación, iluminación y se
revistió el Erlenmeyer con una envoltura
negra, dejando descubierta solo la parte
inferior del Erlenmeyer. Por sifonamiento se
tomaron 50 mL de agua de mar con náuplios
y se mantuvieron suspendidos por agitación
manual.
Ensayo de letalidad
Se rotularon placas de 96 micropocillos
(Solis et al., 1993) de fondo plano con el
nombre de la planta y las diluciones, al
control negativo (blanco) le correspondió el
número cero. A partir de la solución madre
Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 29
se procedió a depositar en los pocillos el
equivalente a 50, 150, 350, 550 y 750 µg/
mL de extracto, 50 µL de agua de mar
con náuplios de A. salina y agua de mar
artificial aireada hasta completar 200 µL. La
determinación se realizó por triplicado para
cada dilución.
Paralelamente se realizó la prueba utilizando
el patrón de dicromato de potasio como
referencia (González Pérez & Aportela
Gilling 2001), para validar la técnica.
Los micropocillos fueron incubados luego
por veinte y cuatro horas a 27,5 ± 2,5 ºC,
con intensa iluminación (Atta-ur-Rahman
et al., 2005). Una vez transcurrido el
período de incubación se examinaron las
placas realizando el recuento de náuplios
muertos. Se consideraron náuplios muertos
a aquellos que no presentaron movimiento
por más de 5 segundos, luego se adicionó
100 µL de metanol a todos los micropocillos,
se dejó reposar por 15 minutos y se realizó
un nuevo recuento.
Para la valoración de la CL50 se consideró
las siguientes categorías: extremadamente
tóxico (CL50< 10 μg/mL), muy tóxico (entre
10 y 100 μg/mL), moderadamente tóxico
(entre 100 y 1 000 μg/mL) y no tóxico (CL50
> 1 000 μg/mL). (Valdés-iglesias et al. 2003).
el método Probit que es una regresión lineal
desarrollada para establecer la relación
existente entre la concentración de una
sustancia tóxica y la respuesta de la especie
ensayada expuesta al tóxico por un tiempo
determinado (24 horas) (Vincent 1980). La
respuestade los organismos se transforma
a unidades Probit en el eje Y y el logaritmo
decimal de la concentración de tóxico en el
eje X.
Los datos obtenidos de las lecturas fueron
procesados en el programa SPSS versión
18, desarrollando un análisis de regresión y
fijándose los valores de CL50.
Resultados
Los metabolitos identificados en las
diferentes especies se exponen en el
Cuadro 1, indicando la intensidad de las
reacciones presentadas, así mismo en el
Cuadro Nº 3 se muestran los valores de
CL50 para las diez plantas estudiadas de las
cuales Cyperus sp3, S. occultum y Begonia
fischeri, resultaron moderadamente tóxicas,
con concentraciones de 459, 676 y 650 ug/
mL respectivamente; es decir, valores entre
los 100 y 1000 ug/mL. Los siete extractos
restantes: Renealmia sp. B. grandiflora,
Bidens pilosa, V. cherophylloides, I. herbstii,
M. ruderalis, A. ciliatum, se encuentran en
la categoría de no toxicas.
Análisis estadístico
Para la determinación de la CL50 se siguió
En el Cuadro 3 se detallan los valores de la
CL50 para las plantas estudiadas.
Cuadro 3. Determinación de CL50
Nº
Nombre
CL50 μg/mL
1 Renealmia sp.
>40000
2 Cyperus. sp3.
429
3 S.occultum
676
4 B. grandiflora
1244
5 Bidens pilosa
>40000
6 V. chaerophylloides
1106
7 Begoniafischeri
650
8 I.herbstii
39512
9 M.ruderalis
38151
Escala
No tóxica
Moderadamente tóxica
Moderadamente tóxica
No tóxica
No tóxica
No tóxica
Moderadamente tóxica
No tóxica
No tóxica
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10 Final del formulario
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Principio del formulario
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30 Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013
No tóxica
2295
A. ciliatum
Centro de Biotecnología, Vol. 2 Nro. 1. 2013 31
Discusión
La determinación de la letalidad en A. salina
ha sido utilizada con eficiencia para detectar
componente tóxicos en plantas (FernándezCalienes Valdés et al. 2009; Solis et al.
1993;Meyer et al. 1982) y en base a ella,
evaluar los posibles usos terapéuticos,
considerándose, además que existe una
buena correlación entre los realizados en
Artemia salina con la toxicidad en ratones
(Lagarto Parra et al. 2001), estableciéndose
para tal fin una escala (Valdés-iglesias et al.
2003) en base a la cual se puede clasificar
a los extractos estudiados por su toxicidad.
patologías humanas
origen infeccioso.
principalmente
de
Los
extractos
evaluados
mostraron
mayoritariamente baja toxicidad mediante el
ensayo de letalidad sobre Artemia salina, lo
que permite respaldar el uso tradicional de
estas plantas.
Las especies de plantas cuyos resultados
mostraron baja toxicidad de los extractos
tienen la posibilidad de continuar otros
estudios de bioactividad, los cuales sientan
las bases para el desarrollo de fitofármacos.
Agradecimientos
Los resultados obtenidos indican que los
extractos hidroetanólicos de tres especies
pueden ser consideradas medianamente
tóxicas, sin haberse establecido una relación
causal con los resultados del tamizaje
fitoquímico, el cual es necesario profundizar.
Las tres especies mencionadas se utilizan
comúnmente para tratar diversas patologías;
de este modo Cyperus sp3 es usadacomo
purgante, en reumatismo, mordedura
de serpiente e infecciones respiratorias
(Proyecto Plantas Medicinales 2009). S.
occultum es utilizada para quemaduras,
infecciones intestinales (Contento G. &
Andrade 2008)y Begonia fischeri para
diarreas e infecciones respiratorias (Proyecto
Plantas Medicinales 2009), afecciones
comunes en la zona de estudio y por ello
también son usadas frecuentemente.
Los resultados del presente trabajo confirman
que las especies evaluadas son seguras
para su uso, aunque se debe profundizar en
la evaluación las bioactividades atribuidas,
que no se abordan aquí, pero que sin duda
permitirán justificar su uso con mayor criterio
científico.
Queremos expresar nuestros sinceros
agradecimientos a los sanadores de las
diversas comunidades Shuar y Saraguro de
la zona de estudio por hacernos partícipes
de su sabiduría; a la Dra. Ruth Sigüenza,
Directora Provincial de Salud de Zamora
Chinchipe; al Dr. Rumi Contento, Coordinador
del Subproceso de Medicina Intercultural de
la Dirección de Salud de Zamora Chinchipe,
por su apoyo incondicional al proyecto y a
la labor investigativa de la UNL.
A los directivos de la UNL, al Dr. Max
González Merizalde, Rector UNL periodo
2003-2008; al Dr. Gustavo Villacís Rivas
Rector de la UNL periodo 2008-2013, 20132018 y al Dr. Rómulo Chávez, Director
de Investigaciones UNL, motivadores y
convencidos impulsadores del proyecto.
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Conclusiones
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Se determina la toxicidad moderada
de tres plantas medicinales utilizadas
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provincia de Zamora Chinchipe para tratar
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YQNgMT2wgipwrzMVxMFpq9pxhONF6V_
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ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD MORFOLÓGICA DE AISLADOS FÚNGICOS
ASOCIADOS CON LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR DEL BABACO
(Vasconcellea heilbornii var. pentagona) EN LOJA, ECUADOR
MORPHOLOGICAL VARIABILITY STUDY OF FUNGAL ISOLATES ASSOCIATED
WITH VASCULAR WILT BABACO (VASCONCELLEAHEILBORNII VAR. PENTAGONA)
DISEASE IN LOJA, ECUADOR
Ángel Robles-Carrión1, Darío SalinasSerrano2, Wilman Armijos-Armijos2, Aminael
Sánchez-Rodríguez3 y Roldán TorresGutiérrez4*
Centro de Biotecnología, Universidad
Nacional de Loja. Proyecto “Prometeo
Viejos Sabios”. SENESCYT-ECUADOR.
[email protected]
Centro de Biotecnología, Universidad
Nacional de Loja. Ciudad Universitaria
Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”. LojaECUADOR. [email protected]
*Autor para correspondencia.
1
Carrerade
Ingeniería
Agronómica.
Universidad Nacional de Loja-ECUADOR.
2
Centro de Genética Microbiana y de
Plantas. Universidad Católica de LovainaBÉLGICA. [email protected]
3
4
Resumen
La Marchitez Vascular del Babaco (MVB),
causado por Fusariumoxysporum es una
enfermedad de gran importancia debido a las
severas pérdidas que produce en el cultivo
de Babaco. El objetivo de esta investigación
fue estudiar la variabilidad morfológica
de once aislados fúngicos asociados a la
MVB en la provincia de Loja, Ecuador. Las